JPH02147067A - ヒルジン被覆生物相容性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の技術的分野は人工血管材料であり、更に特定す
るに生物相容性血栓抵抗物質とその製造方法に関する。

人工表面材への血液の暴露は通常、内因性凝固系の賦活
に伴う付着性血小板層の沈着に至り、最終的には血栓形
成に至る。事実、血液−材料間の有意な相互作用がプロ
テーゼの動脈性移植片への一回通しで生じつる０合成表
面材に始めに吸着ないし結合する種類の血液蛋白は接触
凝固に巻込まれる蛋白を含みつる。接触凝固又は凝固の
外因的経路は、線維素形酸、血小板ないし補体の賦活、
走化性、キニンの発生および血栓溶解成分の賦活を含む
生化学的出来事の複雑な経路である。

加えて、斯かる出来事の各々はしばしば、正又は負のフ
ィードバックループにより制御される後続の生化学的経
路を増大する。斯（して、人工血管ないし器官並びに心
肺バイパスおよび血液透析の如き内部プロテーゼないし
体外装置を開発し使用する際、人工材料との接触によっ
て誘発される血栓症は大きな障害である。

種々の血栓抵抗度を有する材料が、血管プロテーゼに限
られた成功度を以て用いられてきた。

斯かる材料に腐食性（自己清浄性）金属、合成重合体例
えばポリジメチルシロキサン、テフロン、アクリレート
およびメタクリレート例えばダクロン、エレクトレット
、アニオン共重合体並びにヒドロゲルが含まれる［参考
文献の例　Ｓａｌｚｍａｎｎ等（１９８７）のＨｅｍｏ
ｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：　Ｂａ
５ｉｃＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａ
ｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ｃｏ１ｍａｎ等編集）、ペンシ
ルバニア州フィラデルフィア所在のＪ、　Ｂ、　Ｌｉｐ
ｐｉｎｃｏｔｔ社発行、第１３３５頁〜１３４７頁］ 斯かる人工材料との長期接触で血栓症の起きる可能性を
軽減するために、患者は、組織投与される坑凝結薬、抗
血小板および血栓溶解剤で処理されてきた。このような
薬剤には、プロスタシフリンシンセターゼに影響せずに
トロンボキサンシンセターゼを選択的に阻止し、血小板
付着並びに凝集および解放に影響し、血管ＰＧＩ２製造
を高め且つ（或は）トロンビン−およびトロンボキサン
媒介血小板凝集を阻止する化合物すべてが含まれる。斯
かる化合物としてアスピリン、スルフィンピラゾン、ジ
ビリダモル、チクロピジンおよびスロクチジルが挙げら
れる。しかしながら、これらの薬剤による治療はしばし
ば、望まれない副作用を誘引する０例えば、組織出血が
あったり、人体のどこか他の部位で所望凝固を開始完結
させ得なくなったりする。

人工材料を血栓抵抗に関し改良すべく、該材料に血栓溶
解性、抗凝固性、血栓形成阻止能および（又は）血小板
阻止能を有する生物学的に活性な分子を結合させてきた
。例えば、人工表面材にヘパリンを結合させて、内因性
凝固系の種々の阻止剤を賦活することにより凝固を軽減
させてきた（Ｓａｌｚｍａｎｎ等（１９８７）のＨｅｍ
ｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：　Ｂａ
５ｉｃ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃ
ａｌＰｒａｃｔｉｃｅ、第２版、（ｃｏ１ｍａｎ等編集
）、ペンシルバニア州フィラデルフィア所在のＬｉｐｐ
ｉｎｃｏｔｔ社発行、第１３３５頁〜１３４７頁参照］
。しかしながら、ヘパリンはＡＤＰ若しくはコラーゲン
の如き刺激に対する血小板応答を高め、合成表面材に対
し不利な悪い二つの主な血液応答すなわち血小板の付着
および凝集を促進する。加えて、表面材結合ヘパリン／
抗トロンビン複合物は血小板に対し受動的であるが、そ
れが内皮細胞増殖因子、平滑筋増殖の阻止およびリポ蛋
白リパーゼの賦活との相互作用に及ぼすさまざまな影響
はそれが時間の経過に伴いどんな悪影響を誘発しうるか
に関する問題を提起する。

また、ＰＧＥ、、ＰＧＩＩ　　（実験用のみ）、環式Ａ
ＭＰおよびアスピリンの如き抗血小板剤も固体重合体表
面材に加えられてきた。これらの剤は、血管移植片付近
で悪い修復応答を刺激する血小板因子の解放をとどまら
せる。核剤はまた、血小板の付着を阻止することによっ
て血小板により助成される血栓形成を軽減しうる。

多くの人工表面材は血管接触前アルブミンに暴露される
と、血小板との反応性が低められる（Ｎ　Ｉ　Ｈ公報第
８５−２１８５号、１９８５年９月、第１９頁〜６３頁
）。それ故、心肺バイパス外科前体外表面材を被覆する
のにアルブミンが用いられてきた。しかしながら、この
方法によって長期血栓抵抗は達成されていない。

にｕｓｓｅｒｏｗ等は、人工表面材に血栓溶解活性スト
レプトキナーゼおよびウロキナーゼを単独又はヘパリン
との混合で加えている［Ｔｒａｎｓ、　Ａｍ。

Ｓｏｃ、　Ａｒｔｉｆ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｏｒｇａｎ
ｓ　（１９７１）　１７：１　］、これらの酵素は過剰
のフィブリン沈着および血栓閉塞を軽減する。しかしな
がら、該酵素が合成表面材に血栓抵抗を付与する能力に
関する長期アセスメントは定められていない。

ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ　　６８の如き表面活性剤も亦人工
表面材に固定されてきたが、核剤が長期の血液相容性を
提示しているとは思えない［５ａｌｙｅｒ等（１９７１
）のＭｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　
ＰｌａｓｔｉｃｓＢｉｏｍｅｄ、　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ
　Ｒｅｓ、　Ｓｙｍ、　（Ｇｒｅｇｏｒ編集）、第１号
、第１０５頁］。

それ故、必要とされているのは、長期血栓抵抗性であり
且つ活性成分が有害な副作用を惹起しない、より良好な
生物相容性物質である。

本発明の一つの目的は、体液と接触する移植可能ないし
体外の装置に有用な合成生物相容性血栓抵抗物質を提供
することである。

本発明の別の目的は、生物学的に活性な固定された血栓
形成阻止剤およびその製造方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、移植片の局在部位若しくは人
工器官−血液インタフェイスでの血小板凝集、血小板因
子の解放および血栓形成を阻止し、斯くして抗血小板物
質および抗血栓症薬剤の組織効果を排除する方法を提供
することである。

及月日υｌ鷹 血液に接触する移植性装置若しくは体外の装置の成分と
して有用な生物相容性血栓抵抗物質を提供するための材
料および方法が本明細書で開示される。

合成生物相容性材料を、これに、下塗層により血栓形成
阻止剤ヒルジン又はその活性類似物若しくは断片を、そ
の血栓形成阻止活性を危うくしないように固定させるこ
とによって血栓抵抗物質にしうることが発見された。

用語「血栓形成阻止剤」を本明細書で用いるとき、それ
は、ヒルジンの物理的および生化学的特性を有する天然
、合成若しくは組換え型の蛋白ないしその断片を記述す
るのに用いられる。

本発明により企図される合成材料は好ましくはダクロン
、ナイロン、ポリウレタン、架橋コラーゲン、ポリテト
ラフルオロエチレン、ポリグリコール酸およびこれらの
混合物の如き重設体であり、最も叶ましい重合体材料は
ダクロンである。他の合成材料も亦使用することができ
る。

合成材料の少な（とも片面に生物相容性材料の少なくと
も一つの層を付着させる。この下塗層は血栓形成阻止剤
を結合しうる成分を含有する。

斯かる下塗成分の例として蛋白、ペプチド、リポ蛋白、
グリコ蛋白、グリコサミノグリカン、ヒドロゲル、合成
重合体およびこれらの混合物が挙げられる０本発明の好
ましい具体例での下塗層には、例えば人又は牛を給源と
する血清アルブミン、フィブロネクチン又はこれらの混
合物の如き蛋白成分が含まれる。他の材料を用いて下塗
層を形成することもできる。

本発明に従い、合成材料上に、該合成材料の少な（とも
片面に付着した下塗層によって血栓形成阻止剤を固定さ
せる。下塗層は、阻止剤の生物学的活性を危うくするこ
となく血栓形成阻止剤を結合しうる成分を含有する。

本発明の典型的具体化では、合成材料を賦活した後該材
料に下塗層を付着させて、その、下塗層を結合する能力
が高められるようにする０例えば、一つの好ましい具体
化では、合成材料と、該材料の少なくとも一つの化学的
活性基（例　カルボン酸基）を二官能価架橋試薬（カル
ボジイミド）への結合に有効にする溶液とを接触させる
。

次いで、このように処理された材料と架橋カルボジイミ
ド試薬を含有する溶液とを、該試薬への化学的活性基の
結合を許容するのに十分な時間接触させる。

別の具体化では、合成材料を、既述の賦活前該材料中の
また（或は）該材料上の不純物を除去する溶液に接触さ
せることができる。

固定工程は、先ず血栓形成阻止剤と二官能価架橋試薬の
少な（とも１分子とを、該架橋試薬を阻止剤に結合させ
るのに十分な時間接触させ次いで血栓形成阻止剤−結合
試薬を下塗に結合させることにより実施しうる。結合し
た血栓形成阻止剤は試薬への結合時その血栓形成阻止活
性を保留する。斯かる固定工程に有用な二官能価架橋試
薬はヘテロ二官能価（例　Ｎ−スクシンイミジル３−（
２−ビ、リジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））
　、ホモ二官能価（例　エチレングリコールビス（スク
ニンイミジルスクシネート）　（ＥＧＳ））又は両者の
混合物でありうる。

用語「二官能価架橋試薬」を本明細書で用いるとき、そ
れは、例えば１分子又は別個の２分子上の二つの反応基
に結合しそれ故にまたそれら二つの基を結合する能力を
有する分子と定義される。もし二官能価架橋試薬が異な
るタイプの二つの基を結合するなら、それは「ヘテロ二
官能価」架橋試薬である。しかしながら、もし二官能価
架橋試薬が同類の二つの基にのみ結合するなら、それは
「ホモ二官能価」である。

結合工程前、血栓形成架橋試薬をクロマトグラフィー法
に付して混在する不純物を除去しうる。

本発明の別の具体化では、合成材料に付着される下塗は
同時に二官能価架橋試薬の少なくとも１分子に結合しう
る。この具体化で、本方法は更に、下塗結合試薬に血栓
形成阻止剤結合試薬を結合させ、それによって材料付着
下塗層に血栓形成阻止剤を結合させることを含む。

本発明の他の具体化では、結合工程前、下塗結合試薬を
還元させる。この還元によって、下塗上に試薬からのス
ルフヒドリル基が形成し、それは置換反応により阻止剤
結合二官能価架橋試薬と反応してＳ−８結合を形成し得
、それによって血栓形成阻止剤が下塗に共有結合しうる
。

本発明の更に別の具体化では、下塗を血栓形成阻止剤に
結合後合成生物相容性材料に結合させる。

以下、本発明を特定の具体例に関連して説明する。しか
しながら、本発明の精神若しくは範囲から逸脱すること
な（種々の修正、付加および削減を行ないうることは明
らかである。

児旦Ｊとｌ朋 本発明は、血管系に接触する移植性装置若しくは体外装
置に有用な生物相容性血栓抵抗物質およびその製造方法
を提供する。

本発明により提供される物質は材料表面４こ付着した生
物相宵性下塗により血栓形成阻止試薬を結合させた生物
相容性合成物質を含む。

プロテーゼの体外装置若しくは移植性装置で有用な材料
は、血液循環の過酷さに耐えるのに十分な引張強さを有
し且つ下塗が直接ないし間接的に結合しうる基を有する
生物相容性合成材料好ましくは重合体材料よりなりつる
。斯かる合成材料の例はポリテトラフルオロエチレン（
テフロン）およびダクロン、ナイロン等である。該材料
は、使用目的に適したいかなる寸法をも有しうる。例え
ば、それは、移植心臓バルブ又は血液透析若しくは心肺
バイパス外科に用いられる体外装置の一体部分であり得
、或はそれはカテーテルを被覆し血管移植片内部をライ
ニングするのに用いられるつる。

合成材料が得られるとき、それは種々の非共有結合せる
不純物で被覆され得、或は該不純物を含みつる。この不
純物は、材料に下塗を付着させるのに予め除去すること
が求められつる。例えば、商用品質ダクロン上の潤滑剤
は、不純物を解放し且つ（或は）溶解する、例えば種々
の洗浄剤、溶剤又は塩を含有する溶液をダクロンに接触
させることによって除去しうる。

表１および表２に、生物相容性血栓抵抗物質の調製方法
を厩肥する。表中ｒＤａＪは、ダクロン繊維織物よりな
る合成材料を意味し、ｒ　Ｈ３ＡＪは人血清アルブミン
を意味する。

聚−−１ Ｄａ＋ＮａＯＨ−ｉ　　　Ｄａ−ＣＯＯＨＤ　ａ　−Ｃ
ＯＯＨ＋　Ｅ　Ｄ　Ｃ→Ｄ　ａ　−Ｅ　Ｄ　ＣＤａ−Ｅ
ＤＣ＋Ｈ３Ａ→ Ｄａ−Ｈ３Ａ十尿素（ＥＤＣ副生物） Ｄａ−Ｈ８Ａ＋ＳＰＤＰ− Ｄａ−ＩＳＡ−３ＰＤＰ Ｄａ−ＩＳＡ−ＳＰＤＰ＋ＤＴＴ　− Ｄａ−ＩＳＡ−ＳＨ＋Ｐ−２ 阻止剤＋ＳＰＤＰ→阻止剤−３ＰＤＰ Ｄａ−ＩＳＡ−３Ｈ十阻止剤−３ＰＤＰ−Ｄａ−ｌ５Ａ
−３−３−＋Ｐ−２−Ｔ １−に μ Ｈ３Ａ＋ＳＰＤＰ−Ｈ３Ａ−ＳＰＤＰ Ｈ８Ａ−３ＰＤＰ＋ＤＴＴ→ Ｈ３Ａ−３Ｈ＋Ｐ−２−Ｔ 阻止剤＋ＳＰＤＰ　　−阻止剤−３ＰＤＰＩＳＡ−３Ｈ
十阻止剤−ＳＰＤＰ→ ＨＳＡ−８−３−阻止剤＋Ｐ−２−Ｔ ５）　　　Ｄａ＋ＮａＯＨ−４Ｄａ−ＣＯＯＨ６）　　
Ｄａ−ＣＯＯＨ＋ＥＤＣ−Ｄａ−ＥＤＣ７）　　ＤａＥ
ＤＣ＋Ｈ３Ａ−３−８阻止剤　→Ｄａ−Ｈ３＾−５−Ｓ
−＋ 尿素（ＥＤＣ副生物） 先ず、材料を、下塗層の結合を高めるように賦活しうる
。この賦活工程は、材料の化学的活性基数を増加させる
０例えば、カルボジイミドの如き二官能価架橋試薬が結
合しうるダクロンの反応性カルボン酸基数を増加させる
べくアルカリ性加水分解を行なうことができる。最終的
に、下塗は材料上の結合カルボジイミド基に付着する。

しかしながら、この方法は注′意しながら実施せねばな
らない、何故なら、アルカリ性加水分解はダクロンを部
分的に減成し、その結果材料繊維が摩損するからである
。

少なくとルーつの下塗層を合成材料の少なくとも片面に
付着させる。

この層は、材料に付着していようと未結合であろうと血
栓形成阻止剤の付着用成分をもたらす、斯かる成分は単
独で、合成材料よりも阻止剤により多くの結合部位を与
え、それによって結合しうる阻止剤の量が高められる。

有用な成分に蛋白、ペプチド、リポ蛋白、グリコ蛋白、
グリコサミノグリカン、合成重合体およびこれらの混合
物が含まれる。血清アルブミンおよびフィブロネクチン
の如き蛋白は、それが抗トロンボゲン形成性を有するこ
とが知られており、それ自体下塗成分として非常に望ま
しいので上記目的に特に有用である［　Ｌ３ｖ＋ａｎｎ
等（１９６５）のＴｒａｎｓ、　Ａｍ、　Ｓｏｃ、Ａｒ
ｔｉｆ。

Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｏｒｇａｎｓ、　１１：３０１；　　
Ｆａｂ等（１９７１）のＦｅｄ。

Ｐｒｏｃ、　３０：１６８８　］　、　ＨＳ　Ａ分子は
例えば結合部位として有効な６５個のアミノ基を有する
。

人工表面材への下塗の付着は共有性でありうる。ダクロ
ンに蛋白を共有結合させる方法は、架橋試薬の遊離反応
性スクシンイミドエステル基が蛋白上の第一アミノ基を
攻撃することを含む０表１の例で示される如く、下塗を
ダクロンに共有付着させるために、ダクロンを先ず０．
５　Ｎ　−Ｎ　ａＯＨで処理し、カルボジイミドとの反
応後、燐酸塩緩衝剤入り食塩水（ＰＢＳ）中Ｈ３Ａ　（
下塗）で被覆する。

次いで、血液、体液又は組織と接触する表面材の被覆と
して有用な血栓形成阻止剤を成分を介し下塗に共有付着
させる。阻止剤被覆物質が、血液と直接接触する装置で
の移植性用途に理想的である０例えば、血管に取って代
わるべ（用いられるバイパス移植片はしばしば血餅又は
トロンビンで満たされ、その結果血液流れが制限される
。阻止剤被覆物質は血餅の形成に抵抗するので、血栓症
と、それに続くバイパス移植片の阻害が予防される。同
様に、診断ないし治療目的で血管系にカテーテルを挿入
するとき、該カテーテルの外側にしばしば血餅が形成す
る。血餅はカテーテルから流動血液によって洗去され或
はカテーテルの操作により振動解放されて、塞栓症およ
び生命器官への循環阻害の可能性を高める。阻止剤被覆
物質は人工心臓バルブ、大動脈内バルーンポンプ、全心
臓又は人工心臓若しくは心臓補助装置、大静脈装置およ
び、血流と接触する任意装置に同様の益をもたらす、加
えて、阻止剤被覆装置は、腹腔的透析カテーテルおよび
皮下移植片の如き腔内装置に利益をもたらし、血栓形成
誘発炎症反応を減少させる。

斯かる用途に有用な血栓形成阻止剤としてヒルジン並び
にその活性類似物、断片、誘導体およびこれらの融合物
ないし混合物が含まれる。

ヒルジンは蛭の唾液から単離される蛋白である。第３図
にそのアミノ酸配列を示す、ヒルジンは血小板付着性を
低めることが示されている。この特徴は恐らくトロンビ
ンに対するその作用態様に帰せられる。斯かる性質は、
合成表面材が血液とインターフェイスするとき単独でヒ
ルジンを最も魅力的な抗凝固剤にする。それはまた、ト
ロンビンが蛋白分解し、線維芽細胞に対し分裂性であり
、血小板を賦活し、単核細胞ないし多形核白血球に対し
走化性を有する能力を阻止する。その上、固定されたヒ
ルジン−トロンビン複合物はトロンビン媒介走化性とい
う行動を阻止する。これは、慢性炎症が、吻合部位で効
果を示す移植片全体にわたる超酸化物および分解酵素の
多形核白血球による解放（吻合過形成に寄与）に起因し
うるので有意な行動である。

血栓形成阻止剤として少な（とも等しく有用な合成ない
し組換＾型のヒルジン類似物が多数存在する（例えば、
ＣＧＰ３９３９３　（スイス国バーゼル所在のＣ１ｂａ
　Ｇｅｉｇｙ社の組換えＤＮＡ技法による製品）、ＰＣ
Ｔ　　Ｗ０７９１００６３８、ＰＣＴ　　Ｗ００８６１
０３５１７）。

血栓形成阻止剤は二官能価架橋試薬の使用により下塗上
に直接又は間接に固定される。特に、線状分子の各末端
に異なる二つの反応基を有し、それ故地の分子上の或は
同一分子の異なる領域での異なる二つの反応基を結合し
うるヘテロ二官能価架橋試薬が二官能価架橋剤と・して
最も有用である。例えば、スルホスクニンイミジル２−
（ｍ−アシド−０−ニトロベンズアミド）エチル−１，
３−ジチオブロビオネート（５ＡＮＤ）又はＮ−スクシ
ンイミジル−６−（４−アゾイド−２゛−ニトロフェニ
ルアミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）の如き光反
応性架橋剤は、光化学カップリングにより下塗のＣ−Ｈ
結合に直接挿入しうる光反応基を有し、他の基は蛋白に
結合すべく遊離したままである。

他の有用且つ好ましい架橋試薬（例えばＳＰＤＰ）およ
びその特性は表３に見出される。表３中、各試薬に関し
リストした「ダブルエージェントナンバー」はＰｉｅｒ
ｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社（イリノイ州ロックフォード
所在）より市販されている試薬の商品名である。

及−１ 表−」−〇ＬＬＩ ＡＮＢ−ＮＯ３ ＢＰ ＾ＰＧ ＰＴＰ ＢＳ” ＭＷ ＢＳＯＣＯＥＳ ＦＤＮＢ ＩＤＳ ＭＡ ＭＰ ＭＳ ［ＩＳＰ ０Ｂ６９ ＳＳ ＳＴ ＴＢＰ ＴＢＰＡ ＴＳＳＰ ＡＤＢ ＧＳ ＮＰＡ ＳＡＢ ＡＢＩ ＢＳ ＮＨ３−ＡＳＡ ＰＮＰ−ＤＴＰ 及−」−口ＬＬＩ 人−じＬユＪＬＬＬ ＡＤＰ ＡＮＤ ＡＮＰＡＨ ＡＳＤ ＩＡＢ ＭＣＣ ＭＰＢ ＰＤＰ スル本− ＢＳＯＣＯＥＳ スル本− 〇ＳＴ スル本− ＧＳ スル本− ＢＳ ｘ スル本− ＡＤＰ スル本− ＡＮＰＡＨ スル本− ＩＡＢ スル本 ＭＣＣ スル本− ＭＰＢ ＴＲＡＵＴ’Ｓ 架橋試薬は、所望の結合部位密度が達成されるような量
で下塗に適用される。結合部位密度は、合成材料ｔｇ当
りのモル数に換算した、下塗に結合する架橋試薬の量に
して、表面全体を覆う量である。

阻止剤を下塗への結合状態におくのに、架橋試薬を先ず
、下塗および阻止剤の双方に別個にカップリングさせる
。カップリング前とカップリング後に阻止剤の反応速度
定数を比較して、該定数に及ぼすカップリングの影響を
評価する。阻止剤はカップリング後も生物活性を保持す
べきである。それ故、固定すべき阻止剤に特異な標準活
性検定を、この能力評価のための標準トロンビン溶液を
用いて実施する。

別法として、表２に示す如く、下塗の蛋白成分を、その
合成材料への付着前血栓形成阻止剤に結合させて接合体
を形成し、該接合体を合成材料に結合させる。加えて、
血栓形成阻止剤接合体は生物活性を保留し、また腎臓で
容易には浄化されないので循環における半減期を高める
剤として用いることができる。

ヒルジンのＳＰＤＰ誘導体化という特定の場合に、ヒル
ジン上の成る特定の基がＳＰＤＰに結合することにより
ヒルジンの生物活性が損なわれることがある。何故なら
、斯かる基の少な（ともいくつかは活性に必要だからで
ある。しかしながら、ヒルジン対ＳＰＤＰの反応比（モ
ル比１：４）を調節し且つ反応をほぼ生理的ｐＨで行な
うことにより、ＳＰＤＰはεアミノ基に関し幾分選択的
になる。これら条件の結果は、ヒルジンの生物活性を損
なうことなく共有結合されるヒルジン対ＳＰＤＰＩ：１
（モル：モル）接合比に有利である。

ＳＰＤＰは末端アミノ基およびεアミノ基と反応する。

末端アミノ基の誘導体化は生物活性蛋白を不活性化しう
るので、ＳＰＤＰ銹導体化の際Ｔ−ブロック（イリノイ
州ロックフォード所在のＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ
１社の製品）を用いて、その基を閉塞することができる
。次いで、誘導体化後Ｔ−ブロックを除去して生物活性
を回復する。

下記の非制限的例から本発明が一層理解されよう。

ダクロンポリエステル５２　（ＤｕＰｏｎｔ社の製品）
を１．０ｃｍの長さに細分する。織物表面上また表面内
の油剤を四塩化炭素による１時間の洗浄１回と１００％
ＣＨＩ　ＯＨによる洗浄２回によって除去する。メタノ
ールは、多数回の水洗とｐＨ７，４の燐酸塩緩衝剤入り
食塩水（ＰＢＳ）による洗浄１回とによって除去する。

次いで、移植片材料をアルカリ性加水分解に付して有効
Ｃ０ＯＨ基を増加させる。該材料を５０℃のＮ　ａ　Ｏ
Ｈ０，５Ｍにより１時間処理する。

次いで、Ｈ，Ｏにより繰返し洗浄し、下記工程を直ちに
開始する。

Ｂ、　　　ダクロンのカルボジイミド 賦活した材料を、室温で一定に撹拌しながらｐＨ４，６
〜５．０の脱イオン水中１０ｍＭの水溶性カルボジイミ
ド（ＥＤＣ）１００ｍＩ２に入れる。

材料を取出し、ＰＢＳ中で洗浄して過剰の未結合ＥＤＣ
を除去する。

Ｃ１二二豆滅 下塗をダクロン移植片材料の管腔に施す。

誘導体化ダクロン材料を、室温で一定に撹拌しながら移
植片材τ斗Ｉ　ｃｍ”当り１ｍｊ２の、ＰＢＳ中５％Ｈ
３Ａ溶液でインキュベートする。移植片を取出し、ＰＢ
Ｓ中で洗浄して非特異的に結合したＨ３Ａを除去する。

ダクロン１ｍｇ当り蛋白はぼ２０μｇが共有結合されろ
。

Ｄ、　　へのＳＰＤＰ±ム Ｈ３Ａ結合ダクロン材料を、ｐ　Ｈ７，４のＰＢＳ中１
．０　ｍ　ＭのＳＰＤＰ？ａ液でインキュベートしてＳ
ＰＤＰをＨ８Ａ　（下塗層　ｃｍ”当りＳＰＤＰ１００
μＭ）に結合する。インキュベーションは室温で３０〜
４０分後に終らせる。非特異的に結合したＳＰＤＰを除
去するために移植片をＰＢＳ中で洗浄する。

Ｅ、　　、でのＳＰＤＰの　　および　Ａ１匹皿ｌ ＳＰＤＰ結合材料を乾燥し、秤量してその絶対ｍ１を得
る。次いで、これを室温で５分間ジチオトレイトール（
ＤＴＴ）の５０ｍＭ溶液に入れる。この反応により、結
合ＳＰＤＰからピリジン−２−チオン（Ｐ−２−Ｔ）が
解放され、同時に下塗上に遊離スルフィドリル（ＳＨ）
基が形成される。解放されたＰ−２−Ｔ量を、その吸光
係数（Ｅ＝８．０８　Ｘ　１０”　）を用いた３４３ｎ
ｍでの吸光分光分析により測定するとき、それは結合Ｓ
ＰＤＰ又は結合部位の量に正比例する。結合部位の数を
算定し、ダクロンＩｇ当りの部位モル数として表わす。

次いで、材料をＰＢＳ中で５回洗浄し、ｄＨ，ｏ中で４
回洗浄する。

Ｆ、ヒルジンへのＳＰＤＰの　Ａ 親液性化ヒルジンをＰＢＳ中１　ｍ　ｇ　／　ｍ　１２
で再懸濁させる。Ｓ１’ＤＰ　にュージャージー州ビス
力タウエー所在のＰｈａｒｍａｓｉａ社の製品）を１０
０％ＥＴＯＨにｌｏｍＭまで溶解する。ヒルジン１部を
ＳＰＤＰ４部（モル：モル）と混合し、室温で３０分間
インキュベートする。次いで、ＳＰＤＰ結合ヒルジンを
遊離ＳＰＤＰおよび反応副生物からＧ−２４カラム上で
のクロマトグラフィーにより分離する。誘導体化ヒルジ
ンが先ず溶離される。

Ｇ、ヒルジンに　人したＳＰＤＰの ヒルジンへのＳＰＤＰの結合量は、ヒルジンに結合した
ＳＰＤＰからピリジン−２−チオン（Ｐ−２−Ｔ）を解
放し且つ３４３ｎｍでの吸光分光分析で測定することの
できるＤＴＴの添加により測定しうる。この測定から、
ヒルジンに結合したＳＰＤＰのモル数を算定することが
できる。

解放されたＰ−２−Ｔの各々はヒルジンへのＳＰＤＰの
共有結合−つを示す。この調査で、ＳＰＤＰ１．２モル
当りヒルジン１モルが結合している。

Ｈｏ　　への　　　　ヒルジンの　Ａ 還元ＳＰＤＰ−結合下塗（遊離ＳＨ基を有する）をＰＢ
Ｓで洗浄してＤＴＴを除去する。次いで、ＳＰＤＰ結合
ヒルジンを移植片に、ダクロン１　ｃｍ”当り５０．０
　ｍ　ｇで加える。溶液を室温で一夜インキユベートし
てダクロン移植片上のＳＨ基にＳＰＤＰ−ヒルジンを結
合させる１次いで、ヒルジンを共有固定させたダクロン
材料を洗浄し、ＰＢＳ中で貯蔵する。

１、ＬＪ！Ｉｔ Ａ、吸光分光分析検定 下塗上に固定したＳＰＤＰ−ヒルジンの量を測定するた
めに、ダクロンにＳＰＤＰ−ヒルジンを添加する時点で
吸光度を読取る。−夜インキユベートした後、更に吸光
度を読取る。吸光度の変化はＳＰＤＰ−ヒルジンから解
放されたＰ−２−Ｔの量による。Ｐ−２−Ｔの解放量は
下塗ＳＨ基とＳＰＤＰ−ヒルジンとの間で生じたＳＰＤ
Ｐ置換反応の数に正比例する。

Ｂ、トロンビン阻止検定 既知量のトロンビンと、既知量のヒルジン若しくはヒル
ジン類似物を用い、トロンビンにヒルジンを加え且つク
ロマトグラフィー基剤Ｓ−２２３８を用いて残留トロン
ビン活性を測定することにより標準曲線を作成する０次
いで、トロンビン１ｍ４２当りＮＩＨＩＯ単位を用いて
ＥＤ５０値を等しくし且つ残留トロンビン活性を測定す
ることにより、誘導体化ヒルジン（ヒルジン−３ＰＤＰ
）若しくは固定ヒルジン（ヒルジンを固定したダクロン
材料）によるトロンビン阻止を未誘導体化ヒルジンの値
と比較する。

本発明は、その精神ないし本質的特徴から逸脱すること
なく他の特定態様で具体化しうる。それ故、上記の具体
化はすべての点で例示的なものと考えられるべきで、制
限的なものと考えられるべきでない。本発明の範囲は、
上記説明よりむしろ前掲特許請求の範囲で示されるので
、該特許請求の範囲の意味および範囲に入るすべての変
更は本発明に包含される。

４、゛　　の　　な２日 第１図は、血栓形成に関連した経路の概略図である。

第２図は血栓形成における血小板包含の概略図である。

第３図は天然ヒルジンのアミノ酸配列の概略図である。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）合成生物相容性材料と、 （ｂ）該材料の少なくとも片面に付着せる少なくとも一
   つの生物相容性下塗層と、 （ｃ）該下塗層上に固定せる血栓形成阻止剤にして、ヒ
   ルジン又はその活性類似物若しくは断片である阻止剤を
   含み、しかも 前記下塗層が血栓形成阻止剤を結合しうる成分を有し、
   また前記阻止剤が、固定された時血栓形成阻止活性を有
   する、生物相容性血栓抵抗物質。 ２、材料が重合体である、特許請求の範囲第１項記載の
   物質。 ３、重合体が、ダクロン、ナイロン、ポリウレタン、架
   橋コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリテトラフルオロ
   エチレンおよびこれらの混合物よりなる群から選ばれる
   、特許請求の範囲第２項記載の物質。 ４、重合体がダクロンである、特許請求の範囲第３項記
   載の物質。 ５、下塗層が、蛋白、ペプチド、リポ蛋白、グリコ蛋白
   、グリコサミノグリカン、ヒドロゲル、合成重合体およ
   びこれらの混合物よりなる群から選ばれる成分を含む、
   特許請求の範囲第１項記載の物質。 ６、下塗層の成分が蛋白を含む、特許請求の範囲第５項
   記載の物質。 ７、蛋白が血清アルブミン、フィブロネクチンおよびこ
   れらの混合物よりなる群から選ばれる、特許請求の範囲
   第６項記載の物質。 ８、蛋白が牛血清アルブミンを含む、特許請求の範囲第
   ７項記載の物質。 ９、蛋白が人血清アルブミンを含む、特許請求の範囲第
   ７項記載の物質。 １０、蛋白が牛フィブロネクチンを含む、特許請求の範
   囲第７項記載の物質。 １１、蛋白が人フィブロネクチンを含む、特許請求の範
   囲第７項記載の物質。 １２、更に、血栓形成阻止剤を下塗層に結合させる二官
   能価架橋試薬を含む、特許請求の範囲第１項記載の物質
   。 １３、二官能価架橋試薬がヘテロ二官能価である、特許
   請求の範囲第１２項記載の物質。 １４、二官能価架橋試薬がホモ二官能価である、特許請
   求の範囲第１２項記載の物質。 １５、ヘテロ二官能価架橋試薬がＳＰＤＰを含む、特許
   請求の範囲第１３項記載の物質。 １６、生物相容性血栓抵抗物質を製造する方法であって
   、 （ａ）合成生物相容性材料の少なくとも片面に少なくと
   も一つの下塗層を付着させ、但し該下塗層は血栓形成阻
   止剤を結合しうる成分を含有するものとし、そして （ｃ）該下塗層に血栓形成阻止剤を固定させ、但し該阻
   止剤はヒルジン又はその活性類似物若しくは断片であり
   而して固定された時血栓形成阻止活性を有するものとす
   る方法。 １７、付着工程が、 （ａ）合成生物相容性材料を、該材料への下塗層の結合
   を高めるように賦活し、そして （ｂ）賦活された材料に下塗層の成分を結合させるのに
   十分な時間該材料と該下塗層とを接触させることを含む
   、特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、付着工程が、蛋白、ペプチド、リポ蛋白、グリコ
   蛋白、ヒドロゲル、グリコサミノグリカン、合成重合体
   およびこれらの混合物よりなる群から選ばれる成分を含
   有する下塗層を材料の少なくとも片面に付着させること
   を含む、特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １９、付着工程が更に、蛋白を含有する下塗層を材料の
   少なくとも片面に付着させることを含む、特許請求の範
   囲第１８項記載の方法。 ２０、付着工程が更に、血清アルブミン、フィブロネク
   チンおよびこれらの混合物よりなる群から選ばれる蛋白
   を含有する下塗層を材料の少なくとも片面に付着させる
   ことを含む、特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１、付着工程が更に、人血清アルブミンを含有する下
   塗層を材料の少なくとも片面に付着させることを含む、
   特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、付着工程が更に、牛血清アルブミンを含有する下
   塗層を材料の少なくとも片面に付着させることを含む、
   特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２３、付着工程が更に、人フィブロネクチンを含有する
   下塗層を材料の少なくとも片面に付着させることを含む
   、特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２４、付着工程が更に、牛フィブロネクチンを含有する
   下塗層を材料の少なくとも片面に付着させることを含む
   、特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２５、賦活工程が、 （ａ）材料を、該材料中の化学反応基少なくとも１個を
   結合させるのに有効にする溶液で処理し、そして （ｂ）処理された材料と二官能価架橋試薬を含有する溶
   液とを、前記化学反応基を該試薬と結合させるのに十分
   な時間接触させる工程を含む、特許請求の範囲第１７項
   記載の方法。 ２６、処理工程が更に、材料を、該材料中の、カルボン
   酸基である化学活性基少なくとも１個を結合させるのに
   有効にする溶液で処理することを含む、特許請求の範囲
   第２５項記載の方法。 ２７、更に、材料と、該材料上の不純物を除去する溶液
   とを接触させる予備工程を含み、而して該予備工程が付
   着工程前に実施される、特許請求の範囲第１６項記載の
   方法。 ２８、固定工程が更に、 （ａ）血栓形成阻止剤と二官能価架橋試薬の少なくとも
   一つの分子とを、該血栓形成阻止剤に該試薬を結合させ
   るのに十分な時間接触させ、そして （ｂ）血栓形成阻止剤結合試薬を下塗に結合させる工程
   を含み、而して結合せる血栓形成阻止剤が血栓形成阻止
   活性を有する、特許請求の範囲第１６項記載の方法。 ２９、接触工程が更に、下塗と二官能価架橋試薬の少な
   くとも一つの分子とを、該下塗に該試薬を結合させるの
   に十分な時間接触させることを含み、また結合工程が更
   に、下塗結合試薬に血栓形成阻止剤結合試薬を結合させ
   ることを含む、特許請求の範囲第２８項記載の方法。 ３０、接触工程が更に、血栓形成阻止剤と、ヘテロ二官
   能価架橋試薬、ホモ二官能価架橋試薬およびこれらの混
   合物よりなる群から選ばれる二官能価架橋試薬の少なく
   とも一つの分子とを接触させることを含む、特許請求の
   範囲第２８項記載の方法。 ３１、接触工程が、下塗と、ヘテロ二官能価架橋試薬、
   ホモ二官能価架橋試薬およびこれらの混合物よりなる群
   から選ばれる二官能価架橋試薬の少なくとも一つの分子
   とを接触させることを含む、特許請求の範囲第２９項記
   載の方法。 ３２、更に、 （ａ）下塗に結合した試薬を還元させてその上にスルフ
   ヒドリル基を暴露させ、 （ｂ）阻止剤に結合した試薬を、暴露されたスルフヒド
   リル基に加え、そして （ｃ）スルフヒドリル基と阻止剤に結合した試薬が関係
   する置換反応を誘発させて下塗を阻止剤に結合させる工
   程を含む、特許請求の範囲第３１項記載の方法。 ３３、接触工程が血栓形成阻止剤とヘテロ二官能価架橋
   試薬、ＳＰＤＰとを接触させることを含む、特許請求の
   範囲第３０項記載の方法。 ３４、接触工程が血栓形成阻止剤とヘテロ二官能価架橋
   試薬、ＳＰＤＰとを接触させることを含む、特許請求の
   範囲第３１項記載の方法。 ３５、更に、血栓形成結合試薬をクロマトグラフィー法
   に付してその中の不純物を除去する付加的工程を含み、
   而して該付加的工程を接触工程後でしかも結合工程前に
   実施する、特許請求の範囲第２８項記載の方法。 ３６、生物相容性血栓抵抗物質の製造方法にして、 （ａ）下塗層に血栓形成阻止剤を固定させ、但し該阻止
   剤はヒルジン又はその活性類似物若しくは断片であり而
   して固定された時血栓形成阻止活性を有するものとし、 また前記下塗層は血栓形成阻止剤を結合しうる成分を含
   有するものとし、そして （ｂ）血栓形成阻止剤に結合した下塗層を合成生物相容
   性材料の少なくとも片面に付着させる工程を含む方法。