PT1957539E

PT1957539E - Anticorpos monoclonais humanos para a proteína tirosinacinase 7 (ptk7) e sua utilização

Info

Publication number: PT1957539E
Application number: PT68485085T
Authority: PT
Inventors: Chin Pan; Li-Sheng Lu; Jonathan Alexander Terrett
Original assignee: Medarex Inc
Priority date: 2005-12-08
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2013-06-25
Also published as: CN101360761A; BRPI0619582A2; US9102738B2; SG177194A1; EP1957539B1; AU2006321841C1; SI1957539T1; JP5401639B2; EP1957539A2; US20100034826A1; IL191788A; CN101360761B; HK1121174A1; KR101373464B1; EA200801509A1; WO2007067730A2; CA2632552C; KR20080082660A; US9505845B2; NZ594466A

Description

ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Anticorpos monoclonais humanos para a proteína tirosina-cinase 7 (PTK7) e sua utilização"

Antecedentes do Invento

Os receptores tirosina-cinases (RTK) são proteínas de sinalização transmembranares que transmitem sinais biológicos do ambiente extracelular para o interior da célula. A regulação dos sinais de RTK é importante para a regulação do crescimento celular, da diferenciação, do crescimento axonal, do crescimento epitelial, do desenvolvimento, da adesão, da migração e da apoptose (Prenzel et al., (2001), Endocr.

Relat. Câncer 8: 11-31; Hubbard e Till (2000) Annu. Rev. Biochem. 69: 373-98). Sabe-se que as RTK estão envolvidas no desenvolvimento e na progressão de várias formas de cancro. Na maior parte dos cancros relacionados com RTK, houve uma amplificação da proteína receptora em vez de uma mutação do gene (Kobus e Fleming (2005) Biochemistry 44: 1464-70). A proteína tirosina-cinase 7 (PTK7), um membro da família de proteínas receptoras tirosina-cinases, foi isolada pela primeira vez a partir de melanócitos humanos normais e clonada através de RT-PCR (Lee et al., (1993) Oncogene 8: 3403-10; Park et al., (1996) J. Biochem. 119: 235-9).

Separadamente, o gene foi clonado a partir de linhas celulares derivadas de carcinoma do cólon humano e designado cinase de carcinoma do cólon 4 (CCK4) (Mossie et al. (1995) Oncogene 11: 2179-84). A PTK7 pertence a um subconjunto de RTK que não têm actividade de tirosina-cinase catalítica detectável mas mantêm a actividade de transdução do sinal e pensa-se que funcione possivelmente como uma molécula de adesão celular.

Verificou-se que o ARNm para PTK7 era expresso variavelmente em linhas celulares derivadas de carcinoma do cólon mas não se verificou ser expresso em tecidos do cólon humano adulto (Mossie et al., supra). A expressão de PTK7 foi também observada nalgumas linhas celulares de melanoma e biopsias de melanoma (Easty, et al. (1997) Int. J. Câncer 71: 1061-5). Verificou-se que era expressa uma forma de 2 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ processamento alternativo em hepatomas e células de cancro do cólon (Jung et al., (2002) Biochim, Biophys, Acta 1579: 153- 63). Além disso, verificou-se que PTK7 era altamente sobre-expressa em amostras de leucemia mielóide aguda (Muller-Tidow et ai., (2004) Clin. Câncer Res. 10: 1241-9). Através de imuno-histoquímica, coloração específica de tumores de PTK7 foi observada em cancros da mama, do cólon, do pulmão, do pâncreas, do rim e da bexiga, tal como descrito na Publicação PCT WO 04/17992. WO 2004/017992 descreve PTK7, agentes que interagem com, ou modulam a expressão ou actividade de PTK7, e sua utilização no tratamento de carcinoma. Kyriakos et al. (Câncer Research 52, Fevereiro de 1992, N° 4, páginas 835-842) descreve o destino de anticorpos ligados à superfície de células tumorais in vitro.

Concordantemente, são desejados agentes que reconheçam PTK7, e métodos de utilização de tais agentes.

Sumário da Invenção A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais isolados, em particular anticorpos monoclonais humanos, que se ligam a PTK7 e que exibem numerosas propriedades desejáveis. Estas propriedades incluem ligação de elevada afinidade a PTK7 humana e ligação a células de tumores de Wilms. São também proporcionados os anticorpos e as composições da invenção para utilização em métodos para tratamento de uma variedade de doenças mediadas por PTK7. A invenção refere-se a um anticorpo monoclonal humano isolado, ou uma porção de ligação ao antigénio deste, em que o anticorpo: a) se liga especificamente a PTK7 humana; e b) se liga a uma linha de células de tumor de Wilms tendo o N° de Acesso ATCC CRL-1441 com uma CE5o de 4,0 nM ou menos, num ensaio que compreende a incubação de lxlO5 células com o anticorpo a uma concentração de partida de 30 pg/ml e diluição em série do anticorpo até uma diluição de 1:10; e c) se liga ao mesmo epitopo em PTK7 humana como um anticorpo de referência compreendendo: i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 3 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; ou ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; ou iii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Um anticorpo preferido ou porção de ligaçao ao antigénio deste compreende: a) uma região variável compreendendo SEQ ID NO: 12; de cadeia pesada CDR1 b) uma região variável compreendendo SEQ ID NO: 16; de cadeia pesada CDR2 c) uma região variável compreendendo SEQ ID NO: 20; de cadeia pesada CDR3 d) uma região variável de cadeia a SEQ ID NO: 25; leve CDR1 compreendendo e) uma região variável de cadeia SEQ ID NO: 31; e leve CDR2 compreendendo f) uma região variável de cadeia SEQ ID NO: 37; leve CDR3 compreendendo ou a) uma região variável compreendendo SEQ ID NO: 14; de cadeia pesada CDR1 b) uma região variável compreendendo SEQ ID NO: 18; de cadeia pesada CDR2 c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 22; d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 28; e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 34; e f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 40; OU a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 13; 4 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 17; c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 21; d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 26; e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 32; e f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 38.

Outros anticorpos preferidos do invento, ou porções de ligação ao antigénio destes, compreendem: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; ou a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; ou a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

Os anticorpos do invento podem ser, por exemplo, anticorpos inteiros, por exemplo de um isotipo IgGl ou IgG4. Alternativamente, os anticorpos podem ser fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos Fab ou Fab'2, ou anticorpos de cadeia simples. O invento também proporciona um imunoconjugado compreendendo um anticorpo do invento, ou uma porção de ligação ao antigénio deste, ligado a um agente terapêutico, tal como uma citotoxina ou um isótopo radioactivo.

Composições compreendendo um anticorpo, ou uma porção de ligação ao antigénio deste, ou imunoconjugado do invento e um 5

ΕΡ 1 957 539/PT transportador farmaceuticamente aceitável sao também proporcionadas.

Moléculas de ácido nucleico codificando os anticorpos, ou as porções de ligação ao antigénio destes, do invento são também englobados pelo invento, bem como vectores de expressão compreendendo tais ácidos nucleicos e células hospedeiras compreendendo tais vectores de expressão. É também proporcionado um método in vitro para preparação de um anticorpo do invento que compreende a expressão do anticorpo numa célula hospedeira do invento e o isolamento do anticorpo a partir da célula hospedeira.

Além disso, é aqui divulgado um ratinho transgénico compreendendo transgenes de cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana, em que o ratinho expressa um anticorpo do invento, bem como hibridomas preparados a partir de um tal ratinho, em que o hibridoma produz o anticorpo do invento.

Ainda noutro aspecto, o invento proporciona um anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, do invento para utilização num método de tratamento ou prevenção de um cancro caracterizado por crescimento de células tumorais expressando PTK7. 0 cancro pode ser cancro do cólon (incluindo cancro do intestino delgado), cancro do pulmão, cancro da mama, cancro do pâncreas, melanoma (p. ex., melanoma maligno metastático), leucemia mielóide aguda, cancro do rim, cancro da bexiga, cancro do ovário ou cancro da próstata. Exemplos de outros cancros incluem cancro renal (p. ex., carcinoma de células renais), glioblastoma, tumores cerebrais, leucemias crónicas ou agudas incluindo leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia de células T do adulto (T-ALL), leucemia mielóide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfornas (p. ex., linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma primário do SNC, linfoma de células T, linfoma de Burkitt, linfomas anaplásicos de células grandes (ALCL), linfomas de células T cutâneas, linfomas nodulares de células pequenas clivadas, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas imunoblásticos, leucemia/linfornas de células T (ATLL), cancros linfomas 6 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ foliculares enteroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfomas de células grandes difusas da linhagem B, linfoma de células T semelhante a linfoadenopatia angioimunoblástica (AILD) e linfomas baseados em cavidades corporais associadas a VIH) , carcinomas embrionários, carcinomas indiferenciados da rinofaringe (p. ex., tumor de Schmincke), doença de Castleman, Sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e outros linfomas de células B, carcinomas nasofaringicos, cancro ósseo, cancro da pele, cancro da cabeça ou do pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intra-ocular, cancro uterino, cancro rectal, cancro da região anal, cancro do estômago, cancro testicular, cancro uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, cancro do esófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino, cancro da glândula tiróide, cancro da glândula paratiróide, cancro da glândula supra-renal, sarcoma de tecidos moles, cancro da uretra, cancro do pénis, tumores sólidos da infância, cancro da bexiga, cancro do rim ou uréter, carcinoma do pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), angiogénese tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma hipofisário, carcinoma epidermóide, cancro de células escamosas, cancros ambientalmente induzidos incluindo aqueles induzidos pelo amianto, p. ex., mesotelioma e combinações dos referidos cancros.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura IA mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 41) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) da região variável de cadeia pesada dos anticorpos monoclonais humanos 3G8 e 3G8a. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 11), CDR2 (SEQ ID NO: 15) e CDR3 (SEQ ID NO: 19) estão delineadas e as derivações da linha germinativa V, D e J estão indicadas. A Figura 1B mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 45) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 3G8. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 23), CDR2 (SEQ ID NO: 29) e CDR3 (SEQ ID NO: 35) estão delineadas e as derivações da linha germinativa V e J estão indicadas. 7 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ A Figura 1C mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 46) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 3G8a. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 24), CDR2 (SEQ ID NO: 30) e CDR3 (SEQ ID NO: 36) estão delineadas e as derivações da linha germinativa V e J estão indicadas. A Figura 2A mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 42) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 4D5. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 12), CDR2 (SEQ ID NO: 16) e CDR3 (SEQ ID NO: 20) estão delineadas e as derivações da linha germinativa V, D e J estão indicadas. A Figura 2B mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 47) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 4D5.

As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 25), CDR2 (SEQ ID NO: 31) e CDR3 (SEQ ID NO: 37) estão delineadas e as derivações da linha germinativa V e J estão indicadas. A Figura 3A mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 43) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) da região variável de cadeia pesada dos anticorpos monoclonais humanos 12C6. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 17) e CDR3 (SEQ ID NO: 21) estão delineadas e as derivações da linha germinativa V, D e J estão indicadas. A Figura 3B mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 48) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 12C6. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 26), CDR2 (SEQ ID NO: 32) e CDR3 (SEQ ID NO: 38) estão delineadas e as derivações da linha germinativa V e J estão indicadas. A Figura 3C mostra a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 49) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 12C6a. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 27), CDR2 (SEQ ID NO: 33) e CDR3 (SEQ ID NO: 39) estão delineadas e as derivações da linha germinativa V e J estão indicadas. 8 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ A Figura 4Α mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 44) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 7C8. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 18) e CDR3 (SEQ ID NO: 22) estão delineadas e as derivações da linha germinativa V, D e J estão indicadas. A Figura 4B mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 50) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 7C8. As regiões CDR1 (SEQ ID NO: 28), CDR2 (SEQ ID NO: 34) e CDR3 (SEQ ID NO: 40) estão delineadas e as derivações da linha germinativa V e J estão indicadas. A Figura 5 mostra o alinhamento das sequências de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesadas de 3G8 (SEQ ID NO: 1) e 3G8a (SEQ ID NO: 1) com a sequência de aminoácidos de VH 3-30.3 da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 51) (linha germinativa JH4b divulgada como SEQ ID NO: 59) . A Figura 6 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 4D5 (SEQ ID NO: 2) com a sequência de aminoácidos de VH 3-30.3 da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 51) (linha germinativa JH4b divulgada como SEQ ID NO: 60). A Figura 7 mostra o alinhamento das sequências de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesadas de 12C6 (SEQ ID NO: 3) e 12C6a (SEQ ID NO: 2) com a sequência de aminoácidos de VH DP44 da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 52) (linhas germinativas 3-7, 3-23, e JH4b divulgadas como SEQ ID NOS 61-63, respectivamente). A Figura 8 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 7C8 (SEQ ID NO: 4) com a sequência de aminoácidos de VH 3-33 da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 53) (linha germinativa 3H6b divulgada como SEQ ID NO: 64). 9 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ A Figura 9 mostra ο alinhamento das sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeias leves de 3G8 (SEQ ID NO: 5) e 3G8a (SEQ ID NO: 6) com a sequência de aminoácidos de Vk L15 da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 54) (linha germinativa JK1 divulgada como SEQ ID NO: 65). A Figura 10 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 4D5 (SEQ ID NO: 7) com a sequência de aminoácidos de Vk AIO da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 55) (linha germinativa JK5 divulgada como SEQ ID NO: 66). A Figura 11 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 12C6 (SEQ ID NO: 8) com a sequência de aminoácidos de Vk A27 da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 56) (linha germinativa JK2 divulgada como SEQ ID NO: 67). A Figura 12 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 12C6a (SEQ ID NO: 9) com a sequência de aminoácidos de Vk L15 da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 54) (linha germinativa JK2 divulgada como SEQ ID NO: 68). A Figura 13 mostra o alinhamento da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 7C8 (SEQ ID NO: 10) com a sequência de aminoácidos de Vk L6 da linha germinativa humana (SEQ ID NO: 57) (linha germinativa JK3 divulgada como SEQ ID NO: 69). A Figura 14 mostra os resultados de experiências de citometria de fluxo demonstrando que o anticorpo monoclonal humano 7C8, dirigido contra a PTK7 humana, se liga à superfície celular de células HEK3 transfectadas com PTK7 humana inteira. A Figura 15 mostra os resultados de experiências de ELISA demonstrando que anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra a PTK7 humana se ligam especificamente a PTK7. 10 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ A Figura 16 mostra os resultados de experiências de citometria de fluxo demonstrando que anticorpos dirigidos contra a PTK7 humana se ligam à superfície celular de células de tumor de Wilms. A Figura 17 mostra os resultados de experiências de citometria de fluxo demonstrando que anticorpos dirigidos contra a PTK7 humana se ligam à superfície celular de uma variedade de linhas celulares de cancro. A Figura 18 mostra os resultados de experiências de citometria de fluxo demonstrando que anticorpos dirigidos contra a PTK7 humana se ligam à superfície celular de células dendríticas. A Figura 19 mostra os resultados de experiências de citometria de fluxo demonstrando que anticorpos dirigidos contra a PTK7 humana se ligam a linfócitos T CD4+ e CD8+, mas não a linfócitos B. A Figura 20 mostra os resultados de experiências de internalização de Hum-Zap demonstrando que anticorpos monoclonais humanos contra a PTK7 humana se podem internalizar em células PTK7+. (A) Internalização dos anticorpos humanos 3G8, 4D5 e 7C8 em células de tumor de Wilms. (B) Internalização do anticorpo humano 12C6 em células de tumor de Wilms. (C) Internalização dos anticorpos humanos 7C8 e 12C6 em células tumorais A-431. (D) Internalização dos anticorpos humanos 7C8 e 12C6 em células tumorais PC3. A Figura 21 mostra os resultados de um ensaio de proliferação celular demonstrando que anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 conjugados com toxina matam linhas celulares de cancro renal humano. A Figura 22 mostra os resultados de um ensaio de proliferação celular demonstrando que anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 conjugados com toxina matam linhas celulares expressando níveis baixos a elevados de expressão de PTK7. 11 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ A Figura 23 mostra os resultados de um ensaio de invasão demonstrando que anticorpos anti-PTK7 inibem a mobilidade da invasão das células expressando PTK7 na superfície celular. A Figura 24 mostra os resultados de um estudo de xenoenxerto de tumor in vivo demonstrando que anticorpos anti-PTK7 conjugados com uma toxina atrasaram a progressão do crescimento tumoral em cancro do pâncreas. A Figura 25 mostra os resultados de um estudo de xenoenxerto de tumor in vivo demonstrando que anticorpos anti-PTK7 conjugados com uma toxina atrasaram a progressão do crescimento tumoral em cancro da mama.

Descrição Detalhada do Invento

Num aspecto, o presente invento refere-se a anticorpos monoclonais isolados, particularmente anticorpos monoclonais humanos, que se ligam especificamente a PTK7. Em certas concretizações, os anticorpos do invento exibem uma ou mais propriedades funcionais desejadas, tais como ligação de elevada afinidade a PTK7 e/ou a capacidade para inibir o crescimento de células tumorais in vitro ou in vivo. Em certas concretizações, os anticorpos do invento são derivados de sequências de determinadas cadeias pesadas e leves da linha germinativa e/ou compreendem determinadas características estruturais tais como regiões CDR compreendendo determinadas sequências de aminoácidos. 0 invento proporciona anticorpos isolados, métodos de produção de tais anticorpos, imunoconjugados e moléculas biespecíficas compreendendo tais anticorpos e composições farmacêuticas contendo os anticorpos, os imunoconjugados ou as moléculas biespecíficas do invento. 0 invento refere-se também a métodos de utilização dos anticorpos, tais como para tratar doenças tais como cancro.

Para que o presente invento possa ser mais facilmente compreendido, são primeiro definidos certos termos. Definições adicionais são estabelecidas ao longo da descrição detalhada. 12 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Os termos "ΡΤΚ7" e "CCK4" são utilizados indiferentemente e incluem variantes, isoformas e homólogos de espécie da PTK7 humana. Deste modo, os anticorpos humanos do invento podem, em certos casos, reagir de forma cruzada com PTK7 de outras espécies que não a humana. Em certas concretizações, os anticorpos podem ser completamente específicos para uma ou mais PTK7 humanas e podem não exibir reactividade cruzada com outras espécies ou outros tipos não humanos. A sequência de aminoácidos completa de uma PTK7 humana exemplar tem o número de acesso Genbank NM_002821 (SEQ ID NO: 58). 0 termo "resposta imunitária" refere-se à acção de, por exemplo, linfócitos, células de apresentação do antigénio, células fagociticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou pelo fígado (incluindo anticorpos, citocinas, e complemento) que resulta em danos, destruição ou eliminação selectiva do corpo humano de patogénios invasores, células ou tecidos infectados com patogénios, células cancerosas, ou, nos casos de auto-imunidade e inflamação patológica, células ou tecidos humanos normais.

Uma "via de transdução de sinal" refere-se à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal a partir de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula. Tal como aqui utilizada, a frase "receptor da superfície celular" inclui, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e a transmissão de tal sinal através da membrana plasmática de uma célula. Um exemplo de um "receptor da superfície celular" do presente invento é o receptor PTK7. 0 termo "anticorpo" tal como aqui referido inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação ao antigénio (i.e., "porção de ligação ao antigénio") ou cadeias simples deste. Um "anticorpo" refere-se a uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas através de ligações dissulfureto, ou uma porção de ligação ao antigénio deste. Cada cadeia pesada é constituída por uma região variável de 13 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é constituída por três domínios, CHi, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é constituída por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR) . Cada VH e VL é composta por três CDR e quatro FR, dispostas do terminal amino para o terminal carboxilo na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou factores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunitário (p. ex., células efectoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema do complemento clássico. 0 termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), tal como aqui utilizado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio (p. ex., PTK7). Foi mostrado que a função de ligação ao antigénio de um anticorpo pode ser efectuada através de fragmentos de um anticorpo inteiro. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2/ um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados através de uma ponte dissulfureto na região charneira; (iii) um fragmento Fab', que é essencialmente um Fab com parte da região charneira (ver, "FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY" (Paul ed., 3a ed. 1993); (iv) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (v) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; (vi) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste num domínio VH; (vii) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada; e (viii) a nanocorpo, uma região variável de cadeia pesada contendo um domínio variável simples e dois domínios 14 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ constantes. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, são codificados por genes separados, podem ser ligados, utilizando métodos recombinantes, através de um ligador sintético que lhes permite que sejam produzidos como uma única cadeia proteica em que as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv) ; ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 85: 5879-5883). Pretende-se que tais anticorpos de cadeia simples estejam também englobados no termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas dos peritos na técnica, e os fragmentos são pesquisados quanto à utilidade da mesma maneira que o são os anticorpos intactos.

Um "anticorpo isolado", tal como aqui se utiliza, pretende referir-se a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos possuindo diferentes especificidades antigénicas (p. ex., um anticorpo isolado que se liga especificamente a PTK7 é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente a outros antigénios que não PTK7) . Um anticorpo isolado que se liga especificamente a PTK7 pode, no entanto, ter reactividade cruzada com outros antigénios, tais como moléculas de PTK7 de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e/ou de químicos.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" tal como aqui se utiliza refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma única especificidade de ligação e afinidade para um determinado epitopo. 0 termo "anticorpo humano", tal como aqui se utiliza, pretende incluir anticorpos possuindo regiões variáveis em que tanto as regiões estruturais como as CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Além disso, se o anticorpo compreender uma região constante, a região constante é também derivada de sequências de 15 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos do invento podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (p. ex. mutações introduzidas através de mutagénese aleatória ou específica do local in vitro ou através de mutação somática in vivo) . No entanto, o termo "anticorpo humano", tal como aqui se utiliza, não pretende incluir anticorpos em que as sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um ratinho, foram enxertadas em sequências estruturais humanas. 0 termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos apresentando uma única especificidade de ligação que possuem regiões variáveis em que tanto as regiões estruturais como as CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Numa concretização, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal transgénico não humano, p. ex., um ratinho transgénico, possuindo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundido com uma célula imortalizada. 0 termo "anticorpo humano recombinante", tal como aqui se utiliza, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados através de meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados a partir de um animal (p. ex., um ratinho) que seja transgénico ou transcromossómico para genes de imunoglobulinas humanas ou um hibridoma preparado a partir deste (descrito mais abaixo), (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, p. ex., a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de uma biblioteca combinatória de anticorpos humanos recombinantes, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de quaisquer outros meios que envolvam o processamento alternativo de sequências de genes de imunoglobulina humanas com outras sequências de ADN. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nas quais as regiões estruturais e as CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Em certas concretizações, no entanto, tais anticorpos humanos 16 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ recombinantes podem ser submetidos a mutagénese in vitro (ou, quando é utilizado um animal transgénico para sequências de Ig humanas, mutagénese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de, e relacionadas com, sequências de VH e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente no repertório de anticorpos da linha germinativa humana in vivo.

Tal como aqui se utiliza, "isotipo" refere-se à classe de anticorpos (p. ex., IgM ou IgGl) que é codificada pelos genes da região constante de cadeia pesada.

As frases "um anticorpo que reconhece um antigénio" e "um anticorpo especifico para um antigénio" são aqui utilizadas indiferentemente com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio". 0 termo "derivados de anticorpos humanos" refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo humano, p. ex., um conjugado de anticorpo e outro agente ou anticorpo. 0 termo "anticorpo humanizado" pretende referir-se a anticorpos em que sequências das CDR derivadas da linha germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um ratinho, foram enxertadas em sequências estruturais humanas. Modificações adicionais da região estrutural podem ser feitas dentro das sequências estruturais humanas. 0 termo "anticorpo quimérico" pretende referir-se a anticorpos em que as sequências das regiões variáveis são derivadas de uma espécie e as sequências das regiões constantes são derivadas de outra espécie, tal como um anticorpo em que as sequências das regiões variáveis são derivadas de um anticorpo de ratinho e as sequências das regiões constantes são derivadas de um anticorpo humano.

Tal como aqui se utiliza, um anticorpo que "se liga especificamente a PTK7 humana" pretende referir-se a um anticorpo que se liga a PTK7 humana com uma KD de lxlCT7 M ou menos, de preferência 5xlCT8 M ou menos, de maior preferência lxlO-8 M ou menos, ainda de preferência 5xlCT9 M ou menos. 17 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ Ο termo "não se liga substancialmente" a uma proteína ou células, tal como aqui se utiliza, significa que não se liga ou não se liga com uma afinidade elevada à proteína ou às células, i.e. liga-se à proteína ou às células com uma KD de 1 x 1CT6 M ou mais, de preferência lxlCT5 M ou mais, de maior preferência lxlCT4 M ou mais, ainda de preferência lxlO”3 M ou mais, ainda de maior preferência lxlCT2 M ou mais. O termo "Kassoc" ou "Ka", tal como aqui se utiliza, pretende referir-se à velocidade de associação de uma determinada interacção anticorpo-antigénio, enquanto o termo "Kdis" ou "Kd, " tal como aqui se utiliza, pretende referir-se à velocidade de dissociação de uma determinada interacção anticorpo-antigénio. 0 termo "KD", tal como aqui se utiliza, pretende referir-se à constante de dissociação, que é obtida a partir da razão de Kd para Ka (i.e., Kd/Ka) e é expresso como concentração molar (M). Os valores de KD para anticorpos podem ser determinados utilizando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método preferido para a determinação da KD de um anticorpo é através da utilização de ressonância de plasmão de superfície, de preferência utilizando um sistema biossensor tal como um sistema Biacore®.

Tal como aqui se utiliza, o termo "elevada afinidade" para um anticorpo IgG refere-se a um anticorpo possuindo uma KD de 1CT8 M ou menos, de preferência 1CT9 M ou menos e de maior preferência 1CT10 M ou menos para um antigénio alvo. No entanto, a ligação de "elevada afinidade" pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, ligação de "elevada afinidade" para um isotipo IgM refere-se a um anticorpo possuindo uma KD de IO”7 M ou menos, de preferência 10”8 M ou menos, de maior preferência 10”9 M ou menos.

Tal como aqui se utiliza, o termo "sujeito" inclui qualquer animal humano ou não humano. 0 termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, p. ex., mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc. Vários aspectos do invento são descritos em mais detalhe nas seguintes subsecções. 18 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Anticorpos Anti-PTK7

Os anticorpos do invento são caracterizados por determinadas caracteristicas ou propriedades funcionais dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos ligam-se especificamente a PTK7. De preferência, um anticorpo do invento liga-se a PTK7 com elevada afinidade, por exemplo com uma KD de lxlO-7 M ou menos. De preferência, o anticorpo liga-se a PTK7 humana com uma KD de 5x1 CT8 M ou menos, liga-se a PTK7 humana com uma KD de lxlCT8 M ou menos, liga-se a PTK7 humana com uma KD de 5xlCT9 M ou menos, ou liga-se a PTK7 humana com uma KD de entre lxlCT8 M e lxlCT10 M ou menos. 0 anticorpo liga-se a células de tumor de Wilms com uma CE5o de 4,0 nM ou menos, ou liga-se a células de tumor de Wilms com uma CE50 de 3,5 nM ou menos. Os ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos a PTK7 são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ELISA, Western blots e RIA. A cinética de ligação (p. ex., afinidade de ligação) dos anticorpos pode também ser avaliada através de ensaios padrão conhecidos na técnica, tal como através de ELISA, análise de Scatchard e Biacore. Como outro exemplo, os anticorpos do presente invento podem ligar-se a uma linha de células tumorais de carcinoma do rim, por exemplo, uma linha celular de tumor de Wilms. Ensaios adequados para avaliação de qualquer uma das caracteristicas acima descritas são descritos em detalhe nos Exemplos.

Anticorpos Monoclonais 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8

Os anticorpos do invento incluem os anticorpos monoclonais humanos 4D5, 12C6 e 7C8. Outros anticorpos aqui divulgados incluem 3G8, 3G8a e 12C6. Todos os anticorpos foram isolados e estruturalmente caracterizados tal como descrito nos Exemplos 1 e 2. Os vulgares peritos na técnica devem apreciar que os anticorpos 3G8 e 3G8a, bem como os anticorpos 12C6 e 12C6a possuem a mesma sequência de cadeia pesada, embora difiram nas suas sequências de cadeia leve. As sequências de aminoácidos de VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas em SEQ ID NOs: 1 (3G8 e 3G8a) , 2 (4D5), 3 (12C6 e 12C6a) e 4 (7C8). As sequências de 19 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ aminoácidos de VL de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 sao mostradas em SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8, 9 e 10, respectivamente.

Dado que cada um destes anticorpos se pode ligar a PTK7, as sequências de VH e VL podem ser "misturadas e combinadas" para criar outras moléculas de ligação anti-PTK7. A ligação a PTK7 de tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada utilizando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (p. ex., ELISA). De preferência, quando as cadeias de VH e VL são misturadas e combinadas, a sequência de VH de um determinado emparelhamento VH/VL é substituída por uma sequência de VH estruturalmente semelhante. Da mesma forma, de preferência uma sequência de VL de um determinado emparelhamento VH/VL é substituída por uma sequência VL estruturalmente semelhante.

Concordantemente, num aspecto, é aqui descrito um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antigénio deste, compreendendo: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 2, 3 e 4; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8, 9 e 10; em que o anticorpo se liga especificamente a PTK7, de preferência PTK7 humana. O anticorpo, ou porção de ligação ao anticorpo deste, do invento pode compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; ou (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; ou (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. 20 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Outras combinações divulgadas de cadeias pesadas e leves incluem: 20 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ (a) uma região variável sequência de aminoácidos de variável de cadeia leve aminoácidos de SEQ ID NO: 5; (a) uma região variável sequência de aminoácidos de variável de cadeia leve aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (a) uma região variável sequência de aminoácidos de variável de cadeia leve aminoácidos de SEQ ID NO: 9. de cadeia pesada SEQ ID NO: 1; e compreendendo a ou de cadeia pesada SEQ ID NO: 1; e compreendendo a ou de cadeia pesada SEQ ID NO: 3; e compreendendo a compreendendo a (b) uma região sequência de compreendendo a (b) uma região sequência de compreendendo a (b) uma região sequência de

Noutro aspecto, são aqui divulgados anticorpos que compreendem as CDR1, CDR2 e CDR3 das cadeias pesadas e cadeias leves de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8, ou combinações destas. As sequências de aminoácidos das CDR1 de VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas em SEQ ID NOs: 11 (3G8 e 3G8a) , 12 (4D5), 13 (12C6 e 12C6a) e 14 (7C8). As sequências de aminoácidos das CDR2 de VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas em SEQ ID NOs: 15 (3G8 e 3G8a) , 16 (4D5), 17 (12C6 e 12C6a) e 18 (7C8). As sequências de aminoácidos das CDR3 de VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas em SEQ ID NOs: 19 (3G8 e 3G8a) , 20 (4D5), 21 (12C6 e 12C6a) e 22 (7C8). As sequências de aminoácidos das CDR1 de Vk de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas em SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 e 28, respectivamente. As sequências de aminoácidos das CDR2 de Vk de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas em SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33 e 34, respectivamente. As sequências de aminoácidos das CDR3 de Vk de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas em SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 e 40, respectivamente. As regiões CDR são delineadas utilizando o sistema de Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) "Sequences of

Proteins of Immunological Interest", Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242). 21 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Dado que cada um destes anticorpos se pode ligar a PTK7 e que a especificidade de ligação ao antigénio é proporcionada principalmente pelas regiões CDR1, CDR2, e CDR3, as sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 de VH e as sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 de Vk podem ser "misturadas e combinadas" (i.e., CDR de diferentes anticorpos podem ser misturadas e combinadas, embora cada anticorpo deva conter uma CDR1, CDR2, e CDR3 de VH e uma CDR1, CDR2, e CDR3 de Vk) para criar outras moléculas de ligação anti-PTK7 do invento. A ligação a PTK7 de tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada utilizando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (p. ex., ELISA, análise Biacore) . De preferência, quando as sequências das CDR de VH são misturadas e combinadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma determinada sequência de VH é substituída por uma ou mais sequências CDR estruturalmente semelhantes. De igual modo, quando as sequências de CDR de Vk são misturadas e combinadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma determinada sequência de Vk é, de preferência, substituída por uma ou mais sequências de CDR estruturalmente semelhantes. Será facilmente aparente para o vulgar perito na técnica que novas sequências de VH e VL podem ser criadas através da substituição de uma ou mais sequências das regiões CDR de VH e/ou VL por sequências estruturalmente semelhantes das sequências de CDR aqui divulgadas para os anticorpos monoclonais 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8.

Concordantemente, noutro aspecto, é aqui divulgado um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação ao antigénio deste compreendendo: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 11, 12, 13 e 14; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 15, 16, 17 e 18; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 19, 20, 21 e 22; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a 22 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 e 28; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33 e 34; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 e 40; em que o anticorpo se liga especificamente a PTK7, de preferência PTK7 humana. O anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, do invento pode compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 12; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 16; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 20; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 25; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 31; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 37; ou (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 14; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 18; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 22; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 28; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 34; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 40; ou 23 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 13; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 17; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 21; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 26; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 32; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 38 .

Sao também aqui divulgados anticorpos compreendendo: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: li; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 15; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 19; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 23; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 29; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 35; ou (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: li; (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 15; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 19; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 24; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 30; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 36; ou (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 13; 24 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ (b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 17; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 21; (d) uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 27; (e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 33; e (f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 39; É bem conhecido na técnica que o domínio CDR3, independentemente do domínio CDR1 e/ou CDR2, pode determinar sozinho a especificidade de ligação de um anticorpo para um antigénio cognato e que podem ser previsivelmente gerados múltiplos anticorpos possuindo a mesma especificidade de ligação com base numa sequência CDR3 comum. Ver, por exemplo, Klimka et ai., British J. of Câncer 83(2): 252-260 (2000) (descrevendo a produção de um anticorpo anti-CD30 humanizado utilizando apenas o domínio variável de cadeia pesada CDR3 do anticorpo anti-CD30 de murídeo Ki-4); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296: 833-849 (2000) (descrevendo anticorpos da glicoproteína-2 epitelial (EGP-2) recombinantes utilizando apenas a sequência da CDR3 de cadeia pesada do anticorpo parental de murídeo anti-EGP-2 MOC-31); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 8910-8915 (1998) (descrevendo um painel de anticorpos anti-integrina ανβ3 humanizados utilizando um domínio variável CDR3 de cadeia pesada e leve de um anticorpo anti-integrina ανβ3 de murídeo LM609 em que cada anticorpo membro compreende uma sequência distinta fora do domínio CDR3 e é capaz de se ligar ao mesmo epitopo que o anticorpo de murídeo parental com afinidades tão elevadas ou mais que o anticorpo de murídeo parental); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116: 2161-2162 (1994) (divulgando que o domínio CDR3 proporciona a contribuição mais significativa para a ligação ao antigénio); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 2529-2533 (1995) (descrevendo o enxerto de sequências de CDR3 de cadeia pesada de três Fabs (SI-1, SI-40, e SI-32) contra ADN placentário humano na cadeia pesada de um Fab anti-toxóide do tétano substituindo deste modo a CDR3 da cadeia pesada existente e demonstrando que o domínio CDR3 sozinho conferiu especificidade de ligação); e Ditzel et 25 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ al., J. Immunol. 157: 739-749 (1996) (descrevendo estudos de enxertos em que a transferência de apenas a CDR3 da cadeia pesada de um Fab poli-especifico parental LNA3 numa cadeia pesada de um anticorpo Fab IgG monoespecifico de ligação ao toxóide do tétano p313 foi suficiente para manter a especificidade de ligação do Fab parental).

Consequentemente, são aqui divulgados anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais dominios CDR3 de cadeia leve e/ou pesada a partir de um anticorpo derivado de um animal humano ou não humano, em que o anticorpo monoclonal é capaz de se ligar especificamente a PTK7. São também aqui divulgados anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais dominios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não humano, tal como um anticorpo de ratinho ou rato, em que o anticorpo monoclonal é capaz de se ligar especificamente a PTK7. Tais anticorpos compreendendo um ou mais domínios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não humano (a) são capazes de competir pela ligação com; (b) mantêm as caracteristicas funcionais; (c) ligam-se ao mesmo epitopo; e/ou (d) têm uma afinidade de ligação semelhante à do anticorpo não humano parental correspondente. São também aqui divulgados anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais dominios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo humano, tal como, por exemplo, um anticorpo humano obtido a partir de um animal não humano, em que o anticorpo humano é capaz de se ligar especificamente a PTK7. Também são aqui divulgados anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais dominios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um primeiro anticorpo humano, tal como, por exemplo, um anticorpo humano obtido a partir de um animal não humano, em que o primeiro anticorpo humano é capaz de se ligar especif icamente a PTK7 e em que um domínio CDR3 de um primeiro anticorpo humano substitui um domínio CDR3 num anticorpo humano sem especificidade de ligação para PTK7 para gerar um segundo anticorpo humano que seja capaz de se ligar especificamente a PTK7. Tais anticorpos compreendendo um ou mais dominios CDR3 de cadeia pesada e/ou leve do primeiro anticorpo humano (a) são capazes de competir pela ligação com; (b) mantêm as características funcionais; (c) ligam-se ao mesmo epitopo; e/ou (d) têm uma afinidade de ligação 26 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ semelhante à do primeiro anticorpo humano parental correspondente. 0 primeiro anticorpo humano pode ser 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ou 7C8.

Anticorpos que se Ligam ao Mesmo Epitopo que os Anticorpos Anti-PTK7 do Invento 0 invento proporciona anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo na PTK7 humana que qualquer um dos anticorpos monoclonais de PTK7 do invento (isto é, anticorpos que têm a capacidade de competir de forma cruzada pela ligação a PTK7 com qualquer um dos anticorpos monoclonais do invento) . 0 anticorpo de referência para estudos de competição cruzada pode ser o anticorpo monoclonal 4D5 (possuindo as sequências de VH e VL tal como mostradas em SEQ ID NOs: 2 e 7, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 12C6 (possuindo as sequências de VH e VL tal como mostradas em SEQ ID NOs: 3 e 8, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 7C8 (possuindo as sequências de VH e VL tal como mostradas em SEQ ID NOs: 4 e 10, respectivamente). Tais anticorpos de competição cruzada podem ser identificados com base na sua capacidade para reagir de forma cruzada com 4D5, 12C6 ou 7C8 em ensaios padrão de ligação a PTK7. Por exemplo, análise BIAcore, ensaios ELISA ou citometria de fluxo podem ser utilizados para demonstrar competição cruzada com os anticorpos do presente invento. A capacidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação de, por exemplo, 4D5, 12C6 ou 7C8, a PTK7 humana demonstra que o anticorpo de teste pode competir com 4D5, 12C6 ou 7C8 pela ligação a PTK7 humana e liga-se assim ao mesmo epitopo na PTK7 humana que 4D5, 12C6 ou 7C8. O anticorpo que se liga ao mesmo epitopo na PTK7 humana que 4D5, 12C6 ou 7C8 é um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados tal como descrito nos Exemplos.

Moléculas de Ácido Nucleico Codificando os Anticorpos do Invento

Outro aspecto do invento refere-se a moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos do invento. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, num lisado celular, ou numa forma parcialmente purificada ou 27 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ substancialmente pura. Um ácido nucleico está "isolado" ou "é tornado substancialmente puro" quando é purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, p. ex., outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, através de técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, ligação a CsCl, cromatografia de coluna, electroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na técnica. Ver, F. Ausubel, et al., ed. (1987) "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Um ácido nucleico do invento pode ser, por exemplo, ADN ou ARN e pode conter ou não sequências intrónicas. Numa concretização preferida, o ácido nucleico é uma molécula de ADNc.

Os ácidos nucleicos podem ser obtidos utilizando técnicas de biologia molecular padrão. Para anticorpos expressos por hibridomas (p. ex., hibridomas preparados a partir de ratinhos transgénicos portadores de genes de imunoglobulinas humanas tal como descrito mais abaixo), os ADNc codificando as cadeias leves e pesadas do anticorpo produzido pelo hibridoma podem ser obtidos através de amplificação padrão por PCR ou técnicas de clonagem de ADNc. Para os anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (p. ex., utilizando técnicas de apresentação fágica), o ácido nucleico codificando o anticorpo pode ser recuperado a partir da biblioteca.

As moléculas de ácidos nucleicos preferidas são as que codificam as sequências de VH e VL dos anticorpos monoclonais 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ou 7C8. As sequências de ADN codificando as sequências de VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas em SEQ ID NOs: 41 (3G8 e 3G8a), 42 (4D5), 43 (12C6 e 12C6a) e 44 (7C8). As sequências de ADN codificando as sequências de VL de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas em SEQ ID NOs: 45, 46, 47, 48, 49 e 50, respectivamente.

Uma vez obtidos os fragmentos de ADN codificando os segmentos de VH e VL, estes fragmentos de ADN podem ainda ser manipulados através de técnicas padrão de ADN recombinante, por exemplo para converter os genes da região variável em genes de cadeias de anticorpos inteiros, em genes de fragmentos Fab, ou num gene de scFv. Nestas manipulações, um 28 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ fragmento de ADN codificando VL ou VH é operativamente ligado a outro fragmento de ADN codificando outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um ligador flexível. 0 termo "operativamente ligado", tal como utilizado neste contexto, pretende significar que os dois fragmentos de ADN são ligados de modo a que as sequências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de ADN permanecem enquadradas. 0 ADN isolado codificando a região VH pode ser convertido num gene de cadeia pesada inteiro através da ligação de forma operativa do ADN codificando VH a outra molécula de ADN codificando regiões constantes de cadeias pesadas (CHI, CH2 e CH3). As sequências dos genes das regiões constantes das cadeias pesadas humanas são conhecidas na técnica (ver, p. ex., Kabat, E.A., et al., (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242) e os fragmentos de ADN englobando estas regiões podem ser obtidos através de amplificação padrão por PCR. A região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas é de preferência uma região constante de IgGl ou IgG4. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o ADN codificando VH pode ser operativamente ligado a outra molécula de ADN codificando apenas a região constante da cadeia pesada CHI. 0 ADN isolado codificando a região VL pode ser convertido num gene de cadeia leve inteiro (bem como um gene de cadeia leve Fab) através da ligação de forma operativa do ADN codificando VL a outra molécula de ADN codificando a região constante de cadeia leve, CL. As sequências dos genes das regiões constantes das cadeias leves humanas são conhecidas na técnica (ver p. ex., Kabat, E. A., et al. (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242) e os fragmentos de ADN englobando estas regiões podem ser obtidos através de amplificação padrão por PCR. A região constante da cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda, mas é de preferência uma região constante capa. 29 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Para criar um gene de scFv, os fragmentos de ADN codificando VH e VL são operativamente ligados a outro fragmento codificando um ligador flexível, p. ex., codificando a sequência de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de modo a que as sequências de VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões VL e VH unidas através do ligador flexível (ver p. ex., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-554).

Produção dos Anticorpos Monoclonais do Invento

Os anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpos monoclonais, p. ex. a técnica de hibridação de células somáticas padrão de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495. Embora sejam preferidos os procedimentos de hibridação de células somáticas, em princípio, outras técnicas para a produção de anticorpos monoclonais podem ser empregues, p. ex. transformação virai ou oncogénica de linfócitos B. O sistema animal preferido para a preparação de hibridomas é o sistema de murídeo. A produção de hibridomas no ratinho é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos de imunização e as técnicas para o isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (p. ex., células de mieloma de murídeo) e os procedimentos de fusão são também conhecidos.

Os anticorpos quiméricos ou humanizados podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal de murídeo preparado tal como descrito acima. O ADN codificando as imunoglobulinas de cadeia pesada e leve pode ser obtido a partir do hibridoma de murídeo de interesse e modificado para conter sequências de imunoglobulina sem serem de murídeo (p. ex., humanas) utilizando técnicas padrão de biologia molecular. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis de murídeo podem ser ligadas a regiões constantes humanas utilizando métodos conhecidos na 30

ΕΡ 1 957 539/PT técnica (ver, p. ex., Patente U.S. No. 4816567 para Cabilly et al.) . Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR de murideo podem ser inseridas numa estrutura humana utilizando métodos conhecidos na técnica (ver, p. ex., Patente U.S. No. 5225539 para Winter, e Patentes U.S. Nos. 5530101, 5585089, 5693762, e 6180370 para Queen et al.).

Os anticorpos do invento são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra PTK7 podem ser gerados utilizando ratinhos transgénicos ou transcromossómicos possuindo partes do sistema imunitário humano em vez do sistema de ratinho. Estes ratinhos transgénicos e transcromossómicos incluem ratinhos aqui

TM referidos como ratinhos HuMAb e ratinhos KM , respectivamente, e são colectivamente aqui referidos como "ratinhos de Ig humana". 0 ratinho HuMAb® (Medarex, Inc.) contêm miniloci de genes de imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina de cadeias pesadas (μ e γ) e leves κ humanas não rearranjadas, juntamente com mutações direccionadas que inactivam os loci das cadeias μ e κ endógenas (ver, p. ex., Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859).

Concordantemente, os ratinhos exibem reduzida expressão de IgM ou κ de ratinho, e em resposta a imunização, os transgenes das cadeias pesadas e leves humanas introduzidos sofrem troca de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgGx humanos de elevada afinidade (Lonberg, N. et al. (1994), "Handbook of Experimental

Pharmacology" 113: 49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sei. 764: 536-546). A preparação e utilização de ratinhos HuMab, e as modificações genómicas transportadas por tais ratinhos, são ainda descritas em Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123;

Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; e Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Ver ainda, Patentes 31 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ U.S. Nos. 5545806; 5569825; 5625126, 5633425, 5789650, 5877397, 5661016, 5814318, 5874299 e 5770429 todas para Lonberg e Kay; Patente U.S. No. 5545807 para Surani et al.; Publicação PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; e Publicação PCT No. WO 01/14424 para Korman et al.

Noutra concretização, os anticorpos humanos do invento podem ser criados utilizando um ratinho que possua sequências de imunoglobulina humanas em transgenes e transcromossomas, tal como um ratinho que possua um transgene de cadeia pesada humana e um transcromossoma de cadeia leve humana. Tais ratinhos, aqui referidos como "ratinhos KM ", são descritos em detalhe na Publicação PCT WO 02/43478 para Ishida et al.

Ainda, sistemas de animais transgénicos alternativos que expressam genes de imunoglobulinas humanas estão disponíveis na técnica e podem ser utilizados para produzir os anticorpos anti-PTK7 do invento. Por exemplo, pode ser utilizado um sistema transgénico alternativo referido como Xenomouse (Abgenix, Inc.); tais ratinhos são descritos em, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5939598, 6075181, 6114598, 6150584 e 6162963 para Kucherlapati et al.

Além disso, sistemas animais transcromossómicos alternativos que expressam genes de imunoglobulinas humanas estão disponíveis na técnica e podem ser utilizados para produzir os anticorpos anti-PTK7 do invento. Por exemplo, podem ser utilizados ratinhos que possuam tanto um transcromossoma de cadeia pesada humana como um transcromossoma de cadeia leve humana, referidos como "ratinhos TC"; tais ratinhos estão descritos em Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 722-727. Além disso, vacas possuindo transcromossomas de cadeias pesadas e leves humanas têm sido descritas na técnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20: 889-894_)_ e podem ser utilizadas para criar os anticorpos anti-PTK7 do invento.

Os anticorpos monoclonais humanos do invento podem também ser preparados utilizando métodos de apresentação fágica para pesquisa de bibliotecas de genes de imunoglobulinas humanas. Tais métodos de apresentação fágica 32 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ para isolamento de anticorpos humanos estão estabelecidos na técnica. Ver por exemplo: Patentes U.S. Nos. 5223409, 5403484, e 5571698 para Ladner et al., Patentes EUA Nos. 5427908 e 5580717 para Dower et al., Patentes EUA Nos. 5969108 e 6172197 para McCafferty et al., e Patentes EUA Nos. 5885793, 6521404, 6544731, 6555313, 6582915 e 6593081 para Griffiths et al.

Os anticorpos monoclonais humanos do invento podem também ser preparados utilizando ratinhos SCID nos quais células imunitárias humanas foram reconstituídas de modo a que possa ser gerada uma resposta de anticorpos humanos após imunização. Tais ratinhos estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5476996 e 5698767 para Wilson et al.

Imunização de Ratinhos de Iq Humanas

Quando são utilizados ratinhos de Ig humanas para produzir os anticorpos humanos do invento, tais ratinhos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de antigénio PTK7 e/ou PTK7 recombinante, ou uma proteína de fusão de PTK7, tal como descrito por Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; e Publicação PCT WO 98/24884 e WO 01/14424. De preferência, os ratinhos terão 6-16 semanas de idade após a primeira infusão. Por exemplo, uma preparação purificada ou recombinante (5-50 pg) de antigénio PTK7 pode ser utilizada para imunizar os ratinhos de Ig humana intraperitonealmente.

Os procedimentos detalhados para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para PTK7 estão descritos no Exemplo 1 abaixo. A experiência acumulada com vários antigénios mostrou que os ratinhos transgénicos respondem quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (IP) com antigénio em adjuvante completo de Freund, seguido por imunizações IP semana sim semana não (até um total de 6) com o antigénio em adjuvante incompleto de Freund. No entanto, verifica-se que outros adjuvantes além de Freund são também eficazes. Além disso, verifica-se que as células intactas na ausência de adjuvante são altamente imunogénicas. A resposta imunitária pode ser monitorizada ao longo do curso do 33 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ protocolo de imunização sendo as amostras de plasma obtidas através de sangrias retro-orbitais. 0 plasma pode ser pesquisado através de ELISA (tal como descrito abaixo), e os ratinhos com títulos suficientes de imunoglobulina ati-PTK7 humana podem ser utilizados para fusões. Os ratinhos podem ser reforçados intravenosamente com antigénio 3 dias antes do sacrifício e da remoção do baço. Espera-se que possa ser necessário realizar 2-3 fusões para cada imunização. Entre 6 e 24 ratinhos são tipicamente imunizados para cada antigénio. Habitualmente, são utilizadas ambas as estirpes HCo7 e HCol2. Além disso, ambos os transgenes HCo7 e HCol2 podem ser criados juntamente num único ratinho possuindo dois transgenes de cadeia pesada humana diferentes (HCo7/HCol2). Alternativamente ou adicionalmente, pode ser utilizada a estirpe de ratinhos KM™, tal como descrito no Exemplo 1.

Geração de Hibridomas Produtores de Anticorpos Monoclonais Humanos do Invento

Para gerar hibridomas produtores dos anticorpos monoclonais humanos do invento, esplenócitos e/ou células de nódulos linfáticos de ratinhos imunizados podem ser isolados e fundidos com uma linha celular imortalizada apropriada, tal como uma linha celular de mieloma de ratinho. Os hibridomas resultantes podem ser pesquisados quanto à produção de anticorpos específicos para o antigénio. Por exemplo, suspensões de células individuais de linfócitos do baço de ratinhos imunizados podem ser fundidas com um sexto do número de células de mieloma de ratinho não secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com PEG a 50%. As células são plaqueadas a aproximadamente 2xl05 numa placa de microtitulação de fundo plano, seguido de uma incubação de duas semanas em meio selectivo contendo Soro de Clone fetal a 20%, meio condicionado "653" a 18%, Origen a 5% (IGEN), L-glutamina 4 mM, piruvato de sódio 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0, 055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina e HAT lx (Sigma; o HAT é adicionado 24 horas após a fusão). Após aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas num meio em que o HAT é substituído por HT. Os poços individuais podem então ser pesquisados através de ELISA quanto a anticorpos monoclonais humanos IgM e IgG. Uma vez ocorrido crescimento 34 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ extensivo do hibridoma, o meio pode ser observado habitualmente após 10-14 dias. Os hibridomas secretores de anticorpos podem ser replaqueados, novamente pesquisados e se ainda forem positivos para IqG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitante. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.

Para purificar anticorpos monoclonais humanos, os hibridomas seleccionados podem ser cultivados em frascos rotativos de dois litros para purificação de anticorpos monoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) . O IgG eluído pode ser verificado através de electroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser mudada para PBS, e a concentração pode ser determinada através de DO280 utilizando o coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.

Geração de Transfectomas Produtores de Anticorpos Monoclonais do Invento

Os anticorpos do invento podem também ser produzidos num transfectoma de células hospedeiras utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de ADN recombinante e métodos de transfecção de genes, tal como é bem conhecido na técnica (p. ex., Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpo destes, ADN codificando cadeias leves e pesadas parciais ou inteiras, podem ser podem ser obtidos através de técnicas padrão de biologia molecular (p. ex., amplificação por PCR ou clonagem de ADNc utilizando um hibridoma que expresse o anticorpo de interesse) e os ADN podem ser inseridos em vectores de expressão de modo a que os genes fiquem operativamente ligados a sequências de controlo da transcrição e tradução. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" pretende significar que um gene de anticorpo está ligado num vector de tal modo que as 35 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ sequências de controlo da transcrição e da tradução dentro do vector desempenhem a sua função pretendida de regulação da transcrição e tradução do gene do anticorpo. As sequências do vector de expressão e de controlo da expressão são escolhidas para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. 0 gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vectores separados ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vector de expressão. Os genes do anticorpo são inseridos no vector de expressão através de métodos padrão (p. ex., ligação de locais de restrição complementares no fragmento do gene de anticorpo e no vector, ou ligação de extremidades cegas se não estiverem presentes locais de restrição). As regiões variáveis de cadeia leve e pesadas dos anticorpos aqui descritos podem ser utilizadas para criar genes de anticorpos inteiros de qualquer isotipo de anticorpo através da sua inserção em vectores de expressão codificando já as regiões constante da cadeia pesada e constante da cadeia leve do isotipo desejado de modo a que o segmento VH esteja operativamente ligado ao segmento ou aos segmentos CH no vector e o segmento VK esteja operativamente ligado ao segmento CL no vector. Adicionalmente ou alternativamente, o vector de expressão recombinante pode codificar um péptido sinal que facilite a secreção da cadeia do anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 gene da cadeia de anticorpo pode ser clonado no vector de modo a que o péptido sinal esteja ligado enquadrado com o terminal amino do gene da cadeia de anticorpo. 0 péptido sinal pode ser um péptido sinal de imunoglobulina ou um péptido sinal heterólogo (i.e., um péptido sinal de uma proteína sem ser imunoglobulina).

Além dos genes das cadeias de anticorpo, os vectores de expressão recombinante do invento possuem sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes das cadeias de anticorpo numa célula hospedeira. 0 termo "sequência reguladora" pretende incluir promotores, estimuladores e outros elementos de controlo da expressão (p. ex., sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes das cadeias de anticorpo. Tais sequências reguladoras estão descritas, por exemplo, em Goeddel ("Gene Expression Technology". Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Será apreciado pelos peritos na técnica 36 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ que ο desenho do vector de expressão, incluindo a selecção de sequências reguladoras, pode depender de factores tais como a escolha da célula hospedeira a transformar, o nível de expressão de proteína desejado, etc. Sequências reguladoras preferidas para expressão em células hospedeiras de mamífero incluem elementos virais que dirigem níveis elevados de expressão proteica em células de mamífero, tais como promotores e/ou estimuladores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus (p. ex., o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Alternativamente, podem ser utilizadas sequências de regulação não virais, tais como o promotor de ubiquitina ou o promotor de β-globina. Ainda, outros elementos de regulação compostos por sequências de diferentes fontes, tais como o sistema promotor SRa, que contém sequências do promotor inicial de SV40 e a repetição terminal longa do vírus de leucemia de células T humanas de tipo 1 (Takebe, Y. et ai. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472).

Para além dos genes de cadeias de anticorpo e das sequências reguladoras, os vectores de expressão recombinante do invento podem possuir sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vector em células hospedeiras (p. ex., origens de replicação) e genes de marcadores seleccionáveis. O gene do marcador seleccionável facilita a selecção de células hospedeiras nas quais o vector foi introduzido (ver, p. ex., Pat. U.S. 4399216, 4634665 e 5179017, todas por Axel et ai.). Por exemplo, tipicamente o gene do marcador seleccionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vector foi introduzido. Genes de marcadores seleccionáveis preferidos incluem o gene da di-hidrofolato-redutase (DHFR) (para utilização em células hospedeiras dhfr- com selecção/amplificação com metotrexato) e o gene neo (para selecção com G418).

Para expressão das cadeias leves e pesadas, o ou os vectores de expressão codificando as cadeias leves e pesadas são transfectados numa célula hospedeira através de técnicas padrão. As várias formas do termo "transfecção" destinam-se a englobar uma ampla variedade de técnicas vulgarmente utilizadas para a introdução de ADN exógeno numa célula 37 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ hospedeira procariótica ou eucariótica, p. ex., electroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano e semelhantes. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos do invento em células hospedeiras procariotas ou eucariotas, a expressão de anticorpos em células eucariotas, e de preferência células hospedeiras de mamífero, é a mais preferida, porque tais células eucariotas, e em particular as células de mamífero, são mais propensas do que as células procariotas a montar e segregar um anticorpo corretamente dobrado e imunologicamente activo. A expressão procariótica de genes de anticorpos foi relatada como sendo ineficaz para a produção de elevados rendimentos de anticorpo activo (Boss, M.A. e Wood, C.R. (1985) Immunology Today 6: 12-13). Células hospedeiras de mamífero preferidas para expressão dos anticorpos recombinantes do invento incluem células de Ovário de Hamster chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr-, descritas em Urlaub e Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 77: 4216-4220, utilizadas com um marcador seleccionável de DHFR, p. ex., tal como descrito em R.J. Kaufman e P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em particular, para utilização com células de mieloma NSO, outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão do gene GS divulgado em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338841. Quando vectores de expressão recombinante codificando genes de anticorpos são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos através da cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, de preferência, a secreção do anticorpo para o meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando métodos padrão de purificação de proteínas.

Caracterização da Ligação do Anticorpo ao Antigénio

Os anticorpos do invento podem ser testados quanto à ligação a PTK7 através, por exemplo, de ELISA padrão. Resumidamente, placas de microtitulação são revestidas com 38 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ ΡΤΚ7 purificada a 0,25 pg/ml em PBS, e depois bloqueadas com albumina de soro bovino a 5% em PBS. Diluições do anticorpo (p. ex., diluições de plasma de ratinhos imunizados com PTK7) são adicionadas a cada poço e incubadas durante 1-2 horas a 37°C. As placas são lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com reagente secundário (p. ex., para anticorpos humanos, um reagente policlonal de cabra especifico de Fc anti-IgG humana) conjugado com fosfatase alcalina, durante 1 hora a 37°C. Após lavagem, as placas foram reveladas com substrato pNPP (1 mg/ml), e analisadas à DO de 405-650. De preferência, os ratinhos que desenvolvem os títulos mais elevados serão utilizados para fusões.

Um ensaio ELISA tal como descrito acima pode também ser utilizado para pesquisa de hibridomas que mostrem reactividade positiva com o imunogénio PTK7. Os hibridomas que se ligam com elevada avidez a PTK7 são subclonados e melhor caracterizados. Um clone de cada hibridoma que mantenha a reactividade das células parentais (por ELISA), pode ser escolhido para fazer um banco de células de 5-10 frascos armazenados a -140°C, e para a purificação de anticorpos.

Para purificar anticorpos anti-PTK7, os hibridomas seleccionados podem ser cultivados frascos rotativos de dois litros para purificação de anticorpos monoclonais. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). O IgG eluído pode ser verificado através de electroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser mudada para PBS, e a concentração pode ser determinada através de D02so usando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.

Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-PTK7 seleccionados se ligam a epitopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado utilizando reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, IL) . Estudos de competição, utilizando anticorpos monoclonais não marcados e anticorpos monoclonais biotinilados podem ser realizados utilizando 39 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ placas de ELISA revestidas com PTK7 tal como descrito acima. A ligação do mAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda de estrep-avidina-fosfatase alcalina.

Para determinar o isotipo dos anticorpos purificados, podem ser realizados ELISA de isotipo utilizando reagentes específicos para anticorpos de um determinado isotipo. Por exemplo, para determinar o isotipo de um anticorpo monoclonal humano, os poços das placas de microtitulação podem ser revestidos com 1 pg/ml de imunoglobulina anti-humano de um dia para o outro a 4°C. Após bloqueio com BSA a 1%, as placas são feitas reagir com 1 pg/ml ou menos de anticorpos monoclonais de teste ou controlos de isotipo purificados, à temperatura ambiente durante uma a duas horas. Os poços podem então ser feitos reagir com qualquer uma de sondas especificas de IgGl humana ou IgM humana conjugadas com fosfatase alcalina. As placas são reveladas e analisadas tal como descrito acima.

As IgG anti-PTK7 humanas podem ainda ser testadas quanto à reactividade com o antigénio PTK7 através de Western blotting. Resumidamente, PTK7 pode ser preparada e submetida a electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio. Após a electroforese, os antigénios separados são transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com soro fetal de vitelo a 10%, e sondados com os anticorpos monoclonais a testar. A ligação da IgG humana pode ser detectada utilizando anti-IgG humana-fosfatase alcalina e revelada com comprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).

Imunoconjugados

Noutro aspecto, o presente apresenta um anticorpo anti-PTK7, ou um fragmento deste, conjugado com uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, um fármaco (p. ex., um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Tais conjugados são aqui referidos como "imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas". Uma citotoxina ou um agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial para (p. ex., mate) células. Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina 40 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxi-antracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos destes. Agentes terapêuticos incluem, por exemplo, anti-metabolitos (p. ex., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil-decarbazina), agentes alquilantes (p. ex., mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (p. ex., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (p. ex., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos (p. ex., vincristina e vinblastina).

Outros exemplos preferidos de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas com um anticorpo do invento incluem duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas e auristatinas, e derivados destes. Um exemplo de um conjugado de anticorpo com caliqueamicina está comercialmente disponível (Mylotarg™, Wyeth-Ayerst). Exemplos de citotoxinas terapêuticas podem ser verificados, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos: 6548530 e 6281354 e pedido de Patente U.S. Nos.: US 2003/0064984, US 2003/0073852 e US 2003/0050331.

As citotoxinas podem ser conjugadas com os anticorpos do invento utilizando a tecnologia de ligadores disponível na técnica. Exemplos de tipos de ligadores que tenham sido utilizados para conjugar uma citotoxina com um anticorpo incluem, mas não estão limitados a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfuretos e ligadores contendo péptidos. Pode ser escolhido um ligador que seja, por exemplo, susceptível de clivagem através de pH baixo no interior do compartimento lisossómico ou seja susceptível de clivagem por proteases, tais como proteases de preferência expressas em tecido tumoral, tais como as catepsinas (p. ex., as catepsinas B, C, D) . 41 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Para melhor discussão dos tipos de citotoxinas, ligadores e métodos para conjugação de agentes terapêuticos a anticorpos, ver também Saito, G. et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 99-215; Trail, P.A. et al. (2003) Câncer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne; G. (2003) Câncer. Cell 3: 207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Câncer 2: 750-763; Pastan, I. e Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; Senter, P.D. e Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.

Os anticorpos do presente invento podem também ser conjugados com um isótopo radioactivo para gerar radiofármacos citotóxicos, também referidos como radioimunoconjugados. Exemplos de isótopos radioactivos que podem ser conjugados com anticorpos para utilização em diagnóstico ou terapia incluem, mas não estão limitados a, iodo131, índio111, ítrio90 e lutécio177. Os métodos para a preparação de radioimunconjugados estão estabelecidos na técnica. Exemplos de radioimunoconjugados estão comercialmente disponíveis, incluindo Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) e Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), e métodos semelhantes podem ser utilizados para preparar radioimunoconjugados utilizando os anticorpos do invento.

Os conjugados de anticorpos do invento podem ser utilizados para modificar uma dada resposta biológica, e a porção fármaco não deve ser entendida como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção fármaco pode ser uma proteína ou um polipéptido possuindo uma actividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente activa, ou um fragmento activo desta, tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria; uma proteína tal como factor de necrose tumoral ou interferão-γ; ou, modificadores da resposta biológica, tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos ("GM-CSF"), factor de estimulação de colónias de granulócitos ("G-CSF"), ou outros factores de crescimento. 42 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

As técnicas para conjugação de tal porção terapêutica com anticorpos são bem conhecidas, ver, p. ex., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em "Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy", Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em "Controlled Drug Delivery" (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", em "Monoclonal Antibodies" 84: Biological And Clinicai

Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em "Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy", Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), e

Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugados", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

Composições Farmacêuticas

Noutro aspecto, o presente invento proporciona uma composição, p. ex., uma composição farmacêutica, contendo um anticorpo ou uma combinação de anticorpos monoclonais, ou porção ou porções de ligação ao antigénio, do presente invento, formulados juntos com um transportador farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um anticorpo ou uma combinação de anticorpos (p. ex., dois ou mais diferentes) ou imunoconjugados do invento. Por exemplo, uma composição farmacêutica do invento pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados) que se liguem a diferentes epitopos no antigénio alvo ou que tenham actividades complementares.

As composições farmacêuticas do invento podem também ser administradas em terapia de combinação, ou seja, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo anti-PTK7 do presente invento combinado com pelo menos um outro agente anti-inflamatório ou imunossupressor. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser utilizados em terapia de combinação são descritos em maior detalhe abaixo na secção sobre utilizações dos anticorpos do invento. 43 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Tal como aqui se utiliza, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, aqentes antibacterianos e antifúnqicos, aqentes isotónicos e retardadores da absorção, e semelhantes, que sejam fisiologicamente compatíveis. De preferência, o transportador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (p. ex., através de injecção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto activo, ou seja, o anticorpo, imunoconjugado, ou molécula biespecífica, pode ser revestido de um material para proteger o composto da acção de ácidos e outras condições naturais que possam inactivar o composto.

Os compostos farmacêuticos do invento podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retém a actividade biológica desejada do composto parental e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejáveis (ver p. ex., Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66: 1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácida e sais de adição básica. Sais de adição ácida incluem os derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e semelhantes, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos mono e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanóicos substituídos com fenilo, ácidos hidroxi-alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos e semelhantes. Sais de adição básica incluem os derivados de metais alcalino-terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como a partir de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.

Uma composição farmacêutica do invento pode também incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito 44 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propilo, alfa-tocoferol, e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes.

Exemplos de transportadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregues nas composições farmacêuticas do invento incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol, e semelhantes), e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis, tais como oleato de etilo. A fluidez correcta pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de materiais de revestimento, tais como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso das dispersões, e através da utilização de tensioactivos.

Estas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes molhantes, agentes emulsionantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto através de procedimentos de esterilização, supra, como através da inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico, e semelhantes. Pode também ser desejável incluir agentes isotónicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e semelhantes nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injectável pode ser alcançada através da inclusão de agentes que retardem a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

Transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é conhecida na técnica. Excepto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto activo, a sua utilização nas composições farmacêuticas do presente invento está 45 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ contemplada. Compostos activos suplementares podem também ser incorporados nas composições.

As composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabrico e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para uma elevada concentração de fármaco. 0 transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol liquido, e semelhantes), e misturas adequadas destes. A fluidez correcta pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de uma dispersão e através da utilização de tensioactivos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser alcançada através da inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

As soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do composto activo na quantidade requerida num solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido de esterilização por microfiltração. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação do composto activo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários entre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem por vácuo e a secagem por congelação (liofilização), que produzem um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução destes previamente esterilizada por filtração. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem unitária variará dependendo do sujeito a tratar e do modo particular de administração. A quantidade de 46 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ ingrediente activo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de cem porcento, esta quantidade irá variar de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente activo, de preferência de cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, de maior preferência de cerca de 1 por cento a cerca de 30 por cento de ingrediente activo em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.

Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta óptima desejada (p. ex., uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser administrado um único bolo, podem ser administradas ao longo do tempo várias doses divididas ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada tal como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas na forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade da dosagem. A forma de dosagem unitária tal como aqui se utiliza refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a tratar; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitárias do invento é ditada por, e directamente dependente de (a) as características únicas do composto activo e do efeito terapêutico particular a alcançar, e (b) as limitações inerentes na técnica de compor um tal composto activo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.

Para administração do anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou no intervalo de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar envolve administração uma vez por semana, uma vez cada duas semanas, uma vez cada três semanas, uma vez cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez cada 3 meses ou uma vez cada três a seis meses. Os 47 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ regimes de dosagem preferidos para um anticorpo anti-PTK7 do invento incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal através de administração intravenosa, com o anticorpo a ser administrado utilizando um dos seguintes programas de dosagem: (i) cada quatro semanas durante seis doses, em seguida cada três meses; (ii) cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal de três em três semanas.

Nalguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, caso em que a dosagem de cada anticorpo administrado cai dentro dos intervalos indicados. 0 anticorpo é geralmente administrado em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre as doses individuais podem ser, por exemplo, semanais, mensais, cada três meses ou anuais. Os intervalos podem também ser irregulares conforme indicado pela medição dos niveis sanguíneos de anticorpo para o antigénio alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para se obter uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1-1000 pg/ml e em alguns métodos de cerca de 25-300 pg/ml.

Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de libertação sustida, caso em que é necessária uma administração menos frequente. A dosagem e frequência variam dependendo da semivida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanos mostram a semivida mais longa, seguidos pelos anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo de se o tratamento é profiláctico ou terapêutico. Em aplicações profilácticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada a intervalos relativamente pouco frequentes ao longo de um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto das suas vidas. Em aplicações terapêuticas é por vezes necessária uma dosagem relativamente elevada a intervalos relativamente curtos, até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e de preferência até que o paciente apresente melhoria parcial ou completa dos sintomas da doença. Depois disso, pode ser administrado ao paciente um regime profiláctico. 48 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ Níveis reais de dosagem dos ingredientes activos nas composições farmacêuticas do presente invento podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente activo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um determinado paciente, composição e modo de administração, sem ser tóxica para o paciente. 0 nível de dosagem seleccionado dependerá de uma variedade de factores farmacocinéticos, incluindo a actividade das composições particulares do presente invento empregues, ou do éster, sal ou amida destas, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular a utilizar, da duração do tratamento, de outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições particulares empregues, da idade, do sexo, do peso, da condição, da saúde geral e da história médica anterior do paciente a tratar, e de factores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.

Uma "dose terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti-PTK7 do invento resulta de preferência numa diminuição na gravidade dos sintomas da doença, num aumento da frequência e duração dos períodos livres de sintomas da doença, ou numa prevenção da insuficiência ou incapacidade devido à aflição da doença. Por exemplo, para o tratamento de tumores, uma "dose terapeuticamente eficaz" inibe de preferência o crescimento celular ou o crescimento tumoral em pelo menos cerca de 20%, de preferência em pelo menos cerca de 40%, de maior preferência em pelo menos cerca de 60%, e ainda de preferência em pelo menos cerca de 80% relativamente a sujeitos não tratados. A capacidade de um composto para inibir o crescimento tumoral pode ser avaliada num sistema de modelo animal preditivo de eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada através do exame da capacidade do composto para inibir, tal inibição in vitro através de ensaios conhecidos dos peritos na técnica. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou de outro modo melhorar os sintomas num sujeito. Um vulgar perito na técnica seria capaz de determinar tais quantidades com base em factores tais como o tamanho do sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito, e a composição particular ou via de administração seleccionada. 49 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Uma composição do presente invento pode ser administrada através de uma ou mais vias de administração utilizando uma ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Tal como será apreciado pelo perito na técnica, a via e/ou modo de administração variarão dependendo dos resultados desejados. Vias de administração preferidas para os anticorpos do invento incluem a via de administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinal ou outras parentéricas, por exemplo através de injecção ou infusão. A frase "administração parentérica", tal como aqui utilizada, significa modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, usualmente por injecção, e inclui, sem limitação, injecção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intra-espinal, epidural e intrasternal.

Alternativamente, um anticorpo do invento pode ser administrado através de uma via não parentérica, tal como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosa, por exemplo por via intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual ou tópica.

Os compostos activos podem ser preparados com transportadores que protegerão o composto contra libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como etileno-acetato de vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações estão patenteados ou são geralmente conhecidos dos peritos na técnica. Ver, p. ex., "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.

As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, numa 50 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ concretização preferida, uma composição terapêutica do invento pode ser administrada com um dispositivo de injecção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos divulgados nas Patentes U.S. Nos. 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824; ou 4596556. Exemplos de implantes bem conhecidos e módulos úteis no presente invento incluem: Patente U.S. No. 4487603, que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para dispensa de medicação a uma taxa controlada; Patente U.S. No. 4486194, que divulga um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; Patente U.S. No. 4447233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para distribuição de medicação a uma taxa de infusão precisa; Patente U.S. No. 4447224, que divulga um aparelho de infusão implantável de caudal variável para distribuição continua de fármacos; Patente U.S. No. 4439196, que divulga um sistema de distribuição osmótica de fármacos possuindo compartimentos de múltiplas câmaras; e Patente U.S. No. 4475196, que divulga um sistema osmótico de distribuição de fármacos. Muitos outros desses implantes, sistemas de distribuição e módulos são bem conhecidos dos peritos na técnica.

Em certas concretizações, os anticorpos monoclonais humanos do invento podem ser formulados para assegurar uma distribuição correcta in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BHE) exclui muitos compostos altamente hidrófilos. Para assegurar que os compostos terapêuticos do invento atravessam a BHE (se desejado), estes podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de produção de lipossomas, ver, p. ex., Patentes U.S. 4522811; 5374548; e 5399331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são selectivamente transportadas para células ou órgãos específicos, aumentando assim a distribuição direccionada de fármacos (ver, p. ex., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Porções direccionadoras exemplares incluem folato ou biotina (ver, p. ex., Patente U.S. 5416016 para Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophvs. Res. Commun. 153: 1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor de proteína A tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); pl20 (Schreier et al. 51 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); ver também K. Keinanen, M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123, J.J. Killion, I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.

Utilizações e Métodos do Invento

Os anticorpos, composições de anticorpo e métodos do presente invento têm numerosas utilidades de diagnóstico e terapêuticas in vitro e in vivo, envolvendo o diagnóstico e tratamento de distúrbios mediados por PTK7. Os anticorpos do presente invento são anticorpos humanos. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a sujeitos humanos, p. ex., in vivo, para tratar, prevenir e diagnosticar uma variedade de distúrbios. Tal como aqui se utiliza, o termo "sujeito" pretende incluir humanos e animais não humanos. "Animais não humanos" inclui todos os vertebrados, p. ex., mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios e répteis. Sujeitos preferidos incluem pacientes humanos possuindo distúrbios mediados por actividade de PTK7. Os métodos são particularmente adequados para tratamento de pacientes humanos com um distúrbio associado a expressão aberrante de PTK7. Quando os anticorpos para PTK7 são administrados juntamente com outro agente, os dois podem ser administrados por qualquer ordem ou simultaneamente.

Dada a ligação específica dos anticorpos do invento para PTK7, os anticorpos do invento podem ser utilizados para detectar especificamente a expressão de PTK7 na superfície das células e, além disso, podem ser utilizados para purificar PTK7 através de purificação por imunoafinidade. O invento proporciona ainda métodos para detecção da presença de antigénio PTK7 humano numa amostra, ou medição da quantidade de antigénio PTK7 humano, compreendendo o contacto da amostra, e de uma amostra de controlo, com um anticorpo monoclonal humano, ou uma porção de ligação ao antigénio deste, que se ligue especificamente a PTK7 humana, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo ou uma porção deste e PTK7 humana. É então detectada a formação de um complexo, em que uma diferença na 52 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ formação de um complexo entre a amostra em comparação com a amostra de controlo é indicativa da presença de antigénio PTK7 humano na amostra. PTK7 é expressa em linhas celulares derivadas de carcinoma do cólon, mas não se verificou ser expressa em tecidos do cólon de adultos humanos (Mossie et ai. (1995) Oncogene 11: 2179-84). A expressão de PTK7 foi também observada nalgumas linhas celulares de melanoma e biopsias de melanoma (Easty, et al. (1997) Int. J. Câncer 71: 1061-5). Além disso, verificou-se que PTK7 é altamente sobre-expressa em amostras de leucemia mielóide aguda (Muller-Tidow et al., (2004) Clin. Câncer Res. 10: 1241-9). Um anticorpo anti-PTK7 pode ser utilizado sozinho para inibir o crescimento de tumores cencerosos. Alternativamente, um anticorpo anti-PTK7 pode ser utilizado em conjunto com outros agentes imunogénicos, tratamentos padrão de cancro ou outros anticorpos, tal como descrito abaixo.

Cancros preferidos cujo crescimento pode ser inibido utilizando os anticorpos do invento incluem cancros que tipicamente respondem a imunoterapia. Exemplos não limitantes de cancro preferidos para tratamento incluem cancro do cólon (incluindo cancro do intestino delgado), cancro do pulmão, cancro da mama, cancro do pâncreas, melanoma (p. ex., melanoma maligno metastático) , leucemia mielóide aguda, cancro do rim, cancro da bexiga, cancro do ovário e cancro da próstata. Exemplos de outros cancros que podem ser tratados utilizando os métodos do invento incluem cancro renal (p. ex., carcinoma de células renais), glioblastoma, tumores cerebrais, leucemias crónicas ou agudas incluindo leucemia linfocitica aguda (ALL), leucemia de células T do adulto (T-ALL), leucemia mielóide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocitica crónica, linfomas (p. ex., linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin, linfoma linfocitico, linfoma primário do SNC, linfoma de células T, linfoma de Burkitt, linfomas anaplásicos de células grandes (ALCL), linfomas cutâneos de células T, linfomas de células nodulares pequenas clivadas, linfomas periféricos de células T, linfomas de Lennert, linfomas imunoblásticos, leucemia/linfornas de células T (ATLL), cancros linfomas foliculares enteroblásticos/centrociticos (cb/cc), linfomas 53 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ difusos de células grandes de linhagem B, linfoma de células T semelhante a linfoadenopatia angioimunoblástica (AILD) e linfomas baseados em cavidades corporais associadas a VIH) , carcinomas embrionários, carcinomas indiferenciados da rinofaringe (p. ex., tumor de Schmincke), doença de Castleman, Sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e outros linfomas de células B, carcinomas nasofaringicos, cancro ósseo, cancro da pele, cancro da cabeça ou do pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intra-ocular, cancro uterino, cancro rectal, cancro da região anal, cancro do estômago, cancro testicular, cancro uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, cancro do esófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino, cancro da glândula tiróide, cancro da glândula paratiróide, cancro da supra-renal, sarcoma de tecido mole, cancro da uretra, cancro do pénis, tumores sólidos da infância, cancro da bexiga, cancro do rim ou uréter, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), angiogenése tumoral, tumor do eixo espinal, glioma do tronco cerebral, adenoma da pituitária, cancro epidermóide, cancro de células escamosas, cancros induzidos ambientalmente incluindo os induzidas pelo amianto, p. ex., mesotelioma, e combinações dos referidos cancros.

Além disso, tendo em conta a expressão da PTK7 em várias células tumorais, os anticorpos humanos, as composições de anticorpo e os métodos do presente invento podem ser utilizados para tratar um sujeito com um distúrbio tumorigénico, p. ex., um distúrbio caracterizado pela presença de células tumorais expressando PTK7 incluindo, por exemplo, cancro do cólon (incluindo cancro do intestino delgado), melanoma (p. ex., melanoma maligno metastático), leucemia mielóide aguda, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro da bexiga, cancro do pâncreas, cancro do ovário e cancro da próstata. Exemplos de outros sujeitos com um distúrbio tumorigénico incluem sujeitos com cancro renal (p. ex., carcinoma de células renais), glioblastoma, tumores cerebrais, leucemias crónicas ou agudas, incluindo leucemia linfocitica aguda (ALL), leucemia de células T do adulto (T-ALL) , leucemia mielóide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocitica crónica, linfomas (p. ex., 54 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma primário do SNC, linfoma de células T, linfoma de Burkitt, linfomas anaplásicos de células grandes (ALCL), linfomas cutâneos de células T, linfomas de células nodulares pequenas clivadas, linfomas periféricos de células T, linfomas de Lennert, linfomas imunoblásticos, leucemia/linfornas de células T (ATLL), cancros linfomas foliculares enteroblásticos/centrociticos (cb/cc), linfomas difusos de células grandes de linhagem B, linfoma de células T semelhante a linfoadenopatia angioimunoblástica (AILD) e linfomas baseados em cavidades corporais associadas a VIH) , carcinomas embrionários, carcinomas indiferenciados da rinofaringe (p. ex., tumor de Schmincke), doença de Castleman, Sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e outros linfomas de células B, carcinomas nasofaringicos, cancro ósseo, cancro da pele, cancro da cabeça ou do pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intra-ocular, cancro uterino, cancro rectal, cancro da região anal, cancro do estômago, cancro testicular, cancro uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, cancro do esófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino, cancro da glândula tiróide, cancro da glândula paratiróide, cancro da glândula supra-renal, sarcoma de tecido mole, cancro da uretra, cancro do pénis, tumores sólidos da infância, cancro da bexiga, cancro do rim ou uréter, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), angiogénese tumoral, tumor do eixo espinal, glioma do tronco cerebral, adenoma da pituitária, cancro epidermóide, carcinoma de células escamosas, cancros induzidos ambientalmente incluindo os induzidas pelo amianto, p. ex., mesotelioma, e combinações dos referidos cancros.

Concordantemente, numa concretização, o invento proporciona um anticorpo ou uma porção de ligação ao antigénio do invento para utilização num método de inibição do crescimento de células tumorais num sujeito, o referido método compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz do referido anticorpo ou da porção de ligação ao antigénio. 55 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Os anticorpos (ρ. ex., anticorpos monoclonais humanos e composições) do invento podem ser utilizados para detectar níveis de PTK7 ou níveis de células que contêm PTK7 à superfície da sua membrana, níveis que podem depois ser ligados a certos sintomas de doença. Alternativamente, os anticorpos podem ser utilizados para inibir ou bloquear a função de PTK7 que, por sua vez, pode ser ligada à prevenção ou melhoria de certos sintomas de doença, implicando assim PTK7 como um mediador da doença. Isto pode ser conseguido fazendo contactar uma amostra experimental e uma amostra de controlo com o anticorpo anti-PTK7 sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e PTK7. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e PTK7 são detectados e comparados na amostra experimental e no controlo.

Os anticorpos (p. ex. anticorpos humanos e composições) do invento podem ser inicialmente testados quanto à actividade de ligação associada a utilização terapêutica ou de diagnóstico in vitro. Por exemplo, as composições do invento podem ser testadas utilizando os ensaios de citometria de fluxo descritos nos Exemplos abaixo.

Os anticorpos (p. ex., anticorpos humanos, imunoconjugados e composições) do invento podem ter uma utilidade adicional em terapia e diagnóstico de doenças relacionadas com PTK7. Por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos e os imunoconjugados podem ser utilizados para desencadear in vivo ou in vitro uma ou mais das seguintes actividades biológicas: para inibir o crescimento de, e/ou matar, uma célula que expresse PTK7; para mediar fagocitose ou ADCC de uma célula que expresse PTK7 na presença de células efectoras humanas; ou para bloquear a ligação do ligando de PTK7 a PTK7.

Os anticorpos (p. ex. anticorpos humanos e composições) podem ser utilizados in vivo para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças relacionadas com PTK7. Exemplos de doenças relacionadas com PTK7 incluem, entre outras, cancro do cólon (incluindo cancro do intestino delgado), melanoma (p. ex., melanoma maligno metastático), leucemia mielóide aguda, cancro do pulmão, cancro da mama, 56 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ cancro da bexiga, cancro pancreático, cancro do ovário e cancro da próstata.

As vias de administração adequadas das composições de anticorpo (p.ex., anticorpos humanos monoclonais e imunoconjugados) do invento in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser seleccionadas pelos vulgares peritos. Por exemplo, as composições de anticorpo podem ser administradas através de injecção (p. ex., intravenosa ou subcutânea). As dosagens adequadas das moléculas utilizadas dependerão da idade e do peso do sujeito e da concentração e/ou formulação da composição de anticorpo.

Tal como descrito anteriormente, os anticorpos anti-PTK7 humanos do invento podem ser co-administrados com um ou mais outros agentes terapêuticos, p. ex., um agente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agente imunossupressor. 0 anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separado do agente. Neste último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, depois ou simultaneamente com o agente ou pode ser co-administrado com outras terapias conhecidas, p. ex., uma terapia anticancro, p. ex., radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos, tais como doxorrubicina (adriamicina), sulfato de cisplatina-bleomicina, carmustina, clorambucilo e ciclofosfamida hidroxiureia, que, por si, só são eficazes a níveis que são tóxicos ou subtóxicos para um paciente. A cisplatina é administrada intravenosamente como uma dose de 100 mg/dose uma vez cada quatro semanas e a adriamicina é administrada intravenosamente numa dose de 60-75 mg/ml, uma vez cada 21 dias. A co-administração de anticorpos anti-PTK7 humanos ou de fragmentos de ligação ao antigénio destes, do presente invento com agentes quimioterapêuticos proporciona dois agentes anticancro que actuam através de mecanismos diferentes, que produzem um efeito citotóxico para células tumorais humanas. Tal co-administração pode resolver problemas devidos ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou de uma mudança na antigenicidade das células tumorais que se tornam não reactivas com o anticorpo. 57 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Numa concretização, os imunoconjugados do invento podem ser utilizados para direccionar compostos (p. ex., agentes terapêuticos, marcadores, citotoxinas, radiotoxinas, imunossupressores, etc.)λ a células que possuam receptores da superfície celular PTK7, ligando tais compostos ao anticorpo. Por exemplo, um anticorpo anti-PTK7 pode ser conjugado com qualquer um dos compostos toxina descritos nas Patentes U.S. Nos. 6281354 e 6548530, publicações de Patente U.S. Nos. 20030050331, 20030064984, 20030073852 e 20040087497 ou publicado em WO 03/022806. Assim, o invento proporciona também métodos para localização ex vivo ou in vivo de células que expressem PTK7 (p. ex., com um marcador detectável, tal como um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofactor de enzima). Alternativamente, os imunoconjugados podem ser utilizados para matar células que tenham receptores de superfície celular PTK7 direccionando citotoxinas ou radiotoxinas para PTK7. Células efectoras específicas do alvo, p. ex., células efectoras ligada a composições (p. ex., anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) do invento podem também ser utilizadas como agentes terapêuticos. As células efectoras para direccionamento podem ser leucócitos humanos, tais como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células assassinas naturais e outras células que possuam um receptor de IgG ou IgA. Se desejado, as células efectoras podem ser obtidas a partir do sujeito a tratar. As células efectoras específicas do alvo podem ser administradas como uma suspensão de células numa solução fisiologicamente aceitável. O número de células administradas pode ser da ordem de 108-109 mas variará dependendo da finalidade terapêutica. Em geral, a quantidade será suficiente para obter a localização na célula alvo, p. ex., uma célula tumoral expressando PTK7 e efectuar a morte da célula através de, p. ex., fagocitose. As vias de administração podem também variar. A terapia com células efectoras específicas do alvo pode ser realizada em conjunto com outras técnicas para remoção de células alvo. Por exemplo, a terapia anti-tumoral utilizando as composições (p. ex., anticorpos humanos) do invento e/ou células efectoras armadas com estas composições pode ser 58 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ utilizada em conjunto com quimioterapia. Além disso, imunoterapia de combinação pode ser utilizada para dirigir duas populações efectoras citotóxicas distintas para rejeição de células tumorais. Por exemplo, anticorpos anti-PTK7 ligados a anti-Fc-gama RI ou anti-CD3 podem ser utilizados em conjunto com agentes de ligação específicos do receptor de IgG ou IgA.

As composições (p. ex., anticorpos humanos e imunoconjugados) do invento que têm locais de ligação ao complemento, tais como porções de IgGl, 2 ou 3 ou IgM que se ligam ao complemento, podem também ser utilizados na presença de complemento. Numa concretização, o tratamento ex vivo de uma população de células compreendendo células alvo com um agente de ligação do invento e células efectoras apropriadas pode ser suplementado através da adição de complemento ou soro contendo complemento. A fagocitose de células alvo revestidas com um agente de ligação do invento pode ser melhorada através da ligação de proteínas do complemento. Noutra concretização, células alvo revestidas com as composições (p. ex., anticorpos humanos) do invento podem também ser lisadas pelo complemento. Ainda noutra concretização, as composições do invento não activam o complemento.

As composições (p. ex., anticorpos humanos e imunoconjugados) do invento podem também ser administradas juntamente com o complemento. Concordantemente, dentro do âmbito do invento estão composições compreendendo anticorpos humanos e soro ou complemento. Estas composições são vantajosas na medida em que o complemento está localizado em estreita proximidade com os anticorpos humanos. Alternativamente, os anticorpos humanos do invento e o complemento ou soro podem ser administrados separadamente.

Consequentemente, aos pacientes tratados com as composições de anticorpo do invento pode ser adicionalmente administrado (antes, simultaneamente ou após a administração de um anticorpo humano do invento) outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, que melhora ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpos humanos. 59 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Noutras concretizações, ο sujeito pode ser adicionalmente tratado com um agente que module, p. ex., aumente ou iniba, a expressão ou actividade dos receptores Fcy ou Fcy, por exemplo, através do tratamento do sujeito com uma citocina. As citocinas preferidas para administração durante o tratamento com a molécula multiespecifica incluem factor de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), interferão-γ (IFN-γ) e factor de necrose tumoral (TNF) .

As composições (p. ex., anticorpos humanos) do invento podem também ser utilizadas para direccionar células expressando FcyR ou PTK7, por exemplo para marcação de tais células. Para tal utilização, o agente de ligação pode ser ligado a uma molécula que pode ser detectada. Assim, o invento proporciona métodos para localização ex vivo ou in vitro de células que expressam receptores de Fc, tais como FcyR ou PTK7. 0 marcador detectável pode ser, p. ex., um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofactor de enzima.

Também dentro do âmbito do presente invento estão estojos compreendendo as composições de anticorpo do invento (p. ex., anticorpos humanos ou imunoconjugados) e instruções de utilização. 0 estojo pode ainda conter um ou mais reagentes adicionais, tais como um reagente imunossupressor, um agente citotóxico, ou um agente radiotóxico ou um ou mais anticorpos humanos adicionais do invento (p. ex., um anticorpo humano possuindo uma actividade complementar que se liga a um epitopo no antigénio PTK7 distinto do primeiro anticorpo humano). Os estojos incluem tipicamente um marcador indicando a utilização pretendida dos componentes do estojo. 0 termo marcador inclui qualquer material escrito ou registado fornecido no ou com o estojo, ou que de outro modo acompanhe o estojo. 0 presente invento é ainda ilustrado pelos seguintes exemplos que não devem ser entendidos como maior limitação.

Exemplos 60 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Exemplo 1: Geração de Anticorpos Monoclonals Humanos Contra PTK7

Antigénio

Os protocolos de imunização utilizaram como antigénio tanto (i) uma proteina de fusão recombinante compreendendo a porção extracelular de PTK7 com uma etigueta myc e his como (ii) a PTK7 inteira ligada à membrana. Ambos os antigénios foram gerados através de métodos de transfecção recombinantes numa linha celular CHO.

Ratinhos Transgenicos HuMab e KM

Anticorpos monoclonais totalmente humanos para PTK7 foram preparados utilizando as estirpes HCo7 e HCol2 de ratinhos transgénicos HuMab e a estirpe de ratinhos transgénicos transcromossómicos KM, cada uma das quais expressa genes de anticorpos humanos. Em cada uma destas estirpes de ratinho, o gene da cadeia leve capa de ratinho endógeno foi interrompido homozigoticamente tal como descrito em Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 811-820 e o gene da cadeia pesada de ratinho endógeno foi interrompido homozigoticamente tal como descrito no Exemplo 1 da Publicação PCT WO 01/09187.

Cada uma destas estirpes de ratinho possui um transgene da cadeia leve capa humana, KCo5, tal como descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 . A estirpe HCo7 possui o transgene da cadeia pesada humana HCo7, tal como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5770429; 5545806; 5625825; e 5545807. A estirpe HCol2 possui o transgene da cadeia pesada humana HCol2 tal como descrito no Exemplo 2 de WO 01/09187 ou Exemplo 2 de WO 01/14424. A estirpe KM contém o transcromossoma SC20 tal como descrito na Publicação PCT WO 02/43478.

Imunizações de HuMab e KM:

Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para PTK7, ratinhos HuMab e ratinhos KM” foram imunizados com proteina de fusão PTK7 recombinante purificada e células CHO transfectadas com PTK7 como antigénio. Esquemas gerais de imunização para ratinhos HuMab são descritos em Lonberg, N. 61 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ et al., (1994) Nature 368 (6474) : 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 e Publicação PCT WO 98/24884. Os ratinhos tinham 6-16 semanas de idade após a primeira infusão de antigénio. Uma preparação recombinante purificada (5-50 pg) de antigénio proteina de fusão de PTK7 e 5-10xl06 células foram utilizadas para imunizar os ratinhos HuMab e ratinhos KM™ por via intraperitoneal, subcutânea (Sc) ou através de injecção na pata.

Os ratinhos transgénicos foram imunizados duas vezes com antigénio em adjuvante completo de Freund ou adjuvante de Ribi IP, seguido por 3-21 dias IP (até um total de 11 imunizações) com o antigénio em adjuvante incompleto de Freund ou Ribi. A resposta imunitária foi monitorizada através de sangrias retro-orbitais. O plasma foi pesquisado através de ELISA (tal como descrito abaixo), e os ratinhos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-PTK7 foram utilizados para fusões. Os ratinhos foram reforçados por via intravenosa com antigénio 3 dias antes do sacrifício e da remoção do baço. Tipicamente, foram realizadas 10-35 fusões para cada antigénio. Várias dezenas de ratinhos foram imunizadas para cada antigénio.

Selecção de Ratinhos HuMab ou KM™ Produtores de Anticorpos Anti-PTK7:

Para seleccionar ratinhos HuMab ou KM™ produtores de anticorpos que se ligam a PTK7, os soros dos ratinhos imunizados foram testados através de ELISA tal como descrito por Fishwild, D. et al. (1996). Resumidamente, placas de microtitulação foram revestidas com proteína de fusão de PTK7 recombinante purificada a partir de células CHO transfectadas com 1-2 pg/ml em PBS, 100 μΐ/poço incubadas a 4°C de um dia para o outro, em seguida bloqueadas com 200 μΐ/poço de soro fetal bovino a 5% em PBS/Tween (0,05%). As diluições de soros de ratinhos imunizados com PTK7 foram adicionadas a cada poço e incubadas durante 1-2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e depois incubadas com um anticorpo policlonal de cabra anti-IgG humana conjugado com peroxidase de rábano (HRP) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram reveladas com o substrato ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) e analisadas 62 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ através de espectrofotometria a uma DO 415-495. Os ratinhos que desenvolveram os títulos mais elevados de anticorpos anti-PTK7 foram utilizados para fusões. As fusões foram realizadas tal como descrito abaixo e os sobrenadantes dos hibridomas foram testados quanto à actividade anti-PTK7 através de ELISA.

Geração de Hibridomas Produtores de Anticorpos Monoclonais Humanos para PTK7:

Os esplenócitos de ratinho, isolados a partir de ratinhos HuMab, foram fundidos com PEG com uma linha de células de mieloma de ratinho com base em protocolos padrão. Os hibridomas resultantes foram então pesquisados quanto à produção de anticorpos específicos do antigénio. Suspensões de células individuais de esplenócitos de ratinhos imunizados foram fundidas com um quarto do número de células SP2/0 de mieloma de ratinho não secretoras (ATCC, CRL 1581) com PEG a 50% (Sigma). As células foram plaqueadas a aproximadamente lxl05/poço em placas de microtitulação de fundo plano, seguido de cerca de duas semanas de incubação em meio selectivo contendo 10% de soro fetal bovino a 10%, meio condicionado com P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) a 10%, Origen (IGEN) a 3-5% em DMEM (Mediatech, CRL 10013, rico em glicose, L-glutamina e piruvato de sódio) mais HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 mg/ml de gentamicina e HAT lx (Sigma, P-7185 CRL). Após 1-2 semanas, as células foram cultivadas em meio no qual o HAT foi substituído por HT. Os poços individuais foram então pesquisados através de ELISA (descrito acima) para anticorpos monoclonais IgG anti-PTK7 humanos. Uma vez ocorrido um crescimento extensivo do hibridoma, o meio foi monitorizado normalmente após 10-14 dias. Os hibridomas não secretoras de anticorpo foram novamente plaqueados, pesquisados novamente e, se ainda positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais anti-PTK7 foram subclonados pelo menos duas vezes através de diluição limitante. Os sub-clones estáveis foram então cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para melhor caracterização. 63 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Os clones dos hibridomas 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 foram seleccionados para mais análises.

Exemplo 2: Caracterização Estrutural dos Anticorpos Monoclonais Humanos 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8

As sequências de ADNc codificando as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves dos anticorpos monoclonais 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 foram obtidas a partir dos hibridomas 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8, respectivamente, utilizando técnicas de PCR padrão e foram sequenciadas utilizando técnicas de sequenciação de ADN padrão.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 3G8 são mostradas na Figura IA e em SEQ ID NO: 41 e 1, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 3G8 são mostradas na Figura 1B e em SEQ ID NO: 45 e 5, respectivamente. A comparação da sequência da cadeia pesada da imunoglobulina 3G8 com as sequências conhecidas de cadeia pesada de imunoglobulinas humanas da linha germinativa demonstrou que a cadeia pesada de 3G8 utiliza um segmento VH da linha germinativa humana VH 3-30.3, um segmento D indeterminado, e um segmento JH da linha germinativa humana JH 4b. O alinhamento da sequência de VH de 3G8 com a sequência da linha germinativa VH 3-30.3 é mostrado na Figura 5. Uma análise posterior da sequência de VH de 3G8 utilizando o sistema de determinação da região CDR de Kabat levou à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia pesada, tal como mostrado nas Figuras IA e 5, e em SEQ ID NOs: 11, 15 e 19, respectivamente. A comparação da sequência de cadeia leve da imunoglobulina 3G8 com as sequências de cadeias leves de imunoglobulinas humanas da linha germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia leve de 3G8 utiliza um segmento VL da linha germinativa humana VK L15 e um segmento JK da linha germinativa humana JK 1. O alinhamento da sequência de VL de 64 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ 3G8 com a sequência da linha germinativa VK L15 é mostrado na Figura 9. Uma análise posterior da sequência de VL de 3G8 utilizando o sistema de Kabat de determinação das regiões CDR conduziu à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve tal como mostrado nas Figuras 1B e 9, e em SEQ ID NOs: 23, 29 e 35, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 3G8a são mostradas na Figura IA e em SEQ ID NO: 41 e 1, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 3G8a são mostradas na Figura 1C e em SEQ ID NO: 46 e 6, respectivamente. A comparação da sequência de cadeia pesada da imunoglobulina 3G8a com as sequências de cadeias pesadas de imunoglobulinas humanas da linha germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia pesada de 3G8a utiliza um segmento VH da linha germinativa humana VH 3-30.3, um segmento D indeterminado, e um segmento JH da linha germinativa humana JH 4b. O alinhamento da sequência de VH de 3G8a com a sequência da linha germinativa VH 3-30.3 é mostrado na Figura 5. Uma análise posterior da sequência de VH de 3G8a utilizando o sistema de Kabat de determinação das regiões CDR conduziu à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia pesada tal como mostrado na Figuras IA e 5, e em SEQ ID NOs: 11, 15 e 19, respectivamente. A comparação da sequência de cadeia leve da imunoglobulina 3G8a com as sequências de cadeias leves de imunoglobulinas humanas da linha germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia leve de 3G8a utiliza um segmento VL da linha germinativa humana VK L15 e um segmento JK da linha germinativa humana JK 3. O alinhamento da sequência de VL de 3G8a com a sequência da linha germinativa VK L15 é mostrado na Figura 9. Uma análise posterior da sequência de VL de 3G8a utilizando o sistema de Kabat de determinação das regiões CDR conduziu à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 de cadeia leve tal como mostrado nas Figuras 1C e 9, e em SEQ ID NOs: 24, 30 e 36, respectivamente. 65 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 4D5 são mostradas na Figura 2A e em SEQ ID NO: 42 e 2, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 4D5 são mostradas na Figura 2B e em SEQ ID NO: 47 e 7, respectivamente. A comparação da sequência de cadeia pesada da imunoglobulina 4D5 com as sequências de cadeias pesadas de imunoglobulinas humanas da linha germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia pesada de 4D5 utiliza um segmento VH da linha germinativa humana VH 3-30.3, um segmento D indeterminado, e um segmento JH da linha germinativa humana JH 4b. O alinhamento da sequência de VH de 4D5 com a sequência da linha germinativa VH 3-30.3 é mostrado na Figura 6. Uma análise posterior da sequência de VH de 4D5 utilizando o sistema de Kabat de determinação das regiões CDR conduziu à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia pesada tal como mostrado nas Figuras 2A e 6, e em SEQ ID NOs: 12, 16 e 20, respectivamente. A comparação da sequência de cadeia leve da imunoglobulina 4D5 com as sequências de cadeias leves de imunoglobulinas humanas da linha germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia leve de 4D5 utiliza um segmento VL da linha germinativa humana VK AIO e um segmento JK da linha germinativa humana JK 5. O alinhamento da sequência de VL de 4D5 com a sequência da linha germinativa VK AIO é mostrado na Figura 10. Uma análise posterior da sequência de VL de 4D5 utilizando o sistema de Kabat de determinação das regiões CDR conduziu à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve tal como mostrado nas Figuras 2B e 10, e em SEQ ID NOs: 25, 31 e 37, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de 12C6 são mostradas na Figura 3A e em SEQ ID NO: 43 e 3, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável da cadeia leve de 12C6 são mostradas na Figura 3B e em SEQ ID NO: 48 e 8, respectivamente. 66 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ A comparação da sequência de cadeia pesada de imunoglobulina de 12C6 com as sequências de cadeias pesadas de imunoglobulinas humanas da linha germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia pesada de 12C6 utiliza um segmento VH da linha germinativa humana VH DP44, um segmento D indeterminado, e um segmento JH da linha germinativa humana JH 4b. 0 alinhamento da sequência VH de 12C6 com a sequência da linha germinativa VH DP44 é mostrado na Figura 7. Uma análise posterior da sequência VH de 12C6 utilizando o sistema de Kabat de determinação das regiões CDR conduziu à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia pesada tal como mostrado nas Figuras 3A e 7, e em SEQ ID NOs: 13, 17 e 21, respectivamente. A comparação da sequência de imunoglobulina da cadeia leve de 12C6 com as sequências de cadeias leves de imunoglobulinas humanas da linha germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia leve de 12C6 utiliza um segmento VL da linha germinativa humana VK A27 e um segmento JK da linha germinativa humana JK 2. 0 alinhamento da sequência de VL de 12C6 com a sequência da linha germinativa VK A27 é mostrado na Figura 11. Uma análise posterior da sequência de VL de 12C6 utilizando o sistema de Kabat de determinação das regiões CDR conduziu à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve tal como mostrado nas Figuras 3B e 11, e em SEQ ID NOs: 26, 32 e 38, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 12C6a são mostradas na Figura 3A e em SEQ ID NO: 43 e 3, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 12C6a são mostradas na Figura 3C e em SEQ ID NO: 49 e 9, respectivamente. A comparação da sequência da cadeia pesada da imunoglobulina 12C6a com as sequências de cadeias pesadas de imunoglobulinas humanas da linha germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia pesada de 12C6a utiliza um segmento VH da linha germinativa humana VH DP44, um segmento D indeterminado, e um segmento JH da linha germinativa humana 67

ΕΡ 1 957 539/PT JH 4b. 0 alinhamento da sequência de VH de 12C6a com a sequência da linha germinativa VH DP44 é mostrado na Figura 7. Uma análise posterior da sequência de VH de 12C6a utilizando o sistema de Kabat de determinação das regiões CDR conduziu à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 de cadeia pesada tal como mostrado nas Figuras 3A e 7, e em SEQ ID NOs: 13, 17 e 21, respectivamente. A comparação da sequência de cadeia leve da imunoglobulina 12C6a com as sequências de cadeias leves de imunoglobulinas humanas da linha germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia leve de 12C6a utiliza um segmento VL da linha germinativa humana VK L15 e um segmento JK da linha germinativa humana JK 2. 0 alinhamento da sequência de VL de 12C6a com a sequência da linha germinativa VK L15 é mostrado na Figura 12. Uma análise posterior da sequência de VL de 12C6a utilizando o sistema de Kabat de determinação das regiões CDR conduziu à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 de cadeia leve tal como mostrado nas Figuras 3C e 12, e em SEQ ID NOs: 27, 33 e 39, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 7C8 são mostradas na Figura 4A e em SEQ ID NO: 44 e 4, respectivamente.

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 7C8 são mostradas na Figura 4B e em SEQ ID NO: 50 e 10, respectivamente. A comparação da sequência de cadeia pesada da imunoglobulina 7C8 com as sequências de cadeias pesadas de imunoglobulinas humanas da linha germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia pesada de 7C8 utiliza um segmento VH da linha germinativa humana VH 3-33, um segmento D da linha germinativa humana 3-10, e um segmento JH da linha germinativa humana JH 6b. O alinhamento da sequência de VH de 7C8 com a sequência da linha germinativa VH 3-33 é mostrado na Figura 8. Uma análise posterior da sequência de VH de 7C8 utilizando o sistema de Kabat de determinação das regiões CDR conduziu à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 de cadeia pesada tal como mostrado nas Figuras 4A e 8, e em SEQ ID NOs: 14, 18 e 22, respectivamente. 68 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ A comparação da sequência de cadeia leve da imunoglobulina 7C8 com as sequências de cadeias leves de imunoglobulinas humanas da linha germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia leve de 7C8 utiliza um segmento VL da linha germinativa humana VK L6 e um segmento JK da linha germinativa humana JK 3. 0 alinhamento da sequência de VL de 7C8 com a sequência da linha germinativa VK L6 é mostrado na Figura 13. Uma análise posterior da sequência de VL de 7C8 utilizando o sistema de Kabat de determinação das regiões CDR conduziu à delineação das regiões CDR1, CDR2 e CD3 de cadeia leve tal como mostrado nas Figuras 4B e 13, e em SEQ ID NOs: 28, 34 e 40, respectivamente.

Exemplo 3: Mutação de mAb 12C6 e Utilização Alternativa da Linha Germinativa

Tal como discutido no Exemplo 2 acima, os anticorpos monoclonais 12C6 e 12C6a utilizam uma região variável da cadeia pesada derivada de uma sequência da linha germinativa humana DP-44 presente no transgene HCo7 da estirpe de Ratinho HuMab®. Uma vez que DP-44 não é uma sequência da linha germinativa que seja utilizada no repertório de imunoglobulinas humanas nativas, pode ser vantajoso mutar a sequência de VH de 12C6 e 12C6a para reduzir uma potencial imunogenicidade. De preferência, um ou mais resíduos estruturais da sequência de VH de 12C6 ou 12C6a são mutados num resíduo ou resíduos presentes na estrutura de uma sequência de VH estruturalmente aparentada da linha germinativa que seja utilizada no repertório de imunoglobulinas humanas nativas. Por exemplo, a Figura 7 mostra o alinhamento da sequência de VH de 12C6 e 12C6a com a sequência da linha germinativa DP44 e também com duas sequências humanas da linha germinativa estruturalmente aparentadas, VH 3-23 e VH 3-7. Dada a relação destas sequências, é possível prever que se pode seleccionar um anticorpo humano que se ligue especificamente a PTK7 humana e que utilize uma região VH derivada de uma sequência da linha germinativa VH 3-23 ou VH 3-7. Além disso, pode-se transformar um ou mais resíduos dentro da sequência de VH de 12C6 ou 12C6a que difiram da do resíduo ou dos resíduos na posição comparável na sequência de VH de 3-23 ou VH de 3-7 no 69 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ resíduo ou nos resíduos que estão presentes na VH de 3-23 ou VH de 3-7, ou numa substituição de aminoácidos conservativa destas.

Exemplo 4: Caracterização da Especificidade de Ligação e Cinética de Ligação de Anticorpos Monoclonais Humanos Anti-PTK7

Neste exemplo, a afinidade de ligação e a cinética de ligação dos anticorpos anti-PTK7 foram examinados através de análise Biacore. A especificidade de ligação, e a competição cruzada foram examinadas através de citometria de fluxo.

Especificidade de ligação através de citometria de fluxo

Linhas celulares HEK3 que expressam PTK7 humana recombinante na superfície celular foram desenvolvidas e utilizadas para determinar a especificidade de anticorpos monoclonais humanos de PTK7 através de citometria de fluxo. As células HEK3 foram transfectadas com plasmídeos de expressão contendo ADNc inteiro codificando formas transmembranares de PTK7. A ligação do anticorpo monoclonal humano anti-PTK7 7C8 foi avaliada através de incubação das células transfectadas com o anticorpo monoclonal humano anti-PTK7 a uma concentração de 10 pg/ml. As células foram lavadas e a ligação foi detectada com um Ac anti-IgG humana marcado com FITC. As análises de citometria de fluxo foram realizadas utilizando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA) . Os resultados estão representados nas Figuras 14. O anticorpo monoclonal humano anti-PTK7 7C8 ligou-se às células HEK3 transf ectadas com PTK7 mas não a células HEK3 que não foram transfectadas com PTK7 humana. Estes dados demonstram a especificidade dos anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 para PTK7.

Especificidade de Ligação através de ELISA A ligação de anticorpos anti-PTK7 foi também avaliada através de ELISA padrão para examinar a especificidade da ligação a PTK7. 70 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ Ο domínio extracelular recombinante de PTK7 foi testado quanto à ligação contra os anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 e 12C6a a diferentes concentrações. Foram efectuados procedimentos ELISA padrão. Os anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 foram adicionados a uma concentração de partida de 10 pg/ml e diluídos em série a uma diluição de 1:2. Anticorpo policlonal de cabra anti-IgG humana (específico da cadeia capa) conjugado com peroxidase de rábano (HRP) foi utilizado como anticorpo secundário. Os resultados são mostrados na Figura 15. Cada um dos anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 e 12C6a ligou-se a PTK7. Estes dados demonstram a especificidade dos anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 para PTK7.

Mapeamento de Epitopos dos Anticorpos Anti-PTK7

Foi utilizada citometria de fluxo para determinar o agrupamento de epitopos de HuMAb anti-PTK7. Células de tumor de Wilms G-401 (No. de Acesso ATCC CRL-1441) foram transfectadas com plasmídeos de expressão contendo ADNc inteiro codificando formas transmembranares de PTK7. A ligação ao epitopo de cada anticorpo monoclonal humano anti-PTK7 foi avaliada através de incubação de lxlO5 células transfectadas com 10 pg/ml de anticorpo monoclonal humano anti-PTK7 frio, lavagem, seguido de adição de 10 yg/ml de um anticorpo monoclonal humano anti-PTK7 conjugado com fluorescência. A ligação foi detectada com um Ac anti-IgG humana marcado com FITC. Análises de citometria de fluxo foram efectuadas utilizando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Após análise dos dados, os anticorpos anti-PTK7 foram categorizados em 3 grupos de epitopos - grupo A, que inclui 7D11, grupo B, que inclui 3G8 e 3G8a e grupo C, que inclui 7C8, 12C6 e 12C6a.

Exemplo 5: Caracterização da ligação do anticorpo anti-PTK7 a PTK7 expressa na superficie de células de cancro humano A linha celular do tumor nefroblastoma de Wilms G-401 (No. de Ac. ATCC CRL-1441) foi testada quanto à ligação dos anticorpos monoclonais humanos HuMab anti-PTK7 12C6 e 7C8 a diferentes concentrações. A ligação dos anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 foi avaliada através de 71 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ incubação de lxlΟ5 células com o anticorpo a uma concentração inicial de 30 mg/ml e diluindo em série o anticorpo a uma diluição de 1:10. As células foram lavadas e a ligação foi detectada com um Ac anti-IgG humana marcado com PE. As análises de citometria de fluxo foram realizadas utilizando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Os resultados são mostrados na Figura 16. Os anticorpos monoclonais anti-PTK7 12C6 e 7C8 ligaram-se à linha celular do tumor nefroblastoma de Wilms de um modo dependente da concentração, medido através da intensidade média de fluorescência (IMF) da coloração. Os valores de CE50 para os anticorpos monoclonais anti-PTK7 12C6 e 7C8 foram de 4,035 nM e 3,428 nM, respectivamente.

Estes dados demonstram que os HuMAb anti-PTK7 se ligam a linhas celulares de cancro do rim.

Exemplo 6: Ligação do anticorpo anti-PTK7 humano a linhas celulares de cancro

Os anticorpos anti-PTK7 foram testados quanto à ligação a uma variedade de linhas celulares de cancro através de citometria de fluxo. A ligação dos anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 3G8, 12C6a, 4D5 e 12C6 a um painel de linhas celulares de cancro foi avaliada através de incubação de linhas celulares de cancro com anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 a uma concentração de 10 pg/ml. As linhas celulares de cancro que foram testadas foram A-431 (No. de Ac. ATCC CRL-1555), células de tumor de Wilms G-401 (No. de Ac. ATCC CRL-1441), Saos-2 (No. de Ac. ATCC HTB-85), SKOV-3 (No. de Ac. ATCC HTB-77), PC3 (No. de Ac. ATCC CRL-1435), DMS 114 (No. de Ac. ATCC CRL-2066), ACHN (No. de Ac. ATCC CRL-1611), LNCaP (No. de Ac. ATCC CRL-1740), DU 145 (No. de Ac. ATCC HTB-81), LoVo (No. de Ac. ATCC CCL-229) e MIA PaCa-2 (No. de Ac. ATCC CRL-1420). Um anticorpo de controlo do isotipo foi utilizado como controlo negativo. As células foram lavadas e a ligação foi detectada com um Ac anti-IgG humana marcado com FITC. As análises de citometria de fluxo foram realizadas utilizando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Os resultados são mostrados nas Figuras 17. Os anticorpos 72 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ monoclonais anti-PTK7 3G8, 12C6a, 4D5 e 12C6 ligaram-se às linhas celulares de cancro A-431, células de tumor de Wilms G-401, Saos-2, SKOV-3, PC3, DMS 114, ACHN, LNCaP, DU 145, LoVo e MIA PaCa-2, medido através da intensidade média de fluorescência (IMF) da coloração. Estes dados demonstram que os HuMAb anti-PTK7 se ligam a uma variedade de células de cancro que expressam PTK7 na superfície celular.

Exemplo 7: Ligação de anti-PTK7 a células T, Be dendriticas humanas

Os anticorpos anti-PTK7 foram testados quanto à ligação a células T CD4+, CD8+, células B CD19+ e células dendriticas mielóides do sangue humano expressando PTK7 na sua superfície celular através de citometria de fluxo.

As células T humanas foram activadas através de anticorpo anti-CD3 para induzir a expressão de PTK7 nas células T antes de se ligarem a um anticorpo monoclonal anti-PTK7 humano. A ligação do anticorpo monoclonal humano anti-PTK7 7c8 foi avaliada através da incubação das células com os anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 a uma concentração de 10 pg/ml. Nalgumas experiências, um anticorpo conhecido que se liga a um marcador específico de células T e B foi utilizado como controlo positivo. As células foram lavadas e a ligação foi detectada com um Ac anti-IgG humana marcado com FITC. As análises de citometria de fluxo foram realizadas utilizando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA) . Os resultados são mostrados nas Figuras 18 (células T e células B humanas activadas) e 19 (células dendriticas). O anticorpo monoclonal anti-PTK7 7C8 ligou-se a células T CD4+ e CD8+ e células dendriticas humanas activadas, mas não a células B, medido através da intensidade média de fluorescência (IMF) da coloração. Estes dados demonstram que os HuMAb anti-PTK7 se ligam a células T humanas e células dendriticas.

Exemplo 8: Internalização do anticorpo monoclonal anti-PTK7

Os HuMAb anti-PTK7 foram testados quanto à capacidade para se internalizarem em linhas celulares expressando PTK7 utilizando um ensaio de internalização Hum-Zap. O ensaio Hum- 73 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Zap testa a internalização de um anticorpo humano primário através da ligação de um anticorpo secundário com afinidade para IgG humana conjugada com a toxina saporina.

As linhas celulares de cancro expressando PTK7 do tumor de Wilms G-401 (No. de Ac. ATCC CRL-1441), A-431 (No. de Ac. ATCC CRL-1555) e PC3 (No. de Ac. ATCC CRL-1435) foram semeadas a lxlO4 células/poço em poços de 100 μΐ directamente. Os anticorpos HuMab anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 ou 7C8 foram adicionados aos poços a uma concentração inicial de 30 nM e titulados em diluições em série de 1:3. Um anticorpo de controlo de isotipo, que é não especifico para PTK7, foi utilizado como controlo negativo. O Hum-Zap (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, TI-22-25) foi adicionado a uma concentração de 11 nM e as placas foram deixadas a incubar durante 72 horas. As placas foram então pulsadas com 1,0 pCi de 3H-timidina durante 24 horas, colhidas e lidas num Contador de Cintilações Top Count (Packard Instruments, Meriden, CT) . Os resultados são mostrados nas Figuras 20A-D. Os anticorpos anti-PTK7 3G8, 4D5, 7C8 e 12C6 mostraram uma diminuição dependente da concentração de anticorpo na incorporação de 3H-timidina na linha celular de cancro do tumor de Wilms expressando PTK7. Os anticorpos anti-PTK7 12C6 e 7C8 mostraram uma diminuição dependente da concentração de anticorpo na incorporação de 3H-timidina nas linhas celulares de cancro expressando PTK7 A-431 e PC3. O valor de CE50 para os anticorpos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 e 7C8 em células de tumor de Wilms foi de 0,6437 nM, 0,2516 nM, 0,2053 nM e 0, 1788 nM, respectivamente. O valor de CE50 para os anticorpos anti-PTK7 12C6 e 7C8 em células A-431 foi de 0,1657 nM e 0, 1826 nM, respectivamente. O valor de CE50 para os anticorpos anti-PTK7 12C6 e 7C8 em células tumorais PC3 foi de 0,3175 nM e 0,2648 nM, respectivamente. Estes dados demonstram que os anticorpos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 e 7C8 se internalizam em células de cancro.

Exemplo 9: Avaliação de morte celular de um anticorpo anti-PTK7 conjugado com uma toxina sobre linhas celulares de cancro humanas

Neste exemplo, anticorpos monoclonais anti-PTK7 conjugados com uma toxina foram testados quanto à capacidade 74 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ de matar linhas celulares de cancro humanas PTK7+ num ensaio de proliferação celular. 0 anticorpo HuMab anti-PTK7 12C6a foi conjugado com uma toxina através de um ligador, tal como um ligador peptidilo, hidrazona ou dissulfureto. Exemplos de compostos toxinas que podem ser conjugados com os anticorpos do presente invento são descritos em WO 2007/038658. A linha celular de cancro renal humano do tumor de Wilms expressando PTK7 G-401 (No. de Ac. ATCC CRL-1441) foi semeada a 104 células/poço em poços de 100 μΐ durante 3 horas. Um conjugado anticorpo anti-PTK7-toxina foi adicionado aos poços a uma concentração inicial de 100 nM e titulado em diluições em série até 1:3. As placas foram deixadas a incubar durante 48 horas. As placas foram então pulsadas com 1 pCi de 3H-timidina durante 24 horas antes do término da cultura, colhidas e lidas num Contador de Cintilações Top Count (Packard Instruments). A Figura 21 mostra os efeitos do conjugado de 12C6a nas células de tumor de Wilms. O anticorpo anti-PTK7 12C6a mostrou uma diminuição dependente da concentração de anticorpo-toxina na incorporação de 3H-timidina na linha celular de cancro renal humano do tumor de Wilms expressando PTK7.

Estes dados demonstram que os anticorpos anti-PTK7 conjugados com toxina mostram citotoxicidade especifica para as células de cancro renal humano.

Exemplo 10: Avaliação de morte celular de um anticorpo anti-PTK7 conjugado com toxina em linhas celulares de tumor humanas

Neste exemplo, anticorpos monoclonais anti-PTK7 conjugados com uma toxina foram testados quanto à capacidade de matar linhas celulares de tumor humanas PTK7+ possuindo expressão de PTK7 na superfície celular baixa, intermédia ou alta num ensaio de proliferação celular. O anticorpo HuMAb anti-PTK7 12C6a foi conjugado com uma toxina através de um ligador, tal como um ligador peptidilo, hidrazona ou dissulfureto. Exemplos de compostos de toxinas que podem ser conjugados com os anticorpos do presente invento são descritos em WO 2007/038658. As linhas celulares 75 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ de cancro de tumores humanos expressando PTK7 A-431, SK0V3 e LoVo foram semeadas a 104 células/poço em poços de 100 μΐ. As linhas celulares foram previamente testadas quanto à expressão de PTK7 na superfície celular num ensaio FACS padrão. A linha celular A-431 expressou o nível mais elevado de expressão na superfície celular de PTK7 e a linha celular LoVo expressou o nível mais baixo de expressão na superfície celular de PTK7. Um conjugado de anticorpo anti-PTK7-toxina foi adicionado aos poços a uma concentração inicial de 20 nM e titulado em diluições em série até 1:2. Um anticorpo de controlo de isotipo foi utilizado como controlo negativo. As placas foram deixadas a incubar durante 3 horas e os conjugados anticorpo-toxina não ligados (livres) foram lavados. As placas continuaram a incubar durante 96 horas e a actividade de morte (UF, unidade fluorescente) foi medida através da viabilidade celular em ensaio Luminescente CellTiter-Glo® de acordo com o protocolo (Promega, WI, EUA, Boletim técnico No. 288) utilizando um leitor BIO-TEK (Bio-Tek Instruments, Inc, VT, USA) . Os resultados são mostrados na Figura 22. 0 conjugado anti-PTK7-toxina mostrou uma diminuição dependente da concentração de anticorpo-toxina no ensaio de proliferação em A431alta, SKOV3inter, e LoVobaixa expressando PTK7.

Estes dados demonstram que os anticorpos anti-PTK7 conjugados com toxina mostram citotoxicidade específica para várias células de cancro humanas.

Exemplo 11: Imuno-histoquímica com 3G8, 12C6a, 2E11 A capacidade dos HuMAb anti-PTK7 3G8, 12C6a, e 2E11 para reconhecerem PTK7 através de imuno-histoquímica foi examinada utilizando biopsias clínicas de cancro do pulmão, cancro da mama, cancro da bexiga, cancro pancreático, cancro do cólon, cancro do ovário, cancro do intestino delgado e cancro da próstata.

Para imuno-histoquímica, foram utilizadas secções congeladas de 5 pm (Ardais Inc, EUA). Após secagem durante 30 minutos, as secções foram fixadas com acetona (à temperatura ambiente durante 10 minutos) e secas ao ar durante 5 minutos. As lâminas foram lavadas em PBS e, em seguida, pré-incubadas 76 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ com soro de cabra normal a 10% em PBS durante 20 minutos e subsequentemente incubadas com 10 μg/ml de anticorpo com FITC em PBS com soro de cabra normal a 10% durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas foram lavadas três vezes com PBS e incubadas durante 30 min com anti-FITC de ratinho (DAKO 10 yg/m) à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas novamente com PBS e incubadas anti-ratinho de cabra conjugado com HRP (DAKO) durante 30 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas novamente 3x com PBS. Diaminobenzidina (Sigma) foi utilizada como substrato, resultando em coloração castanha. Após lavagem com água destilada, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina durante 1 min. Posteriormente, as lâminas foram lavadas durante 10 s em água destilada corrente e montadas em glycergel (Dako). A coloração imuno-histoquímica das biopsias clinicas mostrou coloração positiva em seções de cancro do pulmão, cancro da mama, cancro da bexiga, cancro pancreático, cancro do cólon, cancro do ovário, cancro do intestino delgado e cancro de próstata. O tecido normal foi sempre negativo para a coloração de PTK7, enquanto dentro do tecido maligno, observou-se que tanto os fibroblastos activados por cancro como as células epiteliais de cancro eram positivos para coloração de PTK7. A identidade dos fibroblastos activados por cancro foi confirmada em seções de cancro de bexiga e cancro de mama através de coloração com um anticorpo da Proteína de Activação de Fibroblastos (FAP, Alexis Biochemicals, San Diego, EUA). FAP é um marcador conhecido de fibroblastos activados por cancro (Hofheinz et al. (2003) Oncologie 26: 44-48).

Exemplo 12: Ensaio de invasão

Neste exemplo, anticorpos dirigidos contra PTK7 foram testados quanto à capacidade para afectar a invasão celular na linha de células CHO transfectadas com PTK7. O ensaio foi feito utilizando um HTS 96-Multiwell Insert System (Cat # 351162, BD Biosciences, CA) de acordo com o protocolo. Uma linha de células CHO parental, células CHO transfectadas com PTK7 inteira ou uma linha de células de controlo HEK293 foi misturada com um banco de HuMab anti-PTK7 ou um anticorpo de controlo do isotipo antes da adição das células nas inserções. A mistura (células + banco de Ac) foi adicionada a 77 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ um poço de inserção na placa de invasão. Após incubação a 37°C com CO2 a 5% durante 24 horas, as células foram marcadas com um corante fluorescente e as células que invadiram a parte inferior da membrana foram quantificadas utilizando um leitor de fluorescência de placas. Os resultados são mostrados na Figura 23. Estes dados demonstram que os anticorpos anti-PTK7 inibem a mobilidade de invasão de células expressando PTK7 na superfície celular.

Exemplo 13: Tratamento do modelo in vivo de xenoenxerto de cancro do pâncreas utilizando anticorpos anti-PTK7 nus e conjugados com citotoxina

Este Exemplo descreve o tratamento in vivo de ratinhos implantados com um tumor carcinoma de células pancreáticas com anticorpos anti-PTK7 conjugados com toxina para examinar o efeito in vivo dos anticorpos no crescimento tumoral. Células HPAC (adenocarcinoma pancreático humano, Número de Acesso ATCC CRL-2119) ou outras de cancro pancreático adequadas foram expandidas in vitro utilizando procedimentos laboratoriais padrão. Ratinhos nus atímicos Ncr machos (Taconic, Hudson, NY) entre 6-8 semanas de idade foram implantados subcutaneamente no flanco direito com 2,5xl06 células HPAC em 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por ratinho. Os ratinhos foram pesados e medidos quanto às três dimensões dos tumores utilizando um paquímetro electrónico duas vezes por semana após a implantação. Os volumes tumorais foram calculados como altura χ largura χ comprimento/2. Os ratinhos com tumores HPAC com 90 mm3 em média foram distribuídos aleatoriamente em grupos de tratamento. Aos ratinhos foi administrada uma dose única intravenosa com veiculo de PBS, anticorpo anti-PTK7 nu ou HuMAb anti-PTK7 conjugado com toxina no Dia 0 na dosagem indicada (pmol/kg). Exemplos de compostos toxina que podem ser conjugados com os anticorpos do presente invento foram descritos na Publicação de Pedido de Patente U.S. número 2006/0024317 AI pendente. Os ratinhos foram monitorizados quanto ao crescimento tumoral durante 61 dias após a dosagem. Os ratinhos foram sujeitos a eutanásia quando os tumores atingiam o ponto final (2000 mm3) ou ulceravam. Os anticorpos anti-PTK7 conjugados com uma toxina retardaram a progressão do crescimento tumoral. Os resultados 78 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ são mostrados na Figura 24. 0 efeito anti-tumoral do anti-PTK7 conjugado com toxina foi dependente da dose, com o maior efeito observado a uma dose de 0,3 pmol/kg. O tratamento com o conjugado anti-PTK7-toxina foi bem tolerado, com sujeitos que nunca experimentaram uma perda de peso corporal mediana superior a 5% (dados não mostrados). Assim, o tratamento com um conjugado anticorpo anti-PTK7-toxina tem um efeito inibitório in vivo directo no crescimento tumoral do cancro do pâncreas.

Exemplo 14: Tratamento do modelo in vivo de xenoenxerto de células de cancro de mama utilizando anticorpos anti-PTK7 nus e conjugados com citotoxina

Este Exemplo divulga o tratamento in vivo de ratinhos implantados com um tumor de carcinoma da mama resistente a adriamicina com anticorpos anti-PTK7 conjugados com toxina para examinar o efeito in vivo dos anticorpos no crescimento tumoral. MCF7-adr (linha celular de cancro da mama humano resistente a adriamicina) foi expandida in vitro utilizando procedimentos laboratoriais padrão. Ratinhos CB17.SCID fêmeas (Taconic, Hudson, NY) entre 6-8 semanas de idade, foram implantados por via subcutânea com 1,7 mg de grânulos de estrogénio de libertação em 90 dias, 3,0 mm de tamanho (Innovative Research of America, Sarasota, FL) na região do pescoço um dia antes de serem implantados por via subcutânea no flanco direito com ΙΟχΙΟ6 células MCF7-Adr em 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por ratinho. Os ratinhos foram pesados e medidos guanto à tridimensionalidade dos tumores utilizando um paquímetro electrónico duas vezes por semana após a implantação. O volume dos tumores foi calculado como altura χ largura χ comprimento/2. Os ratinhos com tumores MCF7-adr tendo 160 mm3 em média, foram distribuídos aleatoriamente por grupos de tratamento. Aos ratinhos foi administrada uma única dose intravenosa a 0,1 pmol/kg com veículo de PBS, anticorpo anti-PTK7 nu ou HuMAb anti-PTK7 conjugado com toxina no Dia 0. Exemplos de compostos toxinas que podem ser conjugados com os anticorpos do presente invento foram descritos no Pedido de Patente U.S. número 2006/0024317 AI pendente. Os ratinhos foram monitorizados quanto ao crescimento tumoral durante 63 79 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ dias após a dosagem. Os ratinhos foram sujeitos a eutanásia quando os tumores estavam ulcerados. Os resultados são mostrados na Figura 25. 0 anticorpo anti-PTK7 conjugado com toxina atrasou a progressão do crescimento do tumor. Assim, o tratamento com um conjugado anticorpo anti-PTK7-toxina tem um efeito inibidor in vivo directo no crescimento tumoral do cancro da mama. SEQ ID NO: SEQUÊNCIA SEQ ID NO: SEQUÊNCIA 1 a. a. 3G8a de VH de 3G8, 23 a. a. de CDR1 de VK de 3G8 2 a. a. de VH de 4D5 24 a. a. de CDR1 de VK de 3G8a 3 a. a. de VH de 12C6, 25 a. a. de CDR1 de VK de 4D5 12C6a 4 a. a. de VH de 7C8 26 a. a. de CDR1 de VK de 12C6 27 a. a. de CDR1 de VK de 12C6a 5 a. a. de VK de 3G8 28 a. a. de CDR1 de VK de 7C8 6 a. a. de VK de 3G8a 7 a. a. de VK de 4D5 29 3..3.. de CDR2 de VK de 3G8 8 a. a. de VK de 12C6 30 a. a. de CDR2 de VK de 3G8a 9 a. a. de VK de 12C6a 31 a. a. de CDR2 de VK de 4D5 10 a. a. de VK de 7C8 32 a. a. de CDR2 de VK de 12C6 33 a. a. de CDR2 de VK de 12C6a 11 a. a. de CDR1 de VH 34 a. a. de CDR2 de VK de 7C8 de 3G8 12 a. a. de CDR1 de VH de 4D5 13 a. a. de CDR1 de VH 35 a. a. de CDR3 de VK de 3G8 de 12C6 14 a. a. de CDR1 de VH 36 a. a. de CDR3 de VK de 3G8a de 7C8 37 a. a. de CDR3 de VK de 4D5 15 a. a. de CDR2 de VH 38 a. a. de CDR3 de VK de 12C6 de 3G8 16 a. a. de CDR2 de VH 39 a. a. de CDR3 de VK de 12C6a de 4D5 17 a. a. de CDR2 de VH 40 a. a. de CDR3 de VK de 7C8 de 12C6 80 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ 18 a. a. de CDR2 de VH de 7C8 41 n.t. de VH de 3G8, 3G8a 19 a. a. de CDR3 de VH de 3G8 42 n.t. de VH de 4D5 20 a. a. de CDR3 de VH de 4D5 43 n.t. de VH de 12C6, 12C6a 21 a. a. de CDR3 de VH de 12C6 44 n.t. de VH de 7C8 22 a. a. de CDR3 de VH de 7C8 45 n.t. de VK de 3G8 51 a.a. da linha germinativa VH3-30.3 46 n.t. de VK de 3G8a 52 a.a. da linha germinativa VHDP44 47 n.t. de VK de 4D5 53 a.a. da linha germinativa VH3-33 48 n.t. de VK de 12C6 49 n.t. de VK de 12C6a 54 a.a. da linha germinativa VKL15 50 n.t. de VK de 7C8 55 a.a. da linha germinativa VKA10 56 a.a. da linha germinativa VKA27 57 a.a. da linha germinativa VKL6 58 a.a. da PTK7 59 a.a. da linha germinativa JH4b 60 a.a. da linha germinativa JH4b 61 a.a. da linha germinativa 3-7 62 a.a. da linha germinativa 3-23 63 a.a. da linha germinativa JH4b 64 a.a. da linha germinativa JH6b 65 a.a. da linha germinativa JK1 66 a.a. da linha germinativa JK5 67 a.a. da linha germinativa JK2 68 a.a. da linha germinativa JK2 69 a.a. da linha germinativa JK3 81

ΕΡ 1 957 539/PT

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> MEDAREX, INC.

<120> ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS PARA A PROTEÍNA TIROSINA-CINASE 7 (PTK7) E MÉTODOS PARA UTILIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-PTK7

<130> MXI-345PC <140> <141> <150> 60/748,373 <151> 2005-12-08 <16 0 > 6 9 <170> Patentln Ver. 3.3

<210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Gin 1 Vai Gin Leu vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Vai Vai Gin Pro Gly 15 Arg Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Ile Phe Ser 30 Asn Tyr Ala Met His 35 Trp vai Arg Gin Ala 40 Pro Gly LyS Gly Leu 45 Glu Trp Vai Ala Vai 50 Ile Ser Tyr Asp Gly 55 Asn Asn Lys Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Vai Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn ser 65 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Glu Vai 100 Trp Ser Ile Asp Asn 105 Trp Gly Gin Gly Thr 110 Leu Val Thr Vai Ser 115 Ser <210> 2 <211> 115 82 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gin Vai 1 Gin Leu Vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Val . Val Gin i Pro Gly Arg 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys 'Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Ala Phe His 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 4S Glu Trp Val Ala Vai 50 Ile Ser Tyr Asp Gly 55 Ser Ile Lys Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 65 Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Thr Tyr 100 Tyr Phe Asp Tyr Trp 105 Gly Gin Gly Thr Leu 110 Val Thr Vai Ser Ser 115 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Vai 1 Gin Leu Val 5 Gin Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val His Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Gly Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Thr Tyr Leu Met Tyr 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Thr Leu 45 Glu Trp Val Ser Ala 50 Xle Gly Ser Gly Gly 55 Asp Thr Tyr Tyr Ala 60 Asp Ser Val Lys Gly Arg 65 Phe Thr Ile Ser 70 Arg Asp Asn Ala Lys 75 Asn Ser Leu Tyr Leu 80 Gin Met Asn Ser Leu 85 Arg Ala Glu Asp Met 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Ala Arg Gly Leu Gly 100 Tyr Trp Gly Gin Gly 105 Thr Leu Val Thr Val 110 Ser Ser <210> 4 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens 83 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <400> 4

Gin 1 Vai Gin Leu Vai S Glu Ser Gly Gly Gly 10 Vai Vai Gin Pro Gly 15 Arg Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Gly Met His 35 Trp Vai Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Vai Ala Vai 50 Ile Trp Asp Asp Gly 55 Ser Asn Lys Tyr Tyr 60 Vai Asp Ser Vai Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Asp Asp 100 Tyr Tyr Gly Ser Gly 105 Ser Phe Asn Ser Tyr 110 Tyr Gly Thr Asp Vai 115 Trp Gly Gin Gly Thr 120 Thr Vai Thr Vai Ser 125 Ser <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Homo , sapiens <400> 5 Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Vai 15 Gly Asp Arg Vai Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Gly Ile Ser 30 Ser Trp Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Glu Lys Ala Pro Lys 45 Ser LeU Ile Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu Gin 55 Ser Gly Vai Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Ser 65 Gly Se r Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 Tyr Asn Ser Tyr Pro 95 Arg Thr Phe Gly Gin 100 Gly Thr Lys Vai Glu 105 Ile Lys

<210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens 84 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <40 0> 6

Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Vai 15 Gly Asp Arg Vai Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Gly Ile Ser 30 Ser Trp Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Glu Lys Ala Pro Lys 45 Ser Leu Ile Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu Gin 55 Ser Gly Vai Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 Tyr Asn Ser Tyr Pro 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp ile Lys 100 105

<210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Glu 1 Ile Vai Leu Thr 5 Gin Ser Pro Asp Phe 10 Gin Ser Val Thr Pro 15 Lys Glu Lys Vai Thr 20 ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser Ile Gly 30 Ser Ser Leu His Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Asp Gin Ser Prp Lys 45 Leu Leu Ile Lys Tyr 50 Ala Ser Gin Ser Phe 55 Ser Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Asn Ser Leu Glu Ala 80 Glu Asp Ala Ala Ala 85 Tyr Tyr Cys His Gin 90 Ser Ser Ser Leu Pro 95 Ile Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105

<210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens 85 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <400> 8

Glu 1 Ile Vai Leu Thr 5 Gin Ser Pro Gly Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser Vai Ser 30 Ser Ser Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin Lys 40 Pro Gly Gin Ala Pro 45 Arg Leu Leu rie Tyr 50 Gly Ala Ser Ser Arg 55 Ala Thr Gly Ile Pro 60 Asp Arg Phe Ser Gly 65 Ser Gly Ser Gly Thr 70 Asp Phe Thr Leu Thr 75 Ile Ser Arg Leu Glu 80 Pro Glu ASp Phe Ala 85 Vai Tyr Tyr . Cys Gin 90 Gin Tyr Gly Ser Ser 95 Pro Met Tyr Thr Phe 100 Gly Gin Gly Thr Lys 105 Leu Glu Ile Lys

<210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Vai 15 Gly Asp Arg Vai Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Gly Ile Ser 30 Ser Trp Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Glu Lys Ala Pro Lys 45 Ser Leu Ile Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu Gin 55 Ser Gly vai Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 Tyr Asn Ser Tyr Pro 95 Tyr Thr Phe Gly Gin 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 Ile Lys

<210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens 86 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <40 0> 10 Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 Arg Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 50 SS Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr 85 Cys Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr 100 Lys <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asn Tyr Ala Met His 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Tyr Ala Phe His 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Thr Tyr leu Met Tyr 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens

Ala Thr ' 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly Ala 25 Ser Gin Ser Val Ser 30 Ile Tyr Gly Gin Ala Pro Arg 45 Leu Leu ile Gly Ile Pro Ala 60 Arg Phe Ser Gly Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Glu Pro 80 Gin Gin 90 Arg Ser Asn Trp Pro' 95 Pro Val 105 Asp Ile Lys 87 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <400> 14

Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 15 <2ll> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15

Vai He Ser Tyr Asp Gly Asn' Asn Lys Tyr Tyr Ale Asp Ser Vai Lys 1 Gly in H O <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Vai Ile Ser Tyr.Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 Gly 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Ala Ile Gly Ser Gly Gly Aep Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys Gly 1 5 10 15 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18

Vai Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Vai Asp Ser Vai Lys 15 10 15

Gly <210> 19 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ 88

<211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19

Glu Vai Trp Set ILe Asp Asn 1 5

<210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20

Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5

<210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21

Gly Leu Gly Tyr 1

<210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

Asp Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Asn Ser Tyr Tyr Gly Thr Asp 1 5 10 '15

Vai

<210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 15 10 <210> 24 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ 89 <211> 11

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Arg Ala ser Gin Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Arg Ala Ser Gin Ser Ile Gly Ser Ser Leu His 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26

Arg Ala Ser Gin Ser vai Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 S 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21

Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28

Arg Ala Ser Gin Ser vai Ser Ile Tyr Leu Ala 15 10 <210> 29 <211> 7 90 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Tyr Ala Ser Gin Ser Phe Ser 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 32 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT 91 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <213> Homo sapiens <400> 34 Αερ Ala Sex Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 35 Gin Gin Tyx Asn Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Gin Gin Tyr Asn . Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 His Gin Ser Ser Ser Leu Pro Ile Thr 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 38 Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Met Tyr 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 92 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <400> 39

Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5

<210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40

Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro Phe Thr 15 10 <210> 41 <211> 348 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D · · (348) <400> 41 cag gtg cag ctg gtg gag tet 999 gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg Gin 1 val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Val Val Gin Pro Gly 15 Arg tcc ctg cga etc tcc tgt gca gee tet gga ttc ate ttc agt aac tat Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe ile Phe Ser 30 Asn Tyr gct atg cac tgg gtc ege cag gct cca ggc aag ggq ctg gag tgg gtg Ala Met His 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val gca gtt ata tca tat gat gga aac aat aaa tac tac gca gac tcc gtg Ala Val 50 Ile Ser Tyr Asp Gly 55 Asn Asn Lys Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat Lys 65 Gly Arg Phe Thr ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 ctg caa atg aac age ctg aga gct gag gac acg gct gtg tat tac tgt Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala val Tyr Tyr 95 Cys gcg aga gag gtc tgg agt att gac aac tgg ggc cag gga acc ctg gtc Ala Arg Glu Val 100 Trp Ser Ile Asp Asn 105 Trp Gly Gin Gly Thr 110 Leu Val 48 96 144 192 240 288 336 acc gtc tcc tca Thr Val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 345 348 93

ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 42 cag gtg cag ctg gtg gag tet ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 Gin 1 Vai Gin Leu Vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Vai Vai Gin Pro Gly 15 Arg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gee tet gga ttc acc ttc agt age tat 96 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr gct ttc cac tgg gtc cga cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Ala Phe His 35 Trp Vai Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Vai gca gtt ata tca tat gat gga age att aaa tac tac gca gac tcc gtg 192 Ala Vai 50 Ile Ser Tyr Asp Gly 55 Ser Ile Lys Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Vai aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 ctg caa atg aac age ctg aga gct gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr 95 Cys gcg agg acg tac tac ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc 336 Ala Arg Thr Tyr 100 Tyr Phe Asp Tyr Trp 105 Gly Gin Gly Thr Leu 110 Vai Thr gtc tcc tca Vai Ser Ser 115

<210> 43 <211> 336 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1).. (336) 94 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <400> 43 gag gtt cag ctg gtg cag tet ggg gga ggc ttg gta cat cct 999 ggg 48 Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Gin Ser Gly Gly Gly 10 Leu val His Pro Gly 15 Gly tcc ctg aga ctc tcc tgt gea ggc tet gga ttc acc ttc agt acc tat 96 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Gly Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Thr Tyr ctt atg tac tgg gtt ege cag gct cca gga aaa aet ctg gag tgg gtc 144 Leu Met Tyr 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Thr Leu 45 Glu Trp Val tca gct att ggt tet ggt ggt gat aca tac tat gea gac tcc gtg aag 192 Ser Ala 50 Ile Gly Ser Gly Gly 55 Agp Thr Tyr Tyr Ala 60 Asp Ser Val Lys ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aat gee aag aac tcc ttg tat ctt 240 Gly 65 Arg Phe Thr Ile Ser 70 Arg Asp Asn Ala Lys 75 Asn Ser Leu Tyr Leu 80 caa atg aac age ctg aga gee gag gac atg gct gtg tat tac tgt gea 288 Gin Met Asn Ser Leu 85 Arg Ala Glu Asp Met 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Ala aga gga ctg ggc tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 336 Arg Gly Leu Gly 100 Tyr Trp Gly Gin Gly 105 Thr Leu Val Thr Val 110 Ser Ser

<210> 44 <211> 378 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(378) <400> 44 cag gtg caa ctg gtg gag tet ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48 Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gea gcg tet gga ttc acc ttc agt age tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc ege cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 gea gtt ata tgg gat gat gga agt aat aaa tac tat gta gac tcc gtg 192 Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac age ctg aga gee gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala VBl Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga gat gat taC tat ggt teg ggg agt ttt aac tcc tac tac ggt 336 Ala Arg Asp Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Asn Ser Tyr Tyr Gly 100 105 110 a cg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 378 Thr Asp val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 95 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <210> 45 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D · · (321) <4 0 0> 45 gac abc cag atg acc cag tct cca tcc tea ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgt cgg gcg age cag ggt act age age tgg 96 Asp Arg Vai The Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc ate age age ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe' Thr Leu Thr Ile Ser Ssr Leu Gin Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag tat aat agt tac cct cgg 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 35 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa 321 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys 100 105

<210> 46 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (321) <400> 46 gac ate cag atg acc cag tct cca tcc tea ctg tct gca. tct gta gga Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Vai 15 Gly gac aga gtc acc ate act tgt cgg gcg agt cag ggt att age age tgg Asp Arg Vai Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Gly Ile Ser 30 Ser Trp tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg ate Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Glu Lys Ala Pro Lys 45 Ser Leu Ile* 48 96 144 96 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ tat Tyr gct Ala 50 gca Ala tcc Ser agt Ser ttg Leu caa Gin 55 agt Ser ggg Gly gtc Vai cca Pro tea Ser 60 agg Arg ttc Phe age Ser ggc Gly 192 agt Ser 65 gga Gly tct Ser ggg Gly aca Thr gat Asp 70 ttc Phe act Thr ctc Leu acc Thr ate Ile 75 age Ser age Ser ctg Leu cag Gin cct Pro 80 240 gaa Glu gat Asp ttt Phe gca Ala act Thr 85 tat Tyr tac Tyr tgc Cys caa Gin cag Gin 90 tat Tyr aat Asn agt Ser tac Tyç· cca Pro 95 ttc Phe 288 act Thr, ttc Phe ggc Gly cct Pro 100 ggg Gly acc Thr aaa Lys gtg Vai gat Asp 105 ate Ile aaa Lys 321 <210> 47 <211> 321 <212> ADN <213> Homo . sapiens <220> <221> CDS <222> (D (321) <400> 47 gaa Glu 1 att Ile gtg Vai ctg Leu act Thr 5 cag Gin tct Ser cca Pro gac Asp ttt Phe 10 cag Gin tct Ser gtg Vai act Thr cca Pro 15 aag Lys 48 Glu aaa Lys gtc Vai acc Thr 20 ate Ile acc Thr tgc Cys cgg Arg gee Ala 25 agt Ser cag Gin age Ser att Ile ggt Gly 30 agt Ser age Ser 96 tta Leu cac His tgg Trp 35 tac Tyr cag Gin cag Gin aaa Lys cca Pro 40 gat Asp cag Gin tct Ser cca Pro aag Lys 45 ctc Leu ctc Leu ate Ile 144 aag Lys tat Tyr 50 gct Ala tcc Ser cag Gin tcc Ser ttc Phe 55 tea Ser ggg Gly gtc vai ccc Pro teg Ser 60 agg Arg ttc Phe agt Ser ggc Gly 192 agt Ser 65 gga Gly tct Ser ggg Gly aca Thr gat Asp 70 ttc Phe acc Thr ctc Leu acc Thr ate Ile 75 aat Asn age Ser ctg Leu gaa Glu gct Ala 80 240 gaa Glu gat Asp gct Ala gca Ala gcg Ala S5 tat Tyr tac Tyr tgt Cys cat His cag Gin 90 agt Ser agt Ser agt Ser tta Leu ccç Pro 95 ate Ile 288 acc Thr ttc Phe ggc Gly caa Gin ggg Gly aca Thr cga Arg ctg Leu gag Glu att Ile aaa Lys 321 100 105

<210> 48 <211> 327 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS 97 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <222> (1)..(327) <400> 48 gaa Glu 1 att Ile gtg Vai ttg Leu acg Thr 5 cag Gin tet Ser cca Pro ggc Gly acc Thr 10 ctg Leu tet Ser ttg Leu tet Ser cca Pro 15 ggg Gly 48 gaa Glu aga Arg gee Ala acc Thr 20 etc Leu tcc Ser tgc Cys agg Arg gee Ala 25 agt Ser cag Gin agt Ser gtt Vai age Ser 30 age Ser age Ser 96 tac Tyr cta Leu gee Ala . 35 tgg Trp tac Tyr cag Gin cag Gin - aaa Lys 40 cct Pro ggc Gly cag Gin gct Ala ccc Pro' 45 agg •Arg etc Leu etc Leu 144 ate Ile tat Tyr 50 ggt Gly gea Ala tcc Ser age Ser agg Arg 55 gee Ala act Thr ggc Gly ate Ile cca Pro 60 gac Asp agg Arg ttc Phe agt Ser 192 ggc Gly 65 agt Ser ggg Gly tet Ser ggg Gly aca Thr 70 gac Asp ttc Phe act The etc Leu acc Thr 75 ate Ile age Ser aga Atg ctg Leu gag Glu 80 240 cct Pro gaa Glu gat Asp ttt Phe gea Ala 85 gtg Vai tat Tyr tac Tyr tgt Cys cag Gin 90 cag Gin tat Tyr ggt Gly age Ser tea Ser 95 ccc Pro 2B8 atg Met tac Tyr act Thr ttt Phe ggc Gly cag Gin ggg Gly acc Thr aag Lys ctg Leu gag Glu ate Ile aaa lys 327 100 105

<210> 49 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (321) . <400> 49 gac Asp 1 ate ile cag Gin atg Met acc Thr 5 cag Gin tet Ser cca Pro tcc Ser tea Ser 10 ctg Leu tet Ser gea Ala tet Ser gta Val 15 gga Gly 4B gac Asp aga Arg gtc Vai acc Thr 20 ate Ile set Thr tgt Cys cgg Arg gcg Ala 25 agt Ser cag Gin ggt Gly att Ile age Ser 30 age Ser tgg Trp 96 tta Leu gee Ala tgg Trp 35 tat Tyr cag Gin cag Gin aaa Lys cca Pro 40 gag Glu aaa Lys gee Ala cct Pro aag Lys 45 Ccc Ser ctg Leu ate Ile 144 tat Tyr gct Ala 50 gea Ala tcc Ser agt Ser ttg Leu caa Gin 55 agt Ser ggg Gly gtc Vai cca Pro tea Ser 60 agg Arg ttc Phe age Ser ggc Gly 192 agt Ser 65 gga Gly tet Ser ggg Gly aca Thr gat Asp 70 ttc Phe act Thr etc Leu acc Thr ate Ile 75 age Ser age Ser ctg Leu cag Gin cct Pro 80 240 gaa Glu gat Asp ttt Phe gea Ala act Thr 85 tat Tyr tac Tyr tgc Cys caa Gin cag Gin 90 tat Tyr aat Asn agt Ser tac Tyr ccg Pro 95 tac Tyr 28B act Thr ttt Phe ggc Gly cag Gin 100 ggg Gly acc Thr aag Lys ctg Leu gag Glu 105 ate Ile aaa Lys 321 98 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

<210> 50 <211> 324 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 50 gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct; ttg tct cca ggg 48 Glu Ile val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age ate tac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ile Tyr 20 25 30 tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct cec agg ctc ctc ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc ate cca gcc agg ttc agt ggc 192 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 €0 agt ggg tct <399 aca gac ttc act ctc acc ate age age Cta gag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 55 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tàt tac tgt cag cag cgt age aac tgg cct cca 288 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 ttc act ttc ggc cct 999 acc aaa gtg gat ate aaa 32 4 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <21 0> 51 <211> 98 <212> PRT <213> Homo , sapiens <400> 51 Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Mat His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 Ala val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 6S 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg 99 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

<210> 52 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52

Glu 1 Vai Gin Leu Vai 5 Gin Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val His Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Gly Ser Gly 25 Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Ala Met His 35 Trp Vai Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ser Ala 50 Ile Gly Thr Gly Gly Gly 55 Thr Tyr Tyr Ala 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg 65 Phe Thr Ile Ser 70 Arg Asp Asn Ala Lys 75 Asn Ser Leu Tyr Leu 80 Gin Met Asn Ser Leu 85 Arg Ala Glu Asp Met 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Ala <210> 53 <211> 98

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53

Gin. 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Val Val Gin Pro Gly 15 Arg Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Alâ Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Gly Met His 3b Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ala Val 50 Ile Trp Tyr Asp Gly 55 Ser Asn Lys Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys

<210> 54 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens 100 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <400> 54 Asp Ile 1 Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Asp Arg Vai Thr 20 Ile Thr Cys Arg Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu Gin 55 Ser Ser Gly 65 Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Glu ASP Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys <210> 55 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Glu Ile 1 Val Leu Thr 5 Gin Ser Pro Glu Lys Vai Thr 20 Ile Thr Cys Arg Leu His Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Lys Tyr 50 Ala Ser Gin Ser Phe 55 Ser Ser Gly 65 Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Glu Asp Ala Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys <210> 56 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Glu Ile 1 Val Leu Thr 5 Gin Ser Pro Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Arg Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin Lys 40 Ile Tyr 50 Gly Ala Ser Ser Arg 55 Ala Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr 70 Asp Phe Pro Glu Asp Phe Ala 85 Val Tyr Tyr

Ser Ser leu Ser Ala Ser Vai Gly 10 15

Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Trp 25 30

Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 45

Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 75 80

Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro 90 95

Asp Phe Gin Ser Vai Thr Pro Lys 10 15

Ala Ser Gin Ser Ile Gly Ser Ser 25 30

Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 45

Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 75 80

His Gin Ser Ser Ser Leu Pro 90 95

Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 10 15

Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser 25 30

Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 45

Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 60

Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 75 80

Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 90 95 101 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

<210> 57 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57

Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly Asp Arg Vai Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Gly Ile Ser 30 Ser Trp Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Glu Lys Ala Pro Lys 45 Ser Leu Ile Tyr Ala 50 Ala Ser Ser Leu Gin 55 Ser Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gin Pro 80 Glu Asp Phe Ala Thr 05 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 Tyr Asn Ser Tyr Pro 95 <210> 58 <211> 1070 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Met 1 Gly Ala Ala Arg 5 Gly Ser Pro Ala Arg 10 Pro Arg Arg Leu Pro 15 Leu Leu Ser Vai Leu 20 Leu Leu Pro Leu Leu 25 Gly Gly Thr Gin Thr 30 Ala Ile Vai Phe Ile 35 Lys Gin Pro Ser Ser 40 Gin Asp Ala Leu Gin 45 Gly Arg Arg Ala Leu 50 Leu Arg Cys Glu Val 55 Glu Ala Pro Gly Pro 60 Val His Val Tyr Trp 65 Leu Leu Asp Gly Ala 70 Pro Val Gin Asp Thr 75 Glu Arg Arg Phe Ala ao Gin Gly Ser Ser Leu 85 Ser Phe Ala Ala Val 90 Asp Arg Leu Gin Asp 95 Ser Gly Thr Phe Gin 100 Cys Vai Ala Arg Asp 105 Asp Val Thr Gly Glu no Glu Ala Arg Ser Ala 115 Asn Ala Ser Phe Asn 120 Ile Lys Trp lie Glu 125 Ala Gly Pro Vai Vai Leu Lys Hls Pro Ala Ser Glu Ala Glu Ile Gin Pro Gin Thr 130 135 140 102 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Gin 145 Vai Thr Leu Arg Cys 150 HiS Ile Asp Gly His 155 Pro Arg Pro Thr Tyr 160 Gin Trp Phe Arg Asp 165 Gly Thr Pro Leu Ser 170 Asp Gly Gin Ser Asn 175 His Thr Val Ser Ser 180 Lys Glu Arg Asn Leu 185 Thr Leu Arg Pro Ala 190 Gly Pro Glu His Ser 195 Gly Leu Tyr Ser Cys 200 Cys Ala His Ser Ala 205 Phe Gly Gin Ala Cys 210 Ser Ser Gin Asn Phe 215 Thr Leu Ser Ile Ala 220 Asp Glu Ser Phe Ala 225 Arg Val Val Leu Ala 230 Pro Gin Asp val Val 235 Val Ala Arg Tyr Glu 240 Glu Ala Met Phe His 245 Cys Gin Phe Ser Ala 250 Gin Pro Pro Pro Ser 255 Leu Gin Trp Leu Phe 260 Glu Asp Glu Thr Pro 265 Ile Thr Asn Arg Ser 270 Arg Pro Pro His Leu 275 Arg Arg Ala Thr Val 280 Phe Ala Asn Gly Ser 285 Leu Leu Leu Thr Gin 290 val Arg Pro Arg Asn 295 Ala Gly Ile Tyr Arg 300 Cys Ile Gly Gin Gly 305 Gin Arg Gly Pro Pro 310 Ile Ile Leu Glu Ala 315 Thr Leu His Leu Ala 320 Glu Ile Glu Asp Met 325 Pro Leu Phe Glu Pro 330 Arg Val Phe Thr Ala 335 Gly Ser Glu Glu Arg 340 Val Thr Cys Leu Pro 345 Pro Lys Gly Leu Pro 350 Glu Pro Ser Val Trp 355 Trp Glu His Ala Gly 360 Val Arg Leu Pro Thr 365 His Gly Arg Vai Tyr 370 Gin Lys Gly His Glu 375 Leu Val Leu Ala Asn 380 Ile Ala Glu Ser Asp 3B5 Ala Gly Val Tyr Thr 390 Cys His Ala Ala Asn 395 Leu Ala Gly Gin Arg 400 Arg Gin Asp Val Asn 405 Ile Thr Val Ala Thr 410 val Pro Ser Trp Leu 415 Lys Lys Pro Gin Asp 420 Ser Gin Leu Glu Glu 425 Gly Lys Pro Gly Tyr 430 Leu Asp Cys Leu Thr 435 Gin Ala. . Thr Pro Lys 440 Pro Thr val Val Trp 445 Tyr Arg Asn 103 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Gin Met 450 Leu Ile Ser Glu Asp 455 Ser Arg Phe GlU Vai 460 Phe Lys Asn Gly Thr 4 65 Leu Arg Ile Asn Ser 470 Vai Glu Vai Tyr Asp 475 Gly Thr Trp Tyr Arg 480 Cys Met Ser Ser Thr 485 Pro Ala Gly Ser Ile 490 Glu Ala Gin Ala Arg 4 95 Val Gin Vai Leu Glu 500 Lys Leu Lys Phe Thr 505 Pro Pro Pro Gin Pro 510 Gin Gin Cys Met Glu 515 Phe Asp Lys Glu Ala 520 Thr Vai Pro Cys Ser 525 Ala Thr Gly Arg Glu 530 Lys Pro Thr Ile Lys 535 Trp Glu Arg Ala Asp 540 Gly Ser Ser Leu Pro S45 Glu Trp Vai Thr Asp 550 Asn Ala Gly Thr Leu 555 His Phe Ala Arg Val 560 Thr Arg Asp Asp Ala 565 Gly Asn Tyr Thr Cys 570 Ile Ala Ser Asn Gly 575 Pro Gin Gly Gin lie 580 Arg Ala His Vai Gin 585 Leu Thr Vai Ala Vai 590 Phe Ile Thr Phe Lys 595 Vai Glu Pro Glu Arg 600 Thr Thr Vai Tyr Gin 605 Gly His Thr Ala Leu 610 Leu Gin Cys Glu Ala 615 Gin Gly Asp Pro Lys 620 Pro Leu Ile Gin Trp 625 Lys Gly Lys Asp Arg 630 Ile Leu Asp Pro Thr 635 Lys Leu Gly Pro Arg 640 Met His Ile Phe Gin 64 5 Asn Gly Ser Leu Vai 650 Ile His Asp Vai Ala 655 Pro Glu Asp Ser Gly 660 Arg Tyr Thr Cys ile 665 Ala Gly Asn Ser Cys 670 Asn Ile Lys His Thr 675 Glu Ala Pro Leu Tyr 680 Vai Vai Asp Lys Pro 685 Vai Pro Glu Glu Ser 690 Glu Gly Pro Gly Ser 695 Pro Pro Pro Tyr Lys 700 Met Ile Gin Thr Ile 705 Gly Leu Ser Vai Gly 710 Ala Ala Vai Ala Tyr 715 Ile Ile Ala Vai Leu 720 Gly Leu Met Phe Tyr 725 Cys Lys Lys Arg Cys 730 Lys Ala Lys Arg Leu 735 Gin Lys Gin Pro Glu 740 Gly Glu Glu Pro Glu 745 Met Glu Cys Leu Asn 750 Gly Gly 104 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

Pro Leu Gin 755 Asn Gly Gin Pro Ser 760 Ala Glu Ile Gin Glu 7 65 Glu Val Ala Leu Thr 770 Ser Leu Gly Ser Gly 775 Pro Ala Ala Thr Asn 780 Lys Arg His ser Thr 785 Ser Asp Lys Met His 7 90 Phe Pro Arg Ser Ser 795 Leu Gin Pro Ile Thr 800 Thr Leu Gly Lys Ser 805 Glu Phe Gly Glu Val 810 Phe Leu Ala Lys Ala 815 Gin Gly Leu Glu Glu 820 Gly Vai Ala Glu Thr 825 Leu Val Leu Val Lys 830 Ser Leu Gin Ser Lys 835 Asp Glu Gin Gin Gin 840 Leu Asp Phe Arg Arg 845 Glu Leu Glu Met Phe 850 Gly Lys Leu Asn His 855 Ala Asn val Val Arg 860 Leu Leu Gly Leu Cys 865 Arg Glu Ala Glu Pro 870 His Tyr Met Val Leu 875 Glu Tyr Val Asp Leu 880 Gly Asp Leu Lys Gin 885 Phe Leu Arg Ile Ser 890 Lys Ser Lys Asp Glu 895 Lys Leu Lys Ser Gin 900 Pro Leu Ser Thr Lys 905 Gin Lys Val Ala Leu 910 Cys Thr Gin Vai Ala 915 Leu Gly Met Glu His 920 Leu Ser Asn Asn Arg 925 phe Val His Lys Asp 930 Leu Ala Ala Arg Asn 935 Cys Leu Val Ser Ala 940 Gin Arg Gin Val Lys 945 Vai Ser Ala Leu Gly Leu 950 Ser Lys Asp Val 955 Tyr Asn Ser Glu Tyr 960 Tyr Hls Phe Arg Gin 965 Ala Trp Val Pro Leu 970 Arg Trp Met Sex Pro 975 Glu Ala Ile Leu Glu 980 Gly Asp Phe Ser Thr 98S Lys Ser Asp Val Trp 990 Ala Phe Gly Vai Leu 995 Met Trp Glu Vai Phe L000 Thr His Gly Glu Met 1005 Pro His Gly Gly Gin. 1010 Ala Asp Asp Glu Vai 1015 Leu Ala Asp Leu Gin 1020 Ala Gly Lys Ala Arg Leu 1025 Pro Gin Pro Glu 1030 Gly Cys Pro Ser Lys 1035 Leu Tyr Arg Leu Met L040 Gin Arg Cys Trp Ala 1045 Leu Ser Pro Lys Asp 1050 Arg Pro Ser Phe Ser 1055 Glu Ile Ala Ser Ala Leu Gly Asp Ser Thr Val Asp Ser Lys Pro 1060 1065 1070

<210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59

Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 1 5 . 10 <210> 60 EP 1 957 539/PT 105 <2 11> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Tyr Phe 1 Asp Tyr Trp Gly Gin 5 Gly Thr Leu 10 Vai Thr Val Ser Ser 15 <210> 61 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Glu Vai 1 Gin Leu Vai Glu Ser 5 Gly Gly Gly 10 leu Val Gin Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 20 Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Trp Met Ser Trp Vai Arg Gin 35 Ala 40 Pro Gly lys Gly Leu 45 Glu Trp Ala Asn Ala 50 Lys Gin Asp Gly Ser 55 Glu Lys Tyr Tyr Val 60 Asp Ser Val Lys Gly Arg 65 Phe Thr Ile Ser Arg 70 Asp Asn Ala lys 75 Asn Ser Leu Tyr Leu 80 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85 Glu Asp Thr 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Ala Arg <210> 62 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Glu Vai 1 Gin Leu Leu Glu Ser 5 Gly Gly Gly Leu 10 Val Gin Pro Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 20 Ala ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Ala Met Ser Trp Vai Arg Gin 35 Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ser Ala 50 Ser Gly SBr Gly Gly 55 Ser Thr Tyr Tyr Ala 60 Asp Ser Val Lys Gly Arg 65 Phe Thr Ile Ser Arg 70 Asp Asn Ser Lys 75 Asn Thr Leu Tyr Leu 80 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85 Glu Asp Thr 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Ala

Lys 106 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 63 Tyr Trp 1 Gly Gin Gly Thr Leu 5 Vai Thr Val 10 Ser Ser <210> 64 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Tyr Tyr 1 Tyr Gly Met Asp Vai 5 Trp Gly Gin 10 Gly Thr Thr Val Thr Val 15 Ser Ser <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Thr Phe 1 Gly Gin Gly Thr Lys S Val Glu Ile 10 Lys <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Ile Thr 1 Phe Gly Gin Gly Thr 5 Arg Leu Glu 10 Ile Lys <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Tyr Thr 1 Phe Gly Gin Gly Thr 5 Lys Leu Glu 10 Ile Lys 107 ΕΡ 1 957 539/ΡΤ

<210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68

Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 15 10

<210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 6 9

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp Ile Lys 15 10

Lisboa, 2013-06-17

Claims

ΕΡ 1 957 539/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal humano isolado, ou uma porção de ligação ao antigénio deste, em que o anticorpo: (a) se liga especificamente a PTK7 humana; e (b) se liga a uma linha celular de tumor de Wilms possuindo o No. de Ac. ATCC CRL-1441 com uma CE50 de 4,0 nM ou menos, num ensaio que compreende a incubação de lxlO1 2 células com o anticorpo a uma concentração inicial de 30 pg/ml e diluição em série do anticorpo a uma diluição de 1:10; e (c) se liga ao mesmo epitopo na PTK7 humana que um anticorpo de referência compreendendo: (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; ou (iii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
2. Anticorpo da reivindicação 1 que é: (a) um anticorpo inteiro de um isotipo IgGl ou IgG4; ou (b) um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia simples.
3. Anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, da reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo se liga a células de tumor de Wilms com uma CE50 de 3,5 nM ou menos. 1 Anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que compreende: 2 (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 12, uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 16, uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 20, uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 25, uma ΕΡ 1 957 539/ΡΤ 2/3 região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 31 e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 37; ou (b) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 14, uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 18, uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 22, uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 28, uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 34 e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 40; ou (c) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 13, uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 17, uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 21, uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 26, uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 32 e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 38.
5. Anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; ou (b) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; ou (c) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
6. Imunoconjugado compreendendo o anticorpo, ou a porção de ligação ao antigénio deste, de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ligado a um agente terapêutico, tal como uma citotoxina ou um isótopo radioactivo.
7. Composição compreendendo o anticorpo ou a porção de ligação ao antigénio deste, de qualquer uma das ΕΡ 1 957 539/PT 3/3 reivindicações 1 a 5 ou o imunoconjugado da reivindicação 6 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
8. Molécula de ácido nucleico isolada codificando o anticorpo ou a porção de ligação ao antigénio deste, de qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
9. Vector de expressão compreendendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 8.
10. Célula hospedeira compreendendo o vector de expressão da reivindicação 9.
11. Método in vitro para preparação de um anticorpo anti-PTK7 que compreende a expressão do anticorpo na célula hospedeira da reivindicação 10 e isolamento do anticorpo a partir da célula hospedeira.
12. Anticorpo ou porção de ligação ao antigénio deste, de qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para utilização num método de tratamento ou prevenção de cancro caracterizado pelo crescimento de células tumorais expressando PTK7.
13. Anticorpo, ou porção de ligação ao antigénio deste, da reivindicação 12, em que o cancro é seleccionado a partir de cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro do pâncreas, melanoma, leucemia mielóide aguda, cancro do rim, cancro da bexiga, cancro do ovário e cancro da próstata. Lisboa, 2013-06-17