PT93424B

PT93424B - Processo para a preparacao de uma composicao contendo d-cicloserina e d- -alanina para melhoria de memoria e de aprendizagem ou para tratamento de doencas psicoticas ou cognitivas

Info

Publication number: PT93424B
Application number: PT93424A
Authority: PT
Inventors: Alexis A Cordi; Michael R Jans
Original assignee: Searle & Co
Priority date: 1989-03-15
Filing date: 1990-03-14
Publication date: 1996-08-30
Also published as: ATE88890T1; GR3008225T3; DK0387867T3; NO901198D0; DE69001503D1; EP0387867B1; ES2055197T3; JP2963720B2; EP0387867A1; CA2010635A1; IE64130B1; NO901198L; IE900921L; PT93424A; AU624917B2; IL93562A; JPH03148221A; FI901289A0; AU5073490A; IL93562A0

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PATENTES RELACIONADAS

Este pedido de patente é em parte a continuação do pedido de patente dos EUA nS série 07/324.279 de 15 de Março de 1989.

CAMPO DO INVENTO

Este invento encontra-se no campo da neurologia clinica e diz especificamente respeito a compostos, formulações e métodos para fortalecimento da memória e para o tratamento de problemas psíquicos e cognitivos.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Existem muitas situações relacionadas com a memória para as quais se investigam tratamentos terapêuticos , como métodos para melhorar a memória ou para tratar disfunções de memória. Por exemplo, a perturbação da memória está ligada ao processo de envelhecimento assim como a doenças neuro-degenerativas com a doença de Alzheimer.

O enfraquecimento da memória também pode surgir na sequência de traumatismo craniano ou de demência de multi-infarto. Têm sido investigadas muitos compostos e tratamentos que podem melhorar os processos cognitivos . isot é. que podem favorecer a memória e a fixação.

Por exemplo, recentemente descobriu-se que o composto D-cicloserina provoca melhorias na função cognitiva e é util no tratamento de disfunções cognitivas, como está descrito em U.S. Patent Application Ser NS 07/127. 121 de 1 de Dezembro de 1987 e em Aplication PCT/US88/04244 de 1 de Dezembro de 1988.

-4Existem uitos estados psicóticos para os quais estão em investigação tratamentos terapêuticos.

No mercado existem drogas que se consideram antagonistas em receptores dopaminergicos localizados no sistema nervoso central (SNC) , sendo exemplos dessas drogas o haloperidol e a clorpromazina. Estas drogas possuem a característica de induzirem efeitos secundários de longa duração e por vezes irreversíveis, como a discinésia tardia.

Assim,. a busca de melhorias na terapia de problemas psicóticos tem sido dirigida para a utilização de drogas com um modo diferente de activação.

A Feniciclidina Γ 1-(-fenilciclo-hexil)piferidina: PCP 7é um anestésico geral conhecido e está em utilização como tranquilizante animal. 0 PCP é um agente psicotomimétrico potente usado frequentemente como droga de rua. 0 abuso de PCP largamente difundido tem levado ao aumento da incidência de psicoses induzidas por PCP Γ C.V. Showalter et al., Amer, J. Psychiat., 134, 1234 (1977) 7.

Os abusadores de PCP experimentam um isolamento sensorial aparente acompanhado pelo sentimento de despersonalização que pode ser aterrador para a pessoa. Estas mudanças subjectivas tornam o PCP uma droga modelo para o estudo de esquizofrenia. A maior evidência de que a psicose provocada pelo PCP se assemelha à esquizofrenia é o facto dos utilizadores desta droga têm enganado psiquiatras experientes em esquizofrénicos, antes de terem conhecimento da história do uso da droga Γ S.H. Snyder, Nature, 285, 355-356 (1980) 7-

-50 PCP tem sido referido como modulador alostérico do receptor NMDA Γ P. Loo et al., Eur. J. Pharmacol. . 12 3 . 467-468 (1986)_/ e tem-se especulado que a actividade psicomimétrica do PCP está relacionada com o seu antagonismo à transmissão NMDA (C.A. Tamminga et al , Synapse 1 . 497-504 (1987) 7.

A facilidade dada a transmissão de NMDA por acção no ponto modulador glicina pode antagonizar o efeito de um ligante endógeno equivalente ao PCP Γ R. Quirion et al, Peptides. 5, 967-973 (1984) 7. Também se tem postulado que a acção glutamatérgica no receptor NMDA modulado por glicina poder ser um caminho para o tratamento de esquizofrénicos (SI. Deutch et al . Clin, Neuropharm., 12. 1.11-13 (1989) 7Sabe-se Há muito tempo que a D-cicloserina é um agente bacteriostático Γ ver The Merck Index. Monograph No. 2747. lOth Edn. . Merck & Co. , p. 395 (1983)7Crê-se que o mecanismo da sua acção envolve a inibição da sintese da parede da célula em organismos susceptiveis por competição com a D-alanina para incorporação na célula bacter ial .

Também se sabe que a actividade antibacterial in vitro da D-cicloserina pode ser inibida com D-alanina Γ_ Goodman & Gilman . The Pharmalogical Basis of Therapeutics, 7th Edn.. MacMillan. New york, p. 1209 (1985)7

O composto D-cicloserina nos seus isómeros D- e L- também tem sido considerado no que se refere aos seus efeitos sobre o SNC /~O. Mayer et al., Arzneim. Forsch. . 21(2). 298-303 (1971)7.

Estes isômeros de cicloserina também têm sido avaliados no que se refere aos seus efeitos psicológicos e fisiológicos em sujeitos humanos.

Por exemplo, a D-cicloserina quando administrada em doses de 500 mg/dia a sujeitos humanos saudáveis. parece estimular ligeiramente a sociabilidade, mas com prontidão mental deprimida /~M. Vo jtechorsky, Act. Nerv. Super. , 7 (3). 269 (1965)_7. A D-cicloserina também tem sido administrada em doses de 1000 a 1500 mg/dia a voluntários saudáveis cujos niveis sanguíneos apresentou maiores niveis de actividade da enzima oxidase, monoamina Γ V. Vitek et al , Psichopharmacologia . 7 ( 3) . 203-219 (1965) 7.

A D-cicloserina tem sido investigada como agente terapêutico para problemas mentais em ensaios clínicos, onde a D-cicloserina foi administrada a pacientes com distírbios mentais em doses de 500 mg por dia ΓG. E. Crane, Compr. Psychiat. . 2_. 51-53 (1961) 7. Nesses ensaios clínicos encontraram-se, em alguns pacientes, melhoras na depressão, insónia, anexoria, ou tensão enquanto outros pacientes sofrendo de fortes neuroses ou psicoses responderam fracamente a esta medicação.

Para além disso, a D-cicloserina tem sido utilizada para exacerbar os sintomas de esquizofrenia numa tentativa para curar a perturbação por provocação do sintoma / J. Simeon et al, Compr. Psychiat., 11, 80-88, (1970) 7. Parece que a D-cicloserina. em doses como as utili zadas nos estudos. actua como antagonista na posição glicina do complexo receptor PCP-NMDA imitando a acção do PCP na indução da psicose.

A D-cicloserina também tem sido vendida comercialmente para tratamento contra a Mycobacterium tuberculosis. Quando utilizada em doses tuberculostáticas, a D-cicloserina é acompanhada de muitos efeitos secundários prejudiciais. Os efeitos secundários adversos conhecidos mais frequentes, envolvem o sistema nervoso. De facto, o factor limitativo na utilização de cicloserina é a sua toxicidade em relação ao SNC. incluindo perturbações neurológicas e psíquicas Γ Dang Evaluation, Chapter 75, American Medicai Association, Chicago (1986) 7 .

Os pacientes que receberam D-cicloserina apresentaram abatimento, tonturas, dores de cabeça, letargia, depressão, tremuras, disarteria, hiperreflexia, ansiedade paretesia . nervoso rientação com perda de memória vertigens, confusão e deso. paresis, major and minor clonic seizures. convulsões e coma ΓG.K. McEvoy et al., American Hospital. Formulary Service: Drug Information, 8:16 American society of Hospital Pharmacist, Bethesda MD (1986)7.

Também têm sido ao tratamento com D-cicloserina outros efeitos secundários. Na administração crónica de doses tuberculostáticas a pacientes em ensaios clínicos . verificou-se que a D-cicloserina produzia episódios diarreia e mucosite oral.

Pensa-se que os episódios de diarreia estão ligados ao esvaziamento da flora intestinal natural devido à interferência da D-cicloserina na produção celular da flora. Foram feitas várias tentativas para inverter este efeito de esvaziamento da flora intestinal associado aos tratamentos com D-cicloserina.

-8Por exemplo. o efeito antibacterial da D-cicloserina sobre o Mycobacterium da paratuberculose tem sido invertido por micobatino Γ W.B. Sutton et al, Antibiot. Chemotherapy.., 5_, 582-584 (1955) ~T . Foram dadas preparações de Streptococus faecium a pacientes sob tratamento com doses de tubercolásticas de D-cicloserina e sofren do de diarreia que reduziram significativamente os episódios de diarreia ZM. Burgia et al. . Curr. Therap. Res., 31,2, 265-271 (1982)_7.

Também é um remédio bem conhecido a utilização de alguns queijos fermentados envelhecidos como o queijo Cammembert ou o Maroilles. para repor a flora destruída pelo tratamento de antibiótico.

Têm-se mostrado que o efeito inibidor de D-cicloserina no crescimento de bactérias tem sido significativamente invertido pela D-alanina, um composto que tem uma estrutura análoga à D-cicloserina ΓJ.W. Moulder et al. J. Bacteriol. . 85 . 707-711 (1962) / . Verificou-se que a D-cicloserina. como um inibidor competitivo da racemase alanina. está ligada à enzima racemase alanina com uma eficiência 100 vezes superior à do substrato natural D-alanina (U. Roze et al. Mol. Pharmacol. . 2. 92-94 (1966)7.

Conhecem-se outras interacções entre a D-cicloserina e compostos do tipo alanina. Por exemplo a U.S. Patent no. 4.031.231 descreve composições antibacteriais contendo compostos do tipo 3-fluoro-D-alanina, como 3-fluoro-D-alanina e os seus análogos dentero . em combinação com um inibidor auto-antagonista 3-fluoro-D-alanina, como D-cicloserina .

-9Estas composições são descritas como tendo uma sinergética antibacterial.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Fig. 1 é um gráfico apresentando a influência da concentração de D-cicloserina sobre a estimulação máxima de glicina na ligação TCP na presença de várias concentrações de glicina.

A Fig. 2 é um gráfico gua apresenta a influência da concentração de glicina sobre a máxima estimulação de glicina na ligação TCP na presença de várias concentrações da D-cicloserina.

DESCRIÇÃO DO INVENTO

Um método terapêutico para a melhoria da função cognitiva ou para o tratamento de uma disfunção ou desordem psicótica alcança-se pelo tratamento de um sujeito quando essa terapia é indicada, com uma acção terapêutica combinada de uma quantidade terapeuticamente efectiva de um composto tipo cicloserina e uma quantidade terapeuticamente eficaz de D-alanina.

A frase acção terapêutica combinada, aqui utilizada, pretende abranger a administração dos componentes cicloserina e D-alanina de uma forma sequencial ou abranger a administração conjunta destes dois componentes de uma forma simultânea.

-10A administração conjunta destes dois componentes para fortalecimento da função cognitiva ou para tratamento de disfunções cognitivas ou tratamento anti-psicótico. pode efectuar-se com uma composição farmacêutica tendo como componentes activos uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto tipo cicloserina e uma quantidade eficaz terapeuticamente de D-alanina.

Esta composição deverá conter . preferencilamente. um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Dá-se mais preferência a uma composição farmacêutica constituida principalmente por uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto cicloserina e uma quantidade terapeuticamente eficaz de D-alanina. Define-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de D-alanina como uma quantidade de D-alanina capaz de suprimir os efeitos secundários.

Entre os exemplos de efeitos secundários adversos que podem ser evitados ou reduzidos pela administração de D-alanina encontram-se situações relacionadas com a descompressão gastro-intestinal como a diarreia e a destruição da flora intestinal.

Um tipo de composto cicloserina preferido é D-cicloserina. A composição farmacêutica deve conter D-cicloserina e D-alanina numa relação terapeuticamente eficaz .

A expressão relação terapeuticamente eficaz abrange uma gama de quantidades relativas de D-alanina e D-cicloserina que serão eficazes na melhoria de disfunções cognitivas ou no tratamento de psicoses, sendo, ao mesmo tempo eficazes na redução de efeitos secundários judiciais associados à utilização de D-cicloserina.

preA melhoria na função cognitiva significa. geralmente, melhoria na memória ou na capacidade de aprendizagem. 0 tratamento de disfunções cognitivas inclui o tratamento de doenças neuro-degenerativas como a doença de Alzheimer . enfraquecimento da memória associado à idade ou dificuldades de aprendizagem.

Pensa-se que um problema psicótico está ligado a um aumento de concentração de um ligante endógeno que actue no lado PCP do complexo receptor NMDA-PCP.

Pensa-se que este ligante endógeno possui carácter equivalente ao PCP no que se refere ao facto da inter-acção do ligante com o complexo receptor PCP-NMDA resultar na inibição da abertura do canal engatilhado pelo NMDA, Um composto do invento agonista da glicina-B, pela potenciação da transmissão NMDA, antagonizará, assim, o efeito do ligante endógeno.

Assim, sendo o ligante endógeno responsável pelos problemas psicóticos como a esquizofrenia, o bloqueio da acção desses ligantes resultaria na redução do comportamento psicótico. Em particular, pensa-se, os compos tos deste invento são úteis no tratamento de psicoses agudas ou crónicas induzidos pelo PCP.

Uma relação de D-alanina para D-cicloserina terapeuticamente eficaz estará na gama de cerca de 1 para -1 até cerca de 100 para -1.

A D-cicloserina é 4-amino-3-isoxazolidona com a fórmula estrutural

-12Η₂Ν

Este composto existe nos isômeros Le D- dos quais o composto D-cicloserina é muito mais preferido .

As formas tautoméricas dos compostos de cicloserina anteriormente referidas com a estrutura a seguir representada, também são abrangidas por este invento

As formas isoméricas dos compostos , incluindo os diastereoisómeros e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis estão incluídos na família de compostos deste invento.

A expressão sais farmaceuticamente aceitáveis abrange os sais frequentemente utilizados para a formação de sais de metais alcalinos e para formar sais de adição de ácidos livres ou de bases livres.

-13Visto que contêm átomos de azoto básicos , camente sais de adição ácida ou reza do sal não é critica.desde aceitável e os ácidos que podem esses sais são. evidentemente, tes nesta arte.

os compostos cicloserina esses sais são caracteristi sais quaternários. A natuque seja farmaceuticamente ser utilizados para formar bem conhecidos dos experienNos exemplos de ácidos que se podem utilizar para a formação de sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis, incluem-se ácidos inorgânicos como o ácido clorídrico, o ácido sulfúrico e o ácido fosfórico e ácidos orgânicos como o ácido maleico, o ácido succínico, e o ácido cítrico.

Outros sais farmaceuticamente aceitáveis são sais com metais alcalinos ou metais alcalino-terrosos como o sódio, potássio, cálcio e magnésio, ou com bases orgânicas como a di-ciclo-hexilamina. Todos estes sais podem ser preparados por métodos convencionais, fazendo reagir, por exemplo, o ácido ou base apropriada com o correspondente composto cicloserina.

Os compostos cicloserina para utilização no invento podem ser sintetizados por métodos descritos na literatura. Por exemplo, as sínteses de derivados N-acilo e derivados base-Schiff de D-cicloserina são descritas por N.P, Jensen et al. J.M. Chem. 23. 6-8 (1980). Sínteses de derivados Ν,Ν'-diacilo de cicloserina são descritas por J.

C. Howard. J. Org. Chem., 46, 1720-1723 (1981).

Sinteses de derivados alquilo de cicloserina são descritos por C.H. Staner . J. Med. Chem. , 13(6). 1013. (1970). Sínteses de isómeros L- e D- de cicloserina. assim como de análogos seus, são descritos por PI.

A. Plattner et al.. Helv. Chim. Acta.. 40, 1531 (1957).

Existem muitas fontes comerciais de D-alanina, assim como muitos processos publicados para preparar a D-alanina.

AVALIAÇÃO BIOLOGICA

Procedimento do ensaio de ligação da glicina

Prepararam-se membranas sinópticas de plasma (SPM) a partir de forebrain de ratazana e armazenaram-se como descrito como descrito previamente Γ J.B. Monaham and J. Michel. J. Neurochem,. 48. 1699-1708 (1987)_7.

Fundiram-se as membranas congeladas e diluiram-se 1:20 com triton X-100 0,04% em 50 mM de tris/ac£ tato (pH 7,4). Após incubação a 37°C durante 30 minutos, as SPM foram recolhidas por centrifugação a 95000 X g durante 15 minutos. A pelete foi de novo suspensa em 50 mM de tris/ /acetato (pH 7,4, sem triton) e homogeneizadas manualmente 5 vezes.

As membranas foram de novo centrifugadas como se referiu anteriormente. O produto foi lavado mais duas vezes com 50 mM de tris/acetato sem homogenização e centrifugado. A pelete final foi de novo suspensa com homogenização em 50 ml de tris/acetato.

-15No procedimento geral do ensaio de ligação do receptor adicionaram-se 10 mM Γ H 7 de glicina à concentração adequada dos compostos de teste e o ensaio iniciado por adição de 0.2-0,4 mg de SPM arrefecida em gelo.

O ensaio que foi executado em tubos centrífugos de 1,5 ml. foi ajustado a um volume total de 1,0 ml com todas as adições executadas em 50 mM de tris/acetato, pH 7,4 a 4°C. Após 10 min. de incubação a 2°C, as amostras foram centrífugas a 12000 g (4°C) numa Beckman .. Microfuge 12.

A fase sobrenadante foi aspirada e a extremidade do tubo contendo as membranas pelitizadas foi cortada e agitada em 0.5 ml de solubilizador de tecido Beckman BTS-450 durante pelo menos 6 horas à temperatura am biente. Em seguida, adicionou-se um cocktail (5 ml) de cintilação Beckman MP contendo 7 ml/litro de ácido acético foi então adicionado e as amostras sujeitas a contagem num Beckman LS 5800, contador de cintilação em liquido, com correcções automáticas para têmpera e eficiência de contagem.

Definiu-se ligação não especifica como a ligação residual na presença de 0.1 mM de glicina e avaliada geralmente em 25 - 35% da ligação total. A ligação 3 da glicina Γ H 7 à SPM foi analisada com utilização de trans formações Scatchard e Hill e determinou-se o Ki para outros compostos utilisando análise logit-log.

Os cálculos e a análise de regressão foram efectuados utilizando templantes desenvolvidos para o lotus 123 como previamente descrito.

Resultado

Glicina

D-cicloserina

L-cicloserina

IC (pM) 0 .18

1.92 >100

Ensaio de Modulação TCP

Efectuou-se a ligação Γ H _7 utilizando membranas de plasma sinópticas (SPM) lavadas com Triton X-100 . preparadas a partir de forebrain de ratazana (30-45 dias de idade, macho Sprague-Dawley; Sasco, St. Charles. MO) como previamente descrito ΓJ.W. Thomas, W.F. Hood, J.B. Monahan . P.C. Contreras and T.L. 0¹Donohue, Brain Res. , 442, 396-398 (1988)_7.

Iniciou-se o ensaio pela adição de SPM (0.15-0.25 mg) a uma incubação com 2.0 nM Γ 1 TCP (47.1 C^/mmole); New England Nuclear. Boston, MA) e diversas concentrações do composto de teste adequado num volume total de 0,5 ml (todas as adições foram feitas num tampão Tris/HCl 5 mM. pH 7,4) e continuou-se durante 60 minutos a 25°C.

As amostras foram então filtradas atr£ vés de filtros de fibra de vidro (Schleicher and Schuell #32) que foram previamente tratados com polietilenimina 0.05% (v/v). Os filtros foram lavados e a radioactividade quantificada por espectrometria de cintilação liquida. Mediu-se o estimulo na ligação Γ H 7 TCP avaliando o aumento na ligação especifica de base (ligação de base = 2583Í381 DPM e este valor aumentou até um máximo de 4712 i 779 DPM na presença de glicina 0.6 juM) com ligação não especifica como ligação residual na presença de 60 yuM de PCP (562 + 30 DPM).

-173

Ο para ο Γ Η J TCP sob condições de base foi 44 mM. Os valores ECj-θ para o estimulo de ligação f³H_7 TCP foram determinados utilizando análise de regressão logística de quatro parâmetros.

A D-cicloserina estimula a ligação Γ ³H 7TCP de base de um modo dependente da dose com um EC^g=19.7 μΜ. Valores anteriores mostraram que a D-cicloserina interactua com NMDA associada à posição de reconhecimen to de glicina Γ ³H _7 (IC = 2.33 í0,29 μΜ). Contudo, não se detectou afinidade para a posição de reconhecimento de NMDA como evidência a falta de deslocamento da ligação glutamato L-/ ³H _7 especifico NMDA (K^>100 μΜ) .

Esta descoberta indica que a D-ciclo3 serina fornece a ligação Γ H _7 TCP através da sua interacção com a posição de reconhecimento da glicina associada ao receptor NMDA ( a partir daqui definida como receptor de glicina B). O estimulo máximo produzido pela D-cicloserina foi, contudo, significativamente inferior do que a produzida pela glicina e D-serina em conjunto.

Esta eficácia inferior aparente indica o potencial parcial carácter agonista da D-cicloserina que foi confirmado pela experiência seguinte. Como se mostra na Fig. 1. na ausência de glicina adicionada exogenamente, a D-cicloserina tem propriedades agonistas e estimula a ligação Γ H _7 TCP para um máximo de 40 - 50% do estimulo induzido pela glicina só.

Contudo, na presença de diversas concentrações de glicina (0.1 - 0,6 μΜ). a D-cicloserina tem um carácter antagonista aparente e reduz o nivel máximo de estimulo da glicina.

-18Estes valores fornecem uma família de curvas de resposta a doses de D-cicloserina (geradas na presença de diversas concentrações fixas de glicina) que se aproxima assimptoticamente de 40 - 50% do estimulo máximo induzido pela glicina só, uma evolução característica de compostos com propriedades agonistas parciais como é sabido acontecer diversos compostos actuando sobre outros receptores .

Outra confirmação do carácter parcial agonista da D-cicloserina foi demonstrada em experiências em que a análise da resposta de doses de glicina foi levada a cabo na presença de diversas concentrações fixas de D-cicloserina (0 - 100 pM). Como se mostra na Fig. 2, a D-ciclo serina potência o estimulo da ligação Γ H 7 TCP, a concentrações de glicina abaixo de 0.1 pM , enquanto a maiores concentrações (0.1 - 15 pM) a D-cicloserina produziu um desvio para a direita na curva de resposta por dose. Estes resultados também são consistentes com as caracteristicas de agonista parcial.

A análise funcional da D-cicloserina aqui descrita é o primeiro relato de um composto interactuari do nesta posição modulatória de glicina exibindo caracteristicas de agonista parcial.

Estes resultados em conjunto com a favorável biodisponibilidade dos compostos no cérebro e a evidência para o envolvimento do receptor NMDA na aprendizagem e na memória torna . potencialmente, a D-cicloserina um instrumento valioso para mostrar a função receptora de NMDA.

-19De um modo mais importante, esperar-se-ia que os agonistas parciais de glicina B fornecessem benefícios terapêuticos no tratamento da psicose, de problemas cognitivos como a Doença de Alzheimer, no enfraquecimento da memória associado com a idade, na demência de multi-infarto. no síndroma metabólico misto de encefalopatias orgânicas e cerebrais de diversas origens, na demência alcoólicae em vários problemas de aprendizagem.

Em particular, os compostos agonistas parciais da glicina B seriam úteis no tratamento da esquizofrenia, da doença de Alzheimer. do enfraquecimento da memória associado à idade e na dificuldade de aprendizagem, em sujeitos humanos sofrendo desses problemas, assim como para utilização na melhoria da memória e da capacidade de aprendizagem em indivíduos saudáveis.

MÉTODOS DE ENSAIO DE RECUSA PASSIVA

Sujeitos: Ratazanas macho Long-Evans pesando cerca de 200 g (Sasco). As ratazanas utilizadas foram mantidas em gaiolas, duas por gaiola, com fornecimento de alimentação e água em quantidade para a duração da experiência .

Aparelhagem: A aparelhagem consistia numa caixa de plexigas (32 x 26 x 20 cm) com uma tampa com um chão de varões metálicos separados por uma distância de 1,8 cm. A caixa foi dividida em duas câmaras, uma pintada de negro e outra de cinzento.

Foram abertas duas portas (12 cm de altura) na frente da caixa permitindo o acesso a cada uma das câmaras.

-20Ligou-se uma passagem em forma de Y à parte da frente da caixa. O tronco do Y tinha 16 cm de comprimento e não foi pintado. Os braços do Y (com 14 cm de comprimento, cada) conduzem às duas pontas e cada um foi pin tado da cor da câmera e que dão acesso.

O tronco do Y estendeu-se sobre o limite da mesa sobre a qual o aparelho foi colocado estando aproximadamente a 75 cm acima do chão. O chão de metal da caixa foi ligado a um gerador de choque Lafayette de forma a poder ser fornecido um choque de 0.5 mAmp.

Procedimento: No primeiro dia de teste , cada uma das ratazanas foi colocada no caminho e permitiu-se que entrasse numa das câmeras. Fechou-se então a porta e deixou-se a ratazana entrar na outra câmera. No segundo dia de teste, foram dadas injecções i.p. a algumas das ratazanas, quer de D-cicloserina dissolvida numa solução salina 0,9% . quer de solução salina só.

Sessenta minutos mais tarde, deixou-se de novo cada uma das ratazanas entrar numa das cameras onde receberam um choque nos pés durante 2 segundos. Se a ratazana não tivesse recebido previamente uma injecção, era injectada ou com D-cicloserina ou com uma solução salina dez segundos após o choque nas patas.

No terceiro dia de teste a ratazana é colocada de novo no acesso e é permitida a sua entrada na caixa. Nos segundos e terceiro dias são registados os tempos que cada ratazana leva a entrar na câmara e em que camara entrou.

-21TABELA I

Tempo de tratamento de droga

Solução salina

D-cicloserina

Antes do choque

8.9 + 1.5 (n=6 ) .6 + 3.0

Depois do choque

14.8 í 3,1 (n=5)

22.8 + 2,4

Neste modelo animal para demonstrar o fortalecimento da memória, a demora da ratazana a entrar na câmara (o periodo de latênciá), é uma medida da memória da ratazana da experiência anterior de recepção do choque na pata.

Quanto maior for o periodo de latência melhor é o fortalecimento da memória em resultado do composto testado. Estas experiências em animais, mostram que a D-cicloserina actuando como ligante da glicina tem um efeito fortalecedor da memória que. neste modelo, é caracterizado pelo aumento da demora do animal em entrar no compartimento.

A relação entre o efeito e a dose de D-cicloserina. assim como o efeito deste composto quando administrado imediatamente antes do inicio do ensaio de retorno da informação, também foram estudados, como se relata na Tabela II.

TABELA II % de Latência, relatívamente a Solução Salina

de	Controlo. na	Recusa Passiva
			Administração
Dose de DCS	pré-choque	pós-choque	pré-retoma
(mg/Kgi.p.)	(%)	(%)
Solução salina	100	100	100
0.3	152*	160*	105
3	245*	215*	153*
10	138*	153*	180*
20			100
* Estatisticamente diferente	do controlo	(P < 0,05. teste

efeito da administração conjunta de D-cicloserina e D-alamina a ratazanas foi investigado seguindo a metodologia descrita na Tabela II. Na Tabela III apresentam-se os resultados.

TABELA	III
Lactência em segundos na	Recusa Passiva
Composto	Dose (mg/kg I.G.)	Lâtencia (sec.)
Solução salina		11,9
D-alanina	534	10.9
D-cicloserina	60	17,3*
D-alanina + D-cicloserina	534 + 60	17,4*

*

Estatisticamente diferente do controlo (P 0,05. teste t)

Os resultados da Tabela III mostram que o fortalecimento da memória em resultado da administração da D-cicloserina não se altera quando a D-cicloserina é administrada em conjunto com a D-alnina.

Alternância de Recompensa de Ratazanas num Labirinto em T

As ratazanas foram treinadas num local de aprendizagem da tarefa num labirinto em T e em seguida foi-lhes administrada i.p. D-cicloserina (3 mg/kg) ou uma solução salina. Ambos os grupos aprenderam a tarefa em cerca de 20 ensaios. A aprendizagem é definida como a realização de 9 escolhas correctas em 10 consecutivas.

No dia seguinte a recompensa de alimentação foi colocada no outro braço do labirinto (inverso). As ratazanas tratadas com a solução salina precisaram de cerca de 32 ensaios para aprender o reverso, ao passo que as ratazanas tratadas com D-cicloserina aprenderam o reverso em cerca de vinte ensaios. estes valores confirmam neste paradigma comportamental que a D-cicloserina tem um efeito benéfico no processo de aprendizagem e na memória.

A estrutura hippocampal intacta é necessária para que o cérebro processe informação e a guarda na memória. O fenómeno de potenciação de longo termo (LTP) parece ser o mecanismo pelo qual este processo ocorre. 0 papel fundamental do receptor D-aspartato de N-metilo (NMDA) um tipo subalterno do receptor amino-ácido excitador, um LTP tem sido firmemente confirmado por estudos electro-fisio lógicos.

Antagonistas NMDA como o ácido 2-amiηο-7-fosforo-heptanoico (APH) iniba o estabelecimento ou a propagação de LTP.

Demonstrou-se recentemente em estudos neuro-fisiológicos que a glicina potência a resposta à activação do receptor NMDA em neurómios de cérebro cultivados. Esta é uma acção insensitiva da estricnina e pensa-se que resulta da activação de um receptor supra-espinal da glicina (aqui definido como receptor glicina B) que modula a abertura do canal Na⁺Ca⁺⁺ armadilhado pela activação NMDA.

Por exemplo, a milacemida. como uma prodroga da glicina. aumenta o conteúdo total do cérebro em glicina de 30%, Pelo mecanismo previamente exposto, este aumento de glicina pode conduzir à maior facilidade da trans missão de NMDA e melhorar a memória e a capacidade de aprendizagem .

-25Os valores apresentados na Tabela II demonstram que a relação entre a dose e o efeito da D-cicloserina se caracteriza por uma curva em forma de sino. Pensa-se que a relação não habitual está associada com o carácter parcialmente agonista da D-cicloserina.

Parece, por isso, que a eficácia máxima conseguir-se-á dentro de uma gama definida e que doses mais elevadas, i.e.. superiores a 500 mg por dose em sujeitos humanos deverão resultar em perda de eficácia.

Os ácidos amino acídicos. o ácido glutâmico e aspártico. têm apresentado tanto propriedades excitotóxicas como excitantes Γ J. W. Olney. Science, 164, 719 -- 721 (1969); J. W. Olney et al. , Exp. Brain Res.. 14, 61 - 76 (1971) _7. De facto, as memórias com receptores de aminoácidos excitantes sobre as suas superfícies somai ou dendriticas . sofrem degenesrescência excitotóxica aguda quando esses receptores são sucessivamente activados pelo ácido glutâmico.

Os agonistas de glicina gue possuem um efeito potenciador sobre a transmissão NMDA. deveriam aumentar a excitotoxicidade do ácido glutâmico. Um agonista parcial de glicina B alcança efeitos excitantes benéficos sem os efeitos prejudiciais excitotóxicos secundários.

A maioria dos ligantes de glicina são moléculas muito polares e dificilmente transpoêm a barreira entre o sengue e o cérebro. Em consequência da dificuldade na travessia da barreira entre o sangue e o cérebro, tais ligantes não estão bio-disponíveis em concentrações efectivas para serem terapeuticamente benéficas.

Saba-se que a D-cicloserina atravessa com facilidade a barreira entre o sangue e o cérebro /Godman e Gi1man. The Pharmocologic Basis of Terapeutics, Ch.. 53, 1210 - 1211 (1980) 7. Verificou-se com surpresa e inesperadamente que a D-cicloserina apresenta uma finidade tão boa para o receptor de glicina insensitivo às estricnina como os valores ligantes anteriores mostraram.

Pensa-se que os agonistas de glicina facilitam a transmissão NMDA e que, por isso, têm um efeito positivo sobre LTP. Apresenta-se a melhoria no LTP como estando ligada ao fortalecimento da memória. Também se pensa que esses agonistas da glicina têm potencial para inverter os sintomas da esquizofrenia e, em particular, inverter os sintomas induzidos pela intoxicação crónica ou aguda do PCP.

A administração conjunta ou sequencial de um composto cicloserina e D-alanina pode ser realizado por qualquer técnica capaz de introduzir a combinação dos compostos no sistema gastro-intestinal.

Tais combinações indicadas para terapia profiláctica serão administradas de preferência numa relação no intervalo de cerca de 1:1 a cerca de 100:1 de D-alanina para o composto cicloserina. A relação entre a D-alanina e a D-cicloserina estará, de preferência, no intervalo de cerca de 10:1 a cerca de 100:1.

Essas combinações podem, em geral, ser administradas com base na dose de D-cicloserina eficaz para melhorar a memória ou tratar a disfunção cognitiva.

Essa quantidade de D-cicloserina encontrar-se-á, geralmente, numa dose diária na gama de cerca de 0,01 mg a cerca de 10 mg por quilograma de corpo, por dia. Uma dose mais preferida estará no intervalo de cerca de 0.01 mg a cerca de 5 mg por quilograma de peso de corpo.

-27A dose mais preferida encontra-se num intervalo de cerca de 0.05 a cerca de 2.5 mg por quilograma de peso de corpo por dia. Uma dose conveniente pode ser administrada em sub-doses múltiplas por dia. Estas sub-doses podem ser administradas em formas de dose unitária.

Habitualmente uma dose ou sub-dose pode conter de cerca de 1 mg a cerca de 100 mg do composto activo por dose unitária. Uma dose mais preferida conterá de cerca de 2 mg a cerca de 50 mg do composto activo por dose unitária. E dada maior preferência à dose contendo de cerca de 3 mg a cerca de 25 mg do composto activo por dose unitária.

Os compostos activos são habitualmente administrados numa formulação farmaceuticamente aceitável Tais formulações podem abranger quantidades eficazes de cada composto activo em conjunto com um ou mais diluentes ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Na formulação também podem encontrar-se outros agentes terapêuticos.

Um diluente ou transportador farmaceuticamente aceitável fornece um veiculo adequado para a transferência dos compostos activos sem efeitos secundários indesejáveis. A transferência dos compostos activos nessas formulações pode efectuar-se por várias vias incluindo a oral, a nasal, a tópica, buccal e sub-lingual.

As formulações para administração oral podem encontrar-se na forma de cápsulas contendo os compostos activos dispersos num ligante como a gelatina ou hidroxi-propil-metil-celulose. em conjunto com um ou mais lubrificantes, conservantes, agentes tensio-activos ou dispersantes .

Essas cápsulas ou comprimidos podem conter uma formulação de libertação controlada como se pode obter numa distribuição dos compostos activos em hidroxi-pr pil-metil-celulose.

Embora este invento tenha sido descri to com referência a incorporações especificas, os detalhes dessas incorporações não devem constituir limitações. Podem ser feitas diversas equivalentes e modificações, sem afastamento do espirito e do âmbito deste invento, e entende-se que essas incorporações equivalentes são parte deste invento.

Claims

REIVINDICAÇÕES lã. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto cicloserina e uma quantidade terapeuticamente eficaz de D-alanina. juntamente com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
2ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1 . caracterizado por se preparar uma composição constituida principalmente por uma quantidade terapeuticamen te eficaz de D-cicloserina e uma quantidade terapeuticamente eficaz de D-alanina.
3â. - Processo de acordo com a reivindicação 2. caracterizado por se preparar uma composição em que a relação entre D-alanina e D-cicloserina se encontra numa gama de cerca de 1 para 1 a cerca de 100 para 1.
4â. - Processo de acordo com a reivindicação 3 . caracterizado por a referida relação se encon trar numa gama de cerca de 10 para 1 a cerca de 100 para 1.
5ã. - Método terapêutico para melhoria da função coginitiva. ou tratamento de disfunção cognitiva . ou tratamento de psicose, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade terapêutica e uma quan tidade terapeuticamente eficaz de D-alanina, sendo a gama de dosagem de cicloserina de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg

-30por quilograma de peso corporal por dia.

65. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida quantidade terapeuticamente eficaz de D-alanina ser uma quantidade de D-alanina redutora de efeitos secundários.

75. - Método de acordo com a reivindicação 5. caracterizado por compreender a co-administração de uma composição contendo o referido composto cicloserina e a referida D-alanina numa relação terapeuticamente eficaz.

85. - Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a referida composição farmacêutica conter essencialmente, uma produção terapeuticamente eficaz, da referida cicloserina e uma quantidade terapeuticameri te eficaz da referida D-alanina. em conjunto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

95. - Método de acordo com a reivindicação 8. caracterizado por o referido composto cicloserina ser D-cicloserina,

105. - Método de acordo com a reivindicação 9 . caracterizado por a razão entre a D-alanina e a D-cicloserina se encontrar na gama de cerca de 1 para 1 a cerca de 100 para 1.

-31llã. - Processo de acordo com a reivindicação 10 . caracterizado por a referida razão se encontrar na gama de cerca de 10 para 1 a cerca de 100 para 1.

12^a. - Método terapêutico para o tratamento da Doença de Alzheimer num indivíduo quando tal terapia for adequada, caracterizada por compreender a co-administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz D-cicloserina e uma quantidade terapeuticamente eficaz de D-alanina estando as referidas D-cicloserina e D-alanina numa relação terapeuticamente eficaz, sendo a gama de dosagem de cicloserina de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg por quilograma de peso corporal por dia.

13â. - Método terapêutico para o tratamento do enfraquecimento da memória associado à idade num indivíduo quando tal terapia for indicada, caracterizado por compreender a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de D-cicloserina e de uma quantidade terapeuticamente eficaz de D-alanina. estando as referidas D-cicloserina e D-alanina numa relação terapeuticamente eficaz, sendo a gama de dosagem de cicloserina de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg por quilograma de peso corporal por dia.

14â. - Método terapêutico para o tratamento de deficiência na aprendizagem num indivíduo quando tal terapia for indicada, caracterizado por compreender a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de D-cicloserina e de uma quantidade terapeuticamente eficaz de D-alanina. estando as referidas D-cicloseri-32na e D-alanina numa relação terapeuticamente eficaz, sendo a gama de dosagem de cicloserina de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg por quilograma de peso corporal por dia.

15ã. - Método terapêutico para melhorar a memória ou a capacidade de aprendizagem num indivíduo saudável . caracterizado por compreender a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de D-ciclo serina e de uma quantidade terapeuticamente eficaz de D-alanina estando a referida D-cicloserina e D-alanina numa relação terapeuticamente eficaz, sendo a gama de dosagem de cicloserina de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg por quilograma de peso corporal por dia.

16â. - Método terapêutico para o tratamento de doenças psicóticas, nomeadamente, doenças esquizofrénicas . em especial doenças esquizofrénicas induzidas por PCP Γ 1-(f enilciclo-hexil)piperidina_7 , caracterizado por compreender na administração ao indivíduo de uma;quantidade terapeuticamente eficaz de D-cicloserina e de uma quantidade terapeuticamente eficaz de D-alanina, estando as referidas D-alanina e D-cicloserina numa relação terapeuticamente eficaz , sendo a gama de dosagem de cicloserina de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg por quilograma de peso corporal por dia.