JP7479384B2 - N-複素環式5員環含有カプシドタンパク質のアセンブリの阻害剤、その医薬組成物および使用 - Google Patents
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Description
本願は、2019年1月25日に中国国家知的財産局に出願された出願番号がCN201910073465.2である中国特許出願に基づく優先権および利益を主張し、当該中国特許出願の内容の全てを本明細書に援用する。
本発明は、式Iもしくは式IIで表される化合物(以下、式Iもしくは式IIの化合物とも言い)、その立体異性体、互変異性体、幾何異性体、溶媒和物、活性代謝物、水和物、プロドラッグまたはそれらの薬学的に許容される塩、その製造方法、および該化合物を含む医薬組成物、ならびに疾患の予防または治療のためのその使用(例えば、B型肝炎ウイルス感染の治療薬とするようなカプシドタンパク質のアセンブリの阻害から恩恵を受ける疾患の予防又は治療への応用)に関する。
本発明のいくつかの実施形態において、前記カプシドタンパク質のアセンブリの阻害から恩恵を受ける疾患とは、B型肝炎ウイルス(HBV)感染によって引き起こされる肝疾患を意味する。
他に断らない限り、本明細書に用いられる下記の用語およびフレーズは、次の意味を有する。ある1個の特定の用語は、特に定義されない場合、不確定または不明確とが認定されておらず、当該分野の一般的な意味として理解されるべきである。本明細書では、商品名が記載される場合、その対応の商品またはその活性成分を示すことである。
(i)疾患または疾患状態を阻害し、すなわちその発生・進行を阻害することと、
(ii)疾患または疾患状態を緩和し、すなわち疾患または疾患状態を減退させることとを含む。
哺乳類において疾患または疾患状態の発生を予防し、特に、当該哺乳類が前記疾患状態に罹りやすいが、そのような疾患状態にすでに罹患していることがまだ診断されていない場合、予防することとを含む。
用語「水和物」とは、既に開示されたまたは保護の請求された化合物、および化学量論量または非化学量論量の水を含む溶媒和物を意味する。
本発明に係る化合物にオレフィン二重結合または他の幾不斉中心を含む場合、特に断りのない限り、それらはEおよびZ幾何異性体を含む。
医薬組成物は、さらに、適切な単位剤形の無菌液剤、懸濁液や凍結乾燥製品での非経口投与のために適用されてもよい。
EAは酢酸エチルを表し、MeOHはメタノールを表し、DMFはN、N-ジメチルホルムアミドを表し、HATUは、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N、N、N’、N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(即ち、2-(7-オキシベンゾトリアゾール)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)を表し、DIPEAはN、N-ジイソプロピルエチルアミンを表し、POは経口投与を表し、IVは静脈注射を表し、DMSOはジメチルスルホキシドを表す。
氷浴中に、N2の保護下で、反応フラスコに2-クロロ-2-オキソ酢酸エチル(40.8g)および酸化亜鉛(1.22g)を順次加え、そして2,4-ジメチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチル(5g)を加えた後、混合物を氷浴下で10分間撹拌し、氷浴を取り外し、室温で撹拌した。反応終了後、反応液を氷水混合物200mLに徐々に滴下し、EA(200mL)を加え、分層し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、カラムクロマトグラフィーにより作製して5-(2-エトキシ-2-オキソアセチル)-2,4-ジメチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチル(4.5g)を得た。MS (ESI+,[M+Na]+) m/z:290.07。
反応フラスコに、5-(2-エトキシ-2-オキソアセチル)-2,4-ジメチル-1H-ピロール-3-カルボン酸エチル(3.5g)、MeOH(40mL)を順次加え、氷浴下で水酸化ナトリウム(1.05g)の水(20mL)溶液を滴下し、室温で撹拌した。反応終了後、2N塩酸水溶液で水相のpHを3~4に調整し、EA(100mL×2)で抽出し、有機相を水(30mL)で洗浄し、濃縮して2-(4-(エトキシカルボニル)-3,5-ジメチル-1H-ピロール-2-イル)-2-オキソ酢酸(2.7g)を得た。MS (ESI-,[M-H]-) m/z:238.1.
室温で、反応フラスコに、2-(4-(エトキシカルボニル)-3,5-ジメチル-1H-ピロール-2-イル)-2-オキソ酢酸(1g)、DMF(20mL)、HATU(2.07g)およびDIPEA(1.08g)を順次加えた後、室温で10分間撹拌し、(S)-1,1,1-トリフルオロプロパン-2-アミン塩酸塩(0.63g)を加えた。反応終了後、反応液を水50mLに注ぎ、EA(50mL×3)で抽出し、有機相を飽和硫酸ナトリウム水溶液(50mL×3)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、ろ液を回収し、濃縮し、カラムクロマトグラフィーにより精製して(S)-2,4-ジメチル-5-(2-オキソ-2-((1,1,1-トリフルオロプロパン-2-イル)アミノ)アセチル)-1H-ピロール-3-カルボン酸エチル(0.5g)を得た。MS (ESI-,[M-H]-) m/z:333.4.
反応フラスコに、(S)-2,4-ジメチル-5-(2-オキソ-2-((1,1,1-トリフルオロプロパン-2-イル)アミノ)アセチル)-1H-ピロール-3-カルボン酸エチル(300mg)、MeOH(2mL)を加え、さらにNaOH(72mg)の水(1mL)溶液を加えた後、反応温度を80℃まで加熱して一晩反応させた。反応終了後、濃縮し、そして水(20mL)およびEA(60mL)を加え、水層を分離し、有機相を水(30mL)で洗浄し、分層し、水相を合わせ、2N塩酸で水相を調整し、pHを3程度にし、そしてEA(100mL×2)で抽出し、分層し、有機相を濃縮して(S)-2,4-ジメチル-5-(2-オキソ-2-((1,1,1-トリフルオロプロパン-2-イル)アミノ)アセチル)-1H-ピロール-3-カルボン酸(230mg)を得た。MS (ESI-,[M-H]-) m/z:305.4.
室温で、反応フラスコに、(S)-2,4-ジメチル-5-(2-オキソ-2-((1,1,1-トリフルオロプロパン-2-イル)アミノ)アセチル)-1H-ピロール-3-カルボン酸(230mg)、DMF(5mL)、HATU(428mg)およびDIPEA(194mg)を順次加えた後、10分間撹拌し、さらに5-アミノ-2-フルオロベンゾニトリル(123mg)を加え、40℃まで加熱して撹拌しながら20時間反応させた。反応終了後、水(20mL)およびEA(60mL)を加え、分層し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、ろ液を回収し、回転乾燥し、サンプルを混合し、カラムクロマトグラフィーにより精製して(S)-N-(3-シアノ-4-フルオロフェニル)-2,4-ジメチル-5-(2-オキソ-2-((1,1,1-トリフルオロプロパン-2-イル)アミノ)アセチル)-1H-ピロール-3-カルボキサミド(180mg)を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 12.05 (s, 1H), 10.20 (s, 1H), 9.49 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.20 (dd, J = 6.0, 2.5Hz, 1H), 7.98-7.91 (m, 1H),7.53 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.78-4.67 (m, 1H),2.40 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 1.34 (d, J = 7.0 Hz, 3H)。MS (ESI-,[M-H]-) m/z:423.0。
ステップA:
実施例1に記載のステップCにおいて、(S)-1,1,1-トリフルオロプロパン-2-アミン塩酸塩の代わりに、(R)-1,1,1-トリフルオロプロパン-2-アミン塩酸塩を用い、(R)-2,4-ジメチル-5-(2-オキソ-2-((1,1,1-トリフルオロプロパン-2-イル)アミノ)アセチル)-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステルを得た。MS (ESI-,[M-H]-) m/z:333.2。
ステップB:
実施例1に記載のステップDにおいて、(S)-2,4-ジメチル-5-(2-オキソ-2-((1,1,1-トリフルオロプロパン-2-イル)アミノ)アセチル)-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステルの代わりに、(R)-2,4-ジメチル-5-(2-オキソ-2-((1,1,1-トリフルオロプロパン-2-イル)アミノ)アセチル)-1H-ピロール-3-カルボン酸エチルエステルを用い、(R)-2,4-ジメチル-5-(2-オキソ-2-((1,1,1-トリフルオロプロパン-2-イル)アミノ)アセチル)-1H-ピロール-3-カルボン酸を得た。MS (ESI-,[M-H]-) m/z:305.4。
ステップC:
実施例1に記載のステップEにおいて、(S)-2,4-ジメチル-5-(2-オキソ-2-((1,1,1-トリフルオロプロパン-2-イル)アミノ)アセチル)-1H-ピロール-3-カルボン酸の代わりに、(R)-2,4-ジメチル-5-(2-オキソ-2-((1,1,1-トリフルオロプロパン-2-イル)アミノ)アセチル)-1H-ピロール-3-カルボン酸を用い、(R)-N-(3-シアノ-4-フルオロフェニル)-2,4-ジメチル-5-(2-オキソ-2-((1,1,1-トリフルオロプロパン-2-イル)アミノ)アセチル)-1H-ピロール-3-カルボキサミドを得た。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 12.03 (s, 1H), 10.19 (s, 1H), 9.48 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.20 (dd, J = 6.0, 2.5 Hz, 1H), 8.00-7.90 (m, 1H), 7.52 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 4.90-4.65 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.33 (s, 3H), 1.34 (d, J = 7.5 Hz, 3H)。MS (ESI-,[M-H]-) m/z:423.2。
1.1 インビトロ細胞HBV DNA阻害活性
指数増殖期における状態が良好なHepG2.2.15細胞(Wuhan Institute of Virology)またはHepAD38細胞をボトル1本で取り、PBS 5mLを加えて1回洗浄した後、トリプシン3mLを加えた。室温で5分間消化した後、2mLのトリプシンを廃棄し、細胞培養インキュベーターに入れて10分間消化し、細胞を時々取り出し、顕微鏡下で観察(細胞が単一の円形であるかどうか、細胞間に接着がなかったかどうか)を行った後、完全培地10mLを加えて消化を停止した。単細胞懸濁液になるようにピペッティングした後、細胞懸濁液10μLを取り出してセルカウンターで細胞数を計数し、完全培地で希釈し、細胞密度を1×105個細胞/mLに調整した。次に、マルチチャンネルピペットを用いて細胞懸濁液を24ウェルプレートに1mL/ウェルで播種し(24ウェルプレートに対して予め50μg/mLコラーゲンI(Collagen I)溶液で被覆した)、恒温CO2インキュベーターに48時間インキュベートした。
指数増殖期における状態が良好なHepG2.2.15細胞(Wuhan Institute of Virology)をボトル1本で取り、PBS 5mLを加えて1回洗浄した後、トリプシン2mLを加えた。細胞インキュベーターに入れて消化を行い、時々取り出して顕微鏡下で観察し、細胞が脱落した直後に、1mLのトリプシンを廃棄し、残液のみを残し、37℃のインキュベーターに入れて8~15分間消化し、顕微鏡下に取り出して細胞を観察し(細胞が単一の円形であるかどうか、細胞間に接着がなかったかどうか)、MEM培地5mLを加えて細胞を再懸濁した。セルカウンターで細胞数を計数し、完全培地で希釈し、細胞密度を2×105個細胞/mLに調整した。マルチチャネルピペットを用いて96ウェルプレートに100μL/ウェルで接種し(96ウェルプレートに対して予め50μg/mLコラーゲンI(Collagen I)溶液で被覆した)、恒温CO2インキュベーターに置いて24時間インキュベートし、投薬処理し、化合物含有新鮮培地を3日間ごとに交換し、薬物を含まないDMSO濃度が0.5%である培地を対照ウェルに加え、また通常の培地での対照ウェルを設け、投与処理6日間後、10μL/ウェルでCCK-8を加え、1~2時間後マイクロプレートリーダーにより450nmでの吸光値を検出し、阻害率を算出し、且つCC50を算出した。結果を表3に示す。
500μLの最終インキュベーション系には、ヒト肝ミクロソーム(タンパク質濃度:0.2mg/mL、Corning)50μL、混合CYP450特異的基質(CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、およびCYP3A4)1μL、PBSバッファー(PH7.4)398μL、特異的陽性阻害剤(陽性対照群)1μLまたは被験化合物(アセトニトリルで調製)1μL、およびNADPH+MgCl2 50μLが含まれていた。各CYP450サブタイプ(亜型)に対して、それぞれ0.5mLの重複したインキュベーション系を作成した。各チューブに予め基質と酵素と均一に混合された溶液(総容量450μL)を配合してそれぞれ37oCで5分間プレインキュベートした後、NADPH+MgCl2の混合溶液50μLを加えて反応させ、30分間で反応液50μLを取り出し、内部標準含有氷アセトニトリル300μLで反応を停止した。また、NADPHを加えずに、2つのブランク対照群を500μLずつ平行して作製して陰性対照群とした。
インキュベートしたサンプル50μLに、内部標準含有アセトニトリル300μLを加えて沈殿させ、5分間ボルテックスした後、サンプルを10分間遠心分離(12,000rpm、4℃)した。上清75μLをピペットで吸引して取り、超純水75μLで希釈して均一に混合し、得られた溶液1μLを検体として注入し分析した。結果を表4に示す。
血漿サンプルの調製:
対応する種(マウス、ラット、イヌ、サルおよびヒト)のブランク血漿495μLをそれぞれ採取し、対応する被験化合物溶液または陽性対照5μLを加え、化合物の血漿薬物濃度がそれぞれ1μM、10μM(アセトニトリルで調製)となるように血漿サンプル溶液を得た。
血漿側のサンプル50μLに、内部標準含有アセトニトリル450μLを加えて沈殿させ、5分間ボルテックスした後、サンプルを10分間遠心分離(12,000rpm、4℃)した。上清75μLをピペットで吸引して取り、超純水75μLで希釈して均一に混合し、得られた溶液1μLを検体として注入し分析した。PBS側のサンプル50μL、内部標準含有氷アセトニトリル250μLを加えてを沈殿させ、5分間ボルテックスした後、サンプルを10分間遠心分離(12,000rpm、4℃)した。上清75μLをピペットで吸引して取り、超純水75μLで希釈して均一に混合し、得られた溶液2μLを検体として注入し分析した。結果を表5に示す。
最終インキュベーション系300μLには、肝ミクロソーム(タンパク質濃度:0.15mg/mL、Corning)30μL、NADPH+MgCl2 30μL、基質(アセトニトリルで調製)3μL、およびPBSバッファー237μLが含まれていた。各種に対して、それぞれ0.3mLの重複したインキュベーション系を作成した。各チューブに予め基質と酵素と均一に混合された溶液(総容量270μL)を配合してそれぞれ37oCで5分間プレインキュベートした後、NADPH+MgCl2の混合溶液30μLを加えて反応させ、それぞれ0、10、30、60分間で反応液50μLを取り出し、内部標準含有氷アセトニトリル300μLで反応を停止した。
インキュベートしたサンプル50μLに、内部標準ジアゼパム含有アセトニトリル300μLを加えて沈殿させ、5分間ボルテックスした後、サンプルを10分間遠心分離(12,000rpm、4℃)した。上清75μLを96ウェルプレートに吸引して取り出し、超純水75μLで希釈して均一に混合し、0.5μLを検体として注入してLC-MS/MS分析を行った。結果を次の表6に示す。
3.1 AAVマウスモデルによる抗ウイルス効果の評価
6~8週齢の雄C57BL/6マウス(Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.)を取り、用量1×1011vgでrAAV8-1.3HBVウイルス(Beijing FivePlus Gene Technology Ltd.、adrサブタイプ)を、C57BL/6マウスに尾静脈注射した。ウイルス注射後2週目、4週目にマウスの眼窩から採血し、血清を分離し、血清中のHBeAgとHBsAgの発現レベル、およびHBV DNAコピー数を検出し、モデル構築の成否について評価した。血清学的HBeAg、HBsAg、およびHBV DNAの定量的検出の結果と組み合わせると、選択したマウスのそれぞれのHBV DNA発現レベルは1×104 IU/mLを超え、HBeAg発現レベルは1×103 NCU/mLを超え、HBsAg発現レベルは1×103 ng/mLを超えた。マウスをブランク対照群、溶媒対照群、被験物質群として群分けた。各群のマウスには、1日1回連続的に3週間胃内投与し、1週間投与停止(休薬)した。実験中、1週間おきに眼窩から採血し、血清を分離し、蛍光定量PCR法によりDNA含有量を検出した。結果を表7及び表8に示す。
6~8週齢の雄C57BL/6マウス(Shanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd.)を取り、精製した組換えプラスミドpAAV/HBVl.2(10μg)をPBSに溶解し、各マウスに対してそれぞれの体重の約10%である体積量で3~8秒以内に尾静脈注射した。プラスミド注射3日後に、マウスの眼窩から採血し、血清HBV DNAを検出し、血清DNAの均一なモデルマウスを選択し、モデル対照群、溶媒対照群、および被験物質群として分けた。各群のマウスには、用量3mg/kgで1日1回連続的に10日間胃内投与された。マウス血清を、それぞれ投与後の0、4、7、10日に採取し、10日目にマウスを犠牲にさせて肝臓組織サンプルを採取し、蛍光定量PCR法によりマウス血清と肝臓中のHBV DNAコピー数を検出した。結果を表9に示す。
ラットインビボ薬物動態学的(PK)研究
体重180~220gのSDラット(Shanghai Xipuer-Bikai Laboratory Animal Co., Ltd.)を用い、3日~5日間適応性飼育を行った後、群ごとに3匹で無作為に群分け、それぞれ一連の化合物を投与量20mg/kgで胃内投与した。
被験動物(SDラット)には、投与前12時間から絶食させ、投与後4時間から給餌し、実験前後も実験中も自由に水を飲んだ。
Claims (11)
- 請求項1に記載の式Iもしくは式IIの化合物、その立体異性体、互変異性体、幾何異性体、溶媒和物、水和物または薬学的に許容される塩を含み、
任意に、薬学的に許容される補助剤をさらに含む、医薬組成物。 - カプシドタンパク質のアセンブリの阻害から恩恵を受ける疾患の予防または治療のための医薬の調製における、請求項1に記載の式Iもしくは式IIの化合物、その立体異性体、互変異性体、幾何異性体、溶媒和物、水和物または薬学的に許容される塩の使用。
- カプシドタンパク質のアセンブリの阻害から恩恵を受ける疾患が、B型肝炎ウイルス(HBV)感染によって引き起こされる疾患である、請求項3に記載の使用。
- カプシドタンパク質のアセンブリの阻害から恩恵を受ける疾患の予防または治療のための医薬の調製における、請求項2に記載の医薬組成物の使用。
- カプシドタンパク質のアセンブリの阻害から恩恵を受ける疾患が、B型肝炎ウイルス(HBV)感染によって引き起こされる疾患である、請求項5に記載の使用。
- カプシドタンパク質のアセンブリの阻害から恩恵を受ける疾患の予防または治療における使用のための、請求項2に記載の医薬組成物。
- カプシドタンパク質のアセンブリの阻害から恩恵を受ける疾患が、B型肝炎ウイルス(HBV)感染によって引き起こされる疾患である、請求項7に記載の医薬組成物。
- カプシドタンパク質のアセンブリの阻害のための医薬の調製における、請求項1に記載の式Iもしくは式IIの化合物、その立体異性体、互変異性体、幾何異性体、溶媒和物、水和物または薬学的に許容される塩の使用。
- カプシドタンパク質のアセンブリの阻害のための医薬の調製における、請求項2に記載の医薬組成物の使用。
- カプシドタンパク質のアセンブリの阻害における使用のための、請求項2に記載の医薬組成物。
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