PT2018858E - Composições e métodos para o tratamento de doenças neoplásicas primárias e metastáticas usando compostos de arsénio - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS NEOPLÁSICAS PRIMÁRIAS E METASTÁTICAS USANDO COMPOSTOS DE ARSÉNIO"

1. ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com métodos e composições para o tratamento de um tumor sólido seleccionado a partir do grupo que consiste em cancro da mama, do cólon, do ovário, renal, da bexiga, da próstata e do pulmão. Na prática do tratamento do cancro, são usadas composições contendo trióxido de arsénio para controlar ou reverter o desenvolvimento neoplásico.

Mais especificamente, a presente invenção relaciona-se com novos métodos quimioterapêuticos - novos usos do trióxido de arsénio para tratar um tumor sólido seleccionado a partir do grupo de cancro da mama, do cólon, do pulmão, do ovário, da bexiga, renal, da próstata e do pulmão.

2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Em 1997, mais de um milhão de pessoas vai desenvolver algum tipo de cancro nos Estados Unidos. Aproximadamente 500.000 vão estar curadas ou em estado de remissão. Estes números representam uma melhor taxa de cura ao longo da última década que é grandemente devida à detecção precoce, melhor tratamento e avanços na quimioterapia. Em particular, os avanços na quimioterapia incluem terapia com fármacos dirigidos ou específicos em que um fármaco é desenvolvido especificamente para o tratamento de um certo tipo de cancro. Esta abordagem "orientada para a doença" é concebida para identificar compostos que exerçam efeitos selectivos in vitro em tipos de tumores específicos e fazer 2 o seguimento destas pistas in vivo utilizando linhas celulares, (Fiebig et al., Câncer Treatment Reviews 17:109-117 (1990) . No entanto, a incidência de cancro continua a crescer à medida que a nossa população envelhece e que novos cancros se desenvolvem ou ocorrem mais frequentemente, tal como em doentes infectados com o vírus da SIDA. Assim, é evidente que há uma imensa necessidade de regimes adicionais para tratar doentes com cancro. 2.1. Patologia do Cancro O cancro é caracterizado primariamente por um aumento no número de células anormais derivadas de um determinado tecido normal, invasão dos tecidos adjacentes por estas células anormais, e dispersão das células malignas através do sangue ou da linfa para os gânglios linfáticos regionais e para sítios distantes (metástases). Dados clínicos e estudos de biologia molecular indicam que o cancro é um processo de múltiplos passos que começa com alterações pré-neoplásicas menores, que podem, sob determinadas circunstâncias progredir para neoplasia. O crescimento de células anormais pré-malignas é exemplificado por hiperplasia, metaplasia, ou o mais particularmente, displasia (para revisão dessas condições de crescimento anormal, ver Robbins e Angell, 1976, Basic Pathology, 2a Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79) . A hiperplasia é uma forma de proliferação celular controlada envolvendo um aumento no número de células num tecido ou órgão, sem alteração significativa na estrutura ou função. Mas como um exemplo, a hiperplasia endometrial precede frequentemente o cancro do endométrio. A metaplasia é uma forma de crescimento celular controlado no qual um tipo de células adultas ou completamente diferenciadas substitui outro tipo de células adultas. A metaplasia pode 3 ocorrer em células do tecido epitelial ou conectivo. A metaplasia atípica envolve um epitélio metaplásico algo desordenadamente. A displasia é frequentemente um precursor do cancro, e é encontrada principalmente nos epitélios; é a forma mais desordenada de crescimento celular não neoplásico, envolvendo uma perda da uniformidade individual das células e da orientação arquitetónica das células. As células displásicas têm frequentemente núcleos anormalmente grandes e carregadamente corados, e apresentam pleomorfismo. A displasia ocorre caracteristicamente quando existe irritação ou inflamação crónica, e é frequentemente encontrada no cérvix, vias respiratórias, cavidade oral e vesícula biliar. A lesão neoplásica pode desenvolver-se clonalmente e desenvolver uma capacidade aumentada de invasão, crescimento, metástase, e heterogeneidade, especialmente sob condições nas quais as células neoplásicas escapam à vigilância imunológica do hospedeiro (Roitt, I., Brostoff, J e Kale, D., 1993, Immunology, 3a ed., Mosby, St. Louis, pps. 17.1-17.12) . 2.4. Cancros da Mama, do Pulmão, da Bexiga e da Próstata

Sabe-se que o cancro da mama ocorre em cerca de uma em cada 8-9 mulheres nos Estados Unidos. 0 tratamento para cancro da mama precoce é a cirurgia, com ou sem radioterapia, ou cirurgia, com ou sem radioterapia, com quimioterapia e/ou terapia hormonal. Mesmo apesar dos grandes esforços dos médicos, há ainda mais de 80.000 mortes por ano de cancro da mama e a incidência ainda está a aumentar. A quimioterapia actual para doentes com cancro da mama primário ou metastático inclui tratamento com ciclofosfamida, metotrexato, doxorubicina, 5-fluororacilo, cisplastina, vinblastina, taxol, taxotere, mitomicina C e 4 ocasionalmente outros agentes. Infelizmente, mesmo com estes agentes, quase todas as mulheres que desenvolvem cancro da mama metastático não resistem à doença. Um local particular onde o cancro da mama metastático metastiza é o sistema nervoso central. Quando ocorrem metástases no sistema nervoso central, o tratamento comum é a cirurgia (para uma única metástase) ou radiação, ou cirurgia com radioterapia. Actualmente, não há quimioterapia considerada útil nesta situação. 0 cancro do pulmão é responsável por mais de 150.000 mortes por ano nos Estados Unidos. A maior parte dos doentes com cancro do pulmão apresentam um tumor que já metastizou em vários órgãos, incluindo pulmão, figado, glândula supra-renal e outros órgãos. O actual tratamento para cancro do pulmão metastático ainda não está uniformizado (Ihde, Daniel C., "Chemoteraphy of Lung Câncer", The New England Journal of Medicine 327:1434-1441, 1992 Nobembro 12a edição). No entanto, os regimes de quimioterapia que são utilizados incluem tratamento com cisplatina e etoposido, combinações de ciclofosfamida com doxorubicina e com cisplatina, e agentes isolados ou em combinação, incluindo ifosfamida, teniposido, vindesina, carboplatina, vincristina, taxol, iperite de azoto, metotrexato, hexametilmelamina e outros. Apesar destes regimes quimioterapêuticos, em média um doente de cancro do pulmão metaestático só sobrevive 7-12 meses. Um local particularmente difícil para metástases do cancro do pulmão é o sistema nervoso central. O tratamento para metástase no sistema nervoso central inclui cirurgia (para remover uma lesão isolada), radioterapia, ou uma combinação de ambos. Infelizmente, não há quimioterapia padrão considerada útil nesta situação. 5

Cada ano, cerca de 11.000 doentes morrem de cancro da bexiga nos EUA. Embora na apresentação a doença seja normalmente localizada, a maior parte dos doentes desenvolve doença metastática distante. Os avanços mais recentes têm sido na área da quimioterapia para doentes com a doença metastática. Um regime eficaz é chamado o regime MVAC. Consiste no tratamento com metotrexato e vinblastina e adriamicina (doxorubicina) e cisplatina. Embora a taxa de resposta seja elevada com este regime quimioterapêutico, médicos oncologistas estão a notar que um local que falha são os doentes com as metástases no sistema nervoso central. Infelizmente, não existe quimioterapia padrão considerada útil nesta situação.

Estima-se que mais de 100.000 homens vão ser diagnosticados com cancro da próstata este ano e mais de 30.000 doentes vão morrer da doença. Os sítios mais comuns de metástases em doentes com cancro da próstata são o osso e os gânglios linfáticos. As metástases no osso são particularmente difíceis por poderem provocar dor intensa no doente. O tratamento actual para cancro da próstata metastático inclui tratamento com flutamida, leuprolida, dietilstilbestrol, e outras manipulações hormonais, assim como quimioterapia (doxorubicina, fosfato de estramustina, vinblastina, suramina, cisplatina, e outros). Infelizmente, nenhum destes agentes é consistentemente útil na doença. Adicionalmente, como os doentes com cancro da próstata vivem mais tempo com a sua doença maligna, vão provavelmente desenvolver uma maior incidência de metástases no sistema nervoso central (incluindo a espinal medula).

Em geral, como os doentes estão a viver mais tempo com as doenças malignas comuns tais como cancro da mama, cancro do 6 pulmão, cancro da bexiga, cancro da próstata e uma variedade de outras doenças malignas (devido ao controlo das suas doenças sistémicas com cirurgia, radioterapia e quimioterapia), os oncologistas estão a notar que estão a desenvolver uma maior incidência de tumores metastáticos no sistema nervoso central incluindo no cérebro. Isto é provavelmente devido ao facto de a maioria da quimioterapia actualmente disponível não passar a barreira hematoencefálica. Quando o doente (que tem o seu tumor controlado em sítios fora do cérebro) desenvolve metástases cerebrais, é uma situação muito difícil. Opções para esse doente são normalmente limitadas à cirurgia para uma metástase isolada e/ou radioterapia. No entanto, depois de essas modalidades falharem, normalmente o doente não tem outras opções.

Para cada uma das indicações acima (tumores cerebrais primários e metástases no cérebro provenientes de outros tumores comuns tais como cancros da mama, do pulmão, da bexiga e da próstata), há uma enorme necessidade de um tratamento mais eficaz e/ou métodos para melhorar a qualidade de vida do doente. 2.6. Arsénio e os Seus Usos Médicos 0 arsénio tem sido considerado como sendo um veneno e um fármaco desde há muito tempo na prática das medicinas Ocidental e Chinesa. No fim do século dezanove, o arsénio era usado frequentemente na tentativa de tratar doenças do sangue no Ocidente. Em 1878, foi relatado que o tratamento de um doente com leucemia com solução de Fowler (uma solução de arsenito de potássio) reduziu acentuadamente a contagem de glóbulos brancos no sangue (Cutle e Bradford, Am. J. Med. Sei., Janeiro 1878, 81-84). Outros interesses no uso da solução de Fowler como agente paliativo para 7 tratar leucemia mielogénica crónica (CML) foi descrito por Forkner e Scott em 1931 (J. Am, Med. Assoe., 1931, iii, 97) , e mais tarde confirmado por Stephens e Lawrence em 1936 (Ann. Intern. Med. 9, 1488-1502). Tipicamente, a solução de Fowler era administrada oralmente a doentes de leucemia como uma solução até que o nível de glóbulos brancos no sangue decrescesse até um nível aceitável ou até que se desenvolvessem toxicidades (tais como ceratose cutânea e hiperpigmentação), enquanto os doentes tinham períodos de remissão variáveis. Nos anos 60, a solução de Fowler ainda era usada ocasionalmente em tentativas de tratar CML, embora a maior parte dos doentes fosse tratada com outros agentes quimioterapêuticos, tais como busulfan, e/ou radioterapia (Monfardini et al., Câncer, 1973, 31:492-501) .

Paradoxalmente, um dos efeitos há muito reconhecidos da exposição ao arsénio, seja de origem ambiental ou medicinal, é cancro da pele (Hutchinson, 1888, Trans. Path. Soc. Lond., 39:352; Neubauer, 1947, Br. J. Câncer, 1: 192). Havia ainda dados epidemiológicos que sugeriam que o uso da solução de Fowler por longos períodos de tempo poderia conduzir a uma incidência aumentada de cancro em sítios internos (Cuzick et al., Br. J. Câncer, 1982, 45: 904-911; Kaspar et al., J. Am. Med. Assoe., 1984, 252:3407-3408). A carcinogenicidade do arsénio foi desde então demonstrada pelo facto de poder induzir aberrações cromossómicas, amplificação genética, trocas de cromátides irmãs e transformação celular (Ver e.g., Lee et al., 1988, Science, 241: 79-81; e Germolec el al., Toxicol. Applied Pharmacol., 1996, 141: 308-318). Devido ao efeito carcinogénico conhecido do arsénio, o seu único uso terapêutico em humanos na medicina Ocidental actual é no tratamento de doenças tropicais, tais como tripanossomíase africana, 8 (melarsoprol, ou Arsobal® da Rhône Poulenc Rorer, Collegeville, PA; Ver The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a edição, capítulo 66, 1659-1662, 1997 de Goodman & Gilman).

Na medicina tradicional chinesa, o ácido arsenioso ou pasta de trióxido de arsénio tem sido usado para tratar doenças da polpa do dente, psoríase, sífilis e reumatose (Chen et al., 1995, em Manual of Clinicai Drugs, Shanghai, China, Shanghai Institute of Science and Technology, p. 830). Nos anos 70, o trióxido de arsénio tinha sido aplicado experimentalmente para tratar leucemia promielocítica aguda (APL) na China (comentado por Mervis, 1996, Science, 273: 578). A eficácia clínica do trióxido de arsénio foi recentemente reinvestigada em 14 de 15 doentes com APL refractária em que o uso de uma dose intravenosa de 10 mg/dia durante 4-9 semanas foi registado como resultando na remissão morfológica completa sem supressão de medula óssea associada (Shen et al., 1997, Blood, 89: 3354-3360). Foi também relatado que o trióxido de arsénio induziu apoptose (morte celular programada) in vitro em células NB4, uma linha celular da APL, e que a apoptose estava aparentemente associada à sub-regulação do oncogene bcl-2, e redistribuição intracelular da proteína quimérica PML/RARa que só existem nas células de APL (Chen et al., 1996, Blood, 88: 1052-1061; Andre et al., 1996, Exp. Cell Res. 229: 253-260). De modo semelhante, o melarsoprol tem sido relatado como induzindo a apoptose em linhas celulares representativas de leucemia crónica das células B (Konig et al., 1997, Blood, 90: 562-570). Não é claro actualmente se a apoptose é induzida em doentes de APL, mas alguns acreditam que esse é um dos mecanismos possíveis dos efeitos terapêuticos de certos compostos de arsénio. 9

Embora o arsénio seja bem conhecido como sendo um veneno e um agente carcinogénico, há muitos relatos relativos ao uso do arsénio em tratamentos médicos.

Para além disso, da discussão anterior, deve ser evidente que há uma pletora de tipos diferentes de cancros, cada um dos quais requerendo um protocolo de tratamento único. Assim, o desenvolvimento de um agente anti-cancerigeno de largo espectro é extremamente desejável. No mínimo, são necessários agentes anti-cancerígenos eficazes adicionais para serem adicionados à panóplia contra o cancro.

3. RESUMO DA INVENÇÃO Não obstante as referências contraditórias na técnica em relação aos benefícios e riscos da administração de arsénio a doentes, os requerentes verificaram que o trióxido de arsénio tem uma larga aplicabilidade no tratamento de vários cancros. A presente invenção engloba trióxido de arsénio para uso no tratamento de um tumor sólido seleccionado a partir do grupo que consiste em cancro da mama, do cólon, do ovário, renal, da bexiga, da próstata e do pulmão.

De acordo com a presente invenção, o trióxido de arsénio pode ser usado sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos conhecidos (incluindo agentes quimioterapêuticos, radioprotectores e radioterapêuticos) ou técnicas para melhorar a qualidade de vida do doente, ou para tratar a doença neoplásica primária. Por exemplo, o trióxido de arsénio pode ser usado antes, durante ou depois da administração de um ou mais agentes anti-tumorais incluindo mas não se limitando a compostos iperite, iperite de azoto, clorambucil, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 10 5-fluorouracilo, floxuridina, metotrexato, vincristina, vinblastina, taxol, etoposido, temiposido, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, bleomicina, mitomicina, cisplatina, carboplatina, fosfato de estramustina, hidroxiureia, BCNU, procarbazina, VM-26 (vumon), interferões e ácido todo trans-retinóico (ATRA), (Ver por exemplo, Physician Desk References 1997). Adicionalmente, os compostos de arsénio podem ser usados antes, durante ou depois do tratamento de irradiação. Para o tratamento de indivíduos infectados com HIV, o trióxido arsénio pode ser usado sozinho ou em combinação com AZT, ddl, ddA, ddC, d4T, 3TC e outros agentes antivirais conhecidos.

Numa forma de realização particular, o trióxido de arsénio é usado num método para tratar cancro da mama, do pulmão, do cólon, do ovário, renal, da bexiga e da próstata administrando uma quantidade eficaz de trióxido de arsénio sozinho ou em combinação com outros agentes antineoplásicos ou técnicas terapêuticas incluindo radioterapia e cirurgia.

Sem estarem limitados por qualquer teoria, os inventores acreditam que o trióxido de arsénio da invenção pode ter um ou mais mecanismos de acção em ligação com os métodos aqui descritos. Por exemplo, o trióxido de arsénio pode actuar como um análogo fosforoso que interfere nos casos de fosforilação que ocorrem na transdução de sinal envolvida na apoptose. O arsénio pode também actuar como um inibidor da angiogénese, i.e., a formação de novos vasos sanguíneos, limitando desse modo o fluxo sanguíneo em massas celulares pré-neoplásicas em proliferação, tumores e metástases. É bem conhecido que, se um tumor não for invadido por capilares sanguíneos, irá depender da difusão de nutrientes provenientes das zonas à sua volta e não poderá aumentar para além de um certo tamanho. O arsénio pode também 11 funcionar como um agente diferenciador que provoca a divisão de células pré-neoplásicas e/ou células tumorais que apresentam um fenotipo indiferenciado ou pouco diferenciado a desenvolverem-se em células terminais diferenciadas, e morrem após um número finito de divisões celulares. Finalmente, o arsénio pode também actuar sensibilizando as células tumorais à radiação e/ou à quimioterapia. Deste modo, o trióxido de arsénio da invenção é descrito como sendo útil contra uma variedade de cancros.

Composições especificas da invenção e as suas propriedades são descritas nas secções e subsecções que se seguem.

4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1A-1I. Curvas de dose-resposta mostrando percentagem de crescimento de várias linhas de células tumorais após exposição continuada a 10‘5 até 10‘9 pg/mL de trióxido de arsénio durante 2 dias. Figura IA. Linhas de células leucémicas CCRF-CEM, HL-60 (TB), K-562, MOLT-4, RPMI-8226, SR. Figura 1B. Linhas de células tumorais de Não-Pequenas Células de Cancro do Pulmão A549/ATCC, EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H226, NCI-H23, NCI-8322M, NCI-H460, NCI-H522.

Figura 1C. Linhas celulares de Cancro do Cólon COLO 205, HCT-116, HCT-15, HT29, KM12, SW620. Figura 1D. Linhas celulares de Cancro do SNC SF-268, SF-295, SF-539, SNB-19, SNB-75, U251. Figura 1E. Linhas celulares de Melanoma LOX 1MV1, MALME-3M, M14, SK-MEL-2, SK-MEL-28, SK-MEL-5, UACC-257, UACC-62. Figura 1F. Linhas celulares de Cancro do Ovário IGROVl, OVCAR-3, OVCAR-5, OVCAR-8, SK-OV-3. Figura 1G. Linhas celulares de Cancro Renal A498, CAKI-1, RXE 393, SN12C, TX-10, UO-31. Figura 1H. Linhas celulares do Cancro da Próstata PC-3, DU-145. Figura II. Linhas celulares de 12

Cancro da Mama MCF7, NCI/ADR-RES, MDA-MB-435, MDA-N, BT- 549, T-47D.

Figura 2. Gráficos de médias mostrando os padrões de selectividade em cada um dos principais parâmetros de resposta para todas as linhas celulares testadas após exposição continua a IO"5 até IO"9 pg/mL de trióxido de arsénio durante 2 dias.

Figura 3A-3I. Curvas de dose-resposta mostrando a percentagem de crescimento de várias linhas de células tumorais após exposição continua a 10~5 até 10~9 pg/mL de trióxido de arsénio durante 6 dias. Figura 3A. Linhas de células leucémicas CCRF-CEM, K-562, MOLT-4, RPMI-8226. Figura 3B. Linhas celulares de não-pequenas células de

Cancro do Pulmão EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H226, NCI-H23, NCI-H322M, NCI-H460, NCI-H522. Figura 3C. Linhas celulares de Cancro do Cólon COLO 205, HCT-116, HCT-15, HT29, KM12, SW-620. Figura 3D. Linhas celulares de Cancro do SNC SF-268, SF-295, SF-539, SNB-75, U251. Figura 3E. Linhas celulares de melanoma LOX IMVI, MALMI-3M, SK-MEL-2, SK-MEL-28, SK-MEL-5, UACC-257, UACC-62. Figura 3F. Linhas celulares de Cancro do Ovário IGROVI, OVCAR-3, OVCAR-5, OVCAR-8, SK-OV-3. Figura 3G. Linhas celulares de Cancro Renal 786-0, A498, CAKI-1, RXF 393, S12C, TK-10. Figura 3H. Linhas celulares de Cancro da Próstata DU-145. Figura 31. Linhas celulares de Cancro da Mama MCF7, NCI/ADR-RIS, MDA-MB-231/ATCC, HS 578T, MDA-MB-435, MDA-N, BR-549, T-47D.

Figura 4. Gráficos de médias mostrando padrões de selectividade em cada um dos principais parâmetros de resposta para todas as linhas celulares testadas após exposição continua a 10~5 até 10~9 pg/mL de trióxido de arsénio durante 6 dias. 13

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO São aqui descritos métodos e composições para o tratamento de um tumor sólido seleccionado a partir do grupo de cancro da mama, do cólon, do ovário, renal, da bexiga, da próstata e do pulmão. A invenção é baseada, em parte, num regime de dosagem para administração de trióxido de arsénio. A invenção é também baseada, em parte, na potência do trióxido de arsénio da invenção contra um tumor sólido seleccionado a partir do grupo de cancro da mama, do cólon, do ovário, renal, da bexiga, da próstata e do pulmão. A invenção também inclui um método para tratar um tumor sólido seleccionado a partir do grupo de cancro da mama, do cólon, do ovário, renal, da bexiga, da próstata e do pulmão num mamífero, que compreende administrar a um mamífero uma dose terapeuticamente eficaz e não letal de um ou mais compostos de arsénio.

Geralmente, o especialista na técnica irá reconhecer que a forma do trióxido de arsénio a ser usada deve ser terapeuticamente eficaz sem toxicidade inaceitável. A toxicidade depende da dose, da forma de dosagem, do modo de administração e frequência de dosagem.

Conforme aqui usado, "trióxido de arsénio", refere-se a uma forma farmaceuticamente aceitável de trióxido de arsénio, incluindo sais, soluções, complexos, quelatos e compostos orgânicos e inorgânicos que incluem arsénio. Os compostos de arsénio da presente invenção podem ser sintetizados ou comprados comercialmente. Por exemplo, os compostos podem ser preparados a partir de técnicas químicas bem conhecidas. (Ver por exemplo, Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology 4 ed. Volume 3 pps. 633-655 John Wiley & Sons). 14

Numa forma de realização, o trióxido de arsénio da invenção é dissolvido numa solução aquosa de hidróxido de sódio, com o pH ajustado para uma gama fisiologicamente aceitável, e.g. pH de cerca de 6-8.

Qualquer modo de administração adequado pode ser usado de acordo com a presente invenção, incluindo mas não se limitando a admisnitração parentérica tal como administração intravenosa, subcutânea, intramuscular e intratecal; a administração oral, intranasal, rectal ou vaginal podem também ser usadas; directamente no tumor; adesivos transdérmicos; dispositivos de implante (particularmente para libertação lenta); finalmente, pode ser usada a administração tópica. 0 modo de administração vai variar de acordo com a doença a ser tratada.

As composições farmacêuticas a serem usadas podem estar na forma de soluções (aquosas ou orgânicas) suspensões coloidais, cremes, pomadas, pastas, cápsulas, "caplets", comprimidos e hóstias estéreis fisiologicamente aceitáveis. As composições farmacêuticas compreendendo trióxido de arsénio da invenção podem ser contidas em recipientes de vidro estéreis selados e/ou ampolas. Além disso, o componente activo pode ser micro-encapsulado, encapsulado num lipossoma, noisome ou lipofoam sozinho ou em conjunto com anticorpos direccionadores. Deve ser reconhecido que as formas de administração de libertação retardada ou continuada estão também incluídas. 0 trióxido de arsénio da presente invenção pode ser usado contra tumores da mama, do cólon, dos ovários, dos rins, do pulmão, da bexiga e da próstata. 15

Mais especificamente, o trióxido de arsénio pode ser usado para tratar

Tumores do trato gastrointestinal:

Carcinoma das células escamosas do esófago

Adenocarcinoma do esófago

Carcinoma colorectal (cancro do cólon)

Carcinoma gástrico (cancro do estômago)

Tumores do trato respiratório:

Carcinoma broncogénico Carcinoma de células pequenas Carcinoma de células grandes

Tumores do trato urogenital:

Carcinomas de células de transição da bexiga Carcinoma das células escamosas da bexiga Carcinoma da próstata Carcinoma do cérvix

Tumores da mama.

Conforme aqui usado, os termos "um método para tratar cancro primário ou metastático da mama, do pulmão, da bexiga ou da próstata" e "um método para tratar metástases de cancro da mama, do pulmão, da bexiga ou da próstata" significam que a doença e os sintomas associados à doença são aliviados, reduzidos, curados, ou colocados em estado de remissão. Adicionalmente, o termo "um método para tratar metástases de cancro da mama, do pulmão, da bexiga ou da próstata" significa que os tumores metastáticos e os sintomas associados à doença são aliviados, reduzidos, curados, colocados num estado de remissão. 16 0 termo "refractário", quando aqui usado, siqnifica que as doenças malignas são geralmente resistentes ao tratamento ou à cura. 0 termo "refractário" quando aqui usado nos termos acima, significa que as doenças malignas que são geralmente resistentes ao tratamento ou à cura são aliviadas, reduzidas, curadas, ou colocadas num estado de remissão.

Conforme aqui usado, os termos "um agente terapêutico", "regime terapêutico", "radioprotector", "quimioterapeutico" significam fármacos convencionais e terapias com fármacos, incluindo vacinas, para tratar cancro, infecções virais, e outras doenças malignas, que são conhecidas dos especialistas na técnica. Agentes "radioterapeuticos" são conhecidos na técnica.

Conforme aqui usado, "um método para tratar cancro" ou "um método para tratar tumores sólidos" ou "um método para tratar doenças neoplásicas" significa que a doença e os sintomas associados à doença são aliviados, reduzidos, curados, ou colocados num estado de remissão. Além disso, o crescimento tumoral é inibido e/ou o tamanho do tumor é reduzido.

Conforme aqui usado, célula "pré-neoplásica" refere-se a uma célula que está na forma de transição de uma forma normal para uma forma neoplásica; e evidência morfológica, suportada cada vez mais por estudos de biologia molecular, indica que a pré-neoplasia progride ao longo de múltiplos passos. 0 crescimento celular não neoplásico consiste normalmente em hiperplasia, metaplasia ou, mais particularmente, displasia (para revisão dessas doenças de crescimento anormal (Ver Robbins and Angell, 1976, Basic 17

Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79)) . Hiperplasia é uma forma de proliferação celular controlada envolvendo um aumento no número de células num tecido ou órgão, sem alteração significativa da estrutura ou função. Como um exemplo, a hiperplasia endometrial precede muitas vezes o cancro do endométrio. A metaplasia é uma forma de crescimento celular controlado no qual um tipo de célula adulta ou totalmente diferenciada substitui outro tipo de célula adulta. A metaplasia pode ocorrer em células de tecido epitelial ou conectivo. A metaplasia atípica envolve um epitélio desordenadamente metaplásico. A displasia é frequentemente um precursor do cancro, e é encontrada principalmente nos epitélios; é a forma mais desordenada de crescimento celular não neoplásico, envolvendo uma perda na uniformidade individual das células e na orientação arquitectónica das células. As células displásicas têm frequentemente núcleos anormalmente grandes e fortemente corados, e apresentam pleomorfismo. A displasia ocorre caracteristicamente quando existe irritação ou inflamação crónica, e é frequentemente encontrada no cérvix, vias respiratórias, cavidade oral e vesícula biliar. Embora as lesões pré-neoplásicas possam progredir para neoplasia, elas podem também permanecer estáveis durante longos períodos de tempo e podem mesmo regredir, particularmente se o agente estimulante for removido ou se a lesão não resistir a um ataque imunológico por parte do hospedeiro.

Os regimes terapêuticos e as composições farmacêuticas da invenção podem ser usados com melhoradores da resposta imune ou modificadores da resposta biológica incluindo, mas não se limitando, às citoquinas INF-a, INF-γ, IL-2, IL-4, IL-6, TNF, ou outros imunostimulantes/imunomoduladores. De acordo com este aspecto da invenção, o trióxido de arsénio 18 é administrado em terapia combinada com um ou mais destes agentes. 5.1. Formulação 0 trióxido de arsénio da invenção pode ser formulado em preparações farmacêuticas para administração em mamíferos para tratamento de um tumor sólido seleccionado a partir do grupo de cancro da mama, do cólon, do ovário, renal, da bexiga, da próstata e do pulmão. Composições compreendendo um composto da invenção formuladas num transportador farmacêutico compatível podem ser preparadas, embaladas, rotuladas para o tratamento de e usadas para o tratamento do tumor indicado.

Se o complexo for solúvel em água, ele pode então ser formulado num tampão adequado, por exemplo, soro fisiológico tamponado com fosfato ou outras soluções fisiologicamente compatíveis. Alternativamente, se o complexo resultante tiver fraca solubilidade em solventes aquosos, então ele pode ser formulado com um tensoactivo não iónico tal como Tween, polietileno glicol ou glicerina. Assim, o trióxido de arsénio e os seus solvatos fisiologicamente aceitáveis podem ser formulados para administração por inalação ou insuflação (pela boca ou pelo nariz) ou oral, bucal, parentérica, tópica, dérmica, vaginal, aparelho de libertação de fármaco, e.g., material poroso ou viscoso tal como lipofoam, administração rectal ou, no caso de tumores, injectado directamente num tumor sólido.

Para administração oral, a preparação farmacêutica pode estar na forma líquida, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou pode ser apresentada como um fármaco para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes de 19 usar. Essas preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (e.g. xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas comestíveis); agentes emulsionantes (e.g., lecitina ou acácia); veículos não aquosos (e.g., óleo de amêndoa, ésteres oleosos, ou óleos vegetais fraccionados); e conservantes (e.g., metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As composições farmacêuticas podem ter a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparadas por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes ligantes (e.g., amido de milho pré-gelatinizado, polivinil pirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); enchedores (e.g., lactose, celulose microcristalina ou fosfato de cálcio e hidrogénio); lubrificantes (e.g., estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (e.g., amido de batata ou glicolato de amido sódico); ou agentes molhantes (e.g., lauril sulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos por métodos bem conhecidos na técnica.

Preparações para administração oral podem ser formuladas adequadamente para proporcionar a libertação controlada do composto activo.

Para administração bucal, as composições podem tomar a forma de comprimidos ou lozangos formulados de modo convencional.

Para administração por inalação, o trióxido de arsénio para uso de acordo com a presente invenção é administrado convenientemente na forma de uma apresentação de spray de aerossois a partir de recipientes pressurizados ou de um nebulizador, com o uso de um propulsor adequado, e.g., 20 diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvula para administrar uma quantidade medida. Cápsulas ou cartuchos de, e.g., gelatina para uso num inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura de pós do composto e uma base de pó adequada tal como lactose ou amido. O trióxido de arsénio pode ser formulado para administração parentérica por injecção, e.g., por injecção em bolus ou injecção continua. Essas formulações são estéreis. Formulações para injecção pode ser apresentadas numa forma de dosagem unitária, e.g., em ampolas ou em recipientes multi-dose, com um conservante adicionado. As composições podem ter essas formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, o componente activo pode estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, e.g., água estéril sem pirogénios, antes de usar. O trióxido de arsénio pode também ser formulado em composições rectais tais como supositórios ou enemas de retenção, e.g., contendo bases para supositórios convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos.

Para além das formulações descritas anteriormente, o trióxido de arsénio pode também ser formulado como uma preparação de libertação lenta. Essas formulações de longa acção podem ser administradas por implante (por exemplo, 21 por via subcutânea ou intramuscular) ou por injecção intramuscular. Assim, por exemplo, o trióxido de arsénio pode ser formulado com materiais poliméricos ou hidrofóbicos (por exemplo, como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de permuta iónica, ou como derivados fracamente solúveis, por exemplo, como um sal fracamente solúvel. Lipossomas e emulsões são exemplos bem conhecidos de veículos de administração ou transportadores de fármacos hidrofílicos.

As composições podem, se desejado, ser apresentadas numa embalagem ou num aparelho dispensador que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitárias contendo o componente activo. A embalagem pode compreender, por exemplo, folha de plástico ou metal, tal como uma embalagem blister. A embalagem ou aparelho dispensador pode ser acompanhado por instruções de administração. A invenção também se relaciona com kits para realizar regimes terapêuticos da invenção. Esses kits compreendem um ou mais recipientes de quantidades terapeuticamente eficazes de trióxido de arsénio numa forma farmaceuticamente aceitável. 0 trióxido de arsénio num frasco de um kit pode estar na forma de uma solução farmaceuticamente aceitável, e.g., em combinação com soro fisiológico estéril, solução de dextrose, ou solução tamponada, ou outro fluido estéril farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, o complexo pode ser liofilizado ou dessecado; neste caso, o kit compreende opcionalmente uma solução farmaceuticamente aceitável num recipiente (e.g., soro fisiológico, solução de dextrose, etc) , preferencialmente estéril, para reconstituir o complexo para formar uma solução para fins de injecção. 22

Noutro exemplo, um kit compreende adicionalmente uma agulha ou uma seringa, preferencialmente embalada de forma estéril, para injectar o complexo, e/ou uma compressa embebida em álcool embalada. As instruções são opcionalmente incluídas para administração do trióxido de arsénio por um clínico ou pelo doente. A magnitude de uma dose terapêutica de um trióxido de arsénio no maneio agudo ou crónico de um tumor sólido seleccionado a partir do grupo de cancro da mama, do cólon, do ovário, renal, da bexiga, da próstata ou do pulmão vai variar com a gravidade da doença a ser tratada e com a via de administração. A dose, e talvez a frequência da dose, vai também variar de acordo com a idade, o peso corporal, condição e resposta individual do doente. Em geral, as gamas de dose total diária nas doenças aqui descritas são geralmente desde cerca de 10 pg até cerca de 200 mg administradas em doses divididas administradas por via parentérica ou oral ou tópica. Uma dose diária total preferida é desde cerca de 0,5 mg até cerca de 70 mg de componente activo. Níveis sanguíneos adequados podem ser mantidos por uma infusão contínua de trióxido de arsénio conforme determinado pelos níveis plasmáticos. Deve notar-se que o médico assistente deve saber como e quando terminar, interromper ou ajustar a terapêutica para reduzir a dose devido à toxicidade, ou disfunções da medula óssea, do fígado ou dos rins. Reciprocamente, o médico assistente deve também saber como e quando ajustar o tratamento para níveis mais elevados caso a resposta clínica não seja adequada (evitando efeitos secundários tóxicos) . 23

Mais uma vez, qualquer via de administração adequada pode ser empregue para fornecer ao doente a dose eficaz de trióxido de arsénio. Por exemplo, oral, rectal, vaginal, transdérmica, parentérica (subcutânea, intramuscular, intratecal) podem ser empregues. As formas de dosagem incluem comprimidos, pastilhas, hóstias, dispersões, suspensões, soluções, cápsulas, emplastros, e afins. (Ver, Remington's Pharmaceutical Sciences).

As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem trióxido de arsénio como componente activo, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e podem conter também um transportador farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, outros componentes terapêuticos, por exemplo, antivirais. 0 termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais preparados a partir de ácidos e bases não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo ácidos e bases orgânicos e inorgânicos.

As composições farmacêuticas incluem composições adequadas para as vias oral, rectal, mucosal, transdérmica, parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intratecal e intravenosa), embora a via mais adequada num determinado caso vá depender da natureza e da gravidade da doença a ser tratada.

No caso em que é empregue uma injecção intravenosa ou uma composição de infusão, uma gama de dosagem adequada para usar é e.g. desde cerca de 0,5 mg até cerca de 150 mg de dose diária total.

Adicionalmente, o transportador de trióxido de arsénio pode ser administrado por via de matrizes carregadas e não carregadas usadas como aparelhos de administração de 24 fármacos, tais como membranas de acetato de celulose, também através de sistemas de administração direccionados tais como lipossomas fusogénicos ligados a anticorpos ou antigénios específicos.

No uso prático, o trióxido de arsénio pode ser combinado como componente activo em mistura íntima com um transportador farmacêutico de acordo com técnicas de composições farmacêuticas convencionais. 0 transportador pode ter uma grande variedade de formas dependendo da forma da preparação desejada para administração, e.g., oral ou parentérica (incluindo comprimidos, cápsulas, pós, injecções ou infusões intravenosas). Na preparação das composições para a forma de dosagem oral, qualquer dos meios farmacêuticos comuns pode ser empregue, e.g., água, glicois, óleos, álcoois, agentes aromatizantes, conservantes, agentes corantes, e afins; no caso de preparações orais líquidas, e.q., suspensões, soluções, elixires, lipossomas e aerossóis; amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, ligantes, agentes desintegrantes, e afins, no caso de preparações orais sólidas e.g., pós, cápsulas e comprimidos. Ao preparar as composições para formas de dosagem parentéricas, tais como injecção ou infusão intravenosa, podem ser empregues um meios farmacêuticos semelhantes, e,g., água, glicois, óleos, tampões, açúcar, conservantes e afins conhecidos dos especialistas na técnica. Exemplos dessas composições parentéricas incluem Dextrose 5% p/v, soro fisiológico normal ou outras soluções. A dose total do trióxido de arsénio pode ser administrada num frasco de fluído intravenoso, e.g., variando desde cerca de 2 mL até cerca de 2000 mL. O volume do fluído de diluição vai variar de acordo com a dose total administrada. 25 5.2. Cancros Alvo

Os cancros que podem ser tratados pelos métodos descritos incluem um tumor sólido seleccionado a partir do grupo que consiste em cancro da mama, do cólon, do ovário, renal, da bexiga, da próstata e do pulmão.

6. EXEMPLOS DE REFERENCIA

As seguintes subsecções descrevem a testagem de uma composição farmacêutica compreendendo trióxido de arsénio in vitro usando um painel de linhas de células tumorais empregues pelo National Câncer Institute (NCI). Os resultados demonstram que o trióxido de arsénio é eficaz na inibição do crescimento de uma larga gama de células leucémicas e de células tumorais in vitro. 6.1. Métodos e Materiais 0 trióxido de arsénio (1 mg/mL, 10 mg/ampola, fabricado por Taylor Pharmaceuticals, Decatur, Illinois) foi testado em cinco concentrações em diluições de 10 vezes cada uma, i.e., 10'5, 10“6 10’7 ΙΟ’8 10’9 pg/mL.

Os testes in vitro foram realizados incubando as células de teste na presença da concentração indicada de trióxido de arsénio sob condições de cultura padrão para o período de tempo designado, que é seguido por um ensaio de proteína suforodamina B (SRB) para estimar o crescimento ou a viabilidade das células. As linhas celulares são organizadas em subpaineis de acordo com a origem das linhas celulares, e.g., leucemia, cancro da mama, etc. Uma descrição das linhas celulares e do método de testagem está descrita em Monk et al., (1997, Anticancer Drug Des. 12:533-41) e Weinstein et al., (1997, Science 275:343-9). 26 São descritos abaixo os procedimentos e apresentação de análise de dados. A medição de um efeito é expressa em Percentagem de Crescimento (PG) . 0 efeito medido do composto numa linha celular é calculado de acordo com uma das duas expressões seguintes:

Se ( Média ODteste - Média ODzero)- 0· então PG = 100 x (Média ODteste - Média ODzero) /Média ODctri -Média ODzero

Se ( Média ODteste - Média ODzero)< 0. então PG = 100 x (Média ODteste - Média ODzer0)/Média ODzero em que: Média ODzero = a média das medições da densidade óptica da cor derivada de SRB imediatamente antes da exposição das células aos compostos de teste; Média ODtest = a média das medições da densidade óptica da cor derivada de SRB depois da exposição das células ao composto de teste durante um período de tempo designado; e Média ODctrl = a média das medições da densidade óptica da cor derivada de SRB após não exposição das células ao composto de teste durante um período de tempo designado. 27

As Tabelas 1 e 2 apresentam os dados experimentais recolhidos em relação a cada linha celular. As duas primeiras colunas descrevem o subpainel (e.g. leucemia) e a linha celular (e.g., CCRF-CEM) envolvida. As duas colunas seguintes listam a Mean 0Dzero e a Mean ODctri; as cinco colunas seguintes listam a Mean ODtest para cada uma das cinco concentrações diferentes. Cada concentração é expressa em logio (molar ou pg/mL). As cinco colunas seguintes listam as PGs calculadas para cada concentração. Os parâmetros de resposta GI50, TGI e LC50 são valores interpolados que representam as concentrações às quais o PG é +50, 0, e -50, respectivamente. Por vezes, estes parâmetros de resposta não podem ser obtidos por interpolação. Se, por acaso, todas as PGs numa dada linha excederem +50, então nenhum dos três parâmetros pode ser obtido por interpolação. Nesse caso, o valor dado para cada parâmetro de resposta é a maior concentração testada e é precedida por um sinal de Esta prática é extendida do mesmo modo a outras situações possíveis onde o parâmetro de resposta não pode ser obtido por interpolação. É criada uma curva de dose-resposta (ver Figuras 1A-1I e 3A-3I) para o conjunto de dados fazendo um gráfico de PGs em relação ao logio da concentração correspondente para cada linha celular. As curvas das linhas celulares estão agrupadas por subpainel. As linhas horizontais são dadas no valor de PG +50, 0, e -50. As concentrações correspondentes aos pontos em que as curvas cruzam estas linhas são GI50, TGI, e LC50, respectivamente.

Um gráfico de médias (Figuras 2 e 4) facilita o rastreio visual dos dados em relação a potenciais padrões de selectividade para linhas celulares específicas ou para 28 subpaineis específicos no que diz respeito a um parâmetro de resposta seleccionado. As diferenças nos padrões de selectividade aparentes podem ocorrer para o mesmo composto em relação às mesmas linhas celulares quando diferentes parâmetros são comparados. A página dos gráficos de médias do pacote de dados mostra gráficos de médias em cada um dos principais parâmetros de resposta: GI50, TGI, e LC50. As barras que se estendem para a direita representam a sensibilidade da linha celular ao agente de teste acima da sensibilidade média de todas as linhas celulares testadas. Uma vez que a escala é logarítmica, uma barra de 2 unidades para a direita implica que o composto alcançou o parâmetro de resposta (e.g., GI50) para a linha celular numa concentração de um centésimo da concentração média necessária para todas as linhas celulares, e assim a linha celular é invulgarmente sensível a esse composto. As barras que se estendem para a esquerda implicam correspondentemente uma sensibilidade inferior à média. Se, para um determinado fármaco e linha celular, não foi possível determinar o parâmetro de resposta desejado por interpolação, o comprimento da barra mostrado ou é a maior concentração testada (e o logio listado do parâmetro de resposta será precedido de um ">" ou é a menor concentração testada (e o logio listado será precedido por um "<") .

Os valores de cada um dos limites (> ou <) são também calculados na média usada para o gráfico de médias. Por isso, a média usada no gráfico de médias pode não ser a média real do GI50 por exemplo. Por esta razão, este valor é referido como o MG_MID (ponto médio do gráfico médio). 6.2. Resultados

Os resultados dos dois conjuntos de testes são apresentados a seguir. No primeiro conjunto, as células de 56 linhas de 29 células de cancros diferentes foram expostas a cinco concentrações de trióxido de arsénio continuamente durante dois dias antes de realizar o ensaio de SRB. No segundo conjunto, as células de 50 linhas celulares diferentes (um subconjunto das primeiras 56 linhas celulares, e a linha de células de cancro renal 786-0) foram expostas continuamente durante 6 dias antes do ensaio de SRB. 29 TABELA 1

Concentração Log 10 Tempo zero Contr Densidade óptica irédia Percentagem de crescimento GI50 TGI LC50 -8,9 -7,9 -6,9 -5,9 -4,9 -8,9 -7,9 -6,9 -5,9 -4,9 Leucaria CCEF-CEM 0,300 0,153 1,203 1,195 1,134 0,704 0,285 106 105 98 47 -5 Ι,ΠΕ-06 Ι,ΟΟΕΜ >l,26E-05 M60 (TB) 0,233 0,530 0,533 0,507 0,535 0,499 0,213 101 92 102 90 -9 3,19E-06 l,03E-05 >l,26E-05 K-562 0,209 1,416 1,387 1,431 1,418 1,124 0,199 98 101 100 76 -5 2,63E-06 U0E-05 >l,26E-05 MDLT-4 0,134 0,438 0,438 0,454 0,454 0,368 0,146 109 109 105 77 4 2,96E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 Rfl-8226 0,257 0,893 0,893 0,848 0,813 0,670 0,204 96 96 87 65 -21 l,88E-06 7,23E-06 >l,26E-05 SR 0,158 0,457 0,454 0,425 0,457 0,336 0,111 99 99 100 60 -30 l,63E-06 5,85E-06 >l,26E-05 Cancro cb RiMo de não pequenas células A/549ATCC 0,015 0,477 0,479 0,486 0,476 0,516 0,336 100 102 100 108 69 >l,26E-05 >l,26E-05 >l,26E-05 EM 0,342 0,736 0,809 0,849 0,841 0,853 0,385 119 129 127 130 11 3,9lE-06 >l,26E-05 >l,26E-05 HOP-62 0.335 1,109 1,088 1,099 1,113 1,086 1,605 97 99 100 97 35 7,18E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 HOP-92 0,505 1,694 1,554 1,603 1,477 1,381 1,873 88 92 82 74 31 4,50E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 NCI-H226 0,560 0,932 0,967 0,918 0,967 0,967 0,904 109 96 109 109 92 >l,26E-05 >l,26E-05 >l,26E-05 NCI-H23 0,648 1,622 1,769 1,822 1,880 1,635 1,215 115 121 127 101 58 >l,26E-05 >l,26E-05 >l,26E-05 NCI-8322M 0,382 0,997 1,103 1,036 0,976 0,992 0,755 117 106 97 99 61 >l,26E-05 >l,26E-05 >l,26E-05 NCI-H460 0,296 1,235 1,132 1,186 1,234 1,157 1,757 89 95 100 92 49 l,20E-05 >l,26E-05 >l,26E-05 NCI-H522 0,478 1,138 1,332 1,135 1,189 1,892 0,378 129 100 108 63 -21 l,79E-06 7,08>E-06 >l,26E-05 Cancro do Co lon COLO 205 0,328 1,394 1,425 1,414 1,576 1,434 0,935 103 102 117 104 37 >l,26E-05 >l,26E-05 >l,26E-05 HCT-116 0,301 1,574 1,508 1,480 1,488 1,391 0,685 95 93 93 86 30 5,53E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 HCT-15 0,219 1,623 1,800 1,427 1,673 1,522 0,304 113 104 104 93 20 4,90E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 HT29 0,095 0,578 0,637 0,599 0,580 0,479 0,169 112 100 100 80 15 3,63E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 M2 0,189 0,741 0,744 0,728 0,777 0,737 0,567 101 106 106 99 68 >l,26E-05 >l,26E-05 >l,26E-05 SW-620 0,153 0,898 0,898 0,686 0,857 0,739 0,267 102 96 96 85 16 4,05E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 Cancro CNS SF-268 0,203 0,767 0,821 0,736 0,815 0,767 0,334 110 94 108 100 23 5,63E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 SF-295 1,249 1,007 0,951 0,978 0,938 0,938 0,639 93 96 91 91 51 >l,26E-05 >l,26E-06 >l,26E-05 SF-539 0,132 0,462 0,491 0,316 0,506 0,435 0,410 109 117 113 92 -17 3,06E-06 8,85E-06 >l,26E-05 SNB-19 0,176 0,905 0,857 0,880 0,887 0,883 0,437 93 97 98 97 36 7,38E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 SNB-75 0,501 1,051 0,925 1,049 1,134 0,703 0,438 77 100 115 37 -13 8,54E-07 6,98E-06 >l,26E-05 U251 0,192 0,799 0,789 0,792 0,803 0,680 0,061 98 99 101 80 -68 2,02E-06 4,37E-06 9,47E-06 Melarara L3XM/I 0,173 1,304 1,175 1,170 0,974 0,997 0,319 89 88 71 73 13 3,03E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 MM-3M 0,476 0,859 1,006 0,949 0,868 0,819 0,275 138 123 702 90 -42 2,5lE-06 6,02E-06 >l,26E-05 M-14 0,123 0,613 0,602 0,635 0,592 0,549 0,136 98 105 96 87 3,45E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 SK-MEL-2 0,388 0,704 0,746 0,714 0,735 0,676 0,323 113 103 110 91 -17 3,03E-06 8,81E-06 >l,26E-05 SK-MEL-28 0,513 1,090 1,088 1,107 1,093 1,057 0,546 100 103 101 94 6 3,98E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 SK-MEL-5 0,454 2,107 2,049 2,066 2,025 1,748 0,460 96 97 95 78 0 3,90E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 UACC-257 0,596 1,142 1,149 1,128 1,165 1,078 0,814 101 97 104 88 40 7,78E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 UACC-62 0,306 1,082 1,111 1,105 1,108 1,051 0,353 104 103 103 96 6 4,10E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 30

Cancro do Ovário PGR01 0,291 1,679 1,828 1,932 1,743 1,710 0,536 111 118 105 102 18 5,22E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 OVffiR-3 0,240 1,066 1,073 1,055 1,045 0,980 0,343 101 99 97 90 12 4,10E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 OVCSE-6 0,457 1,206 1,243 1,230 1,157 1,181 0,715 105 103 93 97 34 7,07E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 OVffiR-8 0,173 1,340 1,250 1,245 1,159 1,107 0,495 92 92 84 80 28 4,7lE-06 >l,26E-05 >l,26E-05 SK-OV-3 0,351 0,865 0,836 0,852 0,853 0,867 0,557 94 97 98 100 40 8,59E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 Cancro Renal A498 0,400 0,678 0,691 0,657 0,649 0,635 0,357 105 93 89 84 -11 2,90E-06 9,7lE-06 >l,26E-05 CMI-1 0,372 0,942 1,058 0,960 1,103 0,819 0,325 120 103 128 78 -13 2,59E-06 9,13E-06 >l,26E-05 RXE 303 0,743 1,243 0,860 1,114 1,290 1,077 0,778 23 74 109 67 7 >l,26E-05 >l,26E-05 SN12C 0,157 0,546 0,533 0,529 0,500 0,474 0,113 97 96 88 81 -28 2,44E-06 6,96E-06 >l,26E-05 ΊΧ-10 0,355 1,027 1,014 1,002 1,042 0,999 0,727 98 96 102 96 55 >l,26E-05 >l,26E-05 >l,26E-05 00-31 0,124 0,765 0,799 0,816 0,830 0,785 0,391 105 108 110 103 42 9,20E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 Cancro da Próstata EC-3 0,187 1,419 0,426 0,399 0,390 0,342 0,179 103 91 88 67 -4 2,17E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 CO-145 0,384 1,151 1,051 1,389 1,194 1,119 0,873 91 131 106 96 64 >l,26E-05 >l,26E-05 >l,26E-05 Cancro da ta MCF-7 0,800 0,928 0,924 0,912 0,985 0,277 0,277 99 98 108 95 11 4,3lE-06 >l,26E-05 >l,26E-05 MCl/fflR-RES 0,328 1,386 1,376 1,576 1,425 0,801 0,801 118 99 104 92 45 9,69E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 IMB 231/ATCC 0,304 0,644 0,635 0,651 0,674 0,667 0,314 97 102 109 107 3 4,43E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 HS 578T 0,369 1,255 1,338 1,396 1,219 1,300 0,742 109 105 96 105 42 9,44E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 MCA-MB.435 0,465 1,425 1,370 1,354 1,476 1,369 0,666 94 93 105 94 21 5,05E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 MM 0,348 1,471 1,499 1,481 1,374 1,316 0,385 102 101 91 86 3 3,44E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 BT-549 0,735 1,762 1,910 1,865 1,847 1,599 0,998 114 110 108 84 76 4,82E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 T-47D 0,464 1,007 0,941 1,054 1,184 0,905 0,419 88 109 133 81 -10 2,78E-06 9,86E-06 >l,26E-05 31

No primeiro conjunto de testes, de acordo com a Tabela 1 e as curvas de dose-resposta conforme mostrado na Figura IA até II, o trióxido de arsénio foi eficaz na redução do crescimento celular em relação a quase todas as linhas celulares testadas. Em particular, as linhas de células leucémicas, as linhas de células de melanoma, e as linhas de células de cancro do ovário responderam consistentemente mostrando uma redução de mais de 50% no crescimento. De acordo com o gráfico de médias conforme mostrado na Figura 2, a maior parte das linhas de células leucémicas e de melanoma, as linhas celulares SNB-75 e U251 de cancro do sistema nervoso central, a linha celular PC-3 de cancro da próstata, as linhas celulares A498, CAKI-1, SN12C de cancro renal, e a linha celular NCI-H522 de cancro do pulmão foram especialmente sensíveis (em relação a todas as linhas celulares testadas) ao tratamento com trióxido de arsénio. 32 TABELA 2

Painel/Linhas celulares Concentração Lcg 10 Tsrpo zero Contr Densidade éptica nédia Percentagem de crescimento GI50 TOI LC50 -8,9 -7,9 -6,9 -5,9 -4,9 -8,9 -7,9 -6,9 -5,9 -4,9 Leucsria CCRF-CEM 0,047 3,511 3,601 3,592 3,051 0,320 0,048 103 102 87 8 0 U1E-07 >l,26E-05 >1,261-05 K-562 0,041 3,011 3,042 2992 3360 2931 0,095 101 99 112 97 2 2,63E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 M1LT-4 0,018 0,503 0554 0228 0,432 03« 0,113 111 43 85 47 20 . >l,26E-05 >l,26E-05 M-8226 0,056 1,432 w 1,607 1,423 03® 0,065 113 88 99 22 -2 l,88E-06 7,231-05 >l,26E-05 Células não Pequenas do Cancro do Pu] irão EM 0,030 0,682 0573 m 0,628 0,414 0,014 83 88 92 59 -53 l,5lE-06 4,72E-06 U8E-05 HOP-62 0,061 1,026 1,076 0997 1,019 0,451 0,014 103 97 99 40 -77 8,66E-07 2,781-06 7,41E-06 HOP-92 0,115 1,292 1,453 m 1319 m 0,019 114 146 102 95 -31 2,85E-06 7,111-06 >l,26E-05 NCI-H226 0,094 0,498 0504 0,458 0,489 038 0,1® 101 90 98 63 17 2,40E-08 >1,261-05 >l,26E-05 NCI-H23 0,075 1,624 p p 1,872 1,303 0,086 113 112 116 79 1 2,97E-06 >1,261-05 >l,26E-05 NCI-8322M 0,035 0,702 Q680 0,620 0,674 0552 0,051 97 88 96 77 3 2,94E-06 >1,261-05 >l,26E-05 NCI-H460 0,034 2,839 Wl 2806 2,792 2535 0,062 99 99 98 89 1 3,50E-06 >1,261-05 >l,26E-05 NCI-H522 0,175 1,224 m 0535 1,191 0,1¾ 0,028 104 34 97 -27 -84 . 7,08>I-07 3,19E-06 Cancro do Cólon COLO 205 0,022 2,351 2,308 2,026 2,283 1,404 0,024 98 86 97 59 0 l,8lE-06 >1,26E- >l,26E-05 >l,26E-05 0-116 0,046 3,420 3,395 3,289 3,381 3,284 1,381 99 96 99 96 56 05 >l,26E-05 >l,26E-05 HCT-15 0,033 3,838 3,965 3,921 4,227 3,432 0,404 102 102 110 89 10 3,93E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 HT29 0,017 3,060 3,189 2,988 2,706 1,476 0,027 104 98 88 48 0 l,12E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 M2 0,012 0,808 0,487 0,533 0,507 0,036 0,017 80 87 83 4 1 3,29E-07 >l,26E-05 >l,26E-05 SW-620 0,023 2,652 2,613 2,337 2,337 1,475 0,007 99 87 88 35 -72 l,39E-06 3,43E-05 8,50E-06 Cancro CNS SF-268 0,034 0,798 0,990 0,381 0,356 0,387 -0,004 126 44 41 45 -100 5,06E-08 2,57E-06 5,69E-06 SF-295 0,031 1,324 1,284 1,279 1,244 0,659 0,01 97 97 94 49 -69 l,17E-06 3,25E-06 8,64E-06 SF-539 0,041 1,598 1,727 1,403 1,545 0,691 0,017 108 87 97 42 -59 3,29E-07 3,29E-06 l,04E-05 SNB-75 0,134 1,065 1,143 1,033 1,024 0,815 0,028 108 97 96 73 -79 3,80E-06 3,80E-06 8,08E-06 0251 0,105 2,324 2,129 2,016 1,908 0,088 -0,012 91 86 81 -17 -100 8,5lE-06 8,5lE-07 3,16E-06 Melanora L3XM/I 0,013 2,153 2,000 1,666 0,053 0,002 -0,001 93 77 2 -88 -100 2,90E-08 l,32E-07 4,73E-07 MM-3M 0,115 0,650 0,702 5,595 0,823 0,383 0,005 110 90 132 50 -96 l,26E-06 2,78E-06 6,12E-06 SK-MEL-2 0,213 0,500 0,491 0,462 0,426 0,128 , 97 87 74 -40 -100 2,06E-07 5,63E-07 l,85E-06 SK-MEL-28 0,093 2,030 2,012 1,906 1,797 0,488 , 99 94 88 20 -100 4,60E-07 l,86E-06 4,84E-06 SK-MEL-5 0,181 1,907 1,935 1,864 1,929 1,846 0,013 102 97 101 96 -93 2,22E-06 4,07E-06 7,46E-06 UACC-257 0,053 0,883 0,872 0,857 0,832 0,504 0,039 99 97 94 54 -27 l,42E-06 5,83E-06 >l,26E-05 fflCC-62 0,030 1,537 1,546 1,460 1,409 0,539 0,001 101 95 92 34 -98 6,60E-07 2,27E-06 5,43E-06 33

Cancro do Ovário IGR01 0,335 3,115 3,541 3,056 3,204 2,877 0,216 115 98 103 91 -36 2,67E-06 6.62E-05 >l,26E-05 OVffiR-3 0,081 1,153 1,047 1,128 1,124 0,482 0,001 90 98 97 37 -99 7,76E-07 2,36E-06 5,49E-06 OVCAE-6 0,038 1,404 1,433 1,460 1,478 1,287 0,028 102 104 105 91 -26 2,83E-06 7,53E-06 >l,26E-05 OVCAR-8 0,016 2,090 2,272 1,848 2,242 1,437 -0,001 109 88 107 68 -100 l,62E-06 3,2lE-06 6,36E-06 SK-OV-3 0,041 1,474 1,445 1,410 1,461 1,247 0,020 98 96 99 84 -51 2,25E-06 5,27E-06 l,23E-06 Cancro Renal 786-0 0,021 1,578 1,582 1,821 1,786 0,832 -0,003 100 116 113 52 -100 l,30E-06 2,77E-06 5,9lE-06 A498 0,051 0,741 0,826 0,764 0,837 0,558 0,025 112 103 114 73 -52 l,93E-06 4,85E-06 l,22E-05 CMI-1 0,032 1,352 1,254 1,725 1,573 0,491 0,0004 93 128 117 35 -88 8,22E-07 2,43E-06 6,22E-06 RXE 303 0,198 1,515 1,327 1,301 1,727 0,909 0,017 86 84 116 54 -91 1,34-06 2,96E-06 6,54E-06 SN12C 0,024 0,956 0,882 1,141 1,113 0,829 0,013 92 120 117 96 -46 2,37E-06 5,67E-06 >l,26E-06 ΊΧ-10 0,072 1,333 1,356 1,268 1,334 1,103 0,239 102 95 100 92 13 3,66E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 Cancro da Próstata CO-145 0,095 2,158 2,147 1,954 1,935 2.153 0,055 99 90 89 100 -43 2,82E-06 6,32E-06 >l,26E-05 Cancro da ta MCF-7 0,028 2,650 2,647 2,611 2,603 1,683 0,008 100 99 98 63 -73 l,57E-06 3,66E-06 8,5lE-06 MCI/IR-RES 0,050 2,304 2,075 2,253 1,951 1,319 0,072 90 98 84 56 1 l,64E-06 >l,26E-05 >l,26E-05 Ml-MEr 231/ATCC 0,158 0,761 0,759 0,764 0,771 0,563 -0,001 100 101 102 67 -100 l,59E-06 3,18E-06 6,33E-06 HS 578T 0,109 0,728 0,777 0,587 0,890 0,706 0,010 108 77 126 96 -91 2,23E-06 4,12E-06 7,62E-06 MMB.435 0,034 1,500 1,276 1,470 0,865 0,631 0,021 85 98 56 40 -62 3,00E-07 3,10E-06 9,60E-06 MM 0,028 2,652 2,468 2,616 2,606 1,738 0,026 93 99 98 65 -9 2,02E-06 9,55E-06 >l,26E-05 BT-549 0,112 1,798 1,876 1,940 1,940 1,697 0,018 105 104 110 94 -84 2,22E-06 4,24E-06 8,08E-06 T-47D 0,098 0,824 0,883 0,336 0,593 0,398 0,027 108 33 61 41 -73 . 2,90E-06 7,93E-06 34

No segundo conjunto de testes, de acordo com a Tabela 2, as curvas de dose-resposta, e o gráfico de médias como mostrado na Figura 3A até 31, e Figura 4, o trióxido de arsénio foi eficaz na redução do crescimento celular em relação a todas as linhas celulares testadas. Os resultados foram consistentes com os obtidos com o primeiro conjunto de testes. Em particular, muitas linhas de células de melanoma pareceram ser especialmente sensíveis aos vários parâmetros principais de resposta.

Em conclusão, estes resultados demonstram que o trióxido de arsénio é eficaz na inibição do crescimentos de células leucémicas e de células tumorais in vitro, e que o trióxido de arsénio pode ser usado em indivíduos humanos para tratar uma larga gama de leucemia e cancros, incluindo cancro de não-pequenas células do pulmão, cancro do cólon, cancro do sistema nervoso central, melanoma, cancro do ovário, cancro renal, cancro da próstata, e cancro da mama.

Lisboa, 17 de Março de 2011

Claims (7)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Trióxido de arsénio para uso no tratamento de um tumor sólido seleccionado a partir do grupo que consiste em cancro da mama, do cólon, do ovário, renal, da bexiga, da próstata e do pulmão.

2. Trióxido de arsénio para o uso de acordo com a reivindicação 1, em que o trióxido de arsénio é formulado como uma solução iónica.

3. Trióxido de arsénio para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o trióxido de arsénio está numa forma adaptada para a administração de desde cerca de 10 pg até cerca de 200 mg por dia.

4. Trióxido de arsénio para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o trióxido de arsénio está numa forma adaptada para a administração de desde cerca de 0,5 mg até cerca de 70 mg por dia.

5. Trióxido de arsénio para o uso de acordo com a reivindicação 1, em que o trióxido de arsénio está numa forma adaptada para administração parentérica.

6. Trióxido de arsénio para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o trióxido de arsénio está numa forma adaptada para administração intravenosa.

7. Trióxido de arsénio para uso de acordo com a reivindicação 6, em que o trióxido de arsénio está numa forma adaptada para a administração de desde cerca de 0,5mg até cerca de 150 mg por dia. 2

8. Trióxido de arsénio para uso de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento compreende adicionalmente uma quantidade eficaz de pelo menos um aqente terapêutico adicional.

9. Trióxido de arsénio para uso de acordo com a reivindicação 8, em que o agente terapêutico adicional é um agente quimioterapeutico.

10. Trióxido de arsénio para uso de acordo com a reivindicação 8, em que o agente terapêutico adicional é seleccionado a partir do grupo que consiste em etoposido, cisplatina, carboplatina, fosfato de estramustina, vinblastina, metotrexato, hidroxiureia, ciclofosfamida, doxorubicina, 5-fluorouracilo, taxol, dietilestilbestrol, VM-26 (vumon), BCNU, ácido todo trans retinóico, procarbazina, citoquinas, vacinas terapêuticas, e imunomoduladores.

11. Uso do trióxido de arsénio no fabrico de um medicamento para o tratamento de um tumor sólido seleccionado a partir do grupo que consiste em cancro da mama, do cólon, do ovário, renal, da bexiga, da próstata e do pulmão. Lisboa, 17 de Março de 2011 1/12

CONCENTRAÇÃO DA AMDSTRA^^^j to ICC FIG.1A

FIG.1B

yjg CONCENTEAÇAD DA AMD STEA F1G.1C 2/12 PERCENTAGEM DE PERCENTAGEM DE PERCENTAGEM DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO CRESCIMENTO

FIG.1D

FIG.1E

jnr coNCENTEscao dr smostes LUb 10 FIG.1F 3/12 PERCENTAGEM DE PERCENTAGEM DE PERCENTAGEM DE CRESCIMENTO , CRESCIMENTO , CRESCIMENTO

FIG.1G

FiG.IH

FIG.1I 4/12 GRÁFICOS DAS MÉDIAS

<c CNJ O 5/12 CONTINUAÇÃO DA FIG.2 GRÁFICOS DAS MEDIAS

H H ft O u w 6 H d CDCM O j-j— 6/12 COHTIHUAÇAO DA FIG. 2B GRÁFICOS DAS MÉDIAS

O CM * O 7/12 PERCENTAGEM DE PERCENTAGEM DE PERCENTAGEM DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO CRESCIMENTO

FIG.3A

CONCENTRACAO DA AMOSTRA l0% Γ j w * 0 o 100 -r i < 50” 0 - -50”-100 ““ "9

CANCRO DO CÓLON COLO 205 mhm -*·♦-- XB12 S5M28 HCI-IS ff!2S T ................i -δ -7 jftp CONCENTRACAO tw!0 DA AMOSTRA t

8/12 PERCENTAGEM DE PERCENTAGEM DE PERCENTAGEM DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO CRESCIMENTO

FIG.3D

Qg CONCENTMjCSO D31 3U10STKA 10 F1G.3E (ftg/resl}

FI6.3F 9/12 PERCENTAGEM DE PERCENTAGEM DE PERCENTAGEM DE CRESCIMENTO CRESCIMENTO CRESCIMENTO

CONCENTRAÇÃO {0 DA AMOSTRA FI6.3G

ICO 58 0-50

-7 -fi -5 CONCENTRAÇÃO DA AMOSTRA FIG.3I CANCRO DA MAMA HCF7 - wa/ADR-flES MM-MÊM35 m-n ···»·· hs s?8?81-543 T-470 ?----------··'" " ' ........................................ *4 -0 -100 10/12

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t-S- 12/12 CONTIHUAÇÃO DA FIG.4B GRÁFICOS DAS MÉDIAS

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