NO327500B1

NO327500B1 - Polypeptid som utgjor et celleoverflatemolekyl, polypeptidfragment, gen, vektor, transformant, fusjonspolypeptid, homodimert molekyl, farmasoytisk preparat, antistoff, eller del av dette, hybridom, transgen mus samt knockout-mus.

Info

Publication number: NO327500B1
Application number: NO19994146A
Authority: NO
Inventors: Takuya Tamatani; Katsunari Tezuka
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1999-08-26
Publication date: 2009-07-20
Also published as: AU6118598A; CN1221569C; NO994146D0; US7279560B2; CN1624115A; CA2282727A1; IL131584A0; EP0984023B9; US7247612B2; US20040146506A1; EP1502920B1; NZ337425A; ATE360645T1; AU732378B2; US7030225B1; EP0984023A4; US20040073012A1; SI0984023T1; NO20073155L; US20040120945A1

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår et polypeptid som utgjør et celleoverflatemolekyl, polypeptidfragment, gen, vektor, transformant, fusjonspolypeptid, homodimert molekyl, farmasøytisk preparat, antistoff, eller del av dette, hybridom, transgen mus samt knockout-mus.

Bakgrunnsteknikk

En levende pattedyrkropp har immunrespons sys tetne r som ekskluderer patogene mikroorganismer (virus, bakterier, para-sitter etc.) eller fremmedlegemer (begge er betegnet "antigen" i det etterfølgende) som har invadert den levende kropp. Ett av dem er betegnet naturlig immunresponssystem, et annet ervervet immunresponssystem. Det førstnevnte er en eksklus-jonsmekanisme som omfatter fagocytose av fagocytter (polymor-fonukleære leukocytter, monocytter, makrofager etc), angrep av naturlige dreper(NK)celler og uspesifikk gjenkjennelse, slik som opsonisering av antigen ved hjelp av komplementer. Det sistnevnte, ervervet immunresponssystem, er en eksklu-sjonsmekanisme fra lymfocytter (hovedsakelig T-celler og B-celler) som har ervervet spesifisiteten mot antigenet (nemlig aktiverte lymfocytter). B-celler som har ervervet antigenspesifisitet, angriper antigenet som eksisterer utenfor cellene ved produksjon av antistoffer som er spesifikke for antigenet. T-celler som har ervervet antigenspesifisitet (nemlig aktiverte T-celler), er klassifisert som hjelper-T-celler og cytotoksiske T-celler (cytotoksiske lymfocytter, CTL). Hjelper-T-cellene regulerer en differensiering av B-celler og produksjon av antistoffer, og ødelegger antigenet som samarbeider med fagocytter. De sistnevnte, CTL, angriper virusinfiserte celler osv. helt alene (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Bio Science Term Library, Immunity", Yodosha, s. 14-17 (1995)).

Denne ervervelse av antigenspesifisitet hos T-celler (nemlig aktivering av T-celler) initieres ved at T-celler gjenkjenner antigenet presentert ved hjelp av antigenpresenterende celler (APC), slik som makrofager, B-celler eller dendrittceller. Antigenpresenterende celler bearbeider de således inkorporerte antigener og presenterer disse bearbeidede antigener ved å binde dem til hovedhistokompatibilitets-kompleks (MHC). T-celler mottar primært signal for aktivering av cellene (eller ervervelse av spesifisitet) ved å gjenkjenne de bearbeidede antigener presentert av antigenpresenterende celler gjennom et kompleks mellom T-cellereseptor (TcR) og CD3-antigen som eksisterer på overflaten av cellemembranen (TcR/CD3-kompleks).

Det TcR/CD3-kompleksformidlede primære signal kan imidlertid ikke alene aktivere T-celler tilstrekkelig og fører til ureaktivitet eller klonal anergi, slik at cellene ikke kan reagere med noen stimulering mottatt deretter. Den autokrine faktor til interleukin 2 (IL-2) er nødvendig for at T-celler skal aktiveres, differensieres til antigenspesifikke T-cellekloner og prolifereres. Ved klonal anergi inaktiveres T-celler på grunn av ingen produksjon av IL-2 og ingen celledeling. Aktiveringen av T-celler som medfølges av produksjon av cytokiner, slik som IL-2, fordrer nemlig det sekundære signal etter det første signal gjennom TcR/CD3-kompleks. Dette sekundære signal er betegnet kostimulerende signal.

T-celler mottar dette sekundære signal og overfører det til cellene ved interaksjon (celleadhesjon) med molekyler foruten MHC på antigenpresenterende celler gjennom molekyler foruten TcR/CD3-kompleks på T-celleoverflaten. Dette sekundære signal unngår celleanergi (klonal anergi) og aktiverer cellene.

Selv om noe av mekanismen for den sekundære signaltransmisjon mellom antigenpresenterende celler og lymfocytter, slik som T-celler, hittil ikke er belyst i detalj, har under-søkelser hittil avslørt at en viktig faktor for den sekundære signaltransmisjon er interaksjonen av CD2 8 (også betegnet Tp44-, T44- eller 9.3-antigen), som er et celleoverflatemolekyl hovedsakelig uttrykt på T-celler og thymusceller, med CD80 (også betegnet B7-1, B7, BB1 eller B7/BB1), som er et celleoverflatemolekyl uttrykt på antigenpresenterende celler (makrofager, monocytter, dendrittceller etc.), og med CD86 (også betegnet B7-2 eller B70), som også er et celleoverflatemolekyl på antigenpresenterende celler (nemlig celleadhesjon gjennom binding mellom disse molekyler). Det er dessuten funnet eksperimentelt at interaksjonen av cytolytisk T-lymfo-cyttassosiert antigen 4 (CTLA-4), hvis ekspresjon antas å bli forhøyet avhengig av det sekundære signal, med CD80 (B7-1) og CD86 (B7-2) (nemlig celleadhesjon gjennom binding mellom disse molekyler) også spiller en viktig rolle ved regulering av T-celleaktivering ved hjelp av det sekundære signal. Med andre ord involverer reguleringen av T-celleaktivering ved transmisjon av det sekundære signal minst interaksjon mellom CD28 og CD80/CD86, forhøyelse av CTLA-4-ekspresjon som antas å være avhengig av interaksjonen, og interaksjonen mellom CTLA-4 og CD80/CD86.

CD28 er kjent for å være et kostimulatormolekyl som overfører det sekundære signal (kostimulerende signal) som fordres for aktivering av T-celler og for å unngå anergi. Det sekundære signal overført ved å binde dette molekyl til ko-stimulatormolekyler, CD80 (B7-1) og CD86 (B7-2), på antigenpresenterende celler (celleadhesjon gjennom binding mellom disse molekyler) stabiliserer mRNA til cytokiner av Thl-type og fremmer følgelig produksjon fra T-celler av en stor mengde cytokiner av Thl-type, slik som IL-2, IFNy og TNFa. Ekspresjonen av CTLA-4 induseres av det primære signal transmittert gjennom TcR/CD3, og ekspresjonen forhøyes også av det sekundære signal transmittert ved bindingen mellom CD28 og CD80. Det er oppdaget at CTLA-4 mottar disse signaler og gjør at T-cellefunksjon inhiberes, hvilket står i motsetning til aktiveringen av T-celler ved hjelp av det sekundære signal transmittert av CD28.

Humant CD28 og CTLA-4 er glykoproteiner av I-type med molekylvekter på henholdsvis 44 kD og 41-43 kD. Begge har et immunglobulinlignende domene som tilhører immunglobulinsuperfamilien, og de har begge funksjon som et celleadhesjons-molekyl og virker som et signaltransmisjonsmolekyl.

Humant CD28 danner en homodimer med en disulfidbinding, mens CTLA-4 eksisterer som en monomer. Både CD28- og CTLA-4-gener er lokalisert ved "2q33" på humant kromosom og "1C" på musekromosom, og er sammensatt av fire exoner. Humant CD28 og CTLA-4 består av henholdsvis 220 og 223 aminosyrer, inkludert ledersekvensene, og aminosyrehomologi mellom dem er 20-30 %.

Ligandene for CD28 og CTLA-4 er CD80 (B7-1) og CD86 (B7-2) hos mennesker og mus. CTLA-4 har ca. 20 ganger så høy affinitet for begge ligander som CD28. Det er funnet at amino-syresekvensstrukturene "MYPPPY (Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr)" konservert gjennom dyrearter er viktig for bindingen av CD28 og CTLA-4 til CD80 (B7-1). Det er også rapportert at når CD28 stimuleres, så assosierer PI3-kinase (fosfoinositid-3-kinase, PI3K) med den fosforylerte tyrosinrest i en partiell sekvens, "YMNM (Tyr-Met-Asn-Met)", av CD28, og at CD28 spiller en viktig rolle ved intracellulær signaltransmisjon gjennom denne "YxxM"-struktur. Det er dessuten rapportert at CTLA-4 også har en sekvens representert ved "YxxM", nemlig "YVKM (Tyr-Val-Lys-Met)", i dets cytoplasmatiske område, og at etter at det er

stimulert, assosierer SYP med denne sekvens.

CD28 uttrykkes spesifikt i thymocytter og T-celler fra perifert blod, og CTLA-4 uttrykkes spesifikt i aktiverte T-celler (Cell Engineering: SUPPLEMENT, "Handbook of Adhesion Molecule", Shujunsha, s. 93-102 (1994); ibid., s. 120-136; Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Bio Science Term Library, Immunity", Yodosha, s. 94-98 (1995); Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Bio Science Term Library, Intracellular Signal Transduction", Yodosha, s. 58-59 (1997); Nihon Rinsho, vol. 55, nr. 6, s. 215-220 (1997)).

Ved reguleringen av T-cellefunksjon (aktiveringen og inhiberingen av funksjonen av T-celler) er betydningen av interaksjoner blant multiple molekyler, slik som kostimulator-molekyler (CD28, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) etc.) og CTLA-4, som samarbeider med disse (med andre ord celleadhesjon gjennom binding mellom disse molekyler), således erkjent, og dette har trukket oppmerksomhet mot slektskapet mellom disse molekyler og sykdommer, og behandlingen av sykdommer ved å regulere funksjonen av disse molekyler.

Som beskrevet ovenfor, selv om en levende kropp aktiverer dens ervervede immunresponssystem mot antigener som er fremmedlegemer for den levende kropp, har den også immunologisk toleranse slik at den ikke viser noen immunrespons mot dens egen komponent (autoantigen). Hvis immunologisk toleranse bryter sammen av noen årsak, forekommer immunrespons mot auto-antigenene, autoantigenreaktive T-celler induseres av den samme mekanisme som nevnt ovenfor og medfører en unormal immunitetstilstand, og forårsaker forskjellige autoimmunsykdommer .

Med andre ord, fordi ikke-stimulerte, antigenpresenterende celler (APC) i normale vev ikke uttrykker kostimulerende molekyler når immunsystemet i en levende kropp er normalt, befinner T-cellene seg i den ureagerende tilstand for å opprettholde immunologisk toleranse, selv dersom autoantigenreaktive T-celler, som reagerer med autoantigen, eksisterer. Det er blitt antydet at i en unormal immunitetstilstand blir flere autoantigenreaktive T-celler aktivert på grunn av unormalt overskudd og kontinuerlig ekspresjon av kostimulerende molekyler, hvilket derved forårsaker autoimmunsykdommer .

Ut fra slike synspunkter er det i den senere tid foreslått mange forsøk for å behandle forskjellige autoimmunsykdommer ved å modulere transmisjonen av kostimulerende signaler, f.eks. den ovennevnte signaltransmisjon mellom CD28/CTLA-4 og CD80/CD86.

Det er blitt observert at CD80, et kostimulerende molekyl som liganden av CD28 og CTLA-4, blir unormalt uttrykt i de antigenpresenterende celler ved fokus for autoimmun-sykdom, slik som reumatoid artritt, multippel sklerose, autoimmun tyreoiditt, allergisk kontakttypedermatitt og kronisk inflammatorisk dermatose, slik som lichen planus og psoriasis. Fra en slik observasjon er det gjort mange forsøk på å behandle forskjellige autoimmunsykdommer ved å modulere funksjonen av CD80.

Det er blitt foreslått å blokkere funksjonen av CD80 ved hjelp av metoder som anvender et antistoff mot CD80, opp-løst protein av CD28, som er en ligand av CD80, og oppløst protein av CTLA-4, som også er en ligand av CD80. Basert på det faktum at bindingsaffiniteten av CTLA-4 til CD80 er 20 ganger, eller mer, høyere enn affiniteten av CD28, ble det spesielt utført terapeutiske forsøk ved anvendelse av "oppløst CTLA-4", spesielt fusjonsproteinet (CTLA-4-IgFc), som omfatter det ekstracellulære domenet av "CTLA-4", og Fc-området av humant immunglobulin IgGl, i en dyremodell og i kliniske tester (Nihon Rinsho, vol. 55, nr. 6, s. 215-220 (1997)).

Som vist under punktene 1-5 nedenfor, er det blitt rapportert terapeutiske effekter av CTLA-4-IgFc i modelldyr for autoimmunsykdommer. 1. I en (NZB/NZW)Fl-mus, som er en modell for human systemisk lupus erythematosus (SLE), ble produksjonen av autoantistoffer og tilsynekomsten av lupus nephritis undertrykt ved administrering av CTLA-4-IgFc før tilsynekomsten, og de patologiske tilstander ble forbedret ved administrering av legemidlet, selv etter tilsynekomsten (Science, vol. 125, s. 1225-1227 (1994)). 2. Ved eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE), som er en modell for multippel sklerose (MS), ble tilsynekomsten forhindret ved korttidsadministrering av CTLA-4-IgFc umiddelbart etter immunisering (J. Clin. Invest., vol. 95, s. 2783-2789 (1995)). 3. I en NOD(ikke-fedmediabetes)-mus, som er en modell for insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM), ble tilsyne-komsthastigheten markert redusert ved administrering av CTLA-4-IgFc til de 2 eller 3 uker gamle hunnmus i 2 uker (J. Exp. Med., vol. 181, s. 1145-1155 (1995)). 4. Ved rottenefritt er ved hjelp av renal glomerulus-basismembranimmunitet, Goodpastures nefrittmodell, forbed-ringen av symptomet økt ved administrering av CTLA-4-IgFc (Eur. J. Immunol., vol. 24, nr. 6, s. 1249-1254 (1994)). 5. Ved type II-kollagenindusert artritt (CIA) ved anvendelse av en DBA/l-mus, som er en modell for human reumatoid artritt, ble tilsynekomsten av artritt undertrykt ved administrering av testlegemidlet ved tidspunktet for immuniseringen, og produksjonen av autoantistoffer (IgGl og IgG2) mot kollagen ble inhibert (Eur. J. Immunol., vol. 26,

s. 2320-2328 (1996)).

Resultatene fra eksperimentene nevnt ovenfor har hittil ikke klargjort i detalj mekanismen for T-celle-aktiveringen ved interaksjon mellom kostimulerende molekyler og de beslektede molekyler (med andre ord celleadhesjon gjennom binding mellom disse molekyler). Andre ukjente molekyler kan være involvert i denne mekanisme.

Redoglia V et al., Eur. J. Immunol., vol. 26, 1996, pp. 2781-2789 beskriver det murine T-cellespesifike overflatemolekylet H4, som ble isolert ved å benytte det monoklonale antistoffet C3 98.4A.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter et polypeptid, kjennetegnet ved at det utgjør et celleoverflatemolekyl utvalgt fra gruppen bestående av: (1) et polypeptid som omfatter amminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 2, (2) polypeptid som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 2, hvori én til ti aminosyrer er substituert, deletert eller tilføyd med de følgende karakteristika: (a) celleoverflatemolekylet blir i det minste uttrykt i tymocytter og mitogenstimulerte lymfoblastceller; (b) et antistoff som reagererer med celleoverf latemolekylet, induserer adhesjon mellom mitogenstimulerte lymfoblastceller; (c) et antistoff som reagerer med celleoverf latemolekylet , induserer proliferasjon av perifere blodlymfocytter i nærvær av et antistoff mot CD3; (d) celleoverflatemolekylet har en partiell aminosyresekvens representert ved Phe-Asp-Pro-Pro-Pro-Phe i dets ekstracellulære område; og (e) celleoverflatemolekylet har en partiell aminosyresekvens representert ved Tyr-Met-Phe-Met i dets cytoplasmatiske område.

Oppfinnelse omfatter videre et polypeptidfragment, kjennetegnet ved at det omfatter det ekstracellulære området av polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, hvori det ekstracellulære området tilsvarer aminosyrerestene 1 til 141 i

SEKV.ID. NR. 4.

Videre omfatter oppfinnelsen et gen, kjennetegnet ved at det koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse eller polypeptidfragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse.

Oppfinnelsen omfatter også en vektor, kjennetegnet ved at den omfatter genet ifølge foreliggende oppfinnelse.

Også omfattet av oppfinnelsen er en transformant, kjennetegnet ved at vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse er innføyd i denne.

Videre omfatter oppfinnelsen et fusjonspolypeptid, kjennetegnet ved at det omfatter det ekstracellulære området av polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, og et konstant område av en humanimmunglobulin(lg)-tung-kjede, eller en del av det konstante området.

Også omfattet av oppfinnelsen er et homodimert molekyl som omfatter to polypeptidfragmenter ifølge foreliggende oppfinnelse, eller to fusjonspolypeptider ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at de to polypeptidfragmentene eller de to fusjonspolypeptidene er broforbundet med hverandre gjennom disulfidbindinger.

Oppfinnelsen omfatter videre et farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det enten omfatter polypeptidfragmentet foreliggende oppfinnelse eller det homodimere molekyl ifølge foreliggende oppfinnelse, eller begge, eller fusjonspolypeptidet ifølge oppfinnelsen, eller homodimermolekylet ifølge oppfinnelsen, eller begge, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Omfattet av oppfinnelsen er også et antistoff, eller en del av dette, kjennetegnet ved at det reagerer med polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, polypeptidfragmentet ifølge oppfinnelsen, eller celleoverflatemolekylet som omfatter polypeptidet.

Oppfinnelsen omfatter også et hybridom, kjennetegnet ved at det produserer det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse.

Oppfinnelsen omfatter videre en transgen mus, hvori genet som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse er integrert i dens endogene gen, kjennetegnet ved at genet er et humanavledet gen som omfatter nukleotidsekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 1.

Oppfinnelsen omfatter en knockout-mus, kjennetegnet ved at dens endogene gen som koder for musepolypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, er inaktivert slik at polypeptidet ikke produseres.

Farmasøytiske midler anvendelige for behandling eller forebyggelse av forskjellige sykdommer, slik som de ovennevnte autoimmunsykdommer, allergiske sykdommer og inflammatoriske sykdommer, kan utvikles dersom mekanismen for aktiveringen av lymfocytter,' slik som T-celler, ved celleadhesjon gjennom bindingen mellom molekyler involvert i transmisjonen av det sekundære signal som er essensielt for aktiveringen av lymfocytter, slik som T-celler, nevnt ovenfor, og mekanismene for reguleringen av lymfocyttfunksjon, er klargjort, og kjente eller ukjente molekyler som er i stand til å formidle celleadhesjon involvert i mekanismen, og overføre signaler, blir identifisert og karakterisert.

Et mål for foreliggende oppfinnelse er å identifisere nye celleoverflatemolekyler som har begge funksjoner for for-midling av en slik celleadhesjon og signaltransmisjon, og å klargjøre dens strukturelle og biologiske karakteristika. Et annet mål for oppfinnelsen er å tilveiebringe farmasøytiske midler som er anvendelige for behandling eller forebyggelse av forskjellige autoimmunsykdommer og inflammatoriske sykdommer, ved å anvende de nye molekyler eller antistoffer mot molekylene .

For å identifisere slike anvendelige molekyler har de foreliggende oppfinnere fokusert på det faktum at lymfocytter, slik som T-celler, spiller en viktig rolle ved autoimmunsykdommer og allergiske sykdommer, og det faktum at celleadhesjon er essensiell for signaltransmisjonen av det sekundære signal (kostimulerende signal) fra antigenpresenterende celler til lymfocytter, og de planla å isolere og identifisere celleoverflatemolekyler som blir spesifikt uttrykt på lymfocyttceller, og som formidler celleadhesjon.

De foreliggende oppfinnere fremstilte monoklonale antistoffer mot forskjellige celleoverflatemolekyler uttrykt på overflaten av lymfocyttceller ved å immunisere dyr mot lymfocyttcellene, og de isolerte og identifiserte ønskede celleoverflatemolekyler som formidler celleadhesjon ved anvendelse av de således fremstilte monoklonale antistoffer. De anvendte metoder er beskrevet i detalj nedenfor.

Oppfinnerne administrerte først en rottelymfocytt-cellelinje som et antigen mot mus og fremstilte forskjellige monoklonale antistoffer. De fremstilte monoklonale antistoffer ble deretter reagert med rottelymfocyttceller anvendt som et antigen, og de testet effekten av de monoklonale antistoffer gitt til cellene. Som et resultat ble ett av de monoklonale antistoffer funnet å agglutinere rottelymfocyttcellene sterkt (dette monoklonale antistoff ble betegnet "JTT-l-antistoff"). Et annet av de monoklonale antistoffer ble dessuten funnet å sterkt inhibere agglutineringen av rottelymfocyttceller indusert av "JTT-l-antistoffet" (dette monoklonale antistoff ble betegnet "JTT-2-antistoff").

Fordi agglutineringen av rottelymfocyttceller med "JTT-l-antistoff" ikke ble inhibert av antistoffer mot intercellulaert adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) eller lymfocyttfunksjonsassosiert antigen-1 (LFA-1), som er de mest representative kjente celleadhesjonsmolekyler uttrykt på cellene, antok de foreliggende oppfinnere at denne agglutinering var forårsaket av celleadhesjon gjennom ukjente adhesjonsmolekyler som formidler celleadhesjon.

Celleoverflatemolekyler (betegnet "JTT-1-antigen" og "JTT-2-antigen") gjenkjent av hvert av disse to monoklonale antistoffer, ble deretter identifisert, isolert og karakterisert .

Analysen av ekspresjonsmønstrene for "JTT-1-antigen" og "JTT-2-antigen" i forskjellige celler ble først analysert ved hjelp av strømningscytometri basert på fluorescerende antistoff teknikk ved anvendelse av "JTT-l-antistof f11 og " JTT - 2-antistoff". Mens både "JTT-1-antigen" og "JTT-2-antigen" ble sterkt uttrykt i aktiverte lymfoblastceller (aktiverte T-lymfoblastceller, aktiverte B-lymfoblastceller etc.) som var aktivert ved å stimulere thymocytter og miltceller med spesielt Concanavalin A (ConA), et mitogen, i de aktiverte lymfoblastceller, ble ekspresjon nesten ikke funnet i miltceller som ikke var stimulert i det hele tatt (disse celler betegnes iblant "hvilende lymfocytter" heri). Ekspresjons-mønstrene for molekyler gjenkjent av hvert av "JTT-l-antistof f" og "JTT-2-antistoff" var nesten de samme.

Ved anvendelse av en affinitetskolonne preparert ved å binde "JTT-l-antistoff" til adsorpsjonsmidler, ble molekyler innfanget av "JTT-l-antistoffet", nemlig "JTT-1-antigener", renset fra blandingen av oppløselige celleoverflatemolekyler fremstilt fra de ovenfor beskrevne rottelymfocyttceller. Mole-kylvektene av disse rensede "JTT-1-antigener" ble analysert ved immunutfelling ved anvendelse av "JTT-l-antistoff" og <»>JTT-2-antistoff", og ved hjelp av SDS-PAGE. Som et resultat ble det funnet at molekyler som ble immunutfelt av både "JTT-l-antistof f et" og "JTT-2-antistoffet", var de samme, og at hvert molekyl var en homodimer med forskjellige sukkerkjeder. Når N-koblede sukkerkjeder ikke ble avspaltet, ble spesielt molekylene identifisert som ett molekyl på ca. 47 kD under ikke-reduserende betingelser, og som to molekyler på ca. 24 kD og ca. 28 kD under reduserende betingelser; når N-koblede sukkerkjeder ble avspaltet, ble molekylene identifisert som ett molekyl på ca. 36 kD under ikke-reduserende betingelser, og som ett molekyl på ca. 20 kD under reduserende betingelser.

Adhesjonen av rottetymocytter til platen belagt med det rensede "JTT-1-antigen" ble deretter analysert. Som et resultat adhererte tymocytter kun til platen i betydelig grad (nemlig til "JTT-1-antigen") i nærvær av "JTT-l-antistoff", og adhesjonen ble vesentlig inhibert ved samtidig tilstedeværelse av "JTT-2-antistoff", hvilket indikerer at "JTT-1-antigen" var det celleoverflatemolekyl som formidlet celleadhesjon.

De foreliggende oppfinnere klonet deretter gener som koder for "JTT-1-antigen" fra rotter, mennesker og mus, og analyserte deres strukturer.

cDNA som koder for den fulle lengde av "rotte-JTT-1-antigen", ble først isolert fra cDNA-biblioteket dannet fra lymfoblastene avledet fra ConA-stimulert rottemilt ved hjelp av en ekspresjonskloningsmetode som anvender panoreringsmetoden ved benyttelse av "JTT-l-antistoff", og et fullstendig nytt rottegen ble isolert og identifisert ved bestemmelse av dets nukleotidsekvens ved hjelp av dideoksymetoden. cDNA som koder for den fulle lengde av humant "JTT-1-antigen", ble også isolert fra cDNA-biblioteket dannet fra ConA-stimulerte human-lymfoblaster fra perifert blod ved plakkhybridisering, ved anvendelse av det således oppnådde cDNA som koder for "rotte-JTT-1-antigen" som en probe, og et fullstendig nytt humant gen ble isolert og identifisert ved bestemmelse av dets nukleotidsekvens ved hjelp av dideoksymetoden. cDNA som koder for den fulle lengde av "muse-JTT-1-antigen", ble likeledes isolert fra cDNA-biblioteket dannet fra lymfoblastene avledet fra ConA-stimulert musemilt, og et fullstendig nytt musegen ble isolert og identifisert ved bestemmelse av dets nukleotid-

sekvens ved hjelp av dideoksymetoden. cDNA som koder for den fulle lengde av den alternative spleisingsvariant av "rotte-JTT-1-antigen" nevnt ovenfor, ble dessuten likeledes isolert fra cDNA-biblioteket dannet fra rottetymomcellelinjen, og et annet, fullstendig nytt rottegen ble isolert og identifisert ved bestemmelse av dets nukleotidsekvens ved hjelp av dideoksymetoden .

"JTT-1-antigen" ble funnet å være et transmembranprotein (celleoverflatemolekyl) sammensatt av en signalsekvens, et ekstracellulært område inneholdende glykosyler-ingssetet (-setene), et transmembranområde og et intracellu-lært område, ved hjelp av hydropatiplotanalyse av aminosyresekvensen kodet for av det isolerte cDNA for "humant JTT-1-antigen". Homologisøk med kjente molekyler avslørte at "JTT-1-antigener" fra rotter, mennesker og mus ikke hadde noen signifikant homologi med noen kjente molekyler, inkludert celleadhesjonsmolekyler, hvilket indikerer at de er nye celleoverf latemolekyler som formidler celleadhesjon.

Som et resultat av motivsøk basert på aminosyresekvensen av "humant JTT-1-antigen", ble det funnet at "humant JTT-1-antigen" hadde strukturell likhet med det ovennevnte "CD28", et celleoverflatemolekyl på lymfocytter, sik som T-celler, som overfører et kostimulerende signal som er viktig for T-celleaktivering gjennom celleadhesjon, og med "CTLA-4", et celleoverflatemolekyl på lymfocytter, slik som T-celler, som regulerer funksjonene av aktiverte lymfocytter, slik som aktiverte T-celler, som samarbeider med signalet.

Den strukturelle likhet er som følger.

1. 20 eller flere aminosyrerester, inkludert cysteinrester, er konservert i høy grad. 2. Den gjentatte prolinsekvens, "Pro-Pro-Pro (PPP)", som er essensiell som ligandbindingsområdet, konserveres i det ekstracellulære området. 3. En sekvens, "Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM)" (Xaa og x representerer enhver aminosyre), som er essensiell som signaltransmisjonsområdet, er konservert i det cytoplasmatiske området.

Beliggenheten av genet som koder for "muse-JTT-1-antigen" på musekromosom, ble funnet å være "1C3", som er den samme beliggenhet som for muse-"CD28" og -"CTLA-4", ved anvendelse av f luorescens-i.n si fcu-hybridiseringsmetoden (FISH) .

Effektiviteten av terapi av autoimmunsykdommer og allergiske sykdommer ved å regulere funksjonen av "JTT-1-antigen", ble deretter undersøkt ved hjelp av eksperimenter hvor "JTT-2-antistoff", nevnt ovenfor, ble administrert til modellrotter for eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE) og glomerulusbasismembran(GBM)nefritt. Det ble funnet at de patologiske tilstander ble betydelig undertrykt i begge sykdomsmodelldyr, og at autoimmunsykdommer eller allergiske sykdommer kan behandles ved å regulere funksjonene av "JTT-1-antigen".

Det ble også funnet at det monoklonale antistoff mot "humant JTT-1-antigen" i betydelig grad prolifererte humane perifere blodlymfocytter, og at proliferasjonen ble ytterligere forhøyet ved samtidig tilstedeværelse av et monoklonalt antistoff mot CD3 bestående av et TcR/CD3-kompleks på T-celler, som mottar det primære signal som er essensielt for T-celleaktivering fra antigenpresenterende celler, hvilket indikerer at "JTT-1-antigen" var et celleoverflatemolekyl involvert i signaltransmisjon inn i lymfocytter.

De foreliggende oppfinnere lyktes videre med å produsere et fusjonspolypeptid omfattende det ekstracellulære området av "humant JTT-1-antigen" og Fc-området av humant immunglobulin. Fusjonspolypeptidet er anvendelig som farma-søytisk middel for behandling av autoimmunsykdommer, allergiske sykdommer og inflammatoriske sykdommer, ved å regulere funksjonene av "JTT-1-antigen" og/eller dets ligand.

De foreliggende oppfinnere lyktes dessuten med å frembringe en transgen mus, i hvilken det ble innført et gen som koder for "JTT-1-antigen" fra andre dyrearter. Den transgene mus er anvendelig for analyse av detaljerte funksjoner av "JTT-1-antigen", og for å utvikle farmasøytiske midler for behandling av autoimmunsykdommer, allergiske sykdommer og inflammatoriske sykdommer. Oppfinnerne produserte også en knockout-mus, i hvilken det endogene gen som koder for "muse-JTT-1-antigen" var inaktivert. Denne knockout-mus er også anvendelig for de ovenfor angitte formål.

Foreliggende oppfinnelse angår polypeptider, gener, antistoffer, vektorer, transformanter, farmasøytiske preparater, transgene mus, knockout-mus osv., som er relevante for et nytt pattedyr-"JTT-1-antigen" isolert og identifisert som nevnt ovenfor. Nærmere bestemt angis det som er beskrevet under punktene (1) til (3 6) nedenfor. (1) Et polypeptid som utgjør et celleoverflatemolekyl med de nedenfor angitte karakteristika, (a) celleoverflatemolekylet uttrykkes i det minste i tymocytter og mitogenstimulerte lymfoblastceller, (b) et antistoff som er reaktivt overfor celleoverf latemolekylet , induserer adhesjon mellom mitogenstimulerte lymfoblastceller, (c) et antistoff som er reaktivt overfor celleoverf latemolekylet , induserer proliferasjon av perifere blodlymfocytter i nærvær av et antistoff mot CD3, (d) celleoverflatemolekylet har en partiell aminosyresekvens representert ved Phe-Asp-Pro-Pro-Pro-Phe i dets ekstracellulære område, og (e) celleoverflatemolekylet har en partiell aminosyresekvens representert ved Tyr-Met-Phe-Met i dets cytoplasmatiske område. (2) Polypeptidet ifølge (1) omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 2, eller aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 2 hvori én eller flere aminosyrer er erstattet, fjernet eller tilføyd. (3) Polypeptidet ifølge (1), som kodes for av et DNA som hybridiserer under stringente betingelser med et DNA med nukleotidsekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 1. (4) Polypeptidet ifølge (1), som omfatter en aminosyresekvens med 60 % eller mer homologi med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR. 2. (5) Polypeptidet ifølge ethvert av punktene (1) til (4), hvori celleoverflatemolekylet er avledet fra menneske. (6) Et gen som koder for polypeptidet ifølge ethvert av punktene (1) til (5).

(7) Genet ifølge (6), som er et cDNA.

(8) Genet ifølge (7), hvori cDNA har en nukleotidsekvens ifølge SEKV.ID. NR. 1. (9) Genet ifølge (7), hvori cDNA omfatter en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 26-625 av SEKV.ID. NR. 3, nukleotidrester 35-637 av SEKV.ID. NR. 4, nukleotidrester 1-603 av SEKV.ID. NR. 5 eller nukleotidrester 35-685 av SEKV.ID. NR. 6. (10) Vektor omfattende genet ifølge ethvert av punktene (6) til (9). (11) En transformant, hvori vektoren ifølge (10) er blitt innført. (12) En transformant identifisert ved en internasjonal deponering med aksesjonsnummer FERM BP-5725. (13) Et polypeptidfragment omfattende et ekstracellulært område av polypeptidet ifølge ethvert av punktene

(1) til (5) .

(14) Polypeptidfragmentet ifølge (13), som er et humanavledet polypeptid med en aminosyresekvens ifølge

SEKV.ID. NR. 2.

(15) Et gen som koder for polypeptidfragmentet ifølge

(13) eller (14).

(16) Et homodimert molekyl omfattende to polypeptidfragmenter, hvori hvert av fragmentene omfatter et ekstracellulært område av polypeptidet ifølge ethvert av punktene (1) til (5), og de to polypeptidfragmenter er broforbundet med hverandre gjennom disulfidbindinger. (17) Det homodimere molekyl ifølge (16), hvori polypeptidet er et humanavledet polypeptid med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR. 2. (18) Et farmasøytisk preparat omfattende enten polypeptidfragmentet ifølge (14) eller det homodimere molekyl ifølge (17), eller begge, og en farmasøytisk akseptabel bærer. (19) Et fusjonspolypeptid omfattende et ekstracellulært område av polypeptidet ifølge ethvert av punktene (1) til (5), og et konstant område av en humanimmunglobulin(lg)-tungkjede, eller en del av det konstante området. (20) Fusjonspolypeptidet ifølge (19), hvori immunglobulinet er IgG. (21) Fusjonspolypeptidet ifølge (19), hvori delen av det konstante området omfatter et hengselområde, C2-domene og C3-domene av IgG. (22) Fusjonspolypeptidet ifølge ethvert av punktene (19) til 21, som er et humanavledet polypeptid med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR. 2. (23) Et homodimert molekyl omfattende to fusjonspolypeptider ifølge ethvert av punktene (19) til (22), hvori de to polypeptider er broforbundet med hverandre gjennom disulfidbindinger. (24) Homodimert molekyl omfattende to fusjonspolypeptider ifølge (22), hvori de to polypeptider er broforbundet med hverandre gjennom disulfidbindinger. (25) Et farmasøytisk preparat omfattende enten fusjonspolypeptidet ifølge (22) eller det homodimere molekyl ifølge (24), eller begge, og en farmasøytisk akseptabel bærer. (26) Det farmasøytiske preparat ifølge (25), som benyttes for behandling av autoimmunsykdommer eller allergiske sykdommer, eller for forebyggelse av sykdomssymptomene. (27) Et antistoff, eller en del av dette, som er reaktivt med polypeptidet ifølge ethvert av punktene (1) til (5), polypeptidfragmentet ifølge (13) eller (14), eller celleoverf latemolekylet som omfatter polypeptidet. (28) Antistoffet ifølge (27), eller en del av dette, som er et monoklonalt antistoff. (29) Et monoklonalt antistoff, eller en del av dette, som er reaktivt med polypeptidet med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR. 2, polypeptidfragmentet ifølge (14), eller det humanavledete celleoverflatemolekyl som omfatter polypeptidet . (30) Et monoklonalt antistoff, eller en del av dette, som er reaktivt med polypeptidet ifølge ethvert av punktene (1) til (5), eller celleoverflatemolekylet som omfatter polypeptidet, hvori effekten av det monoklonale antistoff på mitogenstimulerte lymfoblastceller er vesentlig den samme som effekten av et monoklonalt antistoff produsert ved hjelp av en hybridom identifisert ved en internasjonal deponering med aksesjonsnummer FERM BP-5707, på mitogenstimulerte rotte-lymf oblastceller . (31) Et monoklonalt antistoff, eller en del av dette, som er reaktivt med polypeptidet ifølge ethvert av punktene (1) til (5) , eller celleoverflatemolekylet som omfatter polypeptidet, hvori effekten av det monoklonale antistoff på mitogenstimulerte lymfoblastceller er vesentlig den samme som effekten av et monoklonalt antistoff produsert ved hjelp av en hybridom identifisert ved en internasjonal deponering med aksesjonsnummer FERM BP-5708, på mitogenstimulerte rotte-lymf oblastceller . (32) Et farmasøytisk preparat omfattende det monoklonale antistoff ifølge (29), eller en del av dette, og en farmasøytisk akseptabel bærer. (33) Det farmasøytisk preparat ifølge (32), som benyttes for behandling av autoimmunsykdommer eller allergiske sykdommer, eller for forebyggelse av sykdomssymptomene. (34) En hybridom, som produserer det monoklonale antistoff ifølge ethvert av punktene (28) til (31). (35) En transgen mus, i hvilken et gen som koder for polypeptidet ifølge (1), som er et humanavledet gen omfattende en nukleotidsekvens ifølge SEKV.ID. NR. 1, eller et rotte-avledet gen som omfatter en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrestene 35-637 ifølge SEKV.ID. NR. 4, er integrert i dens endogene gen. (36) En knockout-mus, i hvilken dens endogene gen som koder for musepolypeptidet ifølge oppfinnelsen, omfattende aminosyresekvensen som kodes for av genet ifølge SEKV.ID. NR. 5, er inaktivert slik at musepolypeptidet ikke produseres.

Som beskrevet ovenfor, er celleoverflatemolekylet som beskrevet heri ("JTT-1-antigen") involvert i celleadhesjon, signaltransmisjon inn i lymfocytter, slik som T-celler, og regulering av funksjon av aktiverte lymfocytter. Generell kunnskap om lymfocyttiske celler, celleadhesjonsmolekyler og forholdet mellom disse og sykdommer er beskrevet nedenfor for å gi en generell forståelse av disse biologiske hendelser, men den følgende generelle kunnskap skal ikke benyttes for en begrensende fortolkning av foreliggende oppfinnelse.

Lymfocytter blir grovt klassifisert i to typer, T-celler og B-celler. Etter differensiering fra multipotente stamceller i benmarg til lymfoidstamceller strømmer noen av disse inn i blodet og når thymus. Lymfocytter differensiert og modnet i thymus, som betegnes T-celler (thymusavledete T-celler), strømmer inn i blodet på nytt og sirkulerer gjennom hele kroppen. Modne T-celler har et molekyl betegnet CD3 på overflaten. Eksistensen av CD3-molekyler er en markør som bestemmer hvorvidt cellene er modne T-celler eller ikke. CD3 er en overbevisende T-cellemarkør. T-celler uttrykker dessuten CD4 eller CD8. T-celler er klassifisert i hjelper-T-celler (Th-celler) som assisterer antistoffproduksjonen ved hjelp av B-lymfocytter, cytotoksiske T-celler (Tc-celler, CTL) eller dreper-T-celler som er bundet til målceller for å ødelegge dem direkte, suppressor-T-celler som undertrykker antistoffproduksjonen ved hjelp av B-lymfocytter og effektor-T-celler som utskiller effektorstoffer, slik som lymfokiner, og forårsaker forsinket allergi.

B-celler er avledet fra lymfoidstamcellene som er differensiert og modnet i benmarg. B-celler er antistoffproduserende forløperceller fordi de produserer antistoffer med en passende stimulus. B-celler har immunglobuliner på celleoverflaten, og disse var produsert i en celle. Slike immunglobuliner virker som reseptorer for antigener. Modne B-celler har både IgM og IgD på overflaten. Dersom B-celler blir differensiert med antigenstimulering og signaler fra T-celler, øker produksjonen av IgM, og deres C-terminale cellemembran-bindingsområder endres slik at de utskilles. Med tilstrekkelig stimulering endres ikke kun overflateimmunglobulinene til IgG, IgE og IgA, men immunglobulinene av hver klasse blir også utskilt. Immunglobulinet på B-celleoverflaten blir iblant betegnet som sig, en forkortelse for overflate-Ig, eller mig, en forkortelse for membran-lg. Alle lg på overflaten av den samme B-celle har de samme antigenbindingsseter.

Det finnes lymfocytter betegnet store granulære lymfocytter (LGL) eller null celler, som verken er T-celler eller B-celler. Disse celler kan ødelegge tumorceller og virusinfiserte celler uten forhåndsstimulering med antigen, hvilket er sammenlignbart med tilfellet med cytotoksiske T-celler. Således blir de også betegnet som naturlige dreperceller (NK-celler).

Blant T-cellene nevnt ovenfor utskiller CD4-positive T-celler forskjellige cytokiner, de nyuttrykker reseptorer for disse cytokiner, forstørrer deres egen størrelse, starter celledeling og prolifererer når de reagerer med antigener presentert ved hjelp av antigenpresenterende celler. Før disse reaksjoner på cellenivået vil komplekset av antigenpeptidene på antigenpresenterende celler og molekyler av MHC-klasse II bindes til den tilsvarende T-celleantigenreseptor (TCR) . Dette forårsaker forskjellige biokjemiske endringer i cellene, og signalet overføres inn i kjerner for å starte transkripsjonen av spesifikke DNA og produsere respektive proteiner. Som et resultat blir reaksjoner på cellenivået økt. Celler infisert med et virus produserer f.eks. virusproteiner, og de nedbrytes til peptider av proteaser i cytoplasmaet. En del av peptidene kommer inn i det endoplasmatiske retikulum gjennom TAP, danner stabilt kompleks med nylig produserte molekyler av MHC-klasse I og overføres til celleoverflaten. Peptidet overført til celleoverflaten gjenkjennes spesifikt av CD8-positive T-celler, men T-cellene kan ikke ennå ødelegge de infiserte celler på dette stadium. Disse T-celler, som er omsatt med antigenet, uttrykker IL-2-reseptor (IL-2R), differensieres til CTL-cellulær cytotoksisitet ved IL-2-virkning og ødelegger deres målceller for å drepe dem neste gang de møter det samme kompleks av antigenpeptid/MHC-klasse I. Nødvendige cytokiner for differensiering til CTL er ikke kun IL-2, men også IFNy eller andre cytokiner som antas å ha lignende virkninger. Lymfokiner som utskilles av T-celler, er således nødvendige for differensiering til CTL. Lymfokinene produseres som et resultat av at CD4-positive Thl-celler (CD4-positive T-celler som utskiller IL-2 eller IFNy) gjenkjenner antigenpeptidene avledet fra det samme virus med klasse II-molekyler. I noen tilfeller, uten hjelp av CD4-positive T-celler, reagerer CD8-positive T-celler med antigener og produserer IL-2 og andre cytokiner. Når CD8-positive T-celler differensieres til CTL, øker granuler i cytoplasmaet. Disse granuler omfatter forskjellige høymolekylære proteiner, representert ved perforin. Perforin ligner et membranangrepskompleks (MAC) sammensatt av de femte til de niende komplementkomponenter og lager hull i cellemembranen på målceller. Granulene omfatter dessuten serinproteaser, LT, proteoglykan etc. Dersom dessuten CD8-positive celler som er differensiert til CTL mottar antigenstimulering, utskiller de også lymfokiner som IFNy, LT, TNF eller IL-2. T-celler viser dessuten et blasttransformasjons-fenomen når de reagerer med hemagglutinin (fytohemagglutinin, PHA) eller ConA.

Modne T-celler som ikke er stimulert i det hele tatt, er betegnet som hvilende T-celler og har mindre cellestørrelse og kortere levetid, noen få dager. Når de mottar stimulering, blir cellene større, som allerede nevnt ovenfor, og reagerer lett ved forskjellige typer stimulering. Slike T-celler betegnes som aktiverte T-celler. En del av de aktiverte T-celler blir hukommelses-T-celler som bringer sekundær immunreaksjon hvis de mottar den samme antigenstimulering. Hukommelses-T-celler antas å holdes i sirkulasjon i kroppen i noen få år eller tiår.

B-celler som ikke er stimulert i det hele tatt, betegnes som hvilende B-celler, slik som i tilfellet med T-celler, og prolifererende B-celler stimulert med multivalente antigener eller CD40L, betegnes som aktiverte B-celler. Fordi hvilende B-celler ikke har noen kostimulerende molekyler som stimulerer T-celler med signaler gjennom TCR, slik som B7-1 (CD80) eller B7-2 (CD86), antas presentasjon av antigener til hvilende T-celler kun å stimulere TCR og ikke å være i stand til å uttrykke CD40-ligander (CD40L) eller produsere lymfokiner. Det antas derfor at aktiverte hjelper-T-celler stimulert med antigen som er presentert av andre antigenpresenterende celler, reagerer med antigenet presentert av hvilende B-celler. Det vil si at dersom et antigen først invaderer dendrittceller (celler med ekstremt dendrittiske projek-sjoner) , uttrykkes B7-molekyler, eller makrofager aktivert ved omsetning med mikroorganismer presenterer antigenet og stimulerer hvilende hjelper-T-celler til å aktivere dem til å uttrykke CD40L. De aktiverte hjelper-T-celler bindes deretter til hvilende B-celler som presenterer det samme antigen og stimulerer deres CD40. Når B-celler er aktivert ved stimulering med multivalente antigener eller CD40L, uttrykker de også B7-molekyler, aktiverer hjelper-T-celler ved å stimulere CD28 på deres overflate med TCR, og tillater hjelper-T-cellene å uttrykke CD40L eller produsere lymfokiner. B-celler som viser endringer, slik som ekspansjon av cellestørrelsen med stimulering, men som ikke viser antistoffsekresjon, betegnes som aktiverte B-celler. Dersom således modnede B-celler møter antigener, øker IgM-produksjonen sammen med stimuleringen fra T-celler, og de således produserte IgM-molekyler utskilles ved at de endres fra membrantypen til sekresjonstypen. De produserer dessuten isotypiske antistoffer foruten IgM, slik som IgG, etter de humorale faktorer fra T-celler. Dette betegnes som isotypeskift eller klasseskift. B-celler som utskiller antistoffer, betegnes som antistoffutskillende celler. En del av dem blir morfologisk karakteristiske celler og betegnes som plasmaceller (Knowledge of Immunology, Ohmsha (1996)).

Ved forskjellige reaksjoner i immunsystemet viser for øvrig subpopulasjonen av hvite blodceller, nemlig T-lymfocytter, B-lymfocytter, NK, nøytrofiler etc, ofte dynamikk som er forskjellig fra hverandre. Selv de samme lymfocytter som nevnt ovenfor viser dynamikk forskjellig fra hverandre, avhengig av hvorvidt cellene er aktivert eller hvilende. Disse fakta innebærer eksistensen av en gjenkjennelsesmekanisme som er spesifikk for subpopulasjonen av hvite blodceller, videre en gjenkjennelsesmekanisme som er spesifikk for tilstanden hos celler, og spesielt celleadhesjonsmolekyler (celleadhesjons-proteiner).

Celleadhesjonsmolekyler, eller celleadhesjons-proteiner, er generelt de molekyler som adhererer celler til hverandre under utvikling og differensiering av individer, eller ved migrasjon av celler til lokale steder, og de er kjent som essensielle molekyler for organiske og funksjonelle kontakter i en levende kropp.

Celleadhesjonsmolekyler blir grovt klassifisert fra deres strukturelle karakteristika i fem familier, immunglobulinsuperfamilien, integrinfamilien, selektinfamilien, cadherinfamilien og CD44-familien. Adhesjonsmolekyler som tilhører immunglobulinsuperfamilien, er kjennetegnet ved eksistensen av gjentatte løkkelignende domener dannet med disulfidbindinger. Eksempler på disse er intercellulært adhesjonsmolekyl-1, "ICAM-1", og vaskulært celleadhesjons-molekyl-1, "VCAM-1". Adhesjonsmolekyler som tilhører integrinfamilien, er dessuten kjennetegnet ved en a/p-heterodimer struktur. Eksempler på disse er meget sent antigen-1 til 6, "VLA-1 til 6", lymfocyttfunksjonsassosiert antigen-1, "LFA-1", "Mac-1" og "pl50/90". Molekyler som tilhører selektinfamilien, har et lektinlignende domene, et EGF-lignende domene og et komplementdomene i denne rekkefølge fra N-terminalen. Eksempler på disse er "E-selektin" og "P-selektin". Eksempler på cadherinfamilien er "E-cadherin", "N-cadherin" og "P-cadherin", og et eksempel på CD44-familien er "CD44".

Den spesifikke funksjon av disse adhesjonsmolekyler er kjent for å være adhesjon av hvite blodceller til vaskulære endotelceller, eller adhesjon av lymfocytter til antigenpresenterende celler. Fra forskjellige undersøkelser i den senere tid er det gradvis blitt avslørt at adhesjonsmolekyler ikke kun er involvert i disse funksjoner, men også i forskjellige sykdommer.

Nærmere bestemt foreligger det mange rapporter om sykdommer og ekspresjonsabnormalitet hos adhesjonsmolekyler. For reumatoid artritt (RA) ble det f.eks. rapportert at ekspresjonen av både "Mac-1" og "pl50/95" ble styrket i RA-synoviocytter (Allen, C. et al., Arthritis Rheum., vol. 32,

s. 947 (1989)). Det er også rapportert at forskjellige celler uttrykte "ICAM-1" sterkt og ektopisk på RA-synovialmembranen (Hale, L. et al., Arthritis Rheum., vol. 32, s. 22 (1989)). En annen rapport antydet at "ELAM-1" også var involvert i adhesjonen av nøytrofiler til vaskulære endotelceller, og at overekspresjonen av disse molekyler var involvert i infiltra-sjon av nøytrofiler (spesielt inn i synovialvæsken), hvilket er observert i RA-synovialvæsken (Laffon, A. et al., Arthritis Rheum., vol. 32, s. 386 (1989)). Sterk ekspresjon av "CD44" i vaskulære endotelceller og synoviocytter av A-type på RA-synovialmembranen ble rapportert (Heynes, B. et al., Arthritis Rheum., vol. 34, s. 1434 (1991)).

Det foreligger rapporter om sammenhengen mellom systemisk lupus erythematosus (SLE) og ekspresjonsabnormali-teten av adhesjonsmolekyler. Det ble f.eks. rapportert at adhesjonsevnen hos T-lymfocytter til dyrkede vaskulære endotelceller ble redusert hos SLE-pasienter sammenlignet med friske frivillige. I perifere lymfocytter hos SLE-pasienter ble adhesjonsmolekylene "ICAM-1", "VLA-4" og "IFA-1" sterkt uttrykt (Haskard, D.O. et al., Rheumatol. Int., vol. 9, s. 33

(1989) ) .

Ved autoimmune tyreoidsykdommer ble det rapportert at "ICAM-1" ble uttrykt når tyreoide follikkelceller ble stimulert med interf eron-y, interleukin-1 og tumornekrosefaktor, og at dannelsen av opphopninger av follikkelceller og mono-nukleære celler ble inhibert av anti-"ICAM-1"-antistoff (Weetman, A.P. et al., Eur. J. Immunol., vol. 20, s. 271

(1990) ).

Ved hepatitt antas det at sjansene for adhesjon mellom hepatocytter og inflammatoriske celler øker fordi det finnes to adhesjonsreaksjonsveier, "ICAM-1" og "LFA-3", og "LFA-1" og "CD2", for derved å fremme presentasjon av antigener og aktivering av inflammatoriske celler. Ved hepatitt B blir spesielt "LFA-3"-molekyler sterkt uttrykt i hepatocytter hvori virus prolifererer aktivt, og "ICAM-1" samsvarer godt med graden av hepatitt. Det antydes således at "LFA3" er involvert i eksklusjonen av virus, og at "ICAM-1" aktiverer T-celler til å presentere antigen og regulerer inflammasjons-reaksjon. I "ICAM-1"-negative og HBc-antigenpositive hepatocytter kan kronisk virusinfeksjon, en type immunreaktivitet, forekomme på grunn av at det ikke foreligger noen interaksjon mellom lymfocytter og hepatocytter. Det er også rapportert at serum-"ICAM-1" ved kronisk leversykdom kan samsvare med graden av hepatocyttskade fordi serum-"ICAM-1"-konsentrasjonene hos pasienter med akutt hepatitt, pasienter med kronisk, aktiv hepatitt og pasienter med levereirrhose var høyere enn hos friske frivillige personer og pasienter med kronisk, ved-varende hepatitt, og konsentrasjonen var høy ved histologisk fremskridende, aktiv hepatitt (Mod. Phys., vol. 15, nr. 1,

s. 73-76 (1995)) .

I en dyremodell for arteriosklerose ble adhesjon og invasjon av monocytter og lymfocytter til vaskulært endotel observert på meget tidlige stadier av sykdommen. Det antas således at interaksjonen av disse hemocytter med endotel er det første trinn ved inntreden av arteriosklerose. Forskjellige rapporter viser ekspresjonen av adhesjonsmolekyler i manifeste lokaliseringer av arteriosklerose, inkludert ekspresjonen av "ICAM-1" i lokaliseringer av arteriosklerose hos mennesker (Poston, R.N. et al., Am. J. Pathol., vol. 140, s. 665 (1992)) og ekspresjonen av "VCAM-1" i lokaliseringer av arteriosklerose hos en kanin med hyperkolesterolemi (Cybulsky, M.I. & Gimbrone, M.A. jr., Science, vol. 251, s. 788 (1991)). En nylig rapport avslørte at ekspresjonen av "VCAM-1" ble observert i lokaliseringer av arteriosklerose hos mennesker, og spesielt sterk ekspresjon i glatte muskelceller som migrerer til intima og i monocytter/makrofager. Ekspresjonen av "MCP-1" ble dessuten forhøyet i fremkomststeder for arteriosklerose hos kanin og menneske, hvilket antyder at "MCP-1" fremmer dannelsen av fremkomststeder for arteriosklerose gjennom migrasjonen av monocytter/makrofager (Current Therapy, vol. 12, nr. 8, s. 1485-1488 (1994)).

Forbindelsen mellom tumormetastase og adhesjons-molekylabnormalitet er også blitt rapportert. Cancerceller redusert med E-cadherin viste f.eks. inntrengningsevne, men inntrengningsevnen ble inhibert ved innføring av cDNA for E-cadherin i cancercellene, og inntrengningsevnen ble gjen-opprettet når E-cadherinantiserum ble tilført til cellene. Dette antyder den tette forbindelse mellom reduksjonen av ekspresjon av E-cadherin og inntrengningsevnen av tumorceller (Frixen, U.H. et al., vol. 113, s. 173 (1991)). I reelle kliniske tilfeller er forbindelsen mellom reduksjonen av ekspresjon av E-cadherin og metastase illustrert i forskjellige typer cancer, slik som hepatom, øsofaguscancer, magecancer og brystcancer. Det er også rapportert at "VLA-4"-molekyler, en ligand for "VCAM-1", ble sterkt uttrykt ved metastatisk melanom, magecancer og brystcancer, hvilket antyder at dette molekyl kan anvendes for implantasjon i vaskulære endotelceller under metastase. Basert på eksperimenter ved anvendelse av forskjellige tumorcellelinjer, er det dessuten rapportert at epitelcancer, slik som magecancer, tykktarmscancer, lungecancer, hepatom eller pankreascancer, adhererte til vaskulære endotelceller gjennom E-selektin (Takada, A. et al., Cancer Res., vol. 53, s. 354 (1993)).

På den annen side er det blitt utført terapeutiske fremgangsmåter for å behandle sykdommer ved å målrette disse adhesjonsmolekyler. Det ble f.eks. rapportert at antirotte-"ICAM-1"-antistoff sterkt inhiberte inflammatorisk reaksjon i en rotteautoimmunartrittmodell. Det er også rapportert at administrering av anti-"ICAM-l"-antistoff inhiberte utbruddet av artritt fra synovitt i en av dyremodellene for RA (Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi, vol. 14, nr. 6, s. 571-577

(1991)). Det ble videre rapportert at metastasedannelsen fra inokulert tumor ble betydelig inhibert dersom en stor mengde peptider med REG-sekvens, som er en aminosyresekvens i et ekstracellulært matriksprotein som gjenkjennes og bindes av noen integriner, ble administrert til en mus med galleblære-cancer, og at in vitro-system-RGD-peptider og anti-pl-sub-enhetsantistoff inhiberte bevegelsen og infiltrasjonen av tumorceller (Yamada, K.M. et al., Cancer Res., vol. 50,

s. 4485 (1990)) .

I det etterfølgende er foreliggende oppfinnelse beskrevet i detalj ved å klargjøre betydningene av betegnelser anvendt heri og de generelle produksjonsmetoder for polypeptider, fusjonspolypeptider, gener, antistoffer, transgene mus og knockout-mus. Betydningen av disse betegnelser skal imidlertid ikke fortolkes som begrensning av definisjonen gitt heri.

"Mitogen" anvendt heri, betegnes også som mitogen faktor og betyr et stoff som induserer celledeling. Immunologisk betyr dette et stoff som induserer blastogenese av lymfocytter polyklonalt og indusering av celledeling. Eksempler er lektiner, slik som PHA og PWM, Concanavalin A (ConA), lipopolysakkarider, streptolysin S og antilymfocyttantistoff. Det er kjent at Concanavalin A og PHA kun virker på T-lymfocytter, at lipopolysakkarider virker kun på B-lymfocytter og at PWM virker på begge lymfocytter.

Betegnelsen "lymfoblastcelle" anvendt heri, betegnes også som en stor lymfocytt, lymfoblast eller immunoblast, og betyr en lymfocytt som tilhører de store lymfocytter som foreligger i lymfoidvev (lymfeknute, milt, thymus, benmarg, lymfe-kanaler, tonsiller etc.) og blod.

Betegnelsen "aktivert lymfocytt" anvendt heri, betyr f.eks. en av lymfocyttene nevnt nedenfor, men er ikke begrenset til disse. Betegnelsen betyr f.eks. en lymfocytt som er aktivert ved en stimulering. Som nevnt ovenfor, er lymfocytter klassifisert i T-celler, B-celler og naturlige dreperceller. T-celler er klassifisert i CD4-positive celler og CD8-positive celler. De "aktiverte lymfocytter" ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer derfor hovedsakelig aktiverte T-celler, aktiverte B-celler og aktiverte naturlige dreperceller, og aktiverte T-celler inkluderer aktiverte CD4- positive celler og aktiverte CD8-positive celler.

Ved reaksjon med antigener presentert av antigenpresenterende celler utskiller CD4-positive T-celler forskjellige cytokiner, nyuttrykker reseptorer for disse cytokiner, forstørrer deres egen størrelse, starter celledeling, prolifererer og aktiveres. Aktiverte CD4-positive T-celler inkluderer de celler som er på et slikt stadium.

CD8-positive T-celler uttrykker IL-2R når de reagerer med antigener. Når IL-2 virker på IL-2R, differensieres cellene til CTL, som har cellulær cytotoksisitet. CTL angriper målcellene for å drepe dem når de møter det samme kompleks av antigenpeptid/MHC-klasse I. Når CD8-positive T-celler differensieres til CTL, øker antallet granuler i cytoplasmaet. Disse granuler omfatter forskjellige høymolekylære proteiner, representert ved perforin. Perforin ligner MAC sammensatt av de femte til de niende komplementkomponenter og lager hull i cellemembranen på målceller. Granulene omfatter også serinproteaser, LT og proteoglykan. Dersom CD8-positive celler mottar antigenstimulering og differensieres til CTL, utskiller de også lymfokiner, slik som IFNy, LT, TNF eller IL-2. Aktiverte CD8-positive T-celler inkluderer de celler som er i en slik tilstand.

T-celler viser blastdannelsesfenomen når de reagerer med hemagglutinin (fytohemagglutinin, PHA) eller Concanavalin A (ConA). Aktiverte T-celler inkluderer de celler som er i en slik tilstand.

B-celler uttrykker B-7-molekyler, aktiverer hjelper-T-celler ved å stimulere CD28 på deres overflate med TCR, tillater hjelper-T-cellene å uttrykke CD40L eller produsere lymfokiner. Når cellene blir stimulert, endres de til å ekspandere deres cellestørrelse eller proliferere. Aktiverte B-celler inkluderer de celler som er i en slik tilstand. Ved foreliggende oppfinnelse inkluderer aktiverte B-celler de celler som utskiller antistoffer (antistoffutskillende celler og plasmaceller).

Aktiverte, naturlige dreperceller betyr de celler som viser cytotoksisk virkning på tumorceller eller virusinfiserte celler, som nevnt ovenfor. Ved foreliggende oppfinnelse inkluderer aktiverte lymfocytter thymusceller stimulert med Concanavalin A (ConA).

"Aktiverte lymfoblastceller" anvendt heri, inkluderer aktiverte "lymfoblaster" som dannes når lymfoblastene nevnt ovenfor stimuleres med "mitogen", nevnt ovenfor, slik som Concanavalin A.

Betegnelsen "hvilende lymfocytt" anvendt heri, betyr i noen tilfeller en ikke-aktivert lymfocytt som ikke er blitt stimulert til å aktivere celler, i motsetning til en aktivert lymfocytt nevnt ovenfor.

"Gen" ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer et genomisk DNA og et cDNA.

Et "humanavledet" stoff ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer naturlige stoffer isolert fra en human kroppskomponent (organ, vev, celle, kroppsvæske etc), og et rekombinant stoff produsert ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi. Når stoffet er et protein eller et polypeptid, inkluderer det et syntetisk fremstilt protein og polypeptid med en aminosyresekvens der én eller flere aminosyrer er substituert, deletert eller tilføyd.

"Celleoverflatemolekylet" ifølge foreliggende oppfinnelse er det som er avledet fra et pattedyr, slik som et menneske, en rotte, en mus, et marsvin og en kanin, spesielt molekylet avledet fra et menneske, en rotte eller en mus, og mer foretrukket molekylet avledet fra et menneske.

"Celleoverflatemolekylet" som beskrevet heri er spesielt det som er kjennetegnet ved minst de egenskaper som er beskrevet nedenfor:

(a) celleoverflatemolekylet blir i det minste uttrykt i tymocytter og mitogenstimulerte lymfoblastceller; (b) et antistoff som er reaktivt overfor celleoverf latemolekylet , induserer adhesjon mellom mitogenstimulerte lymfoblastceller; (c) et antistoff som er reaktivt med celleoverflatemolekylet, induserer proliferasjon av perifere blodlymfocytter i nærvær av et antistoff mot CD3; (d) celleoverflatemolekylet har en partiell aminosyresekvens representert ved Phe-Asp-Pro-Pro-Pro-Phe i dets ekstracellulære område; og (e) celleoverflatemolekylet har en partiell aminosyresekvens representert ved Tyr-Met-Phe-Met i dets cytoplasmatiske område. "Celleoverflatemolekylet" omfatter fortrinnsvis det følgende "polypeptid" ifølge foreliggende oppfinnelse. "Polypeptidet" ifølge oppfinnelsen er det som utgjør det ovennevnte "celleoverflatemolekyl" ifølge oppfinnelsen. Eksempler på slike er som følger: (1) et polypeptid som kodes for av et DNA som hybridiserer med et DNA omfattende en nukleotidsekvens ifølge SEKV.ID. NR. 1 under stringente betingelser; (2) et polypeptid med en aminosyresekvens med 60 %, eller mer, homologi med en aminosyre ifølge SEKV.ID. NR. 2; (3) et polypeptid med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR. 2, eller en aminosyresekvens som vesentlig er den samme som denne aminosyresekvens (nemlig et polypeptid som utgjør "humant JTT-1-antigen" og dets derivat); (4) et polypeptid med en aminosyresekvens som kodes for av en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 26-625 av SEKV.ID. NR. 3, eller en aminosyresekvens som vesentlig er den samme som denne aminosyresekvens (nemlig et polypeptid som utgjør "humant JTT-1-antigen" og dets derivat); (5) et polypeptid med en aminosyresekvens som kodes for av en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 35-637 av SEKV.ID. NR. 4, eller en aminosyresekvens som vesentlig er den samme som denne aminosyresekvens (nemlig et polypeptid som utgjør "rotte-JTT-1-antigen" og dets derivat); (6) et polypeptid med en aminosyresekvens som kodes for av en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 1-603 av SEKV.ID. NR. 5, eller en aminosyresekvens som vesentlig er den samme som denne aminosyresekvens (nemlig et polypeptid som utgjør "muse-JTT-l-antigen" og dets derivat); (7) et polypeptid med en aminosyresekvens som kodes for av en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 35-685 av SEKV.ID. NR. 6, eller en aminosyresekvens som vesentlig er den samme som denne aminosyresekvens (nemlig et polypeptid som utgjør en "mutant av rotte-JTT-1-antigen" og dets derivat) ; og (8) et polypeptid med en aminosyresekvens som kodes for av et DNA som koder for et polypeptid som utgjør celleoverf latemolekylet ifølge foreliggende oppfinnelse, hvori DNA innføres i transformanten som er identifisert ved en internasjonal deponering med aksesjonsnummer FERM BP-5725, eller med en aminosyresekvens som vesentlig er den samme som denne aminosyresekvens (nemlig et polypeptid som utgjør et "humant JTT-l-antigen" og dets derivat).

Eksempler på "stringente betingelser" er som følger. Når en probe med 50 eller flere nukleotider anvendes og hybridisering utføres i 0,9 % NaCl, beregnes standarden for temperatur når 50 % dissosiasjon forekommer (Tm) ved anvendelse av den følgende formel, og temperaturen for hybridisering kan bestemmes i overensstemmelse med den følgende formel: Tm = 82,3 °C + 0,41 x (G + C) % - 500/n - 0,61 x (formamid) %.

(n betyr antallet nukleotider i proben). Temperatur = Tm

-25 °C.

Når det dessuten anvendes en probe med 100 eller flere nukleotider (G + C = 40-50 %), bør det tas i betraktning at Tm varierer som angitt i (1) og (2) nedenfor.

(1) Tm synker med ca. 1 °C pr. 1 % feilparing.

(2) Tm synker med 0,6-0,7 °C pr. 1 % formamid. Temperaturbetingelsene for kombinasjonen av fullstendig komplementære tråder kan således oppstilles som følger:

(A) 65-75 °C (formamid ikke tilsatt),

(B) 35-45 °C (i nærvær av 50 % formamid).

Temperaturbetingelsene for kombinasjonen av ufull-stendig komplementære tråder kan oppstilles som følger:

(A) 45-55 °C (formamid ikke tilsatt),

(B) 35-42 °C (i nærvær av 30 % formamid).

Temperaturbetingelsene når en probe med 23 eller færre nukleotider anvendes, kan være 37 °C eller kan beregnes ved anvendelse av den følgende formel: Temperatur = 2 °C x (antall A + T) + 4 °C x (antall C + G)

-5 °c.

"Med vesentlig den samme aminosyresekvens" betyr her å inkludere et polypeptid med en aminosyresekvens hvor flere aminosyrer, fortrinnsvis 1-10 aminosyrer, spesielt foretrukket 1-5 aminosyrer, i aminosyresekvensen vist i sekvenslisten er substituert, deletert og/eller modifisert, og et polypeptid med den aminosyresekvens hvor flere aminosyrer, fortrinnsvis 1-10 aminosyrer, spesielt foretrukket 1-5 aminosyrer, er tilføyd til aminosyresekvensen vist i sekvenslisten, så lenge polypeptidet har vesentlig de samme biologiske egenskaper som polypeptidet med aminosyresekvensen vist i sekvenslisten.

Slik substitusjon, delesjon eller innføyelse av aminosyrer kan utføres ved hjelp av den vanlige metode (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Handbook of Genetic Engineering" (1992); osv.).

Eksempler på disse er syntetisk oligonukleotidrettet mutagenese ("gapped duplex-metode"), punktmutagenese der en punktmutasjon innføres vilkårlig ved behandling med nitritt eller sulfitt, metoden ved hvilken en delesjonsmutant prepareres med Bal31-enzym og lignende, kassettmutagenese, linker-skanningsmetode, misinkorporeringsmetode, feilparingsprimer-metode, DNA-segmentsyntesemetode etc.

Syntetisk oligonukleotidrettet mutagenese ("gapped duplex-metode") kan f.eks. utføres som følger. Området som ønskes mutagenisert, klones i M13-fagvektor med en ambermutasjon for å preparere det enkelttrådete fag-DNA. Etter at RF-I-DNA av M13-vektoren, uten ambermutasjon, er linearisert ved restriksjonsenzymbehandling, blandes DNA med det enkelttrådete fag-DNA nevnt ovenfor, denatureres og anneales derved under dannelse av "gapped duplex-DNA". Et syntetisk oligo-nukleotid som mutasjoner er innført i, hybridiseres med "gapped duplex-DNA", og de lukket sirkel-dobbelttrådete DNA prepareres ved reaksjoner med DNA-polymerase og DNA-ligase.

E. coli-mutS-celler, uten feilparingsreparasjonsaktivitet, transfekteres med dette DNA. E. coli-celler uten suppressor-aktivitet infiseres med de dyrkede fager, og kun fager uten ambermutasjon screenes.

Metoden ved hvilken en punktmutasjon innføres med nitritt, anvender f.eks. prinsippet nevnt nedenfor. Dersom DNA behandles med nitritt, blir baser deaminert og endrer adenin til hypoksantin, cytosin til uracil og guanin til xantin. Dersom deaminert DNA innføres i celler, blir "A:T" og "G:C" erstattet med henholdsvis "G:C" og "A:T", fordi hypoksantin, uracil og xantin danner et basepar med henholdsvis cytosin, adenin og tymin i DNA-replikasjonen. I realiteten blir enkelttrådete DNA-fragmenter behandlet med nitritt hybridisert med "gapped duplex-DNA", og deretter separeres mutante stammer ved manipulasjon på samme måte som ved syntetisk oligonukleotidrettet mutagenese ("gapped duplex-metode").

Alfabetiske trebokstav- eller enbokstavkoder anvendt for å betegne aminosyrer i den foreliggende beskrivelse eller i figurene, angir aminosyrer som følger. (Gly/G) glysin, (Ala/A) alanin, (Val/V) valin, (Leu/L) leucin, (Ile/l) iso-leucin, (Ser/S) serin, (Thr/T) treonin, (Asp/D) asparaginsyre, (Glu/E) glutaminsyre, (Asn/N) asparagin, (Gln/Q) glutamin, (Lys/K) lysin, (Arg/R) arginin, (Cys/C) cystein, (Met/M) metionin, (Phe/F) fenylalanin, (Tyr/Y) tyrosin, (Trp/W) tryptofan, (His/H) histidin, (Pro/P) prolin.

"Polypeptidet" som utgjør det ovennevnte "celleoverflatemolekyl" ifølge foreliggende oppfinnelse, er et transmembranprotein som trenger inn i cellemembranen, og "celleoverflatemolekylet" består av ett eller to av disse transmembranpolypeptider.

Et "transmembranprotein" betyr her et protein som bindes til membranen gjennom det hydrofobe peptidområdet som trenger gjennom lipidbilaget i membranen én eller flere ganger, og hvis struktur, totalt sett, er sammensatt av tre hovedområder, det vil si et ekstracellulært område, et transmembranområde og et cytoplasmatisk område, som observert hos mange reseptorer eller celleoverflatemolekyler. Et slikt transmembranprotein utgjør hver reseptor eller hvert celleoverflatemolekyl i form av en monomer, homodimer, heterodimer eller oligomer, med en annen kjede(r) med den samme eller en forskjellig aminosyresekvens.

"Polypeptidfragmentet" ifølge foreliggende oppfinnelse er et fragment fra det ovenfor definerte "polypeptid" ifølge foreliggende oppfinnelse, og fortrinnsvis det ekstracellulære området av polypeptidet. Én til fem aminosyrer kan, hvis ønskelig, tilføyes til N-terminalen og/eller C-terminalen av dette området.

Et "ekstracellulært område" betyr her hele, eller en del av, den partielle struktur (partielt område) fra hele strukturen av det ovennevnte transmembranprotein, hvor den partielle struktur eksisterer utenfor membranen. Med andre ord betyr det hele, eller en del av, området av transmembran-proteinet, unntatt området inkorporert i membranen (trans-membranområdet) og området i cytoplasmaet etter transmembran-området (cytoplasmatisk område).

"Det konstante området, eller en del av det konstante området, av human immunglobulin(lg)-tungkjede" anvendt heri, betyr det konstante området eller Fc-området av humanavledet immunglobulin-tungkjede (H-kjede), som beskrevet, eller en del av disse. Immunglobulinet kan være ethvert immunglobulin som tilhører enhver klasse og enhver underklasse. Spesifikke eksempler på immunglobulinet er IgG (IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4), IgM, IgA (IgAl og IgA2), IgD og IgE. Fortrinnsvis er immunglobulinet IgG (IgGl, IgG2, IgG3 eller IgG4) eller IgM. Eksempler på spesielt foretrukne immunglobuliner ifølge foreliggende oppfinnelse er de som tilhører humanavledet IgG (IgGl, IgG2, IgG3 eller IgG4).

Immunglobuliner har en Y-formet strukturell enhet hvori fire kjeder som består av to homologe lette kjeder (L-kjeder) og to homologe tunge kjeder (H-kjeder), er forbundet gjennom disulfidbindinger (S-S-bindinger). Den lette kjede består av lett kjede-variabelt område (VL) og lett kjede-konstant område (CL). Den tunge kjede består av tung kjede-variabelt område (VH) og tung kjede-konstant område (CH).

Det tung kjede-konstante området består av noen domener med aminosyresekvenser som er naturlige for hver klasse (IgG, IgM, IgA, IgD og IgE) og hver underklasse (IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4, IgAl og IgA2).

Den tunge kjede av IgG (IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4) består av VH, CH1-domenet, hengselområdet, CH2-domenet og CH3-domenet, i denne rekkefølge fra N-terminalen.

Den tunge kjede av IgGl består likeledes av VH, Cy^-domenet, hengselområdet, Cyx2-domenet og Cy^-domenet, i denne rekkefølge fra N-terminalen. Den tunge kjede av IgG2 består av VH, Cy2l-domenet, hengselområdet, Cy22-domenet og Cy23-domenet,

i denne rekkefølge fra N-terminalen. Den tunge kjede av IgG3 består av VH, Cy3l-domenet, hengselområdet, Cy32-domenet og Cy33-domenet, i denne rekkefølge fra N-terminalen. Den tunge kjede av IgG4 består av VH, Cy4l-domenet, hengselområdet, Cy42-domenet og Cy43-domenet, i denne rekkefølge fra N-terminalen.

Den tunge kjede av IgA består av VH, Cal-domenet, hengselområdet, Ca2-domenet og Ca3-domenet, i denne rekkefølge fra N-terminalen.

Den tunge kjede av IgAl består likeledes av VH, Cdil-domenet, hengselområdet, Cax2-domenet og Ca^-domenet, i denne rekkefølge fra N-terminalen.

Den tunge kjede av IgA2 består av VH, Ca2l-domenet, hengselområdet, Ca22-domenet og Ca23-domenet, i denne rekke-følge fra N-terminalen.

Den tunge kjede av IgD består av VH, C8l-domenet, hengselområdet, C82-domenet og C63-domenet, i denne rekkefølge fra N-terminalen.

Den tunge kjede av IgM består av VH, Cul-domenet, C(i2-domenet, Cu3-domenet og Cfi4-domenet, i denne rekkefølge fra N-terminalen, og har ikke noe hengselområde, som observert hos IgG, IgA og IgD.

Den tunge kjede av IgE består av VH, Cel-domenet, Ce2-domenet, Ce3-domenet og Ce4-domenet, i denne rekkefølge fra N-terminalen, og har ikke noe hengselområde, som observert hos IgG, IgA og IgD.

Dersom f.eks. IgG behandles med papain, spaltes det litt på den N-terminale side bortenfor disulfidbindingene som eksisterer i hengselområdet hvor disulfidbindingene forbinder de to tunge kjeder for å danne to homologe Fab, hvori et tung-kjedefragment bestående av VH og CH1 forbindes med én lett kjede gjennom en disulfidbinding, og ett Fc, hvori to homologe tungkjedefragmenter bestående av hengselområdet, CH2-domenet og CH3-domenet er forbundet gjennom disulfidbindinger (se "Immunology Illustrated", original 2. utg., Nankodo, s. 65-75

(1992); og "Focus of Newest Medical Science 'Recognition Mechanism of Immune System<1>", Nankodo, s. 4-7 (1991); osv.).

Det vil si at "en del av et konstant område av immunglobulin- tungkjede" betyr en del av et konstant område av en immunglobulin-tungkjede med de strukturelle karakteristika nevnt ovenfor, og er fortrinnsvis det konstante området uten Cl-domenet eller Fc-området. Spesifikke eksempler på disse er området bestående av hengselområdet, C2-domenet og C3-domenet fra hver av IgG, IgA og IgD, og er området bestående av C2-domenet, C3-domenet og C4-domenet fra hvert av IgM og IgE. Et spesielt foretrukket eksempel er Fc-området av humanavledet IgGl.

"Fusjonspolypeptidet" ifølge foreliggende oppfinnelse er det som består av det ekstracellulære området av "polypeptidet" som utgjør det ovenfor beskrevne "celleoverflatemolekyl" ifølge foreliggende oppfinnelse og "et konstant område, eller en del av et konstant område, av human immunglobulin (lg) -tungkjede" . Det er fortrinnsvis et fusjonspolypeptid bestående av et ekstracellulært område av et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, og en del av et konstant område av human IgG-tungkjede, og spesielt foretrukket er det et fusjonspolypeptid bestående av et ekstracellulært område av et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse og området (Fc) bestående av et hengselområde, CH2-domenet og CH3-domenet av human IgG-tungkjede. Blant IgG er dessuten IgGl foretrukket. Et polypeptid avledet fra menneske, mus eller rotte (fortrinnsvis menneske) er dessuten foretrukket som polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse.

Fusjonspolypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse har den fordel at det kan renses meget lett ved anvendelse av affinitetskolonnekromatografi ved anvendelse av egenskapen hos protein A, som bindes spesifikt til immunglobulinfragmentet, fordi fusjonspolypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse har en del av et konstant område (f.eks. Fc) av et immunglobulin, slik som IgG nevnt ovenfor, som en fusjonspartner. Fordi dessuten forskjellige antistoffer mot Fc fra forskjellige immunglobuliner ér tilgjengelige, kan en immunanalyse for fusjonspolypeptidene lett utføres med antistoffene mot Fc.

Polypeptidet, polypeptidfragmentet og fusjonspolypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse kan ikke bare produseres ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi, som nevnt ovenfor, men også ved en velkjent metode i teknikken, slik som en kjemisk syntesemetode og en cellekulturmetode, eller en modifisert metode derav.

"Genet" ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et DNA som koder for det ovennevnte polypeptid eller polypeptidfragment ifølge foreliggende oppfinnelse, og inkluderer ethvert gen med en nukleotidsekvens som koder for polypeptidet eller polypeptidfragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse.

Eksempler på disse gener er de som koder for polypeptidet eller polypeptidfragmentet nevnt nedenfor: (1) et polypeptid som kodes for av et DNA som hybridiserer med et DNA som omfatter en nukleotidsekvens ifølge SEKV.ID. NR. 1 under stringente betingelser; (2) et polypeptid med en aminosyresekvens med 60 %, eller mer, homologi med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR. 2; (3) et polypeptid med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR. 2, eller en aminosyresekvens som vesentlig er den samme som denne aminosyresekvens (nemlig et polypeptid som utgjør "humant JTT-1-antigen" og dets derivat); (4) et polypeptid med en aminosyresekvens som kodes for av en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 26-625 av SEKV.ID. NR. 3, eller en aminosyresekvens som vesentlig er den samme som denne aminosyresekvens (nemlig et polypeptid som utgjør "humant JTT-1-antigen" og dets derivat); (5) et polypeptid med en aminosyresekvens som kodes for av en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 35-637 av SEKV.ID. NR. 4, eller en aminosyresekvens som vesentlig er den samme som denne aminosyresekvens (nemlig et polypeptid som utgjør "rotte-JTT-1-antigen" og dets derivat); (6) et polypeptid med en aminosyresekvens som kodes for av en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 1-603 av SEKV.ID. NR. 5, eller en aminosyresekvens som vesentlig er den samme som denne aminosyresekvens (nemlig et polypeptid som utgjør "muse-JTT-1-antigen" og dets derivat); (7) et polypeptid med en aminosyresekvens som kodes for av en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 35-685 av SEKV.ID. NR. 6, eller en aminosyresekvens som vesentlig er den samme som denne aminosyresekvens (nemlig et polypeptid som utgjør en "mutant av rotte-JTT-1-antigen" og dets derivat) ; og (8) et polypeptid med en aminosyresekvens som kodes for av et DNA som koder for et polypeptid som utgjør celleoverf latemolekylet ifølge foreliggende oppfinnelse, hvori DNA innføres i transformanten som er identifisert ved en internasjonal deponering med aksesjonsnummer FERM BP-5725, eller med en aminosyresekvens som vesentlig er den samme som denne aminosyresekvens (nemlig et polypeptid som utgjør et "humant JTT-1-antigen" og dets derivat).

"Vesentlig den samme aminosyresekvens" har her den samme betydning som definert ovenfor.

Spesifikke eksempler på genet er DNA eller fragmenter av disse, som angitt nedenfor: (1) et DNA som omfatter en nukleotidsekvens ifølge SEKV.ID. NR. 1, og et DNA som hybridiserer med dette DNA under stringente betingelser; (4) et DNA som omfatter en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 26-625 av SEKV.ID. NR. 3; (5) et DNA som omfatter en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 35-637 av SEKV.ID. NR. 4; (6) et DNA som omfatter en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 1-603 av SEKV.ID. NR. 5; (7) et DNA som omfatter en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 35-685 av SEKV.ID. NR. 6; (8) et DNA som koder for et polypeptid som utgjør et celleoverflatemolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse, hvori DNA innføres i en transformant identifisert ved en internasjonal deponering med aksesjonsnummer FERM BP-5725.

DNA som koder for en del av et konstant område av immunglobulin-tungkjede, som er en del av et fusjonspolypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, kan være cDNA eller genomisk DNA bestående av introner mellom hvert exon (DNA som f.eks. koder for CH1-domenet, hengselområdet, CH2-domenet, CH3-domenet, CH4-domenet osv.).

DNA som beskrevet heri inkluderer ethvert DNA sammensatt av hvilke som helst kodoner, så lenge kodonene koder for de samme aminosyrer.

DNA som beskrevet heri kan være et DNA fremstilt ved hjelp av enhver metode. DNA inkluderer f .eks. komplementært DNA (cDNA) fremstilt fra mRNA, DNA fremstilt fra genomisk DNA, DNA fremstilt ved kjemisk syntese, DNA fremstilt ved PCR-amplifisering med RNA eller DNA som templat, og DNA konstruert ved en egnet kombinasjon av disse metoder.

DNA som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, kan fremstilles ved enhver av de vanlige metoder, slik som en metode for kloning av DNA fra mRNA som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, en metode for isolering av genomisk DNA, etterfulgt av spleising av disse, kjemisk syntese osv. (1) cDNA kan klones fra mRNA som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. ved hjelp av metoden beskrevet nedenfor.

Først prepareres mRNA som koder for et celleoverflatemolekyl (polypeptid) ifølge foreliggende oppfinnelse fra vev eller celler (f .eks. thymusceller eller miltavledete lymfoblastceller stimulert med ConA) som uttrykker og produserer et celleoverflatemolekyl (polypeptid) ifølge foreliggende oppfinnelse. mRNA kan prepareres ved å isolere totalt RNA ved hjelp av en kjent metode, slik som guanidintiocyanat-metoden (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry, vol. 18,

s. 5294, 1979), varm fenol-metoden eller AGPC-metoden, etterfulgt av affinitetskromatografi ved anvendelse av oligo-dT-cellulose eller poly-U-Sepharose.

Med mRNA oppnådd som et templat syntetiseres deretter cDNA, f .eks. ved hjelp av en velkjent metode ved anvendelse av reverstranskriptase, slik som metoden ifølge Okayama et al.

(Mol. Cell. Biol., vol. 2, s. 161 (1982); ibid., vol. 3,

s. 280 (1983)) eller metoden ifølge Hoffman et al. (Gene, vol. 25, s. 263 (1983)), og omdannes til dobbelttrådet cDNA. Et cDNA-bibliotek prepareres ved transformasjon av E. coli med plasmidvektorer, fagvektorer eller kosmidvektorer inneholdende

dette cDNA, eller ved transfeksjon av E. coli etter in vitro-emballering.

De anvendte plasmidvektorer ved foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset, så lenge de replikeres og opprettholdes i verter. Enhver fagvektor som kan replikeres i verter, kan også anvendes. Eksempler på vanlig anvendte kloningsvektorer er pME18S, A.ZAPII (1ZAPII) , pUC19, A.gtlO, X,gtll osv. Når vektoren anvendes i en immunologisk screening, som nevnt nedenfor, anvendes fortrinnsvis vektoren som inneholder en promotor som kan uttrykke et gen som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse i en vert.

cDNA kan innføyes i et plasmid, f.eks. ved hjelp av metoden ifølge Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory, s. 1.53, 1989). cDNA kan innføyes i en fagvektor, f.eks. ved hjelp av metoden ifølge Hyunh et al. (DNA cloning, a practical approach, vol. 1, s. 49 (1985)). Disse metoder kan utføres enkelt ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig klonings-sett (f.eks. et produkt fra Takara Shuzo). Det således oppnådde rekombinante plasmid, eller fagvektor, innføres i passende vertsceller, slik som en prokaryot (f.eks. E. coli: XLlBlue MRF1 , DH5a, HB101, MC1061/P3 etc).

Eksempler på en metode for innføring av et plasmid i en vert er kalsiumkloridmetoden, kalsiumklorid-/rubidium-kloridmetoden beskrevet i Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory, s. 1.74

(1989)) og elektroporeringsmetoden. Fagvektorer kan innføres i vertsceller, f.eks. ved en metode hvori fag-DNA innføres i dyrkede verter etter in vitro-emballering. In vitro-emballering kan lett utføres med et kommersielt tilgjengelig in vitro-emballeringssett (f.eks. et produkt fra Stratagene eller Amersham). cDNA som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, kan isoleres fra det således fremstilte cDNA-bibliotek i overensstemmelse med metoden beskrevet ovenfor ved å kombinere generelle cDNA-screeningsmetoder. En klon som omfatter det ønskede cDNA, kan f.eks. screenes ved hjelp av en kjent kolonihybridiseringsmetode (Crunstein et al., Proe Nati. Acad. Sei., USA, vol. 72, s. 3961 (1975)) eller en plakkhybridiseringsmetode (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory, s. 2.108 (1989)) ved anvendelse av <32>P-merkede, kjemisk syntetiserte oligonukleotider som prober, som tilsvarer aminosyresekvensen av polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse. Alternativt kan en klon med et DNA-fragment som koder for et spesifikt område innen polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, screenes ved amplifisering av området ved hjelp av PCR med syntetiske PCR-primere. Når det anvendes et cDNA-bibliotek fremstilt ved anvendelse av en cDNA-ekspresjonsvektor (f .eks. X,ZAPII-fagvektor), kan den ønskede klon screenes ved hjelp av antigen-antistoffreaksjonen ved anvendelse av et antistoff mot polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse. En screeningsmetode som anvender PCR-metoden, anvendes fortrinnsvis når mange kloner underkastes screening. Nukleotidsekvensen av det således fremstilte DNA kan bestemmes ved hjelp av Maxam-Gilbert-metoden (Maxam et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 74, s. 560 (1977)) eller den dideoksynukleotidsyntetiske kjedetermineringsmetoden ved anvendelse av fag-M13 (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 74, s. 5463-5467 (1977)). Hele, eller en del av, genet som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, kan oppnås ved å utkutte den således oppnådde klon nevnt ovenfor med restriksjonsenzymer osv. (2) DNA som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, kan isoleres fra det genomiske DNA avledet fra cellene som uttrykker polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, som nevnt ovenfor, ved hjelp av de følgende metoder. Slike celler blir fortrinnsvis oppløst ved hjelp av SDS eller proteinase K, og DNA deproteiniseres ved gjentatt fenolekstraksjon. RNA spaltes fortrinnsvis med ribonuklease. De oppnådde DNA spaltes partielt med passende restriksjonsenzymer, og de oppnådde DNA-fragmenter amplifiseres med en passende fag eller et kosmid for å danne et bibliotek. Klonene med den ønskede sekvens blir deretter påvist ved f.eks. anvendelse av radioaktivt merkede DNA-prober, og alt, eller en del av, genet som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, isoleres fra klonene ved spalting med restriksjonsenzymer osv. cDNA som koder for et humanavledet polypeptid, kan oppnås som følger. Etter at det er fremstilt et kosmid-bibliotek der humant genomisk DNA (kromosomalt DNA) er innført ("Laboratory Manual: Human Genome Mapping", Maruzen Press), oppnås positive kloner som omfatter DNA fra kodingsområdet av det ønskede protein ved screening av kosmidbiblioteket. cDNA-biblioteket nevnt ovenfor screenes deretter med det kodende DNA utkuttet fra den positive klon som en probe for å fremstille det humane cDNA. (3) DNA som beskrevet heri kan også syntetiseres kjemisk på vanlig måte, basert på nukleotidsekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 1, 3, 4, 5 eller 6. Foreliggende oppfinnelse angår også en rekombinant vektor som omfatter DNA som koder for et ovenfor nevnt celleoverflatemolekyl (polypeptid) ifølge foreliggende oppfinnelse. Den rekombinante vektor ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset, så lenge den kan replikeres og opprettholdes, eller kan replikere autonomt i forskjellige prokaryote og/eller eukaryote verter. Vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer plasmidvektorer og fagvektorer. Den rekombinante vektor kan lett fremstilles ved å ligere DNA som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse med en rekombinasjonsvektor som er tilgjengelig i teknikken (plasmid-DNA og bakteriofag-DNA) på vanlig måte. Spesifikke eksempler på de anvendte vektorer for rekombinasjon er E. coli-avledete plasmider, slik som pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 og pUC19, gjæravledete plasmider, slik som pSH19 og pSH15, og Bacillus subtil is-avledete plasmider, slik som pUBHO, pTP5 og pC194. Eksempler på fager er en bakteriofag, slik som X,-fag, og et animalsk eller insektvirus (pVL1393, Invitrogen), slik som et retrovirus, vacciniavirus og et nukleært polyhedrosisvirus. En ekspresjonsvektor er anvendelig for ekspresjon av DNA som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, og for å produsere polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse. Ekspresjonsvektoren er ikke begrenset, så lenge den uttrykker genet som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse i forskjellige prokaryote og/eller eukaryote vertsceller, og produserer dette protein. Eksempler på slike er pEFneo (Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 91, s. 158-162

(1994)), pEF-BOS (Nucleic Acids Res., vol. 18, s. 5322

(1990)), pME18S (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Handbook of Genetic Engineering" (1992)), pMAL C2 osv.

Når bakterier, spesielt E. coli, anvendes som vertsceller, består en ekspresjonsvektor vanligvis av i det minste et promotor-/operatorområde, et initieringskodon, DNA som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, et termineringskodon, et terminatorområde og et replikon.

Når gjær, dyreceller eller insektceller anvendes som verter, består ekspresjonsvektoren fortrinnsvis av i det minste en promotor, et initieringskodon, DNA som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse og et termineringskodon. Den kan også omfatte DNA som koder for et signal-peptid, en enhancersekvens, et 5'- og 3'-utranslatert område av genet som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, spleisingsseter, polyadenyleringsseter, et selekter-bart markørområde og et replikon. Ekspresjonsvektoren kan også inneholde, hvis nødvendig, et vanlig anvendt gen for genamplifisering (markør).

Et promotor-/operatorområde for å uttrykke polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse i bakterier omfatter en promotor, en operator og en Shine-Dalgarno(SD)-sekvens (f.eks. AAGG). Når verten er Escherichia, omfatter den f.eks. fortrinnsvis en Trp-promotor, lac-promotor, recA-promotor, X,PL-promotor, lpp-promotor, tac-promotor eller lignende. Eksempler på en promotor for å uttrykke polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse i gjær er PHO5-promotor, PGK-promotor, GAP-promotor, ADH-promotor osv. Når verten er Bacillus, er eksempler på promotorer SLO1-promotor, SP02-promotor, penP-promotor osv. Når verten er en eukaryot celle, slik som en pattedyrcelle, er eksempler på promotorer SV40-avledet promotor, retroviruspromotor, varmesjokkpromotor, EF-promotor osv., og fortrinnsvis SV-40, SRa og retrovirusavledete promotorer. Promotoren er selvsagt ikke begrenset til de ovenfor angitte eksempler. Å anvende en enhancer er dessuten effektivt for ekspresjon.

Et foretrukket initieringskodon er f.eks. et metioninkodon (ATG).

De vanlig anvendte termineringskodoner (f.eks. TAG, TGA, TAA osv.) er representative som et termineringskodon.

Vanlig anvendte, naturlige eller syntetiske termi-natorer benyttes som et terminatorområde.

Et replikon betyr et DNA som er i stand til å replikere hele DNA-sekvensen i vertsceller, og inkluderer et naturlig plasmid, et kunstig modifisert plasmid (DNA-fragment fremstilt fra et naturlig plasmid), et syntetisk plasmid osv. Eksempler på foretrukne plasmider er pBR322 eller kunstig fremstilte derivater av dette (DNA-fragmenter oppnådd ved å behandle pBR322 med passende restriksjonsenzymer) for E. coli, gjær-2u-plasmid eller gjær-kromosomalt DNA for gjær, og pEFneo, pME18S, pRSVneo ATCC 37198, pSV2dhfr ATCC 37145, pdBPV-MMTneo ATCC 37224, pSV2neo ATCC 37149 etc. for pattedyrceller.

En enhancersekvens, et polyadenyleringssete og et spleisingssete som vanligvis anvendes i teknikken, slik som dem avledet fra SV40, kan også anvendes.

En vanlig anvendt, selekterbar markør kan anvendes i overensstemmelse med den vanlige metode. Eksempler er resi-stensgener for antibiotika, slik som tetrasyklin, neomycin, ampicillin eller kanamycin, og tymidinkinasegen.

Eksempler på et gen for genamplifisering er dihydro-folatreduktase(DHFR)gen, tymidinkinasegen, neomycinresistensgen, glutamatsyntetasegen, adenosindeaminasegen, ornitin-dekarboksylasegen, hygromycin-B-fosfotransferasegen, aspartat-transkarbamylasegen etc.

Ekspresjonsvektoren som beskrevet heri kan fremstilles ved kontinuerlig og sirkulær binding av minst den ovennevnte promotor, initieringskodon, DNA (gen) som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, termineringskodon og terminatorområde til et passende replikon. Hvis ønskelig kan passende DNA-fragmenter (f.eks. linkere, restriksjonsseter dannet med andre restriksjonsenzymer) anvendes på vanlig måte, slik som ved spalting med et restriksjonsenzym eller ligering ved anvendelse av T4-DNA-ligase.

Transformanter ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved å innføre ekspresjonsvektoren nevnt ovenfor i vertsceller.

Vertsceller anvendt ved foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset, så lenge de er forenlige med en ekspresjonsvektor nevnt ovenfor og kan transformeres. Eksempler på slike er forskjellige celler, slik som naturlige celler eller kunstig etablerte, rekombinante celler som vanligvis anvendes på det tekniske området for oppfinnelsen, f.eks. bakterier { Escherichia og Bacillua) , gjær { Saccharomyces, Pichia etc), dyreceller eller insektceller.

E. coli eller pattedyrceller anvendes fortrinnsvis. Spesifikke eksempler er E. coli (DH5a, XLlBlue MRF<1>, TB1, HB101 etc), museavledete celler (COP, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH 3T3 etc), rotteavledete celler, hamsteravledete celler (BHK, CH0-K1, CHO etc), apeavledete celler (COSI, C0S3, C0S7, CVl, Velo etc) og celler avledet fra mennesker (HEK293, Hela, diploide, fibroblastavledete celler, myelom, Namalwa etc).

En ekspresjonsvektor kan innføres (transformeres (transduseres)) i vertsceller på kjent måte.

Transformering kan f.eks. utføres i overensstemmelse med metoden ifølge Cohen et al. (Proe Nati. Acad. Sei., USA, vol. 69, s. 2110 (1972)), protoplastmetoden (Mol. Gen. Genet., vol. 168, s. 111 (1979)) eller kompetentmetoden (J. Mol. Biol., vol. 56, s. 209 (1971)) når vertene er bakterier

( E. coli, Bacillus subtilis etc), metoden ifølge Hinnen et al. (Proe Nati. Acad. Sei., USA, vol. 75, s. 1927 (1978)) eller litiummetoden (J. Bacteriol., vol. 153, s. 163 (1983)) når verten er Saccharomyces cerevisiae, metoden ifølge Graham (Virology, vol. 52, s. 456 (1973)) når verten er dyreceller og metoden ifølge Summers et al. (Mol. Cell. Biol., vol. 3,

s. 2156-2165 (1983)) når verten er insektceller.

Polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse kan produseres ved å dyrke transformanter (i det etterfølgende inkluderer denne betegnelse transduktanter) som omfatter en ekspresjonsvektor fremstilt som nevnt ovenfor i næringsmedium.

Næringsmediet omfatter fortrinnsvis en karbonkilde, en uorganisk nitrogenkilde eller en organisk nitrogenkilde som er nødvendig for veksten av vertsceller (transformanter). Eksempler på karbonkilder er glukose, dekstran, oppløselig stivelse og sukrose, og eksempler på uorganiske eller organiske nitrogenkilder er ammoniumsalter, nitrater, aminosyrer, maisstøpevæske, pepton, kasein, kjøttekstrakt, soyabønnekake og potetekstrakt. Hvis ønskelig kan mediet omfatte andre næringsmidler (f.eks. et uorganisk salt (f.eks. kalsiumklorid, natriumdihydrogenfosfat og magnesiumklorid)), vitaminer, antibiotika (f.eks. tetrasyklin, neomycin, ampicillin, kanamycin etc.) .

Dyrkningen utføres på kjent måte i teknikken. Dyrkningsbetingelser, slik som temperatur, pH i mediet og dyrkningstid, utvelges på passende måte, slik at polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse blir overprodusert.

De anvendte spesifikke medier og dyrkningsbetingelser, avhengig av vertsceller, er illustrert nedenfor, men er ikke begrenset til disse.

Når vertene er bakterier, aktinomyceter, gjær, filamentøs sopp, er flytende medier som omfatter nærings-kildene nevnt ovenfor passende. Fortrinnsvis anvendes medier med pH 5-8.

Når verten er E. coli, er eksempler på foretrukne medier LB-medium og M9-medium (Miller et al., Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, s. 431 (1972)). Ved anvendelse av disse medier kan dyrkningen vanligvis utføres ved 14-43 °C i ca. 3-24 timer under lufttilførsel og omrøring, hvis nødvendig.

Når verten er Bacillus, kan dyrkningen vanligvis utføres ved 30-40 °C i ca. 16-96 timer med lufttilførsel og omrøring, hvis nødvendig.

Når verten er gjær, er et eksempel på medium Burkholders minimale medium (Bostian, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 77, s. 4505 (1980)). pH i mediet er fortrinnsvis 5-8. Dyrkningen kan vanligvis utføres ved 20-35 °C i ca. 14-144 timer med lufttilførsel og omrøring, hvis nødvendig.

Når verten er en dyrecelle, er eksempler på medier MEM-medium inneholdende ca. 5-20 % kalvefosterserum (Science, vol. 122, s. 501 (1952)), DMEM-medium (Virology, vol. 8,

s. 396 (1959)), RPMI1640-medium (J. Am. Med. Assoc, vol. 199, s. 519 (1967)) og 199-medium (Proe. Soc. Exp. Biol. Med, vol.

73, s. 1 (1950)j. pH i mediet er fortrinnsvis ca. 6-8. Dyrkningen kan vanligvis utføres ved ca. 30-40 °C i ca. 15-

72 timer med lufttilførsel og omrøring, hvis nødvendig.

Når verten er en insektcelle, er et eksempel på medium Graces medium inneholdende kalvefosterserum (Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 82, s. 8404 (1985)). pH i mediet er fortrinnsvis ca. 5-8. Dyrkningen kan vanligvis utføres ved ca. 20-40 °C i 15-100 timer med lufttilførsel og omrøring, hvis nødvendig.

Dyrkningen av transformanter, som nevnt ovenfor, spesielt dyreceller, kan overuttrykke polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse på overflaten av cellene.

Polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse kan produseres som et oppløselig polypeptidfragment, slik som et ekstracellulært område-fragment, ved å fremstille transformantene, som nevnt ovenfor, ved anvendelse av DNA som koder for det ekstracellulære området, eller hvert område, og ved dyrkning av transformantene for å tillate dem å utskille det oppløselige polypeptid i kultursupernatanten. Et fusjonspolypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse kan dessuten fremstilles på lignende måte.

Det vil si at et kulturfiltrat (en supernatant) oppnås- ved en metode som filtrering eller sentrifugering av kulturen, og polypeptidet eller polypeptidfragmentet ifølge foreliggende oppfinnelse renses og isoleres fra kultur-filtratet på vanlig måte for å rense og isolere et naturlig eller syntetisk protein.

Eksempler på isolerings- og rensingsmetoder er en metode som benytter oppløselighet, slik som utsalting og utfelling fra et løsningsmiddel, en metode som benytter forskjellen i molekylvekt, slik som dialyse, ultrafiltrering, gelfiltrering og natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektro-forese, en metode som benytter ladninger, slik som ionebytter-kromatografi og hydroksylapatittkromatografi, en metode som benytter spesifikk affinitet, slik som affinitetskromatografi, en metode som benytter forskjellen i hydrofobitet, slik som reversfase-høyytelsesvæskekromatografi, og en metode som benytter forskjellen i isoelektrisk punkt, slik som isolektrisk fokusering.

Når polypeptidet eller et polypeptidfragment ifølge foreliggende oppfinnelse foreligger i periplasmaet eller cytoplasmaet fra dyrkede transformanter, blir sopplegemene eller cellene først innhøstet på vanlig måte, slik som filtrering eller sentrifugering, og suspendert i en egnet buffer. Etter at celleveggen og/eller cellemembranen i cellene er blitt nedbrutt ved hjelp av en metode som lysis med sonikering, lysozym og frysing-tining, oppnås membranfraksjonen som omfatter polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse ved hjelp av en metode som sentrifugering eller filtrering. Membranfraksjonen oppløses med en detergent, slik som Triton-XlOO, for å oppnå råekstrakten. Polypeptidet eller polypeptidfragmentet isoleres til slutt og renses fra råekstrakten på vanlig måte, som illustrert ovenfor.

Den "transgene mus" ifølge foreliggende oppfinnelse er en transgen mus i hvilken DNA (cDNA eller genomisk DNA) , fremstilt som nevnt ovenfor, som koder for polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, avledet fra dyr unntatt mus (ikke-selv-polypeptid), er blitt integrert i musens endogene lokali-tet. Den transgene mus uttrykker ikke-selv-polypeptidet og utskiller polypeptidet i kroppen.

Den transgene mus kan frembringes i overensstemmelse med den vanlig anvendte metode for produksjon av et transgent dyr (se f.eks. "Newest Manual of Animal Cell Experiment", LIC Press, kapittel 7, s. 361-408 (1990)).

Nærmere bestemt blir f.eks. embryoniske stamceller (ES-celler) fra normale museblastocyster transformert med en ekspresjonsvektor der genet som koder for det humanavledete polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse (det vil si "humant JTT-1-antigen"), er blitt operabelt innføyd. ES-celler der genet som koder for det humanavledete polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse er blitt integrert i det endogene gen, screenes ved hjelp av den vanlige metode. De screenede ES-celler blir deretter mikroinjisert i et befruktet egg fra en annen normal mus (blastocyst) (Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 77, nr. 12, s. 7380-7384 (1980)); US-patent nr. 4 873 191) . Blastocysten transplanteres inn i uterus hos en annen normal mus som fostermoren. Stammus (museavkom) fødes deretter fra fostermormusen. Ved å pare stammusen med normale mus oppnås heterogene, transgene mus. Ved å pare de heterogene, transgene mus med hverandre oppnås homogene, transgene mus i overensstemmelse med Mendels lover.

"Knockout-mus" ifølge foreliggende oppfinnelse er en mus der det endogene gen som koder for det museavledete polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse (det vil si "muse-JTT-1-antigen"), er blitt "knocked out" (inaktivert). Den kan f.eks. frembringes ved en positiv-negativ seleksjonsmetode der det anvendes homolog rekombinasjon (US-patenter nr. 5 464 764, 5 487 992, 5 627 059; Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 86,

s. 8932-8935 (1989); Nature, vol. 342, s. 435-438 (1989) etc.) .

"Antistoffet" ifølge foreliggende oppfinnelse kan være et polyklonalt antistoff (antiserum) eller et monoklonalt antistoff, fortrinnsvis et monoklonalt antistoff.

Det er spesifikt et antistoff som reagerer med (mot, som bindes til) det ovennevnte polypeptid eller polypeptidfragment ifølge foreliggende oppfinnelse.

Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan være et naturlig antistoff oppnådd ved immunisering av pattedyr, slik som mus, rotter, hamstere, marsvin og kaniner, med antigenet, slik som celler (naturlige celler, cellelinjer, turaor-celler etc.) som uttrykker "celleoverflatemolekyler" ifølge foreliggende oppfinnelse, transformanter som overuttrykker polypeptidet eller celleoverflatemolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse på overflaten, fremstilt ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi på celleoverflaten, eller "poly-peptidf ragmenter" eller "fusjonspolypeptider" ifølge foreliggende oppfinnelse. Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer også kimære antistoffer og humaniserte antistoffer (CDR-podete antistoffer) som kan produseres ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi, og humane antistoffer som kan produseres ved anvendelse av transgene dyr som produserer humant antistoff.

Det monoklonale antistoff inkluderer dem som har enhver av isotypene IgG, IgM, IgA, IgD eller IgE. IgG eller IgM er foretrukket.

Det polyklonale antistoff (antiserum) eller monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan produseres ved hjelp av kjente metoder. Det vil si at et pattedyr, fortrinnsvis en mus, en rotte, en hamster, et marsvin, en kanin, en katt, en hund, en gris, en geit, en hest eller kveg, eller mer foretrukket en mus, en rotte, en hamster, et marsvin eller en kanin, immuniseres med f.eks. et antigen nevnt ovenfor med Freunds adjuvans, hvis nødvendig.

Det polyklonale antistoff kan oppnås fra antiserumet oppnådd fra det således immuniserte dyr. De monoklonale antistoffer fremstilles dessuten som følger. Hybridomer prepareres fra de antistoffproduserende celler oppnådd fra det således immuniserte dyr og myelomceller som ikke er i stand til å produsere autoantistoffer. Hybridomene klones, og kloner som produserer de monoklonale antistoffer som viser den spesifikke affinitet overfor antigenet anvendt for immunisering av patte-dyret , screenes.

Nærmere bestemt kan det monoklonale antistoff produseres som følger. Immuniseringer utføres ved å injisere eller implantere én eller flere ganger antigenet, som nevnt ovenfor, som et immunogen, hvis nødvendig med Freunds adjuvans, sub-kutant, intramuskulært, intravenøst, gjennom fotpoten eller intraperitonealt i et ikke-humant pattedyr, spesielt en mus, en rotte, en hamster, et marsvin eller en kanin, fortrinnsvis en mus, en rotte eller en hamster (inkludert et transgent dyr frembrakt slik at det produserer antistoffer avledet fra et annet dyr, slik som den transgene mus som produserer humant antistoff, nevnt nedenfor). Vanligvis utføres immuniseringer 1-4 ganger hver 1.-14. dag etter den første immunisering. Antistoffproduserende celler oppnås fra det således immuniserte pattedyr i løpet av 1-5 dager etter den siste immunisering. Hyppigheten av og intervallet mellom immuniseringer kan være ordnet på passende måte, avhengig av egenskapene til det anvendte immunogen. Hybridomer som utskiller et monoklonalt antistoff, kan fremstilles ved metoden ifølge Kohler og Milstein (Nature, vol. 256, s. 495-497 (1975)) og ved dens modifiserte metode. Det vil si at hybridomer fremstilles ved fusjonering av antistoffproduserende celler inneholdt i milt, lymfeknute, benmarg eller tonsill, oppnådd fra det ikke-humane pattedyr immunisert som nevnt ovenfor, fortrinnsvis en milt, med myelomer uten autoantistoffproduserende evne, som fortrinnsvis er avledet fra et pattedyr, slik som en mus, en rotte, et marsvin, en hamster, en kanin eller et menneske, mer foretrukket en mus, en rotte eller et menneske.

Museavledete myelomer, P3/X63-Ag8.653 (653), P3/NSl/l-Ag4-l (NS-1), P3/X63-Ag8.Ul (P3U1), SP2/0-Agl4 (Sp2/0, Sp2), PAI, FO eller BW5147, rotteavledete myelomer, 210RCY3-Ag.2.3, eller menneskeavledete myelomer, U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 eller CEM-T15, kan f.eks. anvendes som myelom for cellefusjonen.

Hybridomkloner som produserer monoklonale antistoffer, kan screenes ved å dyrke hybridomer, f.eks. i mikrotiter-plater, og ved å måle reaktiviteten av kultursupernatanten i brønnen hvor hybridomvekst observeres, til immunogenet anvendt for immuniseringen nevnt ovenfor, f.eks. ved enzymimmunanalyse som RIA og ELISA.

De monoklonale antistoffer kan produseres fra hybridomer ved dyrkning av hybridomene in vitro eller in vivo, slik som i ascitesvæske fra en mus, en rotte, et marsvin, en hamster eller en kanin, fortrinnsvis en mus eller en rotte, mer foretrukket en mus, og ved å isolere antistoffene fra den resulterende kultursupernatant eller ascitesvæske fra et pattedyr.

Dyrkning av hybridomer in vitro kan utføres, avhengig av egenskapene til cellene som skal dyrkes, med formålet en testundersøkelse, og under de forskjellige betingelser for en dyrkningsmetode, ved anvendelse av kjente næringsmedier eller ethvert næringsmedium avledet fra kjente basismedier for dyrkning, opprettholdelse og lagring av hybridomene for å produsere monoklonale antistoffer i kultursupernatanter.

Eksempler på basismedier er medier med lav kalsiumkonsentrasjon, slik som Ham'F12-medium, MCDB153-medium eller MEM-medium med lav kalsiumkonsentrasjon, og medier med høy kalsiumkonsentrasjon, slik som MCDB104-medium, MEM-medium, D-MEM-medium, RPMI1640-medium, ASF104-medium eller RD-medium. Basismediet kan f.eks. inneholde serum, hormoner, cytokiner og/eller forskjellige uorganiske eller organiske stoffer, avhengig av formålet.

Monoklonale antistoffer kan isoleres og renses fra kultursupernatanten eller ascitesvæsken nevnt ovenfor ved hjelp av utfelling med mettet ammoniumsulfat, utfelling med euglobulin, kapronsyremetoden, kaprylsyremetoden, ionebytter-kromatografi (DEAE eller DE52), affinitetskromatografi ved anvendelse av antiimmunglobulinkolonne eller protein A-kolonne.

Foretrukne eksempler på monoklonale antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse er som følger: (1) et monoklonalt antistoff som reagerer med et polypeptid med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR. 2, et polypeptidfragment avledet fra polypeptidet eller et humanavledet celleoverflatemolekyl bestående av polypeptidet; (2) et monoklonalt antistoff som reagerer med et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, et polypeptidfragment avledet fra polypeptidet eller et celleoverflatemolekyl bestående av polypeptidet, hvor effekten av det monoklonale antistoff på mitogenstimulerte lymfoblastceller er vesentlig den samme som effekten av et monoklonalt antistoff produsert av en hybridom som er identifisert ved en internasjonal deponering med aksesjonsnummer FERM BP-5707, på mitogenstimulerte rottelymfoblastceller; og (3) et monoklonalt antistoff som reagerer med et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, et polypeptidfragment avledet fra polypeptidet eller et celleoverflatemolekyl bestående av polypeptidet, hvor effekten av det monoklonale antistoff på mitogenstimulerte lymfoblastceller er vesentlig den samme som effekten av et monoklonalt antistoff produsert av en hybridom som er identifisert ved en internasjonal deponering med aksesjonsnummer FERM BP-5708, på mitogenstimulerte rottelymfoblastceller.

Det monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer dessuten det som produseres av hybridomen identifisert ved en internasjonal deponering med aksesjonsnummer FERM BP-5707 eller FERM BP 5708.

Det "kimære, monoklonale antistoff" ifølge foreliggende oppfinnelse er et monoklonalt antistoff fremstilt ved genteknikk, og betegner spesifikt et kimært antistoff, slik som et kimært, monoklonalt antistoff fra mus/menneske hvis variable områder er avledet fra immunglobulin fra et ikke-humant pattedyr (mus, rotte, hamster etc), og hvis konstante områder er avledet fra humant immunglobulin.

Det konstante området avledet fra humant immunglobulin har den naturlige aminosyresekvens for hver isotype,

slik som IgG (IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4), IgM, IgA, IgD og IgE. Det konstante området av det rekombinante, kimære, monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan være området av humant immunglobulin som tilhører enhver isotype. Fortrinnsvis er det det konstante området av humant IgG.

Det kimære, monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan f.eks. produseres som følger. Produksjonsmetoden er selvsagt ikke begrenset til denne.

Et kimært, monoklonalt antistoff fra mus/menneske kan fremstilles ved referanse til Experimental Medicine: SUPPLEMENT, vol. 1.6, nr. 10 (1988); og den japanske patentsøknad (JP-B) nr. Hei 3-73280. Det vil si at det kan fremstilles ved operabel innføyelse av CH-gen (C-gen som koder for det konstante området av H-kjede) oppnådd fra DNA som koder for humant immunglobulin nedstrøms for aktive VH-gener (rearrangert VDJ-gen som koder for det variable området av H-kjede) oppnådd fra DNA som koder for et monoklonalt museantistoff isolert fra hybridomen som produserer det monoklonale museantistoff, og CL-genet (C-gen som koder for det konstante området av L-kjede) oppnådd fra DNA som koder for humant immunglobulin nedstrøms for aktive VL-gener (rearrangert VJ-gen som koder for det variable området av L-kjede) oppnådd fra DNA som koder for det monoklonale museantistoff isolert fra hybridomen, inn i de samme eller forskjellige vektorer, slik at de uttrykkes, etterfulgt av transformasjon av vertsceller med ekspresjonsvektoren og deretter ved dyrkning av transformantene.

Nærmere bestemt blir DNA først ekstrahert fra monoklonalt museantistoffproduserende hybridomer på vanlig måte, spaltet med passende restriksjonsenzymer (f.eks. EcoRI og Hindlll) , underkastet elektroforese (ved f.eks. anvendelse av 0,7 % agarosegel) og analysert ved Southern-blotting. Etter at en elektroforesegel er farget, f.eks. med etidiumbromid, og fotografert, gis gelen markørposisjoner, vaskes to ganger med vann og nedsenkes i 0,25 M HCl i 15 minutter. Gelen nedsenkes deretter i 0,4 N NaOH-løsning i 10 minutter under forsiktig omrøring. DNA overføres til et filter i 4 timer på vanlig måte. Filteret vaskes to ganger med 2 x SSC. Etter at filteret er tilstrekkelig tørket, oppvarmes det ved 75 °C i 3 timer. Etter oppvarmingen behandles filteret med 0,1 x SSC/0,1 % SDS ved 65 °C i 30 minutter. Det ble deretter nedsenket i 3 x SSC/0,1 % SDS. Det oppnådde filter behandles med prehybridi-seringsløsning i en plastpose ved 65 °C i 3-4 timer.

<32>P-merket probe-DNA og hybridiseringsløsning til-settes deretter til posen og omsettes ved 65 °C i ca. 12 timer. Etter hybridisering vaskes filteret under en passende salt-konsentrasjon, reaksjonstemperatur og -tid (f.eks. 2 x SSC-0,1 % SDS, romtemperatur, 10 minutter). Filteret plasseres i en plastpose med en liten mengde 2 x SSC og autoradiograferes etter at posen er forseglet.

Rearrangert VDJ-gen og VJ-gen som koder for H-kjede og L-kjede fra et monoklonalt museantistoff, identifiseres ved Southern-blotting, nevnt ovenfor. Området som omfatter det identifiserte DNA-fragment, fraksjoneres ved sukrosedensitets-gradientsentrifugering og innføyes i en fagvektor (f.eks. Charon 4A, Charon 28, Å.EMBL3, X.EMBL4 etc). E. coli (f. eks. LE392, NM539 etc.) transformeres med fagvektoren for å danne et genomisk bibliotek. Det genomiske bibliotek screenes ved plakkhybridisering, slik som Benton-Davis-metoden (Science, vol. 196, s. 180-182 (1977)) ved anvendelse av passende prober (H-kjede-J-gen, L-kjede(k)-J-gen etc.) for å oppnå positive kloner som omfatter rearrangert VDJ-gen eller VJ-gen. Ved dannelse av restriksjonskartet og bestemmelse av nukleotidsekvensen av de oppnådde kloner bekreftes det at det er oppnådd gener som omfatter det ønskede rearrangerte VH(VDJ)-gen eller VL(VJ)-gen.

Separat isoleres humant CH-gen og humant CL-gen anvendt for kimerisering. Når et kimært antistoff f.eks. produseres med humant IgGl, isoleres Cyl-gen i form av et CH-gen, og et CK-gen i form av et CL-gen. Disse gener kan isoleres fra humant, genomisk bibliotek med muse-Cyl-gen og muse-CK-gen, som henholdsvis tilsvarer humant Cyl-gen og humant CK-gen, som prober, idet det dras fordel av høy homologi mellom nukleotidsekvensene av museimmunglobulingen og humant immunglobulingen.

DNA-fragmenter som omfatter humant CK-gen og et enhancerområde, isoleres spesifikt fra humant X Charon 4A Haelll-Alul genomisk bibliotek (Cell, vol. 15, s. 1157-1174

(1978)), f.eks. med et 3 kb Hindlll-BamHI-fragment av klon Igl46 (Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 75, s. 4709-4713

(1978)) og et 6,8 kb EcoRI-fragment av klon MEP10 (Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 78, s. 474-478 (1981)) som prober. Etter at f.eks. humant fosterhepatocytt-DNA er spaltet med Hindlll

og fraksjonert ved agarosegelelektroforese, innføyes i tillegg et 5,9 kb fragment i X,788, og det humane Cyl-gen isoleres deretter med probene nevnt ovenfor.

Ved anvendelse av det således oppnådde muse-VH-gen, muse-VL-gen, humant CH-gen og humant CL-gen, og ved å ta i betraktning promotorområdet og enhancerområdet, innføyes humant CH-gen nedstrøms for muse-VH-genet, og humant CL-gen innføyes nedstrøms for muse-VL-genet i en ekspresjonsvektor, slik som pSV2gpt eller pSV2neo, med egnede restriksjonsenzymer og DNA-ligase på vanlig måte. I dette tilfellet kan kimære gener av muse-VH-gen/humant CH-gen og muse-VL-gen/humant CL-gen henholdsvis innføyes i den samme ekspresjonsvektor eller i forskj ellige ekspresj onsvektorer.

Således fremstilt kimært geninnføyd ekspresjonsvektor (er) innføres i myelomer som ikke produserer antistoffer, f.eks. P3X63-Ag8-653-celler eller SP210-celler, ved hjelp av protoplastfusjonsmetoden, DEAE-dekstranmetoden, kalsiumfosfatmetoden eller elektroporeringsmetoden. Transformantene screenes ved dyrkning i medier inneholdende et legemiddel som tilsvarer legemiddelresistensgenet innføyd i ekspresjonsvektoren, og cellene som produserer ønskede kimære, monoklonale antistoffer, oppnås deretter.

Ønskede kimære, monoklonale antistoffer oppnås fra kultursupernatanten fra således screenede antistoffproduserende celler.

Det "humaniserte, monoklonale antistoff (CDR-podet antistoff)" ifølge foreliggende oppfinnelse er et monoklonalt antistoff fremstilt ved genteknikk, og betegnes spesifikt som et humanisert, monoklonalt antistoff hvori en del, eller alt, av de komplémentaritetsbestemmende områder av det hypervariable området er avledet fra de komplémentaritetsbestemmende områder av det hypervariable området fra et monoklonalt antistoff fra et ikke-humant pattedyr (mus, rotte, hamster etc), rammeverksområdene av det variable området er avledet fra rammeverksområdene av det variable området fra humant immunglobulin, og det konstante området er avledet fra et humant konstant område fra immunglobulin.

De komplémentaritetsbestemmende områder av det hypervariable området eksisterer i det hypervariable området i det variable området av et antistoff, og betegner tre områder som direkte og komplementært bindes til et antigen (komplémentaritetsbestemmende rester CDR1, CDR2 og CDR3). Rammeverksområdene av det variable området betegner fire sammenlignbart konser-verte områder som ligger oppstrøms, nedstrøms eller mellom de tre komplementaritetsbestemmendé områder (rammeverksområder FRI, FR2, FR3 og FR4).

Et humanisert, monoklonalt antistoff betyr med andre ord hvori hele området, med unntak av en del av de komplémentaritetsbestemmende områder av det hypervariable området av ikke-humant, pattedyravledet monoklonalt antistoff, er blitt erstattet med de tilsvarende områder avledet fra humant immunglobulin.

Det konstante området avledet fra humant immunglobulin har den naturlige aminosyresekvens for hver isotype, slik som IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD og IgE. Det konstante området av et humanisert, monoklonalt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan være området fra humant immunglobulin som tilhører enhver isotype. Fortrinnsvis er det det konstante området av humant IgG. Rammeverksområdene av det konstante området avledet fra humant immunglobulin er ikke spesielt begrenset.

Det humaniserte, monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan f.eks. produseres som følger. Produksjonsmetoden er selvsagt ikke begrenset til denne.

Et rekombinant, humanisert, monoklonalt antistoff avledet fra monoklonalt museantistoff kan f.eks. fremstilles ved genteknikk, med referanse til japansk patentpublikasjon (JP-WA) nr. Hei 4-506458 og japansk patentpublikasjon (JP-A) nr. Sho 62-296890. Minst ett muse-H-kjede-CDR-gen og minst ett muse-L-kjede-CDR-gen som tilsvarer muse-H-kjede-CDR-genet, isoleres således fra hybridomer som produserer monoklonalt museantistoff, og humant H-kjede-gen som koder for alle områdene, med unntak av H-kjede-CDR som tilsvarer muse-H-kjede-CDR nevnt ovenfor, og humant L-kjedegen som koder for hele området med unntak av humant L-kjede-CDR som tilsvarer muse-L-kjede-CDR nevnt ovenfor, isoleres fra humane immun-globulingener.

Det således isolerte muse-H-kjede-CDR-gen (-gener) og det humane H-kjede-gen (-gener) innføyes operabelt i en passende vektor, slik at de kan uttrykkes. Muse-L-kjede-CDR-genet (-gener) og det humane L-kjedegen (-gener) innføyes likeledes operabelt i en annen passende vektor, slik at de kan uttrykkes. Alternativt kan muse-H-kjede-CDR-genet (-gener)/human-H-kjedegenet (-genene) og muse-L-kjede-CDR-genet (-genene)/human-L-kjedegenet (-genene) operabelt inn-føyes i den samme ekspresjonsvektor, slik at de kan uttrykkes. Vertsceller transformeres med den således fremstilte ekspresjonsvektor for å oppnå transformanter som produserer humanisert, monoklonalt antistoff. Ved dyrkning av transformantene oppnås ønsket humanisert, monoklonalt antistoff fra kultursupernatanten .

Det "humane, monoklonale antistoff" som beskrevet heri er et immunglobulin hvori de fullstendige områder som omfatter det variable og konstante området av H-kjeden og det variable og konstante området av L-kjeden som utgjør immunglobulinet, er avledet fra genet som koder for humant immunglobulin.

Det humane antistoff kan produseres på samme måte som ved produksjonsmetoden for polyklonale eller monoklonale antistoffer, nevnt ovenfor, ved å immunisere et transgent dyr med et antigen, hvor f.eks. humant immunglobulingen(er) er blitt integrert i et ikke-humant pattedyr, slik som en mus, på vanlig måte.

En transgen mus som produserer humane antistoffer, frembringes f.eks. ved hjelp av metodene beskrevet i Nature Genetics, vol. 7, s. 13-21 (1994); Nature Genetics, vol. 15, s. 146-156 (1997); JP-WA nr. Hei 4-504365 og Hei 7-509137;

Nikkei Science, nr. 6, s. 40-50 (1995); internasjonal patentpublikasjon nr. WO 94/25585; Nature, vol. 368, s. 856-859

(1994); og JP-WA nr. Hei-6-500233.

En nylig utviklet teknikk for produksjon av et humanavledet protein fra melken fra en transgen ku eller gris kan dessuten også anvendes (Nikkei Science, s. 78-84 (april 1997)) .

"Delen av et antistoff" anvendt ved foreliggende oppfinnelse, betegner et partielt område av det monoklonale antistoff, som nevnt ovenfor, og betegner spesifikt F(ab')2, Fab<1>, Fab, Fv (variabelt fragment av antistoff), sFv, dsFv (disulfidstabilisert Fv) eller dAb (enkeltdomeneantistoff)

(Exp. Opin. Ther. Patents, vol. 6, nr. 5, s. 441-456 (1996)).

"F(ab<1>)a" og "Fab'" kan produseres ved å behandle immunglobulin (monoklonalt antistoff) med en protease, slik som pepsin og papain, og betegner et antistoffragment dannet ved spalting av immunglobulin nær disulfidbindingene som eksisterer mellom hengselområdene i hver av de to H-kjeder.

Papain spalter f.eks. IgG oppstrøms for disulfidbindingene som eksisterer mellom hengselområdene i hver av de to H-kjeder for å danne to homologe antistoffragmenter, der en L-kjede sammensatt av VL (L-kjede-variabelt område) og CL (L-kjede-konstant område) og et H-kjedefragment sammensatt av VH (H-kjede-variabelt område) og CHyl (yl-område i det konstante området av H-kjeden) er forbundet ved deres C-terminale områder gjennom en disulfidbinding. Hvert av to slike homologe antistof fragmenter betegnes Fab'. Pepsin spalter også IgG ned-strøms for disulfidbindingene som eksisterer mellom hengselområdene i hver av de to H-kjeder for å danne et antistoffragment som er litt større enn fragmentet hvori de to ovennevnte Fab' er forbundet i hengselområdet. Dette antistof f ragment er betegnet F(ab')2.

Det "farmasøytiske preparat" ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter ethvert av "polypeptidene" ifølge foreliggende oppfinnelse, som definert ovenfor; "homodimert molekyl", "polypeptidfragment", "fusjonspolypeptid" omfattende polypeptidet; "homodimert molekyl" omfattende fusjonspolypeptidene, "antistoff" eller "del av et antistoff"; og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Den "farmasøytisk akseptable bærer" inkluderer en eksipiens, et fortynningsmiddel, et ekspanderingsmiddel, et dekomponeringsmidde1, en stabilisator, et konserveringsmiddel, en buffer, en emulgator, et aromastoff, et fargestoff, et søtningsmiddel, et viskositetsøkende middel, et smaksstoff, et oppløselighetsøkende middel eller andre additiver. Ved anvendelse av én eller flere slike bærere kan et farmasøytisk preparat formuleres til tabletter, piller, pulvere, granuler, injeksjoner, løsninger, kapsler, pastiller, eliksirer, suspen-sjoner, emulsjoner eller siruper. Det farmasøytiske preparat kan administreres oralt eller parenteralt. Andre former for parenteral administrering inkluderer en løsning for ekstern applisering, et suppositorium for rektal administrering og et pessar anvendt på vanlig måte, som omfatter én eller flere aktive bestanddeler.

Dosen kan variere, avhengig av pasientens alder, kjønn, vekt og symptom, behandlingseffekt, administrerings-måte, behandlingsperiode eller type aktiv bestanddel (polypeptid eller antistoff nevnt ovenfor) inneholdt i det farma-søytiske preparat. Vanligvis kan det farmasøytiske preparat administreres til en voksen person i en dose på 10 ug til 1000 mg (eller 10 ug til 500 mg) pr. administrering. Avhengig av forskjellige betingelser kan en dose som er mindre enn den ovennevnte, være tilstrekkelig i noen tilfeller, og en dose som er høyere enn den ovennevnte, kan være nødvendig i andre tilfeller.

Injeksjonsløsningen kan nærmere bestemt produseres ved å oppløse eller suspendere antistoffet i en ikke-toksisk, farmasøytisk akseptabel bærer, slik som fysiologisk saltvann eller kommersielt tilgjengelig destillert vann for injeksjon, med justering av konsentrasjonen fra 0,1 ug antistoff/ml bærer til 10 mg antistoff/ml bærer. Den således produserte injek-sjonsløsning kan administreres til en human pasient med behov for behandling i en dose på 1 ug til 100 mg/kg kroppsvekt, fortrinnsvis 50 ug til 50 mg/kg kroppsvekt, én eller flere ganger pr. dag. Eksempler på administreringsmåter er medisinsk passende administreringsmåter, slik som intravenøs injeksjon, subkutan injeksjon, intradermal injeksjon, intramuskulær injeksjon eller intraperitoneal injeksjon, fortrinnsvis intra-venøs injeksjon.

Injeksjonsløsningen kan også prepareres i et ikke-vandig fortynningsmiddel (f.eks. propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilsk olje, slik som olivenolje, og alkohol, slik som etanol), en suspensjon eller emulsjon.

Injeksjonsløsningen kan steriliseres ved filtrering med et ikke-bakteriegjennomtrengelig filter ved å innblande baktericider eller ved bestråling. Injeksjonsløsningen kan produseres i en form som prepareres ved bruk. Det vil si at den frysetørkes til et sterilt, fast preparat og kan oppløses i sterilt, destillert vann for injeksjon eller et annet løsningsmiddel før bruk.

Det farmasøytiske preparat ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å behandle eller forebygge forskjellige autoimmunsykdommer, allergiske sykdommer eller inflammatoriske sykdommer forårsaket av aktivering av lymfocytter, slik som T-celler, og regulering av aktiverte lymfocytt-funksjoner. Eksempler på disse sykdommer er reumatoid artritt, multippel sklerose, autoimmun tyreoiditt, allergisk kontaktdermatitt, kronisk inflammatorisk dermatose, slik som lichen planus, systemisk lupus erythematosus, insulinavhengig diabetes mellitus og psoriasis.

Den terapeutiske effekt av det farmasøytiske preparat ifølge foreliggende oppfinnelse mot symptomer på forskjellige sykdommer kan testes på vanlig måte ved administrering til et kjent modellsykdomsdyr. Eksempler på en slik modell inkluderer (1) en (NZB/NZW)Fl-mus, en modell for human systemisk lupus erythematosus (SLE) (Science, vol. 125, s. 1225-1227 (1994)), (2) eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE), en modell for multippel sklerose (MS) (J. Clin. Invest., vol. 95,

s. 2783-2789 (1995)), (3) en NOD(ikke-overvektig diabetes)-mus, en modell for insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM)

(J. Exp. Med., vol., 181, s. 1145-1155 (1995)), (4) rotte-nefrittmodell for renal glomerulus-basalmembranimmunitet, Goodpastures nefrittmodell (Eur. J. Immunol., vol. 24, nr. 6, s. 1249-1254 (1994)) og (5) enDBA/l-mus, en modell for human reumatoid artritt (Eur. J. Immunol., vol. 26, s. 2320-2328

(1996)) .

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 er raikrofotografier som viser tilstanden for aggregering av FTL435-celler indusert med "JTT-l-antistoff", og tilstanden for inhibering av celleaggregering med "JTT-2-antistoff".

Delfigur (a) viser cellenes tilstand i fravær av hybridomsupernatant, delfigur (b) viser tilstanden for celleaggregering indusert av "JTT-l-antistoff", delfigur (c) viser tilstanden for celleaggregering i nærvær av "anti-ICAM-l-antistoff" sammen med "JTT-l-antistoff", og delfigur (d) viser tilstanden for celleaggregering i nærvær av "JTT-2-antistoff" sammen med "JTT-l-antistoff".

Figur 2 er mikrofotografier som viser tilstanden for aggregering av FTL435-celler og aktiverte rottelymfoblaster indusert med "JTT-l-antistoff", og tilstanden for inhibering av celleaggregering med "JTT-2-antistoff".

Delfigur (a) viser tilstanden hos FTL435-celler i fravær av antistoff, delfigur (b) viser tilstanden hos FTL43 5-celler i nærvær av PMA, delfigur (c) viser tilstanden hos FTL435-celler i nærvær av "JTT-l-antistoff", delfigur (d) viser tilstanden hos FTL435-celler i nærvær av anti-LFA-1-antistoff sammen med "JTT-l-antistoff", delfigur (e) viser tilstanden hos FTL435-celler i nærvær av anti-CD18-antistoff sammen med "JTT-l-antistoff", delfigur (f) viser tilstanden hos FTL435-celler i nærvær av anti-ICAM-l-antistoff sammen med "JTT-l-antistoff", delfigur (g) viser tilstanden hos aktiverte lymfoblaster i fravær av antistoff, delfigur (h) viser tilstanden hos aktiverte lymfoblaster i nærvær av PMA, delfigur (i) viser tilstanden hos aktiverte lymfoblaster i nærvær av "JTT-l-antistoff", delfigur (j) viser tilstanden hos aktiverte lymfoblaster i nærvær av anti-LFA-l-antistoff sammen med "JTT-l-antistof f" , delfigur (k) viser tilstanden hos aktiverte lymfoblaster i nærvær av anti-CD18-antistoff sammen med "JTT-l-antistof f" , og delfigur (1) viser tilstanden hos aktiverte lymfoblaster i nærvær av anti-ICAM-l-antistoff sammen med "JTT-l-antistoff".

Figur 3 viser ekspresjonstilstanden for "JTT-l-antigen" og "JTT-2-antigen" i forskjellige celler målt med et strømningscytometer. Figur 4 viser ekspresjonstilstanden for "JTT-l-antigen" i forskjellige lymfocyttceller målt med et strømnings-cytometer. Figur 5 er et fotografi etter elektroforese av "JTT-1-antigen" analysert ved hjelp av SDS-PAGE. Figur 6 er mikrofotografier som viser tilstanden for adhesjon av rottetymocytter til mikrotiterplaten belagt med renset "JTT-1-antigen", hvor adhesjonen induseres i nærvær av "JTT-l-antistoff", og tilstanden for inhibering av celleadhesjonen med "JTT-2-antistoff". Delfigur (a) viser tilstanden for adhesjon av cellene til platen som ikke er belagt med "JTT-1-antigen", delfigur (b) viser tilstanden for adhesjon av cellene til platen belagt med "JTT-1-antigen" i fravær av antistoff, delfigur (c) viser tilstanden for adhesjon av cellene til platen belagt med "JTT-1-antigen" i nærvær av Fab-fragmentene av "JTT-l-antistoff", og delfigur (d) viser tilstanden for adhesjon av cellene til platen belagt med "JTT-1-antigen" i nærvær av "JTT-2-antistoff" sammen med Fab-fragmentene av "JTT-l-antistoff".

Figur 7 viser det relative celleantall av tymocytter som adhererer til platen belagt med renset "JTT-1-antigen", målt som fluorescensintensitet.

"Ag(-)" viser det relative celleantall i platen som ikke er belagt med "JTT-1-antigen", "Ag(+)" viser det relative celleantall i platen belagt med "JTT-1-antigen" i fravær av antistoff, "Ag(+) + JTT-1-Fab" viser det relative celleantall i platen belagt med "JTT-1-antigen" i nærvær av Fab-fragmentene av "JTT-l-antistoff", og "Ag(+) + JTT-1-Fab + JTT-2" viser det relative celleantall i platen belagt med "JTT-1-antigen" i nærvær av "JTT-2-antistoff" sammen med Fab-fragmentene av "JTT-l-antistoff".

Figur 8 viser ekspresjonstilstanden for "rotte-JTT-1-antigen" og "rotte-JTT-2-antigen" i COS-celler transformert med cDNA som koder for "rotte-JTT-l-antigen" med et strømningscytometer. Figur 9 viser de strukturelle karakteristika for aminosyresekvensen av "JTT-1-antigen", vist ved hydropatiplotanalyse. Figur 10 viser homologien blant aminosyresekvenser av "JTT-1-antigen"- og "rotte-JTT-1-antigen"-mutant fra menneske, rotte og mus. Figur 11 viser homologien blant aminosyresekvenser og konserveringstilstanden for motiver i "humant JTT-1-antigen", "humant CD28-molekyl" og "humant CTLA-4-molekyl". Figur 12 viser skjematisk den sekundære protein-struktur av og likheten mellom "humant JTT-1-antigen", "humant CD28-molekyl" og "humant CTLA-4-molekyl". Figur 13 viser skjematisk strukturen av det genomiske DNA som koder for "muse-JTT-1-antigen". Figur 14 viser forskjellen i aminosyresekvenser mellom "rotte-JTT-1-antigen" og dets alternative spleisings-mutant. Figur 15 viser graden av vekst av humane perifere blodlymfocytter indusert av det monoklonale antistoff mot "humant JTT-l-antigen", hvor graden av vekst ble målt ved hjelp av [3H] -tymidinopptak.

Ordinatene viser opptaksmengden (dpm) av [<3>H]-tymidin i cellene.

Figur 16 viser den terapeutiske effekt av det monoklonale antistoff mot "JTT-l-antigen" på eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE) i en rottesykdomsmodell.

Ordinatene viser den registrerte grad av sykdoms-symptom, og abscissen viser antall dager etter immunisering og induksjon av EAE.

Figur 17 viser den terapeutiske effekt av det monoklonale antistoff mot "JTT-l-antigen" på glomerulonefritt i en rottesykdomsmodell.

Ordinatene viser mengden proteiner utskilt i urinen, og abscissen viser tidsforløpet (uker) etter immunisering for induksjon av glomerulonefritt. Figur 18 viser et kolonnehistogram for rensing av fusjonspolypeptid mellom "rotte-JTT-l-antigen"-ekstracellulært område og humant IgFc (rJTT-l-IgFc) ved anvendelse av protein A-Sepharose-kolonne. Figur 19 er et fotografi som viser elektroforese av rJTT-l-IgFc analysert ved hjelp av SDS-PAGE. Figur 20 viser et kolonnehistogram for rensing av fusjonspolypeptid mellom "humant JTT-l-antigen"-ekstracellulært område og humant IgFc (hjTT-l-IgFc) ved hjelp av protein A-Sepharose-kolonne. Figur 21 er et fotografi som viser elektroforese av hJTT-l-IgFc analysert ved hjelp av SDS-PAGE. Figur 22 viser skjematisk strukturen av gen-overførings(målrettings)vektoren anvendt for frembringelse av en transgen mus, hvori cDNA som koder for "rotte-JTT-l-antigen" er blitt innført.

Beste måte for utøvelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er beskrevet i nærmere detalj med referanse til eksemplene nedenfor, men skal ikke oppfattes som begrensende for oppfinnelsen.

Eksempel 1

Fremstilling av monoklonale antistoffer

Antistoffproduserende hybridomer ble preparert i overensstemmelse med metoden ifølge Kohler et al. (Omori et al., Blood, vol. 81, s. 101-111 (1993)), og monoklonale antistoffer ble preparert i overensstemmelse med metoden ifølge Kannagi et al. (Handbook of Experimental Immunology, vol. 4, 117.21-117.21 (1986)).

FTL435-celler fra rottetymomcellelinje ble først administrert som et immunisert antigen til BALB/c-mus i deres fotpote i en mengde på IO<7> celler/mus med 0, 7, 14 og 28 dagers mellomrom. Blandingen av antigenet med Freunds komplette adjuvans ble kun administrert i den første immunisering. To dager etter den siste immunisering ble musenes lymfeknuter uttatt og fusjonert med musemyelomceller PAI (JCR nr. B0113; Stocker, J.W. et al., Res. Disclosure, vol. 217, s. 155

(1982)) på vanlig måte for å oppnå mange hybridomer som produserer monoklonale antistoffer.

Eksempel 2

Screening av hybridomer og karakterisering av monoklonale antistoffer

Hybridomene preparert i eksempel 1 ble screenet ved å analysere effekten av antistoffene produsert i kultursupernatanten på hybridomene på FTL435-celler, som ble anvendt som immunogen. FTL435-celler (5 x IO<6> celler/ml, 0,1 ml) ble tilsatt til hver brønn på en 96-brønners mikrotiterplate og dyrket ved 37 °C i 1 time i nærvær av kultursupernatant fra hver hybridom (10 ug/ml av hver). Resultatene oppnådd for hybridomkloner "JTT-1" og "JTT-2" er vist i figurene 1 og 2.

Det ble vist at et monoklonalt antistoff produsert av hybridomklon "JTT-1" ("JTT-l-antistoff") sterkt agglutinerte FTL435-celler (figur 1(b) og figur 2(c)), og at tilsetning av "JTT-2-antistoff" sterkt inhiberte aggregeringen av FTL435-celler indusert ved hjelp av "JTT-l-antistoff"-stimulering (figur l(d)). Analysen der det ikke ble tilsatt noen hybridomsupernatant, ble anvendt som kontroller (figur 1(a) og figur 2(a)) .

For å bestemme hvorvidt aggregeringen av FTL435-celler indusert ved stimulering med "JTT-l-antistoff" var forårsaket av celleadhesjonen mellom intercellulært adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) og lymfocyttfunksjon-assosiert antigen-1 (LFA-1), som er en representativ kjent reaksjonsvei for celleadhesjon, ble FTL435-celler dyrket ved 37 °C i nærvær av antirotte-ICAM-l-antistoff 1A29 (10 ug/ml; IgGl) eller antirotte-LFA-l-antistoff (10 ug/ml; IgG2a) sammen med "JTT-l-antistof f" .

Aggregering av FTL-435-celler ved hjelp av "JTT-l-antistof f" -stimulering ble verken inhibert av anti-ICAM-1-antistoff eller anti-LFA-l-antistoff (anti-ICAM-l-antistoff, figur l(c) og figur 2 (f); anti-LFA-l-antistoff, figur 2(d)).

For ytterligere å analysere celleagglutineringsevnen til "JTT-l-antistoff" ble evnen til å agglutinere rottelymfoblastceller aktivert ved hjelp av Concanavalin A-stimulering analysert på samme måte som angitt ovenfor. Resultatene er vist i figur 2.

Lignende effekten på FTL435-celler ble aggregering av aktiverte lymfoblastceller indusert ved hjelp av "JTT-l-antistof f" -stimulering (figur 2 (i)). Aggregeringen av aktiverte lymfoblastceller ved hjelp av "JTT-l-antistoff"-stimulering ble hovedsakelig inhibert av anti-LFA-l-antistoff (figur 2(j)) og anti-ICAM-l-antistoff (figur 2 (1)) . (Partiell aggregering forekom imidlertid.)

Som det fremgår av kontrollanalysen (figur 2(g)), der intet antistoff ble tilsatt, viste aktiverte lymfocytter, slik som aktiverte lymfoblaster, ingen aggregering gjennom celleadhesjon hvis de ikke mottar stimulering med forbolmyristatacetat (PMA, som aktiverer LFA-1) (figur 2(h)) eller "JTT-l-antistof f" (figur 2 (i)). Det faktum at anti-LFA-l-antistoff delvis inhiberte celleaggregering ved hjelp av "JTT-l-antistof f" -stimulering, indikerer derfor at LFA-1 i aktiverte lymfoblastceller ble aktivert ved hjelp av "JTT-l-antistoff"-stimulering. Dette indikerer også at molekylene gjenkjent av "JTT-l-antistoff" er involvert i noe signaltransmisjon.

Hybridomkloner ("JTT-1" og "JTT-2" er blitt deponert under Budapest-avtalen med internasjonal deponeringsautoritet, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) siden 11. oktober 1996, henholdsvis med et internasjonalt aksesjonsnummer FERM BP-5707 og FERM BP-5708.

Analyse ved anvendelse av monoklonalt museantistoff-isotypeidentifiseringssett (Amersham) bestemte at isotypen av monoklonale antistoffer produsert fra hver hybridom (JTT-l-antistof f og JTT-2-antistoff) begge var IgGl.

Eksempel 3

Reaktivitet av " JTT- l- antistoff" og " JTT- 2- antistoff" overfor forskjellige celler

For å analysere ekspresjonsmønsteret for molekyler gjenkjent av "JTT-l-antistoff" og "JTT-2-antistoff" i forskjellige celler ble reaktivitetene av antistoffene overfor forskjellige celler undersøkt. Molekyler gjenkjent av "JTT-l-antistof f" eller "JTT-2-antistoff" betegnes som henholdsvis "JTT-1-ant igen" og "JTT-2 -ant igen".

En 5-10 uker gammel Wistar-rotte (150-250 g) ble avlivet ved anestesi med dietyleter. Thymus og milt ble uttatt fra henholdsvis brystet og buken og homogenisert for å preparere en cellesuspensjon. De resulterende miltceller ble dyrket 1 RPMI1640-medium inneholdende 2 ug/ml Concanavalin A og 10 % FCS ved 37 °C i 3 dager for å preparere aktiverte lymfoblaster.

FTL435-celler, tymocytter, miltceller og aktiverte lymfoblaster (5 x 10s celler av hver) ble omsatt med "JTT-l-antistof f" eller "JTT-2-antistoff", og deretter med FITC-merket antimuse-IgG (Cappel). Fluorescensintensiteten i de fargede celler ble målt med et EPICS-Elite-strømningscyto-meter.

Resultatene er vist i figur 3. I FTL435-celler ble det observert en sterk ekspresjon av både "JTT-l-antigen" og "JTT-2-antigen". Mens antigenene ble uttrykt i tymocytter, ble de kun uttrykt i liten grad i miltceller. I aktiverte lymfoblaster oppnådd ved stimulering av miltceller med Concanavalin A ble imidlertid "JTT-l-antigen" og "JTT-2-antigen" sterkt uttrykt. I hver type celler samsvarte ekspresjonsmønsteret for "JTT-l-antigen" og "JTT-2-antigen" med hverandre. Disse resultater indikerer at "JTT-l-antigen" og "JTT-2-antigen" er de samme molekyler.

Eksempel 4

Reaktivitet av " JTT- l- antistoff" overfor forskjellige lymfocyttceller

For å analysere ekspresjonsmønsteret for molekyler ("JTT-l-antigen") gjenkjent av "JTT-l-antistoff" i forskjellige lymfocyttceller ble reaktiviteten av "JTT-l-antistoff" overfor lymfeknuter, T-lymfoblaster avledet fra milt og B-lymfoblaster avledet fra milten fra to typer rotter (Wistar-rotte og F344-rotte) analysert.

En 5-10 uker gammel Wistar-rotte og en F344-rotte (150-250 g) ble avlivet ved anestesi med dietyleter. Lymfe-knutene og milten ble uttatt fra hver rotte og homogenisert for å preparere en cellesuspensjon. Den resulterende cellesuspensjon fra milt ble dyrket i RPMI1640-medium inneholdende 2 ug/ml Concanavalin A (ConA) og 10 % FCS, ved 37 °C i 3 dager. Aktiverte T-lymfoblaster og aktiverte B-lymfoblaster ble oppnådd fra hver rotte etter dyrking i 1 dag og 3 dager. Miltavledete T-lymfoblaster og B-lymfoblaster oppnådd før lymfe-knuteceller og ConA ble tilsatt, ble dessuten anvendt som kontroller.

Alle celler (5 x IO<5> celler av hver) ble omsatt med biotinmerket antirotte-T-celleantistoff eller biotinmerket antirotte-B-celleantistoff (10 ug/ml, Seikagaku Corporation), og deretter med fykoerytrinmerket streptavidin. Cellene ble deretter reagert med 10 ug/ml FITC-merket "JTT-l-antistoff". Fluorescensintensiteten i de merkede celler ble målt med et EPICS-Elite-strømningscytometer.

Resultatene er vist i figur 4. I både aktiverte T-lymfoblaster og aktiverte B-lymfoblaster fra Wistar-rotter og F344-rotter ble den sterke ekspresjon av "JTT-l-antigen" observert fra dag 1 med aktivering ved hjelp av stimulering med ConA. Ekspresjonsmønsteret for "JTT-l-antigen" i hver type celler samsvarte dessuten nesten perfekt med hverandre.

Eksempel 5

Karakterisering av " JTT- l- antigen" og " JTT- 2- antigen" ved immunutfelling

"JTT-l-antigen" og "JTT-2-antigen" ble karakterisert ved immunutfelling ved anvendelse av FTL435-celler.

(1) Fremstilling av biotinylerte, oppløselige celleoverf latemolekyler

FTL435-celler ble vasket med PBS, suspendert i fysiologisk saltvann inneholdende 100 ug/ml NHS-biotin og 0,1 M HEPES (pH 8,0) for å justere 1 x IO<7> celler/ml, og inkubert ved romtemperatur i 40 minutter. Cellene ble vasket tre ganger med PBS, lysisbuffer (1 % NP-40, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,15 M NaCl) ble tilsatt for å justere til 5 x IO<7> celler/ml, og blandingen ble omsatt ved 4 °C i 30 minutter for å lysere cellene. Det dannede cellelysat ble sentrifugert, og supernatanten som omfattet biotinylerte, oppløselige celleoverf latemolekyler ble lagret ved -80 °C.

(2) Immunutfelling og SDS- PAGE- analyse

Den rensede prøve av "JTT-l-antistoff", renset på vanlig måte fra kultursupernatanten av hybridomklon "JTT-1", fremstilt i eksempel 1, ble blandet med protein-G-Sepharose-kuler for å justere til 2 mg/ml og tillatt å reagere ved 4 °C i 1 time for å binde antistoffet til kulene. Etter at kulene var vasket, ble 500 ul av det biotinylerte FTL435-cellelysat tilsatt til 10 (il av kulene, og blandingen ble tillatt å reagere ved 4 °C i 2 timer. Etter at kulene var vasket med lysisbuffer tre ganger, ble 50 ul glykanasebuffer (natriumfosfatbuffer (pH 7,0) inneholdende 0,15 % SDS) tilsatt til kulene, og blandingen ble kokt for å eluere molekylene innfanget av de antistoffbundne kuler. 1,25 % NP-40 og 20 U/ml N-glykanase ble tilsatt til en fraksjon av den således eluerte prøve, og blandingen ble tillatt å reagere over natten for å spalte N-bundne sukkerkjeder.

Et like stort volum prøvebuffer (Enprotech) for SDS-PAGE ble tilsatt til 5 ul av den eluerte prøve i nærvær eller fravær av 2-merkaptoetanol, og blandingen ble kokt. Etter elektroforese ble gelen overført til en PVDF-membran. Membranen ble blokkert med 3 % BSA-PBS og omsatt med peroksi-dasemerket streptavidin for å påvise biotinylerte, oppløselige celleoverflatemolekyler innfanget av "JTT-l-antistoff" med ECL-systemet (Amersham) som beskrevet i bruksanvisningen.

Resultatene er vist i figur 5. Det "JTT-l-antistoff"-gjenkjente molekyl ("JTT-l-antigen") på FTL435-celler viste en molekylvekt på ca. 47 kD under de ikke-reduserte betingelser ("(-)" i figur 5) og ca. 24 kD og 28 kD under de reduserte betingelser ("(+)" i figur 5). Som resultatet av avspalting av N-bundne sukkerkjeder ("+N-gly" i figur 5) ble "JTT-l-antigen" samlet til ett enkelt bånd på ca. 36 kD under de ikke-reduserte betingelser og ca. 20 kD under de reduserte betingelser. Disse resultater antyder at "JTT-l-antigen" danner en dimer hvori de samme kjerneproteiner har forskjellige sukkerkjeder. Fullstendig de samme resultater ble oppnådd i eksperimentet utført som nevnt ovenfor ved anvendelse av "JTT-2-antistoff". Tatt i betraktning disse resultater, sammen med resultatene fra eksempel 3 og eksempel 7 nedenfor, er "JTT-l-antigen"

(molekyl gjenkjent av "JTT-l-antistoff") og "JTT-2-antigen"

(molekyl gjenkjent av "JTT-2-antistoff") antatt å være iden-tiske med hverandre.

Eksempel 6

Eksperiment for adhesjon av rottetymocytter til renset " JTT- l-antigen" og N- terminal aminosyreanalyse

De følgende eksperimenter ble utført for å analysere hvorvidt molekylet som "JTT-l-antistoff" gjenkjenner ("JTT-l-antigen"), virker som et adhesjonsmolekyl. N-terminal aminosyreanalyse ble også utført.

(1) Preparering av " JTT- l- antistoff"- affinitetskolonne

Den rensede prøve (2 mg i 2 ml) av "JTT-l-antistoff", renset ved hjelp av den vanlige metoden fra kultursupernatanten fra hybridomklonen "JTT-1", preparert i eksempel 1, ble blandet med 1 ml protein-G-Sepharose-resin, og blandingen ble tillatt å reagere ved 4 °C i 1 time. Resinet ble vasket tre ganger med 200 mM trietanolamin (pH 8,2). Resinet ble deretter inkubert i trietanolamin (pH 8,2) inneholdende 10 mM dimetyl-pimelinimidat (DMP) ved romtemperatur i 1 time for å kovalent binde "JTT-l-antistoff" til resinet.

(2) Rensing av " JTT- l- antigen"

FTL435-celler ble dyrket i RPMI1640-medium inneholdende 10 % FCS. Cellene ble høstet ved sentrifugering for å oppnå en pellet og vasket med PBS tre ganger. Lysisbuffer (1 % NP-40, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,15 M NaCl) ble tilsatt til den vaskede pellet for å justere til 5 x 10<7> celler/ml, og blandingen ble tillatt å reagere ved 4 °C i 30 minutter for å lysere cellene. Det oppnådde cellelysat ble sentrifugert, og supernatanten inneholdende oppløselige celleoverflatemolekyler ble lagret ved -80 °C.

Lysatet (400 ml) ble applisert på en "JTT-l-antistof f" -af f initetskolonne . Etter at kolonnen var vasket med 50 ml av lysisbufferen og 20 ml PBS, ble "JTT-l-antigen" eluert med 0,2 M glysinbuffer (pH 2,8). IM Tris-buffer ble tilsatt til det således eluerte "JTT-l-antigen" for nøytrali-sering. Det oppnådde "JTT-l-antigen" ble lagret ved -80 °C.

(3) Bestemmelse av N- terminal aminosyresekvens

Etter at det rensede "JTT-l-antigen" var underkastet SDS-PAGE, ble den N-terminale aminosyresekvens bestemt ved hjelp av den vanlige metoden. Resultatet avslørte at "JTT-1-antigen" inneholdt aminosyresekvensen Glu-Leu-Asn-Asp-Leu-Ala-Asn-His-Arg.

(4) Adhesj onseksperiment

En 5-10 uker gammel Wistar-rotte (150-250 g) ble avlivet ved anestesi med dietyleter. Thymus ble uttatt og homogenisert for å preparere en tymocyttsuspensjon. 10 uM 2',7'-bis(karboksyetyl)karboksyfluorescein-tetraacetoksymetylester (BCECF-AM; Molecular Probes) ble tilsatt til suspensjonen, og blandingen ble inkubert ved 37 °C i 30 minutter for å fluor-escensmerke tymocyttene. Cellene ble vasket med PBS og suspendert i RPMI1640-medium inneholdende 10 % FCS for å justere til 2 x IO<7> celler/ml.

Det rensede "JTT-l-antigen" oppnådd under (2) ble applisert på en 96-brønners ELISA-plate i en konsentrasjon på 10 ul/brønn over natten. Etter at platen var vasket med PBS, ble 200 (il/brønn med PBS inneholdende 3 % BSA tilsatt til platen, og blokkering ble utført i 2 timer. Etter at platen var vasket med PBS, ble (1) kun fluorescensmerkede tymocytter (2 x IO<7> celler/ml, 0,1 ml), (2) fluorescensmerkede tymocytter (samme konsentrasjon) og "JTT-l-antistoff"-Fab-fragmenter preparert på vanlig måte (5 ug/ml), eller (3) fluorescensmerkede tymocytter (samme konsentrasjon), "JTT-l-antistoff"-Fab-fragmenter (samme konsentrasjon), og "JTT-2-antistoff"

(10 ug/ml) tilsatt til hver brønn og dyrket ved 37 °C i 1 time. For å fjerne ubundne celler ble hver brønn vasket én gang med RPMI1640-medium inneholdende 10 % FCS. Hver brønn ble observert under et lysmikroskop. 100 ul 0,1 % NP-40 ble deretter tilsatt til hver brønn, og cellene som adhererte til platen, ble lysert. Det relative celleantall av fluorescensmerkede tymocytter adherert til hver brønn ble telt ved å måle fluorescensintensiteten ved 53 8 nm (eksitert ved 485 nm) med et Fluoroscan II-mikroplatefluorometer (Flow Laboratories). Analysen der en plate ikke ble belagt med renset "JTT-l-antigen", ble anvendt som en kontroll.

Resultatene fra lysmikroskopiobservasjonen er vist i figur 6.

Tymocytter adhererte i betydelig grad til renset "JTT-l-antigen" kun i nærvær av "JTT-l-antistoff"-Fab-fragmenter (figur 6(c)). Adhesjonen ble betydelig inhibert av "JTT-2-antistoff" (figur 6(d)).

Figur 7 viser det relative celleantall av tymocytter adherert til "JTT-l-antigen" belagt på hver brønn, uttrykt ved fluorescensintensitet.

Fra disse resultater ble det vist at "JTT-l-antigen" virker som et adhesjonsmolekyl.

Eksempel 7

Kloning av cDNA som koder for rotte-" JTT- l- antigen"

1. Preparering av cDNA- bibliotek

1-(1) Ekstraksjon av poly( A)*- RNA fra ConA-stimulerte rottelymfoblaster ConA-stimulerte lymfoblaster (ConA-blast) avledet fra rottemilt (ca. 1 x IO<6> celler/ml) ble sentrifugert (2000 x g) ved 4 °C i 5 minutter. De utfelte celler ble suspendert med ISOGEN (Nippon Gene) og ekstrahert med kloroform under om-røring for å innsamle supernatanten. Etter at isopropanol var tilsatt til den oppnådde supernatant, ble blandingen tillatt å henstå ved romtemperatur i 10 minutter og sentrifugert ved 12000 x g ved 4 °C i 10 minutter for å utfelle RNA. Det utfelte RNA ble vasket med etanol og oppløst i TE-buffer. Poly(A)<+->RNA ble renset fra det således oppnådde total-RNA ved hjelp av et "mRNA-rensingssett" (Pharmacia).

l-(2) Preparering av cDNA

Med 5 ug poly(A)<+->RNA, preparert ovenfor som templat, ble cDNA syntetisert med "Time Saver cDNA-syntesesett"

(Pharmacia). "Oligo dT-primer" (Pharmacia) med Noti-sete ble anvendt for å øke screeningseffektiviteten. EcoRI-adapter ble tilsatt, og spalting med Noti ble utført for å oppnå cDNA med ensartet retning. Størrelsesfraksjonering ble deretter utført ved hjelp av en Spun-kolonne (Pharmacia).

l-(3) Innføyelse i en vektor

Det oppnådde cDNA med EcoRI- og NotI-ender ble ligert med pME18S (Hara, T. & Miyajima, A., EMBO J., vol. 11,

s. 1875-1884 (1992)) spaltet med EcoRI og Noti. "DNA-liger-

ingssett" (Takåra Shuzo) ble anvendt for ligeringen. E. coli-DH5-celler (Toyobo) ble transformert med det således oppnådde reaksjonsprodukt. Transformanter ble dyrket inntil O.D.-verdien (ved 600 nm) nådde 0,6 og innhøstet for å gjenvinne plasmid-DNA med et bibliotek. QUIAGEN-Tip (QUIAGEN) ble anvendt for rensing av plasmid-DNA.

2 . Screening av cDNA- bibliotek

Screening ble utført i overensstemmelse med panoreringsmetoden (Seed, B. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 84, s. 3365-3369 (1987)).

2-(l) Genoverføring i COS- celler

Det således oppnådde bibliotek ble innført i C0S7-celler ved elektroporering (Potter, H. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 85, s. 2288-2292). Transformantene ble dyrket i 60 timer etter innføring, supernatanten ble fjernet, og pelleten ble vasket tre ganger med PBS. Etter at pelleten var behandlet med PBS (inneholdende 0,5 mM EDTA) ved 37 °C i 30 minutter, ble cellene fjernet ved pipettering. Kun levende celler ble deretter oppsamlet med "Lymphprep" (NYCOMED).

2-(2) Konsentrering av genuttrykkende celler ved

panorering

De levende celler oppnådd ovenfor ble suspendert i PBS (inneholdende 5 % FCS og 0,5 mM EDTA). Cellesuspensjonen ble overført til en kulturskål belagt med 11 JTT-l-antistof f" og inkubert ved romtemperatur i 3 timer. Etter at cellene som ikke ble bundet til kulturskålen var fjernet, og kulturskålen var vasket tre ganger med PBS, ble plasmid-DNA oppsamlet fra cellene som ble bundet til kulturskålen ved hjelp av Hirts metode (Hirt, B., J. Mol. Biol., vol. 26, s. 365-369).

E. coli-DHIOB (GIBCO BRL) ble transformert med det således oppnådde plasmid-DNA. Plasmid-DNA ble amplifisert og renset med transformantene som beskrevet i l-(3) ovenfor. Prosedyrene beskrevet i (1) og (2) ble deretter gjentatt to ganger.

2-(3) Isolering av den positive klon

Etter den tredje panorering ble transformerte

E. coli-DH10B-celler dyrket over natten på LB-plater inneholdende ampicillin for å danne kolonier. 20 legemiddelresi-stente kolonier ble dyrket, plasmid-DNA ble oppsamlet ved hjelp av alkalisk miniprep-metoden (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), og det innføyde DNA ble analysert. Agarosegelelektroforese avslørte at klonen på ca. 0,9 kb cDNA (betegnet "T132A7") ble konsentrert.

"T132A7" ble forbigående uttrykt i COS7-celler, på nytt med fremgangsmåten beskrevet i (1). Etter at "T132A7"-innførte celler var reagert med "JTT-l-antistoff" eller "JTT-2-antistoff" og deretter med FITC-merket antimuse-IgG (Cappel), ble fluorescensintensiteten i de fargede celler målt med et EPICS-Elite-strømningscytometer (Coulter). "JTT-l-antistof f" og "JTT-2-antistoff" gjenkjente sterkt "T132A7"-genproduktet. Resultatene er vist i figur 8.

3 . Bestemmelse av nukleotidsekvens og aminosyresekvens

Nukleotidsekvensen av klon "T132A7" ble bestemt ved dideoksymetoden med "Auto Read Sequencing Kit" (Pharmacia) og "A.L.F. DNA Sequencer" (Pharmacia). Den utledete aminosyresekvens for "rotte-JTT-l-antigen" som kodes for av nukleotidsekvensen, ble dessuten analysert ved hjelp av genanalyse-software "GENEWORKS" (IntelliGenetics). Nukleotidsekvensen og den utledete aminosyresekvens er vist i SEKV.ID. NR. 4.

Aminosyresekvensen (bestående av 200 aminosyrerester) utledet fra det klonede gen omfatter den samme aminosyresekvens som den N-terminale aminosyresekvens bestemt i eksempel 6-(3) . I betraktning av at klon "T132A7"-introduserte celler sterkt reagerer med "JTT-l-antistoff", kan det konklu-deres med at klon "T132A7" omfatter cDNA som koder for "rotte-JTT-1-antigen".

4. Computeranalyse

Hydropatianalyse av den primære struktur av den utledete aminosyresekvens av "JTT-l-antigen" ble utført i overensstemmelse med metoden ifølge Kite og Doolittle (Kite, J. & Doolittle, R.F., J. Mol. Biol., vol. 157, s. 105-132

(1982)) (figur 9). Resultatene avslørte at "JTT-l-antigen" er et transmembranprotein med en signalsekvens ved N-terminalen. Resultatene av motivanalyse avslørte dessuten at "JTT-l-antigen" har to Asn-bundne sukkerkjedebindingsseter i det ekstracellulære domenet, og to kaseinkinase-fosforyleringsseter og ett proteinkinase C-fosforyleringssete i det cytoplasmatiske domenet. I figur 9 betyr "CHO" N-bundet sukkerkjedebindings-sete; "P": fosforyleringssete; "CKII": kaseinkinase II; og "PKC": proteinkinase C.

Eksempel 8

Kloning av cDNA som koder for " humant JTT- l- antigen"

1. Preparering av en probe

cDNA (ca. 0,9 kb) som koder for "rotte-JTT-l-antigen" , ble dannet ved spalting av klonen "T132A7", oppnådd i eksempel 7, med restriksjonsenzymene EcoRI og Noti og ble separert ved agarosegelelektroforese. De separerte DNA-fragmenter ble renset med "QUIAEX gelekstraksjonssett"

(QUIAGEN), og de oppnådde DNA-fragmenter ble merket med <32>P ved anvendelse av "Ready-To-Go DNA-merkingssett" (Pharmacia). Disse merkede DNA-fragmenter ble anvendt som prober for plakkhybridisering.

2 . Preparering av cDNA- bibliotek 2-(l) Ekstraksjon av poly( A)*- RNA

Poly(A)<+->RNA ble ekstrahert fra ConA-stimulerte lymfoblaster (ConA-blast) avledet fra humant perifert blod, på samme måte som i eksempel 7-1-(1).

2-(2) Preparering av cDNA

Med 5 ug av det således preparerte Poly(A)<+->RNA som et templat ble cDNA syntetisert med oligo dT-primer"

(Pharmacia) og "Time Saver cDNA-syntesesett" (Pharmacia).

EcoRI-adapter ble deretter tilsatt, og størrelsesfraksjonering ble utført med en Spun-kolonne (Pharmacia).

2-(3) Innføyelse i en vektor og emballering

Det således oppnådde cDNA med EcoRI-ender ble ligert med vektoren "kZAPII" (Stratagene) spaltet med EcoRI. "DNA-ligeringssett" (Takara Shuzo) ble anvendt for ligeringen. Etter at in vitro-emballering av det ligerte DNA var utført med "GIGA PACK II GOLD" (Stratagene), ble E. coli-XLlBlue MRF'-celler (Stratagene) transfektert med den oppnådde fagpartikkel for å danne et cDNA-bibliotek sammensatt av plakk omfattende rekombinant fag.

3 . Screening av cDNA- bibliotek

cDNA-biblioteket ble screenet ved hjelp av plakkhybridiseringsmetoden (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) med "Rapid-hybridiseringsbuffer"

(Amersham). Det således oppnådde cDNA-bibliotek (1 x IO<4>) ble først utspredt på agarplater, og kopier ble produsert med "Hybond-N-nylonmembran" (Amersham). Plakkhybridisering ble utført i "Rapid-hybridiseringsbuffer" (Amersham) ved anvendelse av kopiene og den <32>P-merkede probe preparert i eksempel 8-1. Første og andre screeninger ble utført for å oppnå 8 positive kloner. Enkle plakker fra hver klon ble isolert og underkastet in vivo-utkutting i overensstemmelse med manualen (Stratagene), og 7 positive kloner ble oppsamlet som plasmid-DNA. 4 . Bestemmelse av nukleotidsekvensen

Nukleotidsekvensen av de 7 kloner ble bestemt ved hjelp av dideoksymetoden med "Auto Read Sequencing Kit"

(Pharmacia) og "A.L.F. DNA Sequencer" (Pharmacia). De 7 kloner omfatter den samme nukleotidsekvens. Det ble funnet at klon "pBSh41" koder for det fullengede "humane JTT-l-antigen". cDNA-sekvensen som tilsvarer den åpne leseramme (ORF) av "humant JTT-l-antigen", er vist i SEKV.ID. NR. 1, hele lengden av den utledete aminosyresekvens av "humant JTT-l-antigen" er vist i SEKV.ID. NR. 2, og nukleotidsekvensen som omfatter 5'-

og 3'-sekvenser, er vist i SEKV.ID. NR. 3 (ORF tilsvarer nukleotidrestene 26-625). Det fremgår at nukleotidsekvensen inneholdt i klonen koder for hele lengden av "humant JTT-l-antigen" fordi aminosyresekvensen (bestående av 199 aminosyrerester) utledet fra nukleotidsekvensen viser signifikant homologi med aminosyresekvensen av "rotte-JTT-l-antigen" (figur 10). Som vist i figur 10, er homologien mellom aminosyresekvensene av humant og rotte-"JTT-l-antigen" 60 % eller mer.

E. coIi-DHIOB (GIBCO BRL) transformert med klonen "pBSh41" er blitt deponert under Budapest-avtalen med internasjonal deponeringsautoritet, National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) siden 25. oktober 1996 (en internasjonal deponering med aksesjonsnummer FERM BP-5725). 5. Strukturelle karakteristika og biologisk funksjon av " JTT- l- antigen"

Resultatene fra motivsøk for den utledete aminosyresekvens av "humant JTT-l-antigen" i kjente humane proteiner avslørte at "humant JTT-l-antigen" har strukturell likhet med "CD28" og "CTLA-4", humanavledete cellemembran-proteiner som tilhører immunglobulinsuperfamilien, nevnt i detalj ovenfor (figurene 11 og 12). Som nevnt ovenfor, er "CD28" og "CTLA-4" ytterst viktige molekyler som regulerer aktiveringen og inhiberingen av T-celler i immunsystemet.

Den strukturelle likhet er som følger:

1. 20 eller flere aminosyrerester, inkludert cysteinrester, er høykonserverte. 2. Prolingjentakelsessekvensen "Pro-Pro-Pro (PPP)", som er essensiell som ligandbindingsområdet i CD28 og CTLA-4, er konservert. 3. "Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM)" (Xaa og x representerer en hvilken som helst aminosyre), en sekvens som er essensiell som signaltransmisjonsområdet i CD28 og CTLA-4, er konservert i det cytoplasmatiske området.

Fra det faktum at den samme struktur som den spesifikke struktur av "CD28" og "CTLA-4" spiller en viktig rolle ved regulering av aktivering av T-celler som er hovedaktør i immunmekanismen, kan det utledes at "JTT-1-antigenet" ifølge foreliggende oppfinnelse spiller en like viktig rolle som disse molekyler ved regulering av aktivering av lymfocytter, slik som T-celler, som er hovedaktør i immunresponsen.

Eksempel 9

Kloning av cDNA som koder for " muse- JTT- l- antigen"

1. Preparering av en probe

cDNA (ca. 0,9 kb) som koder for "rotte-JTT-l-antigen" , ble oppnådd ved spalting av klonen "T132A7", klonet i eksempel 7, med restriksjonsenzymene EcoRI og Noti og ble separert ved agarosegelelektroforese. De således separerte DNA-fragmenter ble renset med "QUIAEX gelekstraksjonssett"

(QUIAGEN), og DNA-fragmentene ble merket med <32>P ved anvendelse av "Ready-To-Go DNA-merkingssett" (Pharmacia). Disse merkede DNA-fragmenter ble anvendt som en probe for plakkhybridisering.

2 . Preparering av cDNA- bibliotek 2-(l) Ekstraksjon av poly( A)*- RNA

Som i eksempel 7-1-(1) ble poly(A)<+->RNA ekstrahert fra ConA-stimulerte lymfoblaster avledet fra musemilt (ca.

1 x IO<6> celler/ml) .

2-(2) Preparering av cDNA- bibliotek

Med 5 mg poly(A)<+->RNA, fremstilt ovenfor som et templat, ble cDNA syntetisert med oligo dT-primer (Pharmacia) og "Time Saver cDNA-syntesesett" (Pharmacia). Etter at en EcoRI-adapter ble tilføyd til cDNA, ble størrelsesfraksjo-nering utført med en Spun-kolonne (Pharmacia).

2-(3) Innføyelse i en vektor og emballering

Det således oppnådde cDNA med EcoRI-ender ble ligert med vektoren 1ZAPII (Stratagene) spaltet med EcoRI. "DNA-ligeringssett" (Takara Shuzo) ble anvendt for ligeringen. Etter at in vi tro-emballering av det ligerte DNA var utført med "GIGA PACK II GOLD" (Stratagene), ble E. coIi-XLlBlue MRF'-celler (Stratagene) transfektert med den således oppnådde fagpartikkel for å danne et cDNA-bibliotek bestående av plakk omfattende rekombinant fag.

3 . Screening av cDNA- bibliotek

Screening ble utført ved plakkhybridiseringsmetoden (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) ved anvendelse av "Rapid-hybridiseringsbuffer" (Amersham).

Det oppnådde cDNA-bibliotek (1 x IO<4>) ble utspredt på agarplater, og kopier ble produsert ved anvendelse av "Hybond-N-nylonmembran" (Amersham). Plakkhybridisering ble utført i "Rapid-hybridiseringsbuffer" (Amersham) ved anvendelse av kopiene og den <32>P-merkede probe preparert i eksempel 9-1. Første og andre screeninger ble utført for å oppnå 5 positive kloner. Etter at en enkelt plakk av hver klon var isolert, ble in vivo-utkutting utført i overensstemmelse med instruksjons-manualen (Stratagene), og 5 positive kloner ble oppsamlet som plasmid-DNA.

4 . Bestemmelse av nukleotidsekvensen

Nukleotidsekvensene av hver av de 5 kloner ble bestemt ved hjelp av dideoksymetoden med "Auto Read Sequencing Kit" (Pharmacia) og "A.L.F. DNA Sequencer" (Pharmacia). 4 av de 5 klonene omfatter den samme nukleotidsekvens. Nukleotidsekvensen av cDNA som koder for den fulle lengde av "muse-JTT-1-antigen" og den utledete aminosyresekvens, er vist i

SEKV.ID. NR. 5.

Som det fremgår av figur 10, er "muse-JTT-l-antigen" sammensatt av 200 aminosyrerester, slik som "rotte-JTT-l-antigen" . Homologien mellom aminosyresekvensene av muse-, rotte-og humane "JTT-1-antigener" er signifikant (60 % eller mer). 5 . Analyse av beliggenheten av " muse- JTT- l- antigen"-genet

Beliggenheten av genet som koder for "muse-JTT-l-antigen" ble analysert ved hjelp av in situ-fluorescens-hybridiseringsmetoden.

Det således oppnådde cDNA som koder for "muse-JTT-1-antigen", ble merket med <32>P for å preparere hybridiserings-prober på vanlig måte. Ved anvendelse av disse prober ble det 129 SVJ-musegenomiske DNA-bibliotek (Stratagene) screenet for å oppnå musegenomiske DNA-kloner som omfatter exonet som koder for "muse-JTT-l-antigen". Strukturen av det genomiske DNA er vist skjematisk i figur 13.

De ovenfor oppnådde genomiske DNA-kloner ble merket med digoksigenin-dUTP ved nick-translasjon for å preparere prober. De merkede prober ble bundet til spaltet muse-DNA og hybridisert med normale metafasekromosomer avledet fra muse-embryofibroblaster i en oppløsning inneholdende 50 % form-aldehyd, 10 % dekstransulfat og 2 x SSC. Etter at et objekt-glass for hybridisering var inkubert i fluorescensmerket anti-digoksigeninantistoff, ble et spesifikt hybridiseringssignal påvist ved farging med DAPI. I den første test ble delen nær det største kromosom, som ble antatt å være kromosom 1, bedømt fra DNA-størrelsen og fremkommet bånd, spesifikt merket. Basert på denne informasjon, ble den ovenfor beskrevne genomiske DNA-klon kohybridisert med prober som er spesifikke for sentromerområdet av kromosom 1. Som et resultat ble sentromerområdet av kromosom 1 og områdene nær disse spesifikt merket. 10 prøver av kromosom 1 som viser den spesifikke hybridisering, ble analysert, og det ble avslørt at den ovennevnte genomiske DNA-klon var lokalisert i en posisjon på 33 % av distansen fra grensen mellom heterokromatin og eukromatin i forhold til telomeren av kromosom 1, nemlig på det samme bånd, "1C3", som beliggenhetene av muse-"CD28"- og "CTLA-4"-gener. Som et resultat etter at 80 metafaseceller var analysert, ble spesifikk merking identifisert i denne posisjon for 79 celler.

Disse resultater og resultatene oppnådd i eksempel 8, som indikerer strukturell likhet mellom "JTT-l-antigen" med "CD28" og "CTLA-4", antyder at "JTT-l-antigen", slik som "CD28" og "CTLA-4", er et viktig molekyl som er involvert i regulering av transmisjonen av kostimulerende signal og/eller aktivering av lymfocytter.

Eksempel 10

Kloning av cDNA som koder for en mutant av " rotte- JTT- l- antigen"

Et annet cDNA som antas å kode for en alternativ spleisingsvariant av "rotte-JTT-1-antigen", klonet i eksempel 7, ble klonet som følger.

1. Preparering av en probe

2 . Preparering av cDNA- bibliotek 2-(l) Ekstraksjon av poly( A)*- RNA

Som i eksempel 7-1-(1) ble poly(A)<+->RNA ekstrahert fra rottetymomcellelinje FTL435 (ca. 1 x IO<6> celler/ml) .

2-(2) Preparering av cDNA- bibliotek

Med 5 mg poly(A)<+->RNA, fremstilt som nevnt ovenfor som et templat, ble cDNA syntetisert ved anvendelse av oligo dT-primer (Pharmacia) og "Time Saver cDNA-syntesesett"

(Pharmacia). Etter at en EcoRI-adapter ble tilsatt til cDNA, ble størrelsesfraksjonering utført med en Spun-kolonne (Pharmacia).

2-(3) Innføyelse av cDNA i en vektor og

emballering

cDNA med en EcoRI-ende, oppnådd som beskrevet ovenfor, ble ligert med vektoren 1ZAPII (Stratagene) spaltet med EcoRI. "DNA-ligeringssett" (Takara Shuzo) ble anvendt for ligeringen. Etter at in vitro-emballering av det ligerte DNA var utført med "GIGA PACK II GOLD" (Stratagene), ble E. coli-XLlBlue MRF' (Stratagene) transfektert med den oppnådde fag-

partikkel for å danne et cDNA-bibliotek sammensatt av plakk omfattende rekombinant fag.

3 . Screening av cDNA- bibliotek

Screening ble utført ved plakkhybridiseringsmetoden (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) med "Rapid-hybridiseringsbuffer" (Amersham).

Det ovenfor preparerte cDNA-bibliotek (1 x IO<4>) ble utspredt på agarplater, og kopier ble produsert med "Hybond-N-nylonmembran" (Amersham). Plakkhybridisering ble utført i "Rapid-hybridiseringsbuffer" (Amersham) ved anvendelse av kopiene og den <32>P-merkede probe preparert i eksempel 10-1. Første og andre screeninger ble utført for å oppnå 2 positive kloner. Etter at en enkelt plakk av hver klon var isolert, ble in vivo-utkutting utført i overensstemmelse med instruksjons-manualen (Stratagene), og 2 positive kloner ble oppsamlet som plasmid-DNA.

4 . Bestemmelse av nukleotidsekvensen

Nukleotidsekvensene av de 2 kloner ble bestemt ved dideoksymetoden med "Auto Read Sequencing Kit" (Pharmacia) og "A.L.F. DNA Sequencer" (Pharmacia). De to klonene omfatter den samme nukleotidsekvens. Nukleotidsekvensen av cDNA som koder for den fulle lengde av det oppnådde "rotte-JTT-l-antigen" og den utledete aminosyresekvens, er vist i SEKV.ID. NR. 6. Aminosyresekvensen (SEKV.ID. NR. 6) utledet fra den oppnådde cDNA-sekvens, ble sammenlignet med aminosyresekvensen (SEKV.ID. NR. 4) utledet fra den oppnådde cDNA-sekvens som koder for "rotte-JTT-l-antigen" klonet i eksempel 7 (figur 14). Som vist i figur 14, var aminosyresekvensen som kodes for av cDNA klonet i denne test, fullstendig den samme som sekvensen kodet for av cDNA som koder for "rotte-JTT-l-antigen" oppnådd i eksempel 7, med unntak av at (1) tre C-terminale kontinuerlige aminosyrerester (Met-Thr-Ser) endres til Thr-Ala-Pro, og at (2) etter Thr-Ala-Pro er 16 kontinuerlige aminosyrerester (Leu-Arg-Ala-Leu-Gly-Arg-Gly-Glu-His-Ser-Ser-Cys-Gln-Asp-Arg-Asn) tilføyd. Dette indikerer at cDNA som er klonet i déhné-tést, koder for den alternative spleisingsvariant av "rotte-JTT-l-antigen" oppnådd i eksempel 7.

Eksempel 11

Preparering av celler som uttrykker rekombinant " humant JTT- l-antigen"

Plasmidklonen pBSh41, oppnådd i eksempel 8, ble spaltet med et restriksjonsenzym EcoRI, og et DNA-fragment omfattende cDNA som koder for den fulle lengde av "humant JTT-l-antigen", ble utskåret. Dette DNA-fragment ble innføyd ved hjelp av DNA-ligeringssett (Takara Shuzo) i et plasmid, pEFneo (Proe. Nati. Acad. Sei., USA, vol. 91, S. 158-162 (1994)), behandlet med det samme restriksjonsenzym EcoRI for å preparere ekspresjonsvektoren. CH0-K1-celler (ATCC: CCL-61) ble transformert med vektoren ved elektroporering. Ved dyrkning av cellene i RPMI1640-medium inneholdende 0,8 mg/ml geneticin (GIBCO BRL) og 10 % kalvefosterserum i ca. 2 uker ble geneticinresistente transformanter utvalgt. Ekspresjonen av rekombinant "humant JTT-l-antigen" ble bekreftet ved Northern blotting på vanlig måte.

Eksempel 12

Preparering av monoklonale antistoffer mot " humant JTT- l- antigen"

De rekombinante transformanter som uttrykker "humant JTT-l-antigen", preparert i eksempel 11, ble homogenisert og ultrasentrifugert (100 000 x g). Pelleten inneholdende cellemembranfraksjonen ble oppsamlet og suspendert i PBS. Den resulterende suspensjon omfattende cellemembranfraksjonen ble injisert i fotpoten av en BALB/c-mus med komplett Freunds adjuvans for den første immunisering (dag 0). Cellemembran-fraksjonsantigenet ble videre administrert i fotpoten med intervaller på 7, 14 og 28 dager. To dager etter den siste immunisering ble lymfeknutecellene uttatt. Lymfeknutecellene og musemyelomceller PAI (JCR nr. B0113; Res. Disclosure,

vol. 217, s. 155 (1982)) ble blandet i et forhold på 5:1 og fusjonert ved anvendelse av polyetylenglykol 4000 (GIBCO) som fusjonsmiddel for å preparere monoklonalt antistoff-produ-serende hybridomer. Hybridomene ble screenet ved dyrkning i

HAT-inneholdende ASF104-medium (Ajinomoto) supplert med 10 % kalvefosterserum og aminopterin. Kultursupernatanten fra hver hybridom ble reagert med de rekombinante "humant JTT-l-antigen" -uttrykkende transformanter preparert i eksempel 11, og fluorescensintensiteten i celler farget ved reaksjon med FITC-merket antimuse-IgG (Cappel) ble målt med et EPICS-Elite-strømningscytometer for å bekrefte reaktiviteten av det monoklonale antistoff dannet i hver kultursupernatant overfor "humant JTT-l-antigen". Det er bekreftet at 10 eller flere hybridomer som produserer monoklonale antistoffer som er reaktive overfor "humant JTT-l-antigen", ble oppnådd.

Hver av to typer (betegnet klon SA12 og SG43 0) blant disse hybridomer (IO<6> til 10<7> celler/0,5 ml/mus) ble injisert intraperitonealt i en ICR-nu/nu-mus (hunn, 7-8 uker gammel). Etter 10-20 dager ble det utført celiotomi på musen under anestesi, og de to typer monoklonale antistoffer (SA12 og SG430) som er reaktive overfor "humant JTT-l-antigen", ble preparert i en stor mengde fra ascitesvæsken ekstrahert på vanlig måte.

Eksempel 13

Effekt av de monoklonale antistoffer mot " humant JTT- l- antigen" på humane perifere blodlymfocytter

Som nevnt i eksempel 8, antas det at "JTT-l-antigen" kan være involvert i reguleringen av de aktiverte lymfocytter i immunreaksjon, slik som "CD28" og "CTLA-4". For å vise dette ble effekten av de monoklonale antistoffer mot "humant JTT-l-antigen" på humane lymfocytter analysert i lys av cellevekst som en indikasjon.

Til hver brønn på en 96-brønners mikrotiterplate ble det tilsatt (1) enten SA12 eller SG430 (1 ug/ml), det monoklonale antistoff mot "humant JTT-l-antigen" preparert i eksempel 12, eller (2) en blanding av enten monoklonalt antistoff SA12 eller SG43 0 (1 ug/ml) med anti-CD3-monoklonalt antistoff OKT-3 (1 ug/ml, Orthodiagnostic Systems), som anvendes for å tilføye det primære signal ved aktivering av lymfocytter. Platen ble inkubert ved 37 °C i 1 time for å belegge hver brønn med antistoffet. Etter at platen var vasket med RPMI1640-medium, ble normale humane, perifere blodlymfocytter (1 x IO<5> celler/brønn) tilsatt til hver brønn og inkubert i RPMI1640-medium inneholdende 10 % kalvefosterserum i 3 dager. Hvis nødvendig ble 1 ng/ml forbolmyristatacetat (PMA) tilsatt. Deretter ble [<3>H]-tymidin (3,7 ukBq/brønn) tilsatt til hver brønn, og platen ble inkubert ved 3 7 °C i 6 timer. Cellene ble innhøstet, og mengden av [<3>H]-tymidin inkorporert i DNA ble målt med en væskescintillasjonsteller (Beckman). Analysen uten antistoff ble anvendt som en kontroll. Resultatene er vist i figur 15.

I analysen ved anvendelse av platene belagt med enten monoklonalt antistoff SA12 eller SG43 0 økte antallet lymfocytter ca. 10 ganger sammenlignet med kontrollen. Ved samtidig tilstedeværelse av OKT3 økte antallet lymfocytter ca.

100 ganger når enten monoklonalt antistoff SA12 eller SG430 ble anvendt.

Disse resultater indikerer at "JTT-l-antigen" virker under regulering av lymfocyttaktiveringen. Det faktum at celleveksthastigheten ble økt ved anvendelse sammen med 0KT3, indikerer at "JTT-l-antigen" er involvert ved transmisjon av kostimulerende signal, slik som "CD28" og "CTLA-4".

Eksempel 14

Effekt av " JTT- 2- antistoff" på eksperimentell allergisk encefalomyelitt ( EAE)

Som beskrevet ovenfor i detalj, er det nylig blitt utført mange forsøk på å behandle forskjellige autoimmunsykdommer (reumatoid artritt, multippel sklerose, autoimmun tyreoiditt, allergisk kontaktdermatitt, kronisk, inflammatorisk dermatose, slik som lichen planus, systemisk lupus erythematosus, insulinavhengig diabetes mellitus, psoriasis etc.) ved å regulere transmisjonen mellom CD28/CTLA-4 og CD80/CD86. Effekten er allerede bekreftet i forskjellige dyre-modeller for autoimmunsykdommer ( (1) en modell for human systemisk lupus erythematosus (SLE), (2) eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE), en modell for multippel sklerose (MS), (3) en modell for insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM), (4) Goodpastures nefrittmodell, og (5) human reumatoid artritt).

For å bestemme hvorvidt "JTT-l-antigen" ifølge foreliggende oppfinnelse er et molekyl som er involvert i aktivering eller inhibering av lymfocytter, slik som "CD28" og "CTLA-4", ble det produsert modellrotter for eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE), en modell for multippel sklerose (MS), og effekten av det monoklonale antistoff på "JTT-l-antigen" i modellen ble analysert.

En emulsjon til anvendelse som et immunogen ble preparert ved å blande cerebrospinalhomogenat fra Hartley-marsvin (800 mg/ml fysiologisk saltvann) med den samme mengde Freunds komplette adjuvans. Immunisering ble utført ved intradermal injeksjon av emulsjonen i de venstre og høyre fotpoter hos 15 Lewis-rotter (hunner, 6 uker gamle) i en mengde på 0,25 ml pr. fotpote. Administreringen (immuniseringen) ble justert slik at doseringene av det preparerte homogenat var 200 mg pr. rotte. Denne immunisering induserer eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE).

De således immuniserte rotter ble delt i tre grupper på fem rotter i hver, og ethvert av de tre preparater (l)-(3) nedenfor ble injisert intravenøst i mus fra hver gruppe umiddelbart etter immunisering (dag 0) og 3, 6, 9 og 12 dager etter immuniseringen: (1) monoklonalt antistoff "JTT-2-antistoff" mot "rotte-JTT-l-antigen" preparert i eksempel 2 (dose: 2 mg/ml PBS, 5 mg/kg);

(2) Prednisolon, steroidmiddel (dose: 4 mg/ml PBS,

10 mg/kg); (3) kontrollantistoff som ikke er reaktivt overfor "rotte-JTT-l-antigen" (dose: 2 mg/ml PBS, 5 mg/kg).

Symptomer ble observert i tiden etter immuniseringen. Etter at inntreden av EAE var funnet, ble graden av symptom anslått ved å poengvurdere symptomet basert på de følgende kriterier.

(Poengvurdering 1): bortfall av muskelspenning i en hale (Poengvurdering 2): sleping av bakben og lett paralyse (Poengvurdering 3): sleping av bakben og alvorlig paralyse (Poengvurdering 4): paralyse av hele kroppen eller død.

Resultatene er vist i figur 16. I gruppen som ble administrert kontrollantistoff, nådde symptomet for EAE toppen

(maksimal poengvurdering) 11-15 dager etter immuniseringen og gikk deretter gradvis tilbake. I motsetning til dette var i gruppen som ble administrert "JTT-2-antistoff", symptomet for EAE 11 dager etter immuniseringen betydelig inhibert. Denne inhibitoriske effekt var betydelig høyere enn effekten i gruppen som ble administrert Prednisolon.

Disse resultater indikerer at "JTT-l-antigen" er et molekyl som virker ved induksjon av immunrespons, slik som lymfocyttaktiveringen indusert ved immunisering av fremmede antigener, og at reguleringen av funksjonen av "JTT-l-antigen" eller dets ligander kan inhibere symptomet på forskjellige autoimmunsykdommer.

Eksempel 15

Effekt av " JTT- 2- antistoff" på glomerulonefritt

For det samme formål som eksempel 14 ble det produsert glomerulusbasalmembran(GBM)nefrittmodellrotter, og effekten av det monoklonale antistoff på "JTT-l-antigen" i modellen ble analysert.

Etter at den bovine glomerulusbasalmembran (Shigei Medical Institute) spaltet med kollagenase var fortynnet med fysiologisk saltvann til 200 ug/ml, ble den fortynnede løsning blandet med Freunds komplette adjuvans for å preparere en emulsjon til anvendelse som immunogen. Immunisering ble utført ved intradermal injeksjon av emulsjonen i begge fotsåler hos 48 Wistar-Kyoto-rotter (ca. 200 g) under anestesi i en mengde på ca. 0,2 ml pr. fotsåle (dose: ca. 15 ug). Denne immunisering induserer glomerulusbasalmembran(GBM)nefritt.

De immuniserte rotter ble delt i 8 grupper på

6 rotter, og ethvert av preparatene (l)-(3) nedenfor ble injisert i rotter fra hver gruppe umiddelbart etter immunisering (dag 0) og tre ganger pr. uke i 5 påfølgende uker. (1) monoklonalt antistoff "JTT-2-antistoff" mot "rotte-JTT-l-antigen" preparert i eksempel 2 (dose: 3 mg/kg (2 ml PBS/kg), intravenøs injeksjon); (2) Prednisolon, steroidmiddel, som en positiv kontroll (suspendert i 0,5 % karboksymetylcellulose (CMC)) (dose: 3 mg/kg (5 ml/kg), oral administrering); (3) 0,5- % CMC som en negativ kontroll (dose: 5 ml/kg, oral administrering).

Etter administreringen av et testsubstrat ble steri-lisert vann (25 ml/kg) oralt administrert til hver rotte under tvang, og urin ble oppsamlet i 5 timer fra hver rotte som var blitt oppbevart i et metabolismebur uten tilførsel av mat og drikke. Etter at volumet av den oppsamlede urin var målt, ble proteinkonsentrasjonen i urinen målt ved anvendelse av Tonein TP-II (Otuka), og urinekskresjonen av protein pr. 5 timer ble beregnet (enhet: mg protein/5 timer). Den ovennevnte urin-oppsamling og urinproteinmåling ble utført på samme måte 1, 2, 3 og 4 uker etter immuniseringen (dag 0) .

Resultatene er vist i figur 17. Sammenlignet med kontrollgruppen var ekskresjonen av protein i urinen 3 uker etter immuniseringen betydelig redusert i gruppen administrert med "JTT-2-antistoff".

Disse resultater indikerer at "JTT-l-antigen" er et molekyl som induserer immunrespons, slik som lymfocyttaktiveringen indusert ved immunisering av fremmede antigener, og at reguleringen av funksjonen av "JTT-l-antigen" eller dets ligander kan inhibere symptomer på forskjellige autoimmunsykdommer .

Eksempel 16

Preparering av fusjonsproteinet mellom " JTT- l- antigen" og IgFc

Som nevnt i eksempler 8 og 13-15, antas "JTT-l-antigenet" ifølge foreliggende oppfinnelse å være et molekyl, slik som "CD28" og "CTLA-4", som er involvert i transmisjonen av kostimulerende signal involvert i regulering av aktiveringen av lymfocytter. Som nevnt i eksempel 14, har dessuten et fusjonsprotein (CTLA-4-IgFc), sammensatt av det ekstracellulære domenet av "CTLA-4" og Fc-området av humant immunglobulin IgGl, terapeutiske effekter på forskjellige autoimmunsykdommer. I dette eksempel ble et fusjonsprotein sammensatt av det ekstracellulære området av "JTT-l-antigen" og humant IgGFc preparert som følger for å undersøke hvorvidt oppløselig "JTT-l-antigen", slik som CTLA-4-IgFc, kunne anvendes for terapi av forskjellige autoimmunsykdommer.

(1) Preparering av fusjonsproteinet mellom " rotte- JTT- l-antigen" og humant IgGl- Fc ( rJTT- l- IgFc)

For å amplifisere cDNA som koder for det ekstracellulære området av "rotte-JTT-l-antigen" ved hjelp av PCR ble en 5"-primer med Xhol-restriksjonssetet (5'-CTGCTCGAGATGAAGCCCTA-CTTCTCG-3<1>, SEKV.ID. NR. 7) og en 3'-primer med BamHI-restrik-sj onssetet (5<1->ACCCTACGGGTAACGGATCCTTCAGCTGGCAA-3', SEKV.ID. NR. 8) ved deres terminaler utformet og syntetisert. Ved anvendelse av cDNA-klon "T132A7", oppnådd i eksempel 7, som koder for den fulle lengde av "rotte-JTT-l-antigen", som et templat ble PCR utført med primerne for å preparere cDNA som omfatter cDNA som koder for det ekstracellulære området av "rotte-JTT-l-antigen" med Xhol- og BamHI-restriksjonsseter ved begge ender. De således oppnådde PCR-produkter ble spaltet med Xhol og BamHI og separert ved agarosegelelektroforese for å isolere et ca. 450 bp-bånd som var forutsagt å være cDNA-fragmentet som koder for ønsket ekstracellulært område. Det isolerte cDNA-fragment ble subklonet i pBluescript II SK(+)

(Stratagene) spaltet med Xhol og BamHI. Sekvensanalyse med automatisert fluorescens-DNA-sekvenseringsapparat (Applied Biosystems) avslørte at cDNA-fragmentet omfatter området som koder for aminosyresekvensen som tilsvarer aminosyrerestene 1-141 av "rotte-JTT-l-antigen" (SEKV.ID. NR. 4).

På den annen side ble DNA som koder for Fc fra humant IgGl som fusjonspartner avspaltet som et ca. 1,3 kb BamHI-Xbal-DNA-fragment ved spalting av plasmidet (se Cell, vol. 61, s. 1303-1313 (1990)), fremstilt av B. Seed et al. (Massa-chusetts General Hospital)) med BamHI og Xbal. Dette fragment omfatter exoner som koder for humant IgGl-hengselområdet, Cy^ og Cy^.

Xhol-BamHI-fragmentet som koder for det ekstracellulære området av "rotte-JTT-l-antigen", og BamHI-Xbal-fragmentet som omfatter exoner som koder for Fc av humant IgGl ("IgFc"), begge fremstilt som nevnt ovenfor, ble subklonet i pBluescript II SK(+) (Stratagene) spaltet med Xhol og BamHI.

Plasmidet ble deretter spaltet med Xhol og Xbal, og et ca. 1,8 kb DNA-fragment, omfattende fusjons-DNA som omfatter det ekstracellulære området av "rotte-JTT-l-antigen" og humant IgFc, ble avspaltet. Dette fusjons-DNA-fragment ble innføyd i Xhol- og Xbal-setene av ekspresjonsvektoren pME18S (Medical Immunology, vol. 20, nr. 1, s. 27-32 (1990); Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Handbook of Genetic Engineering", Yodosha, s. 101-107 (1992)) med T4-DNA-ligase for å konstruere plasmid prJTT-l-IgFc.

HEK293-celler (ATCC CRL1573), dyrket subkonfluent som et monolag i DMEM-medium inneholdende 10 % kalvefosterserum og ampicillin, ble transformert med prJTT-l-IgFc ved elektroporering for å danne transformanter.

Transformantene ble dyrket i serumfritt ASF104-medium i 72 timer for å uttrykke rJTT-l-IgFc.

Ved anvendelse av en protein G-Sepharose-affinitetskolonne (Pharmacia) ble rJTT-l-IgFc renset som følger.

Supernatantene oppnådd ved sentrifugering av kultur-mediet nevnt ovenfor ble applisert på en protein G-Sepharose-affinitetskolonne som tidligere var ekvilibrert med bindingsbuffer. Etter at kolonnen var vasket med bindingsbuffer, ble elueringen utført med elueringsbuffer. Eluatet ble oppsamlet og dialysert mot fosfatbuffer under utskifting av den eksterne løsning to ganger eller mer for å oppnå rent rJTT-l-IgFc.

Resultatet av affinitetskromatografien er vist i figur 18, og resultatet av SDS-PAGE av det således oppnådde rene rJTT-l-IgFc er vist i figur 19.

(2) Preparering av fusjonsproteinet mellom " humant JTT- l-antigen" og humant IgGl- Fc ( hJTT- l- IgFc)

hJTT-l-IgFc ble preparert som nevnt ovenfor under (1), med unntak av at cDNA ble anvendt som templater og primere for PCR. I denne testen ble klonen "pBSh41", som omfatter cDNA som koder for det fullengdede "humant JTT-l-antigen" fremstilt i eksempel 8, anvendt som et templat, og

5'-TAACTGTTTCTCGAGAACATGAAGTCAGGC-3' (SEKV.ID. NR. 9) og 5'-ATCCTATGGGTAACGGATCCTTCAGCTGGC-3' (SEKV.ID. NR. 10) ble

anvendt som primere.

Resultatet av affinitetskromatografien er vist i figur 20, og resultatet av SDS-PAGE av det således oppnådde rene hJTT-l-IgFc er vist i figur 21.

Eksempel 17

Frembringelse av en transgen mus der cDNA som koder for " rotte- JTT- l- antigen" er blitt integrert

cDNA som koder for den fulle lengde av "rotte-JTT-l-antigen", oppnådd i eksempel 7, ble innføyd i ekspresjonsvektoren pCAGGS (Gene, vol. 108, s. 193-200 (1991)) som inneholder kylling-P-aktinpromotor, ved anvendelse av DNA Blunting Kit (Takara) for å oppnå plasmid prJTT-1. For å danne en transgen mus ble prJTT-1 linearisert ved restriksjonsenzymbehandling.

En ICR-hunnmus med en vaginalpropp, oppnådd ved å pare en hvit ICR-mus (Nihon LSC) med en vasoligert hvit ICR-hannmus (Nihon LSC), ble anvendt som en fostermormus. En mus for å oppnå befruktede egg for å innføre "rotte-JTT-1-antigen" -gen i disse ble preparert ved å pare en BDF-l-hunnmus (Nihon LSC) som var blitt gjort superovulerende ved å admini-strere PEAMEX (5 enheter, Sankyo Zoki) og Pregnil (5 enheter, Organon) med en BDF-l-hannmus (Nihon LSC). Etter paring ble egglederen fjernet fra BDF-l-hunnmusen, og kun befruktede egg ble innsamlet ved behandling med hyaluronidase og lagret i et medium.

"Rotte-JTT-l-antigen"-genet ble innført i det befruktede egg under mikroskopi ved anvendelse av en manipulator i overensstemmelse med den vanlige metoden. De befruktede egg ble fiksert med en festenål. En oppløsning inneholdende det ovennevnte lineariserte gen som koder for "rotte-JTT-l-antigen", som var fortynnet med tris-EDTA-buffer, ble mikroinjisert i den mannlige pronukleus i de befruktede egg med en DNA-innføringsnål ved 37 °C.

Etter geninnføring ble kun befruktede egg i normal tilstand utvalgt, og deretter ble de således utvalgte befruktede egg hvori "rotte-JTT-l-antigen"-genene var innført, inn-satt i ovariefimbria i ovariet hos en fostermormus (hvit ICR-mus) .

Halen til et museavkom (stammus) født av fostermormusen, ble oppskåret, og det genomiske gen ble oppsamlet fra denne. Det ble bekreftet ved PCR at "rotte-JTT-l-antigen"-genet var integrert i musegenomet. Heterozygote, transgene mus med høy ekspresjon av "rotte-JTT-l-antigen" ble deretter preparert ved å pare denne stammus med en normal mus. Homo-zygote, transgene mus kan prepareres ved å pare de heterozygote mus med hverandre.

Den mikroinjiserte konstruksjon som omfatter "rotte-JTT-l-antigen" -genet , er vist skjematisk i figur 22.

Eksempel 18

Frembringelse av en knockout- mus, hvis endogen som koder for " muse- JTT- l- antigen" er blitt inaktivert

(1) Konstruksjon av en målrettingsvektor

En målrettingsvektor for inaktivering ("knocking out") av det endogene gen som koder for "muse-JTT-l-antigen" gjennom homolog rekombinasjon (Nikkei Science, s. 52-62, mai 1994), ble preparert som følger.

Pstl-Hindlll-fragmentet ("homo1ogt DNA (1)"), oppnådd ved spalting av den musegenomiske DNA-klon som omfatter området som koder for "muse-JTT-l-antigen", klonet i eksempel 9-5 med Pstl og Hindlll, ble subklonet i pGEM-3 (Promega). pGEM-3 ble deretter linearisert med Xhol, og neomycinresistensgen ("neo"), utskåret fra pMCl-neo-polyA (Stratagene) ved behandling med Xhol og Sali, ble innføyd oppstrøms for det "homologe DNA" (1) og deretter ligert. Den ovennevnte musegenomiske DNA-klon ble spaltet med Xhol og Noti for å avspalte et ca.

5,5 kb-gen ("homologt DNA (2)") lokalisert oppstrøms for det ovennevnte "homologe DNA (1)". Det ovennevnte pGEM-3 hvori "neo-homologt DNA (1)" var blitt innføyd, ble separat spaltet med Xhol og Hindlll for å avspalte "neo-homologt DNA (1)". De således oppnådde "homologe DNA (2)" og "neo-homologe DNA (1)" ble subklonet i pSEAP2-C0NT (Clontech) linearisert med Noti og Hindlll.

Etter at det oppnådde plasmid hvori "homologt (2)-neo-homologt (1)" var blitt innføyd, var spaltet og linearisert nedstrøms for "homologt DNA (1)" med Nrul, ble tymidinkinasegen ("TK") oppnådd ved spalting av pMCl-TK (Stratagene) med PvuII innføyd nedstrøms for "homologt DNA (1)" for å oppnå en målrettingsvektor hvori "homologt DNA (2)-neo-homologt (1)" var innføyd.

(2) Innføring av målrettingsvektoren i ES- celler

Museembryostamceller (Nature, vol. 362, s. 255-258

(1993); Nature, vol. 326, s. 292-295 (1987)), dyrket i DMEM-medium inneholdende 15 % kalvefosterserum, ble behandlet med trypsin for å danne enkeltceller, og cellene ble vasket tre ganger, etterfulgt av tilsetning av fosfatbuffer for å justere til 1 x IO<7> celler/ml. Målrettingsvektoren nevnt ovenfor (25 ug pr. 1 ml av cellesuspensjonen) ble tilsatt til cellesuspensjonen, og en elektrisk puls på 350 V/cm (25 uF) ble gitt én gang. 1 x 10<7> ES-celler ble deretter utspredt på en 10 cm skål og dyrket i vedlikeholdsmedium i én dag, og mediet ble utskiftet med seleksjonsmedium (inneholdende 250 ug/ml G418 og 2 uM ganciclovir). Cellene ble dyrket under utskifting av mediet annenhver dag. 10 dager etter innføring av målrettingsvektoren ble 573 neomycinresistente ES-cellekloner isolert under et mikroskop med en mikropipette. Hver av de således oppnådde ES-cellekloner ble dyrket uavhengig av hverandre på en 24-brønners plate belagt med Feeder-celler for å oppnå

768 neomycinresistente ES-cellekopier.

(3) Screening av knockout- ES- celler

Det ble bekreftet ved PCR hvorvidt det endogene gen som koder for "muse-JTT-l-antigen", var nedbrutt ("knocked out") gjennom homolog rekombinasjon i hver av de neomycinresistente ES-celler.

For PCR ble det anvendt (1) primere utformet og syntetisert basert på sekvensen av det ovennevnte neomycinresistensgen ("neo") (5'-CGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGC-3', SEKV.ID. NR. 11), og (2) primere utformet og syntetisert basert på sekvensen av det ovennevnte "homologe DNA (1)" (5<1->

CATTCAAGTTTCAGGGAACTAGTCCATGCGTTTC-3<1>, SEKV.ID. NR. 12).

Hvert genomisk DNA ble ekstrahert fra alle de neomycinresistente ES-celler, og PCR ble utført ved anvendelse av primerne med det genomiske DNA som et templat. PCR ble utført ved en reaksjonssyklus ved 94 °C i 3 minutter, 30 reaksjons-sykluser ved 94 °C i 1 minutt, ved 60 °C i 1 minutt og ved 72 °C i 3,5 minutter, og én reaksjonssyklus ved 72 °C i

10 minutter, og de resulterende produkter ble lagret ved 4 °C. Når et fragment med størrelse mindre enn ca. 4 kb ble amplifisert ved hjelp av denne PCR, kunne det bedømmes at det ekso-gene gen som koder for "muse-JTT-l-antigen", var ødelagt ("knocked out") gjennom homolog rekombinasjon i ES-celle-klonen.

Et ønsket PCR-produkt ble oppnådd fra tre av de

768 testede ES-cellekloner. Genomiske Southern-blottinger ble utført for disse tre kloner for ytterligere screening og bekreftelse. Etter at genomisk DNA ble ekstrahert fra de tre kloner og spaltet med restriksjonsenzymet BamHI, ble de spaltede produkter underkastet agarosegelelektroforese. De resulterende DNA ble overført til en nylonmembran, og hybridisering ble utført med en probe preparert fra den genomiske DNA-sekvens omfattende "muse-JTT-1". Proben ble utformet basert på sekvensen utenfor setet hvor homolog rekombinasjon forekom, hvilket muliggjør å skjelne genom av mutant type fra gen av normal type med hensyn til størrelse.

Som et resultat ble det observert to bånd som tilsvarer mutant type og normal type i én av de tre kloner. Denne ES-celleklon ble anvendt for frembringelse av en knockout-mus beskrevet nedenfor.

(4) Frembringelse av en knockout- mus

De ovenfor oppnådde ES-celler (15 ES-celler pr. blastocyst), hvis endogene gen som koder for "muse-JTT-l-antigen" er blitt inaktivert ("knocked out") gjennom homolog rekombinasjon, ble også mikroinjisert i blastocyster som ble oppnådd ved å pare en C57BL6-hunnmus (Nihon, Charles River) med en hannmus. Umiddelbart etter mikroinjeksjonen ble blasto-cystene (ca. 10 blastocyster pr. side av uterus) transplantert i uterus til en fostermor-ICR-mus (CLEA Japan) som var en 2,5 dager gammel mus fra pseudograviditetsbehandling. Som et resultat ble det totalt oppnådd 38 museavkom, og 18 av disse var ønskede kimære mus. Elleve av de kimære mus var de kimære mus der bidraget til hårfarge var 80 % eller høyere.

De således oppnådde kimære mus ble deretter paret med normale C57BL6-mus for å oppnå aguti-mus, hvis farge er avledet fra hårfargegenet i ES-cellene.

Eksempel 19

Preparering av et farmasøytisk preparat som omfatter antistoff

Hvert av de monoklonale antistoffer (15-150 ug/ml), "JTT-l-antistoff" og "JTT-2-antistoff" mot "rotte-JTT-l-antigen", fremstilt i eksempel 1, og monoklonale antistoffer "SA12" og "SG430" mot "humant JTT-l-antigen", fremstilt i eksempel 12, ble tilsatt til injiserbart, destillert vann (10 ml) for å preparere en injeksjonsløsning.

Industriell anvendelighet

Nye celleoverflatemolekyler (betegnet "JTT-l-antigen") ifølge foreliggende oppfinnelse, avledet fra pattedyr som mennesker, mus og rotter, er kjennetegnet som følger. (1) "JTT-l-antigen" hadde de følgende likheter med "CD28", et celleoverflatemolekyl på lymfocytter, slik som T-celler, som overfører kostimulerende signal som er viktig for T-celleaktivering gjennom celleadhesjon, og "CTLA-4", et celleoverflatemolekyl på lymfocytter, slik som T-celler, som regulerer funksjonen av aktiverte lymfocytter, slik som aktiverte T-celler, under samvirkning med signalet. (1) 20 eller flere aminosyrerester, inkludert cysteinrester, er høyt konservert; (ii) prolingjentakelsessekvens, "Pro-Pro-Pro (PPP)", som er essensiell som ligandbindingsområdet, er konservert i det ekstracellulære området; (iii) "Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM)" (Xaa og x representerer en hvilken som helst aminosyre), en sekvens som er essensiell som signaloverføringsområdet, er konservert i det cytoplasmatiske området; og (iv) beliggenheten av genet som koder for "muse-JTT-l-antigen" på musekromosom, er "1C3", slik som "CD28" og "CTLA-4". (2) "JTT-l-antigen" kan formidle celleadhesjon av tymocytter, lymfoblaster stimulert med mitogen, slik som ConA, tymomer, slik som "CD28" og "CTLA-4", som formidler celleadhesjon. (3) "JTT-l-antigen" er sterkt uttrykt, i det minste i tymocytter, lymfoblastceller stimulert med mitogen, slik som

ConA (aktiverte T-lymfoblastceller og aktiverte B-lymfoblastceller etc.), perifere blodlymfocytter og tymomer. (4) Antistoffet mot "JTT-l-antigen" prolifererer signifikant humane perifere blodlymfocytter, og proliferasjonen blir mer økt i nærvær av et monoklonalt antistoff mot CD3, som utgjør TcR/CD3-kompleks på T-celler som mottar det primære signal som er essensielt for T-celleaktivering fra antigenpresenterende celler. (5) Administreringen av antistoffet mot "JTT-l-antigen" inhiberer signifikant symptomet på eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE). (6) Administreringen av antistoffet mot "JTT-l-antigen" til en modellrotte for glomerulus-basalmembran(GBM)-nefritt inhiberer signifikant symptomet på denne sykdom.

"JTT-l-antigen" ifølge foreliggende oppfinnelse antas, slik som "CD28" og "CTLA-4", å være et molekyl som overfører det sekundære signal (kostimulerende signal) som er essensielt for aktivering av lymfocytter, slik som T-celler, og regulerer funksjonen av aktiverte lymfocytter, slik som aktiverte T-celler, som samarbeider med signalet.

Polypeptider som utgjør slike celleoverflatemolekyler, deres polypeptidfragmenter og fusjonspolypeptider fra disse og antistoffer mot disse ifølge foreliggende oppfinnelse, kan derfor tilveiebringe ytterst anvendelige farmasøytiske midler for terapi eller forebyggelse av forskjellige autoimmunsykdommer, allergiske sykdommer eller inflammatoriske sykdommer, spesielt reumatoid artritt, multippel sklerose, autoimmun tyreoiditt, allergisk kontaktdermatitt, kronisk inflammatorisk dermatose, slik som lichen planus, systemisk lupus erythematosus, insulinavhengig diabetes mellitus og psoriasis, forårsaket av aktivering av lymfocytter, slik som T-celler, og abnormaliteten for regulering av aktiverte lymfocyttfunksj oner.

Genene som koder for polypeptider eller polypeptidfragmenter ifølge foreliggende oppfinnelse, kan likeledes anvendes, ikke kun ved genterapi av forskjellige sykdommer som nevnt ovenfor, men også ved fremstilling av antisense-farma-søytiske midler.

Blant antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse har humane, monoklonale antistoffer og deres farmasøytiske preparater dramatisk økt farmasøytisk verdi som antistoff-legemidler fordi de ikke har noen antigene effekter overfor mennesker, hvilket har vært et alvorlig problem (bivirkning) ved antistoff-farmasøytika som inneholder ikke-humane, patte-dyravledete antistoffer, slik som museavledete antistoffer.

Genene (DNA), polypeptidene, polypeptidfragmentene og antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke kun anvendelige som farmasøytiske midler, men også som reagenser for søk etter molekyler (ligander) som reagerer med celleoverf latemolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse, klargjør funksjonen av liganden og utvikler legemidler rettet mot ligandene.

Den transgene mus ifølge foreliggende oppfinnelse er dessuten ytterst anvendelig, ikke kun som et modelldyr for å studere fysiologisk funksjon av "JTT-l-antigen", som er et celleoverflatemolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse, men også som et verktøy for screening av forskjellige legemidler (lavmolekylære forbindelser, antistoffer, antisensestoffer, polypeptider etc.) med aktivitet som regulerer (inhibering, undertrykkelse, aktivering, stimulering etc.) funksjonen av "JTT-l-antigen". Slike teststoffer kan spesielt administreres til den transgene mus for å måle og analysere forskjellige fysiologiske, biologiske eller farmakologiske parametere dannet i musen, for derved å vurdere aktiviteten av de administrerte testforbindelser.

Knockout-musen ifølge foreliggende oppfinnelse kan dessuten klargjøre funksjonen av celleoverflatemolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse ved å analysere musens karakteristiske egenskaper fra forskjellige synspunkter (fysiologiske, biologiske, farmakologiske, patologiske og genetiske synspunkter).

Claims

1. Polypeptid, karakterisert ved at det utgjør et celleoverflatemolekyl utvalgt fra gruppen bestående av: (1) et polypeptid som omfatter amminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 2, (2) polypeptid som omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 2, hvori én til ti aminosyrer er substituert, deletert eller tilføyd med de følgende karakteristika: (a) celleoverflatemolekylet blir i det minste uttrykt i tymocytter og mitogenstimulerte lymfoblastceller; (b) et antistoff som reagererer med celleoverf latemolekylet, induserer adhesjon mellom mitogenstimulerte lymfoblastceller; (c) et antistoff som reagerer med celleoverf latemolekylet , induserer proliferasjon av perifere blodlymfocytter i nærvær av et antistoff mot CD3; (d) celleoverflatemolekylet har en partiell aminosyresekvens representert ved Phe-Asp-Pro-Pro-Pro-Phe i dets ekstracellulære område; og (e) celleoverflatemolekylet har en partiell aminosyresekvens representert ved Tyr-Met-Phe-Met i dets cytoplasmatiske område.

2. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at celleoverflatemolekylet er avledet fra et menneske.

3 . Polypeptidfragment, karakterisert ved at det omfatter det ekstracellulære området av polypeptidet ifølge krav 1 eller 2, hvori det ekstracellulære området tilsvarer aminosyrerestene 1 til 141 i SEKV.ID. NR. 4.

4. Polypeptidfragmentet ifølge krav 3, karakterisert ved at det er et humanavledet polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 2.

5. Gen, karakterisert ved at det koder for polypeptidet ifølge krav 1 eller 2 eller polypeptidfragmentet ifølge krav 3 eller 4.

6. Gen ifølge krav 5, karakterisert ved at det er et cDNA.

7. Gen ifølge krav 6, karakterisert ved at cDNAet har nukleotidsekvensen som angitt i SEKV. ID. NR. 1.

8. Gen ifølge krav 6, karakterisert ved at cDNA omfatter en nukleotidsekvens som tilsvarer nukleotidrester 26-625 av SEKV.ID. NR. 3.

9. Vektor, karakterisert ved at den omfatter genet ifølge ethvert av kravene 5-8.

10 . Trans formant, karakterisert ved at vektoren ifølge krav 9 er innføyd i denne.

11. Transformant ifølge krav 10, karakterisert ved at den er identifisert ved en internasjonal deponering med aksesjonsnummer FERM BP-5725.

12 . Fusj onspolypept id, karakterisert ved at det omfatter det ekstracellulære området av polypeptidet ifølge krav 1 eller 2, og et konstant område av en humanimmunglobulin(lg)-tung-kjede, eller en del av det konstante området.

13. Fusjonspolypeptid ifølge krav 12, karakterisert ved at immunglobulinet er IgG.

14. Fusjonspolypeptid ifølge krav 12, karakterisert ved at delen av det konstante området omfatter et hengselområde, C2-domene og C3-domene av IgG.

15. Fusjonspolypeptid ifølge ethvert av kravene 12-14, karakterisert ved at det er et humanavledet polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 2.

16. Homodimert molekyl som omfatter to polypeptidfragmenter ifølge krav 3, eller to fusjonspolypeptider ifølge ethvert av kravene 12-15, karakterisert ved at de to polypeptidfragmentene eller de to fusjonspolypeptidene er broforbundet med hverandre gjennom disulfidbindinger.

17. Homodimert molekyl ifølge krav 16, karakterisert ved at polypeptidet er et humanavledet polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 2.

18. Homodimert molekyl ifølge krav 16, karakterisert ved at det omfatter to fusjonspolypeptider ifølge krav 15.

19. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det enten omfatter polypeptidfragmentet ifølge krav 4 eller det homodimere molekyl ifølge krav 17, eller begge, eller fusjonspolypeptidet ifølge krav 15, eller homodimermolekylet ifølge krav 18, eller begge, og en farmasøytisk akseptabel bærer.

20. Farmasøytisk preparat ifølge krav 19, karakterisert ved at det omfatter enten fusjonspolypeptidet ifølge krav 15, eller homodimermolekylet ifølge krav 18, eller begge, som anvendes for behandling av autoimmunsykdommer eller allergiske sykdommer, eller for forebyggelse av symptomer på disse sykdommer.

21. Antistoff, eller en del av dette, karakterisert ved at det reagerer med polypeptidet ifølge krav 1 eller 2, polypeptidfragmentet ifølge krav 3 eller 4, eller celleoverflatemolekylet som omfatter polypeptidet.

22. Antistoff ifølge krav 21, eller en del av dette, karakterisert ved at det er et monoklonalt antistoff.

23. Antistoff, eller en del av dette ifølge krav 22, karakterisert ved at det reagerer med polypeptidet med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR. 2, polypeptidfragmentet ifølge krav 4, eller det humanavledete celleoverflatemolekyl som omfatter polypeptidet.

24. Antistoff, eller en del av dette ifølge krav 22, karakterisert ved at det reagerer med polypeptidet ifølge krav 1 eller 2, eller celleoverflatemolekylet som omfatter polypeptidet, og hvori effekten av det monoklonale antistoff på mitogenstimulerte lymfoblastceller er vesentlig den samme som effekten av et monoklonalt antistoff produsert av en hybridom identifisert ved en internasjonal deponering med aksesjonsnummer FERM BP-5707, på mitogenstimulerte rottelymfoblastceller.

25. Antistoff, eller en del av dette ifølge krav 22, karakterisert ved at det reagerer med polypeptidet ifølge krav 1 eller 2, eller celleoverflatemolekylet som omfatter polypeptidet, og hvori effekten av det monoklonale antistoff på mitogenstimulerte lymfoblastceller er vesentlig den samme som effekten av et monoklonalt antistoff produsert av en hybridom identifisert ved en internasjonal deponering med aksesjonsnummer FERM BP-5708, på mitogenstimulerte rottelymfoblastceller.

26. Antistoff ifølge krav 22, karakterisert ved at det er et humant eller humanisert antistoff som reagerer med et polypeptid omfattende aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR.: 2.

27. Hybridom, karakterisert ved at det produserer det monoklonale antistoff ifølge ethvert av kravene 22-25.

28. Transgen mus, hvori genet som koder for polypeptidet ifølge krav 1 er integrert i dens endogene gen, karakterisert ved at genet er et humanavledet gen som omfatter nukleotidsekvensen ifølge SEKV.ID. NR. 1.

29. Knockout-mus, karakterisert ved at dens endogene gen som koder for musepolypeptidet ifølge krav 1, er inaktivert slik at polypeptidet ikke produseres.