PT2514750E - Tiazolil dihidropirimidinas substituídas com bromo-fenilo - Google Patents

Description

EP2S14750B1

DESCRIÇÃO

TIAZOLIL DIHIDROPIRIMIDINAS SUBSTITUÍDAS COM BROMO-FENILO CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a uma nova tiazolil dihidropirimidina substituída com bromo-fenilo, seu método de preparcLção e utilização como um medicamento, especialmente para o tratamento e prevenção de infecções de hepatite B. A invenção também diz respeito a uma composição compreendendo dihidropirimidina, outro agente anti-viral, e quando apropriado, um imunomodulador e um mediccimento compreendendo a composição, especialmente para o tratamento e prevenção de infecções do VHB, tais como infecções de hepatite B,

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 vírus da hepatite B pertence à família dos vírus hepadna. Pode causar doenças crónicas agudas e/ou persistentes ou progressivas. Muitas outras manifestações clínicas do estado patológico são também, causadas pelo vírus da hepatite B, em particular, inflamação crónica do fígado, cirrose do fígado e carcinoma hepatocelular. Além disso, a co-infecção com o vírus da hepatite delta pode ter efeitos adversos na evolução da doença. convenc interferão e a lamivudina são medicamentos :>nais aprovados para serem utilizados no tratamento de hepatite crónica. No ent actividade moderada, mas adversa. Embora a lamivudiru ito, o interferão tem apenas em uma reacção secundária tenha uma actividade boa, o desenvolvimento da resistência é rápido durante o tratamento, e os efeitos de recaída muitas vezes aparecem 1 ΕΡ2514750Β1 apc o tratamenti 5er interrompido. valor de ICdo da lamivudina (3-TC) é 300 nM (Science, 299 (2003), A patente US N° 7,074,784 divulga 6 — amidoalquildihidropirimidina e seu uso como um medicamento, especialmente para o tratamento e prevenção da infecção de hepatite B. patente US N° 7.074.784 é 3,5-difluoro-piridin-2-O composto pode inibir o É descrito no exemplo 12 da que R1 é o-cloro, Rz é p-cloro, RD ilo, X é -CH?- e Z é morfolinilo. crescimento do virus da hepatite B durante celular. 0 valor de IC50 é 2 nM (testado i cultura por eles próprios). A substituição principal no exemplo 12 é a substituição de bis-cloro com R1 (o-bromo) e Rz (p-flúor), o que resulta na IC50 do composto 9 ser 7 nM (descrito no exemplo 9 da patente). E quando os substituintes principais são transformados em R1 (o-cloro) e Rz (p-flúor), é também obtido um valor de IC50 aproximado (IC50 = 2-4 nM no exemplo 5). É indicado que o valor de IC5o não pode aumentar com a variação dos substituintes principais R1 e R2 (veja-se a tabela 1). A patente US N° 7.0/4.784 B2 também divulga um exemplo em que um resíduo difluoro substitu por tiazol-2-ilo (descrito no valor de IC50 exemplo 45 da patente) semelhante (2 nM) (veja-se O derivado o quadro 1) tem .m 2 EP2S147S0B1

Quadro 1. Exemplo 2 da patente US N° 7.074.784 B2

Exemplo R1 R2 R3 R6 IC5G (nM) 12 Cl Cl CH3 XX 2 (auto-testado) 9 Br p ch3 XX. 7 5 Cl F CH3 2-4 4 5 C1 Cl CH3 X) 2

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Descobrimos surpreendentemente que pode ser obtido um derivado com uma actividade 10 vezes mais elevada e o valor de IC50 menor do que 1 nM, através da substituição com tiazol-2-ilo, e alteração dos substituintes principais em R1 = o-bromo e Pt = p-flúor. Isto é inesperado, quando se lê a US 7.074.784 (veja-se o quadro 2).

3 EP2S147S0B1

Quadro 2. AI guns exemplos desta invenção Exemplo R1 R2 R3 R6 ic50 (nM) Referência 6 Br F ch3 0,3 5 Br F CH2CH3 U ξ z.

Num aspecto, esta invenção refere-se a um sal metanossulfonato de um composto que tem a seguinte estrutura ou um enantiômero, ou levoisómero ou um tautómero do mesmo, de

Em outro aspecto, esta invenção preparação do sal metanossulfona refere-se a um método o aqui divulgado, em que o método é caracterizado por: (a) reacção de um benzaldeído que tem a fórmula (II) com um p-c:etoéster que tem a fórmula (III) para produzir um composto benzilideno que tem a fórmula

4 0 EP2S147S0B1 (b) reacção do composto benzilideno que tem a fórmula (IV) com um sal de uma amidina que tem a fórmula (V):

EP2S147S0B1 NH

em que R1 é o-bromo, Pf é p-flúor, R3 é etilo, R° é thiazolil-2-ilo, X é metileno, e Z é morfolinil, e em que o sal é metanossulfonato.

Em outro aspecto, esta invenção refere-se a um método de preparação do sal metanossulfonato aqui divulgado, em que o método é caracterizado por reacção de um composto que tem a fórmula (III) com um aldeído que tem a fórmula (II) e um sal de um amidina que tem a fórmula (V), |f*> j _LR1 o NH I CHO (II), z— k> (III), R®. NH, (V), em que R1 é o-bromo, Rz é p-flúor, RJ é etilo, R6 é thiazolil-2-ilo, X é metileno, e Z é morfolinilo, e em que o sal é metanossulfonato.

Em outro aspecto, esta invenção refere-se a um método de preparação do metanossulfonato aqui divulgado, em que o método é caracterizado pela reacção do composto que tem a fórmula (VI) com um sal de morfolina (VII):

5 ΕΡ2514750Β1 em que Y é cloro, bromo, iodo, metilsulfonilo ou toluenosulfonilo, e R1 é o-bromo, R3 é p-flúor, R3 é etilo, e Rb é tiazolil-2-ilo, e em que o sal é metanossulfonato.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição que compreende A) o sal metanossulfonato; B) pelo menos um agente antiviral; e, quando apropriado; C) pelo menos um imunomodulador seleccionado a partir de um interferão, uin interleucina, um polipéptido, um derivado de imidazoquinolina, uma imunoglobulina ou um vacina terapêutica.

Em algumas formas de realização, o componente B é um inibidor de polimerase, lamivudina ou um composto de fenilpropenamida que tem a seguinte fórmula:

ou um sal do mesmo, em que cada de R e Rz é independentemente Ci_4 alquilo ou, juntamente com o átomo de azoto em que estão localizados, formam um anel que tem de 5 a 6 átomos de anel que compreendem carbono e/ou oxigénio; cada um de RJ a R12 é independentemente hidrogénio, halogénio, Ci_4 alquilo, Ci_4 alcoxi opcionalmente substituído, nitro, ciano ou trifluorometilo; e X é halogénio ou Ci_4 alquilo opcionalmente substituído.

Em certas formas de realização, o componente B aqui divulgado é o composto fenilpropenamida que tem a seguinte estrutura: 6 ΕΡ2514750Β1

Em. ou tro aspecto, a invenção refere-se a um medicamento que compreende o composto ou pelo menos uma composição aqui divulgada e um ou mais age ntes farmacêuticos activos. realizaçao, o medicamento rmaceuticamente aceitável·

Sm outras formas de compreende ainda um portador f

Sm outro aspecto, a invenção refere-se ao sal rnetanossulf onato ou a composição aqui divulgada para utilização no tratamento e prevenção de uma doença seleccionada a partir de doença virai, infecção Por hepatite B, ou uma doença causada pela infecção por hepatite B.

Em algumas formas de realização, a doença é uma doença causada pela infecção por hepatite B seleccionada a partir de hepatite, cirrose, ou carcinoma hepatocelular.

Esta invenção também se refere a um enantiómero do mesmos. ^ ecido, e é mistura de composto aqui divulgado e urna mistura dos racemato pode ser separado por um método con fundamentalmente um componente homogéneo numa estereoisómero. o um sa composto da invenção pode também estar na forma de de preferência um sal fisioloaicamente aceitável. ,m sal de um 0 sal fisiologicamente aceitável pode ser 7 EP2S147S0B1 acido inorgânico ou uri sal de ácido org"anico. De preferência é um sal de um ácido inorgânico, tal como cioreto, brometo, fosfato ou sulfato, etc, ou um carboxilato ou um sulfonato, tal como acetato, maleato, fumarato, malato, citrato, tartarato, lactato, benzoato ou metanosulfonato, etanosulfonato, benzenosulfonato, toluenosu1fonato ou naftalenodisulfonato, etc. 0 sal fisiologicamente aceitável pode também ser um sal de metal ou um sal de amónio do composto da invenção. Num exemplo preferido, é um sal de sódio, sal de potássio, sal de magnésio ou sal de cálcio, e um sal de amónio produzido por amónia ou uma amina orgânica tal como etilamina, dietilamina ou trietilamina, dietanolamina ou trietanolamina, diciclohexilamina, álcool de dimetilaminoetilo, arginina, lisina, etilenodiamina ou 2-feniletilamina, etc. 0 composto (I) da seguintes métodos: nvençao pode se preparado pelos [A] em primeiro lugar, , um benzaldeido c0m a fórmula (II) reage com ui ER ! 3- cetoéster com a ) -órmuIa (111), com ou sem a adiç ão de , -i τ η ' Ύτ. "i τ U itl ci t.- 1d 0 ψ um metal aicalmo e quando apropr: iado, na presença de um solvente orgânico inerte, para produzir um composto de benzilideno com a fórmula (IV):

8 EP2S147S0B1 em que R1, R2, R2, X e Z são como aqui definidos, e em seguida, o composto de benzilideno reage com uma amidina com a fórmula (V) ou um sal da mesma (tal como hidrocloreto ou acetato), com ou sem a adição de um metal alcalino ou um ácido, e quando apropriado, na presença de um solvente orgânico inerte:

em que Pd é como aqui definido, ou [B] o (3-cetoéster com a fórmula (III) reage com o benzaldeido com a fórmula (II) e a amidina com a fórmula (V), ou um sal da mesma (tal como hidrocloreto ou acetato), com ou sem a adição de um metal alcalino ou um ácido, e quando apropriado, na presença de um solvente orgânico inerte, numa etapa, ou [C] se X na fórmula (I) é metileno, um composto com a fórmula (VI) reage com morfolino com a fórmula (VII), com ou sem a adição de um metal alcalino, e quando apropriado, na presença de um solvente orgânico inerte,

im em que Rh, R.2, R2 e Rb são como aqui definidos, e Y é 9 EP2S147S0B1 substituinte nucleofilico, tal como cloro, bromo, iodo, metilsulfonilo ou toluenosulfonilo. 0 composto com a fórmula (VI) pode ser preparado, por exemplo, reagindo um composto com a fórmula (VIII)

(VIII) R2, r. 3 R sao como aqui aermidos, com um bromação, tal como N-bromosuccinimida, de numa solução orgânica inerte, para produzir um em que R , agente de preferêncic composto com a fórmula (IX) :

(IX) reaamdo o composto com um dir rnem ou depois do substituinte nucleofilico, composto ser ainda ma is Λ'Ί- ;P) convertido, de acordo com um método convencional como descrito na literatura, com o morfolino com a fórmula (VII). A fim de preparar o c o rapo sto da invença o com a fórmula (I), em que X é metileno e Z é morfolinilo, um cloroacetato com a fórmula (XI) reage com morfolino (VII) , para produzir o carboxilato de (3-ceto com a fórmula (Iil) f 10 ΕΡ2514750Β1

benz

Como material de partida, .Ideido (II) encontra-se comerc o 2-bromo~4-fluo.ro-mente disponível.

Como material de partida, o carboxilato de (3-ceto (III) é bem conhecido, ou pode ser preparado por métodos conhecidos publicados na literatura [por exemplo, D. Borrmann, "Umsetzung von Diketen mit Alkoholen, Phenolen und Mercaptanen", em "Methoden der organischen Chemie" (Houben-Weyl), vol. VII/4, 230 ff (1968); Y. Oikawa, K. Sugano e 0. Yonemitsu, J. Org. Chem. 43, 2087 (1978)]. acordo com as é conhecido e pode descrições em WO-A-99/54326 ser preparado de e WO-A-99/54329. 0 morfolino disponível. (VII) encontra-se 3me rcialmente 0 composto (VIU) pode ser preparado de acordo com a ipa [A] ou [B] descritas em WO-A-99/54326.

Todos os solventes orgânicos inertes são adequados para utilização nas etapas A, B, e C. 0 solvente orgânico inerte é de preferência um álcool tal como metanol, etanol e álcool isopropíiico, um éter tal como dioxano, éter dietílico, tetrahidrofurano, éter de etileno glicol monometílico, éter de etileno glicol dirnetílico, um ácido carboxílico tal como ácido acético, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, acetonitrilo, piridina ou triamida he x amet i 1 f o s f ó r i c a . 11 ΕΡ251475061 A temperatura da reacção pode variar dentro de uma gama bastante ampla. Geralmente a temperatura está entre 20°C e 150°C. De preferência, a temperatura é a temperatura de ebulição do solvente seleccionado. A reacção pode ser efectuada sob a pressão atmosférica ou sob uma pressão elevada. Geralmente é realizada à pressão atmosférica. A reacção pode ser realizada com ou sem um ácido ou um metal alcalino. É preferível efectuar a reacção na presença de um ácido fraco, tal como ácido acético, ácido fórmico ou semelhantes.

Uma realização da invenção refere-se a. uma composição compreendendo A) a dihidropirimidina reivindicada, e B) pelo menos um dos outros agentes anti-virais diferentes de A) .

Uma certa realização da invenção refere-se a uma composição compreendendo A) a dihidropirimidina mencionada acima, B) um inibidor da polimerase de VHB, e quando apropriado, C) um imunomodulador.

De preferência, o imunomodulador C) é seleccionado de, por exemplo, todos os interferões, tais como interferão-a, interf eráo~(3 e interf erão -Yr especialmente interfer ão-a- 2a e interferão-a-2b, uma interleucina tal como interleucina- 2, um polipépt ido tal como timosina-a-1, e um timoctonano, um derivado de imidazoquinolina tal como levamisol, uma imunoglobulina e uma vacina terapêutica.

Deste modo , esta invenção refere-se também a uma isição para o tratamento e p revenção de infecções por e da sua utilização para o tratamento de doen iças 12 ΕΡ2514750Β1 induzidas pelo VHB. 0 uso das combinações da invenção proporciona vantagens importantes para o tratamento de doenças induzidas pelo VHB, em comparação com a monoterapia dos compostos individuais, ou seja, principalmente uma activida.de sinérgica anti-viral, mas também uma boa tolerância das combinações da invenção em Tox-50 (a gama de toxicidade em que 50% das células sobrevivem).

As substâncias referidas como inibidores da polimerase do VHB B) para os fins da invenção são aquelas que, no ensaio de polimerase endógena, que foi publicado por Ph. A. Furman et al. , em Antimicrobial Agents and Chemotherapy,

Vol. 3 6 (No. 12 !), 2688 (1992) e que é descritc a seguir, conduzem a uma inibição da formação de uma cade ia dupla de ADN oí r\ v>4- VHB, d< s modo a resultar num máximo de 50% da actividade do valor zero.

Os inibidores da polimerase do VHB B) para utilização na invenção são as substâncias divulgadas na experiência de polimerase endógena publicada em "Antimicrobial Agents and Chemotherapy", Vol. 36, (No. 12), 2688 (1992) por Ph. A. Furman, e as substâncias descritas abaixo para inibição da formação de cadeia dupla de ADN do VHB, resultando assim no >ara ser zero. valor máximo de actividade de 5(

Os viriões do VHB dos sobrenadan da iltura incorporam o nucleosídeo 5’-trifosfatos, na cadeia positiva do ADN do VHB, in vitro. Utilizando electroforese em gel de agarose observa-se a. incorporação de [a-32P] -desoxinucleosídeo 5'-trifosfato no produto de ADN virai de 3,2 kb, na presença e na ausência de uma substancia tendo potencialmente propriedades de inibição da polimerase do VHB. Os viriões do VHB são obtidos do sobrenadante da 13 ΕΡ2514750Β1 cultura celular de células HepG2.2.15 por precipitação com polietilenoglicol, e são concentrados. É misturada uma parte por volume do sobrenadante clarificado da cultura celular, com 1/4 por volume de uma solução aquosa contendo 50% em peso de polietileno glicol 8000 e 0,6 M de cloreto de sódio. Os viriões são sedimentados por centrifugação a 2500x g/15 minutos. Os sedimentos são ressuspendidos em 2 ml de tampão contendo 0,05 M de tris-HCl (pH 7,5), e dialisados contra o mesmo tampão contendo 100 mM de cloreto de potássio . As amostras podem ser congeladas a - 8 0 O O Cada mistur a de reacção (100 μΐ) c ontém pelo menos 10 5 viriões do VHB, 5 0 mM de L* £ i S — H C"* J_ (pH 7, 5), 300 mM (1θ cloreto de potássio, 50 mM de cloreto de magnésio, 0,1% de Nonident® P--4 0 (detergente não iónico da Boehringer Marinheim) , 10 μΜ de dATP, 10 μΜ de dGTP, 10 uM de dTTP, 10 pCi de ["2P ] dCTP (3000 Ci/mmol, concentração final de 33 nM) e 1 μΜ do inibidor de polimerase potencial na sua forma trifosforilizado. As amostras são incubadas a 37 °C durante uma hora, e em seguida a reacção é parada pela adição de 50 mM de EDTA. É adicionada uma solução de SDS a 10% em peso/volume (contendo 10 g de SDS por 90 ml de água) para uma concentração final de 1% por volume (com base no volume total), e é adicionada proteinase K para uma concentração final de 1 mg/ml. Após incubação a 37 °C durante uma hora, as amostras são extraídas com o mesmo volume de fenol/clorofórmio/álcool isoamilico (razão de 25:24:1 por volume), e o ADN é precipitado da fase aquosa com etanoi. O sedimento de ADN é ressuspendido em 10 μΐ de tampão de gel (solução de 10,8 g de tris, 5,5 g de ácido bórico e 0,75 g de EDTA em 1 litro de água (= tampão ΤΒΞ) ) e separado por electroforese em gel de agarose. Ou o gel é seco, ou os ácidos nucleicos presentes no mesmo são transferidos pela técnica de transferência de Southern para uma membrana. A quantidade de cadeia dupla de ADN marcada formada é então determinada em relação ao controlo negativo (= reacção de 14 EP2S147S0B1 endo-poi sem substanciei ou com a substância de controlo inactiva). Um inibidor da polimerase do VHB está presente se um máximo de 50% da actividade do controlo negativo está presente.

Inibidores da polimerase do VHB B) preferidos incluem por exemplo, 3tc = lamivudina = 4-amino-l-[(2R-cis) -2-(hidroximetilo)-1,3-oxatiolano-5-ilo]-pirimidina-2 (1H)-ona, cf. EP-B 382 526 (= patente US N° 5.047.407) e WO 91/11186 (= patente US N° 5.204.466), adefovir dipivoxil = 9-{2~[[bis [ (pivaloiloxi)-metoxi]-fosfinilo]-metoxi]-etilo}-a-denina, cf. EP-B 481 214 (= patentes US NuS 5.663.159 e 5.792.756), patentes US Nos 4.724.233 e 4.808.716, BMS 200475 - [IS- (1-CC, 3-CC, 4 -- (3) ]-2-amino-1, 9- dihidro-9-[4-hidroxi-3-(hidroximetilo)-2-metileno- ciclopent ilo ] -6H-purina-6-ona, cf. EP-B 481 754 ( = patentes US Nos 5.206.244 e 5.340.816.), WO 98/09964 e 99/41275, abacavir = (-) - (lS-cis)-4-[2--amino~6- (c i c 1 op r ορ i 1 arai η o) - 9 H - purina-9-i.lo] -2- emeno-i- metanol, cf. EP-B 349 242 (= patente US N° 5.049.671) e EP-B 434 450 (= patente US N° 5.034.394) , FTC = (2R-cis)-4- amino-5-fluoro-1- [2- (hidroximetilo) -1, 3--oxatiolano-5-ilo] -

pirimidina- -2 (1H)— ona, cf. WO 92/ 14743 (= patentes US 5.204.466, 5.210.085, 5.539.116, 5.700.937, 5.728.5 7 5 5.814.639, 5.827.727, 5.852.027, 5.892.025, 5.914.3 31 5.914.400) eWO 92/18517, P-L-FDDC - 5- (6-amino-2-fluoro- 9H purina-9-ilo)- tetrahidro-2-furanometanol, cf. WO 94/27616 (= patentes US Nos 5.627.160, 5.561.120, 5.631.239 e 5.830.881), L-FMAU = 1- (2-desoxi-2-f luoro-β-Ι,- arabinofuranosilo) -5-metilo- pirimidina-2,4 (1H, 3H)- di WO 99/05157, WO 99/0515Í patente US Ν' 753.78!

Outros compreendem agentes anti—virais VHB B) preferidos por exemplo, as fenilpropenamidas com a 15 EP2S147S0B1 seguinte f 6 rmu 1 a :

em que Ri e Pi são, cada um independentemente, a .lc era coniunto qua.

Ci- tão :om o atomo ae azoto no localizados, formam um anel com 5 a 6 átomos no anel, que compreendem carbono e/ou oxigénio, RJ a R1^ são cada um independentemente hidrogénio, halogénio, alquilo Cl-4, opcionalmente substituído, alcoxi Cl-4, nitro, ciano ou trifluorometilo, e R13 é hidrogénio, alquilo Cl-4, acilo ou aralqu ilo Ci-7, e X é halogénio ou opcionalmente substituído alquilo Cl-4,

As fenilpropenamidas e os seus métodos de preparação são divulgados em WO 98/33501, e são aqui referidos para publicação, AT-61 é o composto

compreendem por exemplo, todos os interferões, tais como interferões -a, -!3 e -y, em particular também interferões -a-2a e -a-2b, interleucinas tal como interleucina-2, polipéptidos tais como astimosina-oí-1 e timoctonano, derivados da linha imidazoquino tal como Levamisole®, imunoglobulinas e vacinas terapêuticas. 16 ΕΡ251475061

Descrição dos testes Ά dcçao antx virai dos compostos da invenção sobre o vírus da hepatite B é investigada por métodos baseados nos descritos por Μ. A. Sells et al. , Proc. Natl. Acad. Sei., 84, 1005-1009 (1987) e B. E. Korba et al., Antiviral Research 19, 55-70 (19921

Os ensaios anti-virais são realizados em placas de micro-titulaçao de 96 poços. A primeira fila vertical da placa recebe apenas meio de crescimento e células

HepG2.2.15. Serve como controlo do vírus.

As soluções stock dos compostos em teste (50 mM) são inicialmente dissolvidas em. DMSO, e outras diluições são preparadas no meio Cie crescimento de HepG2.2.15. Os compostos de acordo com a invenção são geralmente pipetados com uma concentração de teste de 100 (IM (Ia concentração de teste), em cada caso na segunda linha vertical de teste da placa de micro-titulação, e em seguida diluídos 210 vezes em etapas duplas em meio de crescimento com 2% era peso de soro fetal de vitelo (volume 25 (Π) »

Cada poço da placa de micro-titulação contem enta (il da suspensão de células HepG2.2.15 (5 x células./ nu) 5% de C02 em meio de crescimento com 2% em peso de soro recol ae vitelo. A mistura, de ensaio é incubada a (v/v) durante 4 dias. O sobrenadante é então aspirado e descartaao, e os poços recebem 225 (II de meio de crescimenL° tecent^meni_e preparado. Os compostos de acordo com a invenção s.*^ adicionados de novo como uma solução 10 vezes conce/l/-ada num volume de 25 (II. As misturas são incucadas ^^.rantv. mais 4 dias. 17 ΕΡ251475061

Antes de recolher os sobrenadantes rara deterei n„

' —-uxiicl Jl O efeito anti-viral, as células HepG2.2.15 são examii adas microscópio de luz ou >or meio de métodos de deteccã'· bioquímicos (por exemplo corante AIamar Blue ou Trypan Blue) para alterações citotóxicas. ça.( corante 0 sobrenadante e/ou as células são então recolhidos ω sugados por meio de um vácuo, para câmaras dot-blot de 96 poços cobertas com uma membrana de nylon (de acordo com os dados do fabricante).

Determinação da citotoxicidade São detectadas alterações citotóxicas ou citoestáticas induzidas pela substância nas células HepG2.2.15, por exemplo sob o microscópio de luz, como alterações na morfologia celular. Tais alterações induzidas pela substância nas células HepG2.2.15 em comparação com células não tratadas são visíveis, por exemplo como citólise, vac uizacao morfologia lelular alt'

Uma :itotoxicidade de 50% (Tox.-5( significa que 50% das células mostram uma morfologia comparável ao controlo de célula correspondente. Ά tolerabilidade de alguns dos compostos de acordo com a invenção é adicionalmente testada noutras células hospedeiras, tais como por exemplo, células HeLa, células primárias humanas de sangue periférico, ou linhas de células transformadas tais como células H-9. Não sao detectávers alterações citotóxicas a concentrações > 10 (IM dos compostos da invenção. 18 EP25147S0B1

Determinação da acção anti-viral EP25147S0B1 tj

Depois dos isferidos par sobrenadantes ou células risadas serem a membrana de nylon do aparelho blot (ver acima) , os sobrenadamtes intra- ou extraceiulares d£LS células HepG2.2.15 são desnaturados (1,5 M NaCl/0,5 N NaOH) , neutralizados (3 M NaCl/0,5 M Tris HC1, pH 7,5) e lavados (2 x SSC) . 0 ADN é então cozido na membrana por incubação dos filtros a 120 °C durante 2-4 noras.

Hibridação de ADN das células HepG2.2.15 é geralmente realizada com hepatite B marcadas com cada uma das quais está A detecção do ADN virai tratadas nos filtros de nylon, sondas de ADN especificas da digoxigenina, não radioactivas, para a marcada com digoxigenina, purificadas e utilizac hibridação de acordo com informação do fabricante A pré-hibridação e hibridação são realizadas em 5 x SSC, 1 x reagente de bloqueio, 0,1% em peso de N-lauroilsarcosina, 0,02% em peso de SDS e 100 (ig de ADN de esperma de arenque. A pré-hibridação é realizada a 60 °C durante 30 minutos, e a hibridização específica é realizada com 20 cl 40 ng/ml de ADN desnaturado específico do VHB, marcado com digoxigenina (14 horas, então lavados. 60 °r\

Os filtros sí

Detecção do ADN-VHB por anticorpos de digoxigenina A detecção imunológica do ADN marcado com digoxigenina foi feita de acordo com a informação do fabricante:

Os filtros foram lavados e pré-hibridados num reagente de bloqueio (de acordo com a informação do fabricante). A 19 EP2S147S0B1 hibridação foi então efectuada com um anticorpo anti-DIG acoplado a fosfatase alcalina, durante 30 minutos, Após um passo de lavagem, foi adicionado o substrato de fosfatase alcalina, CSPD, incubado com os filtros durante 5 minutos, em seguida embalado em película plástica e incubado a 37 °C durante mais 15 minutos. A quimiluminescência dos sinais do ADN especifico da hepatite B foi visualizada por exposição dos filtros a uma película de raios X (incubação dependendo da intensidade do sinal: 10 minutos a 2 horas). A Cí Dncentração inibitória semi-má: < 1 ΓΠ3 / | f·""1 V -1- b, onc ent racã 0 inibitór da •q r n \ ci «J U 0 / f 0 i deterrni nada corno a onc ent raçã 0 na qual a ioanaa espe cificaL de hep at ite B nt r 3.'" 0 -j -j extracelul ar foi re duz i· da pelo compo sto, de cor do com a invenção em 5 0 % em comp aração cor n uma amo st ra não tratada Não é esperado que o composto da invenção exiba um efeito anti-viral eficaz com uma IC50 inferior a 1 nM. Portanto, o composto da invenção é adequado para utilização no tratamento de doenças induzidas por virus, especialmente as infecções pelo VHB agudas e crónicas persistentes. Doenças virais crónicas induzidas pelo VHB podem, piorar a morbilidade, e a infecção crónica do virus da hepatite B pode causar em muitos casos cirrose hepática e/ou carcinoma hepatocelular.

As áreas de indicação que podem ser mencionadas para os compos tos da invenção são por exemplo: 0 tratamento G.0 infecções virai s agudas e cróni _cas que podem levar a hepatite infecci osa, por exemplo infecções com 0 virus da hepatite B. Os compostos da inve nção são p a r t i c u 1 a r me n t e adequados para 0 tratamento de infecções de hepatite B crónicas, e no tratamento de 1 .nf ecções pelo virus da hepatite : B aguda s e crónicas. 20 ΕΡ2514750Β1 Ά presente invenção inclui preparações farmacêuticas que para arém de transportadores inertes farmaceuticamente adequados, não tóxicos, compreendem um ou mais compostos (r) ou (Ia) ou uma comoinaçao da invenção, ou que consistem em um ou mais ingredientes activos (I) ou (Ia) ou de uma combinação da invenção.

Os ingredientes activos (I) e (Ia) têm a intenção de estar presentes nas preparações farmacêuticas mencionadas anteriormente, numa concentração de cerca de 0,1 a 99, 5?s em peso, de preferência de cerca de 0,5 a 95% em peso, da mistura total.

As preparações farmacêuticas mencionadas anteriormente podem também conter outros ingredientes farmacêuticos actrvos para além dos compostos (I) e (Ia) A razão entre as Quantidades

CiOS componentes A, onde apropriado C dentro de amplos , nas composições da invenção podem, variar limites, de preferência 5 a 500 mg de A/10 a 1000 mg de B, em particular 10 a 200 mg de A/20 a 400 mg de B. O componente que é também para ser utilizado onde apropriaido, pode ser utilizado em preferencialmente 1 a 10 milhões, em milhões, UI (unidades internacionais), por semana durante um período de até um quantidades particular 2 cerca de três de, a 7 vezes ano.

Os compostos ou composições da invenção têm a intenção de estar presentes nas preparações farmacêuticas mencionadas anteriormente, em geral numa concentração de cerca de 0,1 a 99,5, de preferência cerca de 0,5 a 95% em peso da mistura total. 21 EP2S14750B1

As preparações farmacêuticas mencionadas anteriormente podem ser produzidas de uma maneira convencional por métodos conhecidos, por exemplo por mistura do(s) ingrediente(s) activo(s) com o(s) transportador(es).

Tem sido geralmente provado vantajoso para atingir os resultados desejados, tanto na medicina humana e na veterinária, a administração do(s) ingrediente(s) activo(s) em quantidades totais de cerca de 0,5 a cerca de 500, de preferência de 1 a 10 0 m g/kg de peso co rporal cada 24 horas, onde apropriado sob a forma de uma pluralidade de doses individuais. Uma dose única contém o í s) ingrediente(s) activo(s) de preferência em quantidades de cerca de 1 a cerca de 80, em especial de 1 a 30 mg/kg de peso corporal. No entanto, pode ser necessário desviar-se das dosagens mencionadas, em particular dependendo da espécie e do peso corporal do sujeito a ser tratado, da natureza e da gravidade da doença, do tipo de preparação e via de administração do med.icam.ento, e do tempo ou intervalo no qual a administração tem lugar.

Portanto, a invenção refere-se ainda aos compostos e composições definidas anteriormente para o controlo de doenças. A invenção diz ainda respeito a medicamentos compreendendo pelo menos um. dos compostos ou composições definidos anteriormente, e onde apropriado, um ou mais outro(s) ingrediente(s) farmacêutico(s) activo(s). A invenção diz ainda respeito à utilização dos compostos e composições definidas anteriormente para a produção de um medicamento, para o tratamento e profilaxia das doenças descritas anteriormente, de preferência doenças virais, em particular a hepatite B. 22 EP2S147S0B1 deLdos percentuais nos exemplos que se seguem referem-se em cada caso a peso, a menos que indicado de outra forma. As razões de solventes em misturas de solventes são em cada caso com base no volume.

ϊ?νϊ?!^ίΏΤ AC A. Preparação de intermediários Intermediário 1

Ester de etilo 4-(2-bromo-4-fluorofenilo)-2-(tiazol-2-ilo)-6-metilo-1,4-dihidropirimidina-5-carboxilico

Uma mistura de 10,0 g (49,3 mmol) de 2-bromo-4-fluorobenzaldeído, 6,4 g (49,3 mmol) de acetoacetato de etilo, 8,1 g (49,3 mmol) de hidrocloreto de 2-amidino-tiazol e 4,8 g (58,5 mmol) de acetato de sódio foi dissolvida ou suspensa em 400 ml de etanol, e em seguida fervida e submetida a refluxo durante 16 horas. A solução obtida foi arrefecida até à temperatura ambiente e filtrada. O resíduo foi lavado com água para remover sais inorgânicos. Foi obtido o produto de 10,8 g (51,6%). Ponto de fusão: 163-165°C. 23 EP2S147S0B1

Intermediário 2

Ester de metilo 4-(z-bromo-4-fluorofenilo)-z-(tiazol-2- ilo)-6-metilo-1,4-dihidropirimidina-5-carboxilico 0 intermediário 2 foi acetoacetato de metilo, por utilizado para o intermediário fusão: 155-157°C). sintetizado a partir de um método semelhante 3.0 . Rendimento : 53% (ponto de

TâywâHi a ν'ί λ Q JL JL A w3k JL·*

Ester de etilo 6-bromometilo-4-(2-bromo-4-±luorofenilo)-2-(tiazol-2-ilo) — 1, 4---dihidropirimidina---5---carboxilico

Adicionaram-se 5,0 g (11,8 mmol) do intermediário 1 sl 100 ml de tetracloreto de carbono, e aqueceu-se a 50 °C numa atmosfera de gás de árgon, para se obter uma solução límpida. A esta temperatura, adicionaram-se 2,33 g (13,0 mmol) de N-bromosuccinimida à solução, e misturou-se a essa temperatura durante 10 minutos. A solução obtida foi em seguida imediatamente arrefecida e filtrada à temperatura ambiente, e descomprimida para concentração. O produto obtido tem um grau de pureza superior a 90%, de acordo com o resultado do ensaio de HPLC, e foi utilizado como matéria-prima para a etapa seguinte. Rf = 0,69 (a razão de 24 EP2S147S0B1 éter de petróleo para acetato de etilo é 8:2).

Intermediário 4

Ester de metilo 6-bromometilo-4-(2-bromo-4-fluorofenilo)-2-(tiazol-2-ilo) — 1, 4-dihidropirimidina-5-carboxílico 0 intermediário 4 foi sintetizado a partir do intermediário 2, por um método semelhante ao utilizado para a preparação cio intermediário 3. Rf = 0,69 (a razão de éter de petróleo para acetato de etilo é 8:2). B. Preparações de exemplos

Exemplo 5

Ester de etilo 4-(2-bromo-4-fluorofenilo)-2- (tiazol-2- ilo) ---- 6 ---- (4 -morf olinilmet ilo) -1,4-dihidropirimidina-5- c a r b o x í 1 i c o

Adicionaram-se 2,0 g do intermediário 3 a 15 ml de metanol para formar uma solução. A solução foi misturada com 5 vezes de morfolino, e agitada durante 30 minutos à temperatura ambiente. A solução obtida foi em seguida diluída com água e extraída com acetato de etilo. Rendimento: 1,7 g. Ponto de fusão: 161-163 °C. Rf = 0,45 (a 25 EP2S147S0B1 razão de éter de petróleo para acetato de etilo é 8:2). Exemplo 6 Éster de metilo 4-(2-bromo-4-fluorofenilo)-2-(tiazol-2-ilo) ---- 6 — (4-morfolinilmetilo) -1, 4-dihidropirimidina-5- carboxí1ico

0 exemplo 6 foi sintetizado a partir do intermediário 4, por um método semelhante ao utilizado para a preparação do exemplo 5. Ponto de fusão: 173-175 °C. Rf = Cp 43 (a razão de éter de petróleo para acetato de etilo é 8:2).

Os enantiómeros preparados no exemplo 5 e exemplo 6 foram separados numa coluna quiral (Daicel Chiralpak AS-H, fase móvel: n-hexano/etanol = 99/1).

Os compostos activos anti-VHB nos dois exemplos são enantiómeros que têm um tempo de retenção relativamente longo.

Os dados da actividade dos compostos da invenção estão 1is t a d o s aba ixo: 26 ΕΡ251475061 ΕΡ251475061 Exemplo N° ÍC50 (nM) 5 r, 0 w, ^ (-)-5 r\ ·« f X Referência 6 0,3 Referência (-)-6 0,2 0 tratamento do vírus da hepatite B, produ zindo células HepG2.2.15 com os compostos da i nvenção, pode conduzir a uma redução de ADN virai intra- e/ou extracelular.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

Os exemplos aqui divulgados mostram que os compostos aqui divulgados exibem um efeito anti-viral eficaz, com IC5o inferior a 1 nM. Por conseguinte, os compostos podem ser utilizados para o tratamento de uma doença induzida por vírus, especialmente as infecções por VHB agudas e crónicas persistentes.

DESCRICAO

DOCUMENTOS REFERIDOS NA

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Nao obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP na o assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Do • us 7074784 • us 7074784 S wo 9954326 • wo 9954329 imentos de patente referidos na descrição B [0004] [0005] [0009] B2 [0008] A [0030] [0032] A [0030] 27 EP2S147S0B1 » ΕΡ 382526 : Β [0045] S US 5047407 Α [0045] β W0 9111186 Α [0045] S US 5204466 Α [0045] β ΕΡ 481214 : Β [0045] β IJS 5663159 Α [0045] S ÍJS 5792756 Α [0045] β US 4724233 Α [0045] » US 4808716 Α [0045] 9 ΕΡ 481754 : Β [0045] β US 5206244 Α [0045] S US 5340816 Α [0045] β W 0 9809964 Α [0045] β W0 9941275 Α [0045] S ΕΡ 349242 : Β [0045] β US 5049671 Α [0045] S ΕΡ 434450 : Β [0045] S ÍJS 5034394 Α [0045] β \Ν 0 9214743 Α [0045] » US 5210085 Α [0045] 9 US 5539116 Α [0045] β US 5700937 Α [0045] S US 5728575 Α [0045] « US 5814639 Α [0045] « IJS 5827727 Α [0045] ÍJS 5852027 Α [0045] « US 5892025 Α [0045] » US 5914331 Α [0045] 9 US 5914400 Α [0045] β W0 9218517 Α [0045] » W0 9427616 Α [0045] « US 5627160 Α [0045] « IJS 5 5 6112 0 Α [0045] ÍJS 5631239 Α [0045] β US 5830881 Α [0045] EP2S147S0B1 EP2S147S0B1 * wo 9905157 A [0045] * wo 9905158 A [0045] * us 5753789 p [0045] * wo 9833501 A [0047] Literat ura não relaci descriç ão

Science, 2003, vol. 299, 893-896 [0003] D. BORRMANN. Umsetzung von Diketen mit Alkoholen, Phenolen und Mercaptanen. Methoden der organischen

Vnemie, 1968, vol. VII/4, 230 ff [0029]

Org, Chem., Y. GIKAWA ; K. SUGANO ; O. YONEMITSU. 1978, vol. 43, 2087 [0029] PH, A, FURMAN et al. Antimicrobial Agents and

Chemotherapy, 1992, vol. 36 (12), 2688 [0042] PH. A. FURMAK. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1992, vol. 36 (12), 2688 [0043] M. A. SELLS et al. Proc. Natl. Acad. Sei., 1987, vol. 84, 1005-1009 [0049] B. E. KORBA et al. Antiviral Research, 1992, vol. 19, 55-70 [0049] sboa, 16 de janeiro de 2014 29

Claims (7)

1. EP2S147S0B1 REIVINDICAÇÕES 1. Ura sal metanossulfonato que tem a seguinte estrutura ou ura enantiómenro, levoisómero ou ura tautómero do mesmo:
2. 2. Ura método de preparação do composto da reivindicação 1, era que o método é caracterizado por: (a) reacção de ura benzaldeído cora a fórmula (II) cora ura (3" cetoéster cora a fórmula (III), para produzir ura composto de benziiideno cora a fórmula (IV):

   (b) reacção do composto de benziiideno com a fórmula (IV) com um sal de uma amidina com a fórmula (V): MH

   era. que R1 é o-bromo, é p-flúor, é tiazolil-2-ilo, X é metileno e Z Rf é um alquilo é mo r f o 1 i n i 1 o e -4 r Rc era que o 1 EP2S147S0B1 sal é metanossulfonato.
3. 3. Ura método de preparação do sal metanossulfonato da reivindicação 1, era que o método é caracterizado pora reacção de um composto que tem a fórmula (III) cora ura aldeído que tem a fórmula (II) e uma sal de uma amidina que tem a fórmula (V);

   CMO (O), 'o·'' "N $ Z—X^S) (ΪΗ),

   (V), em que RJ é o-brorao, Rz é p-flúor, R'5 é etilo, P.° é tiazolil-2-ilo, X é metileno e Z é raorfolinilo e em que o sal é metanossulfonato.
4. 4. Ura reivindi reacçao método de preparação do sal cação 1, em que o método é do composto com a fórmula me t a η o s s u 1 f o n a t o caracterizado por (VI) com uma sal a de raorfolino (VIi): em que Y

   cloro. jromo, metilsulfoni( ou toluenosulf onilo, e R1 é o-brorao, etilo, e Rb é tiazolil-2-ilo e metanossulfonato. R^ é p-flúor, R em que o sal ura é ara 2 0 EP2S147S0B1
5. 5. Uma composição que compreende: A) um sal metanossulfonato das reivindicação 1, B) pelo menos um agente anti-viral, e quando apropriado, C) pelo menos um imunomodulador seleccionado a partir de um interferão, uma interleucina, um polipéptido, um derivado de imidazoquinolina, uma imunoglobulina ou uma vacina terapêutica.
6. 6. A composição da reivindicação 5, em que o componente B é um inibidor da polimerase, lamivudina ou um composto de fenilpropenamida com a seguinte fórmula: um sal do mesmo,

   o cada R1 e R2 sao independentemente alquilo C1---4, ou em conjunto com o átomo de azoto no qual estão localizados, formam um an el com 5 3. 6 átomos de anel que compreendem carbono e/ou ox igênio, Θ cada R" a R12 são independentemente hidrogénio, halogénio, alquilo C1-C4, alcoxi C1-C4 op c i o n a .1 me n t e s ubstitu ido , nitro, ciano ou trifiuorometilo X é halogénio alquilo Cl-4 Lmente si )St ituído, 3 EP2S147S0B1 A composição da reivindicação 6, em que o componente B composto fenilpropenamida que tem a seguinte estrutura: EP2S147S0B1
7. 8. Um medicamento que compreende o composto da reivindicação 1, ou pelo menos uma composição de qualquer uma das rei\ 7ind: Lcações - e, qu ando apro pr ia· do, um ou ma is agen tes f arm acêu ticos activo s . 9. 0 m edic ame n to da reivin dic ação 8, qi ae compreende ain Ga um p ortador íarmaceuti cament e a ceitável. 10 , 0 sal rnet :anossulfonat . 0 da reivi .ndic ação 1 ou a comp osiç ão de qualquer d as reivindi CaÇOf o s o 7 OU o medi camento de qualquer das reivind .icaç ões 8---9 pa ira utirízacao cratamenuo prevenção de uma doença no seleccion a cl a a partir de doença virai, infecção por hepatite B, ou uma doença causada pela infecção por hepatite B« 11, 0 s a 1 metanossulfonato ou a composição da reivindic a ç cl o 10, em que a doença é uma doença causada pela infecção por hepatite B seleccionada a partir de hepa' tite, cirrose, ou c arcinoma hepatocelular. Lisboa, 1 6 de Janeiro de 2014 4