PT91345A

PT91345A - Substancias biocompativeis e tromboresistentes

Info

Publication number: PT91345A
Application number: PT91345A
Authority: PT
Inventors: Ralph K Ito; Frank W Logerfo
Original assignee: New England Deaconess Hospital
Priority date: 1988-08-03
Filing date: 1989-08-02
Publication date: 1990-03-08
Also published as: ES2068897T3; CA1338756C; DE68920671D1; DK379189A; FI893660A; ZA895862B; AU3918889A; EP0357242B1; AU624170B2; EP0357242A1; DD283933A5; IL91188A0; IL91188A; DE68920671T2; KR900002752A; JPH02147067A; IE892501L; DK379189D0; FI893660A0; US5167960A

Description

Anieced@nt.es da Invenção 0 domínio técnico da presente invenção é o dos materiais vasculares prostéiicos, e, mais especif1 comente, o das substâncias biocompatíveis e iromboresisienies e dos processos para a sua preparação. A exposição de sangue a superfícies artificiais dá geralmente origem a depósito de uma camada de plaquetas aderentes ; acompanhado por a.ctivacão do sistema de coagulação intrínseca, e, finaImente, a formação de um trombo. De facto, pode haver uma iníeracção sangue/materiais significativa numa simples passagem através de um enxerto arterial prostético. Os tipos de proteínas sanguíneas inicialmsnie absorvidas ou unidas/a superfícies sintéticas podem incluir proteínas implicadas em coagulação por contacto. A coagulação por contacto ou percurso extrínseco de coagulação é uma sequência complexa de acontecimentos bioquímicos que induz a formação de fibrina, plaquetas e activa-ção complementar, quimiotàxis, geração de quinino e activação de componentes fibrinolíticos. Além disso, cada um destes acontecimentos aumenta percursos bioquímicos subsequentes frequentemente controlados por laços de retorno positivos e negativos. Assim, a trombose induzida por contacto com materiais artificiais é um obstáculo importante no desenvolvimento e utilização de próteses internas e dispositivos extracorpóreos como vasos e órgãos artificiais, desvio cardiopulmonar e equipamento d© hemodiálise. Têm-se utilizado/em próteses vasculares, materiais com graus diversos de resistência è trombose, com pouco êxito. Estes materiais incluem metais oxidáveis (limpeza automática), polímeros sintéticos como poiidimetil siloxano, Teflon, acilatos e metacrilatos como Oacron, eléctretos, copolímsros aniónicos s 3

hidrogeles ípars uma análise ver Salzman st ai. (1887), em

He0iostasl^_M!á^[l3^^.....Clinicai__PiiaUcs (Colman st al . , eds. ) J.B. Lippincott Co., Phils. PA, pp. 1335--1347}.

Para diminuir a probabi1 idade de trombose devida a períodos extensos de tempo de contacto com esses materiais artificiais, têm~ss tratado pacientes com anticoasulante administrado sistematicamente, além de medicamentos antiplaquetas e iromfoolíticos, tambám administrados sistematicamente. Estes medicamsntos/incluem qualquer composto que iniba selectivamente sintetase de tromboxano sem afectar a sintetase prostaciciina, afecte a aderência, agregação e libertação de plaquetas, aumente a produção de PSI2 vascular, e/ou iniba a agregação de plaquetas por intermédio tanto de trombina como tromboxano. Estes compostos incluem aspirina, sulfinpirazona, dipiridsmole, ticlopidina s suloctidilo. No entanto, o tratamento com estes medicamentos origina frequentemente efeitos secundários não desejados, incluindo hemorragia sistemática e incapacidade para iniciar e completar a formação de coágulos noutro lugar do corpo.

Para aumentar a tromboresistência de materiais artifi..... ciais, têm-lhes sido unidas moléculas biologicamente activas que têm propriedades inibitórias trombo!£ticas, anticoagulantes/trom-bogenéticas e inibem a formação de plaquetas, ror exemplo, tem-se unido hsparina a superfícies artificiais para diminuir a coagulação por meio da activacão de diversos inibidores do sistema de formação de coágulos intrínseco (Salzman et al. (1387) em Hemos- .k§ ÂM.......and.....IhrombosisJ Basic Principies and Clinicai.......Pr atice, 2ã

Ed., (Colman et ai., ©ds.), Lippincott Co., Phila., PA, pp. 1335-1347}. Contudo, a heparina aumenta respostas de plaquetas a estímulos como ADP ou coiagéneo, e promove duas respostas sanguíneas primárias/prejudiciais em direcção a superfícies sintéticas,· - 4 - \

adesão a agregação ds plaquetas. Além disso, embora o complexo hsparina/antitrombina unido à superfície possa ser passivo/em relação a plaquetas, a grande variedade de efeitos que tem em interseções como factor de crescimento celular endotélico, na inibição de proliferação de músculo liso, e na activação de lipoproteína lipase criam dúvidas quanto a possíveis efeitos prejudiciais induzidos ao longo do tempo.

Também se uniram agentes antiplaquetas como PSE, , P6I.., 1 .2 (apenas utilização experimental), hNP cíclico e aspirina s superfícies polímeras sólidas. Estes agentes dificultam a libertação de íactores plaqueta que estimulam respostas a curativos prejudiciais na proximidade de um enxerto vascular. Também podem diminuir a formação de trombos ajudada por plaquetas, por meio da inibição/da adesão de plaquetas. A exposição de muita® superfícies artificiais a albumina antes de contacto dá origem a menor reactividade com plaquetas (Publicação NIH nã. 85-2185, Setembro ds Í98S, PP. 1S--S3) . Portanto, tem-se utilizado albumina para revestir superfícies sxtracorpôreas antes da cirurgia de desvio eardiopulmonar. Contudo, não se obteve por este processo uma termoresistência de longo prazo. Têm-se unido estreptoquinases e uroquinases íibrin™ oliticamente activas a superfícies artificiais CKussero^ et al., ΊJ^SmΰL--B!L·-^SSiL·í___ΑΓtil-.,_Intern,............Qrsmm. (1971> 1211). Estas enzimas diminuem o depósito excessivo de fribina e/ou as oclusões trombótieas. No entanto, a avaliação a longo prazo da sua capacidade para conferir tromboresistência a uma superfície sintética não foi determinada. 5

v"’" v

Também se imobilizaram agentes tensio-activos como Pluronic F-S8 sobre superfícies artificiais, mas não se afigura que proporcionem compatibi1 idade sanguínea a longo prazo CSalyer st al., < 1 871 > {MlcM__ApplicatlMM.....ol......Plastlcg,»........Biomech...... flaierr- ials Res. Symp. (6'regor, sd.) M2. 1 pp. 10S1.

Portanto, o que é necessário é ter melhores materiais biocompativeis que sejam tromboresistentes a longo prazo e cujos componentes activos provoquem efeitos secundários prsjudiciais.

Um objecto da presente invençlio á proporcionar um material sintético, biocompativel e tromboresistente para dispositivos implantáveis e exiracorpôreos em contacto com fluidos corporais.

Outro objecto é proporcionar um inibidor de irombogéne-sê imobilizado, biologicamente activo, e um processo para a sua preparação.

Outro objecto ainda da presente invenção é proporcionar um processo para a inibição da agregação de plaquetas, a libertação ds f adores plaqueta e a trombogánese no lugar localizado do enxerto ou da entrefacs prátese-sangue, evitando-se assim o efeito sistémico de medicamentos antlplaqueta e antitrombose.

Sumário da........Invenção

Descrevem-se na presente os materiais a processos para a preparado de substâncias biocompativeis e tromboresistentes úteis como componente de dispositivos implantáiveis ou extracorpó-raos em contacto com o sangue. 6

Descobriu-se que um material sintético e biocompatível pode tornar-se uma substávicia iromboresisiente, se se imobilizar contra ele, por meio de uma camada de revestimento de base, o inibidor de irombogénsss hirudina, ou um análogo activo ou um fragmento deste, de maneira a não comprometer a sua actividads inibitória de trombogénese. A expressão "inibidor de trombogénese” é utilizada na presente parai descrever uma· proteína nativa, sintética ou rs-eombinante ou um seu fragmento com as caracierísiicas físicas e bioquímicas da hirudina.

Os materiais sintéticos tidos sm conta pela presente invenção são preferivelmente polímeros como Dacron, nilão, poliuretano, colagéneo reticulado, poliistraíluorostileno, ácido poliglicólico e suas misturas, sendo Dacron o material poiimérico mais preferido. Também se podem empregar materiais sintéticos.

Pelo menos uma camada de material biocompat£vel adere a pelo menos uma superfície do material sintético. Eísta camada ds revestimento de base contem um componente capaz de ligar o inibidor de trombogénese. Os exemplos desses componentes de revestimento de base incluem proteínas, peotídeos, iipoproteínas, gl1coproteínas, glicosaminoglicanos, hídrogeles, polímeros sintéticos e suas misturas. Em aspectos preferidos da presente invenção, a camada de revestimento de base inclui um componente proteína como soro albumina ou íibronectina de base inclui um componente proteína como soro albumina ou fibronectina proveniente, por exemplo, de fontes humanas ou bovinas, ou misturas destas proteínas. Também se podem utilizar outros materiais para formar a camada revestimento de base.

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De acordo com a presente invenção, o inibitíor de iromhogénese é imobilizado sobre o material sintético por intermédio de uma camada de revestimento de base que adere a pelo menos uma superfície do material sintético. A camada de revestimento de base contem um componente capaz de ligar o inibidor de irombogánsse sem comprometer a actividade biológica do inibidor.

Em aspectos exemplares da invenção, o material sintético é actiyado antes de lhe ter sido aderida a camada de revestimento de base a im de acentuar a sua capacidade para ligar a camada de revestimento base. Por exemplo, num aspecto preferido, o material sintético é posto em contacto com uma solução que torna disponível pelo menos um grupo aciivo quimicamente (por exemplo, um grupo ácido carboxilico) no material parai ligação a um reagente reticulado biíuncional (por exemplo, carbodiimida). 0 material assim tratado é depois posto em contacto com uma. solução que contem o reagente carbodiimids reiiculante durante tempo suficiente para deixar ligar-se-lhe o grupo activo quimicamente.

Noutra forma de realização, o material sintético pode ser posto em contacto com uma solução que separa impurezas que se encontram no referido material e/ou sobre este antes da fase de ac ii vaçSo desc r i ta anter iormenie .

Noutra forma de realização, o material sintético pode ser posto em contacto com uma solução que separa impurezas que se encontrem no referido material e/ou sobre este antes da fase de activação descrita anteriormenie. A fase de imobilização pode ser efectuada por meio de um contacto inicial do inibidor de irombogénese com pelo menos uma molécula de um reagente de reticulação bifuncional durante um período de tempo suficiente para permitir a ligação do reagente - © ao inibidor , e seguidamente por ligação do reagente inifeidorre-iiculado de irombogénese ao revestimento de base. 0 inifoidor de irombogénese ligado mantém a sua. actividade inibitíora de trombo™ génese quando é ligado ao reagente. 0 reagente de reticulado bifuncional utilizável para essa fase de imobilização pode ser heterofoifuncional Cp.©., N-succinimidi1 3-C2~piridiIditio)} propionaio CSPDP), homobifuneional íp.e., etileno glicolbis fsuecinimidilsuccinato) <EGS)}, ou uma mistura de ambos. A expressão •'•'agente de reticulaçlo bi funcional" é definida na presente como uma molécula capaz de se unir, e portanto ligar, dois grupos reagentes, por exemplo numa molécula ou em duas moléculas separadas. Se o reagente de rsticuiaçso bifuncional liga dois tipos de grupos diferentes, é um reagente de reiiculação "heterobifuneional". No entanto, se o reagente de reiiciação biíuncional ligar apenas dois grupos similares, será "homob i f unei ona1".

Antes da fase de ligação, o reagente de irombogénese reticulado pode ser submetido a processos cromaiográficos para separar impurezas nele misturadas.

Num aspecto alternativo da presente invenção, o revestimento de base que aderiu ao material sintético pode ser ligado ao mesmo tempo a pelo menos uma molécula de um reagente de reiiculação bifuncional. Nesta forma de realização, o processo inclui ainda a ligação do reagente inibidor de Irombogénese •reticulado ao reagente ligado com reagente de base, ligando por este meio o inibidor de irombogénese à camada de revestimento que aderiu ao material.

Noutro aspecto do presente invento, o reagente reticulado de base é reduzido antes da fase de ligação. A redução dá origem á formação de grupos sulíidrilo provenientes do reagente no revestimento de base que pode reagir com o reagente de reticolação bifuncional inibidor reticulado por meio de uma reacçao de substituição para formar uma ligação S-S, ligando por este meio covalentemente o inibidor de trombogénese ao revestimento de base.

Noutro aspecto ainda da invenção, o revestimento da base é ligado ao inibidor de trombogénese representadas por desenhos. No entanto, deve ficar esclarecido que se podem fazer diversas modificações, adições e supressões sem sair do espirito ou do âmbito da invenção. ÍLtm....DâS£ll£Í2.,,^j£esei^20

Ds objectos anteriores e outros da presente invenção, as suas diversas caracisristicas, assim como as suas invenções podem ser compreendidas de maneira mais completa a partir da descrição que se segue quando liga conjuntamente com os desenhos-anexos, nos quais; A figura 1 é uma representação esquemática dos percursos implicados na trombogénese. A figura 2 é uma representação esquemática da implicação das plaquetas na trombogénese; e 10 A figura 3 ê uma representação esquemática da sequência aminoácids de hirudina nativa. fesr i g,jp.....Çfa lovem^fo A presente invenção proporciona substância biocompatí-vais e tromboresistenies utilizáveis para dispositivos implantáveis e exiracorpóreos em contacto com o sistema vascular, e processos para a sua fabricado.

As substâncias proporcionadas pela presente invenção incluem uma substância foiocompaiivel sintética que tem um reagente inibidor de trombogénese que lhe está ligado por um revestimento de base biocompatível que aderiu â superfície do material . 0 material utilizável num dispositivo prostético sxtracorporal ou ímplantável pode ser composto por qualquer material biocompatível, sintético, preferiveimente polimérico que tenha resistência à tensão suficiente para suportar as exigências da circulação sanguínea, e tenha sobre os quais se possa unir um revestimento de base directa ou indirectamente. Exemplos desses materiais sintéticos slo politeirafiuoroeiileno (Teflon) e Dacron, niião, etc.. 0 material pode ter quaisquer dimensSes adequadas ao fim em que está a ser utilizado. Pode ser uma parte integrai de uma válvula de coração implantada ou de um dispositivo extracorpóreo utilizado para hemodiálise ou cirurgia de desvio cardiopuimonar, ou pode ser utilizado para revestir cateteres ou para alinhar o interior de um enxerto vascular. 0 material sintético, quando obtido, pode ser revestido com ou conter diversas impurezas que aderiram não covalentemente cuja separação possa ser condição prévia para. a aderência de um revestimento de base ao mesmo. Por exemplo, podem separar-se iubr i f i canies sobrs Dac ron de qua 1 idads corner c ia 1, pondo o Dac ron ©m contacto com uma solução que contem, por exemplo, diversos detergentes, dissolventes ou sais, que sol taro e/ou so 1 ub i 1 i zsm estas impurezas.

Os quadros 1 s 2 são esquemas de processos representativos para a separação da substância biocompatível © trombonesis-tente, em que "Da" designa um material sintético composto por fibras Dacron tecidas, e "HSA" designa albumina de soro humano.

QUADRO 1 .i

Da . "Ϊ* í'íít!íUR

Da-COOH

2‘.i Da-COOH + EDC

Da-EDC + Hsa

Da-HSA + urea (EDC by '”D!’OQUC t. )

Da-HSA + SPDF n—u =”· λ .... c- o ;*,»

Da-HSA-SPDP+DTT

I nh i b x to r · SPDP -----> ΐ nh i b x to r -SPDF

Da—HSA-SH a~ Inhibi tor~"SPDP

Da-HSA-S-S-Ϊ nhi b itor

I

&yADR0_2

FASE

PROCESSO

1) HSA + SPDP ----------------------> Os-COOH

2) HSA-SPDP + DTT .................—> HSA.....SH + P.....2-T

3) Inhibitor + SPDP --------- > Inhibitor-SPDP 4) HSA—8H+Inhibitor-SPDP -----> H8A-S-8-Inhibitor+

P-2-T

55 D® NaOH Da-COOH

8 5 Da-COOH + EDC -------------------> Da-EDC 7) Oa-EDC+HSA-S~S-Inhibitor-> Da-HSA-S-S-

Jnhibitor ·*· urea CEDC foy~product>

Inic ia 1 mente, o material pode ser act-ivado de maneira a acentuar a ligação da camada de revestimento de base. Esta fase de aciivação aumenta o número de grupos quimicamente activos na material. Por exemplo, pode efectuar-se hidrólise alcalina para aumentar o número de grupos ácido carboxilico reagentes no Oacron ao qual pode ser ligado um reagente de reticulaçáo bifuncional, por exemplo carbodiimida. Por fim, o revestimento de base acabará por aderir aos grupos carbodiimida ligados sobre o material. No

entanto, este processo deve ser realizado com cuidado, visto que a hidrólise alcalina degrada parcialmente o Dacron, o que provoca desgaste das fibras do material.

Pelo menos uma camada de revestimento de base adere a pelo menos uma superfície do material sintético.

Esta camadaj quer tenha aderido ao material ou nlo, proporciona componentes para ligação do inibidor de trombogénese. Esses componentes proporcionam mais lugares de ligado para o inibidor do que o material sintético, isoladamente, pelo que amplificam a quantidade de inibidor que pode ser ligado. Os componentes utilizáveis incluem proteínas, peptideos, lipoproteí— nas, glicoprotelnas, glicosaminoglicanos, polímeros sintéticos s suas misturas. As proteínas como albumina de soro s íibroneciina são particularmente úteis para este fim, visto que se sabe que têm propriedades sntitrombogénicas muito desejáveis como componentes de revestimento de base CLyman et al. (1SS5) Trans. Am. SSÍL;___ízLÍJJL_Ιπίϋΐ!£ΠΑ„^^ yj 301: Falb st al . <1971) Fed. Pv^oc Λ 30! 1688Í. Uma molécula HSA, por exemplo, tem 65 grupos amino disponíveis como locais de ligação. A ligação do revestimento de base á superfície artificial pode ser de natureza covaiente. Os processos para 1ígar covalanismsnie proteínas a Oacron implicam o ataque do grupo éster succinimída reagente do reagente de reticulado a grupos amino primários sobre uma proteína. Conforme está indicado no exemplo do Quadro 1, para fazer aderir covalentemente o revestimento de base a Dracon, o Oracon é tratado inicialmsnts com NaOH 0,S N e posto em reacção com carbodiímida antes de ser revestido com HSA (revestimento de base) em solução saturada de cloreto de sódio (P88) com tamplo fosfato.

Um inibidor da trombogénese utilizável como revestimento para superfícies em contacto com sangue, fluídos corpóreos, ou tecidos, adere então covalentemente ao revestimento de base por intermédio do componente. As substâncias revestidas com inibidor são ideais para utilização impiantável em dispositivos que estão em contacto directo com sangue. Por isso, enxertos de desvio utilizados para substituir vasos sanguíneos ficam frequentemente cheios com coágulos sanguíneos ou trombos, o que reduz o fluxo de sangue. Visto que a substância revestida com inibidor é resistente â formação de coágulos sanguíneos, evitam™ -se trombose e bloqueamento subsequente do enxerto de desvio. Analogamente, quando se colocam cateteres no sistema vascular para um diagnóstico ou com fins terapêuticos, forma-se frequentemente um coágulo sanguíneo no exterior do catetsr. 0 coágulo pode ser separado do cai-ater por lavagem com sangue circulante, ou pode ser separado por manipulação do cateter, aumentando a possibi1 idade de embolia bloquamento da circulação para órgãos vitais. As substâncias revestidas com inibidor proporcionam vantagens análogas para válvulas de coração artificiais ou prostéticas, bombas de balão intra-aórticas, dispositivos de coração total ou artificial ou de ajuda ao coração, dispositivos intracavas, e qualquer dispositivo em contacto com a corrente sanguínea. Além disso, os dispositivos revestidos com inibidor proporcionam vantagens para dispositivos intracavidade como cateteres de diâlise iniraperitoneais e implantações subcutâneas onde as reacções inflamatórias induzidas por irombogénese diminuam .

Os inibidores de tromfoogénese utilizáveis para estes fins incluem hirudina e análogos activos, fragmentos, derivados e produtos da fusão dos mesmos, ou as suas misturas. - 16 A hirudina é uma proteína isolada a partir da saliva de sanguessugas, cuja sequência amino ácida está representada na figura 3. A hirudina diminui a adesividade de plaquetas, uma característica que é atribuída provavelmente ao seus modo de acção sobre a trombina. Esta propriedade isolada torna a hirudina um anticoagulante com muitíssimo interesse quando superfícies sintéticas têm interface com sangue. Também inibe selectivamente s capacidade da trombina para ser proteol £iica, para ser mi to·™ génica para fibroblastos, para activar plaquetas e ter propriedades quimiotáticas para monóciios s leucócitos polimorf©nucleares, Além disso, o complexo hirudina-trombina imobilizado pode reduzir a intensidade dos acontecimentos de quimiotâxis mediada por trombina. Este é um acontecimento significativo, visto que a inflamação crónica pode ser devida à libertação por leucócitos polimorfonucleares de enzimas degradaiivas s supsróxidas através do enxerto que apresenta efeitos nos locais da anastómose, contribuindo para hiperplasia anastomótica.

Existem diversos análogos de hirudina sintéticas s rscombinantss <p.e., C6P39393 produzida por técnicas AON rsc-·· ombinanies por Ciba-Geigy, Basileia, Suiça; PCI U073/0063S; PCT W086/036Í7) que são pelo menos igualmente úteis como inifcidorss de trombogénese. 0 inibidor de trombogénese é imobilizado direcia ou indiraciamsnie no revestimento de base por meio da utilização de um reagente de reticulado bifuncional. Em particular, um reagente de raiiculação heierobifuneional que tenha dois grupos reagentes diferentes em cada extremidade de uma molécula linear, s possa, portanto, ligar dois grupos reagentes diferentes sobre outras moléculas ou sobre uma região diferente da mesma molécula, é muitíssimo útil como agente de reticulado bifuncional. Por exemplo, sulfosucc inimidil 2-Cm-azoto—o-ni tro-benzamido>

sii 1--1,3J ™di iio-ptopionato /'SANO5, ou N--succ inimidi 1-6-(4-azoido---2'-niirofenil-amino) hexanoato (SANPAH) têm um grupo fotoreagente que ss pode inser i r di rec ta mente em ligação C-H do revestimento de base por meio ds união íotoquímica, enquanto que o outro grupo se mantém livre para. se ligar a proteínas.

Outros reagentes de reticulação utilizáveis e preferíveis (por exemplo SPDP) e as suas caracterísiicas estão indicadas no quadro 3. Mo Quadro 3, o “Número Agente Duplo" indicado para cada reagente é a designação comercial do reagente vendido por Piercs Chemical Co. (Rotkfordí Illinois?.

I QUADRO____3 Núrasro Ac rôni co Bi funcional idade EaxauLeaiente. Agente Agente Home Hetero MH^ SH Fotoreagenis

21551 ANB-NOS X X X 201 OS APS V *\ V Λ ** 20 í 07 APS V Λ Λ 2Í&S9 APTP A X X 21579 *«« BS-” Â y 22319 BMH V Λ y 21554 BSOCOES V Λ V Λ 21524 PFQNB X X 20047 01DS V Λ X 20564 DMA X X 20666 DMP X X 20668 DM8 X X 22585 DSP A X 21555 D8S X X 20590 DST X X 20S65 DTBP X X 22590 DTBPA X χ 21577 DTSST X X 2 í 550 EADB Λ X y 21555 ΕΘ8 V A X 23700 FNPA X X X 21560 HSAB y X X

1 '3 Q U A D R 0 3 (CONT.) Número A crónico B i f une i o na 1 i da.de Para reagente Agente Agente Ho roo Ho ter o NH..r SH Fotoreagente

26095 ΜΑΒΙ X X X 22310 MBS X X X 27715 NHS-ASA X X X 20669 PNP-DTP X X X 21552 SADP X X X 21549 SAND X X X 22588 SANPAH X X X 27716 SASD X X X 22325 SIAB X X X X 22320 SMCC X X X 22315 SMPB X X X 21557 SPDP X X X 21556 Sulfo- BSOCOES X X 20591 Sulfo- DST X X 21556 Sulfo- EGS X X 22312 SulfO- MBS X X X 21553 Sulfo- . SADP X X X 22589 Sulfo- SANPAH X X X

Q U A D R 0 •3| (CONT.) Número Acrónico B i funci ona1i dade Pa r a r e a ·=ι e n t e Agente Agente Η o m o H e t e r o NH.-, £ H F o t o r e a. g e π t e 22327 Sulfo- SIAB X X X 22322 Sulfo- SMCC X X X 22317 SulfO- SMPB X X X 26101 TRAUT'S X X

0 reagente de reticulado é aplicado ao revestimento de base em quantidades tais que se obtenha a densidade de local de ligação desejada. A densidade de local de ligação é a quantidade de reagente de reticulação, em termos de moles/g de material sintético., para ligar ao revestimento de base enquanto proporciona cobertura confluente da superfície.

Para colocar o inibidor em condiçoes para ligação ao revestimento de base, o reagente de reticulado pode ser inicial-mente unido em separado ao revestimento de base e ao inibidor. As constantes cinéticas dos inibidores são comparadas antes e depois da união para avaliar os efeitos do processo sobre as suas constantes cinéticas. 0 inibidor deve manter-se biologicamente activo depois de ser unido. Portanto, síectuam-ss experiências normalisadas de actividade específicas para o inibidor a imobilizar, utilizando uma solução de trombina normalizada para avaliar esta capacidade.

Como variante, o componente proteína do revestimento de base pode ser ligado ao inibidor de trombogénese formando um conjugado antes da sua aderência ao material sintético, e o conjugado ligado ao material sintético conforme está indicado no Quadro 2. Além disso, o conjugado inibidor de trombogénese mantém actividade biológica, e pode ser utilizado como agente para aumentar a meia vida na circulação porque não é facilmente clarificado pelo rim.

Mo caso especial do SPDP, a derivação de hirudina, a ligação de certos grupos sobre hirudina para SPDP podem destruir a actividade biológica da hirudina, porque pelo menos alguns destes grupos são necessários para actividade. No entanto, ajustando a proporção de reaccão de hirudina para SPDP /7 <í;4, moles;moles), e eíectuando a rsscçSo próximo do pH f isiológico, o SPDP torna-se um tanto selectivo para épsilon amino grupos. 0 resultado destas condições favorece uma proporção conjugado de 1:1 (moles:moles) de hirudina para SPDP covalents-mente ligada sem destruir a actividade biológica da hirudina. 0 SPDP reagirá com grupos amino terminais ou épsilon. Visto que a derivação d© um grupo amino terminal pode inaciivar uma proteína biologicamente activa, pode empregar-se T-BLOCK (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois) para bloquear aquele grupo durante a derivado de SPDP. 0 T-BLOCK é depois separado após derivação para restabelecer a actividade biológica. A invenção será melhor compreendida com os exemplos seguintes, não limitativos. §L1.....£.....__i A. Tratamento prévio e Activado de Dacron

Corta-se Dacron poliéster 52 (DuPont) em pedaços com 1,0 cm de comprimento. Separa-se o lubrificante que está sobre a superfície tecida e no interior desta, por meio de uma lavagem durante l hora com tetracloreto de carbono, e duas lavagens com CH.-,.»^ 100¾. Separa-se o metanol por meio de várias lavagens com á-gua, seguidas por ua>a lavagem em solução saturada de cloreto de sódio com tamplío fosfato (PBS), pH 7,4.

0 material de enxerte é seguidamenie submetido a hidrólise alcalina para aumentar os grupos COOH disponíveis. 0 material é tratado com NaOH 0,5 II a 50'"'"' durante 1 hora. Em seguida é lavado com h,.._ . . . zu repetioa- inSiiie, e iniciam-se imediatamente as fases seguintes. 0 material activado é colocado em 100,0 ml de carbodiimida (EDO solúvel em âgua 10 mM em água desionizada, pH 4,5-5,0 durante 1 hora á temperatura ambiente com agitação constante. 0 material é separado a lavado em PBS para separar excesso de EDC vicio ligado.

Formação do Revestimento de Base

Aplica-se o revestimento de base ao lúmen do material de enxerto Dacron. 0 material Dacron derivado d é incubado numa solução de HsA a &% em PBS a í ml/cm” de material de enxerto durante 24 horas á temperatura ambiente com agitação constante. 0 enxerto é separado s lavado em PBS para separar HSA não especificamente ligado. Ligam-se aproximadamente 20 mg de prote£na/mg

Dacron de maneira covalente. 0. Ligação de SPDP ao Revestimento de Base 0 material Dacron ligado com HSA á incubado numa solução 1,0 mil de SPDP em PBS, pH 7,4, para ligar o SPDP ao HSA (100 mH S'PDP/cm“ de revestimento de base?. A incubação termina ao f im de 30-40 minutos à 24

temperatura ambiente. G enxerto ê laçado em PBS para separar SPDP não especificamente ligado. E · AçM^ãJElQ......de_SPOP............sobre......Re vesti mento.......de......Base .......e.......Medição de SSj3SÍáâdjL^gJaO£M......MeJUlsasfo. 0 material SPDP ligado é seco e pesado par® se determinar o seu peso absoluto. É depois colocado numa solução 50 míl de ditiotritol ÍDTT) durante S minutos á temperatura ambiente. Esta reacção liberta piridina-2-txona (P-2-T) do SPDP iigado; e ao mesmo tempo forma grupos sulfidriio livres (SH) no revestimento de base. A quantidade de Ρ-2-Ϊ liberta é determinada por espectrofotometria de absorção a 343 nm utilizando o seu coeficiente de extinção <£ = S,08 x Í0’'),e é directamente proporcional á quantidade de SPDP ligado aos locais de ligação. 0 número de locais de ligação é calculado e expresso em moles de locais/g de Dac ron. 0 material é depois lavado 5 vezes em PBS © 4 vezes em dHon

E · kÍãâ£l£.2álL

Prepara-se uma resuspensão de hirudina iiofilizada em PBS a 1 mg/mi. Dissolve-se SPDP (Pharmacia; Fiscataway, MJ) em ETOH a 100% para 10 mH. Uma parte de hirudina é misiu-rada com 4 partes SPDP Cmoles ;moles); e incubada durante 30 minutos â temperatura ambiente. A hirudina ligada a SPDP é seguidamenis separada de SPDP livre e a reatção de subprodutos por cromatografia sobre uma coluna Θ-25; a hirudina derivada é aluída primeiro. G· IMItlg......de, SPDP Ligado.....a Hirudina A ligado de SPDP a hirudina pode ser quanii-f i c ada por meio da adição de DTT que liberta piridina-““2“iiona (P-2-T) a partir de SPDP ligado a hirudina, © que pode ser medido especiroíoiomeiricamenie a 343 n®. A partir desta medição,- os moles de SPDP ligados a hirudina podem ser calculados. Cada P--2-T liberto representa uma ligação covalente de SPDP a hirudina. Um .mole de hirudina liga por 1,2 moles de SPDP no presente estudo. H · Llmcgo... ^^-.B‘®ygMjjyi®nÍLO_de-..Base.

0 revestimento de base ligado com SPDP reduzido (com grupos SH livres é lavado com PBS para separar o DTT. Adiciona-se a seguir hirudina ligada a 2 SPDP sío enxerto a 50,0 mg/cm Dacron. A solução é incubada até a.o dia seguinte à temperatura ambiente para permitir a ligaçSo de SPDP-hirudina a grupos SH no enxerto Dacron. 0 material Dacron com hirudina covalen-temente imobilizada é depois lavado e armazenado em PBS.

Análise

Ensaios Espscircfotoméirícos;

Para determinar a quantidade de SPDP-hirudina imobilizada no revestimento de base, faz-se uma leitura de absorvência a 343 nm da solução no momento da adição de SPDP-hirudina ao Dacron. Depois da incubação durante toda a noite, faz-se outra leitura de absorvência, s a modificação da absorvência é devida á quantidade de r-2-t libertada de SPDP-hirudina. A quantidade de Ρ-2-t liberta é direcia-mante proporcionai ao número de reacçSes de substituição SPDP que ocorrem entre os grupos SH de reves t i mento de base e SPDP-h i rud i na.

Ensaios de Inibição de irombina;

Utilizando uma quantidade conhecida de trombina, pode construir-se uma curva padrão com uma quantidade conhecida de hirudina ou análogo de hirudina, adicionando hirudina a trombina s medindo a actividade da trombina residual tendo S-223S como substrato cromato-gráfico. A inibição de trombina por hirudina derivada <hirudlna-SPDPl ou hirudina imobili..... zada (o material Dacron com hirudina imobi..... lizada? ê seguidamente comparada com valores de hirudina não derivada equacionando valores ED50 com o emprego de unidades MIH 10/ml de trombina, e medindo a actividade da trombina residual.

formas A presente invenção pode ser realizada noutras especificas sem sair do seu espírito ou earacterísticas essenciais. As presentes formas de realização devem ser consideradas, portanto, am todos os seus aspectos, descritivas e não restritivas, sendo o alcance da invenção indicado pelas reivindicações anexas em vez de pela descrição que se segue, a todas as modificações abrangidas pelo signifiçado e alcance da equivalência das reivindicações pretendem, portanto, ser abrangidas neste domínio. i

Claims

eEiyiNOICACSES is.™ Substância biocompativel e iromhoresisienie caractsri····· zsda por compreender I <a) um material sintético e biocompaiível; (b) pelo menos uma camada de revestimento de base biocompaiível que adere a pelo menos uma superfície do referido material; e (c) um inibidor de irombogénese imobilizado na referida camada de revestimento de base, sendo o referido inibidor hirudin ou um análogo aciivo ou um seu fragmento, tendo a referida camada de revestimento de base um componente capaz de unir o referido inibidor de irombogénese, e tendo o referido inibidor actividade inibidora de irombogénese quando i mob i1izado. 21.™ Substância de acordo com a reivindicaçao i, caractsri™ zada por o referido material compreender um polímero. Sl. Substância de acordo com a reivindicação 2, caractsri™ zada por o referido polímero ser escolhido no grupo constituído por D&cron, nylon, poliuretano, colagéneo reticulado, ácido poliglicòlico, politsiravluoroetileno, e suas misturas.
41. Substância de acordo com a reivindicaçlo 3, caracieri-zada por o referido polímero compreender Dracon. Sê. Substância de acordo com a rei vindi caçfío í , caracteri·-zada por a referida camada de revestimento de base compreender um componente escolhido no grupo consiiiui··· do por uma proteína, peptídeo, 1ipoprotsína, glico-proteína, giicosaminoglicano, hidrogel, polímero sintético e suas misturas. Si.™· Substância de acordo com a reivindicado S, earactsri-zada por o referido componente da referida camada de revestimento de base compreender uma proteína. 71.-"· Substância de acordo com a rei vindi caçlo S, caracteri-zada por a referida proteína ser escolhida no grupo constituído por soro albumina, ííforonectina e suas misturas.
81.-- Substância de acordo com a reivindicaçlo 7, caracteri-zada por a referida proteína compreender soro albumina de bovino. Substância de acordo com a reivindicado 7, caracteri-zada por a referida proteína compreender soro albumina humano. Si. -
101.-- Substância ds acordo com a reivindicado 7. caractsri-zada por a referida proteína compreender fibronsciina ds bov i no. 111."" Substância ds acordo com a reivindicação 7, caracieri-zada por a referida proteína conter fibronsciina humana.
121.- Substância ds acordo com a rsivindicaclo 1, caracieri-zada por compreender também um reagente de reticulado bifuncional que une o referido inibidor de iromfoogénese á referida camada de revestimento de base. 131.-" Substância de acordo com a reivindicado 1£; caracteri-zada por o referido reagente de reticulado bifuneional ser hsterobifuneional.
141.-- Substância de acordo com a reivindicado 12, caracteri™ rada por o referido reagente ds reticulado bi funcional ser homobi func iona1.
151.- Substância de acordo com a reivindicado 12, caracteri-zada por o referido reagente de reticulado hetsro-bifuncional compreender SPDP. 161. ~ Processo para a preparado de uma substância biocompa™ tível s tromboresistente, caracterizado por compreender as fases dei 31 (a) adesão de pelo menos uma camada de revestimento de base a pelo menos uma superfície de um material sintético e biocompativel, camadas de revestimento de base esta que contem um componente capas de unir um inibidor de trombogénese; e <b> imobilização do referido inibidor de trombogénese na referida camada de revestimento de ba.se,- sendo o referido inibidor hirudin ou um análogo activo ou um seu fragmento, tendo o referido inibidor de trombogénese actividade inibidor® quando imobilizado .
171,- Processo de acordo com a reivindicação i6, carac--· tsrizado por a referida fase de ades-So compreender! <a> a activação do referido material para aumentar a união da referida camada de revestimento de base ao material; e <b> o contacto do referido material aciivado com a referida camada de revestimento de base durante um período de tempo suficiente para permitir que o referido componente da referida camada de revesti..... mento se una com o referido material activado.
181.-- Processo de acordo com a reivindicaçio IS, carac-tev'izado por a referida fase de adeslo compreender a adesão de uma camada de revestimento de base a pelo menos uma superfície do referido material, contendo s referida camada de revestimento de base um componente 32

ν escolhido no grupo constituído por uma proteína, psptídso, 1ipoproteína, glicoprotsína, hitírogel, g 1 i c osam i nog 1 i. c ano, po I í mero s 1 n té t i c o e suas m i s tur as. 13§.~ Processo de acordo com a reivindicação Í8, carácter isado por a referida fase de adesão compreender também a adesão de uma camada de revestimento de base que contem uma proteína· a pelo menos uma superfície do referido material. 20i.~ Processo de acordo com a reivindicado 13, carácter izado por a referida fase de adesão compreender também a adesão de uma camada de revestimento de base a pelo menos uma superfície do referido material, contendo a referida camada de revestimento de base uma proteína escolhida no grupo constituído por soro albumina, íibronectina e suas misturas. 2iâ.™ Processo de acordo com a reivindicado 20, carac- tsrisado por a referida fase de adesão compreender também a adesão de uma camada de revestimento de base que contem soro albumina e pelo menos uma superfície do r e f e r i do ma te r i a 1. 22â.-~ Processo de acordo com a reivindicação 20, carac-terisado por a referida fase de adesão compreender a adesão de uma camada de revestimento de base que contem soro albumina bovino a pelo menos uma superfície do referido material.

23s.~ Processo de acordo com a reivindicação 20, csrac-terizado por a referida fase ds adesão compreender também a adesão de uma camada de revestimento de base que contem fiforoneciina humana a pelo menos uma superfície do referido material. 24ã.~ Processo de acordo com a reivindicação 20, carac-terizado por a referida fase de adesão compreender também a adesão de uma camada de revestimento de base que contém íibronectina de bovino s pelo menos uma superfície do referido material. 25i.~ Processo de acordo com a reivindicação 17, carac-terizado por a referida fase de activação compreender as fases de! (a) tratamento do referido material com uma solução que torna disponível para união pelo menos um grupo quimicamente reagente no referido material] e <b> contacto do referido material tratado com uma solução que contem um reagente de reticulado bifuncional durante um período de tempo suficiente para permitir a união do referido grupo quimicamente reagente ao referido reagente. 2&ê.- Processo de acordo com a reivindicação 25, carac-terizado por a referida fase de tratamento compreender também o tratamento do referido material com uma solução que torna disponível para união pelo menos um 34 < , V ·' grupo quimicamente ací-ivo no referido material; sendo o referido grupo quimicamente activo um grupo ácido carboxi1i co. 271. ~ Processo de acordo com a reivindi cãição 16, carsc-terizado por compreender também a fase preliminar de contacto do referido material com uma solução que separa dele as impurezas, sendo a referida fase preliminar efectuada antes da referida fase de adesão.
281.- Processo de acordo com a reivindicação ÍS, carácter isado por a referida fase de imobilização compreender também as fases de! (a) contacto cio referido inibidor de trombogênese com pelo menos uma molécula de um reagente de reiicuis-ção bifuncional durante um período de tempo suficiente para. permitir a união do referido reagente ao referido inibidor de trombogênese; e <b) união do referido reagente ligado ao inibidor de trombogênese com o referido revestimento de base, tendo o referido inibidor de trombogênese ligado uma aciividade inibidora de trombogênese. 23i.™ Processo de acordo com a reivindicação 28, carac-terizado por a referida fase de contacto compreender também o contacto do referido revestimento de base com pelo menos uma molécula do referido reagente de reti cuia. cão bifuncional durante um período de tempo 35

suficiente para permitir a ligação do referido agente ao referido revestimento de base, e a referida fase de união incluir também a união do referido reagente ligado ao inibidor de trombogénese com o referido reagente ligado ao revestimento de base. 30Μ.™ Processo de acordo com a reivindicação 28, carác ter izado por a referida fase de contacto incluir também o contacto o referido inibidor de trombogénese com pelo menos uma molécula do referido reagente de reticulado bifuncional escolhido no grupo constituído por reagentes de reiicuiação heterofoifuneionais, reagentes de reiiculação homobifuneionais, e suas misturas. 3iâ.- Processo de acordo com a reivindieação 29, carác ter izado por a referida fase de contacto incluir também o contacto do referido inibidor de trombogénese com pelo menos uma molécula do referido reagente de reticulado bifuncional escolhido no grupo constituído por reagentes de reiicuiação heterofoifuneionais, reagentes de reiicuiação homobifuneionais, e suas misturas. 32§.~ Processo de acordo com a reivindicação 31, carácter izado por compreender também as fases dsí (a) redução do referido reagente de reticulaçlo ligado ao revestimento de base para expor nele um grupo sulfidrilo; (b) adição do referido reagente ligado ao inibidor ao grupo su1f idr i1o ne1e expôsto; e "V

36 (c > induzir uma rsacção de substituição em torno do referido grupo sulfidrilc s do referido reagente ligado ao inibidor, reacçfo esta que termina em ligação do referido revestimento de base ao referido inibidor. 3Sã.- Processo de acordo com a reivíndicação 30, carac- ter izado por a referida í ase de contac io incluir o contacto do referido inibidor de trombogénese com o reagente de rsticulação heierobifuneional, 8PDP. 34§.- Processo de acordo com a reivindicação 31, carac- teri zado por a referida fase de contac io incluir o contacto do referido inibidor de trombogénese com o reagente de reticulação heterobifuneional, SPDP. 35§.- Processo de acordo com a reivindicação 28, carac-ierizado por compreender também a fase adicionai de sujeitar o referido reagente ligado a iromfoogénese a um procedimento cromatogrâfico para separar dela as impurezas, sendo a referida fase adicionai efeciuada depois da referida fase de contacto s antes da referida f as© de uni ao. 3S§.~ Processo para a preparação de uma substância bicompa-tivai © iromboresistente, caracterizado por compreender as fases dei #

V.-.' Ca) imobilização de um inibidor ds trombogénese numa camada ds revestimento de base, sendo o referido inibidor hirudin ou um análogo aciivo ou fragmento deste, que tem aciividade inibidor® de trombogénese quando imobilizado, e contendo a referida camada ds revestimento de base um componente capaz de unir o referido inibidor de trombogénese; e (b) adesiío da referida camada de revestimento de base ligada ao inibidor de trombogénese a pelo menos uma superfície de um material sintético g3e biocomp®-iível. Pede a V.Exa., se digne conceder-lhe a. respectiva patente de invenção Lisboa, 2 de Agosto de 1989

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