PT96062B

PT96062B - Processo para a preparacao de meio reaccional e solubilizante de peptidos e para a sintese de peptidos utilizando este meio

Info

Publication number: PT96062B
Application number: PT96062A
Authority: PT
Inventors: Marie Galvez; Marie-France Maurice
Original assignee: Rhone Poulenc Chim Base
Priority date: 1989-12-04
Filing date: 1990-12-03
Publication date: 1998-08-31
Also published as: US6342582B1; JP2608345B2; EP0432022B1; IL96537A0; ATE144528T1; AU6772890A; DE69028977T2; DE69028977D1; JPH04117395A; EP0432022A1; US5798443A; IL96537A; IE904349A1; CA2031484C; GR3022118T3; ES2097139T3; DK0432022T3; CA2031484A1; AU648764B2; PT96062A

Description

RHÔNE-POULENC CHIMIE

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MEIO REACCIONAL E SOLUBILIZANTE DE PÉPTIDOS E PARA A SÍNTESE DE PÉPTIDOS UTILIZANDO

ESTE MEIO”

A presente invenção tem como objecto um meio reaccional e solubilizante para a síntese de péptidos. Tem também como objecto um processo de síntese de péptidos neste mesmo meio.

Existe um grande número de métodos de síntese de péptidos em fase líquida. Todos eles tém pontos comuns de base, que consistem :

em proteger eventualmente a função da cadeia lateral de um aminoácido por meio de um grupo protector clivãvel no fim da síntese do péptido;

em proteger a função amina (N alfa) do referido aminoácido por meio de um agrupamento protector clivãvel depois da condensação do aminoácido;

em activar a função ácido carboxílico do mencionado aminoácido protegido;

depois, em condensã-lo com um ácido aminado ou um péptido cuja função carbono terminal se encontra protegida e cuja função amina é livre;

o péptido é obtido por desprotecção total dos grupos protectores depois da condensação de todos os aminoácidos.

A reacção de condensação pode realizar-se tanto em fase líquida homogénea como em fase heterogénea (por exemplo, síntese de Merrifield).

Em geral, a síntese de péptidos necessita da protecção da função ácido carboxilico do ácido aminado C terminal sob a forma de ésteres.

No caso das sínteses de péptidos em fase homogénea, o éster é escolhido entre :

ésteres de metilo, de benzilo, de butilo terc.;

ésteres de polímeros solúveis em dissolventes orgânicos, por exemplo os ésteres de poliêteres de M. Mutter e col.,

Justus Liebigs Annalen der Chemie, 1975, páginas 901 - 915;

ou, melhor ainda, entre os ésteres reivindicados na patente de invenção R. P. depositada pela requerente (pedido de

-3patente de invenção francesa número FR 89 06700 sobre os ésteres de GPC).

No caso de sínteses de péptidos em fase heterogénea :

o éster pode ser, nomeadamente, um éster de polímeros não solúveis em dissolventes orgânicos.

Podem citar-se de maneira não exaustiva os seguintes polímeros :

* * o copolimero de estireno/divinil-benzeno, introduzido por

R. B. Merrifield (J. A. C. S., 1963, 85, páginas 2149, 2154);

a poli-dimetil-acrilamida -co-Boc-beta-Ala-N'-acroilil-hexa metileno-diamina de E. Atherton e R. C. Sheppard (J. A. C.

S. , 97, 1975, páginas 6584 - 6585);

J

a.

o poliestireno enxertado em Kel-F (Tregear e col., 1966, patente de invenção norte-americana número 3 700 609 e Chem. Abst., 71, página 508241 (1969);

a celulose.

A realização das sínteses de péptidos em fase heterogénea pode fazer-se quer em reactor agitado quer em reactor de coluna, quer por qualquer outra técnica (por exemplo, utilização de membrana).

rendimento e a pureza do produto final dependem muito do rendimento de cada operação, por um lado em virtude do aumento geométrico das perdas e, por outro lado, em virtude dos problemas da separação do produto pretendido dos subprodutos obtidos. Este problema amplifica-se no decurso da progressão da síntese quando o numero de ácidos aminados aumenta.

Além disso, no caso específico em que se realiza a condensação em meio líquido homogéneo, todos estes processos apresentam o mesmo inconveniente: a sua produtividade em volume é pequena por causa da má solubilidade dos ácidos aminados ou dos péptidos protegidos intermediários.

Este inconveniente foi assinalado por muitos autores, tais como :

M. Narita, K. Ishikawa, J. Y. Chen e Y. Kim, Int. J. Peptide Protein Res., 24, 580 (1984);

E. Gross e J. Meienhofer, The Peptides; Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, 1, 45 (1979);

-5. M. Mutter e E. Bayer, The Peptides; Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press 2., 288 (1980);

Fuhrhop e Penzcin, Organic Synthesis, Verlag Chemie,

4.1.2, Peptides, 219 (1984).

a) A produtividade por unidade de volume ê particularmente muito fraca quando se utilizam dissolventes não miscíveis com água, tais como o clorofórmio ou o acetato de etilo. A titulo de exemplo, o éster de 4-nitrobenzilo da N-(2-nitrofenil-sulfenil)-alfa-benzil-fenilalanil-N-ómega-nitro-L-arginina é sintetizado na proporção de 0,016 mole por litro no seio de clorofórmio: E. Wunsch, Methoden der Organischem Chemie, XV-2, Synthesis von Peptiden, Georg Thieme Verlag, 108 (1974).

Por outro lado, o éster de metilo da benziloxi-carbon.il -L-propil-L-tírosina foi preparado com uma concentração igual a 0,050 mole por litro no seio de acetato de etilo :

J

M. Bodansky, A. Bodansky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, 140, 1984.

Os dissolventes miscíveis com água possuem inconvenientes específicos e não sãochforma alguma mais vantajosos.

-6Com efeito, se eles permitem por vezes realizar a síntese dos péptidos em meio mais concentrado, não permitem a purificação directa por lavagem com água, a qual é necessária para eliminar os reagentes introduzidos em excesso e os produtos da reacção de acoplamento.

Por este motivo, os dissolventes miscíveis com água são habitualmente destilados e depois substituídos por dissolventes não miscíveis com água, a fim de se proceder às lavagens. Regressa-se, portanto, ao problema anterior pois a operação de purificação necessita de volumes de dissolvente muito importantes no entanto, o tratamento da massa reaccional tornou-se mais complexo devido ã introdução das operações suplementares de desti lação e de redissolução.

Assim, o dipéptido Z-Cys(S-BZ1)-Tyr OEt, preparado em THF (2 moles/litro), foi transferido para acetato de etilo (0,1 mole/litro) antes de ser lavado com água: M. Bodansky,

The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, 129, 1984.

dipéptido protegido Z-Lys(Z)-Gly-OEt, sintetizado em acetonitrilo (0,13 mole/litro), foi purificado depois da substituição do dissolvente inicial por acetato de etilo (0,05 mole/ /Litro, ibid 150, 1984), enquanto o Z-Ala-Tyr-OCH^ foi preparado no seio de dirnetilformamida (0,3 mole/litro) antes de ser purificado por lavagem com água em solução em acetato de etilo (0,1 mole/litro) (ibid, 148, 1984).

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ξ ê

A utilização destes dissolventes miscíveis com água, que, em geral, são polares, pode originar inconvenientes suplemen tares tanto sob o ponto de vista da higiene industrial (DMSO, HMPT) como sob o ponto de vista da selectividade química. De uma maneira geral, os dissolventes polares favorecem efectivamente a racemização do ãcido aminado activado N-protegido, de acordo com a realização do processo de D. S. Kemp, Peptides, Analysis, Synthesis, Biology; 1, 354 - 355, 1979.

Assim, a obtenção de soluções concentradas de produtos intermediários peptídicos em dissolventes orgânicos não miscíveis com água e compatíveis com as normas de fabricação actuais (boas práticas de fabricação) continua sendo um problema não resolvido.

Essa é a razão pela qual um dos objectivos da presente invenção é proporcionar um meio reaccional que aumente o rendimento das condensações dos péptidos. Um outro objectivo da presente invenção é proporcionar um meio reaccional que facilite as sínteses e as purificações dos péptidos, nomeadamente os péptidos com dois a cinquenta ácidos aminados em geral e, em particular, com três a vinte ácidos aminados ou aminoácidos.

Por fim, um outro objectivo é proporcionar um meio reaccional que permita a síntese de péptidos em meio homogéneo com concentrações elevadas (pelo menos, por exemplo, igual a 0,1 e, em geral, igual a 0,2 M).

8,Ζ

Estes objectivos e outros que aparecerão em seguida são atingidos por um meio reaccional insolubilizante para a síntese e/ou a purificação de péptidos, que compreende um diluente A escolhido no grupo dos dissolventes não miscíveis com água e um fenol B.

A quantidade de fenol B é igual, de preferência, a pelo menos l/'200 da quantidade do diluente A.

Não existe um limite superior restrito. Assim, a utilização de fenol B (produto puro ou mistura) sem diluente A faz também parte da invenção na medida em que sejam satisfeitas as seguintes condições :

o ponto de fusão do fenol B é pelo menos igual a 50° C (na presente descrição, os zeros não são números significativos, a menos que se especifique o contrário);

o fenol B pode ser separado do produto reaccional por destilação, eventualmente sob pressão reduzida;

o fenol B não é miscível com água em todas as proporções;

o fenol B não forma uma emulsão estável susceptível de preju dicar a eliminação dos coprodutos de lavagem com ãgua.

-9- /

Os halogeno-fenóis, vantajosamente os di-halogeno-fenóis e, de preferência, os monocloro-fenõis, assim como os aicoii-fenóis leves satisfazem, por exemplo, estas exigências. Se puderem ser utilizados sozinhos, os fenóis que satisfazem as citadas exigências constituem igualmente uma das subclasses particularmente interessantes dos fenóis utilizáveis em mistura com os diluentes A.

No entanto, é preferível utilizar um diluente A e um fenol B. Vantajosamente, a relação mássica entre o referido fenol B e o mencionado diluente A está compreendida entre 1/200 e 1, de preferência entre 1/20 e 1/2.

Os valores citados antes expressos em relação mássica são especialmente convenientes para o fenol propriamente dito e para os fenóis cuja massa molecular não é de uma ordem de grandeza diferente da do fenol propriamente dito (ΟθΗ^ΟΗ).

Para os fenóis com massas moleculares elevadas, a concentração em moles por litro e pelo menos igual a 5.10 , vantajosamente compreendida entre 0,1 e 2, de preferência entre 0,5 e 1,5 M.

Quando os diluentes A e os fenóis B não são miscíveis em todas as proporções, o limite superior do teor em fenol ou fenóis é o mais baixo dos dois limites: o mencionado antes e o limite de solubilidade.

-10-/

Pela expressão fenol B, deve compreender-se fenõis ou misturas de fenóis.

Os diluentes A são dissolventes orgânicos suficientemente polares para dissolver pelo menos 12, de preferência pelo menos 2 2 em massa, do fenol (ΟθΗ^ΟΗ) e são suficientemente hidrofobos para não serem miscíveis com água em quaisquer proporções .

É preferível que a água dissolva apenas no máximo 102 em massa do diluente A, vantajosamente no máximo 12 em massa, e isso na presença do fenol B como terceiro dissolvente.

Os diluentes A podem ser misturas que compreendem fracções de petróleo. Naturalmente, nas condições operatórias, os diluentes A devem ser inertes em relaçao a fenóis e aos reagentes da síntese de péptidos utilizados.

As famílias preferidas de diluentes são escolhidas do grupo constituído por derivados aromáticos, éteres, ésteres e dissolventes halogenados.

A título de paradigma de membros destas famílias, podem citar-se como derivados alifáticos halogenados o diclorometano, o 1,2-dicloro-etano e o 1,1,1-tricloro-etano; como derivados aromáticos, o tolueno; como derivados aromáticos halogenados, o clorobenzeno; como ésteres, o acetato de etilo e o acetato de isopropilo; e como éteres, o óxido de butilo terc. e de metilo, bem assim como o anisol.

Por razões de economia industrial, é preferível que o diluente A seja destilável sob pressão atmosférica ou sob vácuo primário ou secundário.

Em geral, o fenol B ê escolhido no grupo de compostos que possuem a fórmula geral I seguinte ⁽R₁)_n - A_r - 0 - Η (I) na qual :

o símbolo A^ representa um radical aromático monocíclico policíclico, heterocíclico ou não heterocíclico;

os substituintes representados pelo símbolo R^, iguais ou diferentes, representam, cada um, um átomo de halogéneo, de preferência flúor, cloro ou bromo; um grupo de fórmula geral -Z-R_2> na qual o símbolo Z pode ser uma ligação simples ou um átomo de oxigénio e em que o símbolo R₂ representa um átomos de hidrogénio ou um radical alquilo ou arilo eventualmente hidroxilado ou poli-halogenados ou mono-halogenado, com um máximo de oito átomos de carbono;

ο símbolo η representa ο número de substituintes e é igual a 0 ou a um número inteiro no máximo igual ao número de posições substituíveis presentes nos núcleos aromáticos;

e as suas misturas.

Os grupos alquilo (tal como definidos em Dictionnaire de lâChimie, Duval Presses Scientifiques Internationales, Paris VIe, 1959) podem ser, nomeadamente, radicais alifáticos lineares ou ramificados com um máximo de seis átomos de carbono ou radicais aril-alifáticos.

número de posições substituíveis é determinável facilmente com o auxílio de regras simples conhecidas dos especia listas na matéria.

Assim, por exemplo, quando A_r = fenilo ^5; quando A_r = piridilo ^4; quando A_r = naftilo 7; e quando A_r = quinolilo ζ 6.

Vantajosamente, o fenol B tem um número de átomos de carbono no máximo igual a trinta, de preferência no máximo igual a 20 átomos de carbono.

-13É desejável que as posições vizinhas da função fenol não sejam substituídas ou então sejam ocupadas por grupos não volumosos. São considerados como volumosos os radicais ligados ãs citadas posições vizinhas por um átomo de carbono terciário ou secundário.

Os compostos monocíclicos são aqueles que originam o melhor compromisso eficácia/custo; preferem-se os hexagonais (núcleo de piridinilo ou de fenilo).

J

É igualmente desejável que Z-R^ ⁿão possa significar mais do que três vezes, de preferência mais de duas vezes, um grupo hidroxilo.

Vantajosamente, na fórmula geral I, os radicais repre sentados pelo símbolo R são escolhidos no grupo constituído por radicais metilo, etilo, propilo, butilo;

J radicais trifluorometilo e pentafluoroetilo;

radicais metoxi, etoxi, propiloxi, butiloxi;

radicais fenilo, hidroxi-fenilo e A_r0H;

radicais feniloxi, hidroxi-feniloxi;

átomos de flúor, de cloro e de bromo.

-u-7

Para não aumentar muito a massa molecular do fenol, é desejável que, na fórmula geral I, n seja no máximo igual a 5.

Entre os fenóis que originam os melhores resultados, convém citar :

os hidroxi-piridinas, eventualmente monossubstituídas;

os hidroxi-quinoleínas, eventualmente monossubstituídas;

os mono-halogeno-fenóis (de preferência monoclorofenóis);

os poli-halogeno-fenóis (de preferência polifluorofenóis);

os fenóis monossubstituldos ou dissubstituídos por radicais alquilo em a C^, aloxi em a , perfluoroalquilo em C-^ a C£ e o 2,2,2-trifluoroetilo;

os difenóis;

o fenol no sentido restrito;

os naftóis eventualmente monossubstituídos ou dissubstituídos .

-15Os meios reaccionais de acordo com a presente invenção permitem dissolver um ácido aminado eventualmente protegido, e isto para uma concentração pelo menos igual a 0,05 M.

ácido aminado pode ser C ou N protegido; neste ultimo caso, o agrupamento ácido pode ser activado sobre a função ácido pelas funções de ácido lateral protegido; os ácidos aminados podem ser naturais ou sintéticos.

O meio reaccional de acordo com a presente invenção permite igualmente dissolver um pêptido protegido.

O meio reaccional de acordo com a presente invenção permite igualmente dissolver péptidos não protegidos (HC1, Pro-Gly-N^; HC1, His-Trp; 2HC1, Arg-Pro) e realizar a síntese.

Devido ao facto de o meio reaccional de acordo com a presente invenção solubilizar ao mesmo tempo ácidos aminados, péptidos e reagentes de bloqueio ou de activação, permite realizar in situ bloqueios, ou seja, efectuar a activação dos ácidos aminados. Assim, o meio de acordo com a presente invenção pode desempenhar o papel de reagente quando possui, além do fenol B e do diluente A, ácidos aminados, péptidos, reagentes de bloqueio e/ou de activação.

péptido, compreendendo o ácido aminado elementar, pode ser C ou N protegido; neste último caso, o agrupamento ácido pode ser activado na função ácido.

Evidentemente, as funções dos ácidos aminados, além das funções ácido ou amina visadas pela síntese, podem ser igualmente protegidas, se necessário, de acordo com as técnicas usuais nesta matéria.

meio de acordo com a presente invenção permite aumentar notavelmente a solubilidade dos péptidos na fase orgânica.

Permite, em geral, alterar a ordem de grandeza da solubilidade no sentido favorável, tomando como base a solubilidade do péptido no diluente orgânico A na ausência do aditivo fenólico.

meio reaccional permite realizar as diferentes fases da síntese dos péptidos em condições que possibilitam obter um bom rendimento volúmico. Aumenta, em particular, a produtividade das operaçoes de condensação.

Entre as inúmeras vantagens do meio de acordo com a presente invenção, convém sublinhar que as condensações de um ácido ou de um péptido N protegido e C activado com um ácido aminado ou com um péptido de C não protegido são muito fortemente facilitadas e aceleradas quando a reacção se efectua no referido meio. Esse facto constitui uma vantagem apreciável na síntese dos oligopéptidos (até cerca de vinte cadeias, ou mesmo cinquenta).

É uma das razões pelas quais convém fazer uma menção particular aos meios de acordo com a presente invenção que desempenham o papel de reagente e que contêm como componentes tendo em vista uma introdução sucessiva ou simultânea :

a) um diluente A escolhido no grupo dos dissolventes não miscíveis com água;

b) um fenol B;

c) um oligopéptido com um a cinquenta, vantajosamente com um a vinte ácidos aminados, de que nem o terminal N nem o terminal C estão protegidos.

A quantidade de fenol B é, de preferência, pelo menos igual a 1/200 do diluente A.

Não existe um limite superior estrito. Vantajosamente, a relação mássica entre o mencionado fenol B e o citado diluente A está compreendida entre 1/200 e 1, de preferência entre 1/20 e 1/2.

Os valores antes mencionados, expressos em relação mãssica, são especialmente convenientes para o fenol propriamente dito e para os fenóis cuja massa molecular não é de uma ordem de grandeza diferente da do fenol propriamente dito (GgH^OH).

Para os fenóis de massa molecular elevada, a concen- - -2 traçao em moles por litro e pelo menos igual a 5.10 , vantajosa mente entre 0,1 e 2 e, de preferência, entre 0,5 e 1,5.M.

Quando os diluentes A e os fenóis B não são miscíveis em quaisquer proporções, o limite superior do teor de fenol ou de fenóis ê o menor dos dois limites seguintes : o mencionado antes e o limite de solubilidade.

teor de oligopéptido o qual, na presente acepção, compreende o caso do ácido aminado não condensado, é vantajosa-2 mente pelo menos igual a 10 M, de preferencia 0,1 Μ. A concentração superior corresponde ao limite de solubilidade, sendo evidente que se pode utilizar uma suspensão de oligopéptido se a sua solubilidade no meio reaccional for considerada insuficiente pelo especialista na matéria.

A presente invenção visa igualmente um processo de síntese de péptidos eventualmente protegidos em meio líquido, em que se parte de um péptido ou de um aminoácido inicial, eventualmente protegido na sua função ácido e em que se adiciona um

,-/ aminoácido activado sobre a função ácido e é protegido na sua função amina, no qual os reagentes são dissolvidos no meio de acordo com a presente invenção.

Da mesma maneira, a presente invenção visa também um processo de síntese de péptidos, eventualmente protegidos, em meio líquido, em que se parte de um aminoácido ou de um péptido inicial, solubilizado de acordo com a presente invenção e se condensa outro péptido que tem a sua função ácida do G terminal activada e a sua função amina N-terminal protegida, no qual os reagentes são dissolvidos num meio de acordo com a presente invenção.

Por exemplo, a função amina ê protegida por um grupo carbamato ou por reacçao com um composto beta-dicarbonilado.

Vantajosamente, a função ácido dos reagentes N-protegidos é activada por um cloreto de ácido orgânico ou mineral, por um cloroformato de alquilo, por uma carbodiimida ou por um éster activado pelo respectivo carbonildi-imidazol ou por um acil-imidazol.

Depois da condensação de um aminoácido ou de um péptido N-protegido com o péptido ou o aminoácido inicial, a função amina N-terminal é libertada por qualquer método e, vantajosamente, por hidrogenôlise ou por solvólise em meio ácido ou básico ou por fotólise.

.4

O aminoácido ou o péptido C-terminal protegido (de preferência, por esterificação ou por amidação) inicial é, em geral, introduzido no meio reaccional e depois adiciona-se o ácido aminado ou o péptido activado sobre a sua função ácido e protegido sobre a sua função amina, sendo indiferente a ordem de adição dos reagentes; depois da reacção, os coprodutos e os excessos de reagentes sao eliminados da fase orgânica por lavagem com soluções aquosas ácidas, básicas ou neutras, depois liberta-se a função amina e, por fim, introduz-se um novo ácido aminado ou um novo péptido activado sobre a sua função ácido e protegido sobre a sua função amina.

De maneira surpreendente, o meio potencializa reactividade dos péptidos com os ácidos aminados e melhora significativa mente a cinética da condensação.

Uma vantagem importante do processo reside no facto de permitir eliminar da fase orgânica concentrada os reagentes em excesso e os coprodutos de condensação, por simples lavagem com água, facilitada pelo efeito anti-emulsionante dos fenois, efeito que se constatou no decurso do estudo que conduziu à presente invenção. Os reagentes em excesso são, por exemplo, aminoãcidos ou péptidos activados e N-protegidos, quer aminoãcidos quer péptidos C-protegidos, quer ainda catalisadores que servem para acelerar o acoplamento, tais como o hidroxi-benzotciazol, o imidazol, a N-hidroxi-succinimida, etc..

-21'3 meio reaccional de acordo com a presente invenção permite igualmente aumentar a produtividade das operações de clivagem dos grupos de protecção. Permite, além disso, realizar igualmente a clivagem de grupos sensíveis aos ácidos, como, por exemplo, o t-butiloxi-carbonilo, por meio de reagentes correntes, tais como ácido trifluoroacético ou o ácido clorídrico, assim como a clivagem de grupos hidrogenolisáveis, como, por exemplo, o grupo benziloxi-carbonilo, os éteres e ésteres benzílicos ou o grupo nitro que protege a função guanidina da cadeia lateral da arginina.

referido meio permite efectuar o corte dos grupos lábeis em meio básico, tais como o sulfofluorenil-metiloxi-carboniio, por meio de reagentes correntes, tais como a díetilamina ou a piperidina. Permite também realizar o corte dos grupos protectores fotolisáveis. Permite igualmente efectuar o corte dos grupos protectores por redução electroquímica.

Uma vantagem importante do processo reside no facto de, em fase homogénea, permitir a eliminação dos catalisadores das operações de clivagem por operação simples: os catalisadores ácidos ou básicos podem ser eliminados por lavagem aquosa, enquanto os catalisadores de hidrogenõlise, tais como o paládio absorvido sobre carvão, são elimináveis por filtração, permanecendo o péptido ou o intermediário peptídico em solução orgânica concentrada.

-22/

Uma outra vantagem do processo de solubilização reside no facto de ser compatível com todas as operações necessárias à síntese de péptidos e permitir o encadeamento directo entre as diferentes operaçoes de condensação, de clivagem de grupos protectores e de purificação por lavagem com ãgua, sem modificação do dissolvente e, eventualmente, sem isolamento do péptido. Permite portanto a síntese repetitiva de péptidos.

Em virtude da repetitividade da síntese, o processo de acordo com a presente invenção pode ser vantajosamente realizado sob uma forma automatizada.

processo é particularmente interessante para a síntese de péptidos pouco solúveis em disssolventes orgânicos, tais como os péptidos que contêm resíduos de glicilo, de arginilo, de glutaminilo, de asparaginilo, de serinilo, de treonilo e de prolinilo.

Pelo que diz respeito aos parâmetros não visados pela presente descrição, o processo de acordo com a presente invenção realiza-se em condições usuais.

Os péptidos obtidos a partir da síntese podem ser utilizados eventualmente na síntese de medicamentos, vacinas, produtos agro-alimentares ou fito-sanitários.

A presente invenção é ilustrada por meio dos seguintes Exemplos não limitativos.

PROTOCOLO DOS ENSAIOS DE SOLUBILIZAgÃO

As solubilidades dos produtos intermediários peptídicos foram determinadas à temperatura de 25° C, procedendo como se descreve em seguida.

Coloca-se num tubo de ensaio de pirex uma quantidade pesada exactamente do produto intermediário peptídico. Introduz-se então o dissolvente ou a mistura de dissolventes com o auxilio de uma pipeta de precisão, de maneira a obter-se uma relaçao da massa de pèptido/volume de dissolvente igual a 8 gramas/100 centímetros cúbicos.

tubo fechado com uma rolha de parafuso é então colocado num agitador de marca HEIDOLPH, modelo TOP-MIX, que vibra com a sua velocidade máxima durante sessenta segundos.

No caso de o sólido ser totalmente dissolvido, a solubi lidade é considerada como Z*8 g/100 cm^; caso contrário, o volume de dissolvente é duplicado e o processo recomeçado.

Se se realizarem quatro diluições sucessivas sem dissolução total, as medições realizam-se sobre uma quantidade menor de sólido.

-24y (ί

Quando se determinou que a solubilidade num dissolvente dado e inferior a 0,05 g/100 cm , verificou-se, alem disso, que o aquecimento a 40° C e uma agitação suplementar de quatro minutos não alteram o resultado.

NOTAS : A composição das misturas dissolvente / aditivo ê expressa ponderalmente.

SOLUBILIZAÇÃO DE DIFERENTES PÉPTIDOS

J

EXEMPLO 1

Cloridrato do Éster Metilico da L-Serinil-L-Tírosina (HC1,

Ser-Tyr-OCH₃)

RESULTADOS :

Solubilidade em diclorometano : S 0,05 g/100 cm^

Solubilidade na mistura diclorometano/fenol; 4/1 : 8 > s > 4 g/100 cm .

EXEMPLO 2

Trifluoroacetato de Éster Metilico da L-triptofanil-L-serinil-L-tirosina (CF^COOH, Trp-Ser-Tyr-OCH^)

-25As solubilidades medidas como no Exemplo 1 são as seguintes :

em diclorometano

0,05 g/100 numa mistura de diclorometano/fenol; 4/1 : 8 s )> 4 g/100 cm

EXEMPLO 3

Éster Metílico da L-triptofaníl-L-serinil-L-tirosina (Trp-Ser-Tyr-OCH^)

Solubilidades medidas como no Exemplo 1 em diclorometano na mistura de diclorometano/fenol; 4/1 em diclorometano/4-t-butil-fenol; 4/1 em diclorometano/2,6-dimetoxi-fenol; 4/1 em diclorometano/2,6-dimetil-fenol; 4/1 <0,05 g/100 cm³ s > 8 g/100 cm³ s 8 g/100 cm³ s 8 g/100 cm³ s 8 g/100 cm³ s 8 g/100 cm³ em diclorometano/2,6-diclorofenol; 4/1

-26/ em diclorometano/2-hidroxi-piridina; 5/1 em diclorometano/2-metoxi-fenol; 4/1 em diclorometano/3-trifluorometil-fenol; 4/1 em diclorometano/2,3,4,5,6-pentafluorofenol; 4/1 em acetato de etilo em acetato de etilo/fenol; 9/1 s J> 8 g/100 cm³ s^l6 g/100 cm³ s 8 g/100 cm³ s 8 g/100 cm³ s 0,05 g/100 cm³ s = 8 g/100 cm³

EXEMPLO 4

Cloridrato de L-hístidinil-L-triptofano (HC1, His, Trp)

As solubilidades, medidas como no Exemplo 1, são as seguintes :

diclorometano : s < 0,05 g/100 cm , q

diclorometano/fenol; 4/1 ; s = 2 g/100 cm

EXEMPLO 5

N-Benziloxi-carbonil-L-piroglutanil-L-histidina (Z-p Glu-His)

-27tf

As solubilidades, medidas como se descreveu no Exemplo 1, são as seguintes :

diclorometano diclorometano/fenol; 4/1 diclorometano/4-metoxi-fenol; 4/1 diclorometano/2-hidroxi-piridina; 5/1 diclorometano/3-trífluorometil-fenol; 4/1

2-clorofenol pentafluorofenol/diclorometano; 1/4

s < 0,05 g/100	3 cm
8>s>4 g/1	.00 cm'
2> s> 1 g/100	3 cm
s = 0,3 g/100	3 cm
8 > s^> 4 g/100	cm^
8> 4 g/100	cm³
8> 4 g/100	cm³.

EXEMPLO 6

Dicloridrato da L-arginil-L-prolina (2HC1, Arg-Pro)

As solubilidades, medidas como se descreveu no Exemplo 1, foram as seguintes :

diclorometano : s 0,05 g/100 cm : s = 2 g/100 cm³ diclorometano/fenol; 4/1 diclorometano/2-clorofenol; 1/1 s 1 g/100 cm³.

EXEMPLO 7

Cloridrato de L-leucil-L- arginil -L-prolil-glícinamida (HC1, Leu-Arg-Pro-Gly-NIL,)

As solubilidades, medidas como se descreveu no Exemplo 1, foram as seguintes :

diclorometano

0,05 g/100 cm' diclorometano/4-metoxi-fenol; 4/1 s = 4 g/100 cm³ diclorometano/fenol; 4/1 s = 4 g/100 cm³ diclorometano/3-trifluorometil-fenol; 4/1 s = 4 g/100 cm³ diclorometano/2-clorofenol; 2/1 s 1 g/100 cm³ diclorometano/2,3,4,5,6-pentafluorofenol; 4/1

2-clorofenol diclorometano/4-butil terc.-fenol; 4/1 g/100 cm³ g/100 cm³

0,5 g/100 cm³ diclorometano/2-hidroxi-piridina; 5/1 ; s = 1 g/100 cm

A título comparativo, ensaiou-se a dimetilformamida, aditivo que nao faz parte do âmbito da invenção :

diclorometano/dimetilformamida; 4/1 : s<ζ 0,5 g/100 cm

EXEMPLO 8

J

Cloridrato de L-propil-glicinamida (HC1, Pro-Gly-NH^)

As solubilidades, medidas como se descreveu no Exemplo 1, foram as seguintes ;

q diclorometano : s <( 0,05 g/100 cm q

diclorometano/fenol; 4/1 : s 16 g/100 cnr

J diclorometano/4-metoxi-fenol; 4/1 : 8 > ^s > k g/100 cu?

diclorometano/2-clorofenol; 2/1 : 2 > ^s> 1 g/100 cm^ q

diclorometano/2-hidroxi-piridina; 5/1 : 4 > ^s> 2 g/100 cm^-3

A título comparativo, ensaiou-se dimetilformamida, aditivo que não faz parte do âmbito da invenção :

diclorometano/dimetilformamida; 4/1

EXEMPLO 9

N-épsilon-Trifluoroacetil-L-lisil-L-prolina

As solubilidades, medidas como se Exemplo 1, foram as seguintes :

diclorometano acetato de etilo diclorometano/fenol; 4/1 diclorometano/4-butil terc.-fenol; 4/1 diclorometano/2,6-dimetoxi-fenol; 4/1

J diclorometano/2,6-dimetil-fenol; 4/1 diclorometano/2-hidroxi-piridina; 5/1 diclorometano/2,6-diclorofenol; 4/1 diclorometano/2-metoxi-fenol; 4/1

-30-_z : s <ζ 0,5 g/100 cm³ (Lys (TFA)-Pro) descreveu no : s < 0,05 g/100 cm³ ; s < 0,05 g/100 cm³ : s20 g/100 cm³ : s^> 8 g/100 cm³ : s 8 g/100 cm³ : s = 8 g/100 cm³ : s> 8 g/100 cm³ : S 8 g/100 cm³ : s 8 g/100 cm³ •31: s )> 8 g/100 cm diclorometano/3-trifluoro-metil-fenol;

4/1 diclorometano/2-clorofenol; 4/1 : s 8 g/100 cm diclorometano/2,3,4,5,6-pentafluoro-fenol; 4/1 acetato de etilo/fenol; 9/1

EXEMPLO 10 : s 8 g/100 cm : s = 8 g/100 cm

Éster metilico da N-butiloxi terc.-carbonil-pentaglicina (Boc-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-OCH^) : (Boc Gly^ OCH₃)

Mediu-se a solubilidade em diclorometano por HPLC, com calibração externa, sobre uma solução saturada de Boc-Gly^-OCH^.

As outras solubilidades foram medidas como no Exemplo 1 e são as seguintes :

diclorometano : s = 0,33 g/100 cm diclorometano/fenol; 20/1 : s = 0,5 g/100 cm : s = 4 g/100 cm^ diclorometano/fenol; 4/1

-32yanisol anisol/fenol; 4/1

2-clorofenol diclorometano/2-clorofenol; 4/1 diclorometano/4-metoxi-fenol; 4/1

J

EXEMPLO 11 s < 0,05 g/100 cm³ s = 4 g/100 cm³ s 8 g/100 cm³

2> s> 1 g/100 cm³

4^ 2 g/100 cm³

Éster benzilico da N-butiloxi terc.-carboni!.pentaglicina (Boc-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-O-CH^Ph)

Mediu-se a solubilidade em diclorometano por HPLC com calibração exterior sobre o líquido sobrenadante de uma solução saturada; as outras solubilidades foram medidas como no Exemplo 1 e são :

diclorometano s = 0,07 g/100 cm diclorometano/fenol; 9/1 s y 5 g/100 cm³.

A título comparativo de aditivos que não fazem parte da presente invenção, ensaiaram-se :

diclorometano/trifluoroetanol; 9/1 diclorometano/2-octanol; 9/1 diclorometano/ácido piválico; 9/1 diclorometano/dimetilformamida ·, 9/1 diclorometano saturado com LiCl

As concentrações menores do que 2 g/100

-3 3-/ : s < 2 g/100 cm³ : s 2 g/100 cm³ : s 2 g/100 cm³ * : s <ζ 2 g/100 cm³ : s 2 g/100 cm^J.

cm³ não foram ensaiadas

EXEMPLO 12

Éster metilico do ácido N-benziloxi-carbonil-B-benzil-L-aspartilamino-l-ciclopropano-carboxílico (Z-Asp-(OBzl)-Ace-OCH^)

As solubilidades, medidas como no Exemplo 1, foram as seguintes :

O óxido de metilo e de butilo terc. : s <ζθ,5 g/100 cm óxido de metilo e de butilo terc./4-butil terc.-fenol; 6/1 : s 1,2 g/100 cm³ : s < 1,5 g/100 cm³ clorobenzeno

-34’clorobenzeno/4-butil terc.-fenol; 4/1 anisol anisol/4-butil terc.-fenol; 4/1 acetato de etilo acetato de etilo/2-hidroxi-piridina (solução saturada) s > 20 g/100 cm³ s> 2,5 g/100 cm³ s )> 2,5 g/100 cm³ s = 2,5 g/100 cm³ } s 5 g/100 cm³.

SÍNTESE DE PÉPTIDOS

EXEMPLO 13

Éster propilico do ácido L-aspartilamino-l-ciclopropano-carboxilico (Asp-Acc-Opr)

NOTA : Este éster de dipéptido é um edulcorante que possui um poder adoçante cerca de duzentas vezes maior do que o da sacarose, de acordo com C. Mapelli, M. Gary Newton, C. E. Ringold e C. H. Stammer, Int. J. Peptide Protein Res. 30, 498 - 510 (1987).

Fase 1 : Condensação com concentração de 0,66 mole/litro de CELiClo (ou seja, 320 gramas)

-35Num reactor de três tubuladuras de vidro pirex, de 100 centímetros cúbicos, arrefecido exteriormente por banho de ãgua a 17° C e submetido à passagem de uma corrente de azoto seco, carregam-se sucessivamente, sobre um volume inicial de anisol (37,5 centímetros cúbicos), agitado, os seguintes sólidos ;

ácido N-benziloxi-carbonil-B-benzil-aspãrtico (25 milimoles);

cloridrato de N-etil-N(3-dimetilamino-propil)-carbodiimida (30 milimoles); e hidroxi-piridina (42,5 milimoles).

A suspensão fluidifica-se rapidamente e origina uma solução à qual se adicionam sucessivamente, ao fim de quinze minutos, 1-amino-ciclopropano-carboxilato de propilo (30 milimoles) e 4-butil terc.-fenol (5 gramas).

Depois de se manter sob agitação durante uma noite, lava-se a mistura reaccional a 30° C com 25 centímetros cúbicos de ácido clorídrico 2 N e depois por três vezes com 13 centímetros cúbicos de uma solução aquosa constituída por 10 centímetros cúbicos de água desmineralizada e 3 centímetros cúbicos de salmoura saturada de NaCI. As fases aquosas depois de reunidas são contra-extraídas com 2,5 centímetros cúbicos de anisol.

-36-.,

Fase 2

Hidrogenõlise dos grupos de protecção da cadeia com a operação de condensação

Transfere-se a fase orgânica (40 centímetros cúbicos) para um reactor de pirex de três tubuladuras de 200 centímetros cúbicos de capacidade, contendo 100 centímetros cúbicos de água destilada e 2,8 gramas de catalisador de paládio a 3% sobre carvão, previamente lavada com azoto.

Aquece-se a mistura reaccional a 55° C e coloca-se à pressão ambiente sob uma corrente de hidrogénio durante quatro horas.

Fase 4 : Isolamento do péptido

Filtra-se a mistura reaccional através de um filtro Millipore 5 A, lava-se o catalisador sobre o filtro com 10 centí metros cúbicos de água a 35° C por duas vezes.

J

Decanta-se a fase orgânica e rejeita-se.

Lava-se a fase aquosa com 30 centímetros cúbicos de acetato de etilo por três vezes e depois concentra-se mediante destilação sob vazio, até se obter uma massa residual de 60 gramas. Verifica-se espontaneamente uma cristalização.

-3 7/

Filtra-se a suspensão depois de se adicionarem 240 centímetros cúbicos de acetona sobre vidro fritado de porosidade número 4.

O sólido, lavado com acetona e seco até peso constante pesa 4,41 gramas.

Dissolve-se o filtrado concentrado a’té à secura em 11 centímetros cúbicos de água.

A adição de acetona (66 centímetros cúbicos) permite isolar um segundo lote de sólido, que pesa 1,52 gramas após secagem sob vazio.

RESULTADOS :

O éster propílico do ácido L-aspartilamino-l-ciclopropano-carboxílico mono-hidratado assim obtido com um rendimento de 86% ê um sólido branco que funde a 179° C.

seu espectro de ressonância magnética nuclear protónica registado a 360 MHz em solução em DMSO é conforme.

Análise elementar para ^G11^H18^N2°5' ^1H2°

Valores calculados : C 47,83; H 7,3; N 10,14; 0 34,76 — 3:8 — κ

Valores determinados : C 47,69; H 7,1; N 10,01; 0 34,81

Teor de água (Karl Fischer) : 6,48%

Dosagem Potenciométrica : Função amina : 102%

Função ácido : 98%.

EXEMPLO 14

A título de comparação, um ensaio de acordo com o Exemplo 13, no qual se omite quer a adiçao de 4-butil terc.-fenol quer a adição de 2-hidroxi-piridina, origina rapidamente uma mistura reaccional que não se consegue agitar.

PURIFICAÇÃO DE PÉPTIDOS POR EXTRACÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO

EXEMPLO 15

Éster benzílico da glicil-glicíl-L-fenilalanil-L-leucina (Gly-Gly-Phe-Leu-OBzl)

Com vista à purificação desta tetrapéptido, por lavagem com água à saída da síntese, estudou-se a distribuição deste péptido entre o diclorometano e a água, procedendo como se refere seguidamente.

-3 9-

£ί

Agita-se fortemente uma solução de cloridrato de Gly-Gly-Phe-Leu-OBzl (0,9 mmole) em diclorometano (12 centímetros cúbicos), na presença de uma solução aquosa de KHCO^ (2 N; 3 centímetros cúbicos). Esta mistura origina uma emulsão que se mantém estável durante vários dias. Realizou-se um ensaio comparativo na presença de fenol.

EXEMPLO 16

Um ensaio de distribuição realizado de acordo com o Exemplo 15, depois da adição de 3,9 gramas de fenol ã solução orgânica, fornece, após agitação idêntica, duas fases líquidas límpidas, cuja decantação é total em menos de quinze minutos.

A análise de HPLC mostra que a fase aquosa contém somente 0,4% do tetrapéptido empregado.

EXEMPLO 17

J fister benzilico da N-butiloxi terc.-carbonil-L-fenilalanil-L-valina (Boc-Phe-Val-OBzl)

Num reactor de vidro pirex de 50 centímetros cúbicos de capacidade, introduzem-se sucessivamente, à temperatura ambiente :

-40- X '/ •7 éster 2-hidroxi-piridínico da N-butiloxi terc.-carbonil-L-fenilalanina (3,6 mM; 1,23 gramas;

cloridrato do éster benzílico da valina (3 milimoles-, 0,73 grama);

diclorometano (15 centímetros cúbicos) e depois sob agitação N-metil-morfolina (3 milimoles).

Depois de sessenta e oito horas à temperatura ambiente, lava-se a mistura reaccional sucessivamente com 5 centímetros cúbicos de ãcido sulfúrico diluído (95%; pH 2), com 5 centímetros cúbicos de água e com 5 centímetros cúbicos de KHCO^ em solução 2 N em água. Forma-se então uma emulsão estável.

Pelo contrário, quando se emprega uma mistura de diclorometano/feno1 (9/1) como dissolvente reaccional, todas as lavagens se realizam sem dificuldade e as decantações são rápidas.

EXEMPLO 18

Assunto : Estudo da Influência do Fenol sobre a Realização do

Acoplamento de Pêptidos

-41Ζ

Acoplamento Estudado	: Boc-Phe-O-Py + HC1, Val-OBzl + NMM CH^C^ (com ou sem fenol) Boc-Phe-Val-OBzl + HC1, NMM
MODO OPERATÓRIO

Efectuou-se ο acoplamento fazendo contactar, no seio de cloreto de metileno aquecido a refluxo, por um lado, 1,2 equivalentes de éster 2-hidroxi-piridínico de N-butiloxi terc.-L-fenilalanina (Boc-Phe-Opy) e, por outro lado, cloridrato de éster benzílico da valina (Val-OBzl) um equivalente, na presença de N-metil-morfolina (NMM).

Mede-se o desaparecimento de Vai OBzl e o aparecimento do mencionado péptido. A correlação é aproximadamente perfeita com as indeterminaçoes das medidas.

Os resultados obtidos estão reunidos no Quadro seguinte, no qual se inclui o rendimento do péptido e, o que é muito mais significativo, os problemas da activação e da cinética no valor de Val-OBzl residual.

Realizaram-se dois tipos de ensaios em meio perfeitamente homogéneo, por um lado com fenol ΟθΗ^ΟΗ em cloreto de metileno (l_0% em massa de fenol) e, por outro lado, sem fenol.

-42/

Os resultados mostram uma diferença de cinética extrema mente significativa, pois obtém-se 90% do citado péptido ao fim de duas horas em cloreto de metileno sozinho, e ao fim de vinte minutos na mistura de cloreto de metileno/fenol com 10% em massa.

RESULTADOS :

No Quadro seguinte, encontra-se indicado o rendimento de acoplamento, assim como a percentagem de Val-OBzl ao longo do tempo.

-	TEMPO	10 minutos	30 minutos	1 hora	2 horas 30 minutos
Rendimento do Acoplamento	sem φΟΗ	56 %	80 %	86 %	95 %
com φΟΗ	78 %	93 %	96 %	99 %
Val-OBzl residual	sem φΟΗ	44 %	20 %	14 %	5 %
	com φΟΗ	22 %	7 %	4 %	1 %

rí .-7

EXEMPLO 19

Influência do Ortocresol sobre a Cinética do Acoplamento de

Péptidos

REACÇÃO :

CH₂C1₂

BocPheOSu +' LeuOH + DIPEA - BocPheLeuOH + HOSu, DIPEA

1,2 eq 1 eq 1 eq com ou sem

o. cresol

7,2 equiva lentes

MODO OPERATÓRIO acoplamento realizou-se fazendo contactar, no seio de dareto de metileno à temperatura ambiente, por um lado, 1,2 equivalentes de éster hidroxi-succinimídico de N-butiloxi terc.-carbonil-L-fenilalanina (Boc Phe OSU) e, por outro lado, um equivalente de leucina livre (Leu OH) na presença de um equivalente de di-isopr£ pil-etilamina (DIPEA).

Realizaram-se dois tipos de ensaios em meio heterogéneo (a leucina é insolúvel); por um lado, com 7,2 equivalentes de ortocresol e, por outro lado, sem ortocresol.

-44Determinou-se o rendimento do dipéptido formado, Boc Phe Leu OH).

Dissolvente	Rendimento de BocPheLeuOH/Leucina
1 h	2 h
CH₂C1₂	9 %	17 %
C^C^/0. cresol	57 %	72 %

Os resultados mostram uma influência importante do ortocresol sobre a cinética de acoplamento. A formação de dipéptido ao fim de uma hora de reacção na presença de ortocresol é multiplicada por 6.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1- — Processo para a preparação de um meio reaccional e solubilizante para a síntese e/ou purificação de péptidos, caracterizado pelo facto de se misturar um diluente A escolhido no grupo dos dissolventes não miscíveis com a água e um fenol B, de tal modo que a relação em massa entre o referido fenol B e o mencionado diluente A esteja compreendida entre '1/200 e.1/1/ de preferência entre 1/20 e 1/2.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o citado diluente ser escolhido no grupo constituído pelos hidrocarbonetos aromáticos, os éteres, os es- teres e os. dissolventes halogenados.
3.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindica ções 1 e 2, caracterizado pelo facto de o referido fenol ser es colhido no grupo dos compostos que correspondem ã seguinte fórmula geral

J ^(Rl^}n - A_r - 0 - Η (I) na qual: .

o símbolo Ar representa um radical aromático monocíclico, pclicíclico, heterociclico eventualmente heterociclico;

os símbolos R^, iguais ou diferentes, representam cada um, um átomo- de halogéneo, de preferência de flúor, cloro ou de bromo ou um grupo de fórmula ge ral -Z-Rj na qual o símbolo Z pode representar uma ligação simples'ou um átomo de oxigénio e o símbolo R₂ representa um átomo de hidrogénio ou um radi cal alquilo ou arilo, eventualmente hidroxilados ou mono-halogenados ou poli-halogenados com o máxi mo de 8 átomos de carbono; e o símbolo n representa o número de substituintes e é igual a zero ou um número inteiro no máximo igual ao número de posições substituíveis existentes nos núcleos aromáticos;

e suas misturas.

/

-474.Processo de acordo com uma qualquer das reivindica ções 1 a 3, caracterizado.pelo facto de o mencionado fenol B ter um número de átomos de carbono no máximo igual a 30 e, de preferência, no máximo igual a 20.
5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindica ções 1 a 4, caracterizado pelo facto de as posições vizinhas da função fenol serem não substituídas ou ocupadas por grupos não volumosos.
6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindica ções 3 a 5, caracterizado pelo facto de o símbolo -Ar represen tar um radical aromático monocíclico, de preferência hexagonal
7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindica ções 3 a 6, caracterizado pelo facto de, na fórmula geral (I), os radicais representados pelo símbolo R serem escolhidos entre:

- radicais metilo, etilo, propilo, butilo,

- radicais trifluorometilo e pen taf luor o etilo,

- radicais metoxi, etoxi, propiloxi, butiloxi,

- fenilo, hidroxifenilo e ArOH,

- radicais feniloxi e hidroxifeniloxi,

- ãtomos de flúor, cloro e de bromo.
8. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindica ções 3 a 7, caracterizado pelo facto de na fórmula geral (I) o símbolo n representar um número inteiro no máximo igual a 5.
9. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindica ções 1 a 5, 7 e 8, caracterizado pelo facto de o citado fenol B ser escolhido no grupo constituído por:

- hidroxipiridinas eventualmente monossubstituídas,

- hidroxiquinoleínas eventualmente monossubstituídas,

- mono-halogenofenóis (de preferência, monoclorofenóis),

- poli-halogenofenóis (de preferência, polifluorofenóis),

- fenóis monos substituídos ou dissubstituídos por radi.

cais alquilo , alcoxi perxluoroalquilo

2 ^{e 2}i²t2-trifluoretilo,

- difenõis,

- fenol no sentido restrito,

- naftóis eventualmente monossubstituídos ou dissubsti tuídos.
10. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 9, caracterizado pelo facto de se misturar também um péptido vantajosamente com 1 a 50 membros da cadeia, um ácido C protegido.

-4911. - Processo de acordo com a reivindicação 10, carac terizado pelo facto de o referido péptido ser C protegido.
12. - Processo de acordo com a reivindicação 10, carac terizado pelo facto de o mencionado péptido aminado ser N pro tegido.

J
13. - Processo de acordo com a reivindicação 12, carac terizado pelo facto de o citado péptido aminado ser activado sobre a função ácido.
14. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de se misturar também um péptido no qual nem a extremidade C nem a extremidade N são protegidas .

J
15. - Processo de acordo com a reivindicação 14, carac terizado pelo facto de a concentração do citado péptido ser -2 pelo menos igual a 10 M de péptido que e C protegido.
16. - Processo de acordo com a reivindicação 14, carac terizado pelo facto de o referido péptido ser um aminoácido, de preferência natural.
17.- Processo de síntese de péptidos eventualmente

-50-j protegidos, em meio líquido, em que se parte um péptido ou de um aminoácido inicial do qual nem a extremidade C nem a extre midade N estão protegidas sobre a função ácido e em que se adiciona um aminoácido com a função ácido activada e protegi, do na função amina, caracterizado pelo facto de se dissolver os reagentes num meio preparado de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9.
18. - Processo de síntese de péptidos eventualmente protegidos, em meio líquido, em que se parte de um péptido ou de um aminoácido inicial, protegido na sua função ácido e em gue se adiciona um aminoácido activado na função ácido e .protegido na função amina, caracterizado pelo facto de se dissol ver os reagentes num meio preparado de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9.

J
19. - Processo de sxntese de péptidos eventualmente pro tegidos, em meio líquido, no qual se parte de· um aminoácido ou de um péptido inicial, solubilizado de acordo com a reivindica ção 1 e se condensa um outro péptido que tem a sua função ácido da extremidade C activada e a sua função amina da extremida de N protegida, caracterizado pelo facto de se dissolver os reagentes num meio preparado de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9.

5120. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 17, 18 e 19, caracterizado pelo facto de a função amina ser protegida por um grupo carbamato ou por reacção com um com posto betadicarbonilado.
21. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo facto de a função ácido da extremidade C do péptido ou do aminoácido inicial ser protegida de preferência por esterificação ou por amidação.
22. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo facto de a função ácido dos reagentes N-protegidos ser activada por um cloreto de ácido or gânico ou inorgânico, por um cloroformato de alquilo, por uma carbodiimida ou por um éster activado ou por um acil-imidazol.
23. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo facto de, depois da condensação de um aminoácido ou de um péptido N-protegido com o péptido ou com o aminoácido inicial, a função N-amino terminal ser libertada por hidrogenôlise, por acidólise ou por basõlise.
24.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 17 a 23, caracterizado pelo facto de se introduzir no

-52meio reaccional o aminoácido ou o péptido com a extremidade C protegida ou não protegida; e o ácido aminado ou o péptido ac tivado na função acido e protegido na função amina, sendo indiferentes a ordem por que se faz a adição dos reagentes; e l

de, apos a reacçao, se eliminar da fase organica os sub-produ tos e o excesso dos reagentes mediante lavagem com soluções aquosas ácidas, básicas ou neutras, em seguida se libertar a função amina e, por fim, se introduzir um novo ácido aminado ou um novo péptido activado na sua função ácido e protegido na sua função amina.