PT2008657E - Uso de derivados da rapamicina em vasculopatias - Google Patents

Description

ΡΕ2008657 1 DESCRIÇÃO "USO DE DERIVADOS DA RAPAMICINA EM VASCULOPATIAS" 0 presente invento refere-se a uma nova utilização, em particular a um novo uso de um composto que é um derivado de rapamicina, em forma livre ou em forma farma-ceuticamente aceitável ou forma de complexo.

Os derivados de rapamicina incluem, por exemplo, compostos de fórmula I

em que X é (Η, H) ou 0; 2 ΡΕ2008657 I is (H.OH) ou O; RI e R2 são independentemente selecionados de H, alquilo, arilalquilo, hidroxialquilo, di-hidroxialquilo, hi-droxialcoxicarbonilalquilo, hidroxialquiloarilalquilo, di-hidroxialquilarilalquilo, aciloxialquilo, aminoalquilo, al-quilaminoalquilo, alcoxicarbonilaminoalquilo, acilaminoal-quilo, arilsulfonamidoalquilo, alilo, di-hidroxialquilali-lo, dioxolanilalilo, dialquildioxolanilalquilo, di(alcoxi-carbonil)-triazolil-alquilo e hidroxialcoxialquilo; em que "alq-" ou "alquilo" é alquilo Ci_6, ramificado ou linear; "arilo" é fenilo ou tolilo; e acilo é um radical derivado de ácido carboxílico; e R4 é metilo ou R4 e R1 em conjunto formam alquilo C2-6; com a condição de R1 e R2 não serem ambos H; e hidroxialcoxialquilo é outro que não hidroxialcoximetilo.

Tais compostos são descritos no documento WO 94/09010.

Acilo tal como pode estar presente em Ri ou R2 é preferencialmente RaCO- em que Ra é alquilo C1-6, alcenilo C2-6, cicloalquilo C3-6, arilo, arilalquilo C1-6 (em que arilo é tal como definido atrás) ou heteroarilo, por exemplo, um resíduo derivado de um heterociclo de 5 ou 6 membros ΡΕ2008657 3 compreendendo N, S ou 0 como heteroátomo e, opcionalmente, um ou dois N como outros heteroátomos. Heteroarilo adequado inclui, por exemplo, piridilo, morfolino, piperazinilo e imidazolilo.

Exemplos de tais compostos incluem: 1. 40-O-Benzil-rapamicina 2. 40-0-(4-Hidroximetil)benzi1-rapamicina 3. 40—0—[4—'(1,2-Di-hidroxietil)]benzi1-rapamicina 4. 40-O-Alil-rapamicina 5. 40-0-[3'-(2,2-Dimetil-l,3-dioxolan-4(S)-il)-prop-2'-en-1'-il]-rapamicina 6. (2'E,4'S)-40-0-(4',5'-Di-hidroxipent-2'-en-1'-il)-rapamicina 7. 40-0-(2-Hidroxi)etoxicarbonilmeti1-rapamicina 8. 40-0-(2-Hidroxi)eti1-rapamicina 9. 40-0-(3-Hidroxi)propi1-rapamicina 10. 40-0-(β-Hidroxi)hexil-rapamicina 11. 40-0-[2-(2-Hidroxi)etoxi]etil-rapamicina 12. 40-0-[(3 S)-2,2-Dimetildioxolan-3-il]meti1-rapamicina 13. 40-0-[(2 S)-2,3-Di-hidroxiprop-l-il]-rapamicina 14. 40-0-(2-Acetoxi)etil-rapamicina 15. 40-0-(2-Nicotinoiloxi)etil-rapamicina 16. 40-0-[2-(N-Morfolino)acetoxi]etil-rapamicina 17. 40-0-(2-N-Imidazolilacetoxi)etil-rapamicina 18. 40-0-(2-(N-Metil-N'-piperazinil)acetoxi]etil-rapamicina 19. 39-0-Desmetil-39,40-0,0-etileno-rapamicina 20. (26R)-26-Di-hidro-40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina 4 ΡΕ2008657 21. 28-0-Metil-rapamicina 22. 40-0-(2-Aminoetil)-rapamicina 23. 40-0-(2-Acetaminoetil)-rapamicina 24. 40-0-(2-Nicotinamidoetil)-rapamicina 25. 40-0-(2-(N-Metil-imidazo-2'-ilcarboxamido)etil)-rapamicina 26. 40-0-(2-Etoxicarbonilaminoetil)-rapamicina 27. 40-0-(2-Tolilsulfonamidoetil)-rapamicina 28. 40—0—[2—(4',5'-Dicarboetoxi-1,,2',3,-triazol-l,-il)-etil]-rapamicina 0 composto para uso de acordo com o presente invento é 40-0-(2-hidroxi)etil-rapamicina (referido a seguir como Composto A).

Os compostos de fórmula I têm, com base na atividade observada, por exemplo, ligação a macrofilin-12 (temperatura conhecido como proteína de ligação FK-506 ou FKBP-12), por exemplo, tal como descrito no documento WO 94/0910, tendo sido verificado que era útil, por exemplo, como imunossupressores, por exemplo, no tratamento da rejeição grave de aloenxertos.

Gregory et al. (Transplantation, vol. 55, no. 6, 1409-1418) refere o efeito da rapamicina no espessamento intimai arterial em vasos danificados. O documento EP-A-0 551 182 refere-se de maneira similar ao uso da repamicina no tratamento de doenças vasculares hiperproliferativas, tal como a restenose. 5 ΡΕ2008657 0 documento EP-A-0 691 130 refere-se à utilização de rapamicina na prevenção da célula do músculo liso intimai, restenose e/ou oclusão vascular a seguir a lesões vasculares.

Os transplantes dos órgãos de fígado, rim, pulmão e coração são agora regularmente realizados como tratamento de doenças dos órgãos em fase terminal. Devido à falta corrente de dadores humanos para aloenxertos transplantáveis, tem sido focalizada a atenção na possibilidade de utilizar xenoenxertos (transplantes entre as espécies) na transplantação. Um dos maiores obstáculos no transplante com sucesso de xenoenxertos em humanos é imunológico.

Um outro obstáculo na alo e xenotransplantação é a rejeição crónica e, deste modo, a transplantação de órgãos não é ainda uma solução clinicamente viável para a doença irreversível dos órgãos. A rejeição crónica, gue se manifesta como uma disfunção progressiva e irreversível do enxerto, é a causa principal da perda de transplante de órgãos, nalguns casos já após o primeiro ano pós-operativo. O problema clínico da rejeição crónica é claro a partir dos tempos de sobrevivência à transplantação; cerca de metade dos aloenxertos de rim perdidos no espaço de 5 anos após a transplantação e um valor semelhante é observado em doentes com aloenxertos do coração. 6 ΡΕ2008657 A rejeição crónica é considerada como um processo multifactorial, em que não apenas a reação imunológica em relação ao enxerto, mas também a resposta das paredes dos vasos sanguíneos no órgão enxertado às lesões (reação de "resposta às lesões") desempenha um papel. A variante da rejeição crónica com o pior prognóstico é uma alteração do tipo arteriosclerose, também designada vasculopatia do transplante, doença dos vasos do enxerto, arteriosclerose do enxerto, doença coronária do transplante, etc. Esta lesão vascular é caracterizada por uma migração e proliferação das células do músculo liso, provavelmente sob influência de fatores de crescimento que são entre outros sintetizados pelas células endoteliais. Isto conduz à proliferação e espessamento intimai, reparação da hipertrofia da célula do músculo liso e finalmente a uma oblietração luminal gradual (remodelação vascular). Parece progredir também através de lesão endotelial repetitiva entre outros por um anticorpo hospedeiro ou complexos antigénio-anticorpo; também os designados fatores não imu-nológicos tais como hipertensão, hiperlipidemia, hiperco-lesterolemia etc., desempenham um papel. A rejeição crónica parece ser inexorável e incontrolável porque não existe um tratamento eficaz ou uma modalidade de prevenção. Deste modo, continua a existir uma necessidade de um tratamento eficaz para a prevenção, controlo ou manifestações de inversão de doenças crónicas dos vasos do enxerto. 7 PE2008657

Continua também a existir uma necessidade de evitar ou tratar a restenose ou as oclusões casculares como consequência da proliferação e migração das céluas de músculo liso intimai, por exemplo, induzido por cirurgias vasculares tais como angioplastia.

De acordo com as descobertas particulares do presente invento, é proporcionado: 1. 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina para uso na prevenção ou tratamento da proliferação e espessamento neointrimal 2. 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina para uso na prevenção ou tratamento da restenose e/ou oclusão vascular a seguir a lesão vascular: A utilidade dos compostos de fórmula I no tratamento de doenças e condições tal como aqui especificado atrás, pode ser demonstrada em testes com animais, por exemplo, de acordo com os métodos aqui descritos a seguir. A. Rejeição Crónica de Aloenxerto (Exemplo de referência) 0 rim de uma ratazana macho DA (RTla) é ortopedicamente transplantado para um recetor Lewis macho (RT11) . No total foram transplantados 24 animais. Todos os animais são tratados com ciclosporina A a 7,5 mg/kg/dia per ΡΕ2008657 os durante 14 dias com início no dia da transplantação, para evitar a rejeição celular aguda. A nefrectomia contralateral não ocorre. Cada grupo experimental tratado com uma dose distinta de um composto de fórmula I ou placebo compreendia seis animais.

Com início no dia 53-64 após transplantação, os animais recetores são tratados per os durante mais 69-72 dias com um composto de fórmula I ou recebem placebo. Aos 14 dias após transplantação os animais são sujeitos a uma avaliação do enxerto através de imagiologia de ressonância magnética (MRI, da sigla em inglês) com medição da perfusão dos rins (com comparação do rim enxertado e do rim colateral próprio) . Isto é repetido aos dias 53-64 após transplantação e no final da experiência. Os animais são então autopsiados. Os parâmetros da rejeição, como a classificação MRI, taxa de perfusão relativa do rim enxertado e classificação hinológica do aloenxerto de rim em relação à rejeição celular e às alterações nos vasos são determinados e estatisticamente analisados. A administração de um composto de fórmula I, por exemplo, o Composto A, com uma dose de 0,5 a 2,5 mg/kg neste modelo de aloenxerto de rim de ratazana dá origem a uma redução em todos os parâmetros de rejeição mencionados. Neste teste, os animais tratados per os com 2,5 mg/kg/dia de Composto A tem uma classificação MRI de rejeição significativamente inferior, uma classificação histológica da rejeição celular e as alterações nos vasos e uma redução significativamente inferior na taxa de perfusão avaliada por MRI do que os animais do grupo do placebo. 9 ΡΕ2008657 B. Transplantaçao da Aorta (Exemplo de referência)

Neste modelo de transplantação da aorta na ratazana, uma resposta alogénica do enxerto não destrói o enxerto, mas dá origem a alterações patológicas que se assemelham às da rejeição crónica na transplantação clinica. Estas incluem a infiltração na adventícia das células monocelulares (linfócitos, macrófagos, algumas células de plasma), e espessamento da íntima. A aorta do dador entre a ramificação da artéria renal e o início da aorta mesentérica caudal, cerca de 1 cm de comprimento, é recolhida de uma ratazana macho DA (RTla) e é ortotopicamente transplantada numa ratazana macho Lewis (RT11) . Semanalmente após a transplantação, o peso corporal é registado. Na autópsia, o enxerto com parte da aorta do recetor imediatamente acima e abaixo do transplante é removido. É perfundido ex vivo com solução salina tamponada com fosfato suplementada com paraformaldeído a 2% e glutaraldeído a 2,5% durante cerca de 2 minutos, e então fixado durante 24 horas por fixação em imersão na mesma solução e depois disto fixado em formalina tamponada a 4%. Pedaços do enxerto são embebidos em parafina, de tal modo que quer a secção transversal quer a secção longitudinal é feita de aorta enxertada e da própria aorta do recetor.

Secções com uma espessura de 4 pm são coradas com 10 ΡΕ2008657 hematoxilin-eosina, elástica-von-Gieson e ácido periódico-Schiff. Para além da microscopia com luz convencional, são registadas imagens através de microscopia de varrimento com laser confocal. Em cada secção, são scaneadas quatro áreas e em cada área a espessura da intima e intima+media é medida em cinco locais.

Na autópsia, o peso é medido e a histologia é realizada para o timo, baço, fígado, rim, testículos e vesículas seminais.

Uma primeira experiência inclui 4 grupos, compreendendo cada um 4 animais. Num grupo são realizadas transplantações isogénicas (Lewis para Lewis), e os animais recebem uma microemulsão de placebo: os outros grupos compreendem transplantações alogénicas e os animais recebem per os quer uma micromemulsão de placebo quer um composto de fórmula I em microemulsão a 2,5 mg/kg/dia. A experiência é terminada às 7 semanas após transplantação.

Uma segunda experiência inclui 4 grupos, cada um compreendendo 4 animais. Em todos os casos transplantes alogénicos são realizados e os animais recebem per os quer uma micromemulsão de placebo quer um composto de fórmula I em microemulsão a 0,63, 1,25, 2,5 ou 5,0 mg/kg/dia. A experiência é terminada 11 semanas após transplantação.

Em ambas as experiências, os compostos de fórmula 1, particularmente o Composto A inibem significativamente a infiltração do enxerto e a formação da neoíntima. 11 ΡΕ2008657 C. Angioplastia

Estudos de angiplastia são realizados no modelo de lesão por cateter balão: a cateterização de balão é realizada no dia 0, essencialmente tal como descrito por Powell et al. (1989). Sob anestesia com isofluorano, é introduzido um cateter Fogarty 2F na artéria carótida comum esquerda através da carótida externa e insuflado (distensão ~10 μΐ H2O) . O balão insuflado é removido ao longo do comprimento da carótida comum três vezes, as duas últimas vezes enquanto se torce suavemente para se obter uma desendotelialização uniforme. O cateter é então removido, uma ligadura colocada à volta da carótida externa para evitar o sangramento e os animais são deixados a recuperar. 2 grupos de ratazanas R0R0 (400 g, aproximada-mente com 24 semanas) são utilizados no estudo: um grupo de controlo e um grupo que recebe o composto de fórmula I. As ratazanas são aleatoriamente utilizadas durante todo o manuseamento, procedimentos experimentais e análise. O composto a ser testado é administrado p.o. (gavagem) começando 3 dias antes da lesão pelo balão (dia -3) até ao final do estudo, 14 dias após as lesões pelo balão (dia +14). As ratazanas são mantidas em gaiolas individuais e deixadas com alimento e água ad libidum.

As ratazanas sao então anestesiadas com isofluo- 12 ΡΕ2008657 rano, um cateter de perfusão é inserido através do ventrículo esquerdo e segurado no arco aórtico, e uma cânula de aspiração inserida no ventrículo direito. Os animais são perfundidos sob uma pressão de perfusão de 150 mm Hg, primeiramente durante 1 min com uma solução salina tamponada com fosfato 0,1 M (PBS, pH 7,4) e então durante 15 min com glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato (pH 7,4). A pressão de perfusão é de 150 mm Hg na ponta da cânula (-100 mm Hg na artéria carótida), tal como determinado numa experiência preliminar introduzindo uma cânula ligada a um transdutor de pressão na carótida externa). As artérias carótidas são então excisadas, separadas do tecido envolvente e imersas em tampão cacodilato 0,1 M (pH 7,4) contendo sacarose a 7% e incuba-se durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as carótidas são imersas e agitadas durante 1 h à temperatura ambiente em KMn04 0,05% em cacodilato 0,1 M. Os tecidos são então desidratados numa série de etanol gradual. 2 x 10 min em 75%, 2 x 10 min em 85%, 3 x 10 min em 95% e 3 x 10 min em 100% de etanol. As carótidas desidratadas são então embebidas em Technovit 7100 de acordo com a recomendação dos fabricantes. 0 meio de embebimento é deixado a polimerizar durante a noite num exsicador sob atmosfera de árgon, dado que se verificou que o oxigénio inibe o endurecimento adequado dos blocos.

As secções com 1-2 pm de espessura são cortadas da secção média de cada carótida com uma faca de metal duro num micrótomo rotativo e coradas durante 2 min com corante de Giemsa. Cerca de 5 secções de cada carótida são assim 13 ΡΕ2008657 preparadas e a área da secção da media, neoíntima e o lúmen são morfometricamente avaliados através de um sistema de análise de imagem (MCID, Toronto, Canadá).

Neste ensaio, os compostos de fórmula I inibem a proliferação miointimal quando administrados per os com uma dose diária de 0,5 a 2,5 mg/kg. O espessamento intimai é significativamente menor nos vasos das ratazanas que receberam o Composto A em comparação com os animais de controlo, por exemplo, a 0,5 mg/kg de inibição estatística da neoíntima formação de 50%, a 2,5 mg/kg de inibição significante de 75%. D. Xenotransplantação de coração ín vivo (hamster para ratazana) (Exemplo de referência) A combinação de xenoenxerto de hamster em ratazana é uma designada combinação concordante difícil. As ratazanas não têm o anticorpo anti-hamster natural em quantidades suficientes para dar origem a uma rejeição hiperaguda imediata tal como observado em combinações concordantes; contudo, a rejeição em recetores não tratados ocorre no espaço de 3-4 dias, através de anticorpos em combinação com complemento. Isto é visualizado em histologia pela destruição dos vasos sanguímeos, exsudação e extravasamento de eritrócitos e influxo de granulócitos polimorfonuclear; frequentemente existem sinais de hemorragia e trombose. Uma vez que esta rejeição tenha sido ultrapassada por inibição eficaz da síntese de anticorpos 14 PE2008657 ou inativação complementar, uma rejeição celular pode emergir depois. Isto é visualizado em histologia pelo influxo de células mononucleares, incluindo linfócitos, células linfoblastóides e macrófagos e destruição do parênquima miócito. A inibição da rejeição celular requer mais imunossupressão do que a dos aloenxertos. Ratazanas congenitamente atimicas (rnu/um) têm falta de um sistema imunológico celular competente (dependente do timo) e geralmente são incapazes de rejeitar aloenxertos. Tais animais rejeitam um xenoenxerto de hamster no espaço de 3-4 dias de maneira semelhante à das ratazanas eutimicas, o que é indicativo que ocorre (pelo menos parte da) síntese de anticorpos anti-hamster nas ratazanas a seguir a uma resposta das células B independentes de timo. Tais recetores são úteis no xenoenxerto de hamster para avaliar a rejeição mediada pelo anticorpo independente do timo. 0 coração de um hamster Sírio é heterotopicamente transplantado para o abdómen de uma ratazana Lewis macho (RTI') com anastomoses entre a aorta do dador e recetor e a artéria pulmonar direita do dador para a veia cava inferior do recetor. 0 enxerto é monitorizado diariamente por palpação do abdómen. A rejeição é concluída no caso da cessação do batimento cardíaco. Os animais sãc ) pesados semanalmente. Na presente série de experiências o ponto final foi de 28 dias. Os animais são sujeitos a autópsia; para além do enxerto, o peso e a histologia são avaliados para o timo, baço, fígado, vesículas seminais e testículos. 0 sangue é recolhido e processado para se obter soro para a 15 ΡΕ2008657 determinação dos anticorpos de eritrócito anti-hamster citoliticos e a atividade de complemento hemolítico.

Neste ensaio, os compostos de fórmula 1, por exemplo, o Composto A, resultam numa sobrevivência ao enxerto prolongada, quer nos recetores atímicos quer eutímicos.

As dosagens diárias requeridas na prática do método do presente invento variarão dependendo, por exemplo, do composto de fórmula I empregue, do hospedeiro, do modo de administração e da gravidade de condição a ser tratada. Uma gama de dosagem diária preferida é de cerca de 0,25 a 25 mg como dose única ou doses divididas.

As dosagens diárias adequadas para os doentes são da ordem de, por exemplo, 0,2 a 25 mg p.o. preferencialmente 5 a 25. Os compostos de fórmula I podem ser administrados através de qualquer via convencional, em particular entericamente, por exemplo, na forma de comprimidos, cápsulas, soluções bebíveis, nasalmente, pulmonarmente (por inalação) ou parentericamente, por exemplo, na forma de soluções ou suspensões injetáveis. As formas de dosagem unitárias adequadas para administração oral compreendem cerca de 0,05 a 12,5 mg, usualmente 1 a 10 mg de ingrediente ativo, por exemplo Composto A, em conjunto com um ou mais diluentes ou portadores farmaceuticamente aceitáveis. ΡΕ2008657 16

Exemplo de Formulação: cápsulas

Etanol 20,0 mg 1,2-propilenoglicol 81,0 mg Óleo refinado 121,5 mg Cremophor RH40 202,5 mg Composto A 20,0 mg Total 500 mg 0 composto A é bem tolerado com dosagens requeridas para utilização de acordo com o presente invento. Por exemplo, o NTEL para o Composto A num estudo de toxicidade de 4 semanas é de 0,5 mg/kg/dia em ratazanas e 1,5 mg/kg/dia em macacos.

Lisboa, 4 de julho de 2013

Claims (6)

1. ΡΕ2008657 1 REIVINDICAÇÕES 1. 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina para utilização na prevenção ou tratamento da proliferação e espessamento neointimal.
2. 2. 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina para utilização de acordo com a reivindicação 1 na prevenção da proliferação e espessamento neointimal.
3. 3. 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina para utilização de acordo com a reivindicação 1 no tratamento da proliferação e espessamento neointimal.
4. 4. 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina para utilização na prevenção ou tratamento da restenose e/ou oclusão vascular a seguir a lesão vascular.
5. 5. 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina para utilização de acordo com a reivindicação 4 na prevenção ou tratamento da restenose e/ou oclusão vascular a seguir a lesão vascular.
6. 6. 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina para utilização de acordo com a reivindicação 4 no tratamento da restenose e/ou oclusão vascular a seguir a lesão vascular. Lisboa, 4 de julho de 2013 1 ΡΕ2008657 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * WO 9409010 A * £P 0881130 A * £P 0551182 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição * GREGORY et «f. Tis«sp/e«fefcn( vai, 55 1409-1415