KR20100038104A

KR20100038104A - 브로모-페닐 치환된 티아졸릴 디하이드로피리미딘

Info

Publication number: KR20100038104A
Application number: KR1020107000850A
Authority: KR
Inventors: 골드만 지그프리드; 징 리; 위송 류
Original assignee: 장 종넹
Priority date: 2007-06-18
Filing date: 2008-06-18
Publication date: 2010-04-12
Also published as: USRE44987E1; CA2691056A1; DK2514750T5; BRPI0813237B1; PT2159224E; US20120282221A1; RU2010101212A; KR101173892B1; JP2010530374A; US20100240655A1; AU2008265397B2; ES2391597T3; AU2008265397A1; US8236797B2; CA2691056C; BRPI0813237A2; US8343969B2; AU2008265397C1; ES2442907T3; DK2514750T3

Abstract

HBV 감염을 대처하기 위한, 브로모-페닐 치환된 티아졸릴 디하이드로피리미딘 및 이 물질 및 다른 항바이러스제의 조합물.

Description

브로모-페닐 치환된 티아졸릴 디하이드로피리미딘{BROMO-PHENYL SUBSTITUTED THIAZOLYL DIHYDROPYRIMIDINES}

본 발명은 새로운 브로모-페닐 치환된 티아졸릴 디하이드로피리미딘, 그의 제조 방법 및 B형 간염의 치료와 예방을 위한 약물로서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 디하이드로피리미딘, 그 밖의 항바이러스제, 및 적절한 경우, 면역조절제를 포함하는 조성물, 및 그러한 조성물을 포함하는 약물로서, 특히 B형 간염과 같은 HBV 감염의 치료와 예방을 위한 약물에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스는 헤파드나 바이러스(hepadna virus)과에 속한다. B형 간염 바이러스는 급성 및/또는 잠복기가 길거나 진행성인 만성 질환을 야기할 수 있다. 병리학적 상태에서의 많은 다른 임상적 증상, 특히 간의 만성 염증, 간경변, 및 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)도 B형 간염 바이러스에 의해 초래된다. 또한, 델타 간염 바이러스(hepatitis delta virus)에 의한 동시감염(coinfection)은 상기 질환의 진행에 악영향을 미칠 수 있다.

인터페론과 라미부딘(lamivudine)은 만성 간염의 치료에 사용될 수 있는 것으로 승인된 종래의 약물이다. 그러나, 인터페론은 활성이 강하지 않은 반면에 부작용을 가진다. 라미부딘은 양호한 활성을 가지지만, 치료 과정에서 내성이 급속히 증가되고, 치료가 중단된 후에는 재발 효과(relapse effect)가 종종 나타난다. 라미부딘(3-TC)의 IC₅₀ 값은 300nM이다(Science, 299(2003), 893-896).

미국 특허 제7,704,784호는 6-아미도알킬디하이드로피리미딘 및 특히 B형 간염의 감염의 치료와 예방을 위한 약물로서의 그의 용도를 개시한다.

미국 특허 제7,704,784호의 실시예 12에는, R¹이 o-염소이고, R²가 p-염소이고, R⁶은 3,5-디플루오로-피리딘-2-일이고, X는 -CH₂, Z는 모르폴리닐인 화합물이 기재되어 있다. 상기 화합물은 세포 배양 시 B형 간염 바이러스의 성장을 억제할 수 있다. IC₅₀ 값은 2nM이다(자체 시험된 값).

실시예 12에서의 주된 치환체는 비스-염소를 R¹(o-브롬) 및 R²(p-플루오르)로 치환한 것이고, 그 결과 얻어지는 화합물 9의 IC₅₀ 값은 7nM이다(상기 특허의 실시예 9에 기재되어 있음). 상기 주된 치환체가 R¹(o-염소) 및 R²(p-플루오르)로 변경되면, 유사한 IC₅₀ 값이 얻어진다(실시예 5에서, IC₅₀ = 2∼4nM).

상기 IC₅₀ 값은 주된 치환제 R¹ 및 R²를 변경해도 증가될 수 없는 것으로 나타나 있다(표 1 참조).

미국 특허 제7,074,784 B2호도 디플루오로 잔기가 티아졸-2-일로 치환되어 있는 실시예를 개시한다(상기 특허의 실시예 45에 기재되어 있음). 상기 유도체는 동일한 IC₅₀ 값(2nM)을 가진다(표 1 참조).

본 발명의 목적은 새로운 브로모-페닐 치환된 티아졸릴 디하이드로피리미딘, 그의 제조 방법 및 B형 간염의 치료와 예방을 위한 약물로서의 그의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 또한, 디하이드로피리미딘, 그 밖의 항바이러스제, 및 적절한 경우, 면역조절제를 포함하는 조성물, 및 그러한 조성물을 포함하는 약물로서, 특히 B형 간염과 같은 HBV 감염의 치료와 예방을 위한 약물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 티아졸-2-일로 치환하고, 주된 치환체를 R¹=o-브롬 및 R²=p-플루오르로 변경함으로써, 활성이 10배 더 높고 IC₅₀ 값이 1nM 미만인 유도체를 얻을 수 있다는 놀라운 사실을 발견했다. 이것은 미국 특허 제7,074,784를 참조할 때 예상치 못한 것이다(표 2 참조).

본 발명은 하기 식(I)으로 표시되는 화합물 및 그의 이성체(Ia)에 관한 것이다:

식에서, R¹은 o-브롬이고, R²는 p-플루오르이며, R³은 C₁-C₄ 알킬이고, R⁶은 티아졸-2-일이고, X는 메틸렌이고, Z는 모르폴리닐이다.

바람직하게는, 식(I) 및 식(Ia)으로 표시되는 본 발명의 화합물의 R¹은 o-브롬이고, R²는 p-플루오르이며, R³은 메틸 또는 에틸이고, R⁶은 티아졸-2-일이고, X는 메틸렌이고, Z는 모르폴리닐이다.

본 발명은 또한, 본 명세서에 개시된 화합물의 거울상 이성체(enantiomer) 및 그의 혼합물에 관한 것이다. 라세미체는 공지된 방법에 의해 분리될 수 있고, 기본적으로는 입체 이성체 혼합물 중의 균질한 성분이다.

본 발명의 화합물은 식(I) 및 식(Ia)으로 표시되는 이성체 및 그의 혼합물을 포함한다.

본 발명의 화합물은 또한, 염의 형태, 바람직하게는 생리학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다.

생리학적으로 허용가능한 염은 무기산 염 또는 유기산 염일 수 있다. 바람직하게는, 상기 염은 염화물, 브롬화물, 인산염 또는 황산염 등과 같은 무기산 염, 또는 아세테이트, 말레에이트(maleate), 푸마레이트, 말레이트(malate), 시트레이트, 타르타레이트, 락테이트, 벤조에이트 또는 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, 톨루엔술포네이트 또는 나프탈렌디술포네이트 등과 같은 카르복실레이트 또는 술포네이트이다.

생리학적으로 허용가능한 염은 본 발명의 화합물의 금속염 또는 암모늄염일 수도 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 염은 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염 또는 칼슘염, 및 에틸아민, 디에틸아민이나 트리에틸아민, 디에탄올아민이나 트리에탄올아민, 디시클로헥실아민, 디메틸아미노에틸 알코올, 아르기닌, 리신, 에틸렌디아민 또는 2-페닐에틸아민 등과 같은 유기 아민이나 암모니아에 의해 생성되는 암모늄염이다.

본 발명의 화합물(I)은 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다:

[A] 알칼리 또는 산을 첨가하거나 첨가하지 않고, 적절한 경우에는 불활성 유기 용매의 존재 하에서, 식(II)으로 표시되는 벤즈알데히드를, 식(III)으로 표시되는 β-케토에스테르와 반응시켜 식(IV)으로 표시되는 벤질리덴 화합물을 제조하고:

(식에서, R¹, R², R³, X 및 Z는 전술한 바와 같음),

이어서, 알칼리 또는 산을 첨가하거나 첨가하지 않고, 적절한 경우에는 불활성 유기 용매의 존재 하에서, 상기 벤질리덴 화합물을 식(V)으로 표시되는 아미딘 또는 그의 염(예를 들면 염산염 또는 아세트산염)과 반응시키고:

(식에서, R⁶은 전술한 바와 같음); 또는

[B] 알칼리 또는 산을 첨가하거나 첨가하지 않고, 적절한 경우에는 불활성 유기 용매의 존재 하에서, 식(III)으로 표시되는 β-케토에스테르를 식(II)으로 표시되는 벤즈알데히드 및 식(V)으로 표시되는 아미딘 또는 그의 염(예컨대 염산염 또는 아세트산염)과 1단계로 반응시키거나; 또는

[C] 식(I)에서의 X가 메틸렌인 경우, 알칼리 또는 산을 첨가하거나 첨가하지 않고, 적절한 경우에는 불활성 유기 용매의 존재 하에서, 식(VI)으로 표시되는 화합물을 식(VII)으로 표시되는 모르폴린과 반응시키거나:

(식에서, R¹, R², R³ 및 R⁶은 전술한 바와 같고, Y는 클로로, 브로모, 요오도, 메틸설포닐 또는 톨루엔설포닐과 같은 친핵성 치환체임); 또는

[D] 알칼리 또는 산을 첨가하거나 첨가하지 않고, 적절한 경우에는 불활성 유기 용매의 존재 하에서, 식(II)으로 표시되는 벤즈알데히드를 식(X)으로 표시되는 화합물 및 식(V)으로 표시되는 아미딘과 반응시킨다:

(식에서, R³, X 및 Z는 전술한 바와 같음).

식(VI)으로 표시되는 화합물은, 예를 들면, 식(VIII)으로 표시되는 화합물:

(식에서, R¹, R², R³ 및 R⁶은 전술한 바와 같음)을, 바람직하게는 불활성 유기 용매 중에서, N-브로모숙신이미드와 같은 브롬화제와 반응시켜 식(IX)으로 표시되는 화합물:

을 생성하고, 친핵성 치환체를 가지는 화합물을, 직접 또는 문헌에 기재된 종래의 방법에 따라 상기 화합물이 추가로 변환된 후에, 식(VII)으로 표시되는 모르폴린과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.

[0019]

X가 메틸렌이고 Z가 모르폴리닐인, 식(I)으로 표시되는 본 발명의 화합물을 제조하기 위해서는, 식(XI)으로 표시되는 클로로아세테이트를 모르폴린(VII)과 반응시켜 식(III)의 β-케토 카르복실레이트를 생성한다:

식에서 R³은 전술한 바와 같다.

출발 물질로서, 2-브로모-4-플루오로-벤즈알데히드(II)를 상업적으로 입수할 수 있다.

출발 물질로서, β-케토 카르복실레이트(III)가 잘 알려져 있고, 또는 문헌에 발표되어 있는 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다[문헌예; D. Borrmann, "Umsetzung von Diketen mit Alkoholen, Phenolen und Mercaptanen", in "Methoden der organischen Chemie"(Houben-Weyl), vol. VII/4,230 FF(1968); Y. Oikawa, K. Sugano und O. Yonemitsu, J. Org. Chem. 43, 2087(1978)].

화합물(V)은 공지되어 있으며, 특허 문헌 WO-A-99/54326 및 WO-A-99/54329의 설명에 따라 제조될 수 있다.

모르폴린(VII)은 상업적으로 입수가능하다.

화합물(VIII) 및 화합물(X)은 특허 문헌 WO-A-99/54326에 기재되어 있는 단계 [A] 또는 [B]에 따라 제조될 수 있다.

모든 불활성 유기 용매가 단계 A, B, C 및 D에서 사용하기에 적합하다. 불활성 유기 용매는 바람직하게는, 메탄올, 에탄올 및 이소프로필 알코올과 같은 알코올, 디옥산, 디에틸 에테르, 테트라하이드로퓨란, 에틸렌글리콜 모노메틸 에테르, 에틸렌글리콜 디메틸 에테르와 같은 에테르, 아세트산과 같은 카르복시산, 디메틸포름아미드, 디메틸 설폭사이드, 아세토니트릴, 피리딘 또는 헥사메틸 포스포릭 트리아미드이다.

반응 온도는 매우 넓은 범위 내에서 변동될 수 있다. 보통, 상기 온도는 20℃ 내지 150℃이다. 바람직하게는, 상기 온도는 선택된 용매의 비등점이다.

상기 반응은 대기압 또는 그보다 높은 압력 하에서 수행될 수 있다. 통상적으로는 대기압 하에서 수행된다.

상기 반응은 산이나 알칼리를 사용하거나 사용하지 않고 수행될 수 있다. 아세트산, 포름산 등과 같은 약산의 존재 하에서 상기 반응을 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예는, A) 하나 이상의 상기 디하이드로피리미딘 및 B) 상기 A)와는 상이한 하나 이상의 다른 항바이러스제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 특정한 실시예는, A) 상기 디하이드로피리미딘, B) HBV 폴리머라아제 억제제, 및 적절한 경우에, C) 면역조절제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 면역조절제(C)는, 예를 들면, α-인터페론, β-인터페론 및 γ-인터페론, 특히 α-2a-인터페론 및 α-2b-인터페론과 같은 모든 인터페론, 인터류킨-2와 같은 인터류킨, 티모신-α-1 및 티목토난과 같은 폴리펩티드, 레바미졸과 같은 이미다조퀴놀린 유도체, 면역 글로불린 및 치료용 백신으로부터 선택된다.

이로써, 본 발명은 또한 HBV 감염을 치료하고 예방하기 위한 조성물, 및 HBV에 의해 유도되는 질환의 치료에 사용되는 그의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 조합을 이용하면, 개별적 화합물에 의한 단일요법(monotherapy)에 비해 HBV-유도성 질환의 치료를 위한 매우 유용한 이점, 즉 원칙적으로 상승작용을 가진 항바이러스 활성이 제공될 뿐 아니라, Tox-50(50%의 세포가 생존하는 독성의 범위)에서의 본 발명의 조합의 양호한 내약성(tolerability)이 제공된다.

[0034]

본 발명의 목적에서 HBV 폴리머라아제 억제제 B로 지칭되는 물질은 Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol 36(No. 12), 2688(1992)에서 Ph. A. Furman 등이 발표하고 이하에 기재되어 있는 내인성 폴리머라아제 분석에서, 최대 50%의 활성이 제로 값을 초래하도록, HBV DNA 이중 스트랜드(double strand)의 형성을 억제하는 것들이다.

본 발명에서 사용되는 HBV 폴리머라아제 억제제 B는, Ph. A Furman에 의한 "Antimicrobial Agents and Chemotherapy' Vol. 36(No. 12), 2688(1992)에 발표되어 있는 내인성 폴리머라아제 실험에 개시되어 있는 물질 및 이하에서 이중-스트랜드화 HBV DNA의 형성을 억제함으로써 최대 50%의 활성이 제로 값을 가져오는 물질이다.

배양 상청액(supernatant)으로부터의 HBV 비리온(virion)은 시험관 내에서 HBV DNA의 플러스 스트랜드 내로 뉴클레오사이드 5'-트리포스페이트를 결합시킨다. 아가로오스 겔 전기영동을 이용함으로써, [α-³²P]-데옥시뉴클레오사이드 5'-트리포스페이트를 바이러스의 3.2kb DNA 생성물 내로 결합시키는 것은 잠재적으로 HBV 폴리머라아제-억제 성질을 가지는 물질의 존재 및 부재 하에서 관찰된다. HBV 비리온은 폴리에틸렌글리콜을 사용한 침전에 의해 HepG2.2.15 세포의 배양 상청액으로부터 얻어지고, 농축된다. 투명화된 세포 배양액 상청액 1체적부는 체적비로 1/4의 50중량부의 폴리에틸렌 글리콜 8000 및 0.6M 염화나트륨을 함유하는 수용액과 혼합된다. 비리온은 2500×g/15분으로 원심분리함으로써 침강된다. 침강물은 0.05M 트리스-HCl(pH 7.5)을 함유하는 완충액 2ml 중에 재현탁되고, 100mM 염화칼륨을 함유하는 동일한 완충액에 대해 투석된다. 상기 샘플은 -80℃에서 동결될 수 있다. 각각의 반응 혼합물(100㎕)은 적어도 105 HBV 비리온; 50mM 트리스-HCl(pH 7.5); 300mM 염화칼륨; 50mM 염화마그네슘; 0.1% Nonident P-40(Boehringer Mannheim사 제조 비이온성 세제); 10μM dATP, 10μM dGTP, 10μM dTTP; 10μCi[³²P]dCTP(3000 Ci/mmol; 최종 농도 33nM) 및 트리포스포릴화 형태의 잠재적 폴리머라아제 억제제 1μM을 함유한다. 샘플을 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음, EDTA 50mM을 가함으로써 반응을 정지시킨다. 1체적%(총 체적 기준으로)의 최종 농도로 10% 중량/체적 SDS 용액(물 90ml당 10g의 SDS 함유)을 가하고, 1mg/ml의 최종 농도로 단백질 분해 효소 K를 가한다. 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 동일한 체적의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(체적비 25:24:1)로 샘플을 추출하고, 에탄올을 사용하여 수상으로부터 DNA를 침전시킨다. DNA 펠릿을 겔 버퍼(물 1리터 중의 트리스 10.8g, 붕산 5.5g 및 EDTA 0.75g의 용액(=TBE 완충액)) 10㎕ 중에 재현탁하고, 아가로오스 겔 중에서 전기영동에 의해 분리한다. 겔이 건조되거나, 그 안에 존재하는 핵산이 Southern 전사 기법에 의해 멤브레인으로 전사된다. 이어서, 네거티브 컨트롤(= 물질을 사용하지 않거나, 비활성 컨트롤 물질을 사용한 엔도-폴 반응(endo-pol reaction))에 대하여 형성된 표지된 DNA 이중 스트랜드의 양을 측정한다. 네거티브 컨트롤의 활성의 최대 50%의 활성이 존재한다면 HBV 억제제가 존재한다.

바람직한 HBV 폴리머라아제 억제제 B)는, 예를 들면, 3TC=라미부딘=4-아미노-1-[(2R-시스)-2-(하이드록시메틸)-1,3-옥사티올란-5-일-]-피리미딘-2(1H)-온(참고문헌: EP-B 382 526(=미국 특허 제5,047,407호) 및 WO 91/11186(=미국 특허 제5,204,466호)); 아데포비르 디피복실(Adefovir dipivoxil)=9-{2-[[비스[(피발로일옥시)-메톡시]-메톨시]-포스피닐]-메톡시]-에틸}-아데닌(참고문헌: EP-B 481 214(=미국 특허 제5,663,159호 및 제5,792,756호), 미국 특허 제4,724,233호 및 제4,808,716호); BMS 200475=[1S(1-α,3-α,4-β)]-2-아미노-1,9-디하이드로-9-[4-하이드록시-3-(하이드록시메틸)-2-메틸렌-시클로펜틸]-6H-퓨린-6-온(참고문헌: EP-B 481 754(=미국 특허 제5,206,244호 및 제5,340,816호), WO 98/09964 및 99/41275); 아바카비르(Abacavir)=(-)-(1S-시스)-4-[2-아미노-6-(시클로프로필아미노)-9H-퓨닐-9-일]-2-시클로펜텐-1-메탄올(참고문헌: EP-B 349 242(=미국 특허 제5,049,671호) 및 EP-B 434 450(=미국 특허 제5,034,394)); FTC=(2R-시스)-4-아미노-5-플루오로-1-[2-(하이드록시메틸)-1,3-옥사티올란-5-일]-피리미딘-2(1H)-온(참고문헌: WO 92/14743(미국 특허 제5,204,466호, 제5,210,085호, 제5,539,116호, 제5,700,937호, 제5,728,575호, 제5,814,639호, 제5,827,727호, 제5,852,027호, 제5,892,025호, 제5,914,331호, 제5,914,400호) 및 WO 92/18517); β-L-FDDC=5-(6-아미노-2-플루오로-9H-퓨린-9-일)-테트라하이드로-2-퓨란메탄올(참고문헌: WO 94/27616(=미국 특허 제5,627,160호, 제5,561,120호, 제5,631,239호 및 제5,830,881호)); L-FMAU=1-(2-데옥시-2-플루오로-β-L-아라비노프라노실)-5-메틸-피리미딘-2,4(1H,3H)-디온(참고문헌: WO 99/05157, WO 99/05158 및 미국 특허 제5,753,789호)를 포함한다.

[0038]

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예는 A) 식(I) 및 (Ia)로 표시되는 상기 디하이드로피리미딘; 및 B) 라미부딘을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

다른 바람직한 HBV 항바이러스제 B는, 예를 들면 하기 식의 페닐프로펜아미드를 포함한다:

식에서, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로, C₁ _-4 알킬 또는 이것들이 위치한 질소 원자와 함께 탄소 및/또는 산소를 포함하는 5∼6개의 원자를 가진 환을 형성하고; R³ 내지 R¹²는 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, C₁ _-4 알킬, 선택적으로 치환된 C₁ _-4 알콕시, 니트로, 시아노, 또는 트리플루오로메틸이고; R¹³은 수소, C₁ _-4 알킬, C₁ _-7 아실 또는 아랄킬이고, X는 할로겐 또는 선택적으로 치환된 C₁ _-4 알킬이다.

페닐프로필아미드 및 그의 제조 방법은 WO 98/33501에 개시되어 있고, 여기서 공개적으로 언급되어 있다. AT-61은 하기 식의 화합물이다:

.

바람직한 면역조절제 C)는, 예를 들면, α-, β- 및 γ-인터페론, 특히 α-2a-인터페론 및 α-2b-인터페론과 같은 모든 인터페론, 인터류킨-2와 같은 인터류킨, 티모신-α-1 및 티목토난과 같은 폴리펩티드, 레바미졸(Levamisole^®)과 같은 이미다조퀴놀린 유도체, 면역 글로불린 및 치료용 백신을 포함한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예는, A) 상기 디하이드로피리미딘(I) 및 (Ia), B) 라미부딘 및, 적절한 경우에, C) 인터페론의 조합물에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 효과적인 항바이러스 효과를 나타내는 화합물을 제조할 수 있으며, 상기 화합물은 본 발명의 방법에 따라, 또는 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법에 따라, 바이러스에 의해 유도된 질환, 특히 급성 및 만성의 지속적 HBV 감염의 치료에 이용될 수 있다.

테스트에 대한 설명

B형 간염 바이러스에 대한 본 발명의 화합물의 항바이러스 작용은 참고문헌 M.A. Sells et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 84, 1005-1009(1987) 및 B.E. Korba et al., Antiviral Research 19, 55-70(1992)에 기재된 바에 의거한 방법에 의해 조사한다.

항바이러스 테스트는 96-웰의 마이크로타이터(microtiter) 플레이트에서 수행된다. 상기 플레이트의 제1 수직열에는 성장 배지(growth medium)와 HepG2.2.15 세포만이 주입된다. 이것은 바이러스 대조군 역할을 한다.

우선, 테스트 화합물의 원액(stock solution)(50mM)을 DMSO에 용해하고, HepG2.2.15 성장 배지로 추가로 희석한다. 본 발명에 따른 화합물은 보통 100μM의 테스트 농도(1차 테스트 농도)로 피펫 채취되어 마이크로타이터 플레이트의 제2 수직형 테스트 열로 이송되고, 이어서 성장 배지와 여기에 첨가된 2중량%의 소 태아 혈청(체적 25㎕) 중에 2단계 공정으로 210배로 희석된다.

이렇게 해서 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰은 성장 배지와 여기에 첨가된 2중량%의 소 태아 혈청 중에 225㎕의 HepG2.2.15 세포 현탁액(5×10⁴ 세포/ml)을 함유한다. 상기 테스트 혼합물을 37℃, 5% CO₂(v/v)에서 4일간 배양시킨다.

이어서, 상청액을 흡입하여 제거하고, 새로 제조된 성장 배지 225㎕를 웰에 주입한다. 본 발명에 따른 화합물은 각각 25㎕의 체적으로 10배 농축된 용액으로서 새로 첨가된다. 혼합물을 추가로 4일간 배양한다.

항바이러스 효과를 판정하기 위해 상청액을 수거하기 전에, HepG2.2.15 세포에 대해 광 현미경 하에서, 또는 생화학적 검출 방법(예를 들면 Alamar Blue 착색(stain) 또는 Trypan Blue 착색)에 의해 세포독성 변화 여부를 검사한다.

이어서, 상청액 및/또는 세포를 수거하고, 진공을 이용하여 나일론 멤브레인으로 커버된 96-웰 도트-블롯(dot-blot) 챔버 상에 흡입한다(제조자의 지침에 따라).

세포독성( cytotoxicity ) 측정

HepG2.2.15 세포에서의 물질 유도성 독성 변화 또는 세포증식 억제의 변화(cytostatic change)를, 예를 들면 광 현미경 하에서 세포 형태(morphology)의 변화로서 검출한다. 미처리 세포와 비교하여 HepG2.2.15 세포에서의 그러한 물질 유도성 변화는, 예를 들면, 세포분해(cytolysis), 공포형성(vacuolation) 또는 변경된 세포 형태로서 관찰될 수 있다. 50% 세포독성(Tox.-50)이란 50%의 세포가 대응하는 세포 대조군과 대등한 형태를 나타낸다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 화합물 중 일부의 내약성을 다른 숙주 세포, 예를 들면 HeLa 세포, 1차 인간 말초혈액 세포 또는 H-9 세포와 같은 형질변환된 세포주 등에 대해 추가로 테스트한다.

본 발명의 화합물의 농도 ＞10μM 에서 세포독성의 변화가 검출되지 않는다.

항바이러스 작용의 측정

상청액 또는 용해된 세포(lysed cell)가 블롯팅 장치(상기 참조)의 나일론 멤브레인에 전사된 후, HepG2.2.15 세포의 세포내 또는 세포외 상청액을 변성시키고(1.5M NaCl/0.5N NaOH), 중화하고(3M NaCl/0.5M Tris HCl, pH 7.5), 세척한다(2×SSC). 이어서, 120℃에서 2∼4시간 동안 필터를 배양함으로써 DNA를 상기 멤브레인 상에서 베이킹(baking)한다.

DNA 하이브리드화( hybridization )

나일론 필터 상의 처리된 HepG2.2.15 세포로부터 바이러스성 DNA를 검출하는 것은 통상적으로 비방사성, 딕옥시게닌(digoxigenin)-표지된 B형 간염 특이성 DNA 프로브에 의해 수행되고, 그 각각은 딕옥시게닌으로 표지되고, 정제되어 제조자의 지침에 따라 하이브리드화용으로 사용된다.

예비하이브리드화(prehybridization) 및 하이브리드화는 5×SSC, 1×블록킹제, 0.1중량% N-라우로일사르코신, 0.05중량% SDS 및 100㎍의 헤링 정액(herring sperm) DNA 중에서 실시된다. 예비하이브리드화는 60℃에서 30분간 이루어지고, 특이적 하이브리드화는 20∼40ng/ml의 딕옥시겐화되고 변성된 HBV-특이적 DNA(14시간, 60℃)를 사용하여 실시된다. 이어서, 필터를 세척한다.

딕옥시게닌 항체에 의한 HBV - DNA 의 검출

딕옥시게닌-표지된 DNA의 면역학적 검출은 제조자의 지침에 따라 실시된다.

필터를 세척하고, 블록킹제 중에서 예비하이브리드화시켰다(제조자의 지침에 따라). 이어서, 알칼리성 포스파타아제에 결합된 항-DIG 항체를 사용하여 30분간 하이브리드화를 수행했다. 세척 단계 후, 알칼리성 포스파타아제의 기질인 CSPD를 첨가하고, 필터와 함께 5분간 배양한 다음, 플라스틱 필름 내에 포장하여 37℃에서 추가로 15분간 배양했다. 상기 필터를 X선 필름에 노출시킴으로써, B형 간염-특이적 DNA 신호의 화학발광(chemiluminescence)을 가시화했다(배양은 신호 강도에 의존함: 10분 내지 2시간).

최대치 절반의 억제 농도(IC₅₀, 50% 억제 농도)를, 본 발명에 따른 화합물에 의해 세포내 또는 세포외 B형 간염-특이적 밴드가 미처리 샘플에 비해 50% 만큼 감소되는 농도로서 판정했다.

본 발명의 화합물이 1nM 미만의 IC₅₀으로 효과적인 항바이러스 효과를 나타낸다는 것은 예상 밖이다. 따라서, 본 발명의 화합물은 바이러스에 의해 유도된 질환, 특히 급성 및 만성의 지속적 HBV 감염의 치료에 사용하기에 적합하다. HBV에 의해 유도된 만성 바이러스성 질환은 이환율(morbidity)을 악화시킬 수 있으며, 만성적 B형 간염 바이러스 감염은 많은 경우에 간경변 및/또는 간세포 암종을 유발할 수 있다.

본 발명의 화합물에 있어서 언급할 수 있는 적응(indication) 영역은, 예를 들면, B형 간염 바이러스에 의한 감염과 같은 전염성 간염을 초래할 수 있는 급성 및 만성 바이러스성 감염의 치료이다. 본 발명의 화합물은 특히 만성적 B형 간염의 치료 및 급성 및 만성 B형 간염 바이러스 감염의 치료에 적합하다.

본 발명은, 무독성이고 비활성인 약학적으로 적합한 캐리어 이외에, 하나 이상의 화합물(I) 또는 (Ia) 또는 본 발명의 조합물을 포함하는 약학적 제제, 또는 하나 이상의 활성 성분(I) 또는 (Ia) 또는 본 발명의 조합물로 구성되는 약학적 제제를 포함한다.

활성 성분(I) 및 (Ia)는, 전체 혼합물의 약 0.1∼99.5중량%, 바람직하게는 약 0.5∼95중량%의 농도로 전술한 약학적 제제에 존재하도록 설계된다.

전술한 약학적 제제는 또한 화합물(I) 및 (Ia)과는 별도로 다른 활성을 가진 약학적 성분들을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물 중 성분 A, B 및 적절한 경우에 성분 C의 양적 비율은 넓은 범위 내에서 변동될 수 있고; 바람직하게는 5∼500mg의 A/10∼1000mg의 B, 특히 10∼200mg의 A/20∼400mg의 B이다.

적절한 경우에 사용될 수 있는 성분 C는 바람직하게는 1백만∼1천만 I.U.(international unit), 특히 2백만∼7백만 I.U.의 양으로, 1년 이내의 기간에 걸쳐 1주일에 약 3회로 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물 또는 조성물은, 전체 혼합물의 약 0.1∼99.5중량%, 바람직하게는 약 0.5∼95중량%의 농도로 전술한 약학적 제제에 존재하도록 설계된다.

전술한 약학적 제제는 공지된 방법, 예를 들면 활성 성분(들)을 캐리어(들)과 혼합함으로써 종래의 방식으로 제조될 수 있다.

상기 활성 성분(들)은 인체용 약물과 동물용 약물 모두에 있어서 원하는 결과를 얻기 위해서, 24시간마다 약 0.5 내지 약 500mg/체중 kg, 바람직하게는 1 내지 100mg/체중 kg의 총량으로, 적절한 경우에는 복수회의 단일 복용량 형태로, 투여하는 것이 유리하다고 일반적으로 입증되었다. 단일 복용량은 상기 활성 성분(들)을 바람직하게는 약 1 내지 약 80mg/체중 kg, 특히 1 내지 30mg/체중 kg의 양으로 함유한다. 그러나, 특히 치료할 대상의 종과 체중, 질환의 성질과 중증도, 약물의 제조 형태와 투여 방식, 및 투여가 실시되는 시간 또는 시간간격에 따라서, 전술한 복용량을 벗어날 필요가 있을 수 있다.

따라서, 본 발명은 추가로 질환의 조절을 위한 전술한 화합물 및 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 하나 이상의 전술한 화합물 또는 조성물, 및 적절한 경우에, 하나 이상의 다른 활성을 가진 약학적 성분(들)을 포함하는 약물에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 전술한 질환, 바람직하게는 바이러스성 질환, 특히 B형 간염의 치료 및 예방을 위한 약물의 제조에서의 전술한 화합물 및 조성물의 용도에 관한 것이다.

이하의 실시예에 제시되는 퍼센트 데이터는 각각의 경우에 달리 적시되지 않는 한 중량 기준이다. 용매 혼합물 중 용매들의 비는 각각의 경우에 체적 기준이다.

실시예

A. 중간체의 제조

중간체 1

에틸 4-(2-브로모-4-플루오로페닐)-2-(티아졸-2-일)-6-메틸-1,4-디하이드로피리미딘-5-카르복실 에스테르

2-브로모-4-플루오로벤즈알데히드 10.0g(49.3mmol), 에틸 아세토아세테이트 6.4g(49.3mmol), 2-아미디노-티아졸 하이드로클로라이드 8.1g(49.3mmol) 및 아세트산나트륨 4.8g(58.5mmol)의 혼합물을 에탈올 400ml 중에 용해 또는 현탁시킨 다음, 가열하여 16시간 동안 환류시켰다. 얻어진 용액을 실온까지 냉각시키고 여과했다. 잔류물을 물로 세척하여 무기염을 제거했다. 생성물 10.8g(51.6%)을 얻었다. 융점: 163∼165℃.

중간체 2

메틸 4-(2-브로모-4-플루오로페닐)-2-(티아졸-2-일)-6-메틸-1,4-디하이드로피리미딘-5-카르복실 에스테르

중간체 1의 제조 방법과 같은 방법으로, 메틸 아세토아세테이트로부터 중간체 2를 합성했다. 수율: 53%(융점: 155∼157℃).

중간체 3

에틸 6-브로모메틸-4-(2-브로모-4-플루오로페닐)-2-(티아졸-2-일)-1,4-디하이드로피리미딘-5-카르복실 에스테르

중간체 1 5.0g(11.8mmol)을 사염화탄소 100ml 중에 가하고, 아르곤 가스 분위기에서 50℃로 가열하여 투명한 용액을 얻었다. 이 온도에서, N-브로모숙신이미드 2.33g(13.0mmol)을 상기 용액 내에 가하고, 상기 온도에서 10분간 혼합했다. 얻어진 용액을 즉시 냉각시키고, 실온에서 여과하고, 감압하여 농축했다. 얻어진 생성물은 HPLC의 테스트 결과에 따라 90%보다 높은 순도를 가졌으며, 다음 단계에서의 원료로서 사용되었다. Rf=0.69(석유 에테르:에틸 아세테이트 = 8:2).

중간체 4

메틸 6-브로모메틸-4-(2-브로모-4-플루오로페닐)-2-(티아졸-2-일)-1,4-디하이드로피리미딘-5-카르복실 에스테르

중간체 3의 제조 방법과 같은 방법으로, 중간체 2로부터 중간체 4를 합성했다. Rf=0.69(석유 에테르:에틸 아세테이트 = 8:2).

B. 예시 화합물의 제조

실시예 5

에틸 4-(2-브로모-4-플루오로페닐)-2-(티아졸-2-일)-6-(4-모르폴리닐메틸)-1,4-디하이드로피리미딘-5-카르복실 에스테르

중간체 2 2.0g을 메탄올 15ml 내에 가하여 용액을 형성했다. 상기 용액을 5배의 모르폴린과 혼합하고, 실온에서 30분간 교반했다. 얻어진 용액을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다. 수율: 1.7g. 융점: 161∼163℃. Rf=0.45(석유 에테르:에틸 아세테이트 = 8:2).

실시예 6

메틸 4-(2-브로모-4-플루오로페닐)-2-(티아졸-2-일)-6-(4-모르폴리닐메틸)-1,4-디하이드로피리미딘-5-카르복실 에스테르

실시예 5의 제조 방법과 같은 방법으로, 중간체 4로부터 실시예 6의 화합물을 합성했다. 융점: 173∼175℃. Rf=0.43(석유 에테르:에틸 아세테이트 = 8:2).

실시예 5 및 실시예 6에서 제조된 거울상 이성체를 카이랄 컬럼(Daicel Chiralpak AS-H, 이동상: n-헥산/에탄올=99/1)에서 분리했다.

상기 두 실시예의 항-HBV 활성 화합물은 비교적 긴 체류 시간을 가지는 거울상 이성체이다.

본 발명의 화합물의 활성 데이터를 아래에 수록한다:

본 발명의 화합물에 의한 B형 간염 바이러스를 생성하는 HepG2.2.15 세포의 치료는 세포내 및/또는 세포외 바이러스성 DNA의 감소를 가져올 수 있다.

[산업상 이용가능성]

본 명세서에 개시된 실시예들은 본 명세서에 개시된 화합물들이 1nM 미만의 IC₅₀으로 효과적인 항바이러스 효과를 나타낸다는 것을 입증한다. 따라서, 상기 화합물은 본 발명의 방법에 따라, 또는 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법에 따라, 바이러스에 의해 유도된 질환, 특히 급성 및 만성의 지속적 HBV 감염의 치료에 이용될 수 있다.

Claims

하기 식(I)으로 표시되는 화합물 또는 그의 이성체(Ia) 또는 거울상 이성체(enantiomer) 및 그의 염:

식에서, R¹은 o-브롬이고, R²는 p-플루오르이고, R³은 C₁-C₄ 알킬이고, R⁶은 티아졸-2-일이고, X는 메틸렌이고, Z는 모르폴리닐임.
제1항에 있어서,
R¹은 o-브롬이고, R²는 p-플루오르이고, R³은 메틸 또는 에틸이고, R⁶은 티아졸-2-일이고, X는 메틸렌이고, Z는 모르폴리닐인 화합물, 그의 거울상 이성체 및 그의 염.
하기 구조 중 하나를 가지는 화합물 및 거울상 이성체, 호변이성체(tautomer) 또는 그의 염:
하기 단계를 포함하는, 제1항에 따른 화합물의 제조 방법:
[A] 식(II)으로 표시되는 벤즈알데히드를, 식(III)으로 표시되는 β-케토에스테르와 반응시켜 식(IV)으로 표시되는 벤질리덴 화합물을 제조하고:

(식에서, R¹, R², R³, X 및 Z는 제1항에 기재된 바와 같음),
식(IV)으로 표시되는 상기 벤질리덴 화합물을 식(V)으로 표시되는 아미딘 또는 그의 염 또는 식(V)으로 표시되는 화합물과 반응시키는 단계:

(식에서, R⁶은 제1항에 기재된 바와 같음);
[B] 식(III)으로 표시되는 상기 화합물을 알데히드(II) 및 아미딘(V) 또는 그의 염 또는 식(V)으로 표시되는 상기 화합물과 1단계(one step)로 반응시키는 단계;
[C] 식(I)에서의 X가 메틸렌인 경우, 식(VI)으로 표시되는 화합물을 모르폴린(VII) 또는 그의 염과 반응시키는 단계:

(식에서, R¹, R², R³ 및 R⁶은 전술한 바와 같고, Y는 친핵성 치환체임), 및
[D] 식(II)으로 표시되는 상기 벤즈알데히드를 식(X)으로 표시되는 화합물 및 식(V)으로 표시되는 아미딘 또는 그의 염과 반응시키는 단계:

(식에서, R³, X 및 Z는 제1항에 기재된 바와 같음).
하기 식(XII)으로 표시되는 화합물:

식에서, R¹, R², R³ 및 R⁶은 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같고, 상기 화합물은 화합물(I) 또는 (Ia)을 합성하기 위한 중간체로서 사용됨.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
질환을 조절하기 위한 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 화합물, 및 적절한 경우에, 다른 약학적 활성 물질을 추가로 포함하는 약물(medicament).
바이러스성 질환의 치료 및 예방을 위한 약물의 제조에 사용되는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
B형 간염의 치료 및 예방을 위한 약물의 제조에 사용되는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
제1항에 따른 화합물의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염의 치료 방법.
제1항에 따른 화합물의 유효량을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염에 의해 야기된 질환의 치료 방법.
제11항에 있어서,
상기 질환이 간염인, 치료 방법.
제11항에 있어서,
상기 질환이 간경변인, 치료 방법.
제11항에 있어서,
상기 질환이 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)인, 치료 방법.
제1항에 따른 하나 이상의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약학적 조성물.
하기 성분을 포함하는 조성물:
A) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 디하이드로피리미딘 화합물,
B) 상기 성분 A와는 상이한 하나 이상의 HBV 항바이러스제, 및
적절한 경우에,
C) 하나 이상의 면역조절제.
제16항에 있어서,
상기 성분 B가 HBV 폴리머라아제 억제제인, 조성물.
제16항에 있어서,
상기 성분 B가 라미부딘(lamivudine)인, 조성물.
제16항에 있어서,
상기 성분 B가 하기 식으로 표시되는 화합물 및 그의 염으로부터 선택되는, 조성물:

식에서,
R¹ 및 R²는 각각 독립적으로, C₁ _-4 알킬 또는 이것들이 위치한 질소 원자와 함께 탄소 및/또는 산소를 포함하는 5∼6개의 원자를 가진 환을 형성하고;
R³ 내지 R¹²는 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, C₁ _-4 알킬, 선택적으로 치환된 C₁ _-4 알콕시, 니트로, 시아노, 또는 트리플루오로메틸이고;
R¹³은 수소, C₁ _-4 알킬, C₁ _-7 아실 또는 아랄킬이고,
X는 할로겐 또는 선택적으로 치환된 C₁ _-4 알킬임.
제19항에 있어서,
상기 화합물이 하기 구조를 가지는, 조성물:
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역조절제가 인터페론을 포함하는, 조성물.
하기 성분을 포함하는 조성물:
A) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 디하이드로피리미딘 화합물,
B) 라미부딘, 및
적절한 경우에,
C) 인터페론.
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 제조 방법으로서,
성분 A, 성분 B 및, 적절한 경우에, 성분 C를 적절한 방식으로 조합 또는 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
질환의 조절을 위한 조성물.
제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 조성물, 및 적절한 경우에, 다른 약학적 활성 물질을 포함하는 약물.
바이러스성 질환의 치료 및 예방을 위한 약물의 제조에 사용되는, 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
B형 간염의 치료 및 예방을 위한 약물의 제조에 사용되는, 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.