KR100349388B1 - 세포간 접착 및 시그널 전달을 매개하는 세포표면분자 - Google Patents

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Abstract

자기면역질환이나 알레르기질환 등에 있어서 중요한 기능을 하는 임파구계세포의 세포표면분자에 대한 모노클로날항체중에서, 흉선세포, ConA 자극활성화 임파구 및 말초혈 임파구에 특이적으로 발현하고, 또한 그 세포의 세포간접착을 유도하는 모노클로날항체를 표제, 그 모노클로날항체가 인식하는 신규 세포표면분자를 단리, 동정함과 동시에, 그 분자의 기능을 해석했다. 또한 그 분자에 대한 항체가, 자기면역질환이나 알레르기질환의 증상을 유의할 정도로 억제하는 것을 발견하였다.

Description

세포간 접착 및 시그널 전달을 매개하는 세포표면분자 {Cell surface molecule mediating cell adhesion and signal transmission}
포유동물의 생체는, 체내에 침입한 병원 미생물(virus, 세균, 기생충 등)이나 외래 이물질 등(이하, 합하여 "항원"이라고 칭함.)을 배제하고자 하는 면역 응답시스템을 가진다. 그 하나는 자연면역 응답시스템으로 불리고, 다른 하나는 획득면역 응답시스템(immune response system)이라고 불리는 것이다. 전자는 식세포(다형핵 백혈구, 단핵구(monocytes), 마크로파아지 등)에 의한 식작용, 내츄럴킬러(natural killer; NK) 세포에 의한 공격, 및 보체에 의한 항원의옵소닌(opsonin)화 등과 같은 비특이적인 인식에 의한 배제기구이다. 후자의 획득면역 응답시스템은 그 항원에 대한 특이성을 획득(활성화)한 임파구(주로 T세포, B세포)에 의한 배제기구이다. 항원특이성을 획득한 B세포는, 그 항원에 특이적인 항체를 생성함에 의해 세포 밖에 존재하는 그 항원을 공격한다. 항원특이성을 획득(활성화)한 T세포는, 헬퍼(helper) T세포와 세포 독성 T세포(cytotoxic T cell; cytotoxic lymphocyte; CTL)로 분류되고, 전자는 B세포의 분화나 항체의 생성을 조절함과 동시에 식세포와 협동하여 그 항원을 파괴한다. 후자는 스스로 바이러스 감염세포 등을 공격하는(실험의학(별책)·"Bio Science 용어 라이브러리[면역]", 요도사, p.14-17, 1995).
이 T세포에 의한 항원특이성의 획득(활성화)은 T세포가, 마크로파아지, B세포 또는 수상 세포(dendritic cell) 등의 항원제시세포(antigen-presenting cells: APC)에 의해 제시되는 항원을 인식함에 의해 개시된다. 항원제시세포는 입력한 항원을 프로세싱(가공)하고, 이 가공된 항원을 주요조직적 합성항원복합체(MHC)에 결합시켜 항원을 제시한다. T세포는 항원제시세포에 의해 제시된 그 가공항원을, 그 세포막 표면에 가지는 T세포수용체(TcR)과 CD3 항원과의 복합체(TcR/CD3 복합체)를 통하여 인식하는 것으로 세포의 활성화(특이성의 획득)를 위한 제1의 시그널을 받는다.
그렇지만 이 TcR/CD3 복합체를 통한 제1시그널만으로는, T세포가 충분한 활성화가 발생하지 않을 뿐만 아니라, 그 후에 받는 어떠한 자극에 대해서도 반응하지 않게 되는 불응답 상태(unresponsiveness) 또는 클론 마비(clonal anergy)로 불리는 상태로 빠진다. T세포가 활성화되어 항원특이적인 T세포 클론에 분화, 증식하기 위해서는 인터루킨-2(IL-2)의 자기분비(오토크린; autocrine)가 필요하지만, 클론 마비의 상태에서는 IL-2가 생성 및 세포분열이 발생하지 않고, T세포가 불활성화된 상태로 된다. 즉 IL-2 등의 사이토카인(cytokine)의 생성을 수반하는 T세포의 활성화에는, TcR/CD3 복합체를 통한 제1시그널에 잇따르는 제2의 시그널을 필요로 한다. 이 제2의 시그널은 코스티뮬러토리-시그널(부자극시그널; costimulatory signal)로 불린다.
T세포는, T세포 표면상의 TcR/CD3 복합체와는 별도의 분자를 통해 항원제시 세포상의 MHC와는 별도의 분자와 상호작용(세포간 접착)에 의해 이 제2의 시그널을 받아 세포내에 전달한다. 이 제2의 시그널에 의해 세포의 아네르기(anergy; 클론마비)가 회피됨과 동시에 세포가 활성화된다.
항원제시세포와 T세포 등의 임파구의 사이의 제2의 시그널의 전달 메커니즘에 있어서는 아직 상세하게 해명되어 있지 않은 부분이 있지만, 지금까지의 연구로부터 이 제2의 시그널전달에는 주로 T세포 및 흉선 세포에서 발현되는 세포표면분자인 CD28(별명: Tp44, T44, 또는 9.3항원)로 항원제시세포(마크로파아지, 단핵구, 수상 세포 등)로 발현되는 세포표면분자 인 CD80(별명: B7-1, B7, BB1, 또는 B7/BB1) 및 마찬가지로 항원제시세포 형상의 세포표면분자인 CD86(별명: B7-2 또는 B70)과의 사이의 상호작용(즉, 이들 분자 사이의 결합을 통한 세포간 접착)이 매우 중요하다는 것이 밝혀져 있다. 또한 이 제2의 시그널에 의한 T세포의 활성화의 제어에는 그 제2의 시그널에 의존하여 그 발현이 증강된다고 생각되고 있는 CTLA-4(Cytolytic T lymphocyte associated antigen 4)로 그 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)과의 사이의 상호작용(즉, 이들 분자 사이의 결합을 통한 세포간 접착 )도 중요한 역할을 하고 있다는 것이 실험적으로 분명하게 밝혀지고 있다. 즉 이 제2의 시그널의 전달에 의한 T세포의 활성화의 제어에는 적어도 CD28과 CD80/CD86의 사이의 상호작용, 그 상호작용에 의존한다고 생각되는 CTLA-4의 발현의 증강, 및 CTLA-4와 CD80/CD86과의 사이의 상호작용이 포함되는 것이 분명히 밝혀지고 있다.
CD28은 이 T세포의 활성화와 아네르기의 회피에 필요한 제2의 시그널(코스티뮬러토리·시그널)을 전달하는 코스티뮬레이터 분자 인 것이 분명하게 밝혀져 있다. 이 분자가 항원제시세포상의 코스티뮬레이터 분자인 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)와 결합하는 것(바꾸어 말하면, 이들 분자 사이의 결합을 통한 세포간 접착)에 의해 전달되는 제2의 시그널은, Th1형 사이토카인의 mRNA를 안정화시켜, 그 결과 T세포부터의 IL-2, IFNγ 및 TNFα 등의 Th1형 사이토카인을 대량 생성을 촉진한다. 한편 CTLA-4는 TcR/CD3을 통하여 들어가는 제1시그널에 의해 발현이 유도됨과 동시에, CD28과 CD80의 결합에 의해 들어가는 그 제2의 시그널에 의해서도 그 발현이 증강되는 것이 알려지고 있다. CTLA-4는 이들 시그널을 받아, CD28에 의해 들어가는 제2의 시그널에 의한 T세포의 활성화와는 반대로 T세포 기능에 대하여 억제적으로 작용하는 것이 밝혀지고 있다.
인간의 CD28 및 CTLA-4는 각각 44 kD 및 41 내지 43 kD의 분자량을 가지는 I형 당단백질이다. 모두 면역글로블린 모양의 도메인 1개를 가지고, 면역글로블린 슈퍼패밀리에 속하며, 세포간 접착 분자로서의 기능과 세포내로의 시그널 전달분자로서의 양쪽 기능을 함께 가진 분자이다.
인간 CD28은 디술피드결합에 의해 호모 다이머를 형성하며, 한편 CTLA-4는 모노머로 존재하는 것이 표시되어 있다. CD28 및 CTLA-4의 유전자의 염색체상에 위치는, 인간에 있어서는 어느 것이나 "2q33", 또한 마우스에 있어서는 "1C"이며, 어느 것도 4개의 엑손으로 된다. 인간의 CD28 및 CTLA-4는 리더서열을 포함하여 각각 220 및 223개의 아미노산으로부터 구성되고, 양자의 아미노산 상동성은 20 내지 30% 정도이다.
CD28 및 CTLA-4의 리간드는, 인간 및 마우스에 있어서 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)인 것이 해명되어 있다. CTLA-4는 어느 리간드에 대하여도 CD28보다 친화성이 높고, 그 차이는 약 20배이다. CD28 및 CTLA-4의 CD80(B7-1)로의 결합에는, 동물종을 넘어 보존되어 있는 아미노산 서열구조인 "MYPPPY(Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr)"가 중요하다는 것이 밝혀져 있다. 또한 CD28이 자극을 받으면, 그 세포내의 부분서열 "YMNM(Tyr-Met-Asn-Met)" 안의 인산화된 티로신잔기에 PI3 키나제(phosphoinositide 3 kinase, PI3K)가 회합하는 것이 나타나고, CD28은 이 "YxxM" 구조를 통해 세포내 시그널 전달에 있어서 중요한 기능을 하고 있는 것이 나타내어지고 있다. 또한 CTLA4의 세포내 영역에도 "YxxM"으로 나타내어지는 서열, 즉 "YVKM(Tyr-Val-Lys-Met)"을 가지고 있고, 자극을 받은 후 이 서열에 SYP 가 회합하는 것이 나타나 있다.
CD28은 흉선세포 및 말초혈 T세포에 국한하여 발현되고, 한편 CTLA-4는 활성화 T세포에 특이적으로 발현하는 것이 알려져 있다(세포공학·별책 "접착분자핸드북", 슈준사 발행, 제93-102페이지, 1994년; 동지, 제120-136페이지; 실험의학·별책 "BIO SCIENCE 용어 라이브러리·면역", 요도사 발행, 제94-98페이지, 1995년; 실험의학·별책 "BIO SCIENCE 용어 라이브러리·세포내 시그널전달", 요도사 발행, 제58-59페이지, 1997년; 일본임상, 제55권, 제6호, 제215-220페이지, 1997년).
이와 같이 하여 T세포기능의 제어(T세포의 활성화 및 기능억제)에 있어서 코스티뮬러가터 분자(CD28, CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2) 등) 및 운동하는 CTLA-4 등의 복수 분자 사이의 상호작용(바꾸어 말하면, 이들 분자 사이의 결합을 통한 세포간 접착)의 중요성이 제창되게 되고, 이들 분자와 질환과의 관계 해명, 및 이들 분자의 기능을 제어함에 의한 질환 치료의 시도가 주목받게 되고 있다.
전술한 바와 같이, 생체는 생체(자기)에 있어서 이물질인 항원에 대해서는 획득면역 응답 시스템을 작동시키지만, 자기의 생체성분(자기항원)에 대해서는 면역응답을 나타내지 않는 면역 관용을 가지고 있다. 그렇지만 어떠한 원인으로 면역관용의 파탄이 발생하면, 자기항원에 대한 면역응답이 발생하여 전술과 같은 메커니즘에 의해 자기항원 반응성 T세포가 유도되어 면역이상상태로 빠지므로 여러 가지 자기면역질환이 야기된다.
즉 생체의 면역 시스템이 정상적인 상태에서는 정상조직의 무자극의 항원제시세포(antigen presenting cell; APC)은 코스티뮬러토리 분자를 발현하지 않으므로, 예를 들어 자기항원에 반응하는 자기항원 반응성 T세포가 존재하고 있더라도 T세포가 불응답 상태로 빠져 있기 때문에 자기관용이 유지되고 있지만, 면역이상상태에 있어서는 과잉 또는 계속적인 코스티뮬러토리 분자의 발현이상으로 자기항원반응성 T세포가 활성화되어 자기면역질환이 야기된다고 하는 가능성이 제시되고 있다.
이러한 관점에서 최근, 코스티뮬러토리 시그널 전달, 예를 들어 전술한 CD28/CTLA-4-CD80/CD86 사이의 시그널전달을 조절함으로써 여러 가지 자기면역성 질환의 치료의 시도가 다수 이루어지고 있다.
자기면역성 질환인 만성 관절 류마티즘, 다발성 경화증, 자기면역성 갑상선염, 알레르기성 접촉성 피부염, 만성 염증성 피부질환인 편평태선 및 건선 등에서는 그 병소부의 항원제시세포에서는 CD28이나 CTLA-4의 리간드로서의 코스티뮬러토리 분자인 CD80이 이상발현이 확인되어 있는 것으로부터, 특히 CD80의 기능을 억제함에 의한 그 여러 가지 자기면역성 질환을 치료하려는 시도가 많이 이루어지고 있다.
CD80의 기능을 블록하는 방법으로서는 CD80에 대한 항체, CD80의 리간드인 CD28의 가용화 단백, 또는 마찬가지로 CD80의 리간드인 CTLA-4의 가용화단백을 사용하는 방법이 검토되고 있다. 그 중에서도 CTLA-4의 CD80에 대한 결합친화성이 CD28의 그것과 비교하여 20배 이상이라는 것에 기초하여 "가용화 CTLA-4", 구체적으로는 "CTLA-4"의 세포외 도메인과 인간 면역글로블린 IgG1의 Fc영역으로 되는 융합단백질(CTLA-4-IgFc)을 사용한 치료의 시도가 동물모델 및 임상시험에 있어서 행해지고 있다(일본임상, 제55권, 제6호, 제215-220페이지, 1997년).
자기면역질환 모델동물에서의 CTLA-4-IgFc에 의한 치료효과에 있어서는 하기 ① 내지 ⑤와 같은 보고가 이루어지고 있다.
① 인간 전신성 홍반성낭창(Systemic Lupus Erythematiodes; SLE)의 모델인 (NZB/NZW)F1 마우스에 있어서는 발증 전 투여로 자기항체생성의 억제 및 루프스 신장염의 발증을 억제하고, 또한 발증 후 투여에 있어서도 병의 상태 개선이 인식되었다(Science, Vol.125, p.1225-1227, 1994).
② 다발성 경화증(MS)의 모델인 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)에 있어서는, 면역 직후의 단기투여에 의해 발병을 저지할 수 있었다(J. Clin. Invest., Vol.95, p.2783-2789, 1995).
③ 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)모델인 NOD(non-obese diabetes) 마우스에서는 생후 2 내지 3주 나이의 암컷에게 2주간 투여하여 발병율이 현저히 저하하였다(J. Exp. Med., vol.181, p.1145-1155, 1995).
④ 굳파스튜어(Goodpasture)의 신장염 모델인 신사구체 기저막 면역에 의한 래트 신장염에서는 투여에 의해 증상의 개선이 인식되었다(Eur. J. Immunol., Vol.24, No.6, p.1249-1254, 1994).
⑤ 인간 만성 관절류마티즘 모델인 DBA/1 마우스를 사용한 타입II 콜라겐 유도 관절염(CIA)에서는 면역시의 투여에 의해 관절염의 발증이 억제되어, 콜라겐에 대한 자기항체(IgG1 및 IgG2)의 생성이 억제되었다(Eur. J. Immunol., Vol.26, p.2320-2328, 1996).
그렇지만 상기와 같은 치료의 시도가 이루어지는 한편으로, 코스티뮬러가터 분자 및 관련되는 분자와의 사이의 상호작용(바꾸어 말하면, 이들 분자 사이의 결합을 통한 세포간 접착)에 의한 T세포의 활성화 메커니즘의 상세한 해명은 아직 이루어지지 않고 있으며, 또한 이 메커니즘에는 아직 확인되어 있지 않은 다른 분자가 관여할 가능성도 남아 있다.
본 발명은 포유동물의 신규한 세포표면분자, 그 분자를 구성하는 폴리펩티드 및 그 단편, 그 폴리펩티드 단편과 면역글로블린 단편으로 된 융합 폴리펩티드, 그 폴리펩티드 및 그 단편을 코드하는 유전자, 그 유전자를 포함하는 벡터, 그 벡터가 도입된 형질전환체, 그 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드에 의해 구성되는 세포표면분자 반응성을 가지는 항체, 그 항체를 생성하는 하이브리도마, 그 폴리펩티드 단편 또는 그 융합 폴리펩티드를 함유하여 되는 의약조성물, 그 항체를 함유하여 되는 의약조성물, 형질전환 마우스(transgenic mouse), 및 노크아웃 마우스(knockout mouse)에 관한 것이다.
도 1은 "JTT.1항체"에 의해 유도되는 FTL435세포의 세포응집상태, 및"JTT.2항체"에 의한 그 세포응집의 저해상태를 나타내는 현미경사진이다.
분도 (a)는 어떤 하이브리도마 상청도 가하지 않은 경우의 세포상태를 나타내며, 분도 (b)는 "JTT-1항체"에 의한 세포응집상태를 나타내고, 분도 (c)는 "JTT-1항체"와 함께 "항ICAM-1항체"를 가한 경우의 세포응집상태를 나타내며, 또한 분도 (d)는 "JTT-1항체"와 함께 "JTT-2항체"를 가한 경우의 세포응집상태를 나타낸다.
도 2는 "JTT.1항체"에 의해 유도되는 FTL435세포 및 래트활성화 임파아구의 세포응집상태 및 "JTT.2항체"에 의한 그 세포응집의 저해상태를 나타내는 현미경사진이다.
분도 (a)는 어떤 항체도 가하지 않은 경우의 FTL435세포의 세포상태를 나타내며, 분도 (b)는 PMA를 가한 경우의 FTL435세포의 세포상태를 나타내고, 분도 (c)는 "JTT-1항체"를 가한 경우의 FTL435세포의 세포상태를 나타내며, 분도 (d)는 "JTT-1항체"와 함께 항LFA-1항체를 가한 경우의 FTL435세포의 세포상태를 나타내고, 분도 (e)는 "JTT-1항체"와 함께 항CD18항체를 가한 경우의 FTL435세포의 세포상태를 나타내고, 분도 (f)는 "JTT-1항체"와 함께 항ICAM-1항체를 가한 경우의 FTL435세포의 세포상태를 나타내며, 분도 (g)는 어떤 항체도 가하지 않은 경우의 활성화 임파아구의 세포상태를 나타내고, 분도 (h)는 PMA를 가한 경우의 활성화 임파아구의 세포상태를 나타내며, 분도 (i)는 "JTT-1항체"를 가한 경우의 활성화 임파아구의 세포상태를 나타내고, 분도 (j)는 "JTT-1항체"와 함께 항LFA-1항체를 가한 경우의 활성화 임파아구의 세포상태를 나타내고, 분도 (k)는 "JTT-1항체"와 함께 항CD18항체를 가한 경우의 활성화 임파아구의 세포상태를 나타내며, 또한 분도(l)는 "JTT-1항체"와 함께 항ICAM-1항체를 가한 경우의 활성화 임파아구의 세포상태를 나타낸다.
도 3은 플로우사이토메트리를 사용하여 측정한 각종 세포에 있어서 "JTT.1항원" 및 "JTT.2항원"의 발현상태를 도시한 도면이다.
도 4는 플로우사이토메트리를 사용하여 측정한 각종 임파구계 세포에 있어서 "JTT.1항원"의 발현상태를 도시한 도면이다.
도 5는 SDS-PAGE에 의한 전기영동에 의해 해석한 "JTT.1항원"의 전기영동상을 나타내는 사진이다.
도 6은 "JTT.1항체"의 공존하에 유도되는 정제 "JTT.1항원"을 코팅한 마이크로플레이트의 래트흉선세포의 접착상태, 및 "JTT.2항체"에 의한 그 세포접착의 저해의 상태를 나타내는 현미경사진이다.
분도 (a)는 "JTT-1항원"을 코팅하지 않은 플레이트로의 세포의 접착상태를 나타내며, 분도 (b)는 어떤 항체도 가하지 않은 경우의 "JTT-1항원"을 코팅한 플레이트로의 세포의 접착상태를 나타내며, 분도 (c)는 "JTT-1항체"의 Fab 단편을 가한 경우에 "JTT-1항원"을 코팅한 플레이트로의 세포의 접착상태를 나타내고, 또한 분도 (d)는 "JTT-1항체"의 Fab 단편과 동시에 "JTT-2항체"를 가한 경우 "JTT-1항원"을 코팅한 플레이트로의 세포의 접착상태를 나타낸다.
도 7은 정제 "JTT.1항원"을 코팅한 플레이트에 접착한 흉선세포의 형광강도에 근거하는 상대 세포수를 도시한 도면이다.
"Ag(-)"는 "JTT-1항원"을 코팅하지 않은 플레이트에 있어서의 상대 세포수를나타내며, "Ag(+)"는 어느쪽의 항체도 가하지 않은 경우의 "JTT-1항원"을 코팅한 플레이트에 있어서의 상대 세포수를 나타내고, "Ag(+)+ JTT.1 Fab"는 "JTT-1항체"의 Fab 단편을 가한 경우의 "JTT-1항원"을 코팅한 플레이트에 있어서 상대 세포수를 나타내고, 또한 "Ag(+)+ JTT.1 Fab+ JTT.2"는 "JTT-1항체"의 Fab 단편과 동시에 "JTT-2항체"를 가한 경우의 "JTT-1항원"을 코팅한 플레이트에 있어서의 상대 세포수를 나타낸다.
도 8은 플로우 사이토메트리를 사용하여 측정한 "래트 JTT-1항원"을 코드하는 cDNA에서 형질전환한 COS 세포에서의 "래트 JTT-1항원" 및 "래트 JTT-2항원"의 발현상태를 도시한 도면이다.
도 9는 하이드로퍼시 플랏 해석에 의한 "JTT.1항원"의 아미노산서열의 구조적 특징을 도시한 도면이다.
도 10은 인간, 래트 및 마우스의 "JTT.1항원" 및 "래트 JTT-1항원"의 변이체의 각각의 아미노산서열의 상동성을 도시한 도면이다.
도 11은 "인간 JTT-1항원", "인간 CD28분자" 및 "인간 CTLA-4분자"의 아미노산서열에 있어서의 아미노산서열 상동성 및 모티브의 보존상태를 도시한 도면이다.
도 12는 "인간 JTT-1항원", "인간 CD28분자" 및 "인간 CTLA-4분자"의 단백2차 구조 및 그 유사성을 모식적으로 도시한 도면이다.
도 13은 "마우스 JTT-1항원"을 코드하는 게노믹 DNA의 구조를 모식적으로 도시한 도면이다.
도 14는 "래트 JTT-1항원" 및 그 얼터너티브 스플라이싱(alternativesplicing) 변이체의 각각의 아미노산서열의 차이를 도시한 도면이다.
도 15는 [3H]티미딘의 도입 시험에 의해 측정한 "인간 JTT-1항원"에 대한 모노클로날항체에 의해 유도되는 인간말초혈 임파구의 증식 정도를 도시한 도면이다.
세로축은 세포내로의 [3H]티미딘의 도입량(dpm)을 나타낸다.
도 16은 질환모델 래트에 있어서의 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)의"JTT-1항원"에 대한 모노클로날항체에 의한 치료효과를 도시한 도면이다.
세로축은 점수화한 질환증상의 정도를 나타내며, 또한 가로축은 EAE 유도를 위한 면역감작 후의 경과일수를 나타낸다.
도 17은 질환모델 래트에 있어서의 사구체 신장염의 "JTT-1항원"에 대한 모노클로날항체에 의한 치료효과를 도시한 도면이다.
세로축은 뇨중 단백배설량을 나타내며, 또한 가로축은 사구체 신장염유도를 위한 면역감작 후의 경과시간(주)을 나타낸다.
도 18은 프로테인 A 세팔로스컬럼에 의한 "래트 JTT-1항원"의 세포외영역과 인간 IgFc와의 융합폴리펩티드(rJTT-1-IgFc)의 정제에 있어서 컬럼 히스토그람을 도시한 도면이다.
도 19는 SDS-PAGE에 의한 전기영동에 의해 해석한 rJTT-1-IgFc의 전기영동상을 나타내는 사진이다.
도 20은 프로테인 A 세팔로스컬럼에 의한 "인간 JTT-1항원"의 세포외영역과인간 IgFc(hJTT-1-IgFc)의 융합폴리펩티드의 정제에 있어서의 컬럼 히스토그람을 도시한 도면이다.
도 21은 SDS-PAGE에 의한 전기영동에 의해 해석한 hJTT-1-IgFc의 전기영동상을 나타내는 사진이다.
도 22는 "래트 JTT-1항원"을 코드하는 cDNA를 도입한 형질전환마우스 제작을 위한 유전자도입용 벡터의 구조를 모식적으로 도시한 도면이다.
전술한 바와 같은 T세포 등의 임파구의 활성화에 필수적인 제2의 시그널 전달에 관여하는 분자 사이의 결합을 통한 세포간 접착에 의한 T세포 등의 임파구의 활성화 및 임파구의 기능 제어의 메커니즘의 해명 및 그 메커니즘에 관여하는 세포간접착을 매개하는 능력과 시그널을 전달할 능력을 더불어 가진 기지 또는 미지의 분자 확인 및 그 성상 해석은, 이미 서술한 바와 같은 여러 가지 자기면역질환, 알레르기성 질환 및 염증성 질환 등의 여러 가지 질환의 치료 또는 예방에 있어서 유용한 의약품을 개발, 제공하는 것을 가능하게 한다.
즉 본 발명은 이와 같은 세포간접착의 매개와 시그널전달이라는 양면의 기능을 함께 가진 신규한 세포표면분자를 확인함과 동시에 그 구조적 및 생물학적인 성상을 명확하게 하는 것을 과제로 한다. 또한 본 발명은 그 신규 분자 또는 그 분자에 대한 항체 등을 사용함으로써 여러 가지 자기면역질환이나 염증성질환의 치료 또는 예방에 유용한 의약품을 제공하는 것을 과제로 한다.
이와 같은 유용한 분자를 확인하기 위해서, 본 발명자 등은 자기면역질환이나 알레르기질환등에 있어서는 T세포 등의 임파구가 중요한 기능을 하고 있다는 것, 및 항원제시세포로부터의 제2의 시그널(코스티뮬러토리 시그널)의 임파구세포내로의 시그널전달에는 세포간접착이 필수라는 것에 착안하여, 임파구계의 세포에 특이적으로 발현되고, 또한 세포간접착을 매개하는 기능을 가지는 세포표면분자의단리 및 동정을 행하는 것을 고려하였다.
그 방법으로서 우선 임파구계 세포 자체를 면역함으로써 그 세포의 표면에 발현하고 있는 여러 가지 세포표면분자에 대한 모노클로날(mono clonal) 항체를 취득하고, 얻어진 모노 클로날 항체를 사용하여 세포간접착을 매개하는 기능을 가지는 목적하는 세포표면분자를 단리, 동정하는 수법을 사용했다. 이하 그 방법을 구체적으로 설명한다.
본 발명자 등은 우선 래트의 임파구계 세포주를 면역원으로서 마우스에게 투여하여, 여러 가지 모노클로날 항체를 제조했다. 이어서 얻어진 모노클로날 항체를 면역원으로서 사용한 래트 임파구계 세포에 작용시켜, 그 모노클로날 항체가 그 세포에 주는 영향에 관해 검토했다. 그 결과 얻어진 모노클로날 항체중 하나가 그 래트 임파구계 세포를 강하게 응집시키는 특성을 가지는 것을 발견하였다(이 모노클로날 항체를 "JTT.1항체"라고 명명했다.). 또한 마찬가지로, 제조한 모노클로날항체중에, 그 "JTT.1항체"에 의해 유도되는 래트 임파구계 세포의 응집을 강하게 저해하는 모노클로날항체를 발견하였다(이 모노클로날항체를 "JTT.2항체"라고 명명했다.).
"JTT.1항체"에 의한 래트 임파구계 세포의 응집이, 그 세포에 발현하고 있는 기지의 가장 대표적인 세포간 접착 분자인 ICAM-1(Intercellular adhesion molecule-1)이나 LFA-1(lymphocyte function-associated antigen-1)에 대한 항체에 의해 저해되지 않았기 때문에, 이 응집이 세포간 접착 매개작용을 가지는 미지의 접착분자를 통한 세포간접착에 의한 응집이라고 여겨졌다.
다음에, 이 2개의 모노클로날항체에 의해 각각 인식되는 세포표면분자(각각 "JTT.1항원" 및"JTT.2항원"이라고 명명했다.)의 동정, 단리 및 성상해석을 행했다.
우선, "JTT-1항체" 및 "JTT-2항체"를 사용한 형광 항체법에 근거하여 플로우사이토메트리(flow cytometry)로 여러 가지 세포에 있어서의 "JTT.1항원" 및 "JTT.2항원"의 발현패턴해석을 행했다. 이 결과 "JTT.1항원" 및 "JTT.2항원"이 모두 흉선세포 및 비장세포를 마이토젠(mitogen)인 콘카나발린A(Concanavalin A; ConA)로 자극하여 활성화한 활성화 임파아구세포(활성화 T 임파아구세포, 활성화 B 임파아구세포 등), 특히 그 활성화 임파아구세포에서 강하게 발현이 확인되는 한편으로, 아무런 자극도 가하지 않은 비장세포(이러한 세포는 본 발명에 있어서 "정지기 임파구"라고 불리는 경우도 있다. )에는 거의 발현이 보이지 않는다는 것을 발견하였다. 또한 "JTT-1항체" 및"JTT-2항체"의 각각에 의해 확인되는 분자의 발현패턴은 거의 동일한 것을 발견하였다.
이어서 흡착제에 "JTT-1항체"를 흡착시켜 제조한 어피니티(affinity) 컬럼을 사용하여, 상기 래트 임파구계 세포로부터 제조한 가용성 세포표면분자의 혼합물로부터 그 "JTT-1항체"에 의해 트랩되는 분자, 즉 "JTT-1항원"을 정제했다. 이 정제 "JTT-1항원"의 분자량을 "JTT-1항체" 및 "JTT-2항체"를 사용한 면역침강법 및 SDS-PAGE에 의해 해석했다. 그 결과 "JTT-1항체" 및 "JTT-2항체"의 각각에 의해 면역침강되는 분자가 동일한 분자이며, 또한 그분자는 각각 다른 당쇄수식(sugar chain)을 가지는 호모다이머인 것을 발견하였다. 구체적으로는 N형 당쇄의 소화처리를 행하지 않은 경우에는, 비환원화로 약 47 kD의 1분자로서, 또한 환원화로 약 24kD와약 28kD의 2분자로서 동정되고, N형 당쇄의 소화처리를 행한 경우에는, 비환원화로 약 36kD의 1분자로서, 또한 환원화로 약 20kD의 1분자로서 동정되었다.
이어서, 그 정제 "JTT.1항원"을 코팅한 플레이트로의 래트 흉선세포의 접착의 해석을 행했다. 이 결과, 흉선세포가 "JTT.1항체" 존재하에서만 유의할 정도로 플레이트에 접착(즉 "JTT.1항원"에 접착)하고, 그 접착은 "JTT.2항체"의 공존하에 유의할 정도로 저해되는 것을 확인하여, "JTT.1항원"이 실제로 세포간접착을 매개하는 세포표면분자인 것을 증명했다.
다음에 본 발명자 등은, 래트, 인간 및 마우스의 "JTT.1항원"을 코드하는 유전자를 클로닝하고, 아울러 그 구조 해석을 행했다.
구체적으로는 우선, "JTT.1항체"를 사용한 패닝(panning)법을 이용한 발현 클로닝법에 의해, ConA 자극한 래트 비장 유래 임파아구의 cDNA 라이브러리로부터, "래트 JTT.1항원"의 전장을 코드하는 cDNA를 단리하는 것에 성공하여, 디데옥시법에 의해 그의 염기서열을 결정함으로써 완전히 신규한 래트의 유전자를 단리, 동정했다. 또한 얻어진 "래트 JTT.1항원"을 코드하는 cDNA를 프로브(probe)로 한 플라크하이브리다이제이션에 의해, ConA 자극한 인간말초혈 임파아구의 cDNA 라이브러리로부터, "인간 JTT.1항원"의 전장을 코드하는 cDNA를 단리하는 것에 성공하여, 디데옥시법에 의해 그의 염기서열을 결정함으로써 완전히 신규한 인간의 유전자를 단리, 동정했다. 마찬가지로, ConA 자극한 마우스 비장 유래 임파아구의 cDNA 라이브러리로부터, "마우스 JTT.1항원"의 전장을 코드하는 cDNA를 단리하는 것에 성공하여, 디데옥시법에 의해 그의 염기서열을 결정함으로써 완전히 신규한 마우스의유전자를 단리, 동정했다. 또한 마찬가지로 래트 흉선종 세포주의 cDNA 라이브러리로부터, 상기 "래트 JTT.1항원"의 얼터너티브 스플라이싱 변이체(alternative splicing variant)의 전장을 코드하는 cDNA를 단리하는 것에 성공하여, 디데옥시법에 의해 그의 염기서열을 결정함으로써 완전히 신규한 별도의 래트 유전자를 단리, 동정했다.
단리된 "인간 JTT-1항원"의 cDNA에 의해 코드되는 아미노산서열의 하이드로퍼시플랏(hydropathy plot)해석으로부터 "JTT.1항원"이 시그널서열, 당쇄수식 부위를 가지는 세포외 영역, 막관통영역 및 세포내 영역으로 구성되는 세포막 관통단백(즉 세포표면분자)인 것을 발견하였다. 또한 기지분자와의 호몰로지검색 결과, 래트, 인간 및 마우스 어느쪽의 "JTT.1항원"도, 세포간 접착 분자를 포함한 기지의 어떠한 분자와도 유의할 정도의 상동성을 가지지 않고, 또한 세포간 접착 매개기능을 가지는 완전히 신규한 세포표면분자인 것을 발견하였다.
또한, "인간 JTT-1항원"의아미노산서열을 바탕으로 모티브검색을 행한 결과, "인간 JTT-1항원"은 이미 상세하게 서술한 세포간 접착을 통해 T세포의 활성화에 중요한 코스티뮬러토리시그널을 전달하는 T세포 등의 임파구의 세포표면분자인 "CD28" 및 그 시그널에 연동하여 활성화 T세포 등의 활성화 임파구의 기능제어를 행하는 T세포 등의 임파구의 세포표면분자인 "CTLA-4"와 하기와 같은 구조적 유사성을 가지고 있는 것을 발견하였다.
즉 ① 시스테인 잔기를 함유하는 20 이상의 아미노산 잔기가 잘 보존되어 있다. ② 리간드결합영역으로서 필수적인 프롤린 잔기가 연속하는 서열"Pro-Pro-Pro(PPP)"이 세포외 영역에 보존되어 있다. 또한 ③ 시그널 전달영역으로서 필수적인 서열 "Tyr-Xaa-Xaa-Met(YxxM)(Xaa 및 x는 임의의 아미노산을 의미한다.)가 세포내 영역에 보존되어 있다.
다음으로 형광 인시투하이브리다이제이션(in situ hybridization)(FISH)법을 사용하여, "마우스 JTT-1항원"을 코드하는 유전자의 마우스 염색체상에서의 위치를 해석한 바, 그 위치는 마우스의 "CD28" 및 "CTLA-4"의 위치와 같은 "1C3"인 것을 발견하였다.
다음으로 "JTT-1항원"의 기능을 제어하여 자기면역질환 및 알레르기성질환 치료의 유효성을 해석하기 위해서, 전술한 "JTT-2항체"를 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE) 및 사구체 기저막(GBM) 신장염의 모델래트에 투여하는 실험을 행했다. 그 결과 어느쪽의 질환 모델동물에 있어서도, 병상의 유의할만한 억제가 보이는 것을 발견하여, "JTT-1항원"의 기능을 제어하여 자기면역질환이나 알레르기성질환의 치료가 가능한 것을 발견하였다.
또한 "인간 JTT-1항원"에 대한 모노클로날항체가 인간말초혈 임파구를 유의할 정도로 증식시키는 것, 또한 그 증식은 T세포의 활성화에 필수적인 항원제시세포부터의 제1의 시그널을 받는 T세포상의 TcR/CD3 복합체를 구성하는 CD3에 대한 모노클로날 항체를 공존시키고 아울러 높은 증식이 보이는 것을 발견하여, "JTT-1항원"이 임파구로의 시그널 전달에 관여하는 세포표면분자인 것을 발견하였다.
또한 "JTT-1항원" 및/또는 그 리간드의 기능을 제어하는 것에 의한 자기면역질환, 알레르기성질환 또는 염증성질환의 치료를 위한 의약품으로서 유용한, "인간 JTT-1항원"의 세포외 영역과 인간면역글로블린의 Fc영역으로 되는 융합폴리펩티드를 제조하는 것에 성공했다.
또한 "JTT-1항원"의 상세한 기능을 해석하여 자기면역질환, 알레르기성질환및 염증성질환의 치료를 위한 의약품을 개발하기 위해서 유용한, 다른 동물종의 "JTT-1항원"을 코드하는 유전자가 도입된 형질전환마우스 및 "마우스 JTT-1항원"을 코드하는 내재성 유전자가 불활성화된 노크아웃마우스를 제조하는 것에 성공했다.
즉 본 발명은 상술 한 바와 같이 하여 단리, 동정된 신규한 포유동물의"JTT-1항원"에 관계하는 폴리펩티드, 유전자, 항체, 벡터, 형질전환체, 의약조성물, 형질전환 마우스 및 노크아웃마우스 등에 관한 것이다. 구체적으로는 하기 (1) 내지 (36)에 기재된 발명에 관한 것이다.
(1) 하기 특징을 가지는 세포표면분자를 구성하는 폴리펩티드:
(a) 적어도 흉선세포 및 마이토젠(mitogen)으로 자극한 임파아구세포에서 발현된다;
(b) 그 세포표면분자에 반응성을 가지는 항체는 마이토젠으로 자극한 임파아구세포사이의 접착을 유도한다;
(c) 그 세포표면분자에 반응성을 가지는 항체는 CD3에 반응성을 가지는 항체와의 공존하에 말초혈 임파구의 증식을 유도한다;
(d) 세포외 영역에 Phe-Asp-Pro-Pro-Pro-Phe으로 나타내는 부분아미노산서열을 가진다; 및
(e) 세포내 영역에 Tyr-Met-Phe-Met으로 나타내는 부분아미노산서열을 가진다.
(2) 그 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산서열, 또는 서열번호2에 기재된 아미노산 서열중 아미노산에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산서열을 가지는 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 폴리펩티드.
(3) 그 폴리펩티드가 서열번호 1에 기재된 염기서열로 된 DNA에 엄격한(stringent) 조건하에 하이브리다이징하는 DNA에 의해 코드되는 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 폴리펩티드.
(4) 그 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산서열과 60% 이상의 상동성을 가지는 아미노산서열을 가지는 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 폴리펩티드.
(5) 그 세포표면분자가 인간 유래의 세포표면분자인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 상기 (4)중 어느 것에 기재된 폴리펩티드.
(6) 상기 (1) 내지 상기 (5)중 어느 것에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 유전자.
(7) 그 유전자가 cDNA인 것을 특징으로 하는 상기 (6)에 기재된 유전자.
(8) 그 cDNA가 서열번호 1에 기재된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 상기 (7)에 기재된 유전자.
(9) 그 cDNA가 서열번호 3의 염기번호 26 내지 625에 기재된 염기서열, 서열번호 4의 염기번호 35 내지 637에 기재된 염기서열, 서열번호 5의 염기번호 1 내지 603에 기재된 염기서열, 또는 서열번호 6의 염기번호 35 내지 685에 기재된 염기서열중 어느 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 (7)에 기재된 유전자.
(10) 상기 (6) 내지 상기 (9)중 어느 것에 기재된 유전자를 함유하는 벡터.
(11) 상기 (10)에 기재된 벡터가 도입된 형질전환체.
(12) 국제기탁번호 FERM BP-5725로 식별되는 형질전환체.
(13) 상기 (1) 내지 상기 (5)중 어느 것에 기재된 폴리펩티드의 세포외영역으로 된 폴리펩티드 단편.
(14) 그 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산서열을 가지는 인간유래의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 상기 (13)에 기재된 폴리펩티드 단편.
(15) 상기 (13) 또는 상기 (14)에 기재된 폴리펩티드 단편을 코드하는 유전자.
(16) 상기 (1) 내지 상기 (5)중 어느 것에 기재된 폴리펩티드의 세포외 영역으로 된 폴리펩티드 단편이 디술피드결합에 의해 결합하여 형성되는 호모다이머 분자.
(17) 그 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산서열을 가지는 인간유래의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 상기 (16)에 기재된 호모다이머분자.
(18) 상기 (14)에 기재된 폴리펩티드 단편 또는 상기 (17)에 기재된 호모다이머분자의 어느 한쪽 또는 양쪽과 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 되는 의약조성물.
(19) 상기 (1) 내지 상기 (5)중 어느 것에 기재된 폴리펩티드의 세포외 영역과 인간 면역글로블린(Ig)의 중쇄의 정상영역 또는 정상영역의 일부로 된 융합폴리펩티드.
(20) 면역글로블린이 IgG인 것을 특징으로 하는 상기 (19)에 기재된 융합폴리펩티드.
(21) 정상영역의 일부가 IgG의 힌지(hinge)영역, C2 도메인 및 C3 도메인으로 된것을 특징으로 하는 상기 (19)에 기재된 융합폴리펩티드.
(22) 그 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산서열을 가지는 인간유래의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 상기 (19) 내지 상기 (21)중 어느 것에 기재된 융합폴리펩티드.
(23) 상기 (19) 내지 상기 (22)중 어느 것에 기재된 융합폴리펩티드가 디술피드결합에 의해 결합하여 형성되는 호모다이머분자.
(24) 상기 (22)에 기재된 융합폴리펩티드가 디술피드결합에 의해 결합하여 형성되는 호모다이머분자.
(25) 상기 (22)에 기재된 융합폴리펩티드 또는 상기 (24)에 기재된 호모다이머분자의 어느 한쪽 또는 양쪽과 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 되는 의약조성물.
(26) 그 의약조성물이 자기면역질환 또는 알레르기성질환의 치료 또는 그 질환증상의 억제에 사용되는 것을 특징으로 하는 상기 (25)에 기재된 의약조성물.
(27) 상기 (1) 내지 상기 (5)중 어느 것에 기재된 폴리펩티드, 상기 (13) 또는 상기 (14)에 기재된 폴리펩티드 단편 또는 그 폴리펩티드에 의해 구성되는 세포표면분자에 반응성을 가지는 항체 또는 그 일부.
(28) 그 항체가 모노클로날항체인 것을 특징으로 하는 상기 (27)에 기재된 항체 또는 그 일부.
(29) 서열번호 2에 기재된 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드, 상기 (14)에 기재된 폴리펩티드 단편 또는 그 폴리펩티드로 구성되는 인간유래의 세포표면분자에 반응성을 가지는 모노클로날항체 또는 그 일부.
(30) 상기 (1) 내지 상기 (5)중 어느 것에 기재된 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드에 의해 구성되는 세포표면분자에 반응성을 가지는 모노클로날항체이고, 그 모노클로날항체의 마이토젠으로 자극한 임파아구세포로의 작용이, 국제기탁번호 FERM BP-5707로 식별되는 하이브리도마가 생성하는 모노클로날항체가 마이토젠으로 자극한 래트 임파아구세포에 나타내는 작용과 실질적으로 동일한 모노클로날항체 또는 그 일부.
(31) 상기 (1) 내지 상기 (5)중 어느 것에 기재된 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드에 의해 구성되는 세포표면분자에 반응성을 가지는 모노클로날항체이고, 그 모노클로날항체의 마이토젠으로 자극한 임파아구세포로의 작용이, 국제기탁번호 FERM BP-5708로 식별되는 하이브리도마가 생성하는 모노클로날항체가 마이토젠으로 자극한 래트 임파아구세포에 나타내는 작용과 실질적으로 동일한 모노클로날항체 또는 그 일부.
(32) 상기 (29)에 기재된 모노클로날항체 또는 그 일부와 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 함유하여 되는 의약조성물.
(33) 그 의약조성물이 자기면역질환 또는 알레르기성질환의 치료 또는 그 질환증상의 억제에 사용되는 것을 특징으로 하는 상기 (32)에 기재된 의약조성물.
(34) 상기 (28) 내지 상기 (31)중 어느 것에 기재된 모노클로날항체를 생성하는 하이브리도마.
(35) 상기 (1)에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 유전자로서, 서열번호 1에 기재된염기서열을 포함하는 인간유래의 유전자 또는 서열번호 4의 염기번호 35 내지 637에 기재된 염기서열을 포함하는 래트 유래의 유전자가, 마우스의 내재성 유전자에 삽입되어(integrated) 있는 것을 특징으로 하는 형질전환 마우스.
(36) 상기 (1)에 기재된 폴리펩티드이고 서열번호 5에 기재된 유전자에 의해 코드되는 아미노산서열을 가지는 마우스유래의 폴리펩티드가 생성되지 않도록, 그 폴리펩티드를 코드하는 마우스의 내재성 유전자가 불활성화되어 있는 것을 특징으로 하는 노크아웃마우스.
상술 한 바와 같이 본 발명의 세포표면분자(즉 "JTT-1항원")는 그 분자를 통한 세포간 접착 및 T세포 등의 임파구로의 시그널의 전달 및 활성화 임파구의 기능제어에 있어서 역할을 부담하는 측면을 가진다. 여기서 이와 같은 생물학적 사상의 일반적 이해에 도움이 되도록 하기 위한 목적으로 임파구계 세포, 세포간 접착 분자 및 이들과 질환의 관계에 관한 일반적 지식을 하기에 기재한다. 따라서 하기에 기재하는 일반적인 지식은 본 발명을 한정적으로 해석하기 위한 것이 아니다.
임파구는 크게 구별하여 T세포와 B세포의 두 가지로 나누어진다. 골수의 다기능성 간세포(stem cell)로부터 임파구계 간세포가 분화하면, 그 일부는 혈류를 타고 흉선에 도달한다. 흉선으로 분화 성숙한 임파구는 T세포(Thymus-derived cell:T cell)로 불리고, 다시 혈중에 들어가 전신을 돈다. 성숙한 T세포는 CD3라고 불리는 분자를 표면에 가지고 있고, 이 분자를 가지고 있는 것이 그 세포가 성숙 T세포인가 어떤가를 구별하는 표지가 된다. CD3는 유력한 T세포 메이커이다. 기타 T세포는 CD4 또는 CD8 등을 발현하고 있다. T세포는 또한 B 임파구의 항체생성을 보조하는 헬퍼 T세포(Th 세포: helper T cell), 표적세포에 관하여 직접 그것을 파괴하는 세포독성 T세포(Tc 세포: cytotoxic T cell:CTL) 또는 킬러 T세포, B 임파구의 항체생성을 억제하는 억제 T세포, 림포카인(lymphokine) 등의 효과물질을 분비 하여 지연형 알레르기를 일으키는 이펙터 T세포(effector T cell)등이 있다.
임파구계 간세포중 골수 안에서 그대로 분화성숙하는 것이 B세포이다. B세포는 적절한 자극이 있으면 항체를 생성하게 되는 세포로, 항체생성 전구세포이다. 표면에는 B세포내에서 합성된 면역글로블린이 있어서 항원 수용체로서 기능하고 있다. 성숙한 B세포의 표면에는 IgM과 IgD가 모두 있으며, 항원자극과 T세포부터의 시그널로 분화되면 IgM의 생성이 증가하여, C 말단부의 세포막결합부분이 변하여 분비되게 된다. 충분한 자극이 있으면 표면의 면역글로블린도 IgG나 IgE, IgA로 변화함과 동시에, 각각의 클라스의 면역글로블린을 분비하게 된다. B세포 표면의 면역글로블린은 표면의 Ig라고 하는 것으로 sIg라든가, 세포막의 Ig라고 하는 것으로 mIg로 표현되는 것도 있다. 하나의 B세포의 표면에 있는 Ig는 전부 같은 항원결합부위를 가진다.
T세포에서도 아니고 B세포도 아닌 임파구에서 LGL(large granular lymphocyte) 또는 눌셀(null cell)로 불리는 것이 있다. 이 세포에는 종양세포나 바이러스 감염세포의 장해능력이 있지만, 세포독성 T세포의 경우와 다르고, 미리 항원자극을 해 둘 필요가 없다. 이로 인해 내츄럴 킬러 세포(NK 세포: natural killer cell)라고도 한다.
상기한 T세포의 안, CD4 양성 T세포는 항원제시세포에 의해서 제시된 항원에 반응하면, 여러 가지 사이토카인을 분비하고, 이들 사이토카인에 대한 수용체 등이 새롭게 발현되어 세포자신도 커지게 되고, 분열을 시작하여 증식한다. 이러한 세포레벨의 반응에 앞서, 각각의 T세포에 특유의 항원 수용체(T cell antigen receptor: TCR)에 항원제시세포상의 항원 펩티드와 MHC 클라스 II 분자의 복합체가 결합하여, 이에 의하여 세포내에서는 여러 가지 생화학적변화가 생겨 핵내에 시그널이 전해지고, 특정한 DNA의 전사가 시작되어, 각각의 단백질이 합성된다. 그 결과 세포레벨의 반응이 보이게 되는 셈이다. 또한 CD8 양성 T세포에 관해서는 예를 들어 어떤 바이러스에 감염된 세포를 고려하면, 이 감염된 세포는 바이러스 단백질을 합성하고, 이 단백질이 세포질내의 프로테아좀으로 분해되고, 일부 펩티드가 TAP를 거쳐 소포체내로 들어가며, 합성된 MHC 클라스 I 분자와 안정한 복합체를 형성하여 세포표면으로 나간다. 이것을 특이적인 CD8 양성 T세포가 인식하지만, 이 단계에서는 아직 그 세포를 파괴하는 것은 없다. 항원에 반응한 이 T세포는 IL-2 수용체(IL-2 R)를 발현하고, 게다가 IL-2가 작용하면 세포장해활성을 가지는 CTL로 분화되어, 다음과 같은 항원 펩티드/MHC 클라스 I 복합체와 만난 경우에 그 표적세포를 파괴하여 죽이는 것이 된다. CTL로 분화되는데 필요한 사이토카인은 IL-2뿐만 아니라, IFNγ나 그 밖의 사이토카인에도 유사의 작용이 있다고 말해진다. 이와 같이 CTL로의 분화에는 T세포가 분비되는 임포카인이 필요하지만, 이들 임포카인은 CD4 양성 Th1세포(IL-2나 IFNγ등을 분비하는 CD4 양성 T세포)가 같은 바이러스에 유래되는 항원의 펩티드를 클라스 II 분자와 동시에 인식하여 생성하고 있다. CD4양성 T세포의 도움이 없더라도, CD8 양성 T세포가 항원에 반응하여 IL-2 등을 생성하고 있는 경우도 있다. CD8 양성 T세포가 CTL로 분화하면, 세포질내에 과립이 증가한다. 이 과립의 안에는 여러 가지 고분자단백질이 포함되어 있고, 퍼포린(perforin)은 그 대표이다. 퍼포린은 보체의 제5-9성분으로 구성되는 막침습 복합체(membrane attack complex:MAC)와 상당히 유사하고, 표적세포의 세포막에 구멍을 뚫는 작용이 있다. 기타 세린프로테아제(serine protease)나 LT, 단백다당류(proteoglycan) 등도 포함되어 있다. 또한 CTL로 분화되어 항원자극을 받으면 IFNγ, LT, TNF 또는 IL-2 등의 임포카인도 분비 된다. 또한 T세포는 범혈구 응집소(식물응집소, PHA)나 콘카나발린A(Con A)에 반응하여 아구화현상을 나타낸다.
또한 아직 전혀 자극을 받고 있지 않은 상태의 성숙 T세포는, 정지기 T세포(resting T cell)로 불리고, 세포의 크기가 작고, 수명도 수일로 다. 자극을 받으면, 이미 서술한 바와 같이 세포는 커지게 되고, 여러 가지 자극에 대하여 더욱 반응하기 쉽게 된다. 이러한 T세포를 활성화 T세포(activated T cell)로 부른다. 일부 활성화 T세포는, 기억 T세포(memory T cell)로 되어, 같은 항원자극을 받으면 2차면역반응을 초래하는 것이 된다. 기억 T세포는 몇 년 또는 수십 년도 체내를 계속 순환한다고 한다.
B 세포에서 아직 전혀 자극을 받고 있지 않은 상태의 것을, T세포의 경우와 같이 정지기 B세포(resting B cell)라고 부르며, 다가의 항원이나 CD40L에서 자극되어, 증식을 일으켰던 바와 같은 B세포를 활성화 B세포(activated B cell)라고 한다. 정지기 B세포에는 B7-1(CD80)이나 B7-2(CD86)같은 코스티뮬러토리 분자(TCR을 통한 시그널과 동시에 T세포를 자극하는 분자)가 없고, 정지기 T세포에 항원을 제공하더라도 TCR을 자극할 뿐이므로, CD40리간드(CD40L)를 발현시키거나, 임포카인을 생성시키거나 할 수 없다라고 한다. 그 때문에 다른 항원제시세포에 의해서 항원자극되어 활성화된 헬퍼 T세포가 정지기 B세포의 항원제시에 반응하는 것으로 여겨지고 있다. 즉 항원이 침입하여 온 경우에는, 우선 B7분자를 발현하고 있는 수상 세포(현저한 수상의 돌기를 가지는 세포)나 미생물과 반응하여 활성화된 마크로파아지가 그 항원을 제시하고, 휴지기 헬퍼 T세포를 자극하여, CD40L을 발현시키는 등 활성화하고 나서, 같은 항원을 제시하는 정지기 B세포에 결합하여 그 CD40을 자극한다고 여겨지고 있다. 다가의 항원이나 CD40L에서 자극되어 한번 활성화되면, B세포도 B7분자를 발현하여, TCR와 동시에 표면의 CD28를 자극하여 그 헬퍼 T세포를 활성화하여 CD40L을 발현시키거나, 임포카인을 생성시키거나 할 수 있다. 또한 자극을 받아 세포가 커지는 등의 변화는 보이지만, 항체의 분비는 거의 보이지 않는 상태의 B세포를 활성화 B세포(activated B cell)라고 한다. 또한 성숙 B세포가 되어 항원과 만나면, T세포로부터의 자극도 가해져 IgM의 생성이 높아지고, 생성하는 IgM이 막형으로부터 분비형으로 변하여 분비되게 된다. 또한 T세포로부터의 액성인자에 의해서 IgM에서 IgG 등의 다른 아이소타입의(isotypic) 항체를 생성하게 된다. 이것을 아이소타입 스위치 또는 클라스스위치라고 한다. 항체를 분비 하게 된 B세포는 항체분비세포(antibody-secreting cell)로 불리게 되고, 일부는 형태학적으로도 특징이 있는 세포가 되어, 형질세포(plasma cell)로 불린다(면역학의 지식, 오옴사(1996)).
그런데 면역계의 여러 가지 반응에 있어서, 백혈구는 그 서브-파퓰레이션(sub-population), 즉 T임파구, B임파구, NK, 호중구 등이 각각 다른 동태를 나타내는 경우가 많다. 또한 상기한 바와 같이 같은 임파구만으로도, 그 세포상태, 즉 활성화하고 있는가, 정지기에 있는가에 따라 각각 다른 동태를 나타낸다. 이들 사실은, 백혈구의 서브-파퓰레이션 특이적인 인식기구, 더욱이 세포상태로 특이적인 인식기구, 특히 세포접착분자(세포접착단백질)의 존재를 시사하는 것이다.
세포접착분자, 즉 세포접착 단백질은 일반적으로 개체의 발생·분화의 경우에, 또는 세포의 국소로의 유주(migration)의 경우에, 세포끼리를 서로 접착시키는 기능을 가지는 분자이며, 생체의 유기적이고 또한 기능적인 연락에 있어서 필수적인 분자인 것이 알려져 있다.
세포접착분자는 그 구조적 특징으로부터 크게 면역글로블린 슈퍼패밀리, 인테그린패밀리(integrin family), 셀렉틴패밀리(selectin family), 카드헤린패밀리(cadherin family), CD44 패밀리의 5개로 분류되고 있다. 면역글로블린 슈퍼패밀리에 속하는 접착분자는 디술피드결합으로 형성되는 루프 모양 도메인을 반복하여 가지는 것을 특징으로 하고 있고, "ICAM-1"(intercellular adhesion molecule-1), "VCAM-1"(vascular cell adhesion molecule-1) 등의 분자가 알려져 있다. 또한, 인테그린패밀리에 속하는 접착분자는, α/β 헤테로다이머구조를 특징으로 하며, "VLA-1∼6"(very late antigen-1∼6), "LFA-1"(lymphocyte function-associated antigen-1), "Mac-1", "p150/90"등이 알려져 있다. 셀렉틴패밀리에 속하는 분자는, N 말단에서 순서대로 렉틴 모양 도메인, EGF 모양 도메인, 보체 도메인을 가지며, "E-셀렉틴", "P-셀렉틴"등이 알려져 있다. 또한 카드헤린패밀리로서는, "E-카드헤린", "N-카드헤린", "P-카드헤린"이, CD44 패밀리에는 "CD44"가 알려져 있다.
이들 접착분자의 구체적인 기능으로서는 백혈구의 혈관내피세포로의 접착이나 임파구의 항원제시세포로의 접착 등이 알려져 있지만, 최근에 있어서의 여러 가지 연구로부터, 이들 기능뿐만 아니라 여러 가지 질환에도 관계하고 있는 것이 서서히 밝혀지고 있다.
특히 질환과 접착분자의 발현이상에 관해서는 많은 보고가 이루어지고 있다. 예를 들어 만성관절류마티즘(RA)에 있어서는 RA 활막세포에 있어서, "Mac-1"과 "p150/95"의 양자의 발현이 증강하고 있는 것이 보고되고 있다(Allen, C et al. Arthritis Rheum.,32,947(1989)). 또한 RA 활막으로서는 여러 가지 세포가 "ICAM-1"을 강하게, 또한 이소성에(ectopically) 발현하고 있는 것이 보고되고 있다(Hale, L.et al.Arthritis Rheum., 32, 22(1989)). 또한 "ELAM-1"도 호중구와 혈관내피세포의 접착에 관여하고 있고, 이들 분자의 과잉발현은 RA 관절액 중에 보이는 호중구의 침윤(특히 관절액중으로의)에 관여하고 있는 것이 시사되고 있다(Laffon, A., et al. Arthritis Rheum., 32, 386(1989)). 또한 "CD44"도 RA 활막에 있어서, 혈관내피세포, A형 활막세포에 강하게 발현하고 있는 것이 보고되고있다(Heynes, B.et al.Arthritis Rheum., 34, 1434(1991)).
또한 전신성 홍반성낭창(SLE)와 접착분자의 발현이상과의 관계에 관해서도 예가 있으며, 예를 들어 SLE 환자에서는 T 임파구의 배양혈관내피세포에 대한 접착능이 건강인과 비교하면 저하하고 있는 것이 보고되고 있다. 또한 SLE 환자의 말소 임파구에 있어서의 접착분자의 발현검토에서는 "ICAM-1", "VLA-4", "IFA-1"의 증강경향이 보이고 있다(Haskard, D.O. et al, Rheumatol. Int, 9, 33 (1989)).
자기면역성 갑상선질환에 있어서는, 갑상선 여포세포를 인터페론-γ, 인터루킨-1, 종양괴사인자로 자극하면 "ICAM-1"이 발현하는 것, 여포세포와 단핵세포의 클러스터(cluster)형성이, 항"ICAM-1"항체에 의해 억제되는 것이 보고되고 있다(Weetman, A.P., et al. Eur.J.Immunol., 20, 271(1990)).
간염에서는 간세포와 염증세포 사이의 접착이 "ICAM-1"과 "LFA-3", "LFA-1"과 "CD2"라고 하는 2개의 경로로 행해지는 것으로 그 기회를 증가시켜, 항원의 제시나 염증세포의 활성화가 촉진된다고 여겨지고 있다. 특히 B형 간염에 있어서의 검토에서는 "LFA-3"이 바이러스 증식이 많은 간세포에 강하게 발현되고, "ICAM-1"이 간염의 정도에 간혹 서로 관련이 있다는 것으로부터, "LFA-3"이 바이러스의 배제에 관여하고, 또한 "ICAM-1"이 T세포로의 항원제시를 촉진시켜 염증반응을 조절하고 있는 것이 시사되고 있다. "ICAM-1" 음성에서 HBc 항원양성의 간세포의 경우는 임파구와의 세포사이 상호작용이 발생하지 않고 바이러스감염의 만성화라는 일종의 면역 불응답의 상태가 생기는 것은 아닌가라고 여겨진다. 급성간염이나 만성활동성 간염, 간경변 환자의 혈청 "ICAM-1"농도가 건강한 상태의 사람이나 만성지속성 간염환자보다도 높고, 또한 활동성 간염환자중에서 조직학적으로 진행한 증례로 비싼 값을 인식하는 것으로부터 만성 간질환에 있어서의 혈청"ICAM-1"이 간세포의 장해의 정도와 서로 상관이 있다는 보고도 이루어지고 있다(Mod.Phys.15,(1),73-76(1995)).
동맥 경화의 모델동물로서는, 그 병변 발증의 극히 초기에서 혈관내피로의 단핵구나 임파구의 접착, 침입이 인식되어, 이들 혈구세포와 내피의 상호작용이 동맥 경화 발증의 제1단계라고 여겨지고 있다. 또한 실제의 동맥 경화소에 있어서 접착분자의 발현에 있어서는, 여러 가지 보고가 이루어지고 있다. 예를 들어 인간동맥경화소에 있어서 "ICAM-1"의 발현(Poston RN, et al.Am J Patol, 140, 665(1992))이나 고콜레스테롤혈증 토끼의 동맥경화소에 있어서 "VCAM-1"의 발현(Cybulsky MI, Gimbrone MA Jr.Science, 251, 788(1991))에 관한 보고예가 있다. 또한 최근 인간의 동맥경화소에 있어서도 "VCAM-1"이 발현하고 있는 것이 관찰되고 있고, 그 발현이 특히 내막에 유주한 평활근 세포와 단핵구/마크로파아지에 강하게 인식된 것이 보고되고 있다. 또한 토끼 및 인간동맥경화소에 있어서 "MCP-1"의 발현항진이 인식되고 있고, "MCP-1"이 단핵구/마크로파아지의 유주를 통해 동맥경화소의 형성을 촉진하고 있다고 하는 시사도 있다(current tera pea, 12, (8), 1485-1488(1994)).
또한 암전이와 접착분자이상의 관계에 관해서도 보고가 있다. 예를 들어 E-카드헤린이 저하된 암세포는 강한 침습성을 나타내지만, 이것에 E-카드헤린의 cDNA를 도입하면 침습성이 억제되고, 또한 E-카드헤린 항혈청을 첨가하면 침습성이회복하는 것이 발견되고 있고, E-카드헤린의 발현저하와 암 세포의 침습성의 밀접한 관련이 시사되고 있다(Frixen, U.H., et al. 113, 173(1991)). 실제의 임상예에 있어서도, 간암, 식도암, 위암, 유방암 등 여러 가지 암으로 E-카드헤린의 발현저하와 전이와의 관계가 지적되고 있다. 또한 "VCAM-1"의 리간드인"VLA-4"는 전이성 흑색종(melanoma), 위암, 유방암 등으로 고발현하는 것이 보고되어 있으며, 이들이 전이에 있어서 혈관내피세포로의 착상에 이용되는 가능성이 시사되고 있다. 또한 여러 가지 암세포주를 사용한 실험에서 위암, 대장암, 폐암, 간암, 췌장암 등의 상피성 암은 E-셀렉틴을 통해 혈관내피세포에 접착한다는 보고도 이루어지고 있다(Takada, A., et al. Cancer Res., 53, 354(1993)).
한편 이들 접착분자를 표적으로 한 질환치료의 시도도 이루어지고 있다. 예를 들어 항래트 "ICAM-1" 항체가 래트 자기면역성 관절염 모델에서의 염증반응을 강하게 억제하는 것이 보고되고 있다. 또한 RA의 동물모델의 하나인 어쥬번트(adjuvant) 활막염에서는 항"ICAM-1"항체를 투여함에 의해, 관절염의 발증이 억제되는 것이 보고되고 있다(일본임상면역학회지, 14, (6), 571-577(1991)). 또한 일부 인테그린이 인식하여 결합하는 세포외 매트릭스 단백상의 아미노산서열인 REG 서열의 펩티드를 다량으로 담암(gallbladder cancer)마우스에게 투여하면, 접종종양의 전이형성이 현저히 억제되고, 또한 in vitro계에서는, RGD 펩티드나 항 β1 서브유닛 항체가 암세포의 연동이나 침윤을 억제하는 것이 보고되고 있다(Yamada, K.M., et al. Cancer Res, 50, 4485, (1990)).
이하 본 발명에서 사용하는 용어의 의미 및 본 발명의 폴리펩티드, 융합폴리펩티드, 유전자, 항체, 형질전환마우스, 노크아웃마우스 등의 일반적 제조방법을 분명히 함으로써 본 발명을 상세하게 설명한다. 그렇지만 이 용어의 의미가 그와 같은 정의를 따라 한정적으로 해석되는 것이 아닌 것은 말할 필요도 없다.
본 발명에 있어서 "마이토젠"이라는 것은 분열촉진제라고도 불리며, 세포분열을 유발하는 물질을 가리킨다. 면역학적으로는 항원비특이적(폴리클로날)으로 임파구를 유악화하여 분열을 유발시키는 것을 의미한다. 예를 들어 PHA나 PWM 등의 렉틴, 콘카나발린 A(Concanavalin A; ConA), 리포다당, 스트렙토리신 S, 항임파구 항체 등을 들 수 있다. 콘카나발린 A나 PHA는 T임파구에만 작용하며, 리포다당은 B임파구에만 작용하고, PWM은 양 임파구에 작용하는 것이 알려져 있다.
본 명세서중에 사용되는 "임파아구세포"라는 용어는, 대임파구, 림포블라스트(lymphoblast) 또는 면역 아세포라고도 불리며, 임파성 조직(임파관절, 비장, 흉선, 골수, 임파관, 편도선 등)이나 혈액중에 존재하는 임파구 안의 대임파구에 속하는 임파구를 가리킨다.
본 명세서중에 사용되는 "활성화 임파구"라는 용어는, 예를 들어 하기와 같은 임파구를 의미하지만 이것만은 아니다. 예를 들어 어떠한 자극에 의해 활성화된 임파구를 가리킨다. 전술한 대로 임파구는, T세포, B세포 및 내츄럴킬러세포로 분류되고, 또한 T세포 에 있어서는 CD4 양성세포와 CD8 양성세포로 분류할 수 있다. 따라서 본 발명의 "활성화 임파구"에는 주로 활성화 T세포, 활성화 B세포, 및 활성화 내츄럴 킬러세포가 포함되고, 또한 활성화 T세포에는 활성화 CD4양성세포와 활성화 CD8양성세포가 포함된다.
CD4양성 T세포는, 항원제시세포에 의해서 제시된 항원과 반응하면, 여러 가지 사이토카인을 분비하고, 이들 사이토카인에 대한 수용체 등이 새롭게 발현하고, 세포자신도 커지고, 분열을 시작하여 증식하여 활성화된다. 활성화 CD4양성 T세포라는 것은 이러한 상태의 CD4양성 T세포를 가리킨다.
CD8양성 T세포는 항원과 반응하면 IL-2R을 발현하고, 게다가 IL-2가 작용하면 세포독성을 갖는 CTL로 분화되어, 다음과 같은 항원 펩티드/MHC 클라스 I 복합체와 만난 경우에 그 표적세포를 파괴하여 죽이게 된다. CD8양성 T세포가 CTL로 분화되면, 세포질내에 과립이 증가해 온다. 이 과립중에는 여러 가지 고분자단백질이 포함되어 있고, 퍼포린은 그 대표이다. 퍼포린은 보체의 제5-9성분으로 구성되는 MAC와 충분히 유사하고, 표적세포의 세포막에 구멍을 뚫는 작용이 있다. 기타 세린프로테아제나 LT, 단백다당류 등도 포함되어 있다. 또한 CTL로 분화되어 항원자극을 받으면 IFNγ, LT, TNF 또는 IL-2 등의 임포카인도 분비된다. 활성화 CD8양성 T세포라는 것은 이러한 상태의 CD8양성 T세포를 가리킨다.
T세포는 범혈구 응집소(식물응집소, PHA)나 콘카나발린 A(Con A)와 반응하여 아구화 현상을 나타내지만, 이러한 상태의 T세포도 활성화 T세포에 포함된다.
B세포로서는, B7분자를 발현하고, TCR과 동시에 표면의 CD28을 자극하여 그 헬퍼 T세포를 활성화하여, CD40L을 발현시키거나, 임포카인을 생성하거나 하며, 자극을 받아 세포가 커지거나, 증식을 일으키는 등의 변화가 보인다. 활성화 B세포라는 것은, 이러한 상태의 B세포를 가리키며, 본 발명에 있어서는 항체를 분비하게된 B세포(항체분비세포(antibody-secreting cell)및 형질세포(plasma cell))도 활성화 B세포에 포함된다.
활성화 내츄럴킬러세포라는 것은 전술한 바와 같이 종양세포나 바이러스 감염세포의 장해작용을 나타내는 내츄럴킬러세포를 가리킨다. 또 본 발명에 있어서는 콘카나발린 A(Con A)으로 자극된 흉선세포도 활성화 임파구에 포함된다.
본 발명에 있어서 사용되는 "활성화 임파아구세포"에는, 상기한 바와 같은 "임파아구"가 콘카나발린 A 같은 상기 "마이토젠"으로 자극을 받아 활성화된 임파아구가 포함된다.
본 명세서에서 경우에 따라 사용되는 "정지기 임파구"라는 용어는, 전술한 활성화 임파구와 대조적으로, 세포의 활성화를 위한 자극을 받고 있지 않은 비활성화상태의 임파구를 가리킨다.
본 발명에 있어서 "유전자"에는 게노믹 DNA 및 cDNA가 포함된다.
본 발명에 있어서 "인간유래"라는 것은, 인간의 생체성분(장기, 조직, 세포, 체액 등으로부터 단리된 천연의 물질, 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조되는 재조합 물질을 포함하고, 또한 그 물질이 단백질 또는 폴리펩티드 인 경우에는, 이들의 아미노산서열중 아미노산의 1 또는 수개의 아미노산서열이 치환, 결실 또는 부가한 아미노산서열을 가지는 인공 단백질 및 폴리펩티드도 포함된다.
본 발명의 "세포표면분자"라는 것은 인간, 래트, 마우스, 모르모트 및 토끼 등의 포유동물에게 유래하는 세포표면분자이며, 바람직하게는 인간, 래트 또는 마우스에게 유래하는 세포표면분자이며, 보다 바람직하게는 인간유래의 세포표면분자이다.
본 발명의 "세포표면분자"는, 구체적으로 적어도 하기의 성질을 가지는 것을 특징으로 하는 세포표면분자이다.
(a) 적어도 흉선세포 및 마이토젠으로 자극한 임파아구세포로 발현된다 ;
(b) 그 세포표면분자에 반응성을 가지는 항체는 마이토젠으로 자극한 임파아구세포사이의 접착을 유도한다 ;
(c) 그 세포표면분자에 반응성을 가지는 항체는, CD3에 반응성을 가지는 항체와의 공존하에 말초혈 임파구의 증식을 유도한다 ;
(d) 세포외영역에 Phe-Asp-Pro-Pro-Pro-Phe으로 나타내는 부분아미노산서열을 가진다; 및
(e) 세포내영역에 Tyr-Met-Phe-Met으로 나타내는 부분아미노산서열을 가진다.
바람직한 태양으로서는 후술하는 본 발명의 "폴리펩티드"로부터 구성되는 세포표면분자이다.
본 발명의 "폴리펩티드"라는 것은 상기 본 발명의 "세포표면분자"를 구성하는 폴리펩티드이며, 구체적으로는 하기를 들 수 있다.
(1) 서열번호1에 기재된 염기서열로 이루어지는 DNA에 엄격한 조건하에서 하이브리다이징하는 DNA에 의해 코드되는 폴리펩티드.
(2) 서열번호2에 기재된 아미노산서열과 60% 이상의 상동성을 가지는 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드.
(3) 서열번호2에 기재된 아미노산서열 또는 그 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드(즉 "인간 JTT-1항원"을 구성하는 폴리펩티드 및 그 유도체).
(4) 서열번호3의 염기번호 26 내지 625에 기재된 염기서열에 의해 코드되는 아미노산서열 또는 그 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드(즉 "인간 JTT-1항원"을 구성하는 폴리펩티드 및 그 유도체).
(5) 서열번호4의 염기번호 35 내지 637에 기재된 염기서열에 의해 코드되는 아미노산서열 또는 그 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드(즉 "래트 JTT-1항원"을 구성하는 폴리펩티드 및 그 유도체).
(6) 서열번호5의 염기번호 1 내지 603에 기재된 염기서열에 의해 코드되는 아미노산서열 또는 그 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드(즉 "마우스 JTT-1항원"을 구성하는 폴리펩티드 및 그 유도체).
(7) 서열번호6의 염기번호 35 내지 685에 기재된 염기서열에 의해 코드되는 아미노산서열 또는 그 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드(즉 "래트 JTT-1항원의 변이체"를 구성하는 폴리펩티드 및 그 유도체).
(8) 국제기탁번호 FERM BP-5725로 식별되는 형질전환체에 도입된 본 발명의 세포표면분자를 구성하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA에 의해 코드되는 아미노산서열 또는 그 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드(즉 "인간 JTT-1항원"을 구성하는 폴리펩티드 및 그 유도체).
여기서 "엄격한 조건하"로서는, 예를 들어 다음과 같은 조건을 들 수 있다.예를 들어 50염기 이상의 프로브를 사용하고, 0.9% NaCl 하에 하이브리다이제이션을 행하는 경우에는, 50%의 해리를 발생하는 온도(Tm)의 표지를 하기 계산식으로부터 구하고, 하이브리다이제이션의 온도를 하기 계산식과 같이 설정할 수 있다.
Tm= 82.3℃+ 0.41×(G+C) % - 500/n - 0.61×(포름아미드) % (n은 프로브의 염기수를 나타낸다. )
온도= Tm - 25℃
또한 100염기 이상의 프로브(G+C= 40~50%의 경우)를 사용하는 경우에는, Tm이 하기 (1) 및 (2) 와 같이 변화하는 것을 표지한다.
(1) 1% 불일치마다, Tm이 약 1℃ 내려간다.
(2) 포름아미드 1%마다, Tm이 0.6∼0.7℃ 내려간다.
따라서 완전상보쇄의 조합의 경우 온도조건은 하기와 같이 할 수 있다.
(A) 65~75℃(포름아미드 무첨가)
(B) 35~45℃(50% 포름아미드존재하)
또한 불완전상보쇄의 조합의 경우 온도조건은 하기와 같이 할 수 있다.
(A) 45~55℃(포름아미드 무첨가)
(B) 35~42℃(30% 포름아미드존재하)
또한 23 염기 이하의 프로브를 사용하는 경우의 온도조건은, 37℃로 하는 것도 가능하고, 또한 하기 계산식을 표지로 하는 것도 할 수 있다.
온도= 2℃×(A+T의 수) + 4℃×(C+G의 수) - 5℃
여기서 "실질적으로 동일한 아미노산서열을 가진다"라는 것은 서열표에 기재된 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드와 실질적으로 동등한 생물학적 성질을 가지는 한, 그 아미노산서열중 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 수식되어 있는 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드, 및 그 아미노산서열에, 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산이 부가된 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하는 것을 의미한다.
이와 같은 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입은 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다(실험의학별책·"유전자공학핸드북" (1992) 등).
예를 들어 합성 올리고뉴클레오티드지정 돌연변이 도입(gapped duplex)법, 아질산 또는 아황산처리에 의해서 무작위로 점돌연변이를 도입하는 방법, Ba131효소 등에 의해 결실변이체를 제작하는 방법, 카셋트변이법, 링커스캐닝법, 미스 인코퍼레이션(mis incorporation)법, 미스매치(mismatch)프라이머법, DNA 세그멘트합성법 등을 들 수 있다.
합성올리고 뉴클레오티드 지정 돌연변이도입(gapped duplex)법은, 예를 들어 하기와 같이 행할 수 있다. 암바변이(amber mutation)를 갖는 M13 파아지벡터에 변이유발을 희망하는 영역을 클로닝하여, 단일가닥(single-stranded) 파아지 DNA를 제조한다. 암바변이를 갖지 않는 M13 벡터의 RFIDNA를 제한효소처리에 의해 선 형상으로 하고, 상기 단일가닥 파아지 DNA와 혼합하여 변성한 뒤, 어닐린시키고, "gapped duplex DNA"를 형성시킨다. 여기에 변이를 도입한 합성 올리고뉴클레오티드를 하이브리다이징시키고, DNA 폴리머라제와 DNA 리가제의 반응에 의해 폐환상이중가닥(double stranded) DNA로 한다. 이 DNA를 불일치 수식능(mismatch repair activity)이 결손하고 있는 대장균 mutS주에 트랜스팩션하여, 증식한 파아지를 서프레서(suppressor)기능이 없는 대장균에 감염시켜, 암바변이를 가지지 않는 파아지만을 선택한다.
또한 아질산에 의한 점돌연변이를 도입하는 방법은, 예를들어 하기와 같은 원리를 이용한다. DNA를 아질산처리하면 염기가 탈아미노화되고, 아데닌은 히포크산틴으로, 시토신은 우라실로, 구아닌은 크산틴이 된다. 탈아미노화된 DNA를 세포에 도입하면, DNA 복제시에 히포크산틴은 시토신과, 우라실은 아데닌과 크산틴은 티민과 염기쌍을 형성하므로 "A:T"가 "G:C"로, "G:C"가"A:T"로 치환된다. 실제로는 아질산 처리한 단일가닥 DNA 단편을 "gapped duplex DNA"로 하이브리다이징시키고, 이하 합성 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이도입(gapped duplex)법과 같이 조작하여 변이주를 분리하면 좋다.
또 본 명세서 또는 도면에 있어서 아미노산을 표기하기 위해서 사용되는 알파벳의 삼문자 또는 일문자는, 각각 다음에 나타내는 아미노산을 의미한다.
(Gly/G) 글리신, (Ala/A) 알라닌, (Val/V) 발린, (Leu/L) 루이신, (Ile/I) 이소루이신, (Ser/S) 세린, (Thr/T) 트레오닌, (Asp/D) 아스파라긴산, (Glu/E) 글루타민산, (Asn/N) 아스파라긴, (Glu/Q) 글루타민, (Lys/K) 리신, (Arg/R) 알기닌, (Cys/C) 시스테인, (Met/M) 메티오닌, (Phe/F) 페닐알라닌, (Tyr/Y) 티로신, (Trp/W) 트립토판, (His/H) 히스티딘, (Pro/P) 프롤린.
전술한 본 발명의 "세포표면분자"를 구성하는 "폴리펩티드"는 세포막을 관통하는 세포막 관통단백이며, 이 세포막관통 폴리펩티드의 1 또는 2에 의해 그 "세포표면분자"가 구성된다.
여기서 "세포막 관통 단백"이라는 것은 많은 수용체 또는 세포막 표면분자에 보이는 바와 같이, 막의 지질 이중층을 1회 또는 수회 관통하는 소수성 펩티드영역에 의해 막과 연결되어, 전체로서 세포외영역(extracellular region), 막관통영역(transmembrane region) 및 세포질영역(cytoplasmic region)의 3가지의 주영역으로 구성되는 구조를 갖는 단백을 가리킨다. 또한 그와 같은 막관통성단백은, 모노머(monomer)로서, 또는 동일한 아미노산서열을 가지는 또 다른 쇄 또는 다른 아미노산서열을 가지는 쇄와 동시에 각각 호모다이머(homodimer), 헤테로다이머(heterodimer) 또는 올리고머(origomer)를 형성하여 존재함에 의해, 각각의 수용체나 세포표면분자를 구성한다.
본 발명의 "폴리펩티드단편"이라는 것은, 앞에서 정의한 본 발명의 "폴리펩티드"의 폴리펩티드단편이며, 바람직하게는 그 폴리펩티드의 세포외영역이다. 그 영역은 필요에 따라 그 N 말단 및/또는 C 말단에 1 내지 5의 아미노산이 부가되어 있더라도 좋다.
여기서 "세포외영역"이라는 것은 전술한 바와 같은 세포막 막관통 단백의 전체구조중, 그 막단백이 연결되어 있는 막의 외계측에 존재하는 부분구조(부분영역)의 전부 또는 일부를 의미하며, 바꾸어 말하면, 막내에 포함되고 있는(incorporated) 영역(막관통 영역) 및 그 막내의 영역에 잇따라 세포질 내에 존재하는 영역(세포내영역) 이외의 영역의 전부 또는 일부를 의미한다.
본 발명에 있어서 "인간의 면역글로블린(Ig)의 중쇄의 정상영역 또는 정상영역의 일부"라는 것은, 전술한 바와 같은 인간유래의 면역글로블린의 중쇄(Heavy Chain, H 쇄)의 정상영역(Constant region), Fc 영역 또는 이들의 일부를 의미한다. 그 면역글로블린은, 어떠한 클라스 및 서브클래스에 속하는 면역글로블린만으로도 좋고, 구체적으로는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), IgM, IgA(IgA1 및 IgA2), IgD 및 IgE를 들 수 있다. 바람직하게는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM 이다. 본 발명에 있어서의 특히 바람직한 예로서는, 인간유래의 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)에 속하는 면역글로블린이다.
면역글로블린은 2개의 상동인 경쇄(Light Chain, L 쇄)와 2개의 상동인 중쇄(Heavy Chain, H 쇄)의 4개의 쇄가, 디술피드결합(S-S 결합)으로 결합한 Y자형의 구조단위를 가진다. 경쇄는 경쇄가변영역(VL) 및 경쇄정상영역(CL)으로부터 구성된다. 중쇄는 중쇄가변영역(VH)으로 중쇄정상영역(CH)으로부터 구성된다.
중쇄정상영역은 클라스(IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE) 및 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)마다 각각 고유의 아미노산서열을 가지는 몇개의 도메인으로 구성된다.
IgG(IgG1, IgG2, IgG3및 IgG4)의 중쇄는 N 말단에서 순차로, VH, CH1 도메인, 힌지영역, CH2 도메인및 CH3 도메인으로 구성되다.
마찬가지로 IgG1의 중쇄는 N 말단에서 순차로, VH, Cγ11 도메인, 힌지영역, Cγ12 도메인 및 Cγ13 도메인으로 구성된다. IgG2의 중쇄는 N 말단에서 순차로, VH, Cγ21 도메인, 힌지영역, Cγ22 도메인 및 C γ23 도메인으로 구성된다. IgG3의 중쇄는 N 말단에서 순차로, VH, Cγ31 도메인, 힌지영역, Cγ32 도메인 및 Cγ33 도메인으로부터 구성된다. IgG4의 중쇄는 N 말단에서 순차로, VH, Cγ41 도메인, 힌지영역, Cγ42 도메인및 Cγ43 도메인으로 구성된다.
IgA의 중쇄는 N 말단에서 순차로, VH, Cα1 도메인, 힌지영역, Cα 2 도메인및 Cα3 도메인으로 구성된다.
마찬가지로 IgA1의 중쇄는 N 말단에서 순차로, VH, Cα11 도메인, 힌지영역, Cα12 도메인 및 Cα13 도메인으로 구성된다. IgA2의 중쇄는 N 말단에서 순차로, VH, Cα21 도메인, 힌지영역, Cα22 도메인 및 Cα23 도메인으로 구성되다.
IgD의 중쇄는 N 말단에서 순차로, VH, Cδ1 도메인, 힌지영역, Cδ2 도메인및 Cδ3 도메인으로 구성된다.
IgM의 중쇄는 N 말단에서 순차로 VH, Cμ1 도메인, Cμ2 도메인, Cμ3 도메인 및 Cμ4 도메인으로부터 구성되며, IgG, IgA 및 IgD에 나타내는 바와 같은 힌지영역을 가지지 않는다.
IgE의 중쇄는 N 말단에서 순차로, VH, Cε1 도메인, Cε2 도메인, Cε3 도메인 및 Cε4 도메인으로부터 구성되며, IgG, IgA 및 IgD에 보이는 바와 같은 힌지영역을 가지지 않는다.
또한 IgG를 예로 들면 IgG를 파파인(papain)으로 처리하면, 2개의 중쇄를 연결시키고 있는 힌지영역중에 존재하는 디술피드결합의 약간 N 말단측에서 절단되어, VH 및 CH1으로 이루어지는 중쇄단편과 하나의 경쇄가 디술피드결합으로 연결된 2개의 상동인 Fab 및 힌지영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 이루어지는 2개의 상동인 중쇄단편이 디술피드결합으로 연결된 하나의 Fc를 발생하는(이상, "면역학일러스트레이티드(Illustrated)", 원서 제2판, 제65∼75페이지, 1992년, 난코도 발행, 및 "최신의과학의 초점" 면역계의 인식기구"", 제4 ∼7페이지, 1991년, 난코도 발행 등 참조).
즉, 본 발명에 있어서 "면역글로블린의 중쇄의 정상영역의 일부"라는 것은 상술한 바와 같이 구조적 특징을 가지는 면역글로블린의 중쇄의 정상영역 일부를 의미하여, 바람직하게는 C1 도메인을 결하는 정상영역 또는 Fc 영역이다. 구체적으로는 IgG, IgA 또는 IgD의 경우에는, 각각의 힌지영역, C2 도메인 및 C3 도메인으로 이루어지는 영역을 들 수 있으며, IgM 또는 IgE의 경우에는, 각각 C2 도메인, C3 도메인 및 C4 도메인으로 이루어지는 영역을 들 수 있다. 특히 바람직한 예로서는, 인간 유래의 IgG1의 Fc 영역을 들 수 있다.
본 발명의 "융합폴리펩티드"라는 것은 상기 정의한 바와 같이 본 발명의 "세포표면분자"를 구성하는 "폴리펩티드"의 세포외영역과 "인간의 면역글로블린(Ig)의 중쇄의 정상영역 또는 정상영역의 일부"로부터 된 융합폴리펩티드이다. 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 세포외영역과 인간 IgG의 중쇄의 정상영역의 일부와의 융합폴리펩티드이며, 특히 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 세포외영역과 인간 IgG의 중쇄의 힌지영역, CH2 도메인및 CH3 도메인으로 이루어지는 영역(Fc)과의융합폴리펩티드이다. 또, IgG로서는 IgG1이 바람직하다. 또한 본 발명의 폴리펩티드로서는 인간, 마우스 또는 래트(바람직하게는 인간)에서 유래하는 폴리펩티드가 바람직하다.
본 발명의 융합폴리펩티드는 전술한 바와 같은 IgG 등의 면역글로린의 정상영역의 일부(예컨데, Fc)를 융합파트너로서 가지는 것으로부터, 그 면역글로블린 단편에 특이적으로 결합한다고 하는 프로테인 A의 성질을 사용한 어피니티컬럼 크로마토그래피를 사용함에 따라 그 융합폴리펩티드를 매우 용이하게 정제하는 것이 가능하다라는 점에서 이점을 가진다. 또한 여러 가지 면역글로블린의 Fc 에 대한 여러 가지 항체가 제공되고 있는 것으로부터, 그 Fc에 대한 항체를 사용하여, 그 융합폴리펩티드의 이뮤노어세이를 간편하게 행할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드, 폴리펩티드단편 및 융합폴리펩티드는, 후술하는 바와 같은 유전자조합 기술 외에, 화학적 합성법, 세포 배양방법 등과 같은 그 기술적 분야에서 알려진 공지의 방법 또는 그 수식방법을 적절하게 사용함에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 "유전자"는, 전술한 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드단편을 코드하는 DNA로 이루어지는 유전자로서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드단편을 코드할 수 있는 어떠한 염기서열을 가지는 유전자도 포함한다.
구체적인 태양으로서는 하기 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드단편을 코드하는 유전자이다.
(1) 서열번호1에 기재된 염기서열로 된 DNA에 엄격한 조건하에 하이브리다이징하는 DNA에 의해 코드되는 폴리펩티드.
(2) 서열번호2에 기재된 아미노산서열과 60% 이상의 상동성을 가지는 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드.
(3) 서열번호2에 기재된 아미노산서열 또는 그 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드(즉, "인간 JTT-1항원"을 구성하는 폴리펩티드 및 그 유도체).
(4) 서열번호3의 염기번호 26내지 625에 기재된 염기서열에 의해 코드되는 아미노산서열 또는 그 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드(즉 "인간 JTT-1항원"을 구성하는 폴리펩티드 및 그 유도체).
(5) 서열번호4의 염기번호 35내지 637에 기재된 염기서열에 의해 코드되는 아미노산서열 또는 그 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드(즉 "래트 JTT-1항원"을 구성하는 폴리펩티드 및 그 유도체).
(6) 서열번호5의 염기번호 1 내지 603에 기재된 염기서열에 의해 코드되는 아미노산서열 또는 그 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드(즉 "마우스 JTT-1항원"을 구성하는 폴리펩티드 및 그 유도체).
(7) 서열번호6의 염기번호 35 내지 685에 기재된 염기서열에 의해 코드되는 아미노산서열 또는 그 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드(즉 "래트 JTT-1항원의 변이체"를 구성하는 폴리펩티드 및 그 유도체).
(8) 국제기탁번호 FERM BP-5725로 식별되는 형질전환체에 도입된 본 발명의 세포표면분자를 구성하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA에 의해 코드되는 아미노산서열 또는 그 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드(즉, "인간 JTT-1항원"을 구성하는 폴리펩티드 및 그 유도체).
여기서 "실질적으로 동일한 아미노산서열을 가진다"라는 것은 상기에 정의한 바와 같은 의미를 가진다.
또한 구체적인 태양으로서는 하기 DNA 또는 그 단편을 들 수 있다.
(1) 서열번호1에 기재된 염기서열로 된 DNA, 및 그 DNA에 엄격한 조건하에서 하이브리다이징하는 DNA.
(4) 서열번호3의 염기번호 26 내지 625에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA.
(5) 서열번호4의 염기번호 35 내지 637에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA.
(6) 서열번호5의 염기번호 1 내지 603에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA.
(7) 서열번호6의 염기번호 35 내지 685에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA.
(8) 국제기탁번호 FERM BP-5725로 식별되는 형질전환체에 도입된 본 발명의 세포표면분자를 구성하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA.
또한 본 발명에 있어서 융합폴리펩티드의 일부인 면역글로블린의 중쇄의 정상영역의 일부를 코드하는 DNA로서는, cDNA만으로도 좋고, 또한 각 엑슨(예를 들어, CH1 도메인, 힌지영역, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인 등을 코드하는 DNA)의 사이에 인트론을 포함하는 게노믹DNA이어도 좋다.
본 발명에 있어서는, 동일한 아미노산을 코드하는 코돈이라면 어떠한 코돈으로 구성되는 DNA를 함유한다.
또한 본 발명의 DNA는 어떠한 방법으로 수득할 수 있는 것이라도 좋다. 예를들어 mRNA에서 제조되는 상보 DNA(cDNA), 게놈 DNA에서 조제되는 DNA, 화학합성에 의해서 수득할 수 있는 DNA, RNA 또는 DNA를 주형으로서 PCR법으로 증폭시켜 수득할 수 있는 DNA 및 이들 방법을 적당히 조합하여 구축되는 DNA도 모두 포함하는 것이다.
본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA는, 통상의 방법에 따라서 본 발명의 폴리펩티드의 mRNA에서 cDNA를 클론화하는 방법, 게놈 DNA를 단리하여 스플라이싱 처리하는 방법, 화학합성하는 방법 등에 의해 취득할 수 있다.
(1) 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 mRNA에서 cDNA를 클론화하는 방법으로서는 이하의 방법이 예시된다.
우선 본 발명의 세포표면분자(폴리펩티드)를 발현·생성하는 조직 또는 세포(예를 들어 흉선세포나 ConA 자극한 비장유래 임파아구세포로부터 그 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 mRNA를 제조한다. mRNA의 제조는 예를 들어 구아니딘티오시아네이트법(Chirgwin J.M. et al, Biochemistry, Vol.18, p.5294, 1979), 열 페놀법 또는 AGPC 법 등의 공지의 방법을 사용하여 제조한 전RNA를 올리고(dT)셀룰로오스나 폴리 U-세팔로스 등에 의한 어피니티 크로마토그래피함에 따라 행할 수 있다.
이어서 수득된 mRNA를 주형으로서, 예를 들어 역전사효소를 사용하는 등의 공지의 방법, 예를 들어 오카야마 등의 방법(몰레큘라셀바이올로지(Mol.Cell.Biol.), 제2권, 제161페이지, 1982년 및 동지 제3권, 제280페이지, 1983년)이나 호프만(Hoffman)등의 방법(진(Gene), 제25권,제263페이지, 1983년)등에 의해 cDNA쇄를 합성하고, cDNA의 이중가닥 cDNA로의 변환을 행한다. 이 cDNA를 플라스미드 벡터, 파아지 벡터 또는 코스미드벡터를 갖는 대장균을 형질전환하여, 또는 in vitro 팩키징 후, 대장균에 형질이입(트랜스펙트)함에 의해 cDNA 라이브러리를 제작한다.
여기서 사용되는 플라스미드 벡터로서는, 숙주내에서 복제유지되는 것이면 특히 제한되지 않고, 또한 사용되는 파아지 벡터로서도 숙주내에서 증식할 수 있는 것이면 좋다. 통상의 방법에서 사용되는 클로닝용 벡터로서 pME18S, λZAPII(lZAPII), pUC19, λgt10, λgt11 등이 예시된다. 단 후술한 면역학적 스크리닝에 이바지하게 하는 경우는, 숙주내에서 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터를 가지는 벡터인 것이 바람직하다.
플라스미드에 cDNA를 삽입한 방법으로서는 예를 들어 마니아티스(Maniatis)등의 방법(몰레큘라클로닝, 아·라보라토리·매뉴얼(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition), 콜드스프링 하보 라보라토리(Cold Spring Harbor Laboratory), 제1.53페이지, 1989년) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다. 또한 파아지 벡터에 cDNA를 짜넣은 방법으로서는, 휸(Hyunh) 등의 방법(DNA 클로닝, 플랙티컬 어프로치(DNA Cloning, a practical approach), 제1권, 제49페이지, 1985년) 등을 들 수 있다. 간편하게는 시판중인 클로닝 키트(예를 들어, 다까라주조제 등)를 사용하는 것도 가능하다. 이와 같이 하여 수득되는 재조합 플라스미드나 파아지 벡터는, 원핵세포(예를 들어, E.coli:XL1Blue MRF', DH5α, HB101 또는 MC1061/P3 등) 등의 적당한 숙주에게 도입된다.
플라스미드를 숙주에게 도입하는 방법으로서는, (몰레큘라 클로닝, 아·라보라토리·매뉴얼(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition), 콜드스프링 Harbor laboratory(Cold Spring Harbor Laboratory), 제1.74페이지, 1989년)에 기재된 염화칼슘법 또는 염화칼슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션(electroporation)법 등을 들 수 있다. 또한 파아지 벡터를 숙주에게 도입하는 방법으로서는 파아지 DNA를 in vitro 팩키징한 후, 증식시킨 숙주에게 도입하는 방법 등이 예시된다. in vitro 팩키징은, 시판의 in vitro 팩키징키트(예를 들어, 스트라타진(Stratagene)제, 아마샴(Amersham)제 등)을 사용함에 따라 간편하게 행할 수 있다.
상기한 방법에 의해서 제작된 cDNA 라이브러리로부터, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 cDNA를 단리하는 방법은, 일반적인 cDNA 스크리닝법을 조합하여 행할 수 있다.
예를 들어, 별개로 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산서열에 대응한다고 생각되는 올리고뉴클레오티드를 화학합성한 후, 이것을32P에서 라벨하여 프로브로 하고, 공지의 콜로니(colony)하이브리다이제이션법(크란슈타인(Crunstein) 등 , 프로시딩 내셔널 오브 사이언스(Proc. Natl. Acid. Sci. USA), 제72권, 제3961페이지, 1975년) 또는 플라크하이브리다이제이션법(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition , Cold Spring Harbor Laboratory, 제2.108 페이지, 1989년)에 의해, 원하는 cDNA를 함유하는 클론을 스크리닝하는 방법, PCR 프라이머를제작하여 본 발명의 폴리펩티드의 특정영역을 PCR법에 의해 증폭하고, 그 영역을 코드하는 DNA 단편을 가지는 클론을 선택하는 방법 등을 들 수 있다.
또한 cDNA를 발현할 수 있는 벡터(예를 들어, λZAPII 파아지 벡터)를 사용하여 제작한 cDNA 라이브러리를 사용하는 경우에는 본 발명의 폴리펩티드에 반응성을 가지는 항체를 사용하는 항원 항체 반응을 이용하여, 원하는 클론을 선택할 수 있다. 대량으로 클론을 처리하는 경우에는, PCR 법을 이용한 스크리닝법을 사용하는 것이 바람직하다.
이렇게 하여 수득된 DNA의 염기서열은 마키샴·길버트법(마키샴(Maxam) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 제74권, 제560페이지, 1977년) 또는 파아지 M13을 사용한 디데옥시뉴클레오티드 합성쇄 정지의 방법(산가(Sanger) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 제74권, 제5463∼5467페이지, 1977년)에 의해서 결정할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 유전자는 그 전부 또는 일부를 상기한 바와 같이 하여 얻어지는 클론으로부터 제한효소 등에 의해 잘라냄으로써 얻을 수 있다.
(2) 또한 전술한 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 유래하는 게놈 DNA에서 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 단리함에 의한 조제방법으로서는, 예를 들어 이하의 방법이 예시된다.
그 세포를 바람직하게는 SDS 또는 프로테나아제K 등을 사용하여 용해하고, 페놀에 의한 추출을 반복하여 DNA의 탈단백질을 행한다. RNA를 바람직하게는 리보뉴클레아제에 의해 소화한다. 얻어지는 DNA를 적당한 제한효소에 의해 부분소화하고, 얻어지는 DNA 단편을 적당한 파아지 또는 코스미드로 증폭하여 라이브러리를 작성한다. 그리고 원하는 서열을 가지는 클론을 예를 들어 방사성 표지된 DNA 프로브를 사용하는 방법 등에 의해 검출하여, 그 클론으로부터 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 전부 또는 일부를 제한효소 등에 의해 잘라내어 취득한다.
인간유래의 폴리펩티드를 코드하는 cDNA를 취득하는 경우에는, 또한 인간 게놈 DNA(염색체 DNA)가 도입된 코스미드라이브러리를 제작("라보매뉴얼 인간 게놈맵핑", 마루젠출판)하고, 그 코스미드라이브러리 스크리닝함에 의해, 목적 프로테인의 코딩영역의 DNA를 함유하는 양성 클론을 수득하고, 그 양성 클론으로부터 잘라낸 코딩 DNA를 프로브로서 사용하여, 전술한 cDNA 라이브러리를 스크리닝함에 의해 제조할 수도 있다.
(3) 또한 화학적 합성에 의한 본 발명의 DNA의 제조는, 서열번호1,3,4,5 또는 6에 기재되는 염기서열을 바탕으로 하며, 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다.
또한 본 발명은 상술한 본 발명의 세포표면분자(폴리펩티드)를 코드하는 DNA를 함유하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 벡터로서는, 원핵세포 및/또는 진핵세포의 각종 숙주내에서 복제유지 또는 자기증식할 수 있는 것이라면 특히 제한되지 않고, 플라스미드 벡터 및 파아지 벡터가 포함된다.
그 재조합 벡터는, 간편하게는 당업계에서 입수가능한 재조합용 벡터(플라스미드 DNA 및 박테리아파아지 DNA)에 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 통상의 방법으로 연결함으로써 제조할 수 있다. 사용되는 재조합용 벡터로서 구체적으로는, 대장균 유래의 플라스미드로서 예를 들어 pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC19 등, 효모유래 플라스미드로서 예를 들어 pSH19, pSH15 등, 고초균 유래 플라스미드로서 예를 들어 pUB110, pTP5, pC194등이 예시된다. 또한 파아지로서는, λ 파아지 등의 박테리오파아지가, 또한 레트로바이러스, 종두바이러스(vaccinia virus), 핵다각체 바이러스 등의 동물이나 곤충의 바이러스(pVL1393, in vitro 진제)가 예시된다.
본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 발현시켜 본 발명의 폴리펩티드를 생산시키는 목적에 있어서는, 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 원핵세포 및/또는 진핵세포의 각종 숙주세포중에서 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 발현하고, 이들 단백질을 생산하는 기능을 가지는 것이면 특히 제한되지 않는다. 예를 들어 pEFneo(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 158-162, 1994), pEF-BOS(Nucleic Acid Research, 18, 5322, 1990), pME18S(실험의학별책 "유전자공학핸드북", 1992년 등) 또는 pMAL C2 등을 들 수 있다.
숙주세포로서 세균, 특히 대장균을 사용하는 경우, 일반적으로 발현 벡터는 적어도 프로모터/오퍼레이터영역, 개시코돈, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 종지코돈, 터미네이터영역 및 복제가능단위로 구성된다.
숙주으로서 효모, 동물세포 또는 곤충세포를 사용하는 경우, 발현 벡터는 적어도 프로머터, 개시코돈, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA, 종지코돈을 함유하고 있는 것이 바람직하다. 또한 시그널 펩티드를 코드하는 DNA, 인핸서서열, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역영역, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐레이션(polyadenylation)부위, 선택마커 영역 또는 복제가능 단위 등을 함유하고 있더라도 좋다. 또한 목적에 따라서 보통사용되는 유전자증폭유전자(마커)를 함유하고 있더라도 좋다.
세균속에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위한 프로모터/오퍼레이터영역은, 프로모터, 오퍼레이터 및 Shine-Dalgarno(SD)서열(예를 들어, AAGG 등)을 함유하는 것이다. 예를 들어 숙주가 에스케리히아속인 경우, 적합하게는 Trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, tac 프로모터 등을 함유하는 것이 예시된다. 효모속에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위한 프로모터로서는, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터를 들 수 있고, 숙주가 간균(Bacillus)인 경우는, SL01 프로모터, SP02 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다. 또한 숙주가 포유동물세포 등의 진핵세포인 경우, SV40 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 히트쇼크 프로모터, EF 프로모터 등을 들 수 있다. 바람직하게는 SV-40, SRα, 레트로바이러스이다. 그러나 특히 이들에 한정되는 것이 아니다. 또한 발현에는 인핸서의 이용도 효과적인 방법이다.
적합한 개시 코돈으로서는, 메티오닌코돈(ATG)이 예시된다.
종지 코돈으로서는, 상용의 종지코돈(예를 들어, TAG, TGA, TAA 등)이 예시된다.
터미네이터영역으로서는, 보통 사용되는 천연 또는 합성의 터미네이터를 사용할 수 있다.
복제가능단위라는 것은 숙주세포속에서 그 전DNA 서열을 복제할 수 있는 능력을 갖는 DNA를 말하고, 천연의 플라스미드, 인공적으로 수식된 플라스미드(천연의 플라스미드로부터 제조된 DNA 프래그먼트) 및 합성플라스미드 등이 포함된다.적합한 플라스미드로서는, E. coli에서는 플라스미드 pBR322, 또는 그 인공적 수식물(pBR322을 적당한 제한효소로 처리하여 수득되는 DNA 프래그먼트)가, 효모로서는 효모2μ플라스미드, 또는 효모염색체 DNA가, 또한 포유동물세포로서는 플라스미드 pEFneo, pME18S, pRSVneo ATCC 37198, 플라스미드 pSV2dhfr ATCC 37145, 플라스미드 pdBPV-MMTneo ATCC 37224, 플라스미드 pSV2neo ATCC 37149등을 들 수 있다.
인핸서서열, 폴리아데닐레이션 부위 및 스플라이싱 접합부위에 있어서는, 예를 들어 각각 SV40에 유래하는 것 등, 당업자에 있어서 보통 사용되는 것을 사용할 수 있다.
선택마커로서는, 보통 사용되는 것을 통상의 방법에 의해 사용할 수 있다. 예를 들어 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 또는 카나마이신 등의 항생 물질 내성유전자 등 또는 티미딘키나제유전자가 예시된다.
유전자증폭유전자로서는, 디히드로엽산리덕타제(DHFR)유전자, 티미딘키나제 유전자, 네오마이신 내성유전자, 글루타민산 합성효소유전자, 아데노신 디아미나아제(deaminase) 유전자, 오르니틴 디카르복실라아제유전자, 히글로마이신B-포스포트랜스퍼라아제 유전자, 아스파테이트 트랜스카바밀라제(aspartate transcarbamylase) 유전자 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 적어도 상술한 프로모터, 개시코돈, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA(유전자), 종지코돈 및 터미네이터영역을 연속적 또한 고리 형상에 적당한 복제가능단위에 연결함으로써 조제할 수 있다. 또한 이때 필요에 따라 제한효소에서의 소화나 T4 DNA 리가제를 사용하는 라이게이션 등의 통상의 방법에 의해 적당한 DNA 프래그먼트(예를 들어, 링커, 다른 리스트릭션사이트 등)을 사용할 수 있다.
본 발명의 형질전환세포는, 상술한 발현 벡터를 숙주세포에 도입함에 의해 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 숙주세포로서는, 상기한 발현 벡터에 적합하고, 형질전환될 수 있는 것이면 특히 한정되지 않고, 본 발명의 기술분야에서 보통사용되는 천연세포 또는 인공적으로 수립된 재조합세포 등 여러 가지 세포(예를 들어, 세균(에스케리히아속, 간균), 효모(효모균속(Saccharomyces), 피키아속(Pichia 등), 동물세포 또는 곤충세포 등)이 예시된다.
바람직하게는 대장균 또는 동물세포이며, 구체적으로는 대장균(DH5α, XL1Blue MRF', TB1, HB101 등), 마우스유래세포(COP, L, C127, Sp2/0, NS-1또는 NIH3 T3등), 래트유래세포, 햄스터유래세포(BH K, CHO-K1 및 CHO 등),원숭이유래세포(COS1, COS3, COS7, CV1 및 Velo 등) 및 인간유래세포(HEK293, Hela, 2배체 섬유아세포(diploid fibroblast)에 유래하는 세포, 미에로마 세포 및 Namalwa 등) 등이 예시된다.
발현 벡터의 숙주세포에의 도입(형질전환(형질이입))은 종래 공지의 방법을 사용하여 행할 수 있다.
예를 들어, 세균(E.coli, Bacillus subtilis 등)의 경우는, 예를 들어 Cohen 등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 제69권, 제2110페이지, 1972년), 프로토플라스트법(Mol. Gen. Genet., 제168권, 제111페이지, 197 9년)이나 콤피텐트법(저널오브몰레큘라바이올로지(J. Mol. Biol.), 제56권, 제209페이지, 1971년)에 의해서, Saccharomyces cerevisiae의 경우는, 예를 들어 하이넨(Hinnen) 등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 제75권, 제1927페이지, 1978년)이나 리튬법(J. Bacteriol., 제153권, 제163페이지, 1983년)에 의해서, 동물세포의 경우는, 예를 들어 그라함(Graham)의 방법(바이롤로지(Virology),제52권, 제456페이지, 1973년), 곤충세포의 경우는, 예를 들어 사마즈(Summers)등의 방법(Mol. Cell. Biol., 제3권, 제2156~제2165페이지, 1983년)에 의해서 각각 형질전환할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는, 상기한 바와 같이 조제되는 발현 벡터를 함유하는 형질전환세포(이하, 형질이입체를 포함하는 의미로 사용한다.)를 영양배지로 배양함으로써 제조할 수 있다.
영양배지는 숙주세포(형질전환체)의 생육에 필요한 탄소원, 무기질소원 또는 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로서는, 예를 들어 글루코오스, 덱스트란, 가용성전분, 자당 등이, 무기질소원 또는 유기질소원으로서는, 예를 들어 암모니움염류, 질산염류, 아미노산, 콘스티프·리쿼, 펩톤, 카제인, 고기추출물, 대두백, 감자추출액 등이 예시된다. 또한 필요에 따라 다른 영양소(예를 들어, 무기염(예를 들어 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘), 비타민류, 항생 물질(예를 들어 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신 등) 등)을 함유하고 있더라도 좋다.
배양은 당업계에서 알려져 있는 방법에 의해 행해진다. 배양조건, 예를 들어 온도, 배지의 pH 및 배양시간은, 본 발명의 폴리펩티드가 대량으로 생산되도록 적절하게 선택된다.
또 하기에 숙주세포에 따라서 사용되는 구체적인 배지 및 배양조건을 예시하지만, 전혀 이들에 한정되는 것이 아니다.
숙주가 세균, 방선균, 효모, 사상균인 경우, 예를 들어 상기 영양원을 함유하는 액체배지가 적당하다. 바람직하게는 pH가 5∼8인 배지이다.
숙주가 E. coli의 경우, 바람직한 배지로서 LB배지, M9배지(밀러(Miller)등, Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, 제431페이지, 1972년)등이 예시된다. 이러한 경우 배양은 필요에 따라 통기, 교반하면서, 보통14~43℃, 약3~24시간 행할 수 있다.
숙주가 Bacillus 속균의 경우, 필요에 따라 통기, 교반을 하면서, 보통 30~40℃, 약16~96시간 행할 수 있다.
숙주가 효모인 경우, 배지로서 예를 들어 Burkholder 최소배(보스티안(Bostian), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제77권, 제4505페이지, 1980년)을 들 수 있고, pH는 5~8인 것이 바람직하다. 배양은 보통 약20∼35℃에서 약14~144시간 행하여지며, 필요에 따라 통풍이나 교반을 행하는 것도 가능하다.
숙주가 동물세포의 경우, 배지로서 예를 들어 약5~20%의 태아소혈청을 함유하는 MEM 배지(사이언스(Science), 제122권, 제501페이지, 1952년), DMEM 배지(바이롤로지(Virology), 제8권, 제396페이지, 1959년), RPMI1640배지(J. Am. Med. Assoc., 제199권, 제519페이지, 1967년), 199배지(proc. Soc. Exp. Biol. Med., 제73권, 제1페이지, 1950년) 등을 사용할 수 있다. 배지의 pH는 약6~8인 것이 바람직하고, 배양은 보통 약30~40℃에서 약15~72시간 행하여지며, 필요에 따라 통풍이나 교반을 행하는 것도 가능하다.
숙주가 곤충세포의 경우, 예를 들어 태아소혈청을 함유하는 Grace's 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제82권, 제8404페이지, 1985년) 등을 들 수 있고, 그 pH는 약5~8인 것이 바람직하다. 배양은 보통 약20~40℃에서 15~100시간 행하여지며, 필요에 따라 통풍이나 교반을 행하는 것도 가능하다.
본 발명의 폴리펩티드는, 상술한 바와 같이 형질전환세포, 특히 동물세포를 배양함에 의해, 그 세포표면에 목적분자를 고발현시키는 것이 가능하다.
한편, 본 발명의 폴리펩티드를, 세포외영역단편같은 가용성폴리펩티드단편으로서 제조하는 경우에는, 그 세포외영역 또는 각 도메인을 코드하는 DNA를 사용하여 상술한 바와 같이 형질전환체를 제조하여, 외형질 전환체를 배양함에 의해 배양상청중에 분비시킴으로써 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합폴리펩티드에 대해서도 마찬가지로 하여 제작할 수 있다.
즉 수득된 배양물을 여과 또는 원심분리 등의 방법으로 배양여액(상청)을 수득하고, 그 배양여액으로부터 천연 또는 합성단백질을 정제 및 단리하기위해서 일반적으로 사용되는 통상의 방법에 따라서 그 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드단편을 정제, 단리한다.
단리, 정제방법으로서는, 예를 들어 염석, 용매침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외여과, 겔여과, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔전기영동 등 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마트그래피나 히드록실아파타이트크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상고속액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 전기영동 등의 등전점의 차이를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.
한편, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드단편이 배양된 형질전환체의 외질(periplasm) 또는 세포질 내에 존재하는 경우는, 배양물을 여과 또는 원심 분리등의 통상의 방법에 부가하여 균체 또는 세포를 모으고, 적당한 완충액에 현탁하여, 예를 들어 초음파나 리소짐(lysozyme) 및 동결융해 등의 방법으로 세포 등의 세포벽 및/또는 세포막을 파괴한 뒤, 원심 분리나 여과 등의 방법으로 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 막 획분을 수득한다. 그 막획분을 트라이톤-X100 등의 계면활성제를 사용하여 가용화하여 조용액을 수득한다. 그리고, 그 조용액을 먼저 예시했던 것 같은 통상의 방법을 사용하는 함에 따라 단리, 정제할 수 있다.
본 발명에 있어서의 "형질전환마우스"는, 상술한 바와 같은 방법에 따라서 제조할 수 있는 본 발명의 마우스 이외의 동물종의 폴리펩티드(비자기의 폴리펩티드)를 코드하는 DNA(cDNA 또는 게노믹DNA)가 마우스의 내재성 유전자 자리상에 인테그레이트(integrate)되어 있는 형질전환마우스이며, 그 형질전환 마우스는, 체내에 그 비자기의 폴리펩티드를 발현, 분비한다.
그 형질전환마우스는, 형질전환동물의 제조에 있어서 보통 사용되는 것 같은 통상의 방법(예를 들어, 최신 동물세포실험매뉴얼, 엘·알·씨발행, 제7장, 제361∼제408페이지, 1990년을 참조)에 따라서 제작하는 것이 가능하다.
구체적으로는, 예를 들어, 정상마우스배반포(blastcyst)로부터 취득한 배성간세포(Embryonic Stem Cell, ES Cell)를, 예를 들어, 인간유래의 본 발명의 폴리펩티드(즉 "인간 JTT-1항원")을 코드하는 유전자가 발현가능하도록 삽입된 발현 벡터에서 형질전환한다. 그 본 발명의 인간유래의 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 내재성 유전자상에 포함된 ES 세포를 통상의 방법에 의해 선별한다. 이어서 선별한 ES 세포를, 별도의 정상마우스로부터 취득한 수정란(폐반포)에 마이크로인젝션한다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.12, pp.7380-7384, 1980; 미국특허 제4,873,191호 공보). 그 배반포를 양모로서의 별도의 정상마우스의 자궁에 이식한다. 그렇게 하여 그 양모(foster mother)마우스로부터, 파운다마우스(founder mice)(자마우스)가 태어난다. 그 파운다마우스를 정상마우스와 교배시킴으로써 헤테로형질전환마우스를 수득한다. 그 헤테로(heterogeneic)형질전환마우스끼리를 교배함에 의해, 멘델의 법칙에 따라서, 호모(homogeneic)형질전환마우스를 얻을 수 있다.
본 발명의 "노크아웃마우스"는, 마우스 유래의 본 발명의 폴리펩티드(즉 "마우스 JTT-1항원)을 코드하는 내재성유전자가 노크아웃(불활성화)된 마우스이며, 예를 들어 상동재조합을 응용한 포지티브네가티브셀렉션법을 사용하여 제작할 수 있다(미국특허 제5,464,764호 공보, 동5,487,992호 공보, 동5,627,059호 공보, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.86, 8932-8935, 1989, Nature, Vol.342, 435-438, 1989등).
본 발명에 있어서의 "항체"란, 폴리클로날항체(항혈청) 또는 모노클로날항체를 의미하고, 바람직하게는 모노클로날항체이다.
구체적으로는, 전술한 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드단편에 반응성을 가지는 항체이다.
본 발명의 "항체"는, 본 발명의 "세포표면분자"를 발현하는 세포(천연의 세포, 주화세포, 종양세포 등), 유전자재조합기술을 사용하여 제작되는 본 발명의 폴리펩티드 또는 세포표면분자를 그 세포표면에 고발현시킨 형질전환체, 또는 본 발명의 "폴리펩티드단편" 또는 "융합폴리펩티드"를 항원으로서, 그항원을 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 또는 토끼 등의 포유동물에게 면역하여 수득되는 천연형항체, 유전자재조합기술을 사용하여 제조할 수 있는 키메라항체 및 인간형항체(CDR-grafted 항체), 및 인간항체생성 형질전환동물 등을 사용하여 제조할 수 있는 인간항체도 포함한다.
또한 모노클로날항체의 경우에는, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 등의 어느쪽 아이소타입을 가지는 모노클로날항체도 포함한다. 바람직하게는, IgG 또는 IgM 이다.
본 발명에서 말하는 폴리클로날항체(항혈청) 또는 모노클로날항체는, 기존의 일반적인 제조방법에 의해서 제조할 수 있다. 즉 예를 들어 전술한 바와 같은 항원을 필요에 따라서 프로인트 어쥬반트(Freund's Adjuvant)와 함께, 포유동물, 바람직하게는, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 염소, 말 또는 소, 보다 바람직하게는 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 또는 토끼에 면역한다.
폴리클로날항체는, 그 면역감작동물로부터 수득한 혈청으로부터 취득할 수 있다.또한 모노클로날항체는, 그 면역감작동물로부터 수득한 그 항체생성세포와 자기항체생성능이 없는 골수종계세포(미에로마세포)로부터 하이브리도마를 조제하여, 그 하이브리도마를 클론화하고, 포유동물의 면역에 사용한 항원에 대하여 특이적 친화성을 나타내는 모노클로날항체를 생성하는 클론을 선택함으로써 제조된다.
모노클로날항체는, 구체적으로는 하기와 같이 하여 제조할 수 있다. 즉, 전술한 바와 같은 항원을 면역원으로 하여, 그 면역원을 필요에 따라서 프로인트 아쥬반트(Freund' s Adjuvant)와 함께, 비인간포유동물, 구체적으로는 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트 또는 토끼, 바람직하게는 마우스, 래트 또는 햄스터(후술하는 인간항체생성형질전환마우스같은 다른 동물유래의 항체를 생성하도록 작출된(generated) 형질전환동물을 함유한다)의 피하내, 근육내, 정맥내, 푸드패드(footpad)내 또는 복강내에 1 내지 수회 주사하거나 또는 이식함에 의해 면역감작을 실행한다. 보통 첫회면역으로부터 약 1 내지 14일 마다 1 내지 4회 면역을 행하여, 최종면역보다 약 1 내지 5일 후에 면역감작된 그 포유동물로부터 항체생성세포가 취득된다. 면역을 실행하는 회수 및 시간적 간격은, 사용하는 면역원의 성질 등에 의해 적절하게 변경할 수 있다. 모노클로날항체를 분비하는 하이브리도마의 조제는, 쾨일러(Kohler) 및 밀슈타인 등의 방법(네이쳐(Nature), 제256권, 제495~제497페이지, 1975년) 및 여기에 준하는 수식방법에 따라서 행할 수 있다. 즉 전술의 바와 같이 면역감작된 비인간포유동물로부터 취득되는 비장, 임파관절, 골수 또는 편도 등, 바람직하게는 비장에 포함되는 항체생성세포와, 바람직하게는 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유동물, 보다 바람직하게는 마우스, 래트 또는 인간유래의 자기항체생성능이 없는 미에로마세포와의 세포융합시킴으로써 조제된다.
세포융합에 사용되는 미에로마세포로서는, 예를 들어 마우스유래 미에로마P3/X63-AG8.653(653), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1), P3/X63-Ag8.U1(P3 U1), SP2/0-Ag14(Sp2/O, Sp2), PAI, F0 또는 BW5147, 래트 유래 미에로마 210 RCY3-Ag.2.3., 인간유래 미에로마 U-266 AR1, GM1500-6 TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1 R11 또는 CEM-T15을 사용할 수 있다.
모노클로날항체를 생성하는 하이브리도마의 스크리닝은, 하이브리도마를, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트중에서 배양하고, 증식이 보인 웰의 배양상청의 전술한 면역감작에서 사용한 면역항원에 대한 반응성을, 예를 들어 RIA나 ELISA 등의 효소면역측정법에 의해서 측정함에 의해 행할 수 있다.
하이브리도마부터의 모노클로날항체의 제조는, 하이브리도마를 in vitro, 또는 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터 또는 토끼 등, 바람직하게는 마우스 또는 래트, 보다 바람직하게는 마우스의 복수중 등에서의 in vivo로 행하여, 얻어진 배양상청, 또는 포유동물의 복수로부터 단리함에 의해 행할 수 있다.
in vitro로 배양하는 경우에는, 배양하는 세포종의 특성, 시험연구의 목적및 배양방법 등의 여러 가지 조건에 맞춰, 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시켜, 배양상청중에 모노클로날항체를 생성시키기 위해서 사용되는 바와 같은 기지 영양배지 또는 기지의 기본배지로부터 유도조제되는 모든 영양배지를 사용하고 실시하는 것이 가능하다.
기본배지로서는, 예를 들어, Ham' F12배지, MCDB153 배지 또는 저칼슘 MEM 배지 등의 저칼슘배지 및 MCDB104배지, MEM배지, D-MEM배지, RPMI1640배지, ASF104배지 또는 RD 배지 등의 고칼슘배지 등을 들 수 있으며, 그 기본배지는, 목적에 따라서, 예를 들어 혈청, 호르몬, 사이토카인 및/또는 여러 가지 무기 또는 유기물질 등을 함유할 수 있다.
모노클로날항체의 단리, 정제는, 상술한 배양상청 또는 복수를, 포화황산암모늄, 유글로블린침전(euglobulin)법, 카프로인산법, 카프릴산법, 이온 교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52등), 항 이뮤노글로블린컬럼 또는 프로테인 A 컬럼 등의 어피니티 컬럼크로마토그래피에 제공하는 것 등에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 모노클로날항체로서는, 바람직하게는 하기의 모노클로날항체를 들 수 있다.
(1) 서열번호2에 기재되는 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드, 그 폴리펩티드에 유래하는 폴리펩티드단편 또는 그 폴리펩티드로 구성되는 인간유래의 세포표면분자에 반응성을 가지는 모노클로날항체.
(2) 본 발명의 폴리펩티드, 그 폴리펩티드에 유래하는 폴리펩티드단편 또는 그 폴리펩티드에 의해 구성되는 세포표면분자에 반응성을 가지는 모노클로날항체로서, 그 모노클로날항체의 마이토젠으로 자극한 임파아구세포에의 작용이, 국제기탁번호 FERM BP-5707로 식별되는 하이브리도마가 생성하는 모노클로날항체가 마이토젠으로 자극한 래트 임파아구세포에 나타내는 작용과 실질적으로 동일한 모노클로날항체.
(3) 본 발명의 폴리펩티드, 그 폴리펩티드에 유래하는 폴리펩티드단편 또는 그 폴리펩티드에 의해 구성되는 세포표면분자에 반응성을 가지는 모노클로날항체로서, 그 모노클로날항체의 마이토젠으로 자극한 임파아구세포에의 작용이, 국제기탁번호 FERM BP-5708로 식별되는 하이브리도마가 생성하는 모노클로날항체가 마이토젠으로 자극한 래트 임파아구세포에 나타내는 작용과 실질적으로 동일한 모노클로날항체.
또한 본 발명의 모노클로날항체에는, 국제기탁번호 FERM BP-5707 및 FERM BP-5708으로 각각 식별되는 하이브리도마가 생성하는 모노클로날항체도 포함한다.
본 발명에 있어서의 "키메라모노클로날항체"는, 유전자공학적으로 제작되는 모노클로날항체로서, 구체적으로는 그 가변영역이 비인간포유동물(마우스, 래트, 햄스터 등)의 이뮤노글로블린 유래의 가변영역이며, 또한 그 정상영역이 인간 이뮤노글로블린 유래의 정상영역인 것을 특징으로 하는 마우스/인간키메라모노클로날항체 등의 키메라모노클로날항체를 의미한다.
인간 이뮤노글로블린 유래의 정상영역은, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD 및 IgE 등의 아이소타입에 의해 각각 고유의 아미노산서열을 가지지만, 본 발명에 있어서의 재조합키메라모노클로날항체의 정상영역은 어느쪽의 아이소타입에 속하는 인간 이뮤노글로블린의 정상영역만으로도 좋다. 바람직하게는, 인간 IgG의 정상영역이다.
본 발명에 있어서의 키메라모노클로날항체는, 예를 들어 아래와 같이 하여 제조할 수 있다. 그렇지만 이와 같은 제조방법에 한정되는 것이 아닌 것은 말할 필요도 없다.
예를 들어, 마우스/인간키메라모노클로날항체는, 실험의학(임시증간호),제1.6권, 제10호, 1988년 및 일본 특허공고 평3-73280호 공보등을 참조하면서 제작할 수 있다. 즉 마우스모노클로날항체를 생성하는 하이브리도마로부터 단리한 그 마우스모노클로날항체를 코드하는 DNA에서 취득한 활성인 VH 유전자(H쇄 가변영역을 코드하는 재서열된 VDJ 유전자)의 하류에, 인간 이뮤노글로블린을 코드하는 DNA에서 취득한 CH 유전자(H쇄 정상영역을 코드하는 C유전자)를, 또한 그 하이브리도마로부터 단리한 마우스모노클로날항체를 코드하는 DNA에서 취득한 활성인 VL 유전자(L쇄 가변영역을 코드하는 재서열된 VJ 유전자)의 하류에 인간 이뮤노글로블린을 코드하는 DNA에서 취득한 CL유전자(L쇄 정상영역을 코드하는 C 유전자)를, 각각 발현가능하도록 서열하여 하나 또는 따로따로의 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하고, 그 형질전환세포를 배양함에 의해 제작할 수 있다.
구체적으로는, 우선 마우스모노클로날항체생성 하이브리도마로부터 통상의 방법에 의해 DNA를 추출한 뒤, 그 DNA를 적절한 제한효소(예를 들어 EcoRI, HindIII 등)을 사용하여 소화하고, 전기영동을 걸어(예를 들어 0.7% 아가로스겔사용) 사우선블로팅(Southern blotting)법을 행한다. 영동한 겔을 예를 들어 에티디움브로마이드 등으로 염색하여, 사진촬영 후, 마커의 위치를 부착하여, 겔을 2회 물로 세척하고, 0.25 M HCl 용액에 15분간 담근다. 이어서, 0.4N의 NaOH 용액에 10분간 침지하여, 그동안 약하게 흔든다. 통상의 방법에 의해, 필터에 옮기고 4시간뒤 필터를 회수하여 2× SSC에서 2회 세척한다. 필터를 충분히 건조한 뒤, 베이킹(75℃, 3시간)을 행한다. 베이킹 종료 후에, 그 필터를 0.1× SSC/0.1% SDS 용액에 넣고, 65℃에서 30분간 처리한다. 이어서 3× SSC/0.1% SDS 용액에 침지한다. 수득된 필터를 프리하이브리다이제이션(prehybridization)액과 함께 비닐자루에 넣고, 65℃에서 3~4시간 처리한다.
다음으로 이 속에32P 표지한 프로브 DNA 및 하이브리다이제이션액을 넣고, 65℃에서 12시간 정도 반응시킨다. 하이브리다이제이션 종료 후, 적절한 염농도, 반응온도 및 시간(예를 들어, 2× SSC-0.1% SDS용액, 실온, 10분간)을 기초로, 필터를 세척한다. 이 필터를 비닐자루에 넣고, 2× SSC를 소량 가하여, 밀봉하고, 오토라디오그래피를 행한다.
상기 사우선블로팅법에 의해, 마우스모노클로날항체의 H쇄 및 L쇄를 각각코드하는 재서열된 VDJ 유전자 및 VJ 유전자를 동정한다. 동정한 DNA 단편을 함유하는 영역을 자당밀도구배원심으로써 분획하여, 파아지 벡터(예를 들어, Charon 4A, Charon 28, λEMBL3, λEMBL4 등)에 삽입시키고, 그 파아지 벡터로 대장균(예를 들어, LE392, NM539 등)을 형질전환하고, 게놈 라이브러리를 제작한다. 그 게놈 라이브러리를 적당한 프로브(H쇄 J유전자, L쇄(κ) J유전자 등)를 사용하고, 예를 들어 벤톤 데이비스법(사이언스(Science), 제196권, 제180~제182페이지, 1977년)에 따라서, 플라크하이브리다이제이션을 행하여, 재서열된 VDJ 유전자 또는 VJ 유전자를 각각 함유하는 포지티브 클론을 수득한다. 수득된 클론의 제한효소지도를 제작하여, 염기서열을 결정하고, 목적하는 재서열된 VH(VDJ)유전자 또는 VL(VJ)유전자를 함유하는 유전자를 얻을 수 있는 것을 확인한다.
한편, 키메라화에 사용하는 인간 CH 유전자 및 인간 CL 유전자를 별도로 단리한다. 예를 들어, 인간 IgG1과의 키메라항체를 제작하는 경우에는, CH 유전자인 Cγ1 유전자와 CL 유전자인 Cκ유전자를 단리한다. 이들의 유전자는 마우스면역 글로블린유전자와 인간면역글로블린유전자의 염기서열이 높은 상동성을 이용하여 인간 Cγ1 유전자 및 인간 Cκ유전자에게 상당하는 마우스 Cγ1 유전자 및 마우스 Cκ유전자를 프로브로서 사용하여, 인간 게놈 라이브러리로부터 단리함으로써 수득할 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어 클론 Ig146(프로시딩 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 제75권, 제4709~제4713페이지, 1978년)부터의 3kb의 HindIII-BamHI 단편과 클론 MEP10(프로시딩 내셔널 아카데미 오브 사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 제78권, 제474~제478페이지, 1981년)로부터의 6.8 kb의 EcoRI 단편을 프로브로서 사용하여, 인간의 람다 Charon 4 A 의 HaeIII-AluI 게놈 라이브러리(셀(Cell),제15권, 제 1157∼제1174페이지, 1978년(해))중에서, 인간 Cκ 유전자를 포함하고, 인핸서영역을 유지하고 있는 DNA 단편을 단리한다. 또한, 인간 Cγ 1 유전자는 예를 들어 인간태아간세포 DNA를 HindIII에서 절단하며, 아가로스겔 전기영동으로 분획한 뒤, 5.9 kb의 밴드를 λ788에 삽입하고, 상기한 프로브를 사용하여 단리한다.
이와 같이 하여 단리된 마우스 VH 유전자와 마우스 VL유전자 및 인간 CH 유전자와 인간 CL유전자를 사용하여, 프로모터영역 및 인핸서 영역 등을 고려하면서 마우스 VH 유전자의 하류에 인간 CH 유전자를, 또한 마우스 VL 유전자의 하류에 인간 CL 유전자를, 적절한 제한효소 및 DNA 리가제를 사용하여, 예를 들어 pSV2gpt 또는 pSV2neo 등의 발현 벡터에 통상의 방법에 따라서 삽입한다. 이때 마우스 VH 유전자/인간 CH 유전자와 마우스 VL 유전자/인간 CL 유전자의 키메라유전자는, 하나의 발현 벡터에 동시에 배치되더라도 좋고, 각각 별개의 발현 벡터에 배치할 수도 있다.
이와 같이 하여 제작한 키메라유전자 삽입발현벡터를, 예를 들어 P3X63·Ag8·653 세포 또는 SP210세포라고 하였으며, 스스로는 항체를 생성하지 않는 골수종세포에 프로토플라스트융합법, DEAE-덱스트란법, 인산칼슘법 또는 전기천공법 등에 의해 도입한다. 형질전환세포는 발현벡터에 도입된 약품내성유전자에 대응하는 약물함유배지중에서의 배양에 의해 선별하여, 목적으로 하는 키메라모노클로날항체생성세포를 취득한다.
이와 같이 하여 선별된 항체생성세포의 배양상청중에서 원하는 키메라모노클로날항체를 취득한다.
본 발명에 있어서의 "인간형모노클로날항체(CDR-grafted 항체)"는, 유전자공학적으로 제작되는 모노클로날항체로서, 구체적으로는 그 초가변영역의 상보성결정영역의 일부 또는 전부가 비인간포유동물(마우스, 래트, 햄스터 등)의 모노클로날항체에서 유래되는 초가변영역의 상보성결정영역이며, 그 가변영역의 틀영역(framework region)이 인간 이뮤노글로블린 유래의 가변영역의 틀영역이며,또한 그 정상영역이 인간이뮤노글로블린 유래의 정상영역인 것을 특징으로 하는 인간형모노클로날항체를 의미한다.
여기서, 초가변영역의 상보성결정영역이라는 것은 항체의 가변영역중의 초가변영역에 존재하며, 항원과 상보적으로 직접결합하는 부위인 3가지의 영역(Complementaritydetermining residue; CDR1, CDR2, CDR3)을 가리키고, 또한 가변영역의 틀영역이라는 것은, 그 3가지 상보성결정영역의 전후로 개재하는 비교적 보존된 4개의 영역(Framework; FR1, FR2, FR3, FR4)을 가리킨다.
바꾸어 말하면, 비인간포유동물 유래의 모노클로날항체의 초가변영역의 상보성결정영역의 일부 또는 전부 이외의 모든 영역이, 인간 이뮤노글로블린의 대응영역과 대신하여 위치한 모노클로날항체를 의미한다.
인간 이뮤노글로블린 유래의 정상영역은, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD 및 IgE 등의 아이소타입에 의해 각각 고유의 아미노산서열을 가지지만, 본 발명에 있어서의 인간형모노클로날항체의 정상영역은 어느쪽의 아이소타입에 속하는 인간이뮤노글로블린의 정상영역만으로도 좋다. 바람직하게는, 인간 IgG의 정상영역이다. 또한 인간 이뮤노글로블린유래의 가변영역의 틀영역에 관해서도 한정되는 것이 아니다.
본 발명에 있어서의 인간형모노클로날항체는, 예를 들어 아래와 같이 하여 제조할 수 있다. 그렇지만, 그와 같은 제조방법에 한정되는 것이 아닌 것은 말할 필요도 없다.
예를 들어, 마우스모노클로날항체에 유래하는 조환 인간형모노클로날항체는, 특표평4-506458호 공보 및 일본 특허공개 소62-296890호 공보 등을 참조하여, 유전자공학적으로 제작할 수 있다. 즉, 마우스모노클로날항체를 생성하는 하이브리도마로부터, 적어도 하나의 마우스 H쇄 CDR 유전자와 그 마우스 H쇄 CDR 유전자에 대응하는 적어도 하나의 마우스 L쇄 CDR 유전자를 단리하여, 또한 인간 이뮤노글로블린유전자로부터 상기 마우스 H쇄 CDR에 대응하는 인간 H쇄 CDR 이외의 전 영역을 코드하는 인간 H쇄 유전자와, 전의 마우스 L쇄 CDR에 대응하는 인간 L쇄 CDR 이외의 전영역을 코드하는 인간 L쇄 유전자를 단리한다.
단리한 그 마우스 H쇄 CDR 유전자와 그 인간 H쇄유전자를 발현가능하도록 적당한 발현 벡터에 도입하고, 마찬가지로 그 마우스 L쇄 CDR 유전자와 그인간 L쇄 유전자를 발현가능하도록 적당한 또 하나의 발현 벡터에 도입한다. 또는 그 마우스 H쇄 CDR 유전자/인간 H쇄 유전자와 마우스 L쇄 CDR 유전자/인간 L쇄유전자를 동일한 발현 벡터에 발현가능하도록 도입할 수도 있다. 이와 같이 하여 제작된 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환함에 의해 인간형모노클로날항체생성형질전환세포를 수득하고, 그 형질전환세포를 배양함에 의해 배양상청중에서 원하는 인간형모노클로날항체를 수득한다.
본 발명에 있어서의 "인간모노클로날항체"라는 것은 이뮤노글로블린을 구성하는 H쇄의 가변영역 및 H쇄의 정상영역 및 L쇄의 가변영역 및 L쇄의 정상영역을 함유하는 모든 영역이 인간 이뮤노글로블린을 코드하는 유전자에 유래하는 이뮤노글로블린이다.
인간항체는, 통상의 방법에 따라서, 예를 들어 적어도 인간 이뮤노글로블린유전자를 마우스 등의 인간 이외의 포유동물의 유전자 자리중에 포함됨으로써 제작된 형질전환동물을, 항원으로 면역감작함에 의해, 전술한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날항체의 제작법과 같이 하여 제조할 수 있다.
예를 들어, 인간항체를 생성하는 형질전환마우스는, Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; 특표평4-504365호 공보; 특표평7-509137호 공보; 닛께이 사이언스, 6월호, 제40~제50페이지, 1995년; 국제출원공개 WO94/25585호 공보; Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; 및 특표평6-500233호 공보 등에 기재된 방법에 따라서 제작할 수 있다.
또한 최근 개발된 기술인 형질전환된 소나 돼지의 밀크중에서 인간유래 프로테인을 제조방법을 적용하는 것도 가능하다(일본계 사이언스, 1997년 4월호, 제78페이지 내지 84페이지).
본 발명에 있어서의 "항체의 일부"라는 것은 전술한 바와 같은 모노클로날항체의 일부분의 영역을 의미하며, 구체적으로는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv(variable fragment of antibody), sFv, dsFv(disulphide stabilised Fv) 또는 dAb(single domain antibody) 등을 의미한다(엑스퍼트·오피니온·온·테라퓨티크·파텐쯔(Exp. Opin. Ther. Patents), 제6권, 제5호, 제441~456페이지, 1996년).
여기서, "F(ab')2" 및 "Fab'"라는 것은 이뮤노글로블린(모노클로날항체)를, 단백분해효소인 펩신 또는 파파인 등으로 처리하여 제조되고, 힌지영역중 2개의 H쇄 사이에 존재하는 디술피드결합의 전후로 소화되어 생성되는 항체 프래그먼트를 의미한다. 예를 들어, IgG를 파파인으로 처리하면, 힌지영역중 2개의 H쇄 사이에존재하는 디술피드결합의 상류에서 절단되어 VL(L쇄 가변영역)과 CL(L쇄 정상영역) 로 되는 L쇄, 및 VH(H쇄 가변영역)으로 CHγ1(H쇄 정상영역중 γ1영역)으로 된 H쇄 프래그먼트가 C 말단영역에서 디술피드결합에 의해 결합한 상동인 2개의 항체 프래그먼트를 제조할 수 있다. 이들 2개의 상동인 항체프래그먼트를 각각 Fab'이라고 한다. 또한 IgG을 펩신으로 처리하면, 힌지영역중 2개의 H쇄 사이에 존재하는 디술피드결합의 하류에서 절단되어 상기 2개의 Fab'가 힌지영역에서 이어진 것보다 약간 큰 항체프래그먼트를 제조할 수 있다. 이 항체 프래그먼트를 F(ab')2이라고 한다.
본 발명의 "의약조성물"이라는 것은 상기에서 정의되는 본 발명의 "폴리펩티드", 그 폴리펩티드로 구성되는 "호모다이머분자", "폴리펩티드단편" 또는 "융합폴리펩티드", 그 융합폴리펩티드로 구성되는 "호모다이머분자", "항체" 또는 "항체의 일부"의 어느 하나와, 약학적으로 허용되어 얻어지는 담체로 이루어지는 의약조성물이다.
여기서 "약학적으로 허용되어 얻어지는 담체"라는 것은, 부형제, 희석제, 증량제, 붕해제, 안정제, 보존제, 완충제, 유화제, 방향제, 착색제, 감미제, 점조제, 교미제, 용해보조제 또는 기타 첨가제 등을 들 수 있다. 그와 같은 담체의 하나 이상을 사용함에 따라, 정제, 환제, 산제, 과립제, 주사제, 액제, 캡슐제, 트로키제, 에릭실제, 현탁제, 유제 또는 시럽제 등의 형태의 의약조성물을 조제할 수 있다. 이들 의약조성물은, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구투여를 위한기타 형태로서는 하나 또는 그 이상의 활성물질을 포함하고, 통상의 방법에 의해 처방되는 외용액제, 장용내 투여를 위한 좌제 및 페사리(pessary) 등이 포함된다.
투여량은 환자의 연령, 성별, 체중 및 증상, 치료효과, 투여방법, 처리시간, 또는 그 의약조성물에 함유되는 활성성분(상기 폴리펩티드나 항체 등)의 종류 등에 의해 다르지만, 보통 성인 한사람당, 일회당 10㎍에서 1000 mg(또는 10㎍에서 500mg)의 범위로 투여할 수 있다. 그렇지만 투여량은 여러 가지 조건에 의해 변동하므로, 상기 투여량보다 적은 량으로 충분한 경우도 있고, 또한 상기 범위를 넘는 투여량이 필요한 경우도 있다.
특히 주사제의 경우에는, 예를 들어 생리식염수 또는 시판의 주사용 증류수등의 비독성의 약학적으로 허용되어 얻어지는 담체중에 0.1㎍항체/ml 담체~10mg항체/ml 담체의 농도가 되도록 용해 또는 현탁하여 제조할 수 있다. 이와 같이 하여 제조된 주사제는, 처치를 필요로 하는 인간환자에 대하여, 한번의 투여에 있어서 1kg체중에 있어서, 1㎍~100mg의 비율로, 바람직하게는 50㎍~50mg의 비율로, 하루마다 한번~수회 투여할 수 있다. 투여의 형태로서는, 정맥내 주사, 피하 주사, 피내주사, 근육내주사 또는 복강내주사같은 의료상 적당한 투여형태를 예시할 수 있다. 바람직하게는 정맥내주사이다.
또한 주사제는 경우에 따라 비수성의 희석제(예를 들어 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유같은 식물유, 에탄올같은 알코올류 등), 현탁제 또는 유탁제로서 조제할 수도 있다.
그와 같은 주사제의 무균화는, 박테리아보류필터를 통과시키는 여과멸균, 살균제의 배합 또는 조사에 의해 행할 수 있다. 주사제는 용시조제의 형태로서 제조할 수 있다. 즉 동결건조법 등에 의해서 무균의 고체조성물로 하고, 사용전에 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수 있다.
본 발명의 의약조성물은 T세포 등의 임파구의 활성화 및 활성화 임파구의 기능제어의 이상에 기인하는 여러 가지 자기면역성질환, 알레르기성질환 또는 염증성질환의 치료 및 예방에 적용이 가능하다. 그 질환으로서는 만성관절류마티즘, 다발성경화증, 자기면역성갑상선염, 알레르기성접촉성피부염, 만성염증성피부질환인 편평태선, 전신성 홍반성낭창, 인슐린의존성 당뇨병 및 건선 등을 들 수 있다.
또한 본 발명의 의약조성물의 여러 가지 질환증상의 치료효과에 있어서는, 통상의 방법에 따라서, 기지의 질환모델동물에게 투여함에 의해 시험, 검토할 수 있다.
예를 들어, ① 인간전신성 홍반성낭창(SLE)의 모델인(NZB/NZW) F1마우스(Science, Vol.125, p.1225-1227, 1994), ② 다발성경화증(MS)으로서의 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)의 모델(J. Clin. Invest., Vol.95, p.2783-2789, 1995), ③ 인슐린의존성 당뇨병(IDDM)모델인 NOD(non-obese diabetes)마우스(J. Exp. Med., Vol.181, p.1145-1155, 1995), ④ 굳파스쳐(Goodpasture)의 신장염모델인 신사구체 기저막 면역에의한 래트신장염모델(Eur. J. Immunol., Vol.24, No.6, p.1249-1254, 1994), ⑤ 인간만성관절류마티즘모델인 DBA/1마우스(Eur. J. Immunol., Vol.26, p.2320-2328, 1996)를 사용하는 것이 가능하다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 모노클로날항체의 조제
이하에 서술하는 항체생성 하이브리도마의 조제는, 케이라(Kohler) 등의 방법(Blood, 제81권, 101-111페이지, 1993년, 오오모리 등)을 참조하면서 행하고, 또한 모노클로날항체의 조제는 칸나목 등의 방법(Handbook of Experimental Immunology, 제4권, 117.21-117.21페이지, 1986년)을 참조하면서 행했다.
우선 래트흉선종 세포주 FTL435세포를 면역감작항원으로서, 그 항원을 BALB/c 마우스에게 0일째(107세포/마리), 7일째, 14일째 및 28일째라는 간격 및 량으로 푸드패드 투여했다. 첫회 면역만 그 항원을 프로인트 완전 어쥬번트(Freund's complete adjuvant) 와 혼화한 것을 투여했다. 최후의 면역감작으로부터 2일 뒤에 그 마우스의 임파관절을 채취하고, 통상의 방법에 의해 마우스 미에로마세포PAI(JCR No.B 0113; Res. Disclosure, Vol.217, p.155, 1982, Stocker, J.W.et al. )로 융합시켜 다수의 모노클로날항체생성 하이브리도마를 수득했다.
실시예 2: 하이브리도마의 스크리닝 및 모노클로날항체의 성상해석
실시예 1에서 조제한 각종 하이브리도마의 배양상청중에 생성된 모노클로날항체의 면역원인 FTL435세포에 미치는 효과를 해석하여 하이브리도마를 스크리닝했다. 96구멍 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 FTL435세포(5×106cell/ml을 0.1 ml)를 파종하고, 각 하이브리도마의 배양상청(각각10μ g/ml)을 가하여, 37℃에서 1시간 배양했다. 그 안의 하이브리도마 클론 "JTT-1" 및 클론 "JTT-2"에 관한 결과를 도 1 및 도 2에 나타낸다.
하이브리도마 클론 "JTT-1"가 생성하는 모노클로날항체("JTT-1항체")는, FTL435세포를 강하게 응집시키는 작용을 가지는 것이 확인되었다(도 1 (b) 및 도 2 (c)). 한편 "JTT-1항체"와 함께 "JTT-2항체"를 가함에 따라, "JTT.1항체" 자극에 의한 FTL435세포의 응집이 강하게 억제되는 것이 확인되었다(도 1 (d)). 또 어떤 하이브리도마 상청도 가하지 않은 계를 대조로 하였다(도 1 (a) 및 도 2 (a)).
이 "JTT-1항체" 자극에 의한 FTL435세포의 응집이, 대표적인 기지의 접착분자경로인 ICAM-1(Intercellular adhesion molecule-1)과 LFA-1(lymphocyte function-associated antigen-1)의 사이의 세포접착에 의한 것인가 아닌가를 확인하기 위해서, "JTT-1항체"와 함께 항래트 ICAM-1항체 1A29(10㎍/ml;IgG1) 또는 항래트 LFA-1항체(10㎍/ml; IgG2a)를 가하여 37℃에서 1시간 배양했다.
"JTT-1항체" 자극에 의한 FTL435세포의 응집은, 항ICAM-1항체 및 항LFA-1항체중 어디에 의하더라도 억제되지 않은 ([항ICAM-1항체]: 도 1 (c) 및 도 2 (f) 및 [항LFA-1항체]: 도 2 (d)).
"JTT-1항체"의 세포응집능에 관한 다른 성상해석을 위해 콘카나발린A로 자극하여 활성화한 래트활성화 임파아구세포에 대한 응집능을 전술한 바와 같이 하여 해석했다. 결과를 도 2에 나타낸다.
FTL435세포에 대한 작용과 같이 "JTT-1항체"의 자극에 의해 활성화 임파아구세포의 응집이 유도된다(도 2 (i)). 그렇지만 활성화 임파아구세포에 대해서는 "JTT-1항체" 자극에 의한 세포응집의 대부분은, 항LFA-1항체(도 2 (j)) 및 항ICAM-1항체(도 2 (l))에 의해 억제된다(단 부분적 응집이 남았다).
대조인 어떤 항체도 가하지 않은 계(도 2 (g))로부터 알 수 있는 바와 같이, 활성화 임파아구 등의 활성화 임파구는, PMA(Phorbol myristate acetate:LFA-1를 활성화시키는 기능을 가진다) (도 2 (h))나 "JTT-1항체"(도 2 (i))에 의한 자극을 받지 않는 한 아무런 세포접착에 의한 응집은 발생하지 않는다. 따라서 항LFA-1항체에 의해 "JTT-1항체" 자극에 의한 세포응집이 부분적으로 억제된 사실은 활성화 임파아구세포에 있어서는, "JTT-1항체"의 자극에 의해 LFA-1가 활성화되어 있는 것을 나타내는 것이다. 이것은 "JTT-1항체"에 의해 인식되는 분자가 어떠한 시그널의 전달에 관여하는 기능을 가지고 있는 것을 나타내는 것이다.
또 하이브리도마 클론 "JTT-1" 및 "JTT-2"은 1996년 10월 11일부로 부다페스트조약하에 인정된 국제기탁기관인 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 히가시 1-1-3 소재의 일본국 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 국제기탁하였다([JTT-1]: 국제기탁번호 FERM BP-5707, [JTT-2]: 국제기탁번호 FERM BP-5708).
마우스모노클로날항체 아이소타입 동정킷트(Amersham사제)를 사용한 해석에 의해, 각각의 하이브리도마로부터 생성되는 모노클로날항체(JTT-1항체 및 JTT-2항체)의 아이소타입은 모두 IgG1로 결정되었다.
실시예 3: "JTT.1항체" 및 "JTT.2항체"의 각종세포에 대한 반응성
각종세포에 있어서 "JTT.1항체" 및 "JTT.2항체"가 인식하는 분자의 발현패턴을 해석할 목적으로, 각종 세포에 대한 그 항체의 반응성을 확인했다. 아울러 "JTT-1항체"가 인식하는 분자를 "JTT-1항원"으로, 또한 "JTT-2항체"가 인식하는 분자를 "JTT-2항원"으로 명명한다.
5 내지 10주 나이의 위스타 래트(150 내지 250g)를 디에틸에테르로 마취사시켰다. 외과적 수술에 의해 개복하여 흉부 및 복부로부터 각각 흉선 및 비장을 적출하고, 으깨어 세포부유액을 조제했다. 또한 비장세포를 콘카나발린A(2㎍/ml) 및 10% FCS를 함유하는 RPMI1640 배지중에서 37℃에서 3일간 배양하여 활성화 임파아구를 조제했다.
FTL435세포, 흉선세포, 비장세포 및 활성화 임파아구(각 5×105개)를 "JTT.1항체" 또는 "JTT.2항체"와 반응시키고, 이어서 FITC 표지 항마우스 IgG(Cappel사제)와 반응시킨 뒤, 염색된 세포의 형광강도를 에픽스-엘리트(EPICS-Elite)플로우사이토메트리를 사용하여 측정했다.
결과를 도 3에 나타낸다. FTL435세포에서는 "JTT.1항원" 및 "JTT.2항원"의 강한 발현을 볼 수 있었다. 흉선세포라도 동분자의 발현을 볼 수 있지만, 비장세포에서는 약간밖에 발현하고 있지 않았다. 그러나 비장세포를 콘카나발린A에서 자극하여 수득한 활성화 임파아구에서는, "JTT.1항원" 및 "JTT.2항원"의 강한 발현을 볼 수 있게 되었다. 또한 각각의 세포종에 있어서 "JTT.1항원" 및 "JTT.2항원"의 발현패턴은 일치하고 있었다. 이 결과는 "JTT-1항원" 및 "JTT-2항원"이 동일한 분자인 것을 시사하는 것이다.
실시예 4: "JTT.1항체"의 여러 가지 임파계세포에 대한 반응성
여러 가지 임파계 세포에서의 "JTT.1항체"가 인식하는 분자("JTT-1항원")의 발현패턴을 해석할 목적으로, 두가지의 래트(Wistar래트 및 F344래트)의 임파관절, 비장유래 T임파아구 및 비장유래 B 임파아구에 대한 "JTT-1항체"의 반응성을 해석했다.
5 내지 10주 나이의 Wistar래트 및 F344래트(150 내지 250g)를 디에틸에테르로 마취사시켰다. 각각의 래트를 외과적 수술에 의해 개복하여 임파관절 및 비장을 적출하고, 으깨어 세포부유액을 조제했다. 또한 비장의 세포조제물을 콘카나발린A(ConA; 2㎍/ml) 및 10% FCS를 함유하는 RPMI1640배지중에서 37℃에서 3일간 배양했다. 각각의 래트에 관한, 하루 동안 배양 후 및 3일간 배양 후에, 활성화 T 임파아구 및 활성화 B 임파아구를 취득했다. 또한 대조로서 임파관절세포 및ConA를 가하기 전(0일)에 취득한 비장유래 T 임파아구 및 B 임파아구를 사용했다.
각각의 세포(각 5×105개)를, 비오틴 표지 항래트 T세포항체 또는 비오틴 표지 항래트 B 세포항체(10㎍/ml, 생화학공업제)와 반응시킨 후, 피코에리스린(phycoerythrin) 표지 스트렙타비딘(streptavidin)과 반응시켰다. 이어서 FITC 표지한 "JTT-1항체"(10㎍/ml)와 반응시켜, 염색된 세포의 형광강도를 에픽스-엘리트(EPICS-Elite) 플로우사이토메트리를 사용하여 측정했다.
결과를 도 4에 나타낸다. Wistar래트 및 F344래트 모두 활성화 T 임파아구 및 활성화 B 임파아구중 어디에 있더라도 ConA 자극에 의한 활성화의 하루째부터 "JTT.1항원"의 강한 발현을 볼 수 있었다. 또한 각각의 세포종에 있어서의 "JTT.1항원"의 발현패턴은 거의 일치하고 있었다.
실시예 5: 면역침강실험에 의한 "JTT.1항원" 및 "JTT.2항원"의 성상해석
"JTT.1항원" 및 "JTT.2항원"의 성상을 해석할 목적으로, FTL435세포를 사용하여 면역침강실험을 행했다.
(1) 비오틴화 가용성 세포표면분자의 조제
FTL435세포를 PBS에서 세척한 뒤, 100㎍/ml의 NHS-비오틴을 함유하는 0.1M 헤페스(HEPES)함유 생리식염수(pH8.0)에 1×107세포/ml이 되도록 현탁하고, 실온에서 40분간 반응시켰다. 세포를 PBS로 3회 세척한 뒤, 가용화 버퍼(1% NP-40, 10mM Tris-HCl(pH7.4), 0.15M NaCl)를 5×107cells/ml이 되도록 첨가하여, 4℃, 30분간반응시켜 세포를 용해했다. 수득된 세포용해물을 원심하여, 비오틴화 가용성 세포표면분자를 함유하는 원심상청을 -80℃에서 보존했다.
(2) 면역침강 및 SDS-PAGE 해석
실시예 1에서 조제한 하이브리도마 클론 "JTT-1"의 배양상청으로부터 통상의 방법에 의해 정제한 "JTT.1항체"의 정제샘플을, 2mg/ml이 되도록 프로테인 G-세팔로스비드와 혼합하고, 4℃에서 1시간 반응시켜 비드에 항체를 결합시켰다. 비드를 세척하고, 10㎕의 비드에 대하여 비오틴화 FTL435 세포가용화물을 500㎕ 첨가하고, 4℃에서 2시간 반응시켰다. 비드를 가용화 버퍼로 3회 세척하고, 50㎕의 글리카나제 버퍼(0.15% SDS 함유 나트륨인산 버퍼(pH7.0))를 가하고 끓여서 항체결합 비드에 트랩된 결합분자를 용출시켰다. 용출샘플의 일부에 1.25% NP-40과 N-글리카나제(20U/ml)를 첨가하여 밤새 반응시켜, N형 당쇄를 소화했다.
용출샘플 5㎕에 2-멜캅토에탄올 존재하 또는 비존재하에 SDS-폴리아크릴아미드 겔전기영동(SDS-PAGE)용 샘플버퍼(Enprotech사제)를 등량 첨가하고 끓여서, 전기영동 후, PVDF 막에 전사했다. 전사막을 3% BSA-PBS로 블로킹하고, 이어서 퍼옥시다아제 표지 스트렙타비딘과 반응시킨 뒤, 사용설명서의 기재에 따라서 ECL 시스템(Amersham사제)을 사용하여 "JTT-1항체"에 의해 트랩된 비오틴화가용성 세포막표면분자를 검출했다.
도 5에 결과를 나타낸다. "JTT.1항체"에 의해 인식되는 FTL435세포상의 분자("JTT-1항원")는, 비환원하(도 5중에 "(-)"로 나타내었다)에 약47kD의 분자량을 가지며, 또한 환원하(도 5중에 "(+)"로 나타내었다)에 약24kD 및 약28kD의 분자량을 가지고 있었다. 또한 N형 당쇄를 소화함에 따라(도 5중에 "+ N-gly"로 나타내었다), "JTT.1항원"은 비환원하에 약36kD, 또한 환원하에 약20kD의 1개의 밴드로 모아졌다(converge). 이상의 결과로부터, "JTT.1항원"은 당쇄수식이 다르고 코아단백이 동일한 분자로 이루어지는 다이머를 형성하고 있는 것으로 추정되었다. 또 "JTT.2항체"를 사용하여 상술한 바와 같이 행한 시험에 있어서도 완전히 같은 결과를 얻을 수 있었다. 이 결과와 실시예 3 및 후술의 실시예 7의 결과를 함께 생각하면, "JTT.1항원"("JTT-1항체"에 의해 인식되는 분자) 및 "JTT.2항원"("JTT-2항체"에 의해 인식되는 분자)은 완전히 동일한 분자라고 생각되었다.
실시예 6: 정제 "JTT.1항원"에 대한 래트흉선세포의 접착실험 및 N말단아미노산해석
"JTT.1항체"가 인식하는 분자("JTT-1항원")가 접착분자로서의 기능을 갖고 있는가 아닌가를 해석하기 위해서 이하의 실험을 행했다. 또한 N 말단아미노산해석을 행했다.
(1) "JTT.1항체" 어피니티컬럼의 조제
실시예 1에서 조제한 하이브리도마 클론 "JTT-1"의 배양상청으로부터 통상의방법에 의해 정제한 "JTT.1항체"의 정제샘플 2mg(2ml)을 1ml의 프로테인 G-세팔로스 수지와 혼합하고, 4℃에서 1시간 반응시켰다. 수지를 200mM의 트리에탄올아민(pH8.2)으로 3회 세척했다. 또한 10mM 디메틸피멜리미데이트(DMP)를 함유하는 트리에탄올아민(pH8.2)중에서 실온하에 1시간 인큐베이트하여, 수지에"JTT.1항체"를 공유결합시켰다.
(2) "JTT.1항원"의 정제
FTL435세포를 10% FCS 함유하는 RPMI1640배지를 사용하여 배양했다. 세포를 원심조작에 의해 회수하고, 펠렛을 PBS로 3회 세척했다. 세척 후의 펠렛에 가용화 버퍼(1% NP-40, 10mM Tris-HCl(pH7.4), 0.15M NaCl)을 5×107cells/ml이 되도록 첨가하고, 4℃에서 30분간 반응시켜 세포를 용해했다. 얻어진 세포용해물을 원심하고, 가용성 세포표면분자를 함유하는 원심상청을 -80℃에서 보존했다.
가용화물 400ml을 "JTT.1항체" 어피니티 컬럼에 첨가했다. 컬럼을 가용화 버퍼 50ml 및 PBS20ml으로 세척한 뒤, 0.2M 글리신 버퍼(pH2.8)로 "JTT-1항원"을 용출시켰다. 용출한 "JTT-1항원"에 1M 트리스 버퍼를 첨가하여 중화했다. 얻어진 "JTT.1항원"은 마이너스80℃에서 보존했다.
(3) N 말단의 아미노산서열의 결정
얻어진 정제 "JTT-1항원"을, SDS-PAGE에서 전개한 뒤, 통상의 방법에 의해 N 말단의 아미노산서열을 결정하여, Glu-Leu-Asn-Asp-Leu-Ala-Asn-His-Arg의 아미노산서열을 포함하는 것이 밝혀졌다.
(4) 접착실험
5 내지 10주 나이의 위스타 래트(150 내지 250g)를 디에틸에테르로 마취사시켰다. 외과적 수술에 의해 흉부를 개복하고 흉선을 적출하고, 으깨어 흉선세포부유액을 조제했다. 세포부유액에, 2',7'-비스(카르복시에틸)카르복시플루오레인테트라세톡시메틸에스테르(BCECF-AM; Molecular probes사제) 10μM을 첨가하고, 37℃에서 30분간 배양하여, 형광표지를 행했다. 세포를 PBS에서 세척한 뒤, 10% FCS를 함유하는 RPMI1640배지중에, 2×107cell/ml의 농도가 되도록 재부유시켰다.
96구멍 ELISA 플레이트에, (2)에서 수득한 정제 "JTT.1항원"을 10㎕/well로 하룻밤 코팅했다. 플레이트를 PBS에서 세척한 뒤, 3% BSA를 포함하는 PBS를 200㎕/well에 첨가하여 2시간 브로킹을 행했다. 플레이트를 PBS로 세척한 뒤, 각 웰에 ① 형광표지 흉선세포(2×107cells/ml을 0.1 ml)만, ② 형광표지 흉선세포(동농도) 및 통상의 방법에 의해 조제한 "JTT.1항체"의 Fab 단편(5㎍/ml) 및 ③ 형광표지 흉선세포(동농도), 그 "JTT.1항체"의 Fab 단편(동농도) 및 "JTT.2항체"(10㎍/ml)를 가하고, 37℃에서 1시간 배양했다. 결합하지 않은 세포를 제거하기 위해서, 각 웰을 10% FCS를 함유하는 RPMI1640배지로써 한번 세척했다. 각 웰을 광학현미경으로 관찰했다. 이어서 각 웰에 0.1% NP-40 용액 100㎕을 첨가하여 플레이트에 결합하고 있는 세포를 용해했다. 플루오로스캔 II(Fluoroscan II) 마이크로플레이트·플루오로미터(Flow Laboratories사제)를 사용하여, 538nm(485nm에서 여기)의 파장에서의 형광강도를 측정함에 의해, 각 웰에 결합한 형광표지 흉선세포의 상대 세포수를 계수했다. 또 정제 "JTT-1항원"을 코팅하지 않은 계를 대조로 했다.
광학현미경의 관찰결과를 도 6에 나타낸다.
흉선세포는 "JTT.1항체"의 Fab 단편 존재하에서만 유의할 정도로정제"JTT.1항원"에 접착한다(도 6 (c)). 또한 그 접착은 "JTT.2항체"에 의해 유의할 정도로 저해되었다(도 6 (d)).
또 각 웰에 코팅한 "JTT.1항원"에 접착한 흉선세포의 상대 세포수를 형광강도에 의해 측정한 결과를 도 7에 나타내었다.
이상의 결과에 의해 "JTT.1항원"은 접착분자로서의 기능을 가지고 있는 것이 확인되었다.
실시예 7: 래트 "JTT.1항원"을 코드하는 cDNA의 클로닝1.cDNA 라이브러리의 제작
1-(1) ConA 자극 래트 임파아구로부터의 poly(A)+ RNA의 추출
ConA에서 자극한 래트비장유래 임파아구(Con A blast)(약1×106cells/ml)를 4℃에서 5분간(2,000×g) 원심하고, 침전된 세포를 ISOGEN(일본 진사제)을 사용하여 현탁하고, 클로로포름으로 침적 추출하여 상청을 회수했다. 얻어진 상청에 이소프로판올을 첨가하고 실온에서 10분간 방치한 뒤, 4℃에서 10분간, 12,000×g에서 원심하여 RNA를 침전시켰다. 침전한 RNA를 에탄올로 세척한 뒤, TE 완충액에 용해했다. 얻어진 전RNA에서, "mRNA Purification Kit"(Pharmacia사제)를 사용하여 poly(A)+ RNA를 정제했다.
1-(2) cDNA의 조제
조제한 poly(A)+ RNA 5㎍를 주형으로 하여, "Time Saver cDNA Synthesis Kit"(Pharmacia사제)를 사용하여 cDNA를 합성했다. 스크리닝의 효율을 올리기 위해서, Not I 절단부위를 가지는 "oligo dT 프라이머"(Pharmacia사제)를 사용했다. 이어서 EcoRI를 어댑터 부가하여, NotI 소화를 행하고, 단일방향성을 가지는 cDNA를 수득했다. 또한 스팬컬럼(Pharmacia사제)을 사용하여 싸이즈분획을 행했다.
1-(3) 벡터로의 삽입
얻어진 EcoRI 및 NotI 말단을 가지는 cDNA를, EcoRI 및 NotI 처리한 벡터 pME18S(Hara, T. and Miyajima, A. EMBOJ.,11,1875-1884,1992)에 연결했다. 연결반응에는 "DNA ligation Kit"(다까라주조사제)를 사용했다. 얻어진 반응생성물을 사용하여 E.coli DH5(도요보사제)를 형질전환했다. 형질전환체는 O.D.값(600nm)이 0.6이 될 때까지 배양한 후 집균하여, 라이브러리를 함유하는 플라스미드 DNA를 회수했다. 플라스미드 DNA의 정제에는 QUIAGEN-Tip(QUIAGEN사제)를 사용했다.
2. cDNA 라이브러리의 스크리닝
스크리닝법은 패닝법(Seed, B. et al. Proc.Natl.Acad.Sci USA, 84, 3365-3369, 1987)에 준하여 행했다.
2-(1) COS 세포로의 유전자도입
얻어진 라이브러리를 일렉트로포레이션법(Potter, H.et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2288-2292)에 의해 COS7세포에 도입했다. 도입 후 60시간 배하여, 상청을 제거하고 PBS로 3회 세척했다. 이어서 PBS(0.5 mM EDTA)로 처리(37℃, 30분)한 뒤 피펫팅 조작에 의해 세포를 벗겼다. 또한 "lymphprep"(NYCOMED사제)를 사용하여 생세포만을 회수했다.
2-(2) 패닝에 의한 유전자발현세포의 농축
얻어진 생세포를 PBS(5% FCS, 0.5 mM EDTA)에 현탁했다. 세포현탁액을 "JTT.1항체"를 코팅한 배양접시에 옮기고, 실온에서 3시간 작용시켰다. 배양접시로부터 비결합세포를 제거하고, 배양접시를 PBS로 3회 세척한 뒤, 배양접시에 결합한 세포로부터 Hirt법(Hirt, B.J.Mol.Biol., 26.365-369)에 의해 플라스미드 DNA를 회수했다. 얻어진 플라스미드 DNA를 사용하여 E.coli DH10B(GIEBCO BRL사제)를 형질전환했다. 형질전환체를 사용하여 상기 1-(3)과 마찬가지로 플라스미드 DNA를 증폭, 정제했다. 얻어진 DNA를 사용하고, 상기 (1) 및 본 (2)에 기재된 조작을 다시 2회 반복했다.
2-(3) 포지티브 클론의 단리
3회째의 패닝(panning) 후, 형질전환한 E.coli DH10B를 암피실린 함유 LB 플레이트에서 밤새 배양하여 콜로니를 수득했다. 약제 내성 콜로니 20개를 배양하고 알칼리·미니 푸렙법(Maniatis, T.et al.Molecular Cloning; A Larolatory Mnual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)으로 플라스미드 DNA를 회수하여 삽입된 DNA(insertion DNA)를 해석했다. 아가로스겔 전기영동의 결과, 약0.9 kb의 cDNA를 가지는 클론(이하, 이 클론을 "T132A7"이라고 칭한다)이 농축되어 있는 것이 밝혀졌다.
상기 (1)에 기재된 방법을 사용하여, "T132A7"를 다시 COS7세포에서 일과성으로 발현시켰다. "T132A7" 도입세포를, "JTT.1항체" 또는 "JTT.2항체"와 반응시키고, 이어서 FITC 표지 항마우스 IgG(Cappel사제)와 반응시킨 뒤, 염색된 세포의 형광강도를 EPICS-Elite 플로우 사이토메트리(Coulter사제)를 사용하여 측정했다."JTT.1항체" 및 "JTT.2항체"는 "T132A7" 유전자산물을 강하게 인식하고 있었다. 결과를 도 8에 나타낸다.
3. 염기서열 및 아미노산서열의 결정
클론 "T132A7"의 염기서열을 디데옥시법에 의해 "Auto Read Sequencing Kit" (Pharmacia사제)와 "A.L.F.DNA sequencer"(Pharmacia사제)를 사용하여 결정했다. 또한 그 염기서열이 코드하는 "래트 JTT.1항원"의 추정 아미노산서열을 유전자해석소프트 "GENEWORKS"(IntelliGenetics사제)를 사용하여 해석했다. 그 염기서열 및 추정아미노산서열을 서열번호 4에 기재한다.
클로닝한 유전자로부터 연역되는 아미노산서열(200아미노산잔기로 구성된다)에는, 실시예 6-(3)에서 결정한 N 말단 아미노산서열과 동일한 아미노산서열을 포함하고 있었다. 클론 "T132A7" 도입세포가 "JTT-1항체"에 강하게 반응하는 것을 함께 고려하면, 클론 "T132A7"는 "래트 JTT.1항원"을 코드하는 cDNA를 함유하고 있다고 결론지을 수 있다.
4. 컴퓨터해석
"JTT.1항원"의 추정 아미노산서열의 일차구조에 관한, Kite와 Doolittle의 방법(Kite, J. Doolittle, R.F.J.Mol.Biol. 157, 105-132, 1982)에 따라서 하이드로퍼시 플랏 해석하였다(도 9). 그 결과 "JTT.1항원"은 N 말단에 시그널서열을 가지는 세포막 관통단백질인 것이 밝혀졌다. 또한 모티브 해석의 결과, "JTT.1항원"의 세포외 도메인에 2곳의 아스파라긴 결합형 당쇄결합부위를 가지고, 또한 세포내 도메인에 2곳의 카제인키나제 인산화 부위 및 1곳의 프로테인키나제 C 인산화부위를 가지고 있는 것이 밝혀졌다. 또 도 9중 "CHO"는 N형 당쇄 결합부위를 나타내고, "P"는 인산화부위를 나타내며, "CKII"는 카제인키나제 II를 나타내고, "PKC"는 크로테인키나제 C를 나타낸다.
실시예 8: "인간 JTT.1항원" cDNA의 클로닝
1. 프로브의 제작
실시예 7에서 수득한 클론 "T132A7"을 제한효소 EcoRI 및 NotI에서 소화하고, "래트 JTT.1항원"을 코드하는 cDNA 약0.9 kb를 잘라내어 아가로스겔 전기영동에 의해 분리했다. 분리한 DNA 단편을 "QUIAEX gel extraction kit"(QUIATEN사제)를 사용하여 정제하고, 얻어진 DNA 단편을 "Ready-To-Go DNA labelling kit"(Pharmacia사제)를 사용하여32P로 표지했다. 이 표지 DNA 단편을 플라크하이브리다이제이션용의 프로브로서 사용했다.
2. cDNA 라이브러리의 제작
2-(1) poly(A)+ RNA의 추출
실시예 7-1-(1)과 동일하게 하여, ConA에서 자극한 인간말초혈유래의 임파아구(Con A blast)로부터 poly(A)+ RNA를 추출했다.
2-(2) cDNA의 조제
조제한 poly(A)+ RNA 5㎍를 주형으로 하여, "oligo dT 프라이머"(Pharmacia 사제)와 "Time Saver cDNA Synthesis Kit"(Phramacia사제)를 사용하여 cDNA를 합성했다. 이어서 EcoRI 어댑터를 부가한 뒤, 스팬컬럼(Pharamacia사제)을 사용하여 싸이즈분획을 행했다.
2-(3) 벡터로의 삽입 및 팩키징
얻어진 EcoRI 말단을 가지는 cDNA를, EcoRI로 처리한 벡터 "λ ZAPII"(Stratagene사제)에 연결했다. 연결반응에는 "DNA ligation Kit"(다까라주조사제)를 사용했다. 이것을 "GIGA PACK II GOLD"(Strategene사제)를 사용하여 in vitro 팩키징(in vitro packaging)한 뒤, 얻어진 파아지입자를 사용하여, E coli XL1Blue MRF'(Strategene사제)를 숙주로서 재조합 파아지를 함유하는 플라크로 된 cDNA 라이브러리를 제작했다.
3. cDNA 라이브러리의 스크리닝
스크리닝은 "Rapid hybridization buffer"(Amersham사제)를 사용한 플라크하이브리다이제이션법(Maniatis, T.et al.Molecular Cloning:A Labolatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)에 따라서 행했다. 얻어진 cDNA 라이브러리(1×104개)를 한천플레이트에 뿌리고, "Hybond-N nylon menbrane"(Amersham사제)을 사용하여 리플리커(replica)를 제작했다. 리플리커와 상기 실시예 8-1에서 제작한32P 표지 프로브를 사용하여, "Rapid hybridization buffer"(Amersham사제)중에서 플라크하이브리다이제이션을 행했다. 1차 스크리닝 및 2차 스크리닝을 행하여, 8개의 포지티브·클론을 수득했다. 각 클론을 싱글플라크로 단리 후, 매뉴얼(Strategene 사)에 따라서 인비보엑시젼(in vivo Excision)에제공하여, 7개의 포지티브 클론을 플라스미드 DNA로서 회수했다.
4. 염기서열결정
7개 클론의 염기서열을, 디데옥시법에 의해, "Auto Read Sequencing Kit"(Pharmacia사제)으로 "A.L.F.DNA sequencer"(Pharmacia사제)를 사용하여 결정했다. 7개의 클론은 전부 같은 염기서열을 포함하고 있었다. 이 중 클론 "pBSh41"은 "인간 JTT-1항원"의 전장을 코드하고 있는 것이 확인되었다. "인간 JTT-1항원"의 판별 프레임(open reading frame; ORF)에 대응하는 cDNA의 염기서열을 서열번호 1에, 또한 "인간 JTT.1항원"의 추정전장아미노산서열을 서열번호 2, 또한 5' 및 3'서열을 함유하는 염기서열을 서열번호 3(ORF는, 염기번호 26 내지 625)에 나타낸다. 그 클론에 포함되는 염기서열이, "인간 JTT-1항원"의 전장을 코드하는 것은 그 염기서열로부터 연역되는 아미노산서열(199아미노산 잔기로 구성된다)이, "래트 JTT.1항원"의 아미노산서열과 유의할만한 상동성을 나타내는 것으로부터 밝혀진다(도 10). 또한 도 10에 나타낸 대로, 인간 및 래트의 "JTT.1항원"의 아미노산서열 상동성은 60% 이상이다.
또 클론 "pBSh41"에 의해 형질전환한 E.coli.DH10B(GIBCO BRL사제)를, 1996년 10월 25일부로 부다페스트조약하에 인정된 국제기탁기관인 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 히가시 1-1-3 소재의 일본국 통산성 공업기술원 생명공학기술연구소에 기탁하였다(기탁번호: FERM BP-5725).
5. "JTT-1항원"의 구조적 특징 및 생물학적 기능
연역되는 "인간 JTT-1항원"의 아미노산서열에 관한, 기지 인간 프로테인과의모티브검색을 행한 결과, "인간 JTT-1항원"은 먼저 상세하게 서술한 면역글로블린 슈퍼패밀리에 속하는 인간유래의 세포막분자인 "CD28" 및 "CTLA-4"과 다음 측면에서 구조적 유사성을 가지고 있는 것이 확인되었다(도 11 및 도 12). 전술한 바와 같이 "CD28" 및 "CTLA-4"는 T세포의 활성화 및 억제를 제어하는 면역계에서 매우 중요한 분자이다.
즉 ① 시스테인 잔기를 함유하는 20 이상의 아미노산잔기가 잘 보존되어 있다. ②: CD28 및 CTLA-4에 있어서 리간드결합영역으로서 필수적인 프롤린잔기가 연속하는 서열 "Pro-Pro-Pro(PPP)"이 보존되어 있다. 또한, ③: 세포내 도메인에, CD28 및 CTLA-4에 있어서의 시그널전달영역으로서 필수적인 서열 "Tyr-Xaa-Xaa-Met(YxxM)(Xaa 및 x는 임의의 아미노산을 의미한다. )가 보존되어 있다.
본 발명의 "JTT-1항원"은 그와 같은 면역반응의 주역인 T세포의 활성화의 제어에 있어서 중요한 역할을 하는 "CD28" 및 "CTLA-4"에 특징적인 구조와 동일한 구조를 가지므로 본 발명의 "JTT-1항원"은 이들 분자와 같이 면역반응의 주체인 T세포를 비롯한 임파구의 활성화의 제어에 있어서 중요한 역할도 하는 분자로 추측된다.
실시예 9: "마우스 JTT-1항원"을 코드하는 cDNA의 클로닝
1. 프로브의 제작
실시예 7에서 수득한 클론 "T132A7"를 제한효소 EcoRI 및 NotI에서 소화하고, "래트 JTT.1항원"을 코드하는 cDNA 약0.9 kb를 잘라내어, 아가로스겔 전기영동에 의해 분리했다. 분리한 DNA 단편을 "QUIAEX gel extraction kit"(QUIATEN사제)를 사용하여 정제하고, 얻어진 DNA 단편을 "Ready-To-Go DNA labelling kit"(Pharmacia사제)를 사용하여32P로 표지했다. 이 표지 DNA 단편을 플라크하이브리다이제이션용의 프로브로서 사용했다.
2. cDNA 라이브러리의 제작
2-(1) poly (A)+ RNA의 추출
실시예 7-1-(1)과 동일하게 하여, ConA에서 자극한 마우스 비장 유래 임파아구(약1×106cells/ml)로부터의 poly (A)+ RNA를 추출했다.
2-(2) cDNA 라이브러리의 제작
상기에서 조제한 poly (A)+ RNA 5mg를 주형으로 하여, oligo dT 프라이머(Pharmacia사제) 및 "Time Saver cDNA Synthesis Kit"(Pharmacia사제)를 사용하여 cDNA를 합성했다. 그 cDNA에 EcoRI 어댑터 부가한 뒤, 스팬컬럼(Pharmacia사제)을 사용하여 싸이즈분획을 행했다.
2-(3) 벡터로의 삽입 및 팩키징
상기에서 얻어진 EcoRI 말단을 가지는 cDNA를, EcoRI로 처리한 벡터 lZAPII(Stratagene사제)에 연결했다. 연결반응에는 "DNA ligation Kit"(다까라주조사제조)를 사용했다. 이것을 GIGA PACK II GOLD(Stratagene사제)를 사용하여 in vitro 팩키징한 뒤, 얻어진 파아지 입자를 사용하여, E coli XL1Blue MRF'(Stratagene사제)를 숙주로서 재조합 파아지를 함유하는 플라크로 된 cDNA 라이브러리를 제작했다.
3. cDNA 라이브러리의 스크리닝
스크리닝은 Rapid hybridization buffer(Amersham사제)를 사용한 플라크하이브리다이제이션법(Maniatis, T. et al. Molecular Cloning: A Labolatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)에 따라서 행했다.
상기에서 얻어진 cDNA 라이브러리(1×104개)를 한천플레이트에 파종하고, Hybond-N nylon menbrane(Amersham사제)를 사용하여 리플리커를 제작했다. 리플리커 및 상기 9-1에서 제작한32P 표지 프로브를 사용하여, Rapid hybridization buffer(Amersham사제)중에서 플라크하이브리다이제이션을 행했다. 1차 스크리닝 및 2차 스크리닝을 행하여, 5개의 포지티브·클론을 수득했다. 각 클론을 싱글프라크로 단리 후, Stratagene 사 설명서에 따라서 인비보엑시젼에 제공하여, 5 클론을 plasmid DNA로서 회수했다.
4. 염기서열결정
5개의 클론의 각각에 대하여, 디데옥시(dideoxy)법에 의해, "Auto Read Sequencing Kit"(Pharmacia사제) 및 "A.L.F.DNA sequencer"(Pharmacia사제)를 사용하여 염기서열을 결정했다. 그 5 클론중 4개의 클론은 전부 같은 염기서열을 포함하고 있었다. "마우스 JTT-1항원"의 전장을 코드하는 cDNA의 염기서열 및 추정아미노산서열을 서열번호 5에 기재한다.
도 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, "마우스 JTT-1항원"은 "래트 JTT-1항원"과 마찬가지로 200아미노산잔기로부터 구성되고, 또한 마우스, 래트 및 인간의 "JTT-1항원"은, 각각의 사이에서 유의할 정도인 아미노산서열 상동성(60% 이상)을 가지고 있었다.
5. "마우스 JTT-1항원"의 유전자의 염색체상의 위치의 해석
"마우스 JTT-1항원"을 코드하는 유전자의 염색체상의 위치를, 형광 인시투 하이브리다이제이션법에 의해 해석했다.
얻어진 "마우스 JTT-1항원"을 코드하는 cDNA를32P로 표지하고 통상의 방법에 따라서 하이브리다이제이션용 프로브를 제작했다. 이 프로브를 사용하여, 129 SVJ 마우스게노믹 DNA 라이브러리(STRATAGENE사제)를 스크리닝하고, "마우스 JTT-1항원"을 코드하는 엑손을 함유하는 마우스게노믹 DNA 클론을 취득했다. 그 게노믹 DNA의 구조를 모식적으로 나타낸 그림을 도 13에 나타낸다.
상기에서 수득한 게노믹 DNA 클론을 닉 트랜스레이션에 의해, 디곡시게닌dUTP(digoxigenin dUTP)로 표지하여 프로브로 했다. 그 표지 프로브를 분단한 마우스 DNA를 결합시킨 후, 50% 포름알데히드, 10% 황산덱스트란 및 2×SSC를 포함하는 용액중에서, 마우스 배성선 유아세포 유래의 정상적인 세포분열중기(metaphase)염색체에 하이브리다이징시켰다. 특이적 하이브리다이제이션 시그널은 하이브리다이제이션용 슬라이드를 형광표지한 항디곡시게닌 항체중에서 인큐베이트한 뒤, DAPI에서 염색함으로써 검출했다. 첫회의 시험에 있어서는,그 DNA 싸이즈 및 나타난 밴드의 상황으로부터, 1번 염색체라고 생각되는 가장 거대한 염색체의 근방 부분에 특이적 표지가 이루어질 수 있었다. 이 정보에 근거하여, 1번 염색체의 센트로메아(centromere)영역에 특이적인 프로브와 함께 상기 게노믹DNA 클론을 공하이브리다이제이션시켰다. 이 결과, 1번 염색체의 센트로메아영역과 그 근방의 영역이 특이적으로 표지되었다. 특이적 하이브리다이제이션이 보인 1번 염색체(10샘플)를 해석한 결과, 상기 게노믹 DNA 클론은 헤테로크로마틴과 유크로마틴의 경계에서 1번 염색체의 텔로메아까지의 거리의 33%의 위치, 즉 마우스 "CD28" 및 "CTLA-4"의 유전자의 염색체상의 위치와 동일한 밴드 "1C3"에 존재하는 것이 밝혀졌다. 총계 80개의 세포분열중기의 세포에 관하여 해석한 결과, 79개의 세포에서 그 위치에 특이적 표지가 확인되었다.
이 결과와 실시예 8에서 얻어진 결과, 즉 "JTT-1항원"과 "CD28" 및 "CTLA-4"의 구조적 유사성을 함께 고려하면, "JTT-1항원"이 "CD28"이나 "CTLA-4"와 마찬가지인 코스티뮬러토리시그널 전달 및/또는 임파구의 활성화의 제어에 관여하는 중요한 분자인 것으로 제안된다.
실시예 10: "래트 JTT-1항원"의 변이체를 코드하는 cDNA의 클로닝
실시예 7에서 클로닝한 "래트 JTT-1항원"의 얼터너티브·스플라이싱 변이체(alternative splicing variant)를 코드하는 것으로 생각되는 다른 하나의 cDNA를 하기와 같이 클로닝했다.
1. 프로브의 제작
실시예 7에서 수득한 클론 "T132A7"를 제한효소 EcoRI 및 NotI에서 소화하고, "래트 JTT.1항원"을 코드하는 cDNA 약0.9 kb를 잘라내고, 아가로스겔 전기영동에 의해 분리했다. 분리한 DNA 단편을 "QUIAEX gel extraction kit"(QUIATEN사제)를 사용하여 정제하고, 얻어진 DNA 단편을 "Ready-To-Go DNA labelling kit"(Pharmacia사제)를 사용하여32P로 표지했다. 이 표지 DNA 단편을 플라크하이브리다이제이션 용의 프로브로서 사용했다.
2. cDNA 라이브러리의 제작
2-(1) poly (A)+ RNA의 추출
실시예 7-1-(1)과 동일하게 하여 래트흉선종 세포주 FTL435(약1×106cells/ml)로부터의 poly(A)+ RNA를 추출했다.
2-(2) cDNA 라이브러리의 제작
상기한 바와 같이 조제한 poly (A)+ RNA 5mg을 주형으로 하여, oligo dT 프라이머(Pharmacia사제) 및 "Time Saver cDNA Synthesis Kit"(Pharmacia 사제조)를 사용하여 cDNA를 합성했다. 그 cDNA에 EcoRI 어댑터를 부가한 뒤, 스팬컬럼(Pharmacia사제)를 사용하여 싸이즈분획을 행했다.
2-(3) 벡터로의 삽입 및 팩키징
전술한 바와 같이 하여 얻어진 EcoRI 말단을 가지는 cDNA를, EcoRI로 처리한 벡터 lZAPII(Stratagene사제)에 연결했다. 연결반응에는 "DNA ligation Kit"(다까라주조사제)를 사용했다. 이것을 GIGA PACK II GOLD(Stratagene 사제)를 사용하여in vitro 팩키징한 뒤, 얻어진 파아지입자를 이용하여, E coli XL1Blue MRF'(Stratagene사제)를 숙주로서 재조합 파아지를 함유하는 플라크로 된 cDNA 라이브러리를 제작했다.
3. cDNA 라이브러리의 스크리닝
스크리닝은 Rapid hybridization buffer(Amersham사제)를 사용하고 플라크하이브리다이제이션법(Maniatis, T. et al. Molecular Cloning: A Labolatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)에 따라서 행했다.
상기에서 조제한 cDNA 라이브러리(1×104개)를 한천플레이트에 뿌리고, Hybond-N nylon menbrane(Amersham사제)를 사용하여 리플리커를 제작했다. 그 리플리커 및 상기 10-1에서 제작한32P 표지 프로브를 사용하여, Rapid hybridization buffer(Amersham사제)중에서 플라크하이브리다이제이션을 행했다. 1차 스크리닝 및 2차 스크리닝을 행하여 2개의 포지티브·클론을 수득했다. 각 클론을 싱글플라크로 단리 후, Stratagene 사 설명서에 따라서 인비보엑시젼에 제공하여, 2 클론을 plasmid DNA로서 회수했다.
4. 염기서열결정
2개의 클론의 각각에 대하여 디데옥시(dideoxy)법에 의해 "Auto Read Sequencing Kit"(Pharmacia사제) 및 A.L.F.DNA sequencer(Pharmacia사제)를 사용하여 염기서열을 결정했다. 2개의 클론은 전부 같은 염기서열을 함유하고 있었다.얻어진 "래트 JTT-1항원"의 전장을 코드하는 cDNA의 염기서열 및 추정 아미노산서열을 서열번호 6에 기재한다. 얻어진 cDNA 서열로부터 연역되는 아미노산서열(서열번호6)을, 실시예 7에서 클로닝한 "래트 JTT-1항원"을 코드하는 cDNA 서열로부터 연역되는 아미노산서열(서열번호4)과 비교하였다(도 14). 그 결과, 도 14로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 시험에서 클로닝된 cDNA에 의해 코드되는 아미노산서열은, 실시예 7에서 얻어진 "래트 JTT.1항원"을 코드하는 cDNA에 의해 코드되는 아미노산서열과 비교하여, ① C 말단의 3가지의 연속하는 아미노산서열(Met-Thr-Ser)이 Thr-Ala-Pro으로 변화하고 있는 점, 및 ② 그 Thr-Ala-Pro에 계속해서 또한 16의 연속하는 아미노산잔기(Leu-Arg-Ala-Leu-Gly-Arg-Gly-Glu-His-Ser-Ser-Cys-Gln-Asp-Arg-Asn)가 연장되어 있다고 하는 2개의 상위점 이외에는, 완전히 동일한 아미노산서열이었다. 이로부터 본 시험에서 클로닝된 cDNA는, 실시예 7에서 얻어진 "래트 JTT.1항원"의 얼터너티브·스플라이싱 변이체(alternative splicing valiant)를 코드하고 있다고 생각된다.
실시예 11: 재조합 "인간 JTT-1항원" 발현세포의 조제
실시예 8에서 취득한 플라스미드 클론 pBSh41을, 제한효소 EcoRI에서 소화하여, "인간 JTT-1항원"의 전장을 코드하는 cDNA를 함유하는 DNA 단편을 잘라내었다. 이 DNA 단편을 DNA 라이게이션킷트(다까라주조사제)를 사용하여, 함께 제한효소 EcoRI로 처리한 플라스미드 pEFneo(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 91, 158-162, 1994)에 삽입하여 발현 벡터를 제작했다. 일렉트로포레이션에 의해, 그 벡터에서 CHO-K1세포(ATCC: CCL-61)를 형질전환했다. 세포를, Geneticin(0.8 mg/ml; GIBCO BRL 제조) 및 10% 소태아혈청(fetal calf serum)을 함유하는 RPMI1640배지중에서 약2주간 배양함에 의해, Geneticin 내성 형질전환세포를 선별했다. 재조합 "인간 JTT-1항원"의 발현은, 통상의 방법으로 노던블로팅(Northern blotting)에 의해 확인했다.
실시예 12: "인간 JTT.1항원"에 대한 모노클로날항체의 조제
실시예 11에서 조제한 재조합 "인간 JTT-1항원"을 발현하는 형질전환세포를, 호모디나이즈하여, 초원심분리(100,000×g)하고, 세포막 분획을 함유하는 원심잔류물을 회수하고, PBS로 현탁시켰다. 얻어진 세포막획분을, 완전 프로인트 어쥬번트와 함께 BALB/c 마우스의 푸드패드내에 주사함에 의해 첫회 면역(0일)했다. 또한 그 세포막획분 항원을 7일째, 14일째 및 28일째라는 간격으로 푸드패드 내에 투여했다. 최후의 면역으로부터 2일 뒤에 임파관절세포를 채취했다. 그 임파관절세포와 마우스 미에로마 세포 PAI(JCR No.B 0113; Res. Disclosure, Vol.217, p.155, 1982)을 5:1로 혼합하여, 융합제로서 폴리에틸렌글리콜4000(GIBCO 제조)을 사용하여 세포융합시킴으로써 모노클로날항체생성 하이브리도마를 제작했다. 하이브리도마의 선택은, 10% 소태아혈청과 아미노프테린을 함유하는 HAT 함유 ASF104배지(아지노모도제)중에서 배양함에 의해 행했다. 각각의 하이브리도마의 배양상청중에 생성된 모노클로날항체의 "인간 JTT-1항원"에 대한 반응성은, 각각의 배양상청을 실시예 11에서 조제한 재조합 "인간 JTT-1항원"을 발현하는 형질전환세포와 반응시킨 뒤, FITC 표지 항마우스 IgG(Cappel제)으로 반응시킴으로써 염색된 세포의 형광강도를 EPICS-ELITE 플로우사이토메트리로 측정함에 의해 확인했다. 이 결과 "인간 JTT-1항원"에 반응성을 가지는 모노클로날항체를 생성하는 10종이상의 하이브리도마가 얻어졌다는 것이 확인되었다.
이들 하이브리도마중의 두가지(각각 클론 SA12 및 SG430 명명)의 각각(106내지 107개/0.5ml/마우스)을, ICR nu/nu 마우스(암컷, 7 내지 8주 나이)의 복강 내에 주사했다. 10 내지 20일 뒤, 마우스를 마취하에 개복하여, 통상의 방법에 따라서 채취한 복수로부터 "인간 JTT-1항원"에 반응성을 가지는 두가지의 모노클로날항체(SA12및 SG430)를 대량 조제했다.
실시예 13: "인간 JTT-1항원"에 대한 모노클로날항체의 인간말초혈 임파구에 대한 효과
실시예 8에서 서술한 대로, "JTT-1항원"은 "CD28"이나 "CTLA-4"과 마찬가지로 면역반응에 있어서의 임파구세포의 활성화의 제어에 관여하는 가능성을 가진다고 생각된다. 이 가능성을 실증하기 위해서, "인간 JTT-1항원"에 대한 모노클로날항체의 인간 임파구에 대한 효과를 세포의 증식을 지표로서 해석했다.
96구멍 마크로타이타플레이트의 각 웰에 ① 실시예 12에서 조제한 "인간 JTT-1항원"에 대한 모노클로날항체 SA12 또는 SG430중 어느 한쪽(1㎍/ml)만, 또는 ② 모노클로날항체 SA12 또는 SG430중 어느 한쪽(1㎍/ml)과 임파구의 활성화에 있어서의 제1시그널 부여를 위한 항CD3모노클로날항체 OKT-3(1㎍/ml, 온·오르토다이아그노스틱·시스템즈사제)의 혼합용액을 가하여 37℃에서 1시간 배양하고 각 웰을 그 항체로 코팅했다. 플레이트를 RPMI1640배지에서 세척한 뒤, 각 웰에 정상인간 말초혈 임파구(1×105cells/well)를 가하고, 10% 소태아혈청을 함유하는 RPMI1640배지중에서 3일간 배양했다. 필요에 따라서 PMA(phorbol myristate acetate:1 ng/ml)를 첨가했다. 이어서 각 웰에 [3H]티미딘(3.7μkBq/웰)을 첨가하고, 37℃에서 6시간 배양했다. 세포를 회수(하베스트)하여, DNA 내에 받아들인 [3H]티미딘의 양을 액체 섬광계수기(scintillation counter)(베크만제)를 사용하여 측정했다. 또 어떤 항체도 가하지 않는 배양계를 대조로 했다. 결과를 도 15에 나타내었다.
모노클로날항체 SA12 또는 SG430중 어느 것을 단독으로 처리한 경우에는, 어떤 항체를 사용한 경우에도 대조와 비교하여 임파구가 약10배로 증식했다. 또한 OKT3과의 병용의 경우에는 모노클로날항체 SA12 또는 SG430의 어는 것을 사용한 경우에도 임파구가 약100배로 증식했다.
이 결과는 "JTT-1항원"이 임파구의 활성화의 제어에 있어서 기능하는 것을 나타내는 것이다. 또한 OKT3과의 병용에 의해 세포증식율이 증폭되었기 때문에 "JTT-1항원"이 "CD28"이나 "CTLA-4"와 같은 코스티뮬러토리·시그널의 전달을 담당하는 것을 나타내는 것이다.
실시예 14: 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)에 대한 "JTT-2항체"의 효과
이미 상세하게 서술한 바와 같이 최근 CD28/CTLA-4-CD80/CD86의 사이의 시그널전달을 조절하여 여러 가지 자기면역성질환(만성관절류마티즘, 다발성경화증, 자기면역성갑상선염, 알레르기성 접촉성피부염, 만성염증성 피부질환인 편평태선, 전신성 홍반성낭창, 인슐린의존성 당뇨병 및 건선 등)의 치료의 시도가 다수 이루어져 오고 있다. 이미 여러 가지 자기면역질환모델동물(① 인간전신성 홍반성낭창(SLE)의 모델, ② 다발성경화증(MS)의 모델인 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE), ③ 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)모델, ④ 굳파스쳐(Goodpasture)의 신장염모델, ⑤ 인간만성관절류마티즘모델)에서 그 효과가 확인되고 있다.
본 발명의 "JTT-1항원"이 "CD28"이나 "CTLA-4"같은 임파구의 활성화 또는 그 억제에 관여하는 분자인가 아닌가를 확인하기 위해서, 다발성경화증(MS)의 모델인 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)모델 래트를 제작하여, 그 모델에 있어서의 "JTT-1항원"에 대한 모노클로날항체의 효과를 해석했다.
Hartley 모르모트의 뇌척수 호모지네이트(800mg/ml 생리식염수)를 등량의 프로인트 완전 어쥬번트와 혼화하여 면역감작 항원으로서의 유탁액을 조제했다. 그 유탁액을, 루이스 래트(암컷, 6주 나이, 15마리)의 좌우의 족지(foot pads)에 각각 0.25ml씩 피내투여함에 의해 면역감작했다. 또 그 투여는 그 호모지네이트의 투여량이 래트 1마리당 200mg이 되도록 행했다. 이 면역감작에 의하여, 알레르기성 뇌척수염(EAE)을 유도시킬 수 있다.
면역감작한 래트를 5마리씩의 3군으로 나누고, 각 군마다, 다음 ① 내지 ③ 중 어느 것을, 면역감작 직후(0일) 및 그 면역감작으로부터 3일째, 6일째, 9일째 및 12일째에 정맥내 투여했다.
① 실시예 2에서 제작한 "래트 JTT-1항원"에 대한 모노클로날항체 "JTT-2항체"(투여량: 2 mg/ml PBS, 5 mg/kg);
② 스테로이드제 프리드니졸론(투여량: 4 mg/ml PBS, 10 mg/kg); 및
③ "래트 JTT-1항원"에 반응하지 않는 대조항체(투여량: 2 mg/ml PBS, 5 mg/kg).
면역감작으로부터 경시적으로 증상을 관찰하여, EAE 발증이 인식된 시점에서 그 증상을 다음 기준으로써 점수화함에 의해 증상의 정도를 평가했다.
(스코어 1) 꼬리의 긴장의 소실;
(스코어 2) 뒷다리를 질질 끔, 및 경도의 마비;
(스코어 3) 뒷다리를 질질 끔, 및 중도의 마비; 및
(스코어 4) 전신의 마비 또는 사망.
결과를 도 16에 나타낸다. 대조항체를 투여한 군에서는, 면역감작으로부터 11 내지 15일째에 EAE 증상이 피크(스코어 최대)로 되고, 그 후 점차 회복했다. 한편 "JTT-2항체" 투여군에서는, 감작 뒤 11일째의 EAE 증상의 발증이 유의할 정도로 억제되었다. 이 억제효과는 프리드니졸론 투여군과 비교하여 유의할 정도로 높은 것이었다.
이 결과는, "JTT-1항원"은 외래항원에 의한 면역감작에 의하여 야기되는 임파구의 활성화를 비롯한 면역응답의 유도에 있어서 기능하는 분자이며, "JTT-1항원" 또는 그 리간드의 기능을 제어함에 의해 여러 가지 자기면역질환의 증상을 억제할 수 있는 것을 나타내는 것이다.
실시예 15: 사구체 신장염에 대한 "JTT-2항체"의 효과
실시예 14와 같은 목적을 위하여, 사구체 기저막(GBM) 신장염모델 래트를 제작하고, 그 모델에 있어서의 "JTT-1항원"에 대한 모노클로날항체의 효과를 해석했다.
콜라게나제에 의해 소화한 소사구체 기저막(시게노이 의학연구소제)을 생리식염수로 200㎍/ml의 농도로 희석한 뒤, 프로인트 완전 어쥬번트와 혼화하여 면역감작 항원으로서의 유탁액을 조제했다. 에테르 마취하에, 위스타·쿄토계 래트(wister kyoto, 약200g, 48마리)의 양쪽 뒷다리의 저피내에 각각 약0.2 ml(항원량: 약15㎍)씩 투여함에 의해 면역감작했다. 이 면역감작에 의하여 사구체 기저막(GBM)신장염이 유도된다.
면역감작한 래트를 6마리씩의 8군으로 나누고, 각 군마다, 다음 ① 내지 ③ 중 어느 것을, 면역감작 직후(0일) 및 그 후 일주일에 3회 씩 5주간에 걸쳐 투여했다.
① 실시예 2에서 제작한 "래트 JTT-1항원"에 대한 모노클로날항체 "JTT-2항체"(투여량: 3mg/kg(2ml PBS/kg), 정맥내 투여);
② 양성대조로서의 스테로이드제 프리드니졸론(0.5% CMC(카르복시메틸셀룰로즈)중에 현탁)(투여량: 3mg/kg(5ml/kg), 경구투여); 및 ③ 음성대조로서의 0.5% CMC(투여량: 5 ml/kg, 경구투여).
피검물질의 투여 뒤, 각각의 래트에 멸균물(25ml/kg)을 강제로 경구투여하고, 1마리씩 대사케이지내에 넣어 절식절수하에 5시간에 걸쳐 뇨를 채취했다. 채취한 뇨의 량을 측정한 뒤, 뇨중 단백농도를 토네인 TP-II(오츠카제약제)를 사용하여 측정하고, 5시간마다의 뇨중 단백 배설량(단위: mg 단백/5시간)을 산출했다. 상기 뇨채취 및 뇨중 단백량의 측정은, 면역감작(0일째)으로부터 1주일째, 2주일째, 3주일째 및 4주일째의 각 시점에서 동일하게 하여 행했다.
결과를 도 17에 나타내었다. 대조군과 비교하여, "JTT-2항체" 투여군으로서는 면역감작으로부터 3주째의 뇨중 단백 단백배설량을 유의할 정도로 감소시켰다.
이 결과는 "JTT-1항원"은 외래항원에 의한 면역감작에 의하여 야기되는 임파구의 활성화를 비롯한 면역응답의 유도에 있어서 기능하는 분자이며, "JTT-1항원" 또는 그 리간드의 기능을 제어함에 의해 여러 가지 자기면역질환의 증상을 억제할 수 있는 것을 나타내는 것이다.
실시예 16: "JTT-1항원"과 IgFc의 융합단백의 조제
실시예 8, 13 내지 15에서 서술한 바와 같이, 본 발명의 "JTT-1항원"은, "CD28"이나 "CTLA-4"같은 임파구의 활성화의 제어에 관계되는 코스티뮬러토리·시그널전달에 관여하는 분자라고 생각된다. 또한 실시예 14에서 서술한 대로, "CTLA-4"의 세포외 도메인과 인간면역글로블린 IgG1의 Fc 영역으로 되는 융합 프로테인(CTLA-4-IgFc)은 여러 가지 자기면역질환의 치료효과를 가지는 것이 보고되고 있다. 본 실시예에서는, CTLA-4-IgFc과 같은 가용화 JTT-1항원의 여러 가지 자기면역질환의 치료에의 적용가능성을 확인하기 위해서 "JTT-1항원"의 세포외영역을 인간 IgGFc으로 되는 융합단백을 하기와 같이 조제했다.
(1) "래트 JTT-1항원"과 인간 IgG1-Fc과의 융합단백(rJTT-1-IgFc)의 조제
"래트 JTT-1항원"의 세포외영역을 코드하는 cDNA를 PCR에서 증폭하기 위해서, 말단에 XhoI 절단부위를 가지는 5'프라이머(5'-CTGCTCGAGATGAAGCCCTACTTCTCG-3', 서열번호 7) 및 BamHI 절단부위를 가지는 3'프라이머(5'-ACCCTACGGGTAACGGATCCTTCAGCTGGCAA-3', 서열번호 8)를 설계, 합성했다. 실시예 7에서 취득한 "래트 JTT-1항원"의 전장을 코드하는 cDNA를 클론 "T132A7"을 주형으로서 그 프라이머를 사용하여 PCR을 행하고, 양단에 XhoI 및 BamHI 절단부위를 각각 가지는 "래트 JTT-1항원"의 세포외영역을 코드하는 cDNA를 함유하는 cDNA를 조제했다. 얻어진 PCR 산물을 XhoI 및 BamHI에서 소화하고, 아가로스겔 전기영동하여 원하는 세포외영역을 코드하는 cDNA 단편이라고 예측되는 약450bp 싸이즈의 밴드를 단리했다. 단리된 cDNA 단편을, XhoI 및 BamHI에서 절단한 플라스미드 pBluescript II SK(+)(Stratagene 제조)중에 서브 클로닝했다. 자동형광 DNA 시퀀서(Applied Biosystems제)에 의한 서열해석에 의해, 그 cDNA 단편은, "래트 JTT-1 항원"(서열번호 4)의 아미노산번호 1 내지 141까지의 영역을 코드하는 영역을 함유하는 것을 확인했다.
한편 융합파트너로서의 인간 IgG1의 Fc를 코드하는 DNA는, 플라스미드(Cell, Vol.61, p.1303-1313, 1990참조. 매사츄세츠·제네랄·호스피탈의 시드박사(B. Seed) 등에 의해 제작)를, BamHI 및 XbaI에서 소화함에 의해 BamHI-XbaIDNA 단편(약1.3 kb)으로 하여 잘라내었다. 이 단편에는 인간 IgG1의 힌지영역, Cγ12 및 Cγ13을 각각 코드하는 엑손이 포함된다.
상기한 바와 같이 하여 제작한 "래트 JTT-1항원"의 세포외영역을 코드하는 XhoI-BamHI 단편 및 인간 IgG1의 Fc("IgFc"이라고 약기한다)를 코드하는 엑손을 함유하는 BamHI-XbaI 단편을, XhoI 및 XbaI에서 절단한 플라스미드 pBluescript II SK(+)(Stratagene제)중에 서브 클로닝했다.
이어서 그 플라스미드를 XhoI 및 XbaI에서 소화하고, "래트 JTT-1항원"의 세포외영역과 인간 IgFc으로 되는 융합 DNA를 함유하는 약1.8 kb의 DNA 단편을 꺼내었다. 이 융합 DNA 단편을, T4 DNA 리가제를 사용하고, 발현 벡터 pME18S(Medical Immunology, Vol.20, No.1, p.27-32, 1990, 및 실험의학(별책): "유전자공학핸드북", 요도사, 제101-107페이지, 1992년)의 XhoI 및 XbaI 부위에 삽입하여 플라스미드 prJTT-1-IgFc를 구축했다.
일렉트로포레이션법에 의해, 10% 소태아혈청 및 암피실린을 함유하는 DMEM 배지중에서 서브컨플루언틀리(subconfluently) 단층 배양한 HEK293세포(ATCC CRL1573)를, 플라스미드 prJTT-1-IgFc에서 형질전환하여 형질전환세포를 취득했다.
형질전환세포를 무혈청 ASF104배지중에서 72시간 배양하여 rJTT-1-IgFc를 발현시켰다.
rJTT-1-IgFc는, Protein G Sepharose 어피니티 컬럼(Pharmacia제)을 사용하여 다음과 같이 정제했다.
상기 배양상청을 원심분리하여 수득한 원심상청을, 미리결합완충액(binding buffer)으로 평형화한 Protein G Sepharose 어피니티컬럼에 가했다. 이어서 컬럼을 결합완충액으로 세척한 뒤, 용출완충액(elution buffer)으로 용출시켰다. 용출액을 회수하고, 인산완충액으로 2회 이상 외액교환함에 의해 투석하여 정제 rJTT-1-IgFc를 수득했다.
어피니티컬럼크로마토그래피의 결과를 도 18에, 또한 얻어진 정제 rJTT-1-IgFc의 SDS-PAGE의 결과를 도 19에 나타낸다.
(2) "인간 JTT-1항원"과 인간 IgG1-Fc과의 융합단백(hJTT-1-IgFc)의 조제
PCR 용에 있어서의 주형으로서의 cDNA 및 프라이머를 제외하고는, 상기 (1)과 동일하게 하여 조제했다. 본 시험에서는 주형으로서는, 실시예 8에서 제작한 "인간 JTT-1항원"의 전장을 코드하는 cDNA를 함유하는 클론 "pBSh41"를 사용하고, 또한 5'프라이머로서는 5'-TAACTGTTTCTCGAGAACATGAAGTCAGGC3'(서열번호 9)를, 3'프라이머로서는 5'-ATCCTATGGGTAACGGATCCTTCAGCTGGC3'(서열번호 10)를 사용했다.
어피니티컬럼 크로마토그래피의 결과를 도 20에, 또한 얻어진 정제 hJTT-1-IgFc의 SDS-PAGE의 결과를 도 21에 나타낸다.
실시예 17: "래트 JTT-1항원"을 코드하는 cDNA 도입형질전환마우스의 제작
실시예 7에서 취득한 "래트 JTT-1항원"의 전장을 코드하는 cDNA를, 닭β액틴프로모터를 가지는 발현 벡터 pCAGGS(Gene, Vol.108, p.193-200, 1991)에, DNA 말단 평활화키트(타카라사제)를 사용하여 삽입하여 플라스미드 prJTT-1을 수득했다. 형질전환마우스제작을 위해, prJTT-1를 제한효소처리하여 직쇄상으로 했다.
양모마우스에는, 백색 ICR 마우스(암컷, 일본에스엘시사제)와 정관결찰한 백색 ICR 마우스(수컷, 일본에스엘시사제)를 교배하여 얻어진 플러그(또는 질전(vaginal plug))를 가지는 암컷 ICR 마우스를 사용했다. 또한 "래트 JTT-1항원"유전자를 도입하기 위한 수정란을 수득하기 위한 채난용 마우스는, PEAMEX(5유닛, 산쿄조키사제) 및 푸레그닐(5유니트, 올가논사제)을 투여하여 과잉배란시킨 BDF-1마우스(암컷, 일본에스엘시사제)를 BDF-1마우스(수컷, 일본에스엘시사제)와 교배시켜 제작했다. 교배 뒤, BDF-1마우스(암컷)으로부터 난관부를 적출하고, 히알루로니다제(hyaluronidase)처리에 의해 수정란만을 수득하여, 배지중에 저장했다.
수정란으로의 "래트 JTT-1항원" 유전자의 도입은, 현미경하에 매니풀레이터(manipulator)를 사용하여 통상의 방법에 의해 행했다. 수정란을 보정침으로 고정하고, 37℃ 조건하, 트리스 EDTA 완충액으로 희석한 "래트 JTT-1항원"을 코드하는 상기 직쇄상 유전자를 함유하는 용액을, DNA 도입침을 사용하여 수정란의 웅성전 핵내에 주입(마이크로인젝션)했다.
유전자도입 뒤, 정상적인 상태를 유지하는 수정란만을 선별하여, 양모마우스(백색 ICR 마우스)의 난소 내에 있는 난관채에, "래트 JTT-1항원" 유전자도입 수정란을 삽입했다.
양모로부터 태어난 자마우스(파운다)의 꼬리를 잘라내어 게놈유전자를 회수하고, PCR에 의해 마우스 게놈내에 "래트 JTT-1항원" 유전자가 도입되어 있는 것을 확인했다. 이어서, 이 파운다를 정상마우스와 교배시킴으로써 "래트 JTT-1항원"을 고발현하는 헤테로형질전환마우스를 제작했다. 그 헤테로마우스끼리를 함께 교배시켜 호모마우스를 제작할 수 있다.
마이크로인젝션한 "래트 JTT-1항원"유전자를 함유하는 콘스트럭트의 모식도를 도 22에 나타낸다.
실시예 18: "마우스 JTT-1항원"을 코드하는 내재성유전자를 불활성화한 노크아웃마우스의 제작
(1) 타게팅 벡터의 구축
"마우스 JTT-1항원"을 코드하는 내재성유전자를 상동 재조합(닛께이 사이언스, 1994년 5월호, 제52-62페이지)에 의해 불활성화(노크아웃)하기 위한 타게팅벡터를 하기와 같이 하여 구축했다.
실시예 9-5에서 클로닝한 "마우스 JTT-1항원"을 코드하는 영역을 함유하는 마우스게노믹 DNA 클론을, PstI 및 HindIII에서 소화하여 수득한 PstI-HindIII 단편("상동 DNA①")을, 플라스미드 pGEM-3(프로메가제)에 서브 클로닝했다. 이어서, pGEM-3를 XhoI에서 개환하고, 플라스미드 pMC1-neo-polyA(Stratagene제)를 XhoI 및 SalI로 처리하여 잘라낸 네오마이신 내성유전자("neo")를, 그 "상동 DNA①"의 상류에 삽입, 연결했다.
상기 마우스게노믹 DNA 클론을 XhoI 및 NotI에서 소화하고, 상술한 "상동 DNA①"보다 상류에 위치하는 약5.5 kb의 유전자("상동 DNA ②")를 잘라내었다. 한편 전술한 "neo-상동 DNA①"을 삽입한 pGEM-3을, XhoI 및 HindIII에서 소화하여 "neo-상동 DNA①"을 잘라내었다. 얻어진 "상동 DNA②"와 "neo-상동 DNA①"을, NotI및 HindIII에서 개환한 플라스미드 pSEAP2-CONT(클론텍제)에 서브 클로닝했다.
얻어진 플라스미드("상동 DNA②-neo-상동 DNA①"이 삽입되어 있다)를, NruI를 사용하여 "상동 DNA①"의 하류에서 소화, 개환한 뒤, 플라스미드 pMC1-TK(Stratagene 제조)를 PvuII에서 소화하여 수득한 티민키나제유전자("TK")를, "상동 DNA①"의 하류에 삽입, 연결하여, 타게팅벡터("상동 DNA②-neo-상동 DNA①-TK"이 삽입되어 있다)를 수득했다.
(2) 타게팅벡터의 ES 세포로의 도입
15% 소태아혈청을 함유하는 DMEM 배지중에서 배양한 마우스배성간세포(ES 세포; embryonic stem cell)(Nature, Vol.362, p.255-258, 1993및 Nature, Vol.326, p.292-295, 1987)를 트립신으로 처리하여 단일세포로 한 뒤, 인산완충액으로 3회 세척하여 세포농도를 1×107세포/ml로 조제했다. 세포현탁액 1ml당 25㎍의 상기 타게팅벡터를 가하여, 350 V/cm(25μF)의 조건하에서 전기펄스를 한 번 걸었다. 이어서 접시(10cm)에 1×107세포의 ES 세포를 파종(plated)하여 유지배지중에서 하루 배양한 뒤, 배지를 선택배지(G418(250㎍/ml) 및 2μM의 간시클로버(ganciclovir)를 함유한다)로 교환했다. 이후 2일 마다 배지변환을 행하여 배양했다. 타게팅벡터 도입으로부터 10일째에, 마이크로 피펫을 사용하여, 현미경하에 573개의 네오마이신내성 ES 세포 클론을 취득했다. 얻어진 ES 세포 클론을, Feeder 세포를 깐 24구멍플레이트로 각각 따로따로 배양하여, 768개의 네오마이신내성 ES 세포의 리플리커를 취득했다.
(3) 노크아웃 ES 세포의 스크리닝
얻어진 네오마이신내성 ES 세포의 각각에 관한, 상동 재조합기에 의한 "마우스 JTT-1항원"을 코드하는 내재성유전자의 파괴(노크아웃)가 일어나 있는가 아닌가를 PCR에 의해 확인했다.
PCR에는, (1) 상기 네오마이신내성 유전자("neo")의 서열에 따라서 설계, 합성한 프라이머(5'-CGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGC-3',서열번호11)) 및 ② 상기 "상동 DNA①"의 서열에 따라서 설계, 합성한 프라이머(5'-CATTCAAGTTTCAGGGAACTAGTCCATGCGTTTC-3',서열번호12)를 사용했다.
각각의 네오마이신내성 ES 세포에 대하여 게노믹 DNA를 추출하고, 이들을 주형으로 하고, 그 프라이머를 사용하여 PCR을 행했다. PCR은 94℃에서 3분의 반응을 1싸이클, 94℃에서 1분, 60℃에서 1분 및 72℃에서 3분 30초의 3가지의 반응으로 이루어지는 반응을 30싸이클, 및 72℃에서 10분의 반응을 1싸이클 행한 뒤, 4℃에서 보존했다. 이 PCR에 의해 약4kb 약의 프래그먼트가 증폭되는 경우에는, 그 ES 세포 클론으로서는 상동 재조합에 의한 "마우스 JTT-1항원"을 코드하는 내재성유전자의 파괴(노크아웃)가 일어나고 있는 것이라고 판단할 수 있다.
그 결과, 시험한 768개의 ES 세포 클론중, 3 클론에 있어서 원하는 PCR 산물이 얻어졌다. 이들 3클론에 관한 게노믹 사우선블로팅을 행하고, 또한 선발 및 확인을 했다. 그 3 클론의 게노믹 DNA를 추출하여, 제한효소 BamHI에서 소화 뒤, 아가로스겔로 전기영동을 행했다. 이것을 나일론멤브레인에 트랜스퍼하고, "마우스 JTT-1"의 게노믹 DNA 서열에 의해 제작한 프로브를 사용하여, 하이브리다이제이션을 행했다. 그 프로브는, 상동재조합이 발생하는 부위보다 외측의 서열로서, 변이형 게놈과 보통형 게놈을 싸이즈적으로 분별되도록 부위의 서열을 기초로 설계했다.
그 결과, 3 클론 내의 1클론에서, 변이형과 보통형의 2자루의 밴드가 확인되었다. 이 ES 세포 클론을 하기에 서술하는 노크아웃마우스의 제작에 사용했다.
(4) 노크아웃마우스의 제작
상기에서 수득한 "마우스 JTT-1항원"을 코드하는 내재성유전자가 상동 재조합에 의하여 불활성화(노크아웃)된 ES 세포를, C57BL6마우스(일본챨즈리버제)의 수컷암컷을 교배하여 수득한 배반포에 1배당 15개씩 주입(마이크로인젝션)했다. 주입 직후에, 가임신(pseudopregnant)처리하고 나서 2.5일째의 양모 ICR 마우스(일본구레아제)의 자궁에 자궁의 한쪽당 약10개씩의 배반포를 이식했다. 그 결과, 합계 38마리의 산아를 수득하고, 그 안의 18마리가 원하는 키메라마우스이었다. 모색(hair color)으로의 공헌도가 80% 이상의 키메라마우스는 11마리였다.
이어서 얻어진 키메라마우스를 정상 C57BL6마우스와 교배하여, ES 세포유래의 모색유전자에 의한 아그티(agouti)색의 마우스를 수득했다.
실시예 19: 항체의약조성물의 조제
실시예 1에서 조제한 "래트 JTT-1항원"에 대한 모노클로날항체 "JTT-1항체" 및 "JTT-2항체"의 각각, 및 실시예 12에서 조제한 "인간 JTT-1항원"에 대한 모노클로날항체 "SA12" 및 "SG430"의 각각(50~150㎍/ml)을 주사용 증류수(10 ml)에 가하여 주사제로 했다.
본 발명에 의해 제공되는 인간, 마우스 및 래트 등의 포유동물 유래의 신규한 세포표면분자("JTT-1항원"이라고 부른다)는 하기와 같은 특징을 가지는 것이다.
(1) T세포의 활성화에 중요한 코스티뮬러토리시그널 세포간접착을 통해 전달하는 T세포 등의 임파구의 세포표면분자인 "CD28" 및 그 시그널에 연동하여 활성화 T세포 등의 활성화 임파구의 기능제어를 행하는 T세포 등의 임파구의 세포표면분자인 "CTLA-4"와 하기와 같은 유사성을 가진다.
① 시스테인잔기를 함유하는 20 이상의 아미노산잔기가 잘 보존되어 있다.
② 리간드결합영역으로서 필수적인 프롤린잔기가 연속하는 서열 "Pro-Pro-Pro(PPP)"이 세포외영역에 보존되어 있다.
③ 시그널전달영역으로서 필수적인 서열 "Tyr-Xaa-Xaa-Met(YxxM)(Xaa 및 x는 임의의 아미노산을 의미한다. )이 세포내영역에 보존되어 있다.
④ "마우스 JTT-1항원"을 코드하는 유전자의 마우스염색체상에서의 위치는, 마우스의 "CD28" 및 "CTLA-4"의 위치와 같으며, "1C3"이다.
(2) 세포간접착을 매개하는 기능을 가지는 "CD28" 및 "CTLA-4"와 마찬가지로, "JTT-1항원"은 흉선세포, ConA 등의 마이토젠으로 자극한 임파아구 및 흉선종세포의 세포간접착을 매개하는 능력을 가진다.
(3) 적어도 흉선세포, ConA 등의 마이토젠으로 자극한 임파아구세포(활성화 T 임파아구세포나 활성화 B 임파아구세포), 말초혈 임파구및 흉선종세포로 강하게발현한다.
(4) "JTT-1항원"에 위치하는 항체는, 인간말초혈 임파구를 유의할 정도로 증식시키고, 또한 그 증식은 T세포의 활성화에 필수적인 항원제시세포로부터의 제1의 시그널을 받는 T세포상의 TcR/CD3복합체를 구성하는 CD3에 대한 모노클로날항체를 공존시킴으로써 또한 높은 증식을 유도한다.
(5) "JTT-1항원"에 위치하는 항체를, 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE)에 투여함에 의해, 그 증상이 유의할 정도로 억제가 된다.
(6) "JTT-1항원"에 위치하는 항체를, 사구체 기저막(GBM)신장염의 모델래트에 투여함에 의해, 그 증상이 유의할 정도로 억제가 된다.
이러한 특징으로부터, 본 발명의 "JTT-1항원"은, 상기 "CD28"이나 "CTLA-4"와 마찬가지로, T세포 등의 임파구의 활성화에 필수적인 제2의 시그널(코스티뮬러토리시그널 전달 및 그 시그널에 연동하여 활성화 T세포 등의 활성화 임파구의 기능제어를 행하는 분자라고 생각된다.
따라서 그와 같은 세포표면분자를 구성하는 본 발명의 폴리펩티드, 폴리펩티드단편, 융합폴리펩티드 및 항체는, T세포 등의 임파구의 활성화 및 활성화 임파구의 기능제어의 이상에 기인하는 여러 가지 자기면역성질환, 알레르기성질환 또는 염증성질환, 구체적으로는 만성관절류마티즘, 다발성경화증, 자기면역성갑상선염, 알레르기성 접촉성피부염, 만성염증성피부질환인 편평태선, 전신성 홍반성낭창, 인슐린의존성당뇨병 및 건선 등의 치료 또는 예방에 매우 유용한 의약품을 제공하는 것이 가능하다.
마찬가지로, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드단편을 코드하는 유전자는, 그 여러 가지 질환의 유전자치료를 가능하게 하는 것 뿐만 아니라, 안티센스의약품을 제공하는 것이 가능하다.
본 발명의 항체중에서도, 인간모노클로날항체 및 그 의약조성물은, 마우스유래의 항체 등의 비인간포유동물유래의 항체로 이루어지는 항체의약품의 치료상의 큰 문제점(부작용)인 인간에 대한 항원성을 전혀 갖지 않으므로, 의약품으로서의 가치를 극적으로 증대시키는 것이다.
또한 본 발명의 유전자(DNA), 폴리펩티드, 폴리펩티드단편 및 항체는, 의약품으로서 유용할 뿐만 아니라, 본 발명의 세포표면분자와 상호작용을 가지는 분자(리간드)의 탐색, 그 리간드의 기능의 해명, 및 그 리간드를 타깃으로 한 치료약을 개발하기 위한 시약으로서 유용하다.
또한 본 발명의 형질전환마우스는, 본 발명의 세포표면분자인 "JTT-1항원"의 생리학적기능을 해명하기 위한 모델동물로서 유용할 뿐만 아니라, "JTT-1항원"의 기능을 제어(저해, 억제, 활성화, 자극 등)하는 활성을 가지는 여러 가지 의약(저분자화합물, 항체, 안티센스, 폴리펩티드 등)을 스크리닝하기 위한 도구로서 매우 유용하다. 즉 그와 같은 피검물질을 그 형질전환마우스에 투여하여, 그 마우스의 생체에 발생하는 여러 가지 생리학적, 생물학적 또는 약리학적 파라메타를 측정, 해석함에 의해 투여한 피검물질의 활성을 평가하는 것이 가능하다.
또한 본 발명의 노크아웃마우스는, 그 마우스의 특징을 여러 가지 측면(생리학적, 생물학적, 약리학적, 병리학적 및 유전자적 등의 측면)으로부터 해석함에 의해, 본 발명의 세포표면분자의 기능을 해명하는 것을 가능하게 한다.
서열표
(1) 출원인의 성명 또는 명칭: 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤
(2) 발명의 명칭: 세포간접착 및 시그널전달을 매개하는 세포표면분자
(3) 정리번호: J1-802 PCT
(4) 출원번호:
(5) 출원일:
(6) 우선권의 기초가 된 출원을 한 국명 및 출원의 번호
일본국 1997년 특허원 제062290호
일본국 1998년2월26일 제출의 특허원(정리번호 J1-802DP1)
(7) 우선일: 1997년 2월27일
(8) 서열의 수: 12
서열번호: 1
서열의 길이: 600
서열의 형: 핵산
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: cDNA to mRNA
기원
생물명: 인간(human)
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: CDS
존재위치: 1 . . 600
특징을 결정한 방법: E
서열:
ATG AAG TCA GGC CTC TGG TAT TTC TTT CTC 30
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu
1 5 10
TTC TGC TTG CGC ATT AAA GTT TTA ACA GGA 60
Phe Cys Leu Arg Ile Lys Val Leu Thr Gly
15 20
GAA ATC AAT GGT TCT GCC AAT TAT GAG ATG 90
Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met
25 30
TTT ATA TTT CAC AAC GGA GGT GTA CAA ATT 120
Phe Ile Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile
35 40
TTA TGC AAA TAT CCT GAC ATT GTC CAG CAA 150
Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val Gln Gln
45 50
TTT AAA ATG CAG TTG CTG AAA GGG GGG CAA 180
Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln
55 60
ATA CTC TGC GAT CTC ACT AAG ACA AAA GGA 210
Ile Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly
65 70
AGT GGA AAC ACA GTG TCC ATT AAG AGT CTG 240
Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu
75 80
AAA TTC TGC CAT TCT CAG TTA TCC AAC AAC 270
Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn
85 90
AGT GTC TCT TTT TTT CTA TAC AAC TTG GAC 300
Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp
95 100
CAT TCT CAT GCC AAC TAT TAC TTC TGC AAC 330
His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn
105 110
CTA TCA ATT TTT GAT CCT CCT CCT TTT AAA 360
Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys
115 120
GTA ACT CTT ACA GGA GGA TAT TTG CAT ATT 390
Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His Ile
125 130
TAT GAA TCA CAA CTT TGT TGC CAG CTG AAG 420
Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys
135 140
TTC TGG TTA CCC ATA GGA TGT GCA GCC TTT 450
Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe
145 150
GTT GTA GTC TGC ATT TTG GGA TGC ATA CTT 480
Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu
155 160
ATT TGT TGG CTT ACA AAA AAG AAG TAT TCA 510
Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser
165 170
TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAC GGT GAA TAC 540
Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
175 180
ATG TTC ATG AGA GCA GTG AAC ACA GCC AAA 570
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys
185 190
AAA TCT AGA CTC ACA GAT GTG ACC CTA TAA 600
Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu
195
서열번호: 2
서열의 길이: 199
서열의 형: 아미노산
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 단백질
기원
생물명: 인간(human)
서열:
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu
1 5 10
Phe Cys Leu Arg Ile Lys Val Leu Thr Gly
15 20
Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met
25 30
Phe Ile Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile
35 40
Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val Gln Gln
45 50
Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln
55 60
Ile Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly
65 70
Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu
75 80
Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn
85 90
Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp
95 100
His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn
105 110
Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys
115 120
Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His Ile
125 130
Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys
135 140
Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe
145 150
Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu
155 160
Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser
165 170
Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
175 180
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys
185 190
Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu
195
서열번호: 3
서열의 길이: 2610
서열의 형: 핵산
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산(3' 및 5' 말단염기서열을 함유하는 cDNA)
기원
생물명: 인간(human)
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: CDS
존재위치: 26 . . 625
특징을 결정한 방법: E
서열:
GGACTGTTAA CTGTTTCTGG CAAAC 25
ATG AAG TCA GGC CTC TGG TAT TTC TTT CTC 55
Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu
5 10
TTC TGC TTG CGC ATT AAA GTT TTA ACA GGA 85
Phe Cys Leu Arg Ile Lys Val Leu Thr Gly
15 20
GAA ATC AAT GGT TCT GCC AAT TAT GAG ATG 115
Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met
25 30
TTT ATA TTT CAC AAC GGA GGT GTA CAA ATT 145
Phe Ile Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile
35 40
TTA TGC AAA TAT CCT GAC ATT GTC CAG CAA 175
Leu Cys Lys Tyr Pro Asp Ile Val Gln Gln
45 50
TTT AAA ATG CAG TTG CTG AAA GGG GGG CAA 205
Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln
55 60
ATA CTC TGC GAT CTC ACT AAG ACA AAA GGA 235
Ile Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly
65 70
AGT GGA AAC ACA GTG TCC ATT AAG AGT CTG 265
Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Ser Leu
75 80
AAA TTC TGC CAT TCT CAG TTA TCC AAC AAC 295
Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn
85 90
AGT GTC TCT TTT TTT CTA TAC AAC TTG GAC 325
Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp
95 100
CAT TCT CAT GCC AAC TAT TAC TTC TGC AAC 355
His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn
105 110
CTA TCA ATT TTT GAT CCT CCT CCT TTT AAA 385
Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys
115 120
GTA ACT CTT ACA GGA GGA TAT TTG CAT ATT 415
Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His Ile
125 130
TAT GAA TCA CAA CTT TGT TGC CAG CTG AAG 445
Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys
135 140
TTC TGG TTA CCC ATA GGA TGT GCA GCC TTT 475
Phe Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe
145 150
GTT GTA GTC TGC ATT TTG GGA TGC ATA CTT 505
Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu
155 160
ATT TGT TGG CTT ACA AAA AAG AAG TAT TCA 535
Ile Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser
165 170
TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAC GGT GAA TAC 565
Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
175 180
ATG TTC ATG AGA GCA GTG AAC ACA GCC AAA 595
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys
185 190
AAA TCT AGA CTC ACA GAT GTG ACC CTA TAA 625
Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu
195
TATGGAACTC TGGCACCCAG GCATGAAGCA CGTTGGCCAG TTTTCCTCAA 675
CTTGAAGTGC AAGATTCTCT TATTTCCGGG ACCACGGAGA GTCTGACTTA 725
ACTACATACA TCTTCTGCTG GTGTTTTGTT CAATCTGGAA GAATGACTGT 775
ATCAGTCAAT GGGGATTTTA ACAGACTGCC TTGGTACTGC CGAGTCCTCT 825
CAAAACAAAC ACCCTCTTGC AACCAGCTTT GGAGAAAGCC CAGCTCCTGT 875
GTGCTCACTG GGAGTGGAAT CCCTGTCTCC ACATCTGCTC CTAGCAGTGC 925
ATCAGCCAGT AAAACAAACA CATTTACAAG AAAAATGTTT TAAAGATGCC 975
AGGGGTACTG AATCTGCAAA GCAAATGAGC AGCCAAGGAC CAGCATCTGT 1025
CCGCATTTCA CTATCATACT ACCTCTTCTT TCTGTAGGGR TGAGAATTCC 1075
TCTTTTAATC AGTCAAGGGA GATGCTTCAA AGCTGGRGCT ATTTTATTTC 1125
TGAGATGTTG ATGTGAACTG TACATTAGTA CATACTCAGT ACTCTCCTTC 1175
AATTGCTGAA CCCCAGTTGA CCATTTTACC AAGACTTTAG ATGCTTTCTT 1225
GTGCCCTCAA TTTTCTTTTT AAAAATACTT CTACATGACT GCTTGACAGC 1275
CCAACAGCCA CTCTCAATAG AGAGCTATGT CTTACATTCT TTCCTCTGCT 1325
GCTCAATAGT TTTATATATC TATGCATACA TATATACACA CATATGTATA 1375
TAAAATTCAT AATGAATATA TTTGCCTATA TTCTCCCTAC AAGAATATTT 1425
TTGCTCCAGA AAGACATGTT CTTTTCTCAA ATTCAGTTAA AATGGTTTAC 1475
TTTGTTCAAG TTAGTGGTAG GAAACATTGC CCGGAATTGA AAGCAAATTT 1525
AWWTTATTAT CCTATTTTCT ACCATTATCT ATGTTTTCAT GGTGCTATTA 1575
ATTACAAGTT TAGTTCTTTT TGTAGATCAT ATTAAAATTG CAAACAAAAT 1625
CATCTTTAAT GGGCCAGCAT TCTCATGGGG TAGAGCAGAA TATTCATTTA 1675
GCCTGAAAGC TGCAGTTACT ATAGGTTGCT GTCAGACTAT ACCCATGGTG 1725
CCTCTGGGCT TGACAGGTCA AAATGGTCCC CATCAGCCTG GAGCAGCCCT 1775
CCAGACCTGG GTGGAATTCC AGGGTTGAGA GACTCCCCTG AGCCAGAGGC 1825
CACTAGGTAT TCTTGCTCCC AGAGGCTGAA GTCACCCTGG GAATCACAGT 1875
GGTCTACCTG CATTCATAAT TCCAGGATCT GTGAAGAGCA CATATGTGTC 1925
AGGGCACAAT TCCCTCTCAT AAAAACCACA CAGCCTGGAA ATTGGCCCTG 1975
GCCCTTCAAG ATAGCCTTCT TTAGAATATG ATTTGGCTAG AAAGATTCTT 2025
AAATATGTGG AATATGATTA TTCTTAGCTG GAATATTTTC TCTACTTCCT 2075
GTCTGCATGC CCAAGGCTTC TGAAGCAGCC AATGTCGATG CAACAACATT 2125
TGTAACTTTA GGTAAACTGG GATTATGTTG TAGTTTAACA TTTTGTAACT 2175
GTGTGCTTAT AGTTTACAAG TGAGACCCGA TATGTCATTA TGCATACTTA 2225
TATTATCTTA AGCATGTGTA ATGCTGGATG TGTACAGTAC AGTACWTAAC 2275
TTGTAATTTG AATCTAGTAT GGTGTTCTGT TTTCAGCTGA CTTGGACAAC 2325
CTGACTGGCT TTGCACAGGT GTTCCCTGAG TTGTTTGCAG GTTTCTGTGT 2375
GTGGGGTGGG GTATGGGGAG GAGAACCTTC ATGGTGGCCC ACCTGGCCTG 2425
GTTGTCCAAG CTGTGCCTCG ACACATCCTC ATCCCAAGCA TGGGACACCT 2475
CAAGATGAAT AATAATTCAC AAAATTTCTG TGAAATCAAA TCCAGTTTTA 2525
AGAGGAGCCA CTTATCAAAG AGATTTTAAC AGTAGTAAGA AGGCAAAGAA 2575
TAAACATTTG ATATTCAGCA ACTGAAAAAA AAAAA 2610
서열번호: 4
서열의 길이: 2072
서열의 형: 핵산
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산(3' 및 5' 말단염기서열을 함유하는 cDNA)
기원
생물명: 래트(rat)
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: CDS
존재위치: 35 . . 637
특징을 결정한 방법: E
서열:
CTGGAGGGGA AGAGTGCAGC TGTTCCTGGC AGAC 34
ATG AAG CCC TAC TTC TCG TGC GTC TTT GTC 64
Met Lys Pro Tyr Phe Ser Cys Val Phe Val
1 5 10
TTC TGC TTC CTA ATC AAA CTT TTA ACA GGA 94
Phe Cys Phe Leu Ile Lys Leu Leu Thr Gly
15 20
GAA CTC AAT GAC TTG GCC AAT CAC AGG ATG 124
Glu Leu Asn Asp Leu Ala Asn His Arg Met
25 30
TTT TCG TTT CAC GAT GGA GGT GTA CAG ATT 154
Phe Ser Phe His Asp Gly Gly Val Gln Ile
35 40
TCT TGT AAC TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG 184
Ser Cys Asn Tyr Pro Glu Thr Val Gln Gln
45 50
TTA AAA ATG CAG TTG TTC AAA GAC AGA GAA 214
Leu Lys Met Gln Leu Phe Lys Asp Arg Glu
55 60
GTC CTC TGC GAC CTC ACC AAG ACC AAG GGA 244
Val Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly
65 70
AGC GGA AAC ACC GTG TCC ATC AAG AAT CCG 274
Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Asn Pro
75 80
ATG TCC TGT CCA TAT CAG CTG TCC AAC AAC 304
Met Ser Cys Pro Tyr Gln Leu Ser Asn Asn
85 90
AGT GTC TCT TTT TTC CTA GAC AAC GCA GAC 334
Ser Val Ser Phe Phe Leu Asp Asn Ala Asp
95 100
AGC TCC CAG GGC AGC TAC TTT TTA TGC AGC 364
Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Phe Leu Cys Ser
105 110
CTG TCG ATT TTC GAC CCA CCC CCT TTT CAA 394
Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln
115 120
GAA AAG AAC CTT AGT GGA GGA TAT TTG CTT 424
Glu Lys Asn Leu Ser Gly Gly Tyr Leu Leu
125 130
ATT TAT GAA TCC CAG CTT TGT TGC CAG CTG 454
Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu
135 140
AAG CTT TGG TTA CCC GTA GGG TGT GCA GCT 484
Lys Leu Trp Leu Pro Val Gly Cys Ala Ala
145 150
TTT GTG GCA GCG CTC CTT TTT GGA TGC ATA 514
Phe Val Ala Ala Leu Leu Phe Gly Cys Ile
155 160
TTT ATC GTC TGG TTT GCA AAA AAG AAG TAC 544
Phe Ile Val Trp Phe Ala Lys Lys Lys Tyr
165 170
AGA TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAT AGC GAG 574
Arg Ser Ser Val His Asp Pro Asn Ser Glu
175 180
TAC ATG TTC ATG GCG GCA GTC AAC ACA AAC 604
Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn
185 190
AAA AAG TCC AGA CTT GCA GGT ATG ACC TCA 634
Lys Lys Ser Arg Leu Ala Gly Met Thr Ser
195 200
TAA 637
TCTGGAACAC GGGAACCCAT GGAGGAACTA CACTGTCTAG TTCCCCTGAA 687
ACTTGAATGG AGAAAGTCTT CTATTTTCTG GACCACAGGG CATCTGACTT 737
GATTAACTAC TGATACCTCC TTTTGGKGTT TTGTTTGTCT GGATCAGTGA 787
CTATCAGTCA CTCGGAATTT CAGCAGACTG CCCTGGGTTT GCTGAGTCCT 837
TTTAAGGCAA ACCCCTTCTT ATAGAAGACC CGGCTCATAT GTATTCAACA 887
AACAGACCTC ACTGGGATAC AATCCCCTCT TTCTGCGCCT GCTTCTAGCT 937
ATGCACCGGC CAGCAAGACA AACATATCTC CAGCATTTTT ACAAAAATGC 987
CAGGGTATGA ATCTGTAAAG TACACAGGCA GCCATTGACC ACCGTCTGTC 1037
CTCGTTTTTT CAGATTCTAT TTTTTTCCAT AGAGATCAGC ATTCCTTCTA 1087
GAATCAGACA GTAGAGGGAG ATGCTTCACA ACAGAAGCTC TTATGTTTCT 1137
GAGATGTTGA TGAATTCATG CTTTAGTACC ACCATGTTCT CTAACAACTT 1187
CTATATTCCA GCTGATCACT GCTTCAGGGC TTAGATGCCT GCTTTTGCCT 1237
TCAAGTCTCC CCTTAAAGAT ACTCCCACAG GTCTACTTGG TGGCCTGCAG 1287
CCACTCTGAA TAGGAAGTTT GGTCTACAAT TTCCCCCCTC TGCTGCTCAA 1337
AAAAAAAAAT TAGTAGATAT GATTTTCCCA TATTCTCCCT GCCAAAGTAA 1387
TTTTTTCCAG CAAAGACATC TAAATTCAGT TAATATGGTT TACTGTGTTG 1437
ATATTAGTGG CAGTAAACAT TTCTCAGAAT CAAAAGCAAA TTAATTTTGC 1487
GGTGGTGTTT TTCTACCATT ATCTTGGGTT TCCATGGTGC TATTACTCAC 1537
AAGTTTAGCT ATTTTTTTAT GCATCATATT AAAGTTGCAA GCAAGCAGAG 1587
CAACCCTCGG TTAATGGGCA AACATTCTCC TGGGGTAGAA TGAATTGTCT 1637
ATTTAGCCCG AAAACTGCAG TTTCTGTGGG TGGCTGCCAG ACTACAGCCG 1687
TGCTTTGCTC TGGCTTTGAC AGGTTGAAAT AGYCCCCATG ASCSTGGAAC 1737
AGWACTCCAG ACTGTGCTGG AGTCCCAAAG TTAGGAGGGC CATGGAGCCT 1787
GGGACAGGCT GCTGCTTTGG TCTTTAGGAT CTAGGAARAA TTACAGAGGG 1837
GCCAAGACAG AGTTCCCTCC CCTAGAAACT GTGCAGCCTG GAAGTCAGCC 1887
CTGGCACTTT AAGATAGCCT TCTTTAGAAC ATGAGTTAGT TGGTAGTATT 1937
CTGACGTGTA AACAGCCTAT KGTTGCTCGG AGCTGGACCA TTTTCTCCAC 1987
TTCCCTGTCT GCATGCCTAA GACTTCTAGA GCAGCCAACG TATATGCAAC 2037
ATTAAAGAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 2072
서열번호: 5
서열의 길이: 603
서열의 형: 핵산
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: cDNA to mRNA
기원
생물명: 마우스(mouse)
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: CDS
존재위치: 1 . . 603
특징을 결정한 방법: E
서열:
ATG AAG CCG TAC TTC TGC CAT GTC TTT GTC 30
Met Lys Pro Tyr Phe Cys His Val Phe Val
1 5 10
TTC TGC TTC CTA ATC AGA CTT TTA ACA GGA 60
Phe Cys Phe Leu Ile Arg Leu Leu Thr Gly
15 20
GAA ATC AAT GGC TCG GCC GAT CAT AGG ATG 90
Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met
25 30
TTT TCA TTT CAC AAT GGA GGT GTA CAG ATT 120
Phe Ser Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile
35 40
TCT TGT AAA TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG 150
Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val Gln Gln
45 50
TTA AAA ATG CGA TTG TTC AGA GAG AGA GAA 180
Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu
55 60
GTC CTC TGC GAA CTC ACC AAG ACC AAG GGA 210
Val Leu Cys Glu Leu Thr Lys Thr Lys Gly
65 70
AGC GGA AAT GCG GTG TCC ATC AAG AAT CCA 240
Ser Gly Asn Ala Val Ser Ile Lys Asn Pro
75 80
ATG CTC TGT CTA TAT CAT CTG TCA AAC AAC 270
Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn
85 90
AGC GTC TCT TTT TTC CTA AAC AAC CCA GAC 300
Ser Val Ser Phe Phe Leu Asn Asn Pro Asp
95 100
AGC TCC CAG GGA AGC TAT TAC TTC TGC AGC 330
Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser
105 110
CTG TCC ATT TTT GAC CCA CCT CCT TTT CAA 360
Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln
115 120
GAA AGG AAC CTT AGT GGA GGA TAT TTG CAT 390
Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr Leu His
125 130
ATT TAT GAA TCC CAG CTC TGC TGC CAG CTG 420
Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu
135 140
AAG CTC TGG CTA CCC GTA GGG TTG CCA GCT 450
Lys Leu Trp Leu Pro Val Gly Leu Pro Ala
145 150
TTC GTT GTG GTA CTC CTT TTT GGA TGC ATA 480
Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys Ile
155 160
CTT ATC ATC TGG TTT TCA AAA AAG AAA TAC 510
Leu Ile Ile Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr
165 170
GGA TCC AGT GTG CAT GAC CCT AAT AGT GAA 540
Gly Ser Ser Val His Asp Pro Asn Ser Glu
175 180
TAC ATG TTC ATG GCG GCA GTC AAC ACA AAC 570
Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn
185 190
AAA AAG TCT AGA CTT GCA GGT GTG ACC TCA 600
Lys Lys Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser
195 200
TAA 603
서열번호: 6
서열의 길이: 836
서열의 형: 핵산
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산(3' 및 5' 말단염기서열을 함유하는 cDNA)
기원
생물명: 래트(rat)
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: CDS
존재위치: 35 . . 685
특징을 결정한 방법: E
서열:
CTGGAGGGGA AGAGTGCAGC TGTTCCTGGC AGAC 34
ATG AAG CCC TAC TTC TCG TGC GTC TTT GTC 64
Met Lys Pro Tyr Phe Ser Cys Val Phe Val
1 5 10
TTC TGC TTC CTA ATC AAA CTT TTA ACA GGA 94
Phe Cys Phe Leu Ile Lys Leu Leu The Gly
15 20
GAA CTC AAT GAC TTG GCC AAT CAC AGG ATG 124
Glu Leu Asn Asp Leu Ala Asn His Arg Met
25 30
TTT TCG TTT CAC GAT GGA GGT GTA CAG ATT 154
Phe Ser Phe His Asp Gly Gly Val Gln Ile
35 40
TCT TGT AAC TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG 184
Ser Cys Asn Tyr Pro Glu Thr Val Gln Gln
45 50
TTA AAA ATG CAG TTG TTC AAA GAC AGA GAA 214
Leu Lys Met Gln Leu Phe Lys Asp Arg Glu
55 60
GTC CTC TGC GAC CTC ACC AAG ACC AAG GGA 244
Val Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly
65 70
AGC GGA AAC ACC GTG TCC ATC AAG AAT CCG 274
Ser Gly Asn Thr Val Ser Ile Lys Asn Pro
75 80
ATG TCC TGT CCA TAT CAG CTG TCC AAC AAC 304
Met Ser Cys Pro Tyr Gln Leu Ser Asn Asn
85 90
AGT GTC TCT TTT TTC CTA GAC AAC GCA GAC 334
Ser Val Ser Phe Phe Leu Asp Asn Ala Asp
95 100
AGC TCC CAG GGC AGC TAC TTT TTA TGC AGC 364
Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Phe Leu Cys Ser
105 110
CTG TCG ATT TTC GAC CCA CCC CCT TTT CAA 394
Leu Ser Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln
115 120
GAA AAG AAC CTT AGT GGA GGA TAT TTG CTT 424
Glu Lys Asn Leu Ser Gly Gly Tyr Leu Leu
125 130
ATT TAT GAA TCC CAG CTT TGT TGC CAG CTG 454
Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu
135 140
AAG CTT TGG TTA CCC GTA GGG TGT GCA GCT 484
Lys Leu Trp Leu Pro Val Gly Cys Ala Ala
145 150
TTT GTG GCA GCG CTC CTT TTT GGA TGC ATA 514
Phe Val Ala Ala Leu Leu Phe Gly Cys Ile
155 160
TTT ATC GTC TGG TTT GCA AAA AAG AAG TAC 544
Phe Ile Val Trp Phe Ala Lys Lys Lys Tyr
165 170
AGA TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAT AGC GAG 574
Arg Ser Ser Val His Asp Pro Asn Ser Glu
175 180
TAC ATG TTC ATG GCG GCA GTC AAC ACA AAC 604
Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn
185 190
AAA AAG TCC AGA CTT GCA GGT ACA GCA CCC 634
Lys Lys Ser Arg Leu Ala Gly Thr Ala Pro
195 200
CTT AGG GCT TTG GGG AGA GGA GAA CAC TCT 664
Leu Arg Ala Leu Gly Arg Gly Glu His Ser
205 210
TCA TGT CAA GAC CGG AAT TAA 685
Ser Cys Gln Asp Arg Asn
215
TTTGTTTATT TCTATTTTAA AAGAAAGACA TTTTTTCCCC TAAAGATAAT 735
TTTTGTATTT TTATGTGAAA GTCTGAATCT TCATTTTAAC TCGACTTATA 785
TACTCTGTGG TATATTAAAA ATAATGTTTG TGAAAAAAAA AAAAAAAAAA 835
A 836
서열번호: 7
서열의 길이: 27
서열의 형: 핵산
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산(합성 DNA)
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: primer bind
존재위치: 1 . . 27
특징을 결정한 방법: E
서열:
CTGCTCGAGA TGAAGCCCTA CTTCTCG 27
서열번호: 8
서열의 길이: 32
서열의 형: 핵산
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산(합성 DNA)
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: primer bind
존재위치: 1 . . 32
특징을 결정한 방법: E
서열:
ACCCTACGGG TAACGGATCC TTCAGCTGGC AA 32
서열번호: 9
서열의 길이: 30
서열의 형: 핵산
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산(합성 DNA)
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: primer bind
존재위치: 1 . . 30
특징을 결정한 방법: E
서열:
TAACTGTTTC TCGAGAACAT GAAGTCAGGC 30
서열번호: 10
서열의 길이: 30
서열의 형: 핵산
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산(합성 DNA)
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: primer bind
존재위치: 1 . . 30
특징을 결정한 방법: E
서열:
ATCCTATGGG TAACGGATCC TTCAGCTGGC 30
서열번호: 11
서열의 길이: 35
서열의 형: 핵산
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산(합성 DNA)
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: primer bind
존재위치: 1 . . 35
특징을 결정한 방법: E
서열:
CGTGATATTG CTGAAGAGCT TGGCGGCGAA TGGGC 35
서열번호: 12
서열의 길이: 34
서열의 형: 핵산
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산(합성 DNA)
서열의 특징
특징을 나타내는 기호: primer bind
존재위치: 1 . . 34
특징을 결정한 방법: E
서열:
CATTCAAGTT TCAGGGAACT AGTCCATGCG TTTC 34

Claims (36)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6 중 어느 하나에 기재되는 아미노산서열을 포함하는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 그 아미노산서열이 서열번호 2에 기재된 아미노산서열인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 그 아미노산서열이 서열번호 1의 염기번호 1 내지 597, 서열번호 3의 염기번호 26 내지 622, 서열번호 4의 염기번호 35 내지 634, 서열번호 5의 염기번호 1 내지 600 또는 서열번호 6의 염기번호 35 내지 682 중 어느 하나에 기재된 DNA에 의해 코드되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. 서열번호 2에 기재된 아미노산서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열을 가지고, 림프구의 활성화에 관여하는 시그널 전달을 담당하는 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 그 폴리펩티드가 인간 유래의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 코드하는 유전자.
  7. 제6항에 있어서, 그 유전자가 cDNA인 것을 특징으로 하는 유전자.
  8. 제7항에 있어서, 그 cDNA가 서열번호 1에 기재된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
  9. 제7항에 있어서, 그 cDNA가 서열번호 3의 염기번호 26 내지 625에 기재된 염기서열, 서열번호 4의 염기번호 35 내지 637에 기재된 염기서열, 서열번호 5의 염기번호 1 내지 603에 기재된 염기서열, 또는 서열번호 6의 염기번호 35 내지 685에 기재된 염기서열중 어느 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  10. 제6항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 유전자를 함유하는 벡터.
  11. 제10항에 따른 벡터가 도입된 형질전환체.
  12. 국제기탁번호 FERM BP-5725로 식별되는 형질전환체.
  13. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 세포외영역으로 된 폴리펩티드 단편.
  14. 제13항에 있어서, 그 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산서열을 가지는 인간유래의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 단편.
  15. 제13항 내지 제14항에 따른 폴리펩티드 단편을 코드하는 유전자.
  16. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 세포외 영역으로 된 폴리펩티드 단편이 디술피드결합에 의해 결합하여 형성되는 호모다이머 분자.
  17. 제16항에 있어서, 그 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산서열을 가지는 인간유래의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 호모다이머분자.
  18. 제14항에 따른 폴리펩티드 단편 또는 제17항에 따른 호모다이머분자의 어느한쪽 또는 양쪽과 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 되고, 자기면역질환 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 억제를 위한 의약조성물.
  19. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 세포외 영역과 인간 면역글로블린(Ig)의 중쇄의 정상영역 또는 정상영역의 일부로 된 융합폴리펩티드.
  20. 제19항에 있어서, 면역글로블린이 IgG인 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드.
  21. 제19항에 있어서, 정상영역의 일부가 IgG의 힌지영역, C2 도메인 및 C3 도메인으로 된 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드.
  22. 제19항 내지 제21항중 어느 한 항에 있어서, 그 폴리펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산서열을 가지는 인간유래의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 융합폴리펩티드.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 융합폴리펩티드가 디술피드결합에 의해 결합하여 형성되는 호모다이머분자.
  24. 제22항에 따른 융합폴리펩티드가 디술피드결합에 의해 결합하여 형성되는 호모다이머분자.
  25. 제22항에 따른 융합폴리펩티드 또는 제24항에 따른 호모다이머분자의 어느 한쪽 또는 양쪽과 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 되고, 자기면역질환의 치료 또는 억제를 위한 의약조성물.
  26. 제22항에 따른 융합폴리펩티드 또는 제24항에 따른 호모다이머분자의 어느 한쪽 또는 양쪽과 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 되고, 알레르기성 질환의 치료 또는 억제를 위한 의약조성물.
  27. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제13항 또는 제14항에 따른 폴리펩티드 단편 또는 그 폴리펩티드에 의해 구성되는 세포표면분자에 반응성을 가지는 항체 또는 그 항체와 실질적으로 동일한 기능을 가지는 그 항체의 일부.
  28. 제27항에 있어서, 그 항체가 모노클로날항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체와 실질적으로 동일한 기능을 가지는 그 항체의 일부.
  29. 서열번호 2에 기재된 아미노산서열을 가지는 폴리펩티드, 제14항에 따른 폴리펩티드 단편 또는 그 폴리펩티드로 구성되는 인간유래의 세포표면분자에 반응성을 가지는 모노클로날항체 또는 그 모노클로날항체와 실질적으로 동일한 기능을 가지는 그 모노클로날항체의 일부.
  30. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드에 의해 구성되는 세포표면분자에 반응성을 가지는 모노클로날항체 또는 그 모노클로날항체와 실질적으로 동일한 기능을 가지는 그 모노클로날항체의 일부이고, 그 모노클로날항체의 마이토젠으로 자극한 임파아구세포로의 작용이, 국제기탁번호 FERM BP-5707로 식별되는 하이브리도마가 생성하는 모노클로날항체가 마이토젠으로 자극한 래트 임파아구세포에 나타내는 작용과 실질적으로 동일한 모노클로날항체 또는 그 모노클로날항체와 실질적으로 동일한 기능을 가지는 그 모노클로날항체의 일부.
  31. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드에 의해 구성되는 세포표면분자에 반응성을 가지는 모노클로날항체 또는 그 모노클로날항체와 실질적으로 동일한 기능을 가지는 그 모노클로날항체의 일부이고, 그 모노클로날항체의 마이토젠으로 자극한 임파아구세포로의 작용이, 국제기탁번호 FERM BP-5708로 식별되는 하이브리도마가 생성하는 모노클로날항체가 마이토젠으로 자극한 래트 임파아구세포에 나타내는 작용과 실질적으로 동일한 모노클로날항체 또는 그 모노클로날항체와 실질적으로 동일한 기능을 가지는 그 모노클로날항체의 일부.
  32. 제29항에 따른 모노클로날항체 또는 그 모노클로날항체와 실질적으로 동일한 기능을 가지는 그 모노클로날항체의 일부와 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 되고, 자기면역질환의 치료 또는 억제를 위한 의약조성물.
  33. 제29항에 따른 모노클로날항체 또는 그 모노클로날항체와 실질적으로 동일한 기능을 가지는 그 모노클로날항체의 일부와 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 되고, 알레르기성 질환의 치료 또는 억제를 위한 의약조성물.
  34. 제28항 내지 제31항중 어느 한 항에 따른 모노클로날항체를 생성하는 하이브리도마.
  35. 삭제
  36. 삭제
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