PT1784426E - Antagonistas humanizados anti-beta7 e suas utilizações - Google Patents

Antagonistas humanizados anti-beta7 e suas utilizações Download PDF

Info

Publication number
PT1784426E
PT1784426E PT05810856T PT05810856T PT1784426E PT 1784426 E PT1784426 E PT 1784426E PT 05810856 T PT05810856 T PT 05810856T PT 05810856 T PT05810856 T PT 05810856T PT 1784426 E PT1784426 E PT 1784426E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
seq
hvr
antibody
beta7
quot
Prior art date
Application number
PT05810856T
Other languages
English (en)
Inventor
Mark S Dennis
Sherman Fong
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of PT1784426E publication Critical patent/PT1784426E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Description

ΕΡ 1 784 426 PT
DESCRIÇÃO "Antagonistas humanizados anti-beta7 e suas utilizações"
CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se genericamente aos campos da biologia molecular e da regulação de factores de crescimento. Mais especificamente, a invenção refere-se a moduladores da actividade biológica das integrinas contendo a subunidade beta7 e a utilizações dos referidos moduladores.
ANTERIORIDADE
As integrinas são receptores da superfície celular heterodiméricos α/β envolvidos em numerosos processos celulares desde a adesão celular à regulação de genes (Hynes, R. O., Cell, 1992, 69:11-25; e Hemler, M.E., Annu. Rev. Immunol., 1990, 8:365-368). Várias integrinas foram implicadas em processos de doença e geraram um interesse generalizado como potenciais alvos para a descoberta de fármacos (Sharar, S. R. et al. , Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16:359-378). No sistema imunitário, as integrinas estão envolvidas no tráfico, adesão e infiltração de leucócitos durante processos inflamatórios (Nakajima, H. et al., J. Exp. Med. , 1994, 179:1145-1154). A expressão diferencial de integrinas regula as propriedades adesivas das células e integrinas diferentes estão envolvidas em respostas inflamatórias diferentes. Butcher, E.C. et al., Science, 1996, 272:60-66. As integrinas beta7 (i.e. alfa4beta7 (α4β7) e alfaEbeta7 (αΕβ7)) são expressas principalmente em monócitos, linfócitos, eosinófilos, basófilos e macrófagos, mas não em neutrófilos. Elices, M.J. et al., Cell, 1990, 60:577-584. Os principais ligandos para a integrina α4β7 são as proteínas da superfície endotelial molécula de adesão a células de adressina mucosa (MAdCAM) e molécula de adesão a células vasculares (VCAM-1) (Makarem, R. et al. , J. Biol. Chem., 1994, 2 69:4 005-4 011) . A ligação da α4β7 a MAdCAM e/ou a VCAM expressam sobre vénulas endoteliais superiores (HEV) em locais de inflamação resulta numa firme adesão do leucócito ao endotélio seguida por extravasão para o tecido inflamado (Chuluyan, H.E. et al., 2
ΕΡ 1 784 426 PT
Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16:391-404). Um ligando principal para a integrina αΕβ7 é a proteína da superfície de linfócitos intra-epiteliais (IEL), a E-caderina, que facilita a aderência da célula portadora de αΕβ7 a linfócitos epiteliais. Foi mostrado que anticorpos monoclonais dirigidos contra α4β7, MAdCAM ou VCAM são moduladores eficazes em modelos animais de doenças inflamatórias crónicas tais como a asma (Laberge, S. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1995, 151:822-829.), artrite reumatóide (AR; Barbadillo, C. et al. , Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16:375-379), colite (Viney et al. , J. Immunol. , 1996, 157: 2488-2497) e doenças inflamatórias intestinais (DII; Podalski, D.K., N. Eng. J. Med., 1991, 325:928-937; Powrie, F. et al. , Ther. Immunol., 1995, 2:115-123). Mostrou-se que anticorpos monoclonais dirigidos contra a subunidade beta7 se ligam à subunidade da integrina (Tidswell, M. et al. (1997) J. Immunol. 159:1497-1505) mas na forma de anticorpos não humanos ou não humanizados não têm utilidade clínica. Anticorpos monoclonais humanizados ou fragmentos de ligação ao antigénio que inibem a adesão de leucócitos que expressam uma integrina contendo a cadeia β7, foram propostos em W096/24673.
Existe uma necessidade de compostos altamente específicos tais como anticorpos humanizados ou seus fragmentos de ligação que inibem a interacção entre a integrina alfa4beta7 e os seus ligandos MAdCAM e/ou VCAM, assim como a interacção entre a integrina alfaEbeta7 e o seu ligando E-caderina. Estes compostos são úteis para o tratamento de doenças inflamatórias crónicas tais como asma, doença de Crohn, colite ulcerativa, diabetes, complicações de transplantação de órgãos e desordens relacionadas com aloenxertos.
DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO A invenção é como definida nas reivindicações e em parte baseia-se na identificação de uma variedade de antagonistas de vias biológicas que envolvem integrinas contendo beta7, que são geralmente processos biológicos/celulares que se apresentam como um importante e vantajoso alvo terapêutico. Estas vias biológicas incluem, sem limitação, a inflamação, particularmente desordens de inflamação crónica tais como asma, alergia, DII, diabetes, desordens de transplantação e de enxerto versus hospedeiro. A invenção proporciona composições 3 ΕΡ 1 784 426 PT e métodos baseados na interferência com a adesão e/ou recrutamento celulares mediados por integrina beta7, incluindo, mas não se lhes limitando, interferência com a ligação de MAdCAM e VCAM-1 à porção extracelular da integrina alfa4beta7 e com a interacção de E-caderina integrina alfaEbeta7. Os antagonistas da invenção, como aqui descrito, proporcionam importantes agentes terapêuticos e de diagnóstico para utilização no direccionamento a condições patológicas associadas com uma sinalização anómala ou indesejada por via de uma integrina beta7. Deste modo, a invenção proporciona métodos e composições relacionados com a modulação de vias mediadas por integrina beta7, incluindo a modulação da ligação MAdCAM-alfa4beta7 e do recrutamento de leucócitos para o epitélio gastrointestinal, ligação e alergia, asma, DII (tal como doença de Crohn e colite ulcerativa), diabetes, inflamação associada com transplantação, desordem de enxerto versus hospedeiro e/ou desordens relacionadas com aloenxertos e outras actividades biológicas/fisiológicas mediadas por integrina beta7.
Num aspecto, a invenção proporciona agentes terapêuticos anti-beta7 adequados para uso terapêutico e capazes de efectuar vários graus de ruptura de uma via mediada por integrina beta7. Por exemplo, numa concretização, a invenção proporciona um anticorpo humanizado anti-beta7 em que o anticorpo, na forma de um fragmento Fab, tem substancialmente a mesma afinidade de ligação a beta7 humana que um fragmento Fab murino compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em, uma sequência de um domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada como representado nas Fig. IA e 1B ou Fig. 9A e 9B. É também aqui descrito, mas não faz parte da invenção reivindicada, um anticorpo humanizado anti-beta7 em que o anticorpo, na forma de um fragmento Fab, tem uma afinidade de ligação a beta7 humana que é inferior, por exemplo pelo menos 3, pelo menos 5, pelo menos 7 ou pelo menos 10 vezes inferior, à de um fragmento Fab murino ou de rato compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em, uma sequência de um domínio variável de cadeia leve e de cadeia pesada como representado nas Fig. IA e 1B ou as sequências de um domínio variável representadas nas Fig. 9A e 9B. Numa concretização da invenção, um anticorpo humanizado anti-beta7 ou seu fragmento de ligação a beta7, da invenção 4
ΕΡ 1 784 426 PT exibe afinidade monovalente para com beta7 humana, afinidade que é substancialmente idêntica ou superior à afinidade monovalente para com beta7 humana de um anticorpo compreendendo sequências variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada como representado na Fig. IA (SEQ ID NO: 10) e/ou na Fig. 1B (SEQ ID NO: 11) ou na Fig. 9A (SEQ ID NO: 12) e/ou na
Fig. 9B (SEQ ID NO: 13) . O anticorpo ou seu fragmento de ligação possuindo grande afinidade para com beta7 humana exibe uma afinidade que é pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 1000 vezes, pelo menos 5000 vezes ou pelo menos 10 000 vezes superior à de um anticorpo compreendendo as sequências de cadeia leve e de cadeia pesada representadas na Fig. IA (SEQ ID NO:10) e/ou na Fig. 1B (SEQ ID NO: 11) ou na Fig. 9A (SEQ ID NO: 12) e/ou na
Fig. 9B (SEQ ID NO:13).
Em outra concretização, a invenção proporciona um anticorpo humanizado anti-beta7 em que o anticorpo, na forma de um fragmento Fab, tem uma afinidade de ligação para com beta7 humana que é superior, por exemplo pelo menos 3, pelo menos 5, pelo menos 7, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20 ou pelo menos 100 vezes superior à de um fragmento Fab de roedor (tal como rato ou murino) compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em, uma sequência de um domínio variável de cadeia leve e de cadeia pesada como representado nas Fig. IA e Fig. 1B, respectivamente. Numa concretização, o referido fragmento Fab de roedor tem a afinidade de ligação de um fragmento Fab compreendendo sequências do domínio variável de um anticorpo de rato designado FIB504.64, produzido pela linha celular de hibridoma depositada na American Type Culture Collection com o Número de Acesso ATCC HB-293. Numa outra concretização, um fragmento Fab humanizado da invenção tem a afinidade de ligação de um fragmento Fab compreendendo sequências do domínio variável de um anticorpo produzida por qualquer um dos anticorpos humanizados anti-beta7 da invenção. Como está bem estabelecido na especialidade, a afinidade de ligação de um ligando para com o seu receptor pode ser determinada utilizando qualquer de uma variedade de ensaios e pode ser expressa em termos de uma variedade de valores quantitativos. Deste modo, numa concretização, a afinidade de ligação é 5
ΕΡ 1 784 426 PT expressa como valores de Kd e reflecte a afinidade de ligação intrínseca (e.g., com efeitos de avidez minimizados). Genericamente e preferivelmente, a afinidade de ligação é medida in vitro,. quer num cenário com isenção de células quer associada a células. Como descrito aqui com maior detalhe, o número de vezes da diferença de afinidade de ligação pode ser quantificado em termos da razão entre o valor da afinidade de ligação de um anticorpo humanizado na forma Fab e o valor da afinidade de ligação de um anticorpo Fab de referência/comparador (e.g., um anticorpo murino possuindo sequências da região hipervariável de dador), em que os valores de afinidade de ligação são determinados em condições de ensaio similares. Assim, numa concretização, o número de vezes da diferença de afinidade de ligação é determinado como a razão entre os valores de Kd do anticorpo humanizado na forma Fab e o do referido anticorpo Fab de referência/comparador. Pode utilizar-se qualquer de vários ensaios conhecidos na especialidade, incluindo os aqui descritos, para obter medições de afinidade de ligação, incluindo, por exemplo, Biacore® (Biacore International Ab, Uppsala, Suécia) e ELISA. É aqui descrito, mas não faz parte da invenção como reivindicada, um anticorpo compreendendo um anticorpo anti-beta7 ou um seu fragmento de ligação a beta7 compreendendo: (a) pelo menos uma, duas, três, quatro ou cinco sequências da região hipervariável (HVR) seleccionadas do grupo que consiste em: i) HVR-LI compreendendo a sequência AI1 é RASESVDTYLH (SEQ ID N0:1) AI-AI 1, em que Al- ii) HVR-L2 compreendendo a sequência B8 é KYASQSIS (SEQ ID NO:2) B1-B8, em que Bl- Íii) HVR-L3 compreendendo a sequência C9 é QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3) C1-C9, em que Cl- iv) HVR-H1 compreendendo a sequência Dl0 é GFFTTNNYWG (SEQ ID NO:4) D1-D10, em que DL- V) HVR-H2 compreendendo a sequência E1-E17, E17 é GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5); e em que El- Vi) HVR-H3 compreendendo a sequência Fll é MTGSSGYFDF (SEQ ID NO:6). F2-F11, em que F2- 6
ΕΡ 1 784 426 PT É também aqui descrito um polipéptido ou anticorpo que compreende pelo menos uma HVR variante, em que a sequência da HVR variante compreende a modificação de pelo menos um resíduo de pelo menos uma das sequências representadas em SEQ ID N0:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9. É também aqui descrito um anticorpo anti-beta7 ou seu fragmento de ligação a beta7 compreendendo uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões hipervariáveis (HVR) seleccionadas do grupo que consiste em HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Hl, HVR-H2 e HVR-H3, em que: (i) HVR-LI compreende a sequência de aminoácidos RASESVDTYLH (SEQ ID NO: 1) ; RASESVDSLLH (SEQ ID N0:7), RASESVDTLLH (SEQ ID NO:8) OU RASESVDDLLH (SEQ ID N0:9); (ii) HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos KYASQSIS (SEQ ID NO: 2), RYASQSIS (SEQ ID NO: 67) ou XYASQSIS (SEQ ID NO:68, onde X representa qualquer aminoácido), (iii) HVR-L3 compreende QQGNSLPNT (SEQ ID N0:3), (iv) HVR-Hl compreende a sequência de aminoácidos GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4), (v) HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5), e (vi) HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos MTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 6) ou RTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 66) para as posições relativas F2-F11; ou compreende a sequência de aminoácidos Fl-Fll, em que Fl-Fll é AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO:63), ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO:64) ou AQTGSSGYFDF (SEQ ID NO:65). É aqui também descrito um anticorpo anti-beta7 ou seu fragmento de ligação a beta7 compreendendo uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões hipervariáveis (HVR) seleccionadas do grupo que consiste em HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-Hl, HVR-H2 e HVR-H3, em que: (i) HVR-L1 compreende a sequência de aminoácidos Al-All, em que Al-All é RASESVDTYLH (SEQ ID NO:1); RASESVDSLLH (SEQ ID NO:7), RASESVDTLLH (SEQ ID N0:8) ou RASESVDDLLH (SEQ ID NO: 9) ou uma variante de SEQ ID N0:1, 7, 8 ou 9 em que o aminoácido A2 é seleccionado do grupo que consiste em A, G, S, T e V e/ou o aminoácido A3 é seleccionado do grupo que consiste em S, G, I, K, N, P, Q, R e T, e/ou 7
ΕΡ 1 784 426 PT Α4 é seleccionado do grupo que consiste em E, V, Q, A, D, G, Η, I, K, L, N e R, e/ou o aminoácido A5 é seleccionado do grupo que consiste em S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, Te V, e/ou o aminoácido A6 é seleccionado do grupo que consiste em V, R, I, A, G, K, L, M e Q e/ou o aminoácido A7 é seleccionado do grupo que consiste em D, V, S, A, E, G, Η, I, K, L, N, P, S e T, e/ou o aminoácido A8 é seleccionado do grupo que consiste em D, G, N, E, T, P e S, e/ou o aminoácido A9 é seleccionado do grupo que consiste em L, Y, I e M, e/ou o aminoácido AIO é seleccionadas do grupo que consiste em L, A, I, M e V e/ou o aminoácido All é seleccionado do grupo que consiste em Η, Y, F e S; (ii) HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos B1-B8, em que B1-B8 é KYASQSIS (SEQ ID N0:2), RYASQSIS (SEQ ID NO:67 ou XYASQSIS (SEQ ID NO:68, onde X representa qualquer aminoácido) ou uma variante de SEQ ID NO: 2, 67 ou 68 em que o aminoácido BI é seleccionado do grupo que consiste em K, R, N, V, A, F, Q, Η, P, I, L, Y e X (onde X representa qualquer aminoácido), e/ou o aminoácido B4 é seleccionado do grupo que consiste em S e D, e/ou o aminoácido B5 é seleccionado do grupo que consiste em Q e S, e/ou o aminoácido B6 é seleccionado do grupo que consiste em S, D, L e R, e/ou o aminoácido B7 é seleccionado do grupo que consiste em I, V, E e K; (iii) HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos C1-C9, em que C1-C9 é QQGNSLPNT (SEQ ID NO: 3) ou uma variante de SEQ ID NO: 3 em que o aminoácido C8 é seleccionado do grupo que consiste em N, V, W, Y, R, S, T, A, F, Η, I, L, M e Y; (iv) HVR-H1 compreende a sequência de aminoácidos D1-D10 em que D1-D10 é GFFITNNYWG (SEQ ID N0:4), (v) HVR-H2 compreende a sequência de aminoácidos E1-E17 em que E1-E17 é GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 5) ou uma variante de SEQ ID NO: 5 em que o aminoácido E2 é seleccionado do grupo que consiste em Y, F, V e D, e/ou o aminoácido E6 é seleccionado do grupo que consiste em S e G, e/ou o aminoácido E10 é seleccionado do grupo que consiste em S e Y, e/ou o aminoácido E12 é seleccionado do grupo que consiste em N, T, A e D, e/ou o aminoácido 13 é seleccionado do grupo que consiste em P, 8
ΕΡ 1 784 426 PT Η, D e A, e/ou o aminoácido E15 é seleccionado do grupo que consiste em L e V, e/ou o aminoácido E17 é seleccionado do grupo que consiste em S e G, e (vi) HVR-H3 compreende a sequência de aminoácidos F2-F11 em que F2-F11 é MTGSSGYFDF (SEQ ID NO:6) ou RTGSSGYFDF (SEQ ID NO:66); ou compreende a sequência de aminoácidos Fl-Fll, em que Fl-Fll é AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO:63), ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO:64) ou AQTGSSGYFDF (SEQ ID NO:65) ou uma variante de SEQ ID NO: 6, 63, 64, 65 ou 66 em que o aminoácido F2 é R, Μ, A, E, G, Q, S, e/ou o aminoácido Fll é seleccionado do grupo que consiste em F e Y. 0 aminoácido na posição 71 do esqueleto da cadeia pesada (de acordo com o sistema de numeração de Kabat) pode ser seleccionado do grupo que consiste em R, A e T, e/ou o aminoácido na posição 73 do esqueleto da cadeia pesada (sistema de numeração de Kabat) pode ser seleccionado do grupo que consiste em N e T, e/ou o aminoácido na posição 78 do esqueleto da cadeia pesada (sistema de numeração de Kabat) pode ser seleccionado do grupo que consiste em F, A e L.
Em determinados anticorpos aqui descritos, HVR-L1 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID N0:1. Numa concretização, HVR-L2 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO:2. Numa concretização, HVR-L3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO:3. Numa concretização, HVR-H1 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO:4. Numa concretização, HVR-H2 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO:5. Numa concretização, HVR-H3 de um anticorpo da invenção compreende a sequência de SEQ ID NO:6 ou 66 para as posições relativas F2-F11 ou SEQ ID NO: 63 ou 64, para as posições relativas Fl-Fll. Numa concretização, HVR-L1 compreende RASESVDSLLH (SEQ ID NO: 7) . Numa concretização, HVR-L1 compreende RASESVDTLLH (SEQ ID NO: 8) . Numa concretização, HVR-L1 compreende RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9). Os anticorpos da invenção compreendendo estas sequências (em combinações como aqui descrito) são humanizados.
Num aspecto, a invenção proporciona um anticorpo compreendendo uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVR, em que cada HVR compreende, consiste em, ou consiste 9
ΕΡ 1 784 426 PT essencialmente em, uma sequência seleccionada do grupo que
consiste em SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 e em que SEQ ID NO: 7, 8 ou 9 correspondem a uma HVR-L1, SEQ ID NO:2 corresponde a uma HVR-L2, SEQ ID NO: 3 corresponde a uma HVR-L3, SEQ ID NO: 4 corresponde a uma HVR-H1, SEQ ID NO: 5 corresponde a uma HVR-H2 e SEQ ID NO: 6 corresponde a uma HVR-H3. Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, por ordem, compreende a SEQ ID NO: 7, 2, 3, 4, 5 e 6. Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, por ordem, compreende SEQ ID NO:8, 2, 3, 4, 5 e 6. Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, por ordem, compreende SEQ ID NO:9, 2, 3, 4, 5 e 6. Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, por ordem, compreende SEQ ID NO:9, 2, 3, 4, 5 e 66 ou SEQ ID NO:9, 2, 3,4, 5, 63 ou SEQ ID N0:9, 2, 3, 4, 5, 64. São aqui descritos anticorpos em que existe uma modificação de HVR e/ou do esqueleto incluindo em que A8 numa HVR-L1 variante é S, D ou T e A9 é L.
Em determinados anticorpos de acordo com a invenção pelo menos uma porção da sequência de esqueleto é uma sequência de esqueleto de consenso humano. É aqui descrito, mas não faz parte da invenção como reivindicada, um anticorpo em que: uma variante de HVR-L1 compreende 1-10 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) substituições em qualquer combinação das posições seguintes: A2 (G, S, T ou V) ; A3 (G, I, K, N, P, Q/ R ou T), A4 (A, D, G, H, I, K, L, N, Q/ R ou V) , r A5 (A, D, ( 3/ Η, I , K, N, P / R -, τ , v OU Y), A6 (A, G, I / K, L, M, Q ou R), A7 (A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T ou V) , A8 (S, D, E, G, P ou N) e A9 (L, I ou Μ) , AIO (A, I, M OU V) e All (F, S ou Y); ou uma variante de HVR- -L2 compreende 1 -4 d, 2, 3 ou 4) substituições em qualquer combinação das posições seguintes: BI (N), B5 (S), B6 (R ou L) e B7 (T, E, K ou V); ou uma variante de HVR-L3 compreende pelo menos uma substituição na posição C8 (W, Y, R, S, A, F, Η, I, L, Μ, N, T ou V); ou 10
ΕΡ 1 784 426 PT uma variante de HVR-H2 compreende 1-7 (1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7) substituições em qualquer combinação das posições seguintes: E2 (V, D ou F), E6 (G), E10 (Y), E12 (A, D ou T) , E13 (D, A ou Η), E15 (V), EI7 (G); ou uma variante de HVR-H3 compreende 1 ou 2 substituições em qualquer combinação das posições seguintes: F2 (A, E, G, Q, R ou S) e Fll (Y). A invenção proporciona um anticorpo compreendendo: uma HVR-L1 possuindo a sequência de SEQ m NO: 7; uma HVR-L1 possuindo a sequência de SEQ ID NO:8; ou uma HVR-L1 possuindo a sequência de SEQ ID NO:9.
Determinados anticorpos de acordo com a invenção compreendem uma sequência de esqueleto de consenso da cadeia pesada do subgrupo III de cadeias pesadas humanas compreendendo uma substituição na posição 71, 73 e/ou 78. A substituição pode ser R71A, N73T e/ou N78A.
Determinados anticorpos de acordo com a invenção compreendem uma HVR-L3 possuindo a sequência de SEQ ID NO:3.
Em alguns anticorpos de acordo com a invenção A8 em HVR-L1 é S.
Em outros, A8 em HVR-L1 é D.
Em alguns anticorpos de acordo com a invenção A9 em HVR-L1 é L. São aqui descritos anticorpos em que uma sequência de esqueleto entre a sequência E1-E17 e a Fl-Fll é HFR3-1-HFR3-31 e em que HFR3-6 é A ou R, HFR3-8 é N ou T e HFR3-13 é L ou A ou F.
Determinados anticorpos humanizados anti-beta7 de acordo com a invenção possuem uma afinidade monovalente do anticorpo para com beta7 humana que é substancialmente idêntica à afinidade monovalente de um anticorpo de rato compreendendo 11 ΕΡ 1 784 426 PT uma sequência variável de cadeia leve e de cadeia pesada como representado na Fig. 9.
Determinados anticorpos humanizados anti-beta7 de acordo com a invenção possuem afinidade monovalente do anticorpo para com beta7 humana que é pelo menos 3 vezes superior à afinidade monovalente de um anticorpo de rato compreendendo uma sequência variável de cadeia leve e de cadeia pesada como representado na Fig. 9. 0 anticorpo de rato pode ser produzido pela linha celular de hibridoma depositada na American Type Culture Collection com o Número de Acesso ATCC com a designação HB-293. A afinidade de ligação pode ser expressa como um valor de Kd. A afinidade de ligação pode ser medida por Biacore™ ou radioimunoensaio. 0 anticorpo da invenção pode compreender a sequência do esqueleto de consenso da cadeia leve κ do subgrupo 1 humana. 0 anticorpo da invenção pode compreender uma sequência do esqueleto de consenso da cadeia pesada do subgrupo III de cadeias pesadas humanas. 0 anticorpo da invenção pode compreender uma sequência de esqueleto que compreende uma substituição na posição 71, 73 e/ou 78. A substituição pode ser R71A, N73T e/ou N78A ou em que o aminoácido substituído na posição 71 é R ou A, e/ou o aminoácido da substituição na posição 78 é N ou T, e/ou o aminoácido da substituição na posição 78 é L ou A ou F. A substituição pode ser L78F ou A78F ou A78L ou L78A. A invenção também proporciona um método de inibição da interacção de uma subunidade de integrina beta7 humana com uma segunda subunidade de integrina e/ou um ligando, in vitro, 12 ΕΡ 1 784 426 PT através do contacto do anticorpo reivindicado com a segunda subunidade de integrina e/ou com o ligando. A segunda subunidade de integrina pode ser a subunidade alfa4 de integrina e o ligando pode ser MAdCAM, VCAM ou fibronectina. A subunidade alfa4 de integrina pode ser humana. 0 ligando pode ser humano. A segunda subunidade de integrina pode ser a subunidade alfaE de integrina e o ligando E-caderina. A subunidade alfaE de integrina pode ser humana. 0 ligando pode ser humano.
Determinados anticorpos para utilização de acordo com a invenção reduzem ou aliviam os sintomas de uma desordem seleccionada entre inflamação, asma, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, diabetes, inflamação resultante de transplantação de órgãos, desordem de enxerto versus hospedeiro e inflamação associada com desordens relacionadas com aloenxertos. HVR-L1 é SEQ ID NO: 7, 8 ou 9. É aqui também descrita uma variante de HVR-L1 de SEQ ID N0:1, 7, 8 ou 9 que compreende Ι- ΙΟ (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) substituições nas posições relativas Al-All, em qualquer combinação das posições seguintes: A2 (A, G, S, T ou V) ; A3 (S, G, I, K, N, P, Q, R ou T), A4 (E, A, D, G, Η, I, K, L, N, Q, R ou V) , A5 (S,A, D, G, Η, I, K, N , P , R, T, V ou Y) , A6 (V, A, G, I, K, L, M, Q ou R) , A7 (D, A, E, G, Η, I, K, L, N, P, S, T ou V), A8 (T, s, D, E, G, P ou N) e A9 (Y, L, I ou M), AIO (L, A, I, M ou V) e All (H, F, S ou Y). Uma HVR-L2 pode ser SEQ ID NO:2, 67 ou 68 ou uma variante de HVR-L2 de SEQ ID NO: 2, 67 ou 68 em que a variante de HVR-L2 compreende 1-4 (1, 2, 3, 4, 4 ou 5) substituições nas posições relativas B1-B8, em qualquer combinação das posições seguintes: BI (K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y ou X (onde X representa qualquer aminoácido) , B4 (S), B5 (Q ou S), B6 (S, R ou L) e B7 (I, T, E, K ou V) . Uma 13
ΕΡ 1 784 426 PT HVR-L3 é SEQ ID NO:3 ou uma variante de HVR-L3 de SEQ ID NO:3 pode compreender pelo menos uma substituição nas posições relativas C1-C8, tal como a posição C8 (W, Y, R, S, A, F, H, I, L, Μ, N, T ou V) . HVR-H1 pode ser SEQ ID NO: 4. Numa concretização, uma HVR-H2 é SEQ ID NO: 5. É aqui também descrita uma variante de HVR-H2 de SEQ ID NO: 5 em que a variante de HVR-H2 compreende 1-7 (1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7) substituições nas posições relativas E1-E17 em qualquer combinação das posições seguintes: E2 (Y, V, D ou F), E6 (S ou G) , E10 (S ou Y) , E12 (N, A, D ou T) , E13 (P, D, A ou Η) , E15 (L ou V) , E17 (S ou G) . Numa concretização, uma HVR-H3 é SEQ ID NO: 6, 63, 64 ou 66. É aqui também descrita uma variante de HVR-H3 de SEQ ID NO: 6, 63, 64, 65 ou 66 que compreende nas posições relativas Fl-Fll para SEQ ID NO: 63, 64 e 65 ou nas posições relativas F2-F11 para SEQ ID NO: 6 e 66, 1 ou 2 substituições em qualquer combinação das posições seguintes: F2 (Μ, A, E, G, Q, R ou S) e Fll (F ou Y). A(s) letra(s) entre parêntesis que se seguem a cada posição indicam um aminoácido de substituição ilustrativo (i.e., substituinte) para um aminoácido de consenso ou outro, como será evidente para um perito na especialidade, em que a adequabilidade dos outros aminoácidos como aminoácidos de substituição no contexto aqui descrito pode ser avaliada rotineiramente utilizando técnicas conhecidas na especialidade e/ou como aqui descrito. É aqui também descrita uma HVR-L1 que compreende a sequência de SEQ ID NO: 1. A8 numa HVR-L1 variante pode ser D ou S. A9 numa HVR-L1 variante pode ser L. Em alguns casos, A8 numa HVR-L1 variante é D e A9 numa HVR-L1 variante é L. Em outros casos, A8 numa HVR-L1 variante é S e A9 numa HVR-L1 variante é L. Um anticorpo pode compreender estas variações na HVR-L1; e a HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 compreendem ou consistem em, ou consistem essencialmente em, por ordem, SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 e 6. HVR-H3 pode compreender ou consistir em, ou consistir essencialmente em, SEQ ID NO: 6 ou 66 (para as posições relativas F2-F11) ou SEQ ID NO: 63 ou 64 ou 65 (para as posições relativas Fl-Fll).
Em alguns anticorpos aqui descritos A8 numa HVR-L1 variante é I e A9 numa HVR-L1 variante é L, em que a variante compreende ainda a HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, 14
ΕΡ 1 784 426 PT cada HVR compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em, por ordem, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5 e 6.
Em outros, A8, A9 e AIO numa HVR-L1 variante são D, L e V, respectivamente, em que a variante compreende ainda a HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, cada HVR compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em, por ordem, SEQ ID N0:2. 3, 4, 5 e 6.
Em outros, A8 e A9 numa HVR-L1 variante são N e L, respectivamente, em que a variante compreende ainda a HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, cada HVR compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em, por ordem, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5 e 6.
Em outros, A8 e A9 numa HVR-L1 variante são P e L, respectivamente e B6 e B7 numa HVR-L2 variante são R e T, respectivamente, em que a variante compreende ainda a HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, cada HVR compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em, por ordem, SEQ ID NO: 3, 4, 5 e 6.
A2, A4, A8, A9 e AIO numa HVR-L1 variante podem ser S, D, S, L e V, respectivamente, em que a variante compreende ainda a HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, cada HVR compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em, por ordem, SEQ ID N0:2, 3, 4, 5 e 6.
Em outros, A5 e A9 numa HVR-L1 variante são D e T, respectivamente, em que a variante compreende ainda a HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, cada HVR compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em, por ordem, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5 e 6.
Em outros, A5 e A9 numa HVR-L1 variante são N e L, respectivamente, em que a variante compreende ainda a HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, cada HVR compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em, por ordem, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5 e 6.
Em outros, A9 numa HVR-L1 variante é L, em que a variante compreende ainda a HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, 15 ΕΡ 1 784 426 PT cada HVR compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em, por ordem, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5 e 6.
Determinados anticorpos ou polipéptidos de ligação anti-beta7 da invenção compreendem uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, cada HVR compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente em, por ordem, SEQ ID NO: 9, 2, 3, 4, 5 e 64. Em outra concretização, cada HVR compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, por ordem, SEQ ID NO: 9, 67, 3, 4, 5 e 64. Em outra concretização, cada HVR compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, por ordem, SEQ ID NO:9, 68, 3, 4, 5 e 64. Em outra concretização, cada HVR compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em, por ordem, SEQ ID NO:9, 2 ou 67 ou 68, 3, 4, 5 e 66. São também descritas aqui variantes de anticorpos com HVR-L1 variante que compreendem ainda HVR-L2, HVR-L3, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID NO: 2 3, 4, 5 e 6. Quando a variante de anticorpo compreende A8 (P) e A9 (L) na HVR-L1 e B6(R) e B7(T) na HVR-L2, a referida variante de HVR-LI, HVR-L2 compreende ainda HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID NO:3, 4, 5 e 6.
Em algumas concretizações, os anticorpos da invenção compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia pesada do subgrupo III humano. Numa concretização destes anticorpos, a sequência de consenso do esqueleto compreende a substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas concretizações destes anticorpos, a posição 71 é A, a 73 é T e/ou a 78 é A. Numa concretização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda um sequência de consenso do esqueleto da cadeia leve κΐ humana.
Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-L3 compreendendo SEQ ID NO:3. É aqui descrita uma HVR-L3 variante em que C8 é L. Um anticorpo variante pode ainda compreender HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID N0:1, 2, 4, 5 e 6. É aqui também descrita uma HVR-L3 variante em que C8 é W. Um anticorpo variante pode ainda 16 ΕΡ 1 784 426 PT compreender HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID N0:1, 2, 4, 5 e 6. HVR-L1 compreende SEQ ID NO:7, 8 ou 9. Em algumas concretizações, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia pesada do subgrupo III humano. Numa concretização destes anticorpos, a sequência de consenso do esqueleto compreende a substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas concretizações destes anticorpos, a posição 71 é A, a 73 é T e/ou a 78 é A. Numa concretização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia leve κΐ humana.
Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-H3 compreendendo SEQ ID NO:6. É aqui também descrita uma HVR-H3 variante em que F1 é Q. Um anticorpo variante pode ainda compreender HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H2, em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID N0:1, 2, 3, 4 e 5. É aqui também descrita uma HVR-H3 variante em que F1 é R. Um anticorpo variante pode ainda compreender HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H2, em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID N0:1, 2, 3, 4 e 5. HVR-L1 compreende SEQ ID NO:7, 8 ou 9. Em algumas concretizações, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia pesada do subgrupo III humano. Numa concretização destes anticorpos, a sequência de consenso do esqueleto compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas concretizações destes anticorpos, a posição 71 é A, a 73 é T e/ou a 78 é A. Numa concretização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia leve κΐ humana.
Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-L2 compreendendo SEQ ID NO:2. É aqui também descrita uma HVR-L2 variante em que BI é N, B5 é S, B6 é L, B7 é V, e/ou B7 é E ou K. Um anticorpo variante pode ainda compreender HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID N0:1, 3, 4, 5 e 6. HVR-L1 compreende SEQ ID NO: 7, 8 ou 9. Em algumas concretizações, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia pesada do 17 ΕΡ 1 784 426 PT subgrupo III humano. Numa concretização destes anticorpos, a sequência de consenso do esqueleto compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas concretizações destes anticorpos, a posição 71 é A, a 73 é T e/ou a 78 é A. Numa concretização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia leve κΐ humana.
Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-L3 compreendendo SEQ ID NO:3. É aqui descrita uma HVR-L3 variante em que C8 é W, Y, R ou S. Um anticorpo variante pode ainda compreender HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID N0:1, 2, 4, 5 e 6. HVR-L1 compreende SEQ ID NO:7, 8 ou 9. Em algumas concretizações, estes anticorpos compreendem ainda a sequência de consenso do esqueleto da cadeia pesada do subgrupo III humana. Numa concretização destes anticorpos, a sequência de consenso do esqueleto compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas concretizações destes anticorpos, a posição 71 é A, a 73 é T e/ou a 78 é A. Numa concretização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia leve κΐ humana.
Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-H2 compreendendo SEQ ID NO: 5. É aqui descrita uma HVR-H2 variante em que E2 é F ou em que E2 é V ou D. É aqui também descrita uma HVR-H2 variante em que E6 é G, E10 é Y, E12 é A, D ou T, E13 é D, A ou N, E15 é V, e/ou E17 é G. Um anticorpo variante pode ainda compreender HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H3, em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID N0:1, 2, 3, 4 e 6. HVR-L1 compreende SEQ ID NO: 7, 8 ou 9. Em algumas concretizações, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia pesada do subgrupo III humano. Numa concretização destes anticorpos, a sequência de consenso do esqueleto compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas concretizações destes anticorpos, a posição 71 é A, a 73 é T e/ou a 78 é A. Numa concretização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia leve κΐ humana. 18
ΕΡ 1 784 426 PT
Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende uma HVR-H3 compreendendo SEQ ID NO:6. É aqui descrita uma HVR-H3 variante em que Fll é Y. Um anticorpo variante pode ainda compreender HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H3, em que cada uma compreende, por ordem, a sequência representada em SEQ ID N0:1, 2, 3, 4 e 6. HVR-L1 compreende SEQ ID NO: 7, 8 ou 9. Em algumas concretizações, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia pesada do subgrupo III humano. Numa concretização destes anticorpos, a sequência de consenso do esqueleto compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas concretizações destes anticorpos, a posição 71 é A, a 73 é T e/ou a 78 é A. Numa concretização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia leve κΐ humana.
Em algumas concretizações, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia pesada do subgrupo III humano. Numa concretização destes anticorpos, a sequência de consenso do esqueleto compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas concretizações destes anticorpos, a posição 71 é A, a 73 é T e/ou a 78 é A. Numa concretização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem ainda uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia leve κΐ humana.
Um agente terapêutico para utilização num indivíduo hospedeiro preferivelmente elicia pouca a nenhuma resposta imunogénica contra o agente no referido indivíduo. Numa concretização, a invenção proporciona um tal agente. Por exemplo, numa concretização, a invenção proporciona um anticorpo humanizado que elicia, e/ou se espera que elicie, uma resposta de anticorpos humanos anti-roedor (tal como uma resposta anti-ratinho ou anti-rato) ou uma resposta humana anti-humana a um nível substancialmente reduzido em comparação com um anticorpo compreendendo a sequência compreendendo SEQ ID NO: 10 e/ou 11 (Fig. IA e 1B) ou SEQ ID NO: 12 e/ou 13 (Fig. 9A e 9B representam sequências de aminoácidos de Fib504 de rato anti-ratinho) num indivíduo hospedeiro. Noutro exemplo, a invenção proporciona um anticorpo humanizado que não elicia, e/ou se espera que não elicie, resposta de 19 ΕΡ 1 784 426 PT anticorpos humanos anti-roedor (tal como humana anti-ratinho (HAMA) ou humana anti-ratinho) ou humana anti-humana (HAHA).
Um anticorpo humanizado da invenção pode compreender uma ou mais sequências que não da região hipervariável (e.g., esqueleto) humana e/ou de consenso humana, no seu domínio variável de cadeia pesada e/ou leve. Em algumas concretizações, estão presentes uma ou mais modificações adicionais no interior das sequências que não da região hipervariável humana e/ou de consenso humana. Numa concretização, o domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo da invenção compreende uma sequência de esqueleto de consenso humano, que numa concretização é a sequência de esqueleto de consenso do subgrupo III. Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende uma sequência de esqueleto de consenso do subgrupo III variante modificada em pelo menos uma posição de aminoácido. Por exemplo, numa concretização, uma sequência de esqueleto de consenso do subgrupo III variante pode compreender uma substituição em uma ou mais das posições 71, 73, 78 e/ou 94. Numa concretização, a referida substituição é R71A, N73T, L78A e/ou R94M, em qualquer sua combinação.
Como é bem conhecido na especialidade e como descrito com mais detalhes adiante, a posição de aminoácido/fronteira que delimita uma região hipervariável de um anticorpo pode variar, dependendo do contexto e das várias definições conhecidas na especialidade (como aqui descrito). Algumas posições no interior de um domínio variável podem ser vistas como posições hipervariáveis híbridas na medida em que estas posições podem ser consideradas como estando no interior de uma região hipervariável segundo um conjunto de critérios, enquanto podem ser consideradas como estando fora de uma região hipervariável segundo um conjunto diferente de critérios. Uma ou mais destas posições podem também ser encontradas em regiões hipervariáveis alargadas (como adicionalmente definido adiante). A invenção proporciona anticorpos compreendendo modificações nestas posições hipervariáveis híbridas. Numa concretização, estas posições hipervariáveis híbridas incluem uma ou mais das posições 26-30, 33-35B, 47-49, 49, 57-65, 93, 94 e 102 num domínio variável da cadeia pesada. Numa concretização, estas posições hipervariáveis híbridas incluem 20 ΕΡ 1 784 426 PT uma ou mais das posições 24-29, 35-36, 46-49, 49, 56 e 97 num domínio variável de cadeia leve. Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende uma sequência de esqueleto de consenso do subgrupo humano variante modificada em uma ou mais posições hipervariáveis híbridas. Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de esqueleto de consenso do subgrupo III humano variante modificada em uma ou mais das posições 28-35, 49, 50, 52a, 53, 54, 58-61, 63, 65, 94 e 102. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição T28F, F29I, S30T, S31N, Y32N, A33Y, M34W e S35G. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição S49G. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição V50F ou V50D ou V50Y. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição G53Y. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição G54S. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição Y58S. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição A60N ou A60D ou A60T. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição D61P ou D61A ou D61H. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição V63L. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição G65S. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição R94M. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição R94A ou R94E ou R94G ou R94Q ou R94S. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição G95T. Numa concretização, o anticorpo compreende uma ou mais das substituições nas posições 28-35, 49, 50, 52a, 53, 54, 58-61, 63, 65, 94 e 102 e compreende ainda uma ou mais das substituições nas posições R71A ou N73T ou L78A ou L78F. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição Y102F. Pode-se observar, por referência à Fig. 1B, que estas substituições são na HVR-H1, HVR-H2 e/ou HVR-H3 da cadeia pesada.
Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de esqueleto de consenso do subgrupo I humano variante modificada em uma ou mais das posições 27, 29-31, 33, 34, 49, 50, 53-55, 91 e 96. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição Q27E. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição I29V. Numa concretização, o 21 ΕΡ 1 784 426 PT anticorpo compreende uma substituição S30D. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição N31T ou N31S ou N31D. Numa concretização, o anticorpo compreende uma Y32L. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição A34H. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição Y49K. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição A50Y. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição S53Q. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição L54S. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição E55I ou E55V. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição Y91G. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição W96N ou W96L. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição A25S. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição de A25 para G, S, T ou V. Numa concretização, o anticorpo compreende uma modificação seleccionada entre um ou mais dos seguintes grupos de substituições. Por exemplo, numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição de S26 para G, I, K, N, P, Q ou T. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição de Q27 para E, A, D, G, Η, I, K, L, N, Q, R ou V. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição de S28 para A, D, G, Η, I, K, N, P, R, T, V ou Y. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição de 129 para V, A, G, K, L, M, Q ou R. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição de S30 para D, A, E, G, Η, I, K, L, N, P, S, T ou V. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição de N31 para D, T e ou G. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição de Y32 para L, I ou M. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição de L33 para A, I, M ou V. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição de A34 para H, F, Y ou S. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição de Y49 para K ou N. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição A50Y. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição S53Q. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição L54S. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição de E55 para V, I ou K. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição Y91G. Numa concretização, o anticorpo compreende uma substituição de W96 para N, L, W, Y, R, S, A, F, Η, I, Μ, N, R, S, T, V ou Y. Pode observar-se, por referência à Fig. IA, 22 ΕΡ 1 784 426 PT que estas substituições são na HVR-L1, HVR-L2 e/ou HVR-L3 da cadeia leve.
Um anticorpo da invenção pode compreender quaisquer sequências de esqueleto da cadeia leve humana ou de consenso humana adequadas, desde que o anticorpo exiba as caracteristicas biológicas desejadas (e.g., uma afinidade de ligação desejada). Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma porção (ou a totalidade) da sequência de esqueleto da cadeia leve κ humana. Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma porção (ou a totalidade) da sequência de consenso do esqueleto do subgrupo I κ humano.
Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende um domínio variável de cadeia pesada e/ou leve compreendendo sequências de esqueleto representadas em SEQ ID NO:34-41 e nas FIG. 1, 7 e 8, desde que as posições 49 da cadeia leve e 94 da cadeia pesada estejam incluídas nas HVR alargadas e desde que a referida posição 49 seja K e a referida posição 94 seja preferivelmente, mas não necessariamente, M e possa ser R. proporciona ligação de antagonista alfa4beta7 antagonista alfa4beta7 antagonista a ligação de um anticorpo a ligação de um anticorpo a ligação de
Os antagonistas da invenção podem ser utilizados para modular um ou mais aspectos dos efeitos associados a beta7, incluindo, mas não se lhes limitando, a associação com a subunidade alfa4 de integrina, a associação com a subunidade alfaE de integrina, a ligação de integrina alfa4beta7 a MAdCAM, VCAM-1 ou fibronectina e a ligação de integrina alfaEbeta7 a E-caderina. Estes efeitos podem ser modulados através de qualquer mecanismo biologicamente relevante, incluindo destruição da ligação do ligando à subunidade beta7 ou à integrina dimérica alfa4beta7 ou alfaEbeta, e/ou por destruição da associação entre as subunidades alfa e beta da integrina de modo que é inibida a formação da integrina dimérica. Deste modo, numa concretização, a invenção um anticorpo antagonista de beta7 que inibe a alfa4 a beta7. Numa concretização, um anticorpo de beta7 da invenção destrói a MAdCAM. Numa concretização, de beta7 a VCAM-1. de beta7 da invenção destrói Numa concretização, da invenção destrói 23
ΕΡ 1 784 426 PT alfa4beta7 a fibronectina. Numa concretização, um anticorpo antagonista de beta7 da invenção destrói a ligação de beta7 a alfaE. Numa concretização, um anticorpo antagonista de beta7 da invenção destrói a ligação de integrina alfaEbeta7 a E-caderina. A interferência pode ser directa ou indirecta. Por exemplo, um anticorpo antagonista de beta7 pode ligar-se a beta7 no interior de uma sequência da região de dimerização alfa4beta7 ou alfaEbeta7 e desse modo inibir a interacção das subunidades de integrina e a formação de um dímero de integrina. Num outro exemplo, um anticorpo antagonista de beta7 pode ligar-se a uma sequência no interior do domínio de ligação ao ligando da subunidade beta7 e desse modo inibir a interacção do referido domínio ligado com o seu parceiro de ligação (tal como fibronectina, VCAM e/ou MAdCAM para a integrina alfa4beta7; ou E-caderina para a integrina alfaEbeta7). Num outro exemplo, um anticorpo antagonista de beta7 pode ligar-se a uma sequência que não está no interior do domínio de dimerização das subunidades de integrina ou de um domínio de ligação ao ligando, mas em que a ligação do referido anticorpo antagonista de beta7 resulta na destruição da capacidade do domínio beta7 interactuar com o seu parceiro de ligação (tal como uma subunidade alfa4 ou alfaE de integrina e/ou um ligando tal como fibronectina, VCAM, MAdCAM ou E-caderina). Numa concretização, um anticorpo antagonista da invenção liga-se a beta7 (por exemplo, o domínio extracelular) de modo que a dimerização de beta7 com a subunidade alfa4 ou alfaE é destruída. Numa concretização, um anticorpo antagonista da invenção liga-se a beta7 de modo que a capacidade de beta7 e/ou uma integrina alfa4beta7 e/ou uma alfaEbeta7 se ligarem ao seu ligando ou ligandos respectivos é destruída. Por exemplo, numa concretização, a invenção proporciona um anticorpo antagonista que, por ligação a uma molécula de beta7, inibe a dimerização da referida molécula. Numa concretização, um anticorpo antagonista de beta7 da invenção liga-se especificamente a uma sequência no domínio de ligação ao ligando de beta7. Numa concretização, um anticorpo antagonista de beta7 da invenção liga-se especificamente a uma sequência no domínio de ligação ao ligando de beta7 de modo que a ligação de ligando (i.e., fibronectina, VCAM e/ou MAdCAM) à integrina alfa4beta7 é destruída. Numa concretização, um anticorpo antagonista de beta7 da invenção liga-se especificamente a uma sequência no domínio de ligação 24 ΕΡ 1 784 426 PT ao ligando de beta7 de modo que a ligação do ligando (i.e., E-caderina) à integrina alfaEbeta7 é destruída.
Numa concretização, um anticorpo antagonista da invenção destrói a dimerização de beta7 compreendendo a heterodimerização (i.e., dimerização de beta7 com uma molécula da subunidade alfa4 ou alfaE de integrina).
Numa concretização, um anticorpo antagonista da invenção liga-se a um epítopo na subunidade beta7 da integrina que está mapeado nos aminoácidos 176-237. Em outra concretização, um anticorpo antagonista da invenção liga-se ao mesmo epítopo na integrina beta7 que é substancialmente o mesmo epítopo que se encontra em Fib504.64 (ATCC HB-293). A determinação da ligação ao epítopo realiza-se por técnicas padrão incluindo, sem limitação, análise de competição pela ligação.
Num aspecto, a invenção proporciona um anticorpo compreendendo uma combinação de uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as sequências de HVR representadas na tabela de substituições de aminoácidos na Fig. 13.
Um agente terapêutico para utilização num indivíduo hospedeiro elicia preferivelmente pouca a nenhuma resposta imunogénica contra o agente no referido indivíduo. Numa concretização, a invenção proporciona um tal agente. Por exemplo, numa concretização, a invenção proporciona um anticorpo humanizado que elicia e/ou se espera que elicie uma resposta de anticorpos humanos anti-rato ou humanos anti-ratinho ou humanos anti-humano num nível substancialmente reduzido em comparação com um anticorpo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 10, 11, 12 e/ou SEQ ID NO: 13 (Fib504 de rato anti-ratinho (ATCC HB-2 93) , FIG. 1 e 9) num indivíduo hospedeiro. Num outro exemplo, a invenção proporciona um anticorpo humanizado que não elicia e/ou se espera que não elicie resposta de anticorpos humanos anti-ratinho, humanos anti-rato ou humanos anti-humano.
Um anticorpo humanizado da invenção pode compreender uma ou mais sequências humanas e/ou de consenso humanas que não da região hipervariável (e.g., esqueleto) no seu domínio variável de cadeia pesada e/ou cadeia leve. Em algumas concretizações, 25 ΕΡ 1 784 426 PT estão presentes uma ou mais modificações adicionais no interior das sequências que não da região hipervariável humanas e/ou de consenso humanas. Numa concretização, o domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo da invenção compreende uma sequência de esqueleto de consenso humano, que numa concretização é a sequência de esqueleto de consenso do subgrupo III. Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende uma sequência de esqueleto de consenso do subgrupo III variante, modificada em pelo menos uma posição de aminoácido. Por exemplo, numa concretização, uma sequência de esqueleto de consenso do subgrupo III variante pode compreender uma substituição em uma ou mais das posições 71, 73, 78 e/ou 94, embora a posição 94 faça parte de uma região hipervariável da cadeia pesada alargada H3 da presente invenção. Numa concretização, a referida substituição é R71A, N73T, N78A e/ou R94M, em qualquer combinação.
Um anticorpo da invenção pode compreender quaisquer sequências de esqueleto da cadeia leve humanas ou de consenso humanas adequadas, desde que o anticorpo exiba as características biológicas desejadas (e.g., uma afinidade de ligação desejada). Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma porção (ou a totalidade) da sequência de esqueleto da cadeia leve κ humana. Numa concretização, um anticorpo da invenção compreende pelo menos uma porção (ou a totalidade) da sequência de consenso do esqueleto do subgrupo I κ humano.
Os antagonistas da invenção podem ser utilizados para modular um ou mais aspectos dos efeitos associados a beta7. Por exemplo, um anticorpo antagonista de beta7 pode ligar-se a beta7 no interior de uma sequência da região de dimerização alfa4beta7 ou alfaEbeta7 e desse modo inibir a interacção das subunidades de integrina e a formação de um dímero de integrina. Num outro exemplo, um anticorpo antagonista de beta7 pode ligar-se a uma sequência no interior do domínio de ligação ao ligando da subunidade beta7 e desse modo inibir a interacção do referido domínio ligado com o seu parceiro de ligação (tal como fibronectina, VCAM e/ou MAdCAM para a integrina alfa4beta7; ou E-caderina para a integrina alfaEbeta7). Noutro exemplo, um anticorpo antagonista de beta7 pode ligar-se a uma sequência que não está no interior do 26 ΕΡ 1 784 426 PT domínio de dimerização das subunidades de integrina ou num domínio de ligação ao ligando, mas em que a ligação do referido anticorpo antagonista de beta7 resulta na destruição da capacidade do domínio beta7 interactuar com o seu parceiro de ligação (tal como uma subunidade alfa4 ou alfaE de integrina e/ou um ligando tal como fibronectina, VCAM, MAdCAM ou E-caderina). Numa concretização, um anticorpo antagonista da invenção liga-se a beta7 (por exemplo, o domínio extracelular) de modo que a dimerização de beta7 com a subunidade alfa4 ou alfaE é destruída. Numa concretização, um anticorpo antagonista da invenção liga-se a beta7 de modo que a capacidade de beta7 e/ou de uma integrina alfa4beta7 e/ou alfaEbeta7 se ligarem ao seu ligando ou ligandos respectivos é destruída. Por exemplo, numa concretização, a invenção proporciona um anticorpo antagonista que, por ligação a uma molécula de beta7, inibe a dimerização da referida molécula. Numa concretização, um anticorpo antagonista de beta7 da invenção liga-se especificamente a uma sequência no domínio de ligação ao ligando de beta7. Numa concretização, um anticorpo antagonista de beta7 da invenção liga-se especificamente a uma sequência no domínio de ligação ao ligando de beta7 de modo que a ligação do ligando (i.e., fibronectina, VCAM e/ou MAdCAM) à integrina alfa4beta7 é destruída. Numa concretização, um anticorpo antagonista de beta7 da invenção liga-se especificamente a uma sequência no domínio de ligação ao ligando de beta7 de modo que a ligação do ligando (i.e., E-caderina) à integrina alfaEbeta7 é destruída.
Numa concretização, um anticorpo antagonista da invenção destrói a dimerização de beta7 compreendendo a heterodimerização (i.e., dimerização de beta7 com uma molécula da subunidade alfa4 ou alfaE de integrina.
Em alguns casos, pode ser vantajoso ter um anticorpo antagonista de beta7 que não interfere com a ligação de um ligando (tal como f ibronectina, VCAM, MAdCAM ou alfaE) à subunidade beta7 enquanto parte de uma integrina ou a uma integrina alfa4beta7 ou uma integrina alfaEbeta7 na forma de um dímero. Deste modo, numa concretização, a invenção proporciona um anticorpo que não se liga a um local de ligação a fibronectina, VCAM, MAdCAM ou E-caderina em beta7 mas, em vez disso, inibe a interacção entre a subunidade beta7 e uma 27 ΕΡ 1 784 426 PT subunidade alfa (tal como a subunidade alfa4 ou alfaE de integrina) de modo seja impedida de se formar uma integrina biologicamente activa. Num exemplo, pode utilizar-se um anticorpo antagonista da invenção em conjunto com um ou mais outros antagonistas, em que os antagonistas estão direccionados para diferentes processos e/ou funções no interior do eixo beta7 da integrina. Assim, numa concretização, um anticorpo antagonista de beta7 da invenção liga-se a um epitopo em beta7 distinto de um epitopo que é ligado por outro antagonista da integrina beta7 ou alfa/beta (tal como um anticorpo alfa4beta7, incluindo um anticorpo monoclonal ou um anticorpo, tal como um anticorpo humanizado ou um anticorpo monoclonal derivado de, e/ou possuindo, as mesmas ou efectivamente as mesmas, caracteristicas ou especificidade de ligação que um anticorpo derivado de um anticorpo murino.
Numa concretização, a invenção proporciona um anticorpo antagonista de beta7 que destrói a multimerização beta7-alfa4 ou -alfaE na integrina respectiva assim como a ligação ao ligando. Por exemplo, um anticorpo antagonista da invenção que inibe a dimerização de beta7 com a subunidade alfa4 ou alfaE de integrina pode ainda compreender uma capacidade de competir com o ligando pela ligação a beta7 ou ao dimero de integrina (e.g., pode interferir com a ligação de fibronectina, VCAM, e/ou MAdCAM a beta7 e/ou alfa4beta7; ou pode interferir com a ligação de E-caderina a beta7 ou alfaEbeta7.)
Numa concretização de um anticorpo antagonista de beta7 da invenção, a ligação do antagonista a beta7 inibe a adesão celular activada pela ligação do ligando. Em outra concretização de um anticorpo antagonista de beta7 da invenção, a ligação do antagonista a beta7 numa célula inibe o recrutamento da célula para as células e/ou tecido em que é expressa a integrina contendo beta7.
Numa concretização, um anticorpo antagonista de beta7 da invenção liga-se especificamente a pelo menos uma porção dos aminoácidos 176-250 (opcionalmente os aminoácidos 176-237) do domínio extracelular de beta7 (veja-se Tidswell, M. et ai. (1997) J. Immunol. 159:1497-1505) ou uma sua variante, e reduz ou bloqueia a ligação dos ligandos MAdCAM, VCAM-1, 28 ΕΡ 1 784 426 PT fibronectina e/ou E-caderina. Numa concretização, este bloqueio da ligação do ligando destrói, reduz e/ou previne a adesão de uma célula que expressa o ligando a uma célula que expressa o ligando contendo beta7. Numa concretização, um anticorpo antagonista da invenção liga-se especificamente a uma sequência de aminoácidos de beta7 compreendendo os resíduos 176-237. Numa concretização, um anticorpo antagonista da invenção liga-se especificamente a um epítopo conformacional formado por parte ou pela totalidade de pelo menos uma das sequências seleccionadas do grupo que consiste nos resíduos 176-237 de beta7. Numa concretização, um anticorpo antagonista da invenção liga-se especificamente a uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade ou similaridade de sequência com a sequência de aminoácido dos resíduos 176-237 ou dos resíduos 176-250 de beta7 humana. Numa concretização, o anticorpo antagonista anti-beta7 da invenção liga-se ao mesmo epítopo que o anticorpo anti-beta7 Fib504 produzido pelo hibridoma ATCC HB-293.
Num aspecto, a invenção proporciona composições compreendendo um ou mais anticorpos antagonistas da invenção e um transportador. Numa concretização, o transportador é farmaceuticamente aceitável. São aqui descritos ácidos nucleicos que codificam um anticorpo antagonista de beta7 da invenção. São aqui também descritos vectores compreendendo um ácido nucleico da invenção e células hospedeiras compreendendo um ácido nucleico ou um vector da invenção. Um vector pode ser de qualquer tipo, por exemplo um vector recombinante tal como um vector de expressão. Pode utilizar-se qualquer de uma variedade de células hospedeiras. Numa concretização, uma célula hospedeira é uma célula procariota, por exemplo, E. coli. Numa concretização, uma célula hospedeira é uma célula eucariota, por exemplo uma célula de mamífero tal como células de ovário de hamster chinês (CHO). São aqui também descritos métodos para a preparação de um antagonista da invenção. Por exemplo, a invenção proporciona 29 ΕΡ 1 784 426 PT um método de preparação de um anticorpo antagonista de beta7 (que, como aqui definido, inclui o comprimento completo e seus fragmentos), o referido método compreendendo a expressão numa célula hospedeira adequada de um vector recombinante da invenção que codifica o referido anticorpo (ou um seu fragmento) e a recuperação do referido anticorpo. É aqui descrito um artigo de fabrico compreendendo um recipiente; e uma composição contida no interior do recipiente, em que a composição compreende um ou mais anticorpos antagonistas de beta7 da invenção. Numa concretização, a composição compreende um ácido nucleico da invenção. Numa concretização, uma composição compreendendo um anticorpo antagonista compreende ainda um transportador, que em algumas concretizações é farmaceuticamente aceitável. Numa concretização, um artigo de fabrico da invenção compreende ainda instruções para a administração da composição (por exemplo, o anticorpo antagonista) a um indivíduo. É aqui descrito um kit compreendendo um primeiro recipiente compreendendo uma composição compreendendo um ou mais anticorpos antagonistas de beta7 da invenção; e um segundo recipiente compreendendo um tampão. Numa concretização, o tampão é farmaceuticamente aceitável. Numa concretização, uma composição compreendendo um anticorpo antagonista compreende ainda um transportador, que em algumas concretizações é farmaceuticamente aceitável. Numa concretização, um kit compreende ainda instruções para a administração da composição (por exemplo, o anticorpo antagonista) a um indivíduo.
As integrinas beta7 e seus ligandos são variadamente expressas em estados de doença. [A expressão de MAdCAM-1 no endotélio intestinal é aumentada em locais de inflamação mucosa em pacientes com doença inflamatória do intestino (CU e DC) e a lâmina própria colónica de pacientes de CU e DC também apresenta níveis aumentados de células CD3+ e a4b7+ comparativamente com controlos IBS (veja-se Souza H., et al., Gut 45:856 (1999)). Observou-se que a expressão de MAdCAM-1 está associada com inflamação do tracto portal em doenças do fígado e pode ser importante no recrutamento de linfócitos alfa4beta7+ para o fígado durante a inflamação. (Hillan, K., 30
ΕΡ 1 784 426 PT et al., Liver, 19(6):509-18 (1999)). A MAdCAM-1 em vasos hepáticos suporta a adesão de linfócitos a4b7+ de pacientes com DII e colangite esclerosante primária. A adesão foi inibida por anticorpos anti-MAdCAM-1, anti-alfa4beta7 ou anti-alfa4. (Grant AJ. et ai., Hepatology. 33(5):1065-72 (2001)). A MAdCAM-1, a VCAM-1 e a E-caderina são expressas em células do endotélio cerebral e/ou em microvasos no sistema nervoso central inflamado. As integrinas beta7 contribuem para a doença desmielinizante do SNC (Kanwar et al., J.
Neuroimmunology 103, 146 (2000)). A expressão de alfa4beta7 foi significativamente superior nos LPL de DC do gue em controlos e pacientes com CU (Oshitani, N. et ai.
International Journal of Molecule Medicine 12, 715-719 (2003) ) . Os IEL de pacientes de DC podem ser cronicamente estimulados e recrutados da periferia (Meresse, B., et al., Human Immunology, 62, 694-700 (2001)). Na doença hepática humana, células T alfaEbeta7 (CD4+ e CD8+) são preferencialmente acumuladas em fígados humanos onde a E-caderina é expressa em hepatócitos e no epitélio do dueto biliar (Shimizu, Y., et al., Journal of Hepatology 39, 918-924 (2003)) . Na pancreatite crónica, células T CD8+CD103+, análogas aos linfócitos intra-epiteliais intestinais, infiltram-se no pâncreas na pancreatite crónica (Matthias, P., et ai., Am J Gastroenterol 93:2141-2147 (1998)). É encontrada supra-regulação de alfaEbeta7 em pacientes de lúpus eritematoso sistémico com envolvimento epitelial específico (Pang et al. , Arthritis & Rheumatism 41:1456-1463 (1998)). Na Síndrome de Sjogren, células T CD8+ alfaEbeta7+ aderem e matam células epiteliais acinares por indução de apoptose (Kroneld et al. , Scand J Rheumatol 27:215-218, 1998) . As integrinas alfa4beta7 e alfaEbeta7 desempenham um papel no epidermotropismo de células T durante a inflamação cutânea e contribuem para a rejeição de aloenxertos cutâneos (Sun et al., Transplantation 74, 1202, 2002). Teraki e Shiohara demonstraram a expressão preferencial de integrina aEb7 em células T CD8+ na epiderme psoriásica (Teraki e Shiohara, Br. J. Dermatology 147, 1118, 2002) . Os linfócitos T da expectoração são IEL activados (CD69+ CD 103+) em indivíduos com asma, DPOC e em indivíduos normais (Leckie et al., Thorax 58, 23, 2003) . Os CTL CD103+ (aEb7+) acumulam-se com epitélio de enxertos durante a rejeição de aloenxerto renal clínico (Hadley et al. , Transplantation 72, 1548, 2001)]. Assim, num 31 ΕΡ 1 784 426 PT aspecto, a invenção proporciona a utilização de um anticorpo antagonista de beta7 da invenção para inibir a interacção integrina beta7-ligando para reduzir ou aliviar uma doença, tal como um ou mais dos estados de doença descritos acima. Numa concretização, o anticorpo da invenção é utilizado na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como uma doença inflamatória incluindo, sem limitação, uma doença inflamatória do intestino (tal como doença de Crohn e colite ulcerativa), doença hepática inflamatória, inflamação do SNC, pancreatite crónica, lúpus eritematoso sistémico, Sindrome de Sjogren, psoriase e inflamação cutânea, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), doença pulmonar intersticial, alergia, doença auto-imune, rejeição de transplantações, rejeição de enxerto renal, doença de enxerto versus hospedeiro, diabetes e cancro. É aqui descrita a utilização de um ácido nucleico na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como uma desordem imunitária (tal como auto-imune ou inflamatória) incluindo, sem limitação, uma doença inflamatória do intestino (tal doença de Crohn ou colite ulcerativa) e reacção alérgica (tal como desordens do sistema respiratório, da pele, das articulações, asma alérgica e de outros órgãos afectados por reacção alérgica mediada por uma integrina contendo beta7). É também aqui descrita a utilização de um vector de expressão na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como uma desordem imunitária (tal como auto-imune ou inflamatória) incluindo sem limitação, uma doença inflamatória do intestino (tal como doença de Crohn ou colite ulcerativa) e uma reacção alérgica (tal como desordens do sistema respiratório, da pele, das articulações e de outros órgãos afectados por reacção alérgica mediada por uma integrina contendo beta7). É também aqui descrita a utilização de uma célula hospedeira na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como uma desordem imunitária (tal como auto-imune ou inflamatória) incluindo, sem limitação, uma doença inflamatória do intestino 32 ΕΡ 1 784 426 PT (tal como doença de Crohn ou colite ulcerativa) e uma reacção alérgica (tal como desordens do sistema respiratório, da pele, das articulações e de outros órgãos afectados por reacção alérgica mediada por uma integrina contendo beta7). É aqui descrita a utilização de um artigo de fabrico na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como uma desordem imunitária (tal como auto-imune ou inflamatória) incluindo, sem limitação, uma doença inflamatória do intestino (tal como doença de Crohn ou colite ulcerativa) e uma reacção alérgica (tal como desordens do sistema respiratório, da pele, das articulações e de outros órgãos afectados por reacção alérgica mediada por uma integrina contendo beta7). É aqui descrita a utilização de um kit na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença, tal como uma desordem imunitária (tal como auto-imune ou inflamatória) incluindo, sem limitação, uma doença inflamatória do intestino (tal como doença de Crohn ou colite ulcerativa) e uma reacção alérgica (tal como desordens do sistema respiratório, da pele, das articulações e de outros órgãos afectados por reacção alérgica mediada por uma integrina contendo beta7). A invenção proporciona anticorpos, fragmentos de ligação e composições úteis para a modulação de estados de doença associados a desregulação do processo de interacção célula-célula mediado por integrina beta7. As integrinas beta7 estão envolvidas em múltiplas funções biológicas e fisiológicas, incluindo, por exemplo, desordens inflamatórias e reacções alérgicas. Assim, num aspecto, o método compreende a administração a um indivíduo de um anticorpo da invenção.
Num aspecto, a invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento de ligação para utilização num método de inibição da inflamação mediada por integrina beta7, o referido método compreendendo o contacto de uma célula ou um tecido com uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, pelo que é inibida a interacção e ligação de linfócitos ou células B com uma célula que expressa integrina beta7. 33
ΕΡ 1 784 426 PT
Num aspecto, a invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento de ligação para utilização num método de tratamento de uma condição patológica associada a desregulação da ligação de integrina beta7 num indivíduo, o referido método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, pelo que é tratada a referida condição.
Num aspecto, a invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento de ligação para utilização num método de inibição da ligação de um linfócito que expressa um ligando de integrina beta7 (tal como uma célula que expressa MAdCAM, VCAM, E-caderina ou fibronectina) a uma célula que expressa integrina beta7 (tal como as integrinas alfa4beta7 ou alfaEbeta7), o referido método compreendendo o contacto da referida célula com um anticorpo da invenção, desse modo inibindo ou prevenindo a adesão das células e provocando uma redução da reacção inflamatória.
Num aspecto, a invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento de ligação para utilização num método para tratamento ou prevenção de uma desordem inflamatória associada com expressão ou actividade aumentadas de integrina beta7 ou interacção aumentada entre uma integrina beta7 numa célula e um receptor de integrina beta7 em outra célula, o referido método compreendendo a administração a um indivíduo necessitado desse tratamento de uma quantidade eficaz de um anticorpo da invenção, desse modo tratando ou prevenindo eficazmente a referida desordem inflamatória. Numa concretização, a referida desordem inflamatória é uma doença inflamatória do intestino (DII). Em outra concretização, a referida desordem inflamatória é uma reacção alérgica.
Os anticorpos ou fragmentos de ligação da invenção podem ser utilizados para afectar qualquer estado patológico adequado, por exemplo, células e/ou tecidos associados a desregulação da via de ligação da integrina beta7. As integrinas beta7 são expressas principalmente em leucócitos (Tidswell, M. et al. (1997) supra). Numa concretização, um leucócito é o alvo num método da invenção e é impedido de se ligar a uma célula que expressa um ligando da integrina beta7. Por exemplo, um linfócito intra-epitelial que expressa 34
ΕΡ 1 784 426 PT E-caderina é impedido, de acordo com a invenção, de se ligar a uma célula que expressa alfaEbeta7, por um anticorpo antagonista anti-beta7. As células que expressam MAdCAM, VCAM-1 ou fibronectina são impedidas por um anticorpo antagonista anti-beta7 da invenção de se ligar a um leucócito que expressa alfa4beta7.
Os métodos da invenção podem ainda compreender passos adicionais de tratamento. Por exemplo, numa concretização, um método compreende ainda um passo em que uma célula e/ou tecido alvo (por exemplo, uma célula endotelial do revestimento intestinal) são expostos a um anticorpo anti-TNF ou a um agente terapêutico de molécula pequena incluindo, sem limitação, compostos 5-ASA (incluindo sem limitação,
Como aqui descrito, as integrinas beta7 medeiam importantes processos biológicos cuja desregulação conduz a numerosas condições patológicas. Deste modo, numa concretização de métodos da invenção, o alvo é uma célula (por exemplo, uma célula endotelial) em que a adesão de uma célula que expressa um ligando de integrina beta7 de uma integrina beta7 (onde a célula pode ser, sem limitação, um linfócito e o ligando pode ser MAdCAM, VCAM ou E-caderina) é destruída, inibida ou prevenida em comparação com as células na ausência do anticorpo antagonista anti-beta7 da invenção. Numa concretização, um método da invenção inibe o alojamento ("homing") de linfócitos, desse modo inibindo a inflamação no local de expressão de integrina beta7. Por exemplo, o contacto com um antagonista da invenção pode resultar na incapacidade de uma célula aderir a uma célula que expressa um ligando de uma integrina beta7.
BREVE DESCRIÇÃO DOS ESQUEMAS
As FIG. IA e 1B representam o alinhamento de sequências das cadeias variáveis leve e pesada para as seguintes: sequência de consenso da cadeia leve humana do subgrupo capa I (Fig. IA, SEQ ID NO:23), sequência de consenso da cadeia pesada humana do subgrupo III (Fig. 1B, SEQ ID NO:24), cadeia variável leve do anticorpo de rato anti-beta7 de ratinho (Fib504) (Fig. IA, SEQ ID NO: 10), cadeia variável pesada do anticorpo de rato anti-beta7 de ratinho (Fib504) (Fig. 1B, SEQ ID NO:11), e variantes humanizadas do anticorpo: cadeia leve 35 ΕΡ 1 784 426 PT variável humanizada com enxerto hu504K (Fig. IA, SEQ ID NO:25), cadeia pesada variável humanizada com enxerto hu504K (Fig. 1B, SEQ ID NO:26), variante hu504.5 (as variações de aminoácidos do enxerto hu504K humanizado estão indicadas na Fig. IA (cadeia leve) e na Fig. 1B (cadeia pesada) para variantes hu504.5, hu504.16 e hu504.32. As substituições de aminoácidos adicionais nas HVR-H1 e HVR-H2 do enxerto hu504K que resultaram em anticorpos de ligação a beta7 estão indicadas na Fig. 1C.
As FIG. 2A e 2B representam a sequência de comprimento completo da sequência de consenso humana do subgrupo III de cadeia leve (Fig. 2A, SEQ ID NO:27) e da cadeia pesada (Fig. 2B, SEQ ID NO:28). As HVR estão sublinhadas.
As FIG. 3A e 3B representam a sequência de comprimento completo das regiões hipervariáveis de Fib504 de rato contendo o enxerto humanizado 504 (como aqui descrito) enxertado na sequência de consenso humana capa I da cadeia leve (Fig. 3A, SEQ ID NO: 29) e na sequência de consenso humana do subgrupo III da cadeia pesada (Fig. 3B, SEQ ID NO:30). As HVR estão sublinhadas.
As FIG. 4A e 4B representam a sequência de comprimento completo do enxerto humanizado 504K em que a posição 49 da cadeia leve do enxerto hu504 é uma substituição Y49K. A cadeia leve do enxerto hu504K está representada pela SEQ ID NO:31 e a cadeia pesada do enxerto hu504K está representada pela SEQ ID NO:30. As HVR estão sublinhadas.
As FIG. 5A e 5B representam a sequência de comprimento completo do enxerto hu504K-RF em que as posições 71 e 78 da cadeia pesada do enxerto hu504 são uma substituição A71R e uma substituição A78F da sequência do enxerto hu504K. A cadeia leve do enxerto hu504K-RF está representada pela SEQ ID NO:31 e a cadeia pesada do enxerto hu504K-RF está representada por SEQ ID NO:32. As HVR estão sublinhadas.
As FIG. 6A e 6B representam a sequência de comprimento completo da variante hu504.32 compreendendo a cadeia pesada do enxerto hu504K-RF (SEQ ID NO:32) e as substituições T31D e 36
ΕΡ 1 784 426 PT Y32L na cadeia leve do enxerto hu504K (SEQ ID NO: 33) . As HVR estão sublinhadas.
As FIG. 7A-FIG. 7B e as FIG. 8A -FIG. 8B representam exemplos de sequências de esqueleto de consenso humanas aceitadoras para utilização na prática da presente invenção com identificadores de sequência como se segue:
Esqueletos de consenso variáveis leves (VL) (FIG. 7A,B)
esqueleto de consenso VL do subgrupo I capa humano (SEQ ID NO:14) esqueleto de consenso VL do subgrupo I capa humano menos a HVR-L2 alargada (SEQ ID NO: 15) esqueleto de consenso VL do subgrupo II capa humano (SEQ ID NO:16) esqueleto de consenso VL do subgrupo III capa humano (SEQ ID NO:17) esqueleto de consenso VL do subgrupo IV capa humano (SEQ ID NO:18)
As regiões sombreadas representam a HVR da cadeia leve (indicadas como Ll, L2 e L3).
Esqueletos de consenso variáveis pesados (VH) (FIG. 8A, B) esqueleto de consenso VH do subgrupo I humano menos as CDR de Kabat (SEQ ID NO:19) esqueleto de consenso VH do subgrupo I humano menos as regiões hipervariáveis alargadas (SEQ ID NO:20-22) esqueleto de consenso VH do subgrupo II humano menos as CDR de Kabat (SEQ ID NO:48) esqueleto de consenso VH do subgrupo II humano menos as regiões hipervariáveis alargadas (SEQ ID NO:49-51) esqueleto de consenso VH do subgrupo III humano menos as CDR de Kabat (SEQ ID NO:52) esqueleto de consenso VH do subgrupo III humano menos as regiões hipervariáveis alargadas (SEQ ID NO:53-55)
esqueleto aceitador VH humano menos as CDR de Kabat (SEQ ID NO:56) 37 ΕΡ 1 784 426 PT esqueleto aceitador VH humano menos as regiões hipervariáveis alargadas (SEQ ID NO:57-58)
esqueleto aceitador 2 VH humano menos as CDR de Kabat (SEQ ID NO:59) esqueleto aceitador 2 VH humano menos hipervariáveis alargadas (SEQ ID NO:60-62) as regiões
As FIG. 9A e 9B representam uma sequência de aminoácido das cadeias variáveis de anticorpo Fib504 de rato anti-integrina beta7 de ratinho produzido pelo hibridoma ATCC HB-293. As HVR estão sublinhadas. A cadeia leve variável está representada na Fig. 9A (SEQ ID NO: 12) e a cadeia pesada variável está representada na Fig. 9B (SEQ ID NO:13). A FIG. 10A representa as posições de aminoácidos na cadeia pesada de várias sequências de consenso (subgrupos I-III hu) . A sequência de consenso utilizada para o desenvolvimento do anticorpo anti-HER2 Herceptin®, os esqueletos de Fib504 de rato e hu504-RL e hu504-RF de rato estão descritos nos Exemplos aqui. A Fig. 10B é um gráfico de barras que mostra a ligação relativa de alfa4beta7 a anticorpo com enxerto hu504 e anticorpo com enxerto hu504K em função de modificações no esqueleto "RL" ou "RF" como descrito no Exemplo 1. FIG. 11A-11C. A FIG. 11A tabula as alterações nas HVR resultantes da maturação por afinidade realizada oferecendo uma gama limitada de substituições de aminoácidos na variante hu504.16. Os resultados são de bibliotecas com HVR modificadas individualmente na variante hu504.16 como aqui descrito no Exemplo 2. As abreviaturas de aminoácidos em caixas são aminoácidos encontrados mais frequentemente nos anticorpos de ligação a beta7 (anticorpos seleccionados em fagos). As FIG. 11B e 11C são gráficos de barras dos resultados na Fig. 11A indicando o número e tipo de substituições de aminoácidos na variante hu504.16 (cadeia leve, Fig. 11B; cadeia pesada, Fig. 11C) detectáveis pelos métodos de mutagénese e selecção do Exemplo 2. A FIG. 12 entabula os resultados da mutação por afinidade realizada oferecendo uma gama ampla de possíveis substituições de aminoácidos na HVR da variante hu504.32 como descrito no 38
ΕΡ 1 784 426 PT
Exemplo 2. As caixas sombreadas indicam o aminoácido que foi detectado mais frequentemente em anticorpos detectados como anticorpos de ligação a beta7 pelos métodos de mutagénese e selecção do Exemplo 2. A FIG. 13 representa sequências de HVR de Fib504 de rato anti-ratinho (ATCC-293) e do consenso humano (colunas da esquerda). Estão mostrados à direita exemplos de substituições de aminoácidos observadas para cada posição da HVR (não significando uma limitação) pelos ensaios descritos nos Exemplos (substituições de aminoácidos observadas por randomização suave de aminoácidos, varrimento amplo de substituição de aminoácidos e varrimento limitado de substituição de aminoácidos) (um método útil de modificação de HVR para a humanização, aplicável a variantes da presente invenção, encontra-se no pedido de patente norte-americano com número de série 60/545,840, apresentado em 19 de Fevereiro, 2004) . A FIG. 14 é uma representação gráfica exemplificativa da ligação de Fib504 e do anticorpo variante a MAdCAM em função da concentração de anticorpo como descrito no Exemplo 3. Foram determinados os valores de IC50 e IC90 para os anticorpos. A FIG. 15 representa as sequências de aminoácidos das HVR da cadeia leve e pesada para o anticorpo anti-beta7 504.32R em relação à posição de acordo com o sistema de numeração de Kabat e um sistema de numeração relativa (A-F) para as seis HVR do anticorpo. Os aminoácidos nas posições 71, 73 e 78 da região FR3 da cadeia pesada estão também representados. Estão também indicadas substituições de aminoácidos úteis para muitas das posições nas HVR ou na região FR3 da cadeia pesada. A FIG. 16 mostra gráficos de barras da capacidade relativa dos anticorpos 504.32M e 504.32R para bloquearem o alojamento ("homing") de células T radiomarcadas no cólon de ratinhos com doença inflamatória do intestino. MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO Técnicas Gerais A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia 39
ΕΡ 1 784 426 PT molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que fazem parte dos conhecimentos de um perito na especialidade. Estas técnicas estão completamente explicadas na literatura, como em, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook et al. , 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J.
Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987 e actualizações periódicas); "PCR: The Polymerase
Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage
Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001) .
Definições
Por "subunidade beta7" ou "subunidade β7" entenda-se a subunidade de integrina β7 humana (Erle et al. , (1991) J.
Blol. Chem. 266:11009-11016). A subunidade beta7 associa-se à subunidade alfa4 da integrina, tal como à subunidade a4 humana (Kilger e Holzmann (1995) J. Mol. Blol. 73:347-354). A integrina alfa4beta7 é expressa numa maioria de linfócitos maduros, assim como numa pequena população de timócitos, células da medula óssea e mastócitos. (Kilshaw e Murant (1991) Eur. J. Immunol. 21:2591-2597; Gurish et al. , (1992) 149: 1964-1972; e Shaw, S.K. e Brenner, M.B. (1995) Semin. Immunol. 7:335). A subunidade beta7 também se associa com a subunidade alfaE, tal como a subunidade alfaE de integrina humana (Cepek, K.L, et al. (1993) J. Immunol. 150:3459). A integrina alfaEbeta7 é expressa em linfócitos epiteliais intra-intestinais (iIEL) (Cepek, K.L. (1993) supra). A subunidade beta7 que se liga ao anticorpo humanizado anti-beta7 da invenção pode ser de ocorrência natural e pode ser solúvel ou estar localizado na superfície de uma célula.
Por "subunidade alfaE" ou "subunidade alfaE de integrina" ou "subunidade aE" ou "subunidade de integrina aE" ou "CD103" entenda-se uma subunidade de integrina que se verificou estar associada a integrina beta7 em linfócitos intra-epiteliais, em que a integrina alfaEbeta7 medeia a ligação dos iIEL ao epitélio intestinal que expressa E-caderina (Cepek, K.L. et al. (1993) J. Immunol. 150:3459; Shaw, S.K. e Brenner, M.B. (1995) Semin. Immunol. 7:335). 40
ΕΡ 1 784 426 PT "MAdCAM" ou "MAdCAM-1" são utilizados indiferentemente no contexto da presente invenção e referem-se à proteína molécula-1 de adesão celular de adressina mucosa, que é um polipéptido de cadeia simples compreendendo uma cauda citoplasmática curta, uma região transmembranar e uma sequência extracelular composta por três domínios semelhantes a imunoglobulina. Os ADNc para MAdCAM-1 murina, humana e de macaco foram clonados (Briskin, et al., (1993) Nature, 363:461-464; Shyjan et al., (1996) J. Immunol. 156:2851-2857). "VCAM-1" ou "molécula-1 de adesão celular vascular" "CD106" referem-se a um ligando de alfa4beta7 e alpha4betal, expresso em endotélio activado e importante em interacções endotélio-leucócito tais como a ligação e a transmigração de leucócitos durante a inflamação. "E-caderina" refere-se a um membro da família das caderinas, onde a E-caderina é expressa em células epiteliais. A E-caderina é um ligando da integrina alfaEbeta7 e medeia a ligação de alfaEbeta7 expressa por iEL ao epitélio intestinal, embora a sua função no alojamento de linfócito não seja clara (A expressão de E-caderina é supra-regulada por TGF-betal. "Fibronectina" refere-se a fibronectina que está envolvida na reparação de tecidos, na embriogénese, na coagulação sanguínea e na migração/adesão celular. Serve como ligante na ECM (matriz extracelular) e como dímero encontrado no plasma (fibronectina plasmática). A forma plasmática é sintetizada por hepatócitos, enquanto a forma na ECM é feita por fibroblastos, condrócitos, células endoteliais, macrófagos, assim como certas células epiteliais. Neste contexto, interactua com a integrina alfa4beta7 para mediar aspectos do alojamento ou adesão de linfócitos. A forma na ECM da fibronectina serve como molécula de adesão celular geral por ancoragem de células a substratos de colagénio ou proteoglicano. A fibronectina também pode servir para organizar a interacção celular com a ECM por ligação a diferentes componentes da matriz extracelular e a receptores de fibronectina ligados à membrana nas superfícies celulares. Finalmente, a fibronectina é importante em eventos de migração celular durante a embriogénese. 41
ΕΡ 1 784 426 PT
As "desordens inflamatórias gastrointestinais" são um grupo de desordens crónicas que causam inflamação e/ou ulceração na membrana mucosa. Estas desordens incluem, por exemplo, doença inflamatória do intestino (e.g., doença de Crohn, colite ulcerativa, colite indeterminada e colite infecciosa), mucosite (e.g., mucosite oral, mucosite gastrointestinal, mucosite nasal e proctite), enterocolite necrotizante e esofagite. "Doença inflamatória do intestino" ou "DII" são aqui utilizadas indiferentemente para referir doenças do intestino que causam inflamação e/ou ulceração e incluem, sem limitação, doença de Crohn e colite ulcerativa. "Doença de Crohn (DC)" ou "colite ulcerativa (CU)" são doenças inflamatórias intestinais crónicas de etiologia desconhecida. A doença de Crohn, ao contrário da colite ulcerativa, pode afectar qualquer parte do intestino. A caracteristica mais proeminente da doença de Crohn é o espessamento edematoso granular, avermelhado-púrpura da parede do intestino. Com o desenvolvimento da inflamação, estes granulomas frequentemente perdem as suas fronteiras circunscritas e integram-se no tecido circundante. Diarreia e obstrução do intestino são as caracteristicas clinicas predominantes. Tal como com a colite ulcerativa, o decurso da doença de Crohn pode ser continuo ou recidivante, moderado ou grave, mas ao contrário da colite ulcerativa, a doença de Crohn não é curável por ressecção do segmento de intestino envolvido. A maioria dos pacientes com doença de Crohn requerem cirurgia em algum momento, mas a subsequente recidiva é comum e é usual um tratamento médico continuo. A doença de Crohn pode envolver qualquer parte do tracto alimentar desde a boca ao ânus, embora tipicamente surja nas regiões ileo-cólica, do intestino delgado ou colónico-ano-rectal. Histopatologicamente, a doença manifesta-se por granulomatomas descontínuos, abcessos na cripta, fissuras e úlceras aftosas. 0 infiltrado inflamatório é misto, consistindo em linfócitos (tanto células T como B) , células plasmáticas, macrófagos e neutrófilos. Existe um aumento 42
ΕΡ 1 784 426 PT desproporcionado de células plasmáticas que segregam IgM e IgG, macrófagos e neutrófilos.
Os fármacos anti-inflamatórios sulfasalazina e ácido 5- aminossalissilico (5-ASA) são úteis para o tratamento da doença de Crohn colónica moderadamente activa e são vulgarmente prescritos para manter a remissão da doença. 0 metroidazole e a ciprofloxacina são similares em eficácia à sulfasalazina e parecem ser particularmente úteis para o tratamento de doença perianal. Em casos mais graves, corticosteróides são eficazes no tratamento de exacerbações activas e podem mesmo manter a remissão. A azatioprina e a 6- mercaptopurina apresentaram também sucesso em pacientes que requerem a administração crónica de corticosteróides. É também possível que estes fármacos possam desempenhar um papel na profilaxia de longo prazo. Infelizmente, pode haver um atraso bastante longo (até seis meses) antes do início da acção em alguns pacientes. Fármacos antidiarreicos podem também proporcionar alívio sintomático em alguns pacientes. A terapia nutricional ou a dieta elementar podem melhorar o estado nutricional dos pacientes e induzir uma melhoria sintomática da doença aguda, mas não induzem remissões clínicas sustentadas. Os antibióticos são utilizados no tratamento de sobrecrescimento bacteriano no intestino delgado secundário e no tratamento de complicações piogénicas. A "colite ulcerativa (CU)" afecta o intestino grosso. 0 decurso da doença pode ser contínuo ou recidivante, moderado ou grave. A primeira lesão a surgir é uma infiltração inflamatória com formação de abcessos na base das criptas de Lieberkuhn. A coalescência destas criptas distendidas e com ruptura tende a separar a mucosa sobrejacente do seu fornecimento sanguíneo, conduzindo a ulceração. Os sintomas da doença incluem cólicas, dor abdominal inferior, sangramento rectal e descargas soltas frequentes consistindo principalmente em sangue, pus e muco com partículas fecais escassas. Pode ser necessária uma colectomia total para a colite ulcerativa aguda, grave ou crónica, perseverante. 43
ΕΡ 1 784 426 PT
As caracteristicas clinicas da CU são muito variáveis e o inicio pode ser insidioso ou abrupto e pode incluir diarreia, tenesmo e sangramento rectal recidivante. Com envolvimento fulminante da totalidade do cólon, megacólon tóxico, pode ocorrer uma emergência com risco de vida. As manifestações extra-intestinais incluem artrite, piodermite gangrenosa, uveite e eritema nodoso. 0 tratamento da CU inclui sulfasalazina e fármacos relacionados contendo salicilato para casos moderados e fármacos corticosteróides nos casos graves. A administração tópica tanto de salicilatos como de corticosteróides é por vezes eficaz, particularmente quando a doença está limitada ao intestino distai e está associada a efeitos secundários diminuídos em comparação com o uso sistémico. Medidas de suporte tais como a administração de ferro e agentes antidiarreicos estão por vezes indicados. Azatioprina, 6-mercaptopurina e metotrexato são por vezes também prescritos para utilização nos casos refractários dependentes de corticosteróides.
Uma "modificação" de um resíduo/posição de aminoácido, como aqui se utiliza, refere-se a uma alteração de uma sequência de aminoácidos primária em comparação com uma sequência de aminoácidos de partida, em que a alteração resulta de uma alteração da sequência que envolve os referidos resíduos/posições de aminoácido. Por exemplo, modificações típicas incluem a substituição do resíduo (ou nessa posição) por outro aminoácido (e.g., uma substituição conservativa ou não conservativa) , a inserção de um ou mais (geralmente menos de 5 ou 3) aminoácidos adjacentes ao referido resíduo/posição e a deleção do referido resíduo/posição. Uma "substituição de aminoácido" ou sua variação, referem-se à substituição de um resíduo de aminoácido existente numa sequência de aminoácidos predeterminada (de partida) por um resíduo de aminoácido diferente. Geralmente, e preferivelmente, a modificação resulta na alteração de pelo menos uma actividade físico-bioquímica do polipéptido variante comparativamente com um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos de partida (ou de "tipo selvagem"). Por exemplo, no caso de um anticorpo, a actividade físico-bioquímica que é alterada pode 44 ΕΡ 1 784 426 PT ser a afinidade de ligação, a capacidade de ligação e/ou o efeito da ligação numa molécula alvo. 0 termo "aminoácido", no âmbito da presente invenção, é utilizado no seu sentido mais amplo e pretende incluir os L a-aminoácidos ou resíduos de ocorrência natural. São aqui utilizadas as abreviaturas de uma e de três letras vulgarmente utilizadas para os aminoácidos de ocorrência natural (Lehninger, A.L., Biochemistry, 2d ed., pp. 71-92, (Worth Publishers, New York, New York, 1975). 0 termo inclui D-aminoácidos assim como aminoácidos quimicamente modificados tais como análogos de aminoácidos, aminoácidos de ocorrência natural que não estão usualmente incorporados em proteínas tais como norleucina e compostos quimicamente sintetizados possuindo propriedades conhecidas na especialidade como sendo características de um aminoácido. Por exemplo, análogos ou miméticos de fenilalanina ou prolina, que permitem a mesma restrição conformacional dos compostos peptídicos que a Phe ou a Pro naturais estão incluídos na definição de aminoácido. Estes análogos e miméticos são aqui referidos como "equivalentes funcionais" de um aminoácido. Outros exemplos de aminoácidos estão enumerados por Roberts e Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Gross e Meiehofer, Eds., Vol. 5, p. 341 (Academic Press, Inc., New York, New York, 1983), que é aqui incorporado por referência. Quando se utiliza a abreviatura de uma letra para designar um dos aminoácidos de ocorrência natural, as designações são como vulgarmente encontradas na literatura relevante (veja-se, por exemplo, Alberts, B. et al. Molecular Biology of the Cell, 3rd ed., Garland Publishing, Inc. 1994, página 57).
Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações em diagnóstico ou terapêuticas do anticorpo e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Nas concretizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) em mais de 95% em peso de anticorpo como determinado pelo método de Lowry e mais preferivelmente em mais de 99% em peso, (2) num grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminais ou internos por 45 ΕΡ 1 784 426 PT utilização de um sequenciador de taça rotativa ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando coloração com azul de Coomassie ou, preferivelmente, com prata. Um anticorpo isolado inclui o anticorpo in sítu no interior de células recombinantes pois pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Vulgarmente, contudo, o anticorpo isolado será preparado com pelo menos um passo de purificação. A expressão "numeração de resíduos do domínio variável segundo Kabat" ou "numeração de posições de aminoácidos segundo Kabat" e suas variações, referem-se ao sistema de numeração utilizado para os domínios variáveis da cadeia pesada ou domínios variáveis da cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Utilizando este sistema de numeração, a sequência linear de aminoácidos actual pode conter menos aminoácidos ou aminoácidos adicionais correspondentes a um encurtamento de, ou a uma inserção em, uma FR ou uma CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável da cadeia pesada pode incluir uma inserção de um único aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (e.g. resíduos 82a, 82b e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 da FR da cadeia pesada. A numeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada para um determinado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência "padrão" numerada segundo Kabat. A frase "substancialmente similar" ou "substancialmente idêntico", como aqui se utiliza, denota um grau suficientemente elevado de similaridade entre dois valores numéricos (geralmente um associado a um anticorpo da invenção e o outro associado a um anticorpo de referência/comparador) tal que um perito na especialidade considerará a diferença entre os dois valores com pouco ou nenhum significado biológico e/ou estatístico no contexto das características biológicas medidas pelos referidos valores (e.g., valores de Kd). A diferença entre os referidos dois valores é preferivelmente inferior a cerca de 50%, preferivelmente inferior a cerca de 40%, preferivelmente inferior a cerca de 46 ΕΡ 1 784 426 PT 30%, preferivelmente inferior a cerca de 20%, preferivelmente inferior a cerca de 10% em função do valor para o anticorpo de referência/comparador. "Afinidade de ligação" refere-se genericamente à força da soma total de interacções não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (e.g. , um anticorpo) e o seu parceiro de ligação (e.g., um antigénio). A menos que indicado em contrário, como aqui se utiliza, "afinidade de ligação" refere-se a afinidade de ligação intrínseca que reflecte uma interacção 1:1 entre membros de um par de ligação (e.g., anticorpo e antigénio). A afinidade de uma molécula X pelo seu parceiro Y pode genericamente ser representada pela constante de dissociação (Kd) . A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na especialidade, incluindo os aqui descritos. Anticorpos de baixa afinidade geralmente ligam o antigénio lentamente e tendem a dissociar-se rapidamente, enquanto anticorpos de alta afinidade geralmente ligam-se ao antigénio mais rapidamente e tendem a permanecer ligados mais tempo. São conhecidos na especialidade uma variedade de métodos de medição da afinidade de ligação, podendo ser utilizados quaisquer deles para os fins da presente invenção. Concretizações especificas ilustrativas estão descritas adiante.
Numa concretização, a "Kd" ou "valor de Kd" de acordo com a presente invenção mede-se através de um ensaio de ligação com um antigénio radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e o seu antigénio como descrito pelo seguinte ensaio que mede a afinidade de ligação em solução dos Fab para com o antigénio por equilíbrio de Fab com uma concentração mínima de antigénio marcado com (125I) na presença de uma série de títulos de antigénio não marcado, e posterior captura do antigénio ligado com uma placa revestida de anticorpo anti-Fab (Chen, et al. , (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para estabelecer condições para o ensaio, placas de microtítulo (Dynex) são revestidas durante a noite com 5 ug/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio 50 mM (pH 9, 6) e subsequentemente são bloqueadas com albumina sérica bovina a 2% (p/v) em PBS durante duas a cinco horas à temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Numa placa não adsorvente (Nunc 47
ΕΡ 1 784 426 PT #269620), misturam-se 100 pM ou 26 pM de [ 125I]-antigénio com diluições em série de um Fab de interesse (e.g., consistente com a avaliação de um anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al. , (1997) Câncer Res. 57:4593-4599). O Fab de interesse é depois incubado durante a noite; contudo, a incubação pode continuar durante um período mais longo (e.g., 65 horas) para assegurar que é atingido o equilíbrio. Posteriormente, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente (e.g., durante uma hora). A solução é depois removida e a placa é lavada oito vezes com Tween-20 a 0,1% em PBS. Quando as placas estão secas, adicionam-se 150 ul/poço de cintilante (MicroScint-20; Packard) e contam-se as placas num contador gama Topcount (Packard) durante dez minutos. As concentrações de cada Fab que originam menos ou 20% da ligação máxima são escolhidas para utilização em ensaios de ligação competitiva. De acordo com outra concretização a Kd ou valor de Kd mede-se utilizando ensaios de ressonância plasmónica de superfície utilizando um
TM TM BIAcore -2000 ou um BIAcore -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25C com chips CM5 com antigénio imobilizado a ~10 unidades de resposta (UR) . Resumidamente, os chips biossensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são activados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antigénio é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,8, para 5 ug/ml (~0,2 uM) antes da injecção a um caudal de 5 ul/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de resposta (UR) de proteína acoplada. Após a injecção de antigénio, injecta-se etanolamina 1M para bloquear grupos que não reagiram. Para medições cinéticas, injectam-se diluições em série de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) em PBS com Tween 20 a 0,05% (PBST) a 25°C a um caudal de aproximadamente 25 ul/min. As velocidades de associação (kon) e as velocidades de dissociação (koff) são calculadas utilizando um modelo simples de ligação de Langmuir de um-para-um (BIAcore Evaluation Software versão 3.2) simultaneamente ajustando o sensorgrama de associação e de dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) é calculada como a razão koff/kon. Veja-se, e.g., Chen, Y., et al. , (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Se a velocidade de associação exceder 106 M_1 S_1 no ensaio de ressonância plasmónica de superfície anterior, então a 48
ΕΡ 1 784 426 PT velocidade de associação pode ser determinada utilizando uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição na intensidade da emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm de passo de banda) a 25°C de um anticorpo anti-antigénio 20nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antigénio como medido num espectrómetro, tal como um espectrofotómetro equipado com interruptor de fluxo ("stop-flow") (Aviv Instruments) ou um espectrofotómetro série 8000 SLM-Aminco (ThermoSpectronic) com uma cuvete agitada.
Uma " on-rate" ou "velocidade de associação" ou "kon" de acordo com a presente invenção pode também ser determinada com a mesma técnica de ressonância plasmónica de superfície descrita acima utilizando um BIAcore”-2000 ou um BIAcore“-3000 (BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ) a 25C com chips CM5 com antigénio imobilizado a ~10 unidades de resposta (UR). Resumidamente, os chips biossensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são activados com cloridrato de AZ-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antigénio é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,8, para 5 ug/ml (~0,2uM) antes da injecção a um caudal de 5 ul/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de resposta (UR) de proteína acoplada. Após a injecção de etanolamina 1M para bloquear os grupos que não reagiram. Para medições cinéticas, injectam-se diluições em série de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) em PBS com Tween 20 a 0,05% (PBST) a 25°C a um caudal de aproximadamente 25 ul/min. A velocidades de associação (kon) e as velocidades de dissociação (koff) são calculadas utilizando um modelo simples de ligação de Langmuir de um-para-um (BIAcore Evaluation Software versão 3.2) ajustando simultaneamente o sensorgrama de associação e de dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) foi calculada como a razão koff/kon. Veja-se, e.g., Chen, Y., et al.r (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Contudo, se a velocidade de associação exceder 106 ET1 S_1 no ensaio de ressonância plasmónica de superfície anterior, então a velocidade de associação é preferivelmente determinada utilizando uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; 49
ΕΡ 1 784 426 PT emissão = 340 mti, 16 rnn de passo de banda) a 25°C de um anticorpo anti-antigénio 20 nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antigénio como medido num espectrómetro, tal como um espectrofotómetro equipado com interruptor de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotómetro série 8000 SLM-Aminco (ThermoSpectronic) com uma cuvete agitada. A "Kd" ou "valor de Kd" de acordo com a presente invenção mede-se, numa concretização, através de um ensaio de ligação com um antigénio radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab do anticorpo e a molécula de antigénio como descrito pelo seguinte ensaio que mede a afinidade de ligação em solução dos Fab para com o antigénio por equilíbrio de Fab com uma concentração mínima de antigénio marcado com (1251) na presença de uma série de títulos de antigénio não marcado, e posterior captura do antigénio ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Bíol 293:865-881). Para estabelecer as condições para o ensaio, revestem-se placas de microtítulo (Dynex) durante a noite com 5 ug/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio 50 mM (pH 9,6) e subsequentemente bloqueiam-se com albumina sérica bovina a 2% (p/v) em PBS durante duas a cinco horas à temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Numa placa não adsorvente (Nunc #269620), misturam-se 100 pM ou 26 pM de [125I] -antigénio com diluições em série de um Fab de interesse (consistente com a avaliação de um anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et ai., (1997) Câncer Res. 57:4593-4599) . 0 Fab de interesse é então incubado durante a noite; contudo, a incubação pode continuar durante um período mais longo (e.g., 65 horas) para assegurar que é atingido o equilíbrio. Posteriormente, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente durante uma hora. A solução é então removida e a placa é lavada oito vezes com Tween-20 a 0,1% em PBS. Quando as placas estão secas, adicionam-se 150 ul/poço de cintilante (MicroScint-20; Packard) e contam-se as placas num contador gama Topcount (Packard) durante dez minutos. As concentrações de cada Fab que originam menos ou 20% da ligação máxima são escolhidos para utilização em ensaios de ligação competitiva. De acordo com outra concretização, a Kd ou valor de Kd mede-se utilizando ensaios de ressonância plasmónica de superfície utilizando um BIAcore™-2000 ou um BIAcore”-3000 (BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ) a 25C com chips CM5 com 50 ΕΡ 1 784 426 PT antigénio imobilizado a ~10 unidades de resposta (UR). Resumidamente, chips biossensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são activados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antigénio é diluído com acetato de sódio lOmM, pH 4,8, para 5 ug/ml (~0,2 uM) antes da injecção a um caudal de 5 ul/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de resposta (UR) de proteína acoplada. Após a injecção de antigénio, injecta-se etanolamina 1M para bloquear os grupos que não reagiram. Para medições cinéticas, injectam-se diluições em série de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) em PBS com Tween 20 a 0,05% (PBST) a 25°C a um caudal de aproximadamente 25 ul/min. As velocidades de associação (kon) e as velocidades de dissociação (koff) são calculadas utilizando um modelo simples de ligação de Langmuir de um-para-um (BIAcore Evaluation Software versão 3.2) ajustando simultaneamente o sensorgrama de associação e de dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) é calculada como a razão koff/kon. Veja-se, e.g., Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Se a velocidade de associação exceder 106 M“ 1 S_1 no ensaio ressonância plasmónica de superfície anterior, então a velocidade de associação pode ser determinada utilizando uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição da intensidade da emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm de passo de banda) a 25°C de um anticorpo anti-antigénio 20nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antigénio como medido num espectrómetro, tal como um espectrofotómetro equipado com interruptor de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotómetro série 8000 SLM-Aminco (ThermoSpectronic) com uma cuvete agitada.
Numa concretização, uma "on-rate" ou "velocidade de associação" ou "kon" de acordo com a presente invenção é determinada com a mesma técnica de ressonância plasmónica de superfície descrita acima utilizando um BIAcore”-2000 ou um BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25C com chips CM5 com antigénio imobilizado a ~10 unidades de resposta (UR). Resumidamente, chips biossensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são activados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N- 51 ΕΡ 1 784 426 PT hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antigénio é diluído com acetato de sódio lOmM, pH 4,8, para 5 ug/ml (~0.2 uM) antes da injecção a um caudal de 5 ul/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de resposta (UR) de proteína acoplada. Após a injecção de etanolamina 1M para bloquear os grupos que não reagiram. Para medições cinéticas, injectam-se diluições em série de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) em PBS com Tween 20 a 0,05% (PBST) a 25°C a um caudal de aproximadamente 25 ul/min. As velocidades de associação (kon) e as velocidades de dissociação (koff) são calculadas utilizando um modelo simples de ligação de Langmuir de um-para-um (BIAcore Evaluation Software versão 3.2) ajustando simultaneamente o sensorgrama de associação e de dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) foi calculada como a razão k0ff/k0n. Veja-se, e.g., Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Contudo, se a velocidade de associação exceder ΙΟ6 1Γ1 S_1 no ensaio de ressonância plasmónica de superfície anterior, então a velocidade de associação é preferivelmente determinada utilizando uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição da intensidade da emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm de passo de banda) a 25°C de um anticorpo anti-antigénio 20nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antigénio como medido num espectrómetro, tal como um espectrofotómetro equipado com interruptor de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotómetro série 8000 SLM-Aminco (ThermoSpectronic) com uma cuvete agitada. A frase "substancialmente reduzido," ou "substancialmente diferente", como aqui se utiliza, denota um grau de diferença suficientemente elevado entre dois valores numéricos (geralmente, um associado a um anticorpo da invenção e o outro associado a um anticorpo de referência/comparador) tal que um perito na especialidade consideraria a diferença entre os dois valores como tendo significado estatístico no contexto das características biológicas medidas pelos referidos valores (e.g., valores de Kd, resposta de HAMA). A diferença entre os referidos dois valores é preferivelmente superior a cerca de 10%, preferivelmente superior a cerca de 20%, preferivelmente superior a cerca de 30%, preferivelmente superior a cerca de 52 ΕΡ 1 784 426 PT 40%, preferivelmente superior a cerca de 50% em função do valor para o anticorpo de referência/comparador. "Percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" em relação a uma sequência peptidica ou polipeptidica é definida como a percentagem de resíduos de aminoácido numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido na sequência peptidica ou polipeptidica específica, após alinhamento das sequências e introdução de hiatos, se necessário, para conseguir a percentagem máxima de identidade de sequência e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequências. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser conseguido de várias maneiras que fazem parte dos conhecimentos de um perito na especialidade, por exemplo, utilizando software de computador disponível ao público tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR) . Os peritos na especialidade podem determinar os parâmetros apropriados para medição do alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências que se estão a comparar. Para os presentes fins, contudo, os valores da % de identidade de sequência de aminoácidos são gerados utilizando o programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2, em que o código-fonte completo para o programa ALIGN-2 é proporcionado na Tabela A adiante. O programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2 é da autoria da Genentech, Inc. e o código-fonte apresentado na Tabela A adiante foi apresentado com documentação para o utilizador no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registado com o n.° de registo U.S. Copyright Registration TXU510087. O programa ALIGN-2 é disponibilizado ao público pela Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código-fonte proporcionado na Figura 8 adiante. O programa ALIGN-2 deverá ser compilado para utilização num sistema operativo UNIX, preferivelmente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Em situações em que o ALIGN-2 é empregue para comparações de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência 53 ΕΡ 1 784 426 PT de aminoácidos de uma determinada sequência de aminoácidos A relativamente a, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B (o que pode alternativamente ser refraseado como uma determinada sequência de aminoácidos A que possui ou compreende uma determinada % de identidade de sequência de aminoácidos relativamente a, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B) é calculada como se segue:
100 vezes a fracção X/Y onde X é o número de resíduos de aminoácido classificados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 nesse alinhamento do programa de A e B e onde Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Notar-se-á que quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequências de aminoácidos de A relativamente a B não será igual à % de identidade de sequências de aminoácidos de B relativamente a A. A menos que especificamente afirmado em contrário, todos os valores de % de identidade de sequências de aminoácidos aqui utilizados são obtidos como descrito no parágrafo imediatamente anterior utilizando o programa de computador ALIGN-2. 54
ΕΡ 1 784 426 PT rTabela A /1 2 AV /2 B 2/ /2 C 2/ I2 D2/ /2E 2/ /2 F 2/ /2 G 2/ 1 /2 * C-C increased from 12 to 15
* Z is average of EQ
* B is average of ND 2 match with stop is _M: stop-stop = 0; J (joker) match = 0 */ #defme _M -8 I2 value of a match with a stop 2í int _day[26][26] = { 12 ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ2/ { 2, 0,-2,0,0,-4, 1,-1,-1, 0,-1,-2,-1, 0,_M, 1, 0,-2, 1,1, 0,0,-6, 0,-3, 0}, { 0, 3,-4,3,2,-5,0, 1,-2, 0,0,-3,-2, 2,_M,-I, 1,0,0,0,0,-2,-5,0,-3, 1}, {-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2,0,-5,-6,-5,-4,_M,-3,-5,-4,0,-2,0,-2,-8,0,0,-5}, { 0, 3,-5,4,3,-6, 1, 1,-2,0, 0,-4,-3, 2,_M,-1,2,-1, 0,0,0,-2,-7,0,-4, 2}, { 0, 2,-5, 3,4,-5,0, 1,-2,0, 0,-3,-2,1,_M,-1, 2,-1, 0,0, 0,-2,-7,0,-4, 3}, {-4,-5,-4,-6,-5,9,-5,-2, 1, 0,-5, 2,0,Λ_>1,-5,-5,-4,-3,-3,0,-1,0,0, 7,-5}, { 1, 0,-3, 1,0,-5, 5,-2,-3,0,-2,-4,-3, 0,31,-1,-1,-3,1,0, 0,-1,-7, 0,-5, 0}, 55
ΕΡ 1 784 426 PT /* Η *1 {-1, 1,-3, 1,1,-2,-2, 6,-2, Ο, 0,-2,-2, 2,_Μ, Ο, 3, 2,-1,-1, 0,-2,-3, Ο, Ο, 2}, /* I */ {-1,-2,-2,-2,-2,1,-3,-2, 5,0,-2, 2,2,-2,31,-2,-2,-2,-1,0,0,4,-5,0,-1,-2}, 1*1*1 { Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, 0,31, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, 0}, /* Κ */ {-1, 0,-5, 0,0,-5,-2, 0,-2, Ο, 5,-3, Ο, 1,31,-1, 1, 3,0, Ο, 0,-2,-3, 0,-4, 0}, /* L */ {-2,-3,-6,-4,-3, 2,-4,-2, 2, 0,-3, 6,4,-3,31,-3,-2,-3,-3,-1, Ο, 2,-2,0,-1,-2}. /* Μ *1 {-1,-2,-5,-3,-2, 0,-3,-2, 2, Ο, Ο, 4,6,-2,_Μ,-2,-1, 0,-2,-1, Ο, 2,-4, 0,-2,-1}. /* Ν *7 { Ο, 2,-4, 2, 1,-4, Ο, 2,-2, Ο, 1,-3,-2, 2,_Μ,-1, 1, Ο, 1, Ο, 0,-2,-4, 0,-2, 1}, /* Ο */ {_Μ,31,_Μ,_Μ,_Μ,„Μ,31,_Μ,„Μ,_Μ,^Μ,_Μ,_Μ,_Μ, /* Ρ */ { 1,-1,-3,-1,-1,-5,-1, 0,-2, 0,-1,-3,-2,-1, Μ, 6, Ο, Ο, 1, Ο, 0,-1,-6, 0,-5,0}, /*Q*/ { 0,1,-5, 2,2,-5,-1,3,-2,0,1,-2,-1,1,31,0,4.1,-1,-1,0,-2,-5,0,-4,3}, /* R */ {-2, 0,-4,-1,-1,-4,-3, 2,-2, Ο, 3,-3, 0,0,_Μ, 0,1,6,0,-1,0,-2,2,0,-4, 0}, /* S */ { 1, Ο, Ο, 0,0,-3, 1,-1,-1, Ο, 0,-3,-2, Ι,_Μ, 1,-1, Ο, 2, 1, 0,-1,-2, 0,-3, 0}, /* Τ */ { I, 0,-2,0,0,-3, 0,-1,0,0,0,-1,-1, 0,_Μ, Ο,-1,-1, 1, 3,0, 0,-5,0,-3, 0}, /* U */ { Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, 0,31,0,0, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, 0}, /* V */ { 0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2,4, 0,-2, 2, 2,-2,31,-1.-2,-2,-1. Ο, Ο, 4,-6,0,-2,-2}. /* W */ {-6,-5,-8,-7,-7, 0,-7,-3,-5, 0,-3,-2,-4,-4,_Μ,-6,-5, 2,-2,-5, 0,-6,17, Ο, 0,-6}, /* X */ { Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, 0,31, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, Ο, 0}, -J, υ,Ί, U,—t, /* Ζ *7 { 0, 1,-5, 2, 3,-5,0, 2,-2, 0, 0,-2,-1, 1,31, 0, 3, 0, 0, 0, 0,-2,-6, 0,-4, 4} }; ι* */ #include <stdio.h> #include <ctype.h> #define MAXJMP 16 /* max juraps in a diag *1 #defíne MAXGAP 24 /* don’t continue to penalize gaps larger than this *1 «define JMPS 1024 /* max jmps in an path *1 «define MX 4 /* save if there's at least MX-1 bases since last jmp *1 «define DMAT 3 /* value of malching bases */ «define DMIS 0 /* penalty for mismatched bases *1 «define DíNSO 8 l* penalty for a gap *7 «define DINS1 1 i* penalty per base */ «define PINSO 8 /* penalty for a gap *t 56
ΕΡ 1 784 426 PT #definePINSl 4 /* penalty per resídue */ struct jmp { /* size of jmp (neg for dely) */ /* base no. of jmp in seq x *1 /* limits seq to 2Λ16 -1 */ short n[MAXJMP]; unsigned short xfMAXJMP]; }; struct diag { int score; /* score at last jmp */ long offset; /* offset of prev block */ short ijmp; /* current jmp índex *! struct jmp jp; 1* listof jmps */ struct path { int spc; /* number of leading spaces */ short n[JMPS]; !* size of jmp (gap) */ }; int x[JMPS]; /* loc of jmp (last elem before gap) */ char *ofile; /* output file name *f char *namex[2]; /* seq names: getseqsO */ char *prog; /* prog name for err msgs */ char *seqx[2]; Γ* seqs: getseqsO */ iut dmax; /* best diag: nwO */ ínt dmaxO; /* final diag */ int dna; /* set if dna: mainO */ int endgaps; /* set if penalizing end int gapx, gapy; /* total gaps in seqs */ int lenO, leni; /* seq lens */ int ngapx, ngapy; /* total size of gaps */ int smax; /* max score: nw() */ int *xbm; /* bitmap for matching */ long offset; /* current offset in jmp file */ struct diag *dx; /* holds diagonais */ struct path PPÍ2]; l* holds path for seqs */ 57
ΕΡ 1 784 426 PT char *callocQ, +ma[[oc(), *index(), *strcpy(); char *getseqO, *g_calloc(); /* Needleman-Wunsch alignment program * + usage: progs filei file2 * where filei and file2 are two dna or two protein sequences. * The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity * Any lines beginning with ’>' or '<’ are ignored * Max file length is 65535 (limited by unsigned short x in the jmp struct)
* A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA * Output is in the file "align.out" * * The program may create a tmp file in /tmp to hold info about tracebaelc. #indude "nw.h" #include "day.h" static _dbval[26] = { 1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0 static _pbval[26] = { 1,2[( 1«('D’-'A'))|( 1«(Ή’-Ά')), 4, 8,16, 32, 64, 128, 256, OxFFFFFFF, 1«10, l«ll, 1«12, 1«13, 1«14, 1«15, 1«16, 1«17, 1«18, 1«19, 1«20, 1«21,1«22, 1«23,1«24, 1 «251( 1 «(Έ'-Ά'))|( 1«('Q'-’A’)) main main(ac, av) int char ac; *av[]; 58
ΕΡ 1 784 426 PT prog = av[0]; iffac != 3) { fprintf(stderr,"usage: %s filei ftle2\n", prog); fprintf{stderr,"where filei and file2 are two dna or two protein sequences.\n"); fprintf(stderr,"The sequences can be in upper- or lower-caseln’1); fprintf(stderr,"Any lines beginning with or '<' are ignoredVn"); fprintf(stderr,"Oatput is in the file Valign.outVAn"); exit(l); } namex(0] = av[l]; namex[l] = av[2]; seqx[0] = getseq(namex[0], &lenO); seqx[l] = getseq(namex[l], &lenl); xbm = (dna)? .dbval; pbval; endgaps = 0; /*1 to penalize endgaps *i ofile = "align.out"; /* output file */ nw(); readjmpsO; printO; /* fill in the matrix, get the possible jraps */ /* get the actual jmps *1 /* print stats, alignment */ cleanup(0); /* unlink any tmp files */ }
I* do the alignment, retum best score: mainO * dna: values in Fitch and Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983 * pro: PAM 250 values * When scores are equal, we prefer mismatches to any gap, prefer :i: a new gap to extending an ongoing gap, and prefer a gap in seqx * to a gap in seq y. */ nw
nwO { 59
ΕΡ 1 784 426 PT char *px, *py; int *ndely, *dely; int ndelx, delx; int *tmp; int mis; int insO, insl; register id; register *j; register *co!0,' register xx, yy; /'* seqs and ptrs */ /* keep track of dely */ /* keep track of delx */ /* for swapping rowO, rowl */ /* score for each type */ /* insertion penalties *i i* diagonal índex */ I* jmp index */ kcoll; /* score for curr, last rc /* index into seqs */ dx = (struct diag *)g_calloc{"to get diags", lenO+lenl+1, sizeofístruct diag)); ndely = (int *)g_calloc("to get ndely", lenl+1, sizeof(int}); dely = (int +)g_calloc("to get dely", lenl+1, sizeof(int)); colO = (int *)g_calloc("to get colO", lenl+1, sizeof(int)); coll = (int *)g_calloc(''to get coll’', lenl+1, sizeof(int)); insO = (dna)7 DINSO : PINSQ; insl = (dna)'? DINS1 : P1NS1; smax = -10000; if (endgaps) { for (col0[0] = dely(0] = -insO, yy = l; yy <= leni; yy++) { col0[yy] - dely[yy] = col0[yy-l] - insl; ndely [yy] = yy; } colOfO] = 0; /* Waterman Buli Math Biol 84 */ ) else for (yy = 1; yy <= leni; yy++) de!y[yy] = -insO; /* fi.ll in match matrix *1 for (px = seqx[0], xx = 1; xx <= Ien0; px++, xx++) { /* initialize first entry in col */
60 ΕΡ 1 784 426 PT if (endgaps) { if (xx = 1) collfO] = delx = -(insO+insl); else coll[0] = delx = col0[0] -insl; ndelx = xx;} else { coll[0] =0; delx = -insO; ndelx = 0; > ___II w for (py = seqx[l], yy = 1; yy <= leni; py++, yy++) { mis = colO[yy-l]; if (dna) rriíg -L— (xbm[*px-lA>]^y.bni[*py"lAt])? 3DJVÍA.T i DM!Sj else mis +=_day[*px-'A'][*py-'A’]; I* update penalEy for del in x seq; * favor new del over ongong del * ignore MAXGAP if weighting endgaps *! if (endgaps |j ndely[yy] < MAXGAP) { if (col0[yy] - insO >= dely[yy]) { dely[yy] - col0[yy] - (insO+insl); ndelyfyy] = 1; } else { delyfyy] -= insl; ndely[yy]++;} } else { if (col0[yy] - (insO+insl) >= dely[yy]) { dely[yy] = colOfyy] - (insO+insl); 61
61 ΕΡ 1 784 426 PT ndely[yy] = 1; } else ndely[yy]++; } Γ* update penalty for del in y seq; * favor new del over ongong del */ if (endgaps || ndelx < MAXGAP) { if (coll[yy-l] - insO >= delx) { delx = coll[yy-l J - (insO+insl); ndelx = 1; } else { delx -= insl; ndelx++; } else { if (coll[yy-l] - (insO+insl) >= delx) { ndelx = 1; } else ndelx++; } /* pick the maximum score; we're favoring * mis over any del and delx over dely *1 ...nw id = xx - yy + leni -1; if (mis > - delx &&. mis >= dely[yy]) coll[yy]= mis; else if (delx >= dely[yy]) { collfyy] = delx; 62
62 ΕΡ 1 784 426 PT ij = dx[id].ijmp; if (dx[id] jp.n[0] && (!dna || (ndelx >= MAXJMP &Sí xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score4DINS0)) { dx[id].ijmp++; if(+4ij>= MAXJMP) { writejinps(id); ij = dx[id],ijmp = 0; dx[id],offset = offset; offset += sizeof(struct jmp) + sizeof(offset); } i dx[id].jp,n[ij] = ndelx; dxfid].jp.x[ij] = xx; dx[id].score = delx; } else { collfyy] = dely[yyj; ij - dxfidj.ijmp;
if (dx[id].jp.n[0] && (!dna || (ndely[yy] >= MAXJMP && xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id] .score+DINSO)) { dx[id].ijmp++; if (++ij >= MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id]ijmp = 0; dx[id].offset = offset; offset += sizeoffstruct jmp) + sizeof(offset); } > dx[id].jp.n[ij] = -ndely[yy]; dx[id].jp.x[ij] = xx; dxlidj.score = dely[yyj; } if (χχ = lenO && yy < leni) { /* last col */ if (endgaps) coll[yy] -= insO+insl*(lenl-yy); 63
ΕΡ 1 784 426 PT if (coll[yy) > smax) { smax - coll[yy]; dmax _ id; } } } if (endgaps && xx < lenO) coll[yy-l] -= insO+ins 1 *{lenO-xx); if (coll[yy-l] > smax) { smax = coll[yy-l]; dmax = id; } tmp = colO; coIO = coll; coll = tmp; } (void) free((char *)ndely); (void) free((char *)dely); (void) free((char *)colO); (void) free((char *)coll); } /* * * print() — only routine visible outside this module * * static;
* getmat() — trace back best path, count matches: printO * pr_alignO - print alignment of described in array pQ: print()
* dumpblockO dump a block of lines with numbers, stars: pr_alignO
* nums() - put out a number line: dumpblockO
* putlineO — put out a line (name, [num], seq, [num]); dumpblockO
* starsO - -put a line of stars: dumpblockO * stripnameO — strip any path and prefix from a seqname */ #include "nw.h" fídefine SPC 3 ífdefine P_LINE 256 /* maximum output line */ 64
ΕΡ 1 784 426 PT tdefine P_SPC 3 /* space between name or num and seq */ extern _day[26][26]; int olen; /* set output line length */ FILE *fx; I* output file */ print
printO í int lx, ly, firstgap, lastgap; /* overlap */ if ((fx = fopen(ofile, "w")) = 0) { fprintf(stderr,"%s: can't write %sW, prog, ofile); cleanup(l); } fprintf(fx, "<first sequence: %s (length = %d)\n", namex[0], lenO); fprintf(fx, Vsecond sequence: %s (length = %d)\n", namex[l], leni); olen = 60; lx = lenO; ly = lenl; firstgap = lastgap = 0; if (dmax < leni - 1) { /* leading gap in x */ pp[0].spc = firstgap = leni - dmax - 1; ly -= pp[0].spc; } else if (dmax > leni - 1) { /* leading gap in y */ pp[l].spc = firstgap = dmax - (leni - 1); lx -= pp(l]-spc; } if (dmaxO < lenO -1) { /* trailing gap in x */ lastgap = lenO - dmaxO -1; lx -= lastgap; } else if (dmaxO > lenO - 1) { /* trailing gap in y */ lastgap = dmaxO - (lenO - 1); ly -= lastgap; } getmat(lx, ly, firstgap, lastgap); 65
ΕΡ 1 784 426 PT pr_aHgnO; > !* * trace back the best path, count matches *1 static getmat getmat(lx, ly, firstgap, lastgap) int lx, ly; /* "core" (minus endgaps) */ int firstgap, lastgap; /* leading trailing overlap *1 { int nra, iO, il, sizO, sizl; char outx[32]; doubie pct; register nO, nl; register char *p0, *pl; /* get total matches, score */ iO = il = sizO = sizl = 0; pO = seqx[0] + pp[l].spc; pl = seqx[l] + pp[0].spc; nQ = pp[l],spc +1; nl =pp[0].spc + 1; nm = 0; while ( *p0 && *pl ) { if (sizO) { pl++; ii 1h—l-; sizO—; } else if (sizl) { p0++; 66
ΕΡ 1 784 426 PT ηΟ++; sizl—; } else{ if (xbm[*pO-'A']&xbm[*pl-'A']) nm++; if (nO++ == pp[0].x[i0]) sizO = pp[0].n[iO++]; if(nl++== pp[l).x[il]) sizl = pp[l].n[il++]; pO++; pl++; } > t* pcthomology: * if penalizing endgaps, base is the shoiter seq * else, knock off overhangs and take shorter core *! if (endgaps) lx = (lenO < leni)? lenO : leni; else lx = (lx < ly)? lx : ly; pct = 100.*(double)nm?(double)lx; fprintf(fx, "\n"); fprintf(fx, "<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarityVn", nm, (nm = 1)? "" ; "es", lx, pct); \ ...getmat fprintf(fx, "<gaps in first sequence: %d", gapx); if(gapx){ (void) sprintf(outx," (%d %s%s)", ngapx, (dna)? "base":,,residue", (ngapx = 1)? "":,'s',); fprintf(fx,"%s", outx); 67
ΕΡ 1 784 426 PT fprintf(fx, ", gaps in second sequencc: %d", gapy); ‘f (gapy) { (void) sprintf(outx, " (%d %s%s)", ngapy, (dna)? "base": "residue", (ngapy = 1)? '"Vs"); fprintf(fx,"%s", outx); } if (dna) fprintf(fx, "\n<score: %d (match = %d, mismatch = %d, gap penalty = %â + %d per base)\n", smax, DMAT, DMIS, DINSO, DINS1); else fprintf(fx, "\n<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penalty = %d + %d per residue)\n", smax, PINSO, PINS1); if (endgaps) fprintf(fx, "<endgaps penaiized. leftendgap: %d %s%s, rightendgap: %d %s%s\n", firstgap, (dna)? "base": "residue", (firstgap = 1)?"": "s", lastgap, (dna)? "base" : "residue", (lastgap = 1)? "": "s"); else fpnntf(fx, "<endgaps not penalizedW); } static nm; /* matches in core — for checking */ static lmax; /* lengths of stiipped file names */ static «PI; /* jmp index for a path */ statíc nc[2]; 1* number at start of current line */ static ni[2]; /* current elem number — for gapping *( static siz[2]; static char *ps[2]; /* ptr to current element */ static char *P°[2J; /* ptr to next output char slot */ static char out[2][PJLINE]; /* output line */ static char star[P_LINE], 1* set by stars() *1 /* * print alignment of described in struct path pp[] *! 68
ΕΡ 1 784 426 PT static pr_align pr_align() < inl nn; I* char count */ int more; register i; for (i = 0, lmax = 0; i < 2; i++) { nn = stripnaine(namex[i]); if (nn > lmax) lmax = nn; nc[i] = 1; ni[i]= 1; siz[i] = ij[i] = 0; ps[i] = seqx[i]; pofi] = out[i]; } for (nn = nm = 0, more = 1; more; ) { ...pr_align for (i = more = 0; i < 2; i++) { I* * do we have more of this sequence? *7 if (!*ps[i]) continue; more++; if (pp[i].spc) { /* leading space */ *po[i]-H- =''; 1 Pp[i] spc—; } else if (sizfi]) { /* in a gap */ *po[i]++ = siz[i]--; í 69
ΕΡ 1 784 426 PT else { /* we’re purtiag a seq element */ •*po[i] S *ps[i]; if (isIower(*ps[i])) *ps[i] = toupper(*ps[i]); po[i]++; ps[i]++; I* * are we at next gap for thís seq? */ if (ni[i] = pp[i].x[ij[i]]) { /* * we need to merge all gaps * at this location */ siz[i] = pp[i].n[ij[i]++]; wbile (ni[i] = pp[i].xtij[i]]) siz[i] += pp[i].n[ij[i]++]; } ni[i]-t-+; > } if (++nn = oten |[ !more && nn) { dutnpblock(); for (i = 0; i < 2; i++) po[i] = out[i]; /* * dump a bfock of lines, including numbers, stats: pr_a]ignO */ static dumpbloek
dumpblockO 70
ΕΡ 1 784 426 PT t; register for (i = 0; i < 2; i++) *po[i]— = Λ0'; ...dumpblock (void) putc('\ii', fx); for (i = 0; i < 2; i++) { if (*out[i] SíSí (*out[i] != " || ψ(ρο[ί]) != ’')) { if (i = 0) nunis(i); if (i = 0 && *out[l]) stars(); putline(i); if (i = 0 && *out[l]) fprint£(fx, st ar); if(i = l) nums(i); } } } /* * put out a number Iine: dumpblock() */ static nums nums(ix) int tx; /* index in out[] holding seq line */ í char niine[P_LINE]; register i, j; register char *pn, *px, *py; for (pn = nline, i = 0; i < lmax+P_SPC; i++, pn++) *pn = 71
ΕΡ 1 784 426 PT for (i = nc[ix], py = out[ix]; *py; py++, pn++) { if(*py = " || *Py = '-') ^pn = ' else { if (i%10 = 0 11 (i == 1 && nc[ix] != 1)) { j = (i < 0)? -i: i; for (px = pn; j; j 1= 10, px--) *px = j%10 + '0'; if (i<0) *px = } else *pn = "; i++; } } *pn = 70'; nc[ix] = i; for (pn = nline; *pn; pn+4·) (void) putc(*pn, Fx); (void) putcfVt', fx); /* * put out a line (name, [num], seq, [num]): dumpblockO */ static putline putline(ix) int ix; { .putlinc int i; rcgister char *px; for (px = namex[ix], i = 0; *px && *px !=px++, i++) (void) putc^px, fx); 72
ΕΡ 1 784 426 PT for {; i < lmax+P_SPC; i++) (void) putc{'fx); - Γ* these count from 1: * ni[] is current element (from 1) * nc [] is number at start of current line *1 for (px = out[ix]; *px; px++) (void) putc(*px&0x7F, fx); (void) putcCVn’, fx); } /*
* put a line of stars (seqs always in out[l]): dumpblockO *t static stars
starsO { int i; register char *p0, *pl, cx, *px·; if(!*out(0]||(*out[0] = "&& *(pofO]) — ’ ’) || !*out[l] || (*out[l] ='' && *(po[l]) ='')) return; px = star; for (i = lmax+P_$PC; i; i~) *px++ =' for (pO = out[0], pl = OLt[l]; *p0 && *pl; p0++, pl++) { if (isalpha(*pO) && isalpha(*pl)) { if (xbm[*pO-'Arl&xbm[*pl-'A']) { cx = nm++; } else if (!dna && _day(*pO-'A’][*pl-'A'] > 0) 73
ΕΡ 1 784 426 PT cx = 7; else cx= ; } else cx = "; *px++ = cx; } *px++ = V; spx = 'MT; ) /* * strip path or prefix firom pn, retum Ien: pr_alignO static stripname(pn) stripname char *pn; /* file name (may be path) *1 { registcr char *px, *py; py = 0; for (px = pn; *px; px++) jf(*px = 7) py = px+ 1; if (py) (void) strcpy(pn, py); return(strlenCpn)); } 74
ΕΡ 1 784 426 PT /* * cleanupO — cleanup any tmp file * getseq() — read in seq, set dna, len, maxlen * g_callocO -- callocO with error checkin * readjmpsO — gct the good jmps, from Unp file if necessary * writejmpsO -- write a filled array of jmps to a tmp File: mv{) *f #include "nw.h" #include <sys/file.h> char “jiianie = ' /tmp/homgXXXXXX"; /* tmp file for jmps */ FILE *fj; int cleanupO; /* cleanup tmp file */ long IseekO; i* * remove any tmp file if we blow <! cleanup cleanupfi)
Int i; { if(fj) (void) unlinkOname); exit(i); } I* * read, renim ptr to seq, ,set dna, len, maxlen * skip lines starting with'<*, or ’>’
* seq in upper or lower case V getseq char * getseq(fde, len) char *file; /* file name *! int *len; I* seq len *t { 75
ΕΡ 1 784 426 PT
char regisier char int FILE line[1024], *pseq; *px, *py; natgc, tlen; *fp; if ((fp = fopen(file,"r")) = 0) { fprintf(stderr,"%s: can't read %s\n”, prog, file); exit(l); } tlen - natgc = 0; while (fgets(line, 1024, fp)) { if (*line -- || *line = ’<' || *line == '>’) continue; for (px = line; *ρχ != W; px++) if (isupper(*px) || Íslower(*px)) tlen++; } if ((pseq = malloc((unsigned)(tlen+6))) = 0) { fprmtffstderr/^s: malioc() faiied to get %d bytes for %s\n", prog, tien+ó, file); exit(l); } pseq[0] = pseq[l] = pseq[2] = pseq[3] = 70'; ...getseq py = pseq + 4; * lcn = tlen; rewind(fp); while (fgets(line, 1024, fp)) { if (*line = || *line = ’<’ || *line = '>') continue; for (px = line; *px != 7n'; px++) í if (isupper(*px)) *py++ = *px; else if (islower(*px)) 76
ΕΡ 1 784 426 PT *py++ = touppei(*px), if (index("ATGCU",*(py-l))) natgc++; } *py++ = Λ0'; *py = Λ0'; (void) fclose(fp); dna = natgc > (tlen/3); return(pseq+4); } char * g_calloc g_calloc(msg. nx, sz) char *msg; /* program, calling routine */ int nx, sz; f* number and size of elements */ { char "'px, *callocO; if ((px = calloc{(unsigned)nx, (unsigned)sz)) == 0) { if (*msg) { , prog, msg, nx, fprintffstderr, "%s: g_calloc0 failed %s (n=%d, sz=%d)\n" sz); exit(l); } } retum(px); > /* * get final jmps from dx[] or tmp file, set ppO, reset dmax: main() */ readjmps
readjmpsO { int fd = -l; int siz, iO, il; register i, j, xx; 77
ΕΡ 1 784 426 PT (void) fclose(fj); if ((fd = open(jname, 0_RDONLY, 0)) < 0) { fprintf(stderr, "%s: can't open() %s\n", prog, jname); cleanup(l); > í for (i = i0 = il = 0, dmaxO = dniax, xx = lenO;; i++) { whiie (1) { for (j — dx[dmax].ijmp; j >= 0 && dx(dmax].jp.x(j] >= xx; j—) ...readjmps if (j < 0 && dx[dmax].offset && íj) { (void) lseek(fd, dx(dmax].offset, 0); (void) read(fd, (char '+)&dx[dmax].jp, sizeof(struct jmp)); (void) read(fd, (char *)&dx[dmax].offset, sizeof(dx[dmax],offset)); dxLdmaxJ.ijmp = MAXJMP-L; } else break; } if (i >= JMPS) { fprintf(stderr, ”%s: too many gaps in alignmentW, prog); cleanup(l); } if(]>=0){ siz = dx[dmax].jp.n[j]; xx = dx[dmax] jp.xfj]; dmax += siz; if (siz < 0) { f* gap in second seq */ pp[l].n[il] =-siz; xx += siz; /* id = xx - yy + leni - 1 */ pp[l].x[il] = xx - dmax + leni -1; 78
ΕΡ 1 784 426 PT gapy++; ngapy -= si*; /* ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz = (-siz < MAXGAP || endgaps)? -siz: MAXGAP; il++; } dse if (siz > 0) { /* gap in first seq */ pp[0].n(i0] = siz; pp[0].x[i0] = xx; gapx++; ngapx += siz; /* ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz = (siz < MAXGAP || endgaps)? siz : MAXGAP; i0++; } } else break; } /* reverse the order of jmps */ for (j = O, ÍO—; j < iO; j++, iO-) { i = pp[0].n[j]; pp[0].n[j] = pp(0].n(iO]; pp{0].n[i0] = í; i = pp[0].x[j]; pp[0].x[j] = pp[0].x(i0]; pp[0].x[i0] = i; > for(j = 0, il—; j < il; j++, >1-) ( i = pp[í].n[j]; pp[l].nlj] = pp[l] n[il]; pp[l].n[il] = i; i = pp[l].x[j], pp[l) x(j] = pp[l].x[il]; pp[l].x[il] = i; } if (fd >= 0) (void) close(fd); (void) unlink(jname); fj=0; offset = 0; } } 79
ΕΡ 1 784 426 PT I* * write a filled jmp struct offset of the prev one (if any): nw()
V wmejTinps(ix) writejmps int ix; í char *mktempO; if (!fj) { if (mktemp(jname) < 0) { fprintf(stderr, "%s: can’t mktempO %s\n", prog, jname); cleanup(l); } if ((fj = fopen(jname, "w")) = 0) { fprintf(stdeir, ''%s; can’t write %s\n", prog, jname); exit(l); } } (void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1, §); (void) fwrite((char *)&dx(ix].offset, sizeof(dx[ix].offset), 1, fj), 0 termo "vector," como aqui se utiliza, destina-se a referir uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vector é um "plasmídeo", que se refere a uma volta de ADN circular de cadeia dupla ao qual podem ser ligados segmentos de ADN adicionais. Outro tipo de vector é um vector fágico. Outro tipo de vector é um vector virai, em que segmentos de ADN adicionais podem ser ligados ao genoma virai. Determinados vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual foram introduzidos (e.g., vectores bacterianos possuindo uma origem de replicação bacteriana e vectores epissómicos de mamífero). Outros vectores (e.g., vectores não epissómicos de mamífero) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira por introdução na célula hospedeira e desse modo são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Adicionalmente, certos vectores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados. Estes vectores são aqui referidos como "vectores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vectores 80 ΕΡ 1 784 426 PT recombinantes"). Em geral, os vectores de expressão com utilidade em técnicas de ADN recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No presente fascículo, "plasmídeo" e "vector" podem ser utilizados indiferentemente pois o plasmídeo é a forma de vector mais vulgarmente utilizada. "Polinucleótido" ou "ácido nucleico", como aqui se utilizam indiferentemente, referem-se a polímeros de nucleótidos de qualquer comprimento e incluem ADN e ARN. Os nucleótidos podem ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos ou bases modificados, e/ou seus análogos ou qualquer substrato que possa ser incorporado num polímero pela ADN- ou ARN-polimerase ou por uma reacção sintética. Um polinucleótido pode compreender nucleótidos modificados, tais como nucleótidos metilados e seus análogos. Quando presente, a modificação da estrutura do nucleótido pode ser conferida antes ou depois da montagem do polímero. A sequência de nucleótidos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleótido pode ser ainda modificado após a síntese, tal como por conjugação com um marcador. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "remates", substituição de um ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural por um análogo, modificações internucleótidos tais como, por exemplo, com ligações não carregadas (e.g., metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (e.g., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), com porções pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (e.g., nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos de sinal, poli-L-lisina, etc.), com intercaladores (e.g., acridina, psoraleno, etc.), com quelantes (e.g., metais, metais radioactivos, boro, metais oxidantes, etc.), com alquilantes, com ligações modificadas (e.g., ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.), assim como formas não modificadas do(s) polinucleótido(s). Adicionalmente, qualquer dos grupos hidroxilo vulgarmente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegido por grupos protectores padrão ou activado para preparar ligações adicionais a nucleótidos adicionais ou pode ser conjugado a suportes sólidos ou semi-sólidos. 0 OH do terminal 5' e 3' pode ser fosforilado ou substituído por aminas ou porções de grupos orgânicos de remate de 1 a 20 átomos de carbono. Outros hidroxilos podem também ser 81 ΕΡ 1 784 426 PT derivatizados em grupos protectores padrões. Os polinucleótidos podem também conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidos na especialidade, incluindo, por exemplo, 2'-0-metil-, 2'-0-alil-, 2'-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcares carbocíclicos, açúcares alfa-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedo-heptuloses, análogos aciclicos e análogos nucleósidos abásicos tais como metilribósido. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas não se lhes limitam, concretizações em que o fosfato é substituído por P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)0R', CO ou CH2 (" formacetal") , em que cada R ou R' é independentemente H ou alquilo substituído ou não substituído (1-20 C.) opcionalmente contendo uma ligação éter (-0-), arilo, alcenilo, cicloalquilo, cicloalcenilo ou araldilo. Nem todas as ligações num polinucleótido precisam de ser idênticas. A descrição precedente aplica-se a todos os polinucleótidos aqui referidos, incluindo ARN e ADN. "Oligonucleótido," como aqui se utiliza, refere-se genericamente a polinucleótidos curtos, geralmente de cadeia simples, geralmente sintéticos, que têm geralmente, mas não necessariamente, menos de cerca de 200 nucleótidos de comprimento. Os termos "oligonucleótido" e "polinucleótido" não são mutuamente exclusivos. A descrição acima para os polinucleótidos é igual e totalmente aplicável aos oligonucleótidos.
Os termos "anticorpo" e " imunoglobulina" são utilizados indiferentemente no sentido mais amplo e incluem anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais de comprimento completo ou intactos), anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (e.g., anticorpos biespecíficos desde que exibam a actividade biológica desejada) e podem também incluir certos fragmentos de anticorpos (como aqui descrito com mais detalhes) . Um anticorpo pode ser humano, humanizado e/ou maturado por afinidade. 82
ΕΡ 1 784 426 PT
Os "fragmentos de anticorpos" compreendem apenas uma porção de um anticorpo intacto, em que a porção preferivelmente retém pelo menos uma, preferivelmente a maioria ou a totalidade, das funções normalmente associadas a essa porção quando presente num anticorpo intacto. Numa concretização, um fragmento de anticorpo compreende um local de ligação ao antigénio do anticorpo intacto e assim retém a capacidade de ligar o antigénio. Em outra concretização, um fragmento de anticorpo, por exemplo um que compreende a região Fc, retém pelo menos uma das funções biológicas normalmente associadas à região Fc quando presente num anticorpo intacto, tal como a ligação a FcRn, a modulação da semivida do anticorpo, a função ADCC e a ligação ao complemento. Numa concretização, um fragmento de anticorpo é um anticorpo monovalente que possui uma semivida in vivo substancialmente similar à do anticorpo intacto. Por exemplo, um destes fragmentos de anticorpo pode compreender um braço de ligação ao antigénio ligado a uma sequência de Fc capaz de conferir in vivo estabilidade ao fragmento. A expressão "anticorpo monoclonal", como aqui se utiliza, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades mínimas. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único antigénio. Adicionalmente, em contraste com as preparações de anticorpos policlonais que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio.
Os anticorpos monoclonais incluem aqui especificamente anticorpos "quiméricos" em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, enquanto a(s) restante (s) cadeia(s) é(são) idêntica(s) ou homóloga(s) à(s) sequência(s) correspondente(s) em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos 83 ΕΡ 1 784 426 PT destes anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada (Patente U.S. 4,816,567; e Morrison et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)).
As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (e.g., murinos) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na sua maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recebedor) em que resíduos de uma região hipervariável do recebedor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como de ratinho, rato, coelho ou primata não humano, possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de esqueleto (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Adicionalmente, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se encontram nem no anticorpo recebedor nem no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as voltas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de uma imunoglobulina, tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, veja-se Jones et ai., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et ai., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Vejam-se também os seguintes artigos de revisão e referências neles citadas: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
Um "antigénio" é um antigénio predeterminado ao qual um anticorpo se pode ligar selectivamente. O antigénio alvo pode ser um polipéptido, um hidrato de carbono, um ácido nucleico, um lípido, um hapteno ou outro composto de ocorrência natural ou sintético. Preferivelmente, o antigénio alvo é um 84 ΕΡ 1 784 426 PT polipéptido. Um "esqueleto humano aceitador" para os presentes fins é um esqueleto compreendendo a sequência de aminoácidos de um esqueleto de VL ou VH derivado de um esqueleto de imunoglobulina humana ou de um esqueleto de consenso humano. Um esqueleto humano aceitador "derivado de" um esqueleto de imunoglobulina humana ou de um esqueleto de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácidos ou pode conter alterações da sequência de aminoácidos preexistente. Quando estão presentes alterações de aminoácidos preexistentes, preferivelmente não estão presentes mais de 5 e preferivelmente estão presentes 4 ou menos ou 3 ou menos, alterações de aminoácidos preexistentes. Quando estão presentes alterações de aminoácidos preexistentes numa VH, preferivelmente essas alterações são apenas em três, duas ou uma das posições 71H, 73H e 78H; por exemplo, os resíduos de aminoácido nessas posições podem ser 71A, 73T e/ou 78A. Numa concretização, o esqueleto humano aceitador de VL é idêntico em sequência à sequência do esqueleto de VL de imunoglobulina humana ou à sequência do esqueleto de consenso humano.
Um "esqueleto de consenso humano" é um esqueleto que representa os resíduos de aminoácido de ocorrência mais comum numa selecção de sequências de esqueletos de VL ou VH de imunoglobulinas humanas. Geralmente, a selecção de sequências de VL ou VH de imunoglobulinas humanas é de um subgrupo de sequências do domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo segundo Kabat et al. Numa concretização, para a VL, o subgrupo é o subgrupo capa I segundo Kabat et al. Numa concretização, para a VH, o subgrupo é o subgrupo III segundo Kabat et al.
Um "esqueleto de consenso VL do subgrupo I" compreende a sequência de consenso obtida a partir das sequências de aminoácidos no subgrupo I capa leve variável de Kabat et al. Numa concretização, a sequência de aminoácidos do esqueleto de consenso VL do subgrupo I compreende pelo menos uma porção ou a totalidade de cada uma das sequências seguintes: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:34)-Ll-WYQQKPGKA PKLLI (SEQ ID NO:35)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:36)-L3-FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:37). 85
ΕΡ 1 784 426 PT
Um "esqueleto de consenso VH do subgrupo III" compreende a sequência de consenso obtida a partir das sequências de aminoácidos no subgrupo III pesado variável de Kabat et al. Numa concretização, a sequência de aminoácidos do esqueleto de consenso VH do subgrupo III compreende pelo menos uma porção ou a totalidade de cada uma das sequências seguintes: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:38)-Hl-WVRQAPG KGLEWV (SEQ ID NO:39)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:40)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:41).
Um "esqueleto humano não modificado" é um esqueleto humano que tem a mesma sequência de aminoácidos que o esqueleto humano aceitador, e.g. sem substituições de aminoácidos de humano para não humano no esqueleto humano aceitador.
Uma "região hipervariável alterada" para os presentes fins é uma região hipervariável compreendendo uma ou mais (e.g. uma a cerca de 16) substituições de aminoácidos.
Uma "região hipervariável não modificada" para os presentes fins é uma região hipervariável possuindo a mesma sequência de aminoácidos que um anticorpo não humano do qual foi derivada, i.e. um que não tem uma ou mais substituições de aminoácidos.
As expressões "região hipervariável", "HVR" ou "HV", quando aqui utilizadas, referem-se às regiões de um domínio variável de um anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam voltas estruturalmente definidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três na VH (Hl, H2, H3) e três na VL (Ll, L2, L3) . Várias delineações de regiões hipervariáveis estão em uso e estão aqui abrangidas. As Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR) de Kabat são baseadas na variabilidade da sequência e são as mais vulgarmente utilizadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia refere-se pelo contrário à localização das voltas estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Blol. 196:901-917 (1987)). As regiões hipervariáveis AbM representam um compromisso entre as CDR de Kabat e as voltas estruturais de Chothia e são utilizadas pelo 86 ΕΡ 1 784 426 PT software de modelação de anticorpos AbM Oxford Molecular. As regiões hipervariáveis de "contacto" são baseadas numa análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis estão anotados adiante.
Tabela 1
Volta Kabat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L4 6-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 numeração de Kabat de Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B numeração de Chothia de Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
As regiões hipervariáveis podem compreender "regiões hipervariáveis alargadas" como se segue: 24-36 ou 24-34 (Ll), 46-56 ou 49-56 ou 50-56 ou 52-56 (L2) e 89-97 (L3) na VL e 26-35 (Hl), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) na VH. Os resíduos do domínio variável estão numerados de acordo com Kabat et al. , supra para cada uma destas definições.
Os resíduos de "esqueleto" ou "FR" são os resíduos do domínio variável outros que não os resíduos da região hipervariável como aqui definido.
Um "anticorpo humano" é um que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou foi preparado utilizando qualquer das técnicas para preparação de anticorpos humanos como aqui divulgado. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antigénio não humanos.
Um anticorpo "maturado por afinidade" é um que possui uma ou mais alterações em uma ou mais das suas CDR que resultam numa melhoria na afinidade do anticorpo para com o antigénio, comparativamente com um anticorpo progenitor que não possui 87 ΕΡ 1 784 426 PT essa(s) alteração(ções). Os anticorpos maturados por afinidade preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para com o antigénio alvo. Os anticorpos maturados por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos na especialidade. Marks et ai. Bio/Technology 10:779-783 (1992) descrevem a maturação por afinidade por baralhamento ("shuffling") de domínios VH e VL. A mutagénese aleatória de resíduos de CDR e/ou de esqueleto está descrita por: Barbas et ai. Proc Nat. Acad. Sei. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et ai. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et ai. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et ai., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
Um anticorpo de "bloqueio" ou um anticorpo "antagonista" é um que inibe ou reduz a actividade biológica do antigénio a que se liga. Os anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibem substancial ou completamente a actividade biológica do antigénio.
Um "anticorpo agonista", como aqui se utiliza, é um anticorpo que imita pelo menos uma das actividades funcionais de um polipéptido de interesse.
Uma "desordem" é qualquer condição que possa beneficiar de tratamento com uma substância/molécula ou método da invenção. Isto inclui desordens ou doenças crónicas e agudas incluindo as condições patológicas que predispõem o mamífero à desordem em questão. Os exemplos não limitantes de desordens a tratar aqui incluem tumores malignos e benignos; malignidades não leucémicas e linfóides; desordens neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicas e outras desordens glandulares, macrofágicas, epiteliais, estromais e blastocélicas; e desordens inflamatórias, imunológicas e outras desordens relacionadas com angiogénese. A expressão "doença imuno-relacionada" significa uma doença em que uma componente do sistema imunitário de um mamífero causa, medeia ou de outro modo contribui para uma morbidade no mamífero. Também estão incluídas doenças em que a estimulação ou intervenção da resposta imunitária tem um efeito de melhoria sobre a progressão da doença. Estão incluídas nesta expressão doenças inflamatórias imuno- 88 ΕΡ 1 784 426 PT mediadas, doenças inflamatórias não imuno-mediadas, doenças infecciosas, doenças de imunodeficiência, neoplasia, etc.
Os exemplos de doenças imuno-relacionadas e inflamatórias, algumas das quais são imunomediadas ou mediadas por células T, que podem ser tratadas de acordo com a invenção, incluem lúpus eritematoso sistémico, artrite reumatóide, artrite crónica juvenil, espondiloartropatias, esclerose sistémica (esclerodermia), miopatias inflamatórias idiopáticas (dermatomiosite, polimiosite), síndrome de Sjõgren, vasculite sistémica, sarcoidose, anemia hemolítica auto-imune (pancitopenia imunitária, hemoglobinúria nocturna paroxismal), trombocitopenia auto-imune (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia imunomediada), tiroidite (doença de Grave, tiroidite de Hashimoto, tiroidite linfocitica juvenil, tiroidite atrófica), diabetes mellitus, doença renal imunomediada (glomerulonefrite, nefrite túbulo-intersticial), doenças desmielinizantes dos sistemas nervosos central e periférico tais como esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante idiopática ou síndrome de Guillain-Barré e polineuropatia inflamatória crónica desmielinizante, doenças hepatobiliares tais como hepatite infecciosa (hepatite A, B, C, D, E e outros vírus não hepatotrópicos), hepatite activa crónica auto-imune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa e colangite esclerosante, doença inflamatória do intestino (colite ulcerativa; doença de Crohn), enteropatia sensível ao glúten e doença de Whipple, doenças cutâneas auto-imunes ou imunomediadas incluindo doenças cutâneas bolhosas, eritema multiforme e dermatite de contacto, psoríase, doenças alérgicas tais como asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibilidade alimentar e urticária, doenças imunológicas do pulmão tais como pneumonias eosinofílicas, fibrose pulmonar idiopática e pneumonite de hipersensibilidade, doenças associadas a transplantação incluindo rejeição de enxertos e doença enxerto-versus-hospedeiro. Doenças infecciosas incluindo doenças virais tais como SIDA (infecção por HIV), hepatite A, B, C, D e E, herpes, etc., infecções bacterianas, infecções fúngicas, infecções protozoáricas e infecções parasíticas. 89
ΕΡ 1 784 426 PT
Uma "desordem auto-imune" ou "doença auto-imune", como aqui se utilizam indiferentemente, são uma doença ou desordem não maligna que surge de, e é dirigida contra, os tecidos do próprio indivíduo. As doenças auto-imunes aqui descritas excluem especificamente doenças ou condições malignas ou cancerosas, excluindo particularmente linfoma de células B, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas e leucemia mieloblástica crónica. Os exemplos de doenças ou desordens auto-imunes incluem, mas não se lhes limitando, respostas inflamatórias tais como doenças cutâneas inflamatórias incluindo psoríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica); esclerodermia sistémica e esclerose; respostas associadas a doença inflamatória do intestino (tais como doença de Crohn e colite ulcerativa) ; síndrome da dificuldade respiratória (incluindo síndrome da dificuldade respiratória do adulto; SDRA); dermatite; meningite; encefalite; uveíte; colite; glomerulonefrite; condições alérgicas tais como eczema e asma e outras condições envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crónicas; aterosclerose; deficiência de adesão de leucócitos; artrite reumatóide; lúpus eritematoso sistémico (LES); diabetes mellitus (e.g. diabetes mellitus Tipo I ou diabetes mellitus dependente de insulina); esclerose múltipla; síndrome de Reynaud; tiroidite auto-imune; encefalomielite alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes com início juvenil; e respostas imunitárias associadas a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citoquinas e linfócitos T tipicamente encontradas na tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças envolvendo diapedese de leucócitos; desordem inflamatória do sistema nervoso central (SNC); síndrome de lesão em múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, mas não se lhes limitando, crioglobinemia ou anemia positiva de Coombs); miastenia grave; doenças mediadas pelo complexo antigénio-anticorpo; doença da membrana de base anti-glomerular; síndrome antifosfolípidos; neurite alérgica; doença de Grave; síndrome miasténica de Lambert-Eaton; penfigóide bolhosa; pênfigo; poliendocrinopatias auto-imunes; doença de Reiter; síndrome do homem rígido; doença de Behcet; arterite de células gigantes; nefrite de imunocomplexo; nefropatia de IgA; polineuropatias 90 ΕΡ 1 784 426 PT de IgM; púrpura trombocitopénica imunitária (PTI) ou trombocitopenia auto-imune, etc. A expressão "desordens inflamatórias gastrointestinais" é um grupo de desordens crónicas que causam inflamação e/ou ulceração na membrana mucosa. Como tal, a expressão inclui uma doença inflamatória do intestino (e.g., doença de Crohn, colite ulcerativa, colite indeterminada e colite infecciosa), mucosite (e.g., mucosite oral, mucosite gastrointestinal, mucosite nasal e proctite), enterocolite necrotizante e esofagite.
As expressões "desordem proliferativa celular" e "desordem proliferativa" referem-se a desordens que estão associadas com algum grau de proliferação celular anormal. Numa concretização, a desordem proliferativa celular é o cancro. "Tumor", como aqui se utiliza, refere-se a todo o crescimento e proliferação de células neoplásicas, quer malignas quer benignas e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Os termos "cancro", "canceroso", " desordem proliferativa celular", "desordem proliferativa" e "tumor" não são mutuamente exclusivos como aqui referido.
Os termos "cancro" e "canceroso" referem-se a, ou descrevem, a condição fisiológica nos mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento/proliferação celular desregulado. Os exemplos de cancro incluem, mas não se lhes limitando, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares destes cancros incluem cancro de células escamosas, cancro do pulmão de células pequenas, cancro do pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, cancro do peritoneu, cancro hepatocelular, cancro gastrointestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro cervical, cancro ovariano, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro do cólon, cancro colorrectal, carcinoma do endométrio ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, cancro do rim, cancro do fígado, cancro da próstata, cancro vulvar, cancro da tiróide, carcinoma hepático e vários tipos de cancro da cabeça e pescoço. 91
ΕΡ 1 784 426 PT A desregulação da angiogénese pode conduzir a muitas desordens que podem ser tratadas por composições e métodos da invenção. Estas desordens incluem tanto condições não neoplásicas como neoplásicas. As neoplásicas incluem, mas não se lhes limitam, as descritas acima. As desordens não neoplásicas incluem, mas não se lhes limitando, hipertrofia indesejada ou aberrante, artrite, artrite reumatóide (AR), psoriase, placas psoriásicas, sarcoidose, aterosclerose, placas ateroscleróticas, retinopatias diabéticas e outras retinopatias proliferativas incluindo retinopatia da prematuridade, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneração macular relacionada com a idade, edema macular diabético, neovascularização corneai, neovascularização de enxerto corneai, rejeição de enxerto corneai, neovascularização retinal/coroidal, neovascularização do ângulo (rubeose), doença neovascular ocular, restenose vascular, malformações arteriovenosas (MAV), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias da tiróide (incluindo doença de Grave), transplantação de tecido corneai e outros tecidos, inflamação crónica, inflamação pulmonar, lesão pulmonar aguda/SDRA, sépsia, hipertensão pulmonar primária, efusões pulmonares malignas, edema cerebral (e.g., associado com icto agudo/ lesão da cabeça fechada/ traumatismo), inflamação sinovial, formação de panos na AR, miosite ossificante, formação hipertrópica óssea, osteoartrite (OA) , ascites refractárias, doença ovariana policística, endometriose, 3o espaçamento de doenças de fluidos (pancreatite, sindrome do compartimento, queimaduras, doença do intestino), fibróides uterinos, trabalho de parto prematuro, inflamação crónica tal como DII (doença de Crohn e colite ulcerativa), rejeição de aloenxerto renal, doença inflamatória do intestino, sindrome nefrótica, crescimento de massa de tecidos indesejada ou aberrante (não cancerosa), articulações hemofílicas, cicatrizes hipertróficas, inibição de crescimento de cabelos, sindrome de Osler-Weber, granuloma piogénico, fibroplasias retrolentais, esclerodermia, tracoma, adesões vasculares, sinovite, dermatite, pré-eclâmpsia, ascites, efusão pericardial (tal como a associada a pericardite) e efusão pleural. 92
ΕΡ 1 784 426 PT
Como aqui se utiliza, "tratamento" refere-se uma intervenção clinica numa tentativa para alterar o decurso natural do indivíduo ou célula que estão a ser tratados e pode ser realizado quer para profilaxia quer durante o decorrer da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas directas ou indirectas da doença, prevenção de metástases, diminuição da velocidade de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado de doença e remissão ou prognóstico melhorado. Em algumas concretizações, são utilizados anticorpos da invenção para retardar o desenvolvimento de uma doença ou desordem.
Uma "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para conseguir o resultado terapêutico ou profiláctico desej ado.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma substância/molécula da invenção, agonista ou antagonista pode variar de acordo com factores tais como o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo e com a capacidade da substância/molécula agonista ou antagonista eliciar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma com a qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da substância/molécula agonista ou antagonista são excedidos pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilacticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para conseguir o resultado profiláctico desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, como uma dose profiláctica é utilizada em indivíduos antes, ou num estádio inicial, da doença, a quantidade profilacticamente eficaz será inferior à quantidade terapeuticamente eficaz. A expressão "agente citotóxico", como aqui se utiliza, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa a destruição de células. Na expressão pretende-se incluir isótopos radioactivos (e.g., At211, I131, 1125^ γ90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos 93 ΕΡ 1 784 426 PT de Lu), agentes quimioterapêuticos e.g. metotrexato, adriamicina, alcaloides de vinca (vincristina, vimblastina, etoposido), doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes, enzimas e seus fragmentos tais como enzimas nucleoliticas, antibióticos e toxinas tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes e os vários agentes antitumorais ou anticancerosos divulgados adiante. Outros agentes citotóxicos são descritos adiante. Um agente tumoricida provoca a destruição de células tumorais.
Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento do cancro. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquilsulfonatos tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetra-hidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colcicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecano, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de azoto tais como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (e.g., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama II e caliqueamicina ómega II 94 ΕΡ 1 784 426 PT (veja-se, e.g., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; assim como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos de antiobióticos de enediina de cromoproteina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolinodoxorrubicina, cianomorfolinodoxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-supra-renais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositores de ácido fólico tais como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglúcido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinóides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo de polissacáridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, e.g., paclitaxel TAXOL® 95 ΕΡ 1 784 426 PT (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE” isento de Cremophor, formulação de nanoparticulas manipuladas com albumina de paclitaxel (American Pharmaceutic Partners, Schaumberg, Illinois) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucilo; gencitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vimblastina (VELBAN®)/ platina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorrelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides tais como ácido retinóico; capecitabina (XELODA®); sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos anteriores; assim como combinações de dois ou mais dos anteriores tais como CHOP, uma abreviatura para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona e FOLFOX, uma abreviatura para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN™) combinada com 5-FU e leucovovina.
Estão também incluídos nesta definição os agentes anti-hormonais que actuam para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormonas que podem promover o crescimento de cancro e estão frequentemente na forma de tratamento sistémico ou de corpo completo. Podem eles próprios ser hormonas. Os exemplos incluem antiestrogénios e moduladores selectivos de receptores de estrogénio (SERM), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo o tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno FARESTON®; anti-progesteronas; infra-reguladores do receptor de estrogénio (ERD); agentes que funcionam para suprimir ou inutilizar os ovários, por exemplo, agonistas da hormona de libertação da hormona leutinizante (LHRH) tais como acetato de leuprolida LUPRON® e ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outros anti-androgénios tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogénio nas glândulas supra-renais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestano, 96 ΕΡ 1 784 426 PT fadrozole, vorozole RIVISOR®, letrozole FEMARA® e anastrozole ARIMIDEX®. Em adição, esta definição de agentes quimioterapêuticos inclui bisfosfonatos tais como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID® ou risedronato ACTONEL®; assim como troxacitabina (um análogo 1,3-dioxolano de nucleósido de citosina); oligonucleótidos anti-sentido, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em vias de sinalização implicadas na proliferação celular aberrante, tais como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras e receptor do factor de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas tais como a vacina THERATOPE® e vacinas de terapia génica, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor de topoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (um inibidor de molécula pequena de tirosina-quinase duplo ErbB-2 e EGFR também conhecido como GW572016); e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos anteriores.
Um "agente inibidor do crescimento", quando aqui se utiliza, refere-se a um composto ou uma composição que inibe o crescimento de uma célula cujo crescimento é dependente da activação de beta7 quer in vitro quer ín vivo. Assim, o agente inibidor do crescimento pode ser um que reduz significativamente a percentagem de células dependentes de beta7 em fase S. Os exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão no ciclo celular (num lugar que não a fase S) , tais como agentes que induzem paragem em G1 e paragem na fase M. Os bloqueadores de fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vimblastina), os taxanos e os inibidores de topoisomerase II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido e bleomicina. Os agentes que param em G1 também transbordam para paragem em fase S, por exemplo, agentes alquilantes do ADN tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo e ara-C. Pode encontrar-se mais informação em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds., Chapter 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs" de Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente a p. 13. Os taxanos 97 ΕΡ 1 784 426 PT (paclitaxel e docetaxel) são fármacos anticancerosos ambos derivados do teixo. 0 docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semi-sintético do paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). 0 paclitaxel e o docetaxel promovem a montagem de microtúbulos a partir de dimeros de tubulina e estabilizam os microtúbulos prevenindo a despolimerização, do que resulta a inibição da mitose nas células. A "doxorrubicina" é um antibiótico de antraciclina. 0 nome químico completo da doxorrubicina é (8S-cis)-10-[ (3-amino-2,3, 6-tridesoxi-cx-L-lixo-hexapiranosil) oxi] -7,8,9, 10-tetra-hidro-6,8,ll-tri-hidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,12-naftacenodiona.
Os compostos úteis em terapia de combinação com um anticorpo antagonista anti-beta7 da invenção incluem anticorpos (incluindo, sem limitação, outros anticorpos antagonistas anti-beta7 (Fib 21, 22, 27, 30 (Tidswell, M. (1997) supra) ou seus derivados humanizados), anticorpos anti-alfa4 (tais como ANTIGEN®), compostos anti-TNF (REMICADE®)) ou não proteínicos incluindo, sem limitação, compostos 5-ASA ASACOL®, PENTASA™, ROWASA™, COLAZAL™ e outros compostos tais como Purinethol e esteróides tais como prednisona. Numa concretização, a invenção abrange um método de tratamento de um paciente, tal como um paciente humano, com o anticorpo antagonista anti-beta7 da invenção sozinho ou em combinação com um segundo composto que é também útil no tratamento da inflamação. Numa concretização, o segundo composto é seleccionado do grupo que consiste em Fib 21, 22, 27, 30 ou seus derivados humanizados), anticorpos anti-alfa4, anti-TNF ANTEGEN®, REMICADE®, compostos 5-ASA, ASACOL®, PENTASA™, ROWASA™, COLAZAL™, Purinethol, esteróides e prednisona. Numa concretização da invenção, a administração do anticorpo antagonista anti-beta7 da invenção reduz substancialmente a dose do segundo composto. Numa concretização, a referida redução na dose do segundo composto é de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%. Numa concretização da invenção, a combinação do anticorpo da invenção e a dose reduzida do segundo composto aliviam os 98 ΕΡ 1 784 426 PT sintomas no paciente para substancialmente o mesmo grau ou melhor do que a administração do segundo composto sozinho.
Geração de anticorpos variantes que exibem resposta de HAMA reduzida ou ausente A redução ou eliminação de uma resposta de HAMA (anti-ratinho humana (também aplicável a anti-rato humana ou anti-humana humana) constitui um aspecto significativo do desenvolvimento clinico de agentes terapêuticos adequados. Veja-se, e.g., Khaxzaeli et al. , J. Natl. Câncer Inst. (1988), 80:937; Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572; Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller et al., Blood (1983), 62:988; Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann et al. , Nature (1988), 332:323; Junghans et al. , Câncer Res. (1990), 50:1495. Como aqui descrito, a invenção proporciona anticorpos que são humanizados de modo a que a resposta de HAMA seja reduzida ou eliminada. As variantes destes anticorpos podem ainda ser obtidas utilizando métodos de rotina conhecidos na especialidade, alguns dos quais são adicionalmente descritos adiante.
Por exemplo, uma sequência de aminoácidos de um anticorpo como aqui descrito pode servir como uma sequência de partida (progenitora) para diversificação de sequência(s) de esqueleto e/ou hipervariável(eis). Uma sequência de esqueleto seleccionada à qual é ligada uma sequência hipervariável de partida é referida aqui como um esqueleto humano aceitador. Embora os esqueletos humanos aceitadores possam ser de, ou derivados de, uma imunoglobulina humana (as suas regiões VL e/ou VH) , preferivelmente os esqueletos humanos aceitadores são de, ou derivados de, uma sequência de esqueleto de consenso humano pois demonstrou-se que estes esqueletos têm uma imunogenicidade mínima ou nula, em pacientes humanos.
Quando o aceitador é derivado de uma imunoglobulina humana, pode opcionalmente seleccionar-se uma sequência de esqueleto humana que é seleccionada com base na sua homologia com a sequência de esqueleto dadora por alinhamento da sequência de esqueleto dadora com várias sequências de esqueleto humanas numa colecção de sequências de esqueleto 99
ΕΡ 1 784 426 PT humanas e selecção da sequência de esqueleto mais homóloqa da aceitadora.
Numa concretização, os esqueletos de consenso humanos aqui são de, ou derivados de, sequências de esqueletos de consenso VH do subgrupo III e/ou VL capa do subgrupo I.
Assim, o esqueleto humano VH aceitador pode compreender uma, duas, três ou todas as seguintes sequências de esqueleto: FR1 compreendendo EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:38), FR2 compreendendo WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:39), FR3 compreendendo RFTISX1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:42), em que XI é A ou R, X2 é T ou N e X3 é A, L ou F, FR4 compreendendo WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:41).
Os exemplos de esqueletos de consenso VH incluem: esqueleto de consenso VH do subgrupo I humano menos as CDR de Kabat (SEQ ID NO:19); esqueleto de consenso VH do subgrupo I humano menos as regiões hipervariáveis alargadas (SEQ ID NO:20-22); esqueleto de consenso VH do subgrupo II humano menos as CDR de Kabat (SEQ ID NO:48); esqueleto de consenso VH do subgrupo II humano menos as regiões hipervariáveis alargadas (SEQ ID NO:49-51); esqueleto de consenso VH do subgrupo III humano menos as CDR de Kabat (SEQ ID NO:52); esqueleto de consenso VH do subgrupo III humano menos as regiões hipervariáveis alargadas (SEQ ID NO:53-55); esqueleto aceitador VH humano menos as CDR de Kabat (SEQ ID NO:5 6); esqueleto aceitador VH humano menos as regiões hipervariáveis alargadas (SEQ ID NO:57-58); esqueleto aceitador 2 VH humano menos as CDR de Kabat (SEQ ID NO:59); ou esqueleto aceitador 2 VH humano menos as regiões hipervariáveis alargadas (SEQ ID NO:60-62). 100
ΕΡ 1 784 426 PT
Numa concretização, o esqueleto humano VH aceitador compreende uma, duas, três ou todas as seguintes sequências de esqueleto: FR1 compreendendo EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:38), FR2 compreendendo WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:39), FR3 compreendendo RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:43), RFTISRDTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ IDNO:44), RFTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:45), RFTTSADTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:46), FR4 compreendendo WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:41). O esqueleto humano VL aceitador pode compreender uma, duas, três ou todas as seguintes sequências de esqueleto: FR1 compreendendo DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:34), FR2 compreendendo WYQQKPGKAPKLLI (SEQ ID NO:35),
FR3 compreendendo GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:3 6), FR4 compreendendo FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:37).
Os exemplos de esqueletos de consenso VL incluem:
esqueleto NO:14); de consenso VL do subgrupo I capa humano (SEQ ID esqueleto de consenso VL do subgrupo I capa humano (HVR-L2 alargado) (SEQ ID NO: 15) ; esqueleto NO:16); de consenso VL do subgrupo II capa humano (SEQ ID esqueleto de consenso VL do subgrupo III capa humano (SEQ ID NO:17); ou esqueleto NO:18) de consenso VL do subgrupo IV capa humano (SEQ ID
Embora o aceitador possa ser idêntico em sequência à sequência de esqueleto humana seleccionada, seja de uma imunoglobulina humana ou um esqueleto de consenso humano, a presente invenção contempla que a sequência aceitadora possa compreender substituições de aminoácidos preexistentes relativamente à sequência de imunoglobulina humana ou à 101 ΕΡ 1 784 426 PT sequência de esqueleto de consenso humano. Estas substituições de preexistentes são preferivelmente mínimas; usualmente quatro, três, duas ou uma diferenças de aminoácidos apenas relativamente à sequência de imunoglobulina humana ou à sequência de esqueleto de consenso.
Os resíduos da região hipervariável do anticorpo não humano são incorporadas nos esqueletos humanos VL e/ou VH aceitadores. Por exemplo, podem incorporar-se resíduos correspondentes aos resíduos de CDR de Kabat, aos resíduos de voltas hipervariáveis de Chothia, aos resíduos de ABm e/ou aos resíduos de contacto. Opcionalmente, são incorporados os resíduos da região hipervariável alargada como se segue: 24-34 (Ll), 49-56 (L2) e 89-97 (L3), 26-35 (Hl), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3).
Embora seja aqui discutida a "incorporação" de resíduos da região hipervariável, será notado que esta pode ser conseguida de várias maneiras, por exemplo, ácido nucleico que codifica as sequências de aminoácidos desejadas pode ser gerado por mutação de ácido nucleico que codifica a sequência do domínio variável de ratinho de modo a que os resíduos do seu esqueleto sejam alterados para resíduos do esqueleto humano aceitador ou por mutação de ácido nucleico que codifica a sequência do domínio variável humano de modo a que os resíduos do domínio hipervariável sejam alterados para resíduos não humanos ou por síntese de ácido nucleico que codifica a sequência desejada, etc.
Nos presentes exemplos, as variantes enxertadas na região hipervariável foram geradas por mutagénese de Kunkel de ácido nucleico que codifica as sequências aceitadoras humanas, utilizando um oligonucleótido separado para cada região hipervariável. Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987). As alterações apropriadas podem ser introduzidas no esqueleto e/ou na região hipervariável, utilizando técnicas de rotina, para corrigir e restabelecer as correctas interacções região hipervariável-antigénio. A exibição sobre fagos(fagemídeos) (também referida aqui como exibição em fagos em alguns contextos) pode ser utilizada como um método conveniente e rápido para gerar e rastrear 102 ΕΡ 1 784 426 PT muitos anticorpos variantes potenciais diferentes numa biblioteca gerada por randomização de sequências. Contudo, estão disponíveis aos peritos na especialidade outros métodos para preparar e rastrear anticorpos alterados. A tecnologia de exibição sobre fagos(fagemídeos) proporcionou uma poderosa ferramenta para gerar e seleccionar novas proteínas que se ligam a um ligando, tais como um antigénio. Utilizando as técnicas de exibição sobre fagos(fagemídeos) é possível gerar grandes bibliotecas de variantes de proteínas que podem ser rapidamente seleccionadas quanto às sequências que se ligam a uma molécula alvo com elevada afinidade. Os ácidos nucleicos que codificam polipéptidos variantes são geralmente fundidos com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína do revestimento virai, tal como a proteína do gene III ou a proteína do gene VIII. Foram desenvolvidos sistemas de exibição sobre fagemídeos monovalentes em que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína ou o polipéptido está fundida com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma porção da proteína do gene III. (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman e Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)). Num sistema de exibição sobre fagemídeos monovalente, a fusão génica é expressa em baixos níveis e são também expressas proteínas do gene III do tipo selvagem de modo que é retida a infecciosidade das partículas. Os métodos para gerar bibliotecas peptídicas e rastrear essas bibliotecas foram divulgados em muitas patentes (e.g. Patente U.S. 5,723,236, Patente U.S. 5,432,018, Patente U.S. 5,580,717, Patente U.S. 5,427,908 e Patente U.S. 5, 498,530) .
Foram preparadas bibliotecas de anticorpos ou polipéptidos de ligação ao antigénio de várias maneiras incluindo por alteração de um único gene por inserção de sequências de ADN aleatórias ou por clonagem de uma família de genes relacionados. Os métodos para exibição de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio utilizando exibição sobre fagos(fagemídeos) foram descritos nas Patentes U.S. 5,750,373, 5,733,743, 5,837,242, 5,969,108, 6,172,197, 5,580,717 e 5,658,727. A biblioteca é então rastreada quanto a expressão 103 ΕΡ 1 784 426 PT de anticorpos ou proteínas de ligação ao antigénio com as caracteristicas desejadas.
Os métodos de substituição de um aminoácido de eleição num ácido nucleico molde estão bem estabelecidos na especialidade, alguns dos quais são aqui descritos. Por exemplo, resíduos da região hipervariável podem ser substituídos utilizando o método de Kunkel. Veja-se, por exemplo, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987).
As sequências de oligonucleótidos incluem um ou mais dos conjuntos de codões designados para serem alterados resíduos da região hipervariável. Um conjunto de codões é um conjunto de diferentes sequências de tripletos de nucleótidos utilizadas para codificar os aminoácidos variantes desejados. Os conjuntos de codões podem ser representados utilizando símbolos para designar nucleótidos particulares ou misturas equimolares de nucleótidos como mostrado adiante de acordo com o código IUB.
CÓDIGOS IUB G Guanina A Adenina T Timina C Citosina R (A ou G) Y (C ou T) M (A OU C) K (G ou T) S (C ou G) W (A ou T) Η (A ou C ou T) B (C OU G ou T) V (A ou C ou G) D (A ou G ou T) H N (A ou C ou G ou T)
Por exemplo, no conjunto de codões DVK, D pode ser os nucleótidos A ou G ou T; V pode ser A ou G ou C; e K pode ser G ou T. Este conjunto de codões pode apresentar 18 diferentes 104 ΕΡ 1 784 426 PT codões e pode codificar os aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly e Cys.
Os conjuntos de oligonucleótidos ou iniciadores podem ser sintetizados utilizando métodos padrão. Um conjunto de oligonucleótidos pode ser sintetizado, por exemplo, por síntese em fase sólida, contendo sequências que representam todas as combinações possíveis de tripletos de nucleótidos proporcionadas pelo conjunto de codões e que irão codificar o grupo desejado de aminoácidos. A síntese de oligonucleótidos com a "degenerescência" de nucleótidos seleccionada em determinadas posições é bem conhecida na especialidade. Estes conjuntos de nucleótidos possuindo determinados conjuntos de codões podem ser sintetizados utilizando sintetizadores de ácido nucleico comerciais (disponíveis de, por exemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA) ou podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, de Life Technologies, Rockville, MD) . Portanto, um conjunto de oligonucleótidos sintetizado possuindo um conjunto de codões particular, tipicamente, incluirá uma pluralidade de oligonucleótidos com diferentes sequências, as diferenças estabelecidas pelo conjunto de codões dentro da sequência global. Os oligonucleótidos, como utilizado de acordo com a invenção, têm sequências que permitem a hibridação com um molde de ácido nucleico de domínio variável e também podem incluir locais para enzimas de restrição para fins de clonagem.
Num método, as sequências de ácido nucleico que codificam aminoácidos variantes podem ser criadas por mutagénese mediada por oligonucleótidos. Esta técnica é bem conhecida na especialidade como descrito por Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10:6487-6504 (1987). Resumidamente, as sequências de ácido nucleico que codificam aminoácidos variantes são criadas por hibridação de um conjunto de oligonucleótidos que codificam os conjuntos desejados de codões com um molde de ADN, em que o molde é a forma de cadeia simples do plasmídeo contendo uma sequência molde de ácido nucleico de uma região variável. Após a hibridação, utiliza-se ADN-polimerase para sintetizar uma segunda cadeia completa complementar ao molde que irá assim incorporar o iniciador oligonucleotídico e irá conter os conjuntos de codões conforme proporcionados pelo conjunto de oligonucleótidos. 105
ΕΡ 1 784 426 PT
Geralmente, utilizam-se oligonucleótidos de pelo menos 25 nucleótidos de comprimento. Um oligonucleótido óptimo terá 12 a 15 nucleótidos que são completamente complementares ao molde de cada um dos lados do(s) nucleótido(s) que codificam para a(s) mutação(ões). Isto assegura que o oligonucleótido hibridará correctamente com a molécula molde de ADN de cadeia simples. Os oligonucleótidos são prontamente sintetizados utilizando técnicas conhecidas na especialidade tal como a descrita por Crea et al., Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA, 75:5765 (1978). O molde de ADN é gerado pelos vectores que são derivados de vectores bacteriofágicos M13 (os vectores M13mpl8 e M13mpl9 comercialmente disponíveis são adequados) ou vectores que contêm uma origem de replicação fágica de cadeia simples como descrito por Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Assim, o ADN que vai ser mutado pode ser inserido num destes vectores de modo a gerar o molde de cadeia simples. A produção do molde de cadeia simples é descrita nas secções 4.21-4.41 de Sambrook et al., acima.
Para alterar a sequência de ADN nativa, o oligonucleótido é hibridado com o molde de cadeia simples sob condições de hibridação adequadas. Uma enzima de polimerização de ADN, usualmente ADN-polimerase de T7 ou o fragmento de Klenow da ADN-polimerase I, é então adicionada para sintetizar a cadeia complementar ao molde utilizando o oligonucleótido como iniciador para a síntese. É assim formada uma molécula heterodúplex tal que uma cadeia de ADN codifica a forma mutada do gene 1 e a outra cadeia (o molde original) codifica a sequência inalterada, nativa, do gene 1. Esta molécula heterodúplex é então transformada numa célula hospedeira adequada, usualmente um procariota tal como E. coli JM101. Após crescimento das células, estas são plaqueadas em placas de agarose e rastreadas utilizando o iniciador oligonucleotídico radiomarcado com um 32-Fosfato para identificar as colónias bacterianas que contêm o ADN mutado. O método descrito imediatamente acima pode ser modificado de modo a ser criada uma molécula homodúplex em que ambas as cadeias do plasmídeo contêm a(s) mutação(ões). As modificações 106 ΕΡ 1 784 426 PT são como se segue: O oligonucleótido de cadeia simples é hibridado com o molde de cadeia simples como descrito acima. Uma mistura de três desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) e desoxirribotimidina (dTT), é combinada com uma tiodesoxirribocitosina modificada denominada dCTP-(aS) (que pode ser obtida de Amersham) . Esta mistura é adicionada ao complexo molde-oligonucleótido. Por adição de ADN-polimerase a esta mistura, é gerada uma cadeia de ADN idêntica ao molde excepto quanto às bases mutadas. Em adição, esta nova cadeia de ADN conterá dCTP-(aS) em vez de dCTP, o que serve para a proteger da digestão por endonucleases de restrição. Após a cadeia molde do heterodúplex de cadeia dupla ser cortado com uma enzima de restrição apropriada, a cadeia molde pode ser digerida com nuclease ExoIII ou outra nuclease apropriada depois da região que contém o(s) local(ais) a mutar. A reacção é então parada para deixar uma molécula que é apenas parcialmente de cadeia simples. É então formado um ADN homodúplex completo de cadeia dupla utilizando ADN-polimerase na presença de todos os quatro desoxirribonucleótido-trifosfatos, ATP e ADN-ligase. Esta molécula homodúplex pode então ser transformada numa célula hospedeira adequada.
Como indicado previamente, a sequência do conjunto de oligonucleótidos tem comprimento suficiente para hibridar com o ácido nucleico molde e pode também conter, embora não necessariamente, locais de restrição. 0 molde de ADN pode ser gerado pelos vectores que são derivados de vectores bacteriofágicos M13 ou vectores que contêm uma origem de replicação fágica de cadeia simples como descrito por Viera et al. Meth. Enzymol., 153:3 (1987) . Assim, o ADN que vai ser mutado tem que ser inserido num destes vectores de modo a gerar o molde de cadeia simples. A produção do molde de cadeia simples está descrita nas secções 4.21-4.41 de Sambrook et al., supra.
De acordo com outro método, pode ser gerada uma biblioteca proporcionando conjuntos de oligonucleótidos a montante e a jusante, possuindo cada conjunto uma pluralidade de oligonucleótidos com diferentes sequências, as diferentes sequências estabelecidas pelos conjuntos de codões proporcionados no interior da sequência dos oligonucleótidos. 107
ΕΡ 1 784 426 PT
Os conjuntos de oligonucleótidos a montante e a jusante, juntamente com uma sequência de ácido nucleico molde de domínio variável, podem ser utilizados numa reacção em cadeia pela polimerase para gerar uma "biblioteca" de produtos de PCR. Os produtos de PCR podem ser referidos como "cassetes de ácido nucleico", pois podem ser fundidos com outras sequências de ácido nucleico relacionadas ou não relacionadas, por exemplo, proteínas de revestimento virai e domínios de dimerização, utilizando técnicas estabelecidas de biologia molecular. A sequência dos iniciadores de PCR inclui um ou mais dos conjuntos de codões projectados para as posições acessíveis ao solvente e altamente diversas numa região hipervariável. Como descrito acima, um conjunto de codões é um conjunto de sequências de tripletos de nucleótidos diferentes utilizadas para codificar os aminoácidos variantes desejados.
Os seleccionantes de anticorpos que cumprem os critérios desejados, seleccionados através dos passos de rastreio/selecção apropriados, podem ser isolados e clonados utilizando técnicas recombinantes padrão.
Vectores, Células Hospedeiras e Métodos Recombinantes
Para a produção recombinante de um anticorpo da invenção, o ácido nucleico que o codifica é isolado e inserido num vector replicável para posterior clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. O ADN que codifica o anticorpo é prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (e.g., utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). Muitos vectores estão disponíveis. A escolha do vector depende em parte da célula hospedeira que se vai utilizar. Geralmente, as células hospedeiras preferidas são de origem procariota ou eucariota (geralmente de mamífero).
Geração de anticorpos utilizando células hospedeiras procaríotas:
Construção do Vector
As sequências polinucleotídicas que codificam componentes polipeptídicos do anticorpo da invenção podem ser obtidas 108 ΕΡ 1 784 426 PT utilizando técnicas recombinantes padrão. As sequências polinucleotidicas desejadas podem ser isoladas e sequenciadas a partir de células produtoras do anticorpo tais como células de hibridoma. Alternativamente, os polinucleótidos podem ser sintetizados utilizando um sintetizador de nucleótidos ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas, as sequências que codificam os polipéptidos são inseridas num vector recombinante capaz de replicar e expressar polinucleótidos heterólogos em hospedeiros procariotas. Muitos vectores que estão disponíveis e são conhecidos na especialidade podem ser utilizados para os fins da presente invenção. A selecção de um vector apropriado dependerá principalmente da dimensão dos ácidos nucleicos a inserir no vector e da célula hospedeira particular a transformar com o vector. Cada vector contém vários componentes, dependendo da sua função (amplificação ou expressão de polinucleótidos heterólogos ou ambas) e da sua compatibilidade com a célula hospedeira particular em que reside. As componentes do vector incluem geralmente, mas não se lhes limitam: uma origem de replicação, um gene marcador de selecção, um promotor, um local de ligação ao ribossoma (RBS), uma sequência de sinal, o ácido nucleico heterólogo inserido e uma sequência de terminação da transcrição.
Em geral, utilizam-se vectores plasmídicos contendo sequências de replicão e de controlo que são derivadas de uma espécie compatível com a célula hospedeira em relação a estes hospedeiros. 0 vector vulgarmente é portador de um local de replicação, assim como de sequências marcadoras que são capazes de proporcionar selecção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, a E. coli é tipicamente transformada utilizando pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli. O pBR322 contém genes que codificam resistência a ampicilina (Amp) e a tetraciclina (Tet) e assim proporciona um fácil meio para a identificação de células transformadas. 0 pBR322, seus derivados ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófagos, podem também conter ou ser modificados para conter, promotores que podem ser utilizados pelo organismo microbiano para a expressão de proteínas endógenas. Os exemplos de derivados de pBR322 utilizados para a expressão de anticorpos particulares estão descritos com detalhes em Cárter et al., Patente U.S. 5,645,237. 109
ΕΡ 1 784 426 PT
Em adição, vectores fágicos contendo sequências de replicão e de controlo que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem ser utilizados como vectores de transformação em relação a estes hospedeiros. Por exemplo, um bacteriófago tal como AGEM.TM.-11 pode ser utilizado para preparar um vector recombinante que pode ser utilizado para transformar células hospedeiras susceptíveis tais como E. coli LE392. O vector de expressão pode compreender dois ou mais pares promotor-cistrão, codificando cada uma das componentes polipeptídicas. Um promotor é uma sequência reguladora não traduzida localizada a montante (5') de um cistrão que modula a sua expressão. Os promotores procariotas tipicamente caiem em duas classes, indutiveis e constitutivos. O promotor indutível é um promotor que inicia níveis aumentados de transcrição do cistrão sob o seu controlo em resposta a alterações nas condições de cultura, e.g. a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura. São bem conhecidos um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras. O promotor seleccionado pode ser operativamente ligado a ADN do cistrão que codifica a cadeia leve ou pesada por remoção do promotor a partir da fonte de ADN por via de digestão com enzimas de restrição e inserção da sequência promotora isolada no vector da invenção. Tanto a sequência promotora nativa como muitos promotores heterólogos podem ser utilizados para dirigir a amplificação e/ou a expressão dos genes alvo. Em algumas concretizações, são utilizados promotores heterólogos, pois estes geralmente permitem maior transcrição e superiores rendimentos de gene alvo expresso em comparação com o promotor do polipéptido alvo nativo.
Os promotores adequados para utilização com hospedeiros procariotas incluem o promotor PhoA, os sistemas promotores da β-galactamase e da lactose, um sistema promotor do triptofano (trp) e promotores híbridos tais como o promotor tac ou o trc. Contudo, outros promotores que são funcionais em bactérias (tais como outros promotores bacterianos ou fágicos conhecidos) são igualmente adequados. As suas sequências de nucleótidos foram publicadas, desse modo permitindo que um 110 ΕΡ 1 784 426 PT técnico especializado os ligue operativamente a cistrões que codificam as cadeias leves e pesadas alvo (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) utilizando ligantes ou adaptadores para fornecer quaisquer locais de restrição necessários.
Num aspecto da invenção, cada cistrão dentro do vector recombinante compreende uma componente sequência de sinal de secreção que dirige a translocação dos polipéptidos expressos através de uma membrana. Em geral, a sequência de sinal pode ser uma componente do vector ou pode ser uma parte do ADN do polipéptido alvo que é inserido no vector. A sequência de sinal seleccionada para os fins da presente invenção deverá ser uma que é reconhecida e processada (i.e. clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procariotas que não reconhecem nem processam as sequências de sinal nativas dos polipéptidos heterólogos, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariota seleccionada, por exemplo, do grupo que consiste em comandos de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina II estável ao calor (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA e MBP. Numa concretização da invenção, as sequências de sinal utilizadas em ambos os cistrões do sistema de expressão são as sequências de sinal STII ou suas variantes.
Noutro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo com a invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira e portanto não requer a presença de sequências de sinal de secreção dentro de cada cistrão. A esse respeito, as cadeias leve e pesada da imunoglobulina são expressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais dentro do citoplasma. Certas estirpes hospedeiras (e.g., as estirpes de E. coli trxB~) proporcionam condições no citoplasma que são favoráveis para a formação de ligações dissulfureto, desse modo permitindo a correcta dobragem e montagem de subunidades de proteína expressas. Proba e Pluckthun Gene, 159:203 (1995). A presente invenção proporciona um sistema de expressão em que a razão quantitativa de componentes de polipéptidos expressos pode ser modulada de modo a maximizar o rendimento de anticorpos da invenção segregados e correctamente montados. Esta modulação é realizada, pelo menos em parte, por modulação 111 ΕΡ 1 784 426 PT simultânea das forças de tradução para os componentes do polipéptido.
Uma técnica para modular a força da tradução é divulgada em Simmons et al., Pat. U.S. 5, 840, 523. Utiliza variantes da região de iniciação da tradução (TIR) no interior de um cistrão. Para uma determinada TIR, podem ser criadas uma série de variantes de sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico com uma gama de forças de tradução, desse modo proporcionando um meio conveniente para ajustar este factor ao nível de expressão desejado da cadeia específica. As variantes de TIR podem ser geradas por técnicas convencionais de mutagénese que resultam em alterações de codões que podem alterar a sequência de aminoácidos, embora sejam preferidas alterações silenciosas na sequência de nucleótidos. As alterações na TIR podem incluir, por exemplo, alterações no número ou no espaçamento de sequências de Shine-Dalgarno, juntamente com alterações na sequência de sinal. Um método para gerar sequências de sinal mutantes é a geração de um "banco de codões" no início de uma sequência de codificação que não altera a sequência de aminoácidos da sequência de sinal (i.e., as alterações são silenciosas). Isto pode ser realizado alterando o nucleótido da terceira posição de cada codão; adicionalmente, alguns aminoácidos, tais como leucina, serina e arginina, têm múltiplas primeira e segunda posições que podem adicionar complexidade na preparação do banco. Este método de mutagénese é descrito com detalhes em Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158.
Preferivelmente, é gerado um conjunto de vectores com uma gama de forças de TIR para cada um dos seus cistrões. Este conjunto limitado proporciona uma comparação de niveis de expressão de cada cadeia assim como o rendimento dos produtos de anticorpo desejados sob várias combinações de força de TIR. As forças de TIR podem ser determinadas quantificando o nível de expressão de um gene repórter como descrito em detalhe em Simmons et al. Pat. U.S. 5,840,523. Com base na comparação de forças de tradução, são seleccionadas as TIR individuais desejadas para serem combinadas nas construções do vector de expressão da invenção. 112
ΕΡ 1 784 426 PT
As células hospedeiras procariotas adequadas para expressão de anticorpos da invenção incluem as Archaebacteria e Eubacteria, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos. Os exemplos destas bactérias úteis incluem Escherichia (e.g., E. coli), Bacilli (e.g., B. subtilis), Enterobacteria, espécies de Pseudomonas {e.g., P. aerugínosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscílla ou Paracoccus. Numa concretização, utilizam-se células Gram-negativas. Numa concretização, utilizam-se células de E. coli como hospedeiras para a invenção. Os exemplos de estirpes de E. coli incluem a estirpe W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; N.° de Depósito na ATCC 27,325) e seus derivados, incluindo a estirpe 33D3 possuindo o genótipo W3110 AfhuA (EtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA {nmpc-fepE) degP41 kanR (Pat. U.S. 5, 639, 635). Outras estirpes e seus derivados, tais como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. colix 1776 (ATCC 31,537) e E. coli RV308 (ATCC 31,608) são também adequadas. Estes exemplos são ilustrativos e não limitantes. Métodos para a construção de derivados de quaisquer das bactérias acima mencionadas possuindo genótipos definidos são conhecidos na especialidade e estão descritos, por exemplo, em Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). É geralmente necessário seleccionar as bactérias apropriadas tendo em consideração a replicabilidade do replicão nas células de uma bactéria. Por exemplo, E. coli, espécies de Serratia ou de Salmonella, podem ser adequadamente utilizadas como hospedeiros quando são utilizados plasmideos bem conhecidos tais como pBR322, pBR325, pACYC177 ou pKN410 para fornecer o replicão. Tipicamente, a célula hospedeira deverá segregar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas e inibidores de protease adicionais podem ser desejavelmente incorporados na cultura celular.
Produção de Anticorpos
As células hospedeiras são transformadas com os vectores de expressão acima descritos e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para induzir promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas. 113
ΕΡ 1 784 426 PT
Transformação significa introduzir ADN no hospedeiro procariota de modo a que o ADN seja replicável, quer como elemento extracromossómico quer integrado nos cromossomas. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando técnicas padrão apropriadas para essas células. 0 tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio é geralmente utilizado para células bacterianas que contêm barreiras de parede celular substanciais. Outro método para a transformação emprega polietilenoglicol/DMSO. Ainda outra técnica utilizada é a electroporação.
As células procariotas utilizadas para produzir os polipéptidos da invenção são crescidas em meios conhecidos na especialidade e adequados para a cultura das células hospedeiras seleccionadas. Os exemplos de meios adequados incluem caldo Luria (LB) mais os suplementos nutrientes necessários. Em algumas concretizações, os meios também contêm uma agente de selecção, escolhido com base na construção do vector de expressão, para selectivamente permitir o crescimento de células procariotas contendo o vector de expressão. Por exemplo, é adicionada ampicilina aos meios para crescimento de células que expressam o gene de resistência a ampicilina.
Quaisquer suplementos necessários para além das fontes de carbono, azoto e fosfato inorgânico, podem também ser incluídos em concentrações apropriadas introduzidos individualmente ou na forma de mistura com outros suplementos ou meios tais como uma fonte complexa de azoto. Opcionalmente, o meio de cultura pode conter um ou mais agentes redutores seleccionados do grupo que consiste em glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.
As células hospedeiras procariotas são cultivadas a temperaturas adequadas. Para o crescimento de E. coli, por exemplo, a temperatura preferida varia de cerca de 20°C a cerca de 39°C, mais preferivelmente de cerca de 25°C a cerca de 37°C, ainda mais preferivelmente a cerca de 30°C. 0 pH do meio pode ser qualquer pH variando de cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para a E. coli, o pH é preferivelmente de cerca de 6,8 a cerca de 7,4 e mais preferivelmente cerca de 7,0. 114
ΕΡ 1 784 426 PT
Se for utilizado um promotor indutivel no vector de expressão da invenção, a expressão da proteína é induzida sob condições adequadas para a activação do promotor. Num aspecto da invenção, utilizam-se promotores PhoA para controlar a transcrição dos polipéptidos. Deste modo, as células hospedeiras transformadas são cultivadas num meio com limitação de fosfato para indução. Preferivelmente, o meio com limitação de fosfato é o meio C.R.A.P (veja-se, por exemplo, Simmons et ai., J. Immumol. Methods (2002), 263:133-147). Podem ser utilizados uma variedade de outros indutores, de acordo com a construção de vector empregue, como é conhecido na especialidade.
Numa concretização, os polipéptidos expressos da presente invenção são segregados para, e recuperados do periplasma das células hospedeiras. A recuperação das proteínas tipicamente envolve a ruptura do microorganismo, geralmente por meios como choque osmótico, tratamento ultra-sónico ou lise. Uma vez concretizada a ruptura das células, os detritos celulares ou as células completas podem ser removidos por centrifugação ou filtração. As proteínas podem ser adicionalmente purificadas, por exemplo, por cromatografia em resina de afinidade. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas para meios de cultura e aí isoladas. As células podem ser removidas da cultura e o sobrenadante da cultura pode ser filtrado e concentrado para purificação adicional das proteínas produzidas. Os polipéptidos expressos podem ser ainda isolados e identificados utilizando métodos vulgarmente conhecidos tais como electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e ensaios Western blot.
Num aspecto da invenção, a produção de anticorpos é conduzida em grandes quantidades através de um processo de fermentação. Vários procedimentos de fermentação em descontínuo com alimentação em grande escala estão disponíveis para a produção de proteínas recombinantes. Os fermentadores para grande escala têm pelo menos 1000 litros de capacidade, preferivelmente cerca de 1000 a 100 000 litros de capacidade. Estes fermentadores utilizam propulsores agitadores para distribuir o oxigénio e os nutrientes, especialmente glucose (a fonte preferida de carbono/energia). A fermentação em 115 ΕΡ 1 784 426 PT pequena escala refere-se geralmente a uma fermentação num fermentador que não tem mais que aproximadamente 100 litros de capacidade volumétrica e pode estar na gama de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros.
Num processo de fermentação, a indução da expressão de proteínas é tipicamente iniciada após as células terem sido crescidas sob condições adequadas até uma densidade desejada, e.g., uma DO550 de cerca de 180-220, altura em que as células estão na fase estacionária inicial. Podem ser utilizados uma variedade de indutores, de acordo com a construção de vector empregue, como é conhecido na especialidade e descrito acima. As células podem ser crescidas durante períodos mais curtos antes da indução. As células são usualmente induzidas durante cerca de 12-50 horas, embora possam ser utilizados tempos de indução mais longos ou mais curtos.
Para melhorar o rendimento da produção e a qualidade dos polipéptidos da invenção, podem ser modificadas várias condições de fermentação. Por exemplo, para melhorar a montagem e dobragem correctas dos polipéptidos de anticorpos segregados, podem ser utilizados vectores adicionais que sobre-expressam proteínas chaperone, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e/ou DsbG) ou FkpA (uma peptidilprolil-cis,trans-isomerase com actividade de chaperone) para co-transformar as células hospedeiras procariotas. Foi demonstrado que as proteínas chaperone facilitam a correcta dobragem e a solubilidade de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et al. (1999) J Βίο Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., Patente U.S. 6, 083,715; Georgiou et al. , Patente U.S. 6,027,888; Bothmann e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.
Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas (especialmente as que são proteoliticamente sensíveis), podem ser utilizadas para a presente invenção determinadas estirpes hospedeiras deficientes em enzimas proteolíticas. Por exemplo, as estirpes de células hospedeiras podem ser modificadas para efectuar mutação(ões) genética (s) 116 ΕΡ 1 784 426 PT nos genes que codificam proteases bacterianas conhecidas tais como Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e suas combinações. Algumas estirpes de E. coli deficientes em proteases estão disponíveis e estão descritas, por exemplo, em Joly et ai. (1998), supra; Georgiou et ai., Patente U.S. 5,264,365; Georgiou et ai., Patente U.S. 5,508,192; Hara et ai., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
Numa concretização, estirpes de E. coli deficientes em enzimas proteoliticas e transformadas com plasmideos que sobre-expressam uma ou mais proteínas chaperone são utilizadas como células hospedeiras no sistema de expressão da invenção.
Purificação dos Anticorpos
Numa concretização, a proteína anticorpo aqui produzida é adicionalmente purificada para obter preparações que são substancialmente homogéneas para posteriores ensaios e utilizações. Podem ser empregues métodos padrão de purificação de proteínas conhecidos na especialidade. Os procedimentos seguintes são exemplificativos de procedimentos de purificação adequados: fraccionamento em colunas de imunoafinidade ou de permuta iónica, precipitação com etanol, HPLC de fase inversa, cromatografia em sílica ou uma resina de permuta catiónica tal como DEAE, cromatofocagem, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de amónio e filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75.
Num aspecto, utiliza-se Proteína A imobilizada numa fase sólida para a purificação por imunoafinidade dos produtos de anticorpo de comprimento completo da invenção. A proteína A é uma proteína da parede celular de 41kD de Staphylococcus aureas que se liga com elevada afinidade à região Fc de anticorpos. Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. A fase sólida em que a Proteína A é imobilizada é preferivelmente uma coluna compreendendo uma superfície de vidro ou de sílica, mais preferivelmente uma coluna de vidro de poro controlado ou uma coluna de ácido silícico. Em algumas aplicações, a coluna foi revestida com um reagente, tal como glicerol, numa tentativa de prevenir a aderência não específica de contaminantes. 117
ΕΡ 1 784 426 PT
Como primeiro passo de purificação, a preparação derivada da cultura celular como acima descrito é aplicada sobre a Proteína A imobilizada em fase sólida para permitir a ligação especifica do anticorpo de interesse à Proteína A. A fase sólida é então lavada para remover contaminantes não especificamente ligados à fase sólida. Finalmente, o anticorpo de interesse é recuperado da fase sólida por eluição.
Geração de anticorpos utilizando células hospedeiras eucariotas:
Os componentes do vector geralmente incluem, mas não se lhes limitam, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. (i) Componente sequência de sinal
Um vector para utilização numa célula hospedeira eucariota pode também conter uma sequência de sinal ou outro polipéptido possuindo um local de clivagem específico no terminal N da proteína madura ou do polipéptido de interesse. A sequência de sinal heteróloga seleccionada preferivelmente é uma que é reconhecida e processada (i.e., clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Na expressão em células de mamífero, estão disponíveis sequências de sinal de mamífero assim como comandos de secreção virais, por exemplo, o sinal de gD de herpes simplex. 0 ADN para esta região precursora é ligado em enquadramento de leitura ao ADN que codifica o anticorpo. (ii) Origem de replicação
Geralmente, uma componente origem de replicação não é necessária para vectores de expressão de mamífero. Por exemplo, a origem de SV40 pode tipicamente ser utilizada apenas porque contém o promotor precoce. (iii) Componente gene de selecção
Os vectores de expressão e de clonagem podem conter um gene de selecção, também denominado um marcador seleccionável. Os genes de selecção típicos codificam proteínas que 118
ΕΡ 1 784 426 PT (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, quando relevante ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos.
Um exemplo de um esquema de selecção utiliza um fármaco para parar o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência ao fármaco e portanto sobrevivem ao regime de selecção. Os exemplos desta selecção dominante utilizam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
Outro exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são aqueles que permitem a identificação de células competentes para tomar o ácido nucleico do anticorpo, tais como DHFR, timidina-quinase, metalotioneína-I e -II, preferivelmente genes de metalotioneína de primata, adenosina-desaminase, ornitina-descarboxilase, etc.
Por exemplo, células transformadas com o gene de selecção DHFR são primeiro identificadas por cultura de todos os transformantes num meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando é empregue DHFR de tipo selvagem é a linha de células de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente em actividade de DHFR (e.g., ATCC CRL-9096).
Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente hospedeiros de tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com sequências de ADN que codificam um anticorpo, proteína DHFR de tipo selvagem e outro marcador seleccionável tal como aminoglicósido-3' -fosfotransferase (APH), podem ser seleccionadas por crescimento celular em meio contendo um agente de selecção para o marcador seleccionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, e.g., canamicina, neomicina ou G418. Veja-se a Patente U.S. 4,965,199. 119 ΕΡ 1 784 426 PT (iv) Componente Promotor
Os vectores de expressão e de clonagem usualmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operativamente ligado ao ácido nucleico do polipéptido do anticorpo. São conhecidas sequências promotoras para eucariotas. Virtualmente todos os genes eucariotas possuem uma região rica em AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases a montante do local onde é iniciada a transcrição. Outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do inicio da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleótido. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucariotas está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para a adição da cauda poli A à extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências são adequadamente inseridas em vectores de expressão eucariotas. A transcrição de polipéptidos de anticorpos a partir de vectores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como o poliomavírus, o poxvírus avícola, adenovírus (tais como Adenovírus 2), papilomavírus bovino, sarcomavírus avícola, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite-B e Vírus Símio 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamífero, e.g., o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que estes promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.
Os promotores precoce e tardio do vírus SV40 são convenientemente obtidos na forma de um fragmento de restrição de SV4 0 que também contém a origem de replicação virai de SV40. O promotor imediato precoce do citomegalovírus humano é convenientemente obtido na forma de um fragmento de restrição HindiII E. Um sistema para a expressão de ADN em hospedeiros mamíferos utilizando o papilomavírus bovino na forma de um vector é divulgado na Patente U.S. 4,419,446. Uma modificação deste sistema está descrita na Patente U.S. 4,601,978. Veja-se também Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) relativamente à expressão de ADNc de β-interferão humano em células de ratinho sob o controlo de um promotor de timidina-quinase do vírus herpes simplex. Alternativamente, pode ser utilizada como promotor a repetição terminal longa do vírus do Sarcoma de Rous. 120
ΕΡ 1 784 426 PT (ύ) Componente elemento potenclador A transcrição de ADN que codifica o polipéptido de anticorpo da presente invenção por eucariotas superiores é frequentemente aumentada pela inserção de uma sequência potenciadora no vector. Muitas sequências potenciadoras são actualmente conhecidas de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, contudo, utilizar-se-á um potenciador de um vírus de células eucariotas. Os exemplos incluem o potenciador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o potenciador do promotor precoce de citomegalovírus, o potenciador do polioma no lado tardio da origem de replicação e potenciadores de adenovírus. Veja-se também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para a activação de promotores eucariotas. O potenciador pode ser unido por splicing no vector numa posição a 5' ou 3' da sequência de codificação do polipéptido de anticorpo, mas está preferivelmente localizada num local a 5' do promotor. (vi) Componente de terminação da transcrição
Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucariotas conterão também, tipicamente, sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do ARNm. Estas sequências estão vulgarmente disponíveis a partir das regiões não traduzidas a 5' e, ocasionalmente a 3', dos ADN ou ADNc eucariotas ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleótidos transcritos na forma de fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm que codifica um anticorpo. Uma componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação da hormona do crescimento bovina. Veja-se WO94/11026 e o vector de expressão aí divulgado. (vii) Selecção e transformação de células hospedeiras
As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos presentes vectores incluem células eucariotas superiores aqui descritas, incluindo células hospedeiras de vertebrados. A propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Os exemplos de linhas de células 121
ΕΡ 1 784 426 PT hospedeiras de mamífero úteis são a linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980));
células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al. , Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2).
As células hospedeiras são transformadas com os vectores de expressão ou de clonagem acima descritos para a produção de anticorpos e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para indução de promotores, selecção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas. (viii) Cultura das células hospedeiras
As células hospedeiras utilizadas para produzir um anticorpo da presente invenção podem ser cultivadas numa variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis tais como F10 de Ham (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), Meio Essencial Mínimo ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle
Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para a cultura das células hospedeiras. Em adição, qualquer dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Pat. U.S. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ou 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente U.S. 30,985 podem ser utilizados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou factor de crescimento epidérmico), sais (tais 122
ΕΡ 1 784 426 PT como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleótidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o fármaco GENTAMYCIN™), elementos vestigiários (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na gama micromolar) e glucose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos nas concentrações apropriadas que serão conhecidas dos peritos na especialidade. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são as previamente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para a expressão e serão evidentes para as pessoas competentes na matéria. (ix) Purificação do anticorpo
Quando se utilizam técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente ou ser directamente segregado para o meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, como primeiro passo, os detritos particulados, quer células hospedeiras quer fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Quando o anticorpo é segregado para o meio, os sobrenadantes destes sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Pode ser incluído um inibidor de protease tal como PMSF em qualquer dos passos anteriores para inibir a proteólise e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios. A composição de anticorpos preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, sendo a cromatografia de afinidade a técnica de purificação preferida. A adequabilidade da proteína A enquanto ligando de afinidade depende das espécies e isótipos de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas γΐ, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et ai., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de ratinho e 123 ΕΡ 1 784 426 PT para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). A matriz a que o ligando de afinidade é ligado é mais frequentemente agarose, mas estão disponíveis outras matrizes. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno, permitem caudais mais rápidos e tempos de processamento mais curtos do que pode ser conseguido com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para a purificação. Outras técnicas para a purificação de proteínas tais como fraccionamento numa coluna de permuta iónica, precipitação com etanol, HPLC de fase inversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina, cromatografia em SEPHAROSE™ numa resina de permuta aniónica ou catiónica (tal como coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação com sulfato de amónio, estão também disponíveis dependendo do anticorpo que vai ser recuperado.
Após qualquer do(s) passo(s) preliminar(es) de purificação, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interacção hidrófoba a baixo pH utilizando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5-4,5, preferivelmente realizada com baixas concentrações salinas (e.g., de cerca de 0-0,25M de sal) .
Ensaios à Actlvldade
Os anticorpos da presente invenção podem ser caracterizados quanto às suas propriedades físicas/químicas e funções biológicas através de vários ensaios conhecidos na especialidade.
As imunoglobulinas purificadas podem ser adicionalmente caracterizadas através de uma série de ensaios incluindo, mas não se lhes limitando, sequenciação N-terminal, análise de aminoácidos, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) de exclusão por tamanhos não desnaturante, espectrometria de massa, cromatografia de permuta iónica e digestão com papaína.
Em certas concretizações da invenção, as imunoglobulinas aqui produzidas são analisadas quanto à sua actividade biológica. Em algumas concretizações, as imunoglobulinas da 124 ΕΡ 1 784 426 PT presente invenção são testadas quanto à sua actividade de ligação ao antigénio. Os ensaios de ligação a antigénios que são conhecidos na especialidade e podem ser aqui utilizados incluem, sem limitação, quaisquer ensaios de ligação directa ou competitiva utilizando técnicas tais como Western blot, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunossorvente com enzima ligada), imunoensaios em "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes e imunoensaios com proteína A. Um ensaio de ligação ao antigénio ilustrativo é proporcionado adiante na secção dos Exemplos.
Numa concretização, a presente invenção contempla um anticorpo alterado que possui algumas, mas não todas as funções efectoras, o que o torna um candidato desejado para muitas aplicações em que a semivida do anticorpo in vivo é importante ainda que certas funções efectoras (tais como complemento e ADCC) sejam desnecessárias ou prejudiciais. Em determinadas concretizações, as actividades de Fc da imunoglobulina produzida são medidas para assegurar que apenas as propriedades desejadas são mantidas. Podem ser conduzidos ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo para confirmar a redução/depleção de actividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, podem ser conduzidos ensaios de ligação ao receptor de Fc (FcR) para assegurar que o anticorpo não tem ligação a FcyR (portanto provavelmente não tem actividade de ADCC), mas retém a capacidade de ligação a FcRn. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam FcyRIII apenas, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) . Um exemplo de um ensaio in vitro para avaliar a actividade de ADCC de uma molécula de interesse está descrito na Patente US 5,500,362 ou 5,821,337. As células efectoras úteis para estes ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (NK). Alternativamente ou adicionalmente, a actividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, e.g., num modelo animal tal como o divulgado em Clynes et ai. PNAS (USA) 95:652-656 (1998) . Podem também ser realizados ensaios de ligação a Clq para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar a Clq e portanto não tem actividade de CDC. Para avaliar a activação do complemento, 125 ΕΡ 1 784 426 PT pode ser realizado um ensaio de CDC, por exemplo como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Podem também ser realizadas determinações da ligação a FcRn e da depuração/semivida in vivo utilizando métodos conhecidos na especialidade, por exemplo os descritos na secção dos Exemplos.
Anticorpos Humanizados A presente invenção abrange anticorpos humanizados. São conhecidos na especialidade vários métodos para a humanização de anticorpos não humanos. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode possuir introduzidos um ou mais resíduos de aminoácido de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos são frequentemente referidos como resíduos "importados", que são tipicamente tomados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et ai. (1988) Science 239:1534-1536), substituindo por sequências de região hipervariável as correspondentes sequências de um anticorpo humano. Deste modo, estes anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. 4,816,567) em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela correspondente sequência de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos da região hipervariável e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos de anticorpos de roedores. A escolha dos domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, para utilizar na preparação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o denominado método do "melhor ajustamento" ("best-fit"), a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra a biblioteca completa de sequências de domínios variáveis humanos conhecidos. A sequência humana que é mais próxima da do roedor é então aceite como esqueleto humano para o anticorpo humanizado (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J.
Mol. Biol. 196:901. Outro método utiliza um esqueleto 126
ΕΡ 1 784 426 PT particular derivado da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. 0 mesmo esqueleto pode ser utilizado para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al. (1992) Proc.
Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J.
Immunol., 151:2623. É também importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de elevada afinidade para com o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objectivo, de acordo com um método, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências progenitoras e vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências progenitoras e humanizadas. Os modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão vulgarmente disponíveis e são familiares aos peritos na especialidade. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas seleccionadas. A inspecção destas apresentações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, í.e., a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata se ligar ao seu antigénio. Desta maneira, resíduos de FR podem ser seleccionados e combinados a partir de sequências do recebedor e importadas de modo serem conseguidas as características desejadas para o anticorpo, tal como afinidade aumentada para com o(s) antigénio(s) alvo. Em geral, os resíduos da região hipervariável estão directamente e muito substancialmente envolvidos na influência sobre a ligação ao antigénio.
Variantes de Anticorpos
Num aspecto, a invenção proporciona fragmentos de anticorpos compreendendo modificações na interface dos polipéptidos Fc compreendendo a região Fc, em que as modificações facilitam e/ou promovem a heterodimerização. Estas modificações compreendem a introdução de uma protuberância num primeiro polipéptido Fc e de uma cavidade num segundo polipéptido Fc, em que a protuberância é posicionável na cavidade de modo a promover a complexação do primeiro e do segundo polipéptidos Fc. Os métodos para gerar 127 ΕΡ 1 784 426 PT anticorpos com estas modificações são conhecidos na especialidade, por exemplo, como descrito na Pat. U.S. 5,731,168.
Em algumas concretizações, são contempladas a(s) modificação(ões) na sequência de aminoácidos do anticorpos aqui descritos. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por introdução de alterações apropriadas de nucleótidos no ácido nucleico do anticorpo ou por síntese peptídica. Estas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos no interior das sequências de aminoácidos do anticorpo. É feita qualquer combinação de deleção, inserção e substituição para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos podem ser introduzidas na sequência de aminoácidos do anticorpo em causa no momento em que essa sequência é feita.
Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são localizações preferidas para mutagénese é denominado "mutagénese por varrimento de alaninas" como descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Aqui, são identificados um resíduo ou grupo de resíduos alvo (e.g., resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys e glu) e são substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afectar a interacção dos aminoácidos com o antigénio. As localizações de aminoácidos que demonstram ter sensibilidade funcional em relação às substituições são então refinadas por introdução de mais, ou de outras, variantes nos locais de substituição. Assim, enquanto o local para introdução de uma variação de sequência de aminoácidos é predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa de ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação num determinado local, conduz-se mutagénese por varrimento de ala ou aleatória no codão ou região alvo e rastreiam-se as imunoglobulinas expressas quanto à actividade desej ada. 128
ΕΡ 1 784 426 PT
As inserções na sequência de aminoácidos incluem fusões amino- e/ou carboxilo-terminais variando em comprimento desde um resíduo até polipéptidos contendo uma centena ou mais de resíduos, assim como inserções intra-sequência de um ou múltiplos resíduos de aminoácido. Os exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionilo N-terminal ou o anticorpo fundido com um polipéptido citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo de uma enzima (e.g. para ADEPT) ou um polipéptido que aumenta a semivida sérica do anticorpo.
Outro tipo de variante é uma variante por substituição de aminoácidos. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula do anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os locais de maior interesse para a mutagénese por substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas estão também contempladas alterações nas FR. São apresentadas na Tabela 2 substituições conservativas na coluna intitulada "substituições preferidas". Se essas substituições resultarem numa alteração na actividade biológica, então podem ser introduzidas alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplificativas" na Tabela 2 ou como adicionalmente descrito adiante com referência às classes de aminoácidos, e os produtos são rastreados. TABELA 2
Residuo Original Substituições E xempl i f i ca t i va s Substituições Preferidas Ala (A) Vai; Leu; Ile Vai Arg (R) Lys; Gin; Asn Lys Asn (N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gin (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gin Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg He (I) Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu 129
ΕΡ 1 784 426 PT
Resíduo Original Substituições Exemplificativas Substituições Preferidas Leu (L) Norleucina; Ile; Vai; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Vai; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Vai; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Vai (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu
Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas por selecção de substituições que diferem significativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura do esqueleto polipeptidico na área da substituição, por exemplo, na forma de uma conformação em folha ou helicoidal, (b) da carga ou da hidrofobicidade da molécula no local alvo ou (c) do volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades das suas cadeias laterais (em A.L. Lehninger, em Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) não polares: Ala (A), Vai (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P) , Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polares não carregados: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gin (Q) (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K), Arg (R) , His(H)
Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades comuns das cadeias laterais: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile; 130
ΕΡ 1 784 426 PT (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Substituições não conservativas implicarão a troca de um membro de uma destas classes por outra classe. Estes resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos locais de substituição conservativa ou, mais preferivelmente, nos locais remanescentes (não conservados).
Um tipo de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo progenitor (e.g. um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) seleccionadas para posterior desenvolvimento terão propriedades biológicas melhoradas relativamente ao anticorpo progenitor a partir do qual foram geradas. Uma maneira conveniente de gerar estas variantes de substituição envolve maturação por afinidade utilizando exibição em fagos. Resumidamente, vários locais da região hipervariável (e.g. 6- 7 locais) são mutados para gerar todas as substituições de aminoácidos possíveis em cada local. Os anticorpos assim gerados são exibidos a partir de partículas de fagos filamentosos na forma de fusões do produto do gene III de M13 empacotado no interior de cada partícula. As variantes exibidas em fagos são então rastreadas quanto à sua actividade biológica (e.g. afinidade de ligação) como aqui divulgado. De modo a identificar locais da região hipervariável candidatos para modificação, pode ser realizada uma mutagénese por varrimento de alanina para identificar os resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para a ligação ao antigénio. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar a estrutura cristalina do complexo antigénio-anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e o antigénio. Estes resíduos de contacto e os resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Uma vez geradas estas variantes, o painel de variantes é submetido a rastreio como aqui descrito e os anticorpos com propriedades superiores em 131 ΕΡ 1 784 426 PT um ou mais ensaios relevantes podem ser seleccionados para posterior desenvolvimento.
As moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo são preparadas através de uma variedade de métodos conhecidos na especialidade. Estes métodos incluem, mas não se lhes limitando, o isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou a preparação por mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou dirigida ao local), mutagénese por PCR e mutagénese por cassetes, de uma versão variante ou não variante do anticorpo preparada anteriormente.
Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações de aminoácidos numa região Fc dos polipéptidos de imunoglobulina da invenção, desse modo gerando uma variante de região Fc. A variante de região Fc pode compreender uma sequência de região Fc humana (e.g., uma região Fc de IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácido (e.g. uma substituição) numa ou mais posições de aminoácido incluindo a de uma cisteina de charneira.
De acordo com esta descrição e com os ensinamentos na especialidade, está contemplado que em algumas concretizações, um anticorpo utilizado em métodos da invenção possa compreender uma ou mais alterações em comparação com o anticorpo contrapartida de tipo selvagem, por exemplo na região Fc. Estes anticorpos reterão no entanto substancialmente as mesmas caracteristicas necessárias para terem utilidade terapêutica em comparação com a sua contrapartida de tipo selvagem. Por exemplo, pensa-se que podem ser feitas certas alterações na região Fc que resultarão em ligação a Clq e/ou Citotoxicidade Dependente do Complemento (CDC) alteradas (i.e., melhoradas ou diminuídas), por exemplo, como descrito em W099/51642. Veja-se também Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); Patente US 5,648,260; Patente US 5,624,821; e W094/29351 relativamente a outros exemplos de variantes da região Fc. 132
ΕΡ 1 784 426 PT
Imunoconjugados A invenção também se refere a imunoconjugados ou conjugados anticorpo-fármaco (ADC), compreendendo um anticorpo conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, um fármaco, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (e.g., uma toxina enzimaticamente activa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou seus fragmentos) ou um isótopo radioactivo (i.e., um radioconjugado) . A utilização de conjugados anticorpo-fármaco para a entrega local de agentes citotóxicos ou citostáticos, i.e. fármacos para matar ou inibir células tumorais no tratamento do cancro (Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; patente U.S. 4,975,278) teoricamente permite a entrega direccionada da porção de fármaco em tumores e a sua acumulação intracelular ai, enquanto a administração sistémica destes agentes fármacos não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para células normais assim como para as células tumorais que se pretendem eliminar (Baldwin et ai., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review," em Monoclonal Antihodies '84: Biologic and Clinicai Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). É deste modo procurada a eficácia máxima com a toxicidade mínima. Tanto os anticorpos policlonais como os anticorpos monoclonais foram relatados como sendo úteis nestas estratégias (Rowland et al. , (1986) Câncer Immunol. Immunother. , 21:183-87). Os fármacos utilizados nestes métodos incluem daunomicina, doxorrubicina, metotrexato e vindesina (Rowland et al., (1986) supra) . As toxinas utilizadas em conjugados anticorpo-toxina incluem toxinas bacterianas tais como a toxina diftérica, toxinas vegetais como a ricina, toxinas de molécula pequena como geldanamicina (Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Câncer Inst. 92(19):1573-1581,- Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinóides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:8618-8623) e caliqueamicina (Lode et al. (1998) Câncer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Câncer Res. 53:333 6-3342) . As toxinas podem efectuar os seus efeitos citotóxicos e 133 ΕΡ 1 784 426 PT citostáticos através de mecanismos incluindo ligação a tubulina, ligação a ADN ou inibição da topoisomerase. Alguns fármacos citotóxicos tendem a ser inactivos ou menos activos quando conjugados com grandes anticorpos ou ligandos receptor de proteínas. 0 ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetano, Biogen/Idec) é um conjugado anticorpo-radioisótopo composto por um anticorpo monoclonal capa de IgGl murino dirigido contra o antigénio CD20 encontrado na superfície de linfócitos B normais e malignos e ligado a radioisótopo 11:LIn ou 90Y por um quelante ligante de tioureia (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99(12):4336-42,-Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63/ Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Embora o ZEVALIN tenha actividade contra Linfoma não de Hodgkin (NHL) de células B, a administração resulta em citopenias graves e prolongadas na maioria dos pacientes. O MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), um conjugado de anticorpo-fármaco composto por um anticorpo hu CD33 ligado a caliqueamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento de leucemia mielóide aguda por injecção (Drugs of the Future (2000) 25(7):686/ Patentes US 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001) . O cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), um conjugado anticorpo-fármaco composto pelo anticorpo huC242 ligado através do ligante dissulfureto SPP à porção de fármaco maitansinóide, DM1, está a avançar para ensaios de Fase II para o tratamento de cancros que expressam CanAg, tais como cancro colónico, pancreático, gástrico e outros. O MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), um conjugado anticorpo-fármaco composto por um anticorpo monoclonal anti-antigénio de membrana específico da próstata (PSMA) ligado à porção de fármaco maitansinóide, DM1, está em desenvolvimento para o tratamento potencial de tumores da próstata. Os péptidos de auristatina, auristatina E (AE), monometilauristatina E (MMAE) e análogos sintéticos de dolastatina, foram conjugados aos anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específico para Lewis Y em carcinomas) e cAClO (específico para CD30 em malignidades hematológicas) (Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784,- e Francisco, et al. (2003) Blood, 102, 1458-1465) e estão em desenvolvimento terapêutico. Outros compostos 134 ΕΡ 1 784 426 PT para utilização como agentes citotóxicos conjugados com fármacos incluem, sem limitação, auristatina E (AE), MMAF (uma variante de auristatina E (MMAE) com uma fenilalanina no terminal C do fármaco) e AEVB (auristatina E valeril-benzil-hidrazona, um ligante lábil a ácidos através do terminal C de AE) . Os ligantes de conjugados úteis para ligação de uma fármaco a um anticorpo incluem, sem limitação, MC (maleimidocaproilo), Vai Cit (valina-citrulina, local de dipéptido em ligante clivável por protease), Citrulina (ácido 2-amino-5-ureidopentanóico), PAB (p-aminobenzilcarbamoilo, uma porção "auto-imolativa" de ligante), Me (N-metil-valina-citrulina quando a ligação do péptido ligante foi modificada para prevenir a sua clivagem por caepsina B) , MC(PEG)6-0H (maleimidocaproí1-polietilenoglicol, ligado a cisteinas do anticorpo), SPP (N-Succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato) e SMCC (N-Succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato). Estes de outros conjugados de fármacos úteis e a sua preparação estão divulgados, por exemplo, em Doronina, S.O. et al., Nature Biotechnology 21:778-794 (2003), aqui incorporado por referência na sua totalidade. As moléculas ligantes particularmente preferidas incluem, por exemplo, N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (veja-se, e.g., Carlsson et al. , Biochem. J. , 173, 723-737 (1978)), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB) (veja-se, e.g., Pat. U.S. 4,563,304), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP) (veja-se, e.g., número de registo CAS 341498-08-6), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato (SMCC) (veja-se, e.g., Yoshitake et al., Eur. J. Biochem., 101, 395-399 (1979)) e N-succinimidil-4-metil-4-[2-(5-nitropiridil)ditio]pentanoato (SMNP) (veja-se, e.g., Pat. U.S. 4,563,304).
Os agentes quimioterapêuticos úteis na geração destes imunoconjugados foram descritos acima. As toxinas enzimaticamente activas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia A da difteria, fragmentos activos não ligantes da toxina diftérica, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaría 135 ΕΡ 1 784 426 PT officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Uma variedade de radionuclidos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Os exemplos incluem 212Bi, 131I, 131In, 90Y e 186Re. Os conjugados do anticorpo e do agente citotóxico são preparados utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetiladipimidato HC1), ésteres activos (tais como dissuccinimidilsuberato), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoí1)-hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (tais como bis-(p-diazónio-benzoí1)etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-activos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987) . O ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono 14 é um agente quelante exemplificativo para a conjugação de um radionucleótido ao anticorpo. Veja-se WO94/11026.
Os conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tais como uma caliqueamicina, maitansinóides, um tricoteceno e CC1065 e os derivados destas toxinas que têm actividade de toxina, estão também aqui contemplados.
Maitansina e maitansinóides
Um anticorpo (de comprimento completo ou fragmentos) da invenção pode ser conjugado a uma ou mais moléculas de maitansinóides.
Os maitansinóides são inibidores mitotóticos que actuam por inibição da polimerização da tubulina. A maitansina foi pela primeira vez isolada a partir do arbusto de África Oriental Maytenus serrata (Patente U.S. 3,896,111). Subsequentemente, foi verificado que determinados micróbios também produzem maitansinóides, tais como maitansinol e ésteres C-3 de maitansinol (Patente U.S. 4,151,042). O maitansinol sintético e seus derivados e análogos são
136 ΕΡ 1 784 426 PT divulgados, 4,248,870; 4,307,016; 4,315,929; 4,364,866; 4, divulgações referência. por exemplo, nas Patentes U.S. 4,137,230; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,317,321; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 424,219; 4,450,254; 4,362,663; e 4,371,533, cujas são aqui expressamente incorporadas por
Conjugados maitansinóide-anticorpo
Numa tentativa para melhorar o seu índice terapêutico, a maitansina e os maitansinóides foram conjugados a anticorpos que se ligam especificamente a antigénios de células tumorais. Os imunoconjugados contendo maitansinóides e o seu uso terapêutico estão divulgados, por exemplo, nas Patentes U.S. 5,208,020, 5,416,064 e na Patente europeia EP 0 425 235 BI. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:8618-8623 (1996) descreveram imunoconjugados compreendendo um maitansinóide designado por DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido contra cancro colorrectal humano. Verificou-se que o conjugado é altamente citotóxico relativamente a células de cancro do cólon em cultura e apresentou actividade antitumoral num ensaio de crescimento tumoral in vivo. Chari et al. , Câncer Research 52:127-131 (1992) descrevem imunoconjugados em que um maitansinóide foi conjugado através de um ligante dissulfureto a um anticorpo murino A7 que se liga a um antigénio em linhas celulares de cancro do cólon humano ou a outro anticorpo monoclonal murino TA.l que se liga ao oncogene HER-2/neu. A citotoxicidade do conjugado TA.1-maitansonóide foi testada in vítro na linha celular de cancro da mama humano SK-BR-3, que expressa 3 x 105 antigénios de superfície HER-2 por célula. O conjugado de fármaco atingiu um grau de citotoxicidade similar ao de um fármaco maitansinóide livre, que podia ser aumentado por aumento do número de moléculas de maitansinóide por molécula de anticorpo. O conjugado A7-maitansinóide apresentou baixa citotoxicidade sistémica em ratinhos.
Conjugados anticorpo-maitansinóide (imunoconjugados)
Os conjugados anticorpo-maitansinóide são preparados por ligação química de um anticorpo a uma molécula de maitansinóide sem diminuir significativamente a actividade biológica quer do anticorpo quer da molécula de maitansinóide. 137
ΕΡ 1 784 426 PT
Uma média de 3-4 moléculas de maitansinóide conjugadas por molécula de anticorpo mostrou eficácia no aumento da citotoxicidade de células alvo sem afectar negativamente a função ou a solubilidade do anticorpo, embora se esperasse que mesmo uma molécula de toxina/anticorpo aumentasse a citotoxicidade sobre a utilização do anticorpo nu. Os maitansinóides são bem conhecidos na especialidade e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontes naturais. Os maitansinóides adequados estão divulgados, por exemplo, na Patente U.S. 5,208,020 e nas outras publicações de patentes e publicações que não de patentes acima referidas. Os maitansinóides preferidos são o maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tais como vários ésteres de maitansinol.
Existem muitos grupos de ligação conhecidos na especialidade para a preparação de conjugados anticorpo-maitansinóide, incluindo, por exemplo, os divulgados na Patente U.S. 5, 208,020 ou na Patente EP 0 425 235 BI e Chari et al., Câncer Research 52:127-131 (1992). Os grupos de ligação incluem grupos dissulfureto, grupos tioéter, grupos lábeis a ácidos, grupos fotolábeis, grupos lábeis a peptidases ou grupos lábeis a esterases, como divulgado nas patentes acima identificadas, sendo preferidos os grupos dissulfureto e tioéter.
Os conjugados de anticorpo e maitansinóide podem ser preparados utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilo HC1), ésteres activos (tais como suberato de dissuccinimidilo), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoí1)-hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (tais como bis-(p-diazónio-benzoí1)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-activos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno) . Os agentes de acoplamento particularmente preferidos incluem N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. 138
ΕΡ 1 784 426 PT J. 173:723-737 [1978]) e N-succinimidil-4-(2- piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar uma ligação dissulfureto. O ligante pode ser ligado à molécula de maitansinóide em várias posições, dependendo do tipo da ligação. Por exemplo, uma ligação éster pode ser formada por reacção com um grupo hidroxilo utilizando técnicas convencionais de acoplamento. A reacção pode ocorrer na posição C-3 que possui um grupo hidroxilo, na posição C-14 modificada com hidroximetilo, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxilo e na posição C-20 que possui um grupo hidroxilo. Numa concretização preferida, a ligação é formada na posição C-3 do maitansinol ou de um análogo de maitansinol.
Caliqueamicina
Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpo conjugado com uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos da caliqueamicina são capazes de produzir quebras em ADN de cadeia dupla em concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família da caliqueamicina, vejam-se as patentes U.S. 5,712,374, 5, 714,586, 5, 739, 116, 5, 767,285, 5, 770, 701, 5, 770, 710, 5,773,001, 5,877,296 (todas da American Cyanamid Company). Os análogos estruturais da caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas não se lhes limitam, γχ1, α2Ι, co1, N-acetil-γχ1, PSAG e Θ1;:, (Hinman et al. , Câncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Câncer Research 58:2925-2928 (1998) e as supramencionadas patentes norte-americanas da American Cyanamid). Outro fármaco antitumoral a que o anticorpo pode ser conjugado é o QFA que é um antifolato. Tanto a caliqueamicina como o QFA possuem locais de acção intracelulares e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Portanto, a assimilação celular destes agentes através da internalização mediada pelo anticorpo melhora grandemente os seus efeitos citotóxicos.
Outros agentes citotóxicos
Outros agentes antitumorais que podem ser conjugados com os anticorpos da invenção incluem BCNU, estreptozoicina, vincristina e 5-fluorouracilo, a família de agentes conhecidos colectivamente como complexo LL-E33288 descrita nas Patentes 139
ΕΡ 1 784 426 PT U.S. 5,053,394, 5,770,710, assim como as esperamicinas (patente U.S. 5,877,296).
As toxinas enzimaticamente activas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem a cadeia A da difteria, fragmentos activos não ligantes da toxina diftérica, a cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), a cadeia A da ricina, a cadeia A da abrina, a cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Veja-se, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de Outubro, 1993. A presente invenção contempla adicionalmente um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com actividade nucleolítica (e.g., uma ribonuclease ou uma ADN-endonuclease tal como uma desoxirribonuclease; ADNase).
Para a destruição selectiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioactivo. Estão disponíveis uma variedade de isótopos radioactivos para a produção de II O 1 1 1 O 1 anticorpos radiocon]ugados. Os exemplos incluem At , I , I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Quando o conjugado é utilizado para detecção, pode compreender um átomo radioactivo para estudos cintigráficos, por exemplo tc99m ou I123 ou um marcador de spin para imagiologia por ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecida como imagiologia por ressonância magnética, mri), tal como iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, azoto-15, oxigénio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
Os marcadores radioactivos ou outros marcadores podem ser incorporados no conjugado de maneiras conhecidas. Por exemplo, o péptido pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácidos utilizando precursores de aminoácidos adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 em vez de hidrogénio. Marcadores tais como tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111 podem ser ligados através de um resíduo de cisteína no péptido. ítrio-90 pode ser ligado através de um resíduo de 140
ΕΡ 1 784 426 PT lisina. O método IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem
Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 pode ser utilizado para incorporar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in
Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhe.
Os conjugados do anticorpo e do agente citotóxico podem ser preparados utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como dimetiladipimidato HC1), ésteres activos (tais como disuccinimidilsuberato), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoíl) hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (tais como bis-(p-diazónio-benzoí1)etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-activos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno) . Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). O ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplificativo para a conjugação de um radionucleótido com o anticorpo. Veja-se WO94/11026. 0 ligante pode ser um "ligante clivável" que facilita a libertação do fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, podem utilizar-se um ligante lábil aos ácidos, um ligante sensível a peptidases, um ligante fotolábil, um ligante de dimetilo ou um ligante contendo dissulfureto (Chari et al., Câncer Research 52:127-131 (1992);
Patente U.S. 5,208,020).
Os compostos da invenção contemplam expressamente, mas não se lhes limitando, ADC preparado com reagentes reticulantes: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC e sulfo-SMPB e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (e.g., de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., E.U.A). Vejam-se as páginas 67-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog. 141
ΕΡ 1 784 426 PT
Preparação de conjugados antlcoozpo-fármaco
Em conjugados anticorpo-fármaco (ADC) , um anticorpo (Ab) é conjugado com uma ou mais porções de fármaco (D), e.g. cerca de 1 a cerca de 20 porções de fármaco por anticorpo, através de um ligante (L) . O ADC de fórmula 1 pode ser preparado por várias vias, empregando reacções de química orgânica, condições e reagentes conhecido dos peritos na especialidade, incluindo: (1) reacção de um grupo nucleófilo de um anticorpo com um reagente ligante bivalente, para formar Ab-L, através de uma ligação covalente, seguida por reacção com uma porção de fármaco D; e (2) reacção de um grupo nucleófilo de uma porção de fármaco com um reagente ligante bivalente, para formar D-L, através de uma ligação covalente, seguida por reacção com o grupo nucleófilo de um anticorpo.
Ab-(L-D)p I
Os grupos nucleófilos em anticorpos incluem, mas não se lhes limitam: (i) grupos amino N-terminais, (ii) grupos amino da cadeia lateral, e.g. lisina; (iii) grupos tiol da cadeia lateral, e.g. cisteína e (iv) grupos hidroxilo ou amino de açúcares quando o anticorpo está glicosilado. Os grupos amino, tiol e hidroxilo são nucleófilos e são capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos electrófilos em porções ligantes e reagentes ligantes incluindo: (i) ésteres activos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos e halogenetos ácidos; (ii) halogenetos de alquilo e benzilo tais como haloacetamidas; (iii) grupos aldeído, cetona, carboxilo e maleimido. Certos anticorpos possuem dissulfuretos redutíveis inter-cadeias, í.e. pontes de cisteínas. Os anticorpos podem ser tornados reactivos para conjugação com reagentes ligantes por tratamento com um agente redutor tal como DTT (ditiotreitol) . Cada ponte de cisteínas irá assim formar, teoreticamente, dois nucleófilos de tiol reactivos. Podem ser introduzidos grupos nucleófilos adicionais em anticorpos através da reacção de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) que resulta na conversão de uma amina num tiol.
Os conjugados anticorpo-fármaco da invenção podem também ser produzidos por modificação do anticorpo para introduzir porções electrófilas, que podem reagir com substituintes nucleófilos no reagente ligante ou no fármaco. Os açúcares de 142 ΕΡ 1 784 426 PT anticorpos glicosilados podem ser oxidados, e.g. com reagentes oxidantes de periodato, para formar grupos aldeído ou cetona que podem reagir com o grupo amino de reagentes ligantes ou porções de fármaco. Os resultantes grupos imina base de Schiff podem formar uma ligação estável ou podem ser reduzidos, e.g. por reagentes de boro-hidreto para formar ligações amina estáveis. Numa concretização, a reacção da porção hidrato de carbono de um anticorpo glicosilado com galactose-oxidase ou meta-periodato de sódio pode originar grupos carbonilo (aldeído e cetona) na proteína que podem reagir com grupos apropriados no fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Em outra concretização, as proteínas contendo resíduos de serina ou treonina N-terminais podem reagir com meta-periodato de sódio, resultando a produção de um aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Este aldeído pode ser feito reagir com uma porção de fármaco ou com um nucleófilo ligante.
Do mesmo modo, grupos nucleófilos numa porção de fármaco incluem, mas não se lhes limitam: grupos amino, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tio-semicarbazona, hidrazinocarboxilato e aril-hidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos electrófilos em porções ligantes e reagentes ligantes incluindo: (i) ésteres activos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos e halogenetos ácidos; (ii) halogenetos de alquilo e benzilo tais como haloacetamidas; (iii) grupos aldeído, cetona, carboxilo e maleimido.
Alternativamente, pode ser preparada uma proteína de fusão compreendendo o anticorpo e o agente citotóxico, e.g., por técnicas recombinantes ou síntese peptídica. 0 comprimento do ADN pode compreender regiões respectivas de codificação das duas porções do conjugado quer mutuamente adjacentes quer separadas por uma região de codificação de um péptido ligante que não destrói as propriedades desejadas do conjugado. 0 anticorpo pode ser conjugado com um "receptor" (tal como estreptavidina) para utilização em pré-direccionamento para tumores em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente, seguido pela remoção de conjugado não ligado da circulação utilizando um agente depurante e 143
ΕΡ 1 784 426 PT depois administração de um "ligando" {e.g., avidina) que é conjugada com um agente citotóxico {e.g., um radionucleótido).
Derivados de Anticorpos
Os anticorpos da presente invenção podem ser adicionalmente modificados para conter porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na especialidade e estão prontamente disponíveis. Preferivelmente, as porções adequadas para derivatização do anticorpo são polímeros solúveis em água. Os exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não se lhes limitam, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, poli(álcool vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (quer homopolímeros quer copolímeros aleatórios) e dextrano ou poli(n- vinilpirrolidona)polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (e.g., glicerol), poli(álcool vinílico) e suas misturas. 0 polietilenoglicol propionaldeído pode ter vantagens no fabrico devido à sua estabilidade em água. 0 polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. 0 número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar e se estiverem ligados mais do que um polímero, podem ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros utilizados para derivatização podem ser determinados com base em considerações incluindo, mas não se lhes limitando, as propriedades ou funções particulares do anticorpo a melhorar, se o derivado do anticorpo vai ser utilizado numa terapia sob condições definidas, etc.
Formulações Farmacêuticas
As formulações terapêuticas compreendendo um anticorpo da invenção são preparadas para armazenagem por mistura do anticorpo possuindo o grau desejado de pureza com transportadores, excipientes ou estabilizantes opcionais fisiologicamente aceitáveis {Remington's Pharmaceutical
Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de soluções aquosas, liofilizados ou outras formulações secas. Os transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não 144 ΕΡ 1 784 426 PT são tóxicos para os beneficiários nas dosagens e concentrações empregues e incluem tampões tais como fosfato, citrato, histidina e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butilico ou benzílico; alquilparabenos tais como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sal tais como sódio; complexos de metais (e.g., complexos Zn-proteína); e/ou tensioactivos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). A presente formulação pode também conter mais do que um composto activo conforme necessário para a indicação particular a tratar, preferivelmente com actividades complementares que não se afectam adversamente entre si. Estas moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para os fins pretendidos.
Os ingredientes activos podem também ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsula de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas estão divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
As formulações a utilizar para administração in vivo têm que ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis. 145
ΕΡ 1 784 426 PT
Podem ser preparadas preparações de libertação sustentada. Os exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo a imunoglobulina da invenção, matrizes essas que estão na forma de artigos conformados, e.g., filmes ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou poli(álcool vinílico)), polilactidas (Pat. U.S. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, de etileno-acetato de vinilo não degradáveis, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tais como LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros tais como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico permitam a libertação de moléculas ao longo de mais de 100 dias, certos hidrogéis libertam as proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando as imunoglobulinas encapsuladas permanecem no corpo durante um longo período de tempo, podem desnaturar ou agregar-se em resultado da exposição à humidade a 37°C, resultando a perda de actividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Podem ser deduzidas estratégias racionais para a estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, quando se verifica que o mecanismo de agregação é a formação intermolecular de ligações S-S através da inter-permuta de tiodissulfureto, a estabilização pode ser conseguida por modificação de resíduos sulfidrilo, liofilização a partir de soluções ácidas, controlo do teor de humidade, utilização de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matrizes poliméricas específicas.
Utilizações
Um anticorpo da presente invenção pode ser utilizado, por exemplo, em métodos terapêuticos in vitro, ex vivo e in vivo. Os anticorpos da invenção podem ser utilizados como antagonistas para parcial ou completamente bloquear a actividade específica do antigénio in vitro, ex vivo e/ou in vivo. Adicionalmente, pelo menos alguns dos anticorpos da invenção podem neutralizar a actividade do antigénio de outras espécies. Deste modo, os anticorpos da invenção podem ser 146 ΕΡ 1 784 426 PT utilizados para inibir uma actividade especifica do antigénio, e.g., numa cultura celular contendo o antigénio, em indivíduos humanos ou em outros indivíduos mamíferos possuindo o antigénio com que um anticorpo da invenção reage cruzadamente (e.g. chimpanzé, babuíno, sagui, macacos cinomolgos e rhesus, porco ou ratinho). Numa concretização, o anticorpo da invenção pode ser utilizado para a inibição das actividades do antigénio fazendo contactar o anticorpo com o antigénio de modo que a actividade do antigénio seja inibida. Preferivelmente, o antigénio é uma molécula de proteína humana.
Numa utilizado indivíduo antigénio indivíduo actividade concretização, um anticorpo da invenção pode ser num método para inibição de um antigénio num que sofre de uma desordem em que a actividade do é prejudicial, compreendendo a administração ao de um anticorpo da invenção de modo a que a do antigénio no indivíduo seja inibida.
Preferivelmente, o antigénio é uma molécula de proteína humana e o indivíduo é um indivíduo humano. Alternativamente, o indivíduo pode ser um mamífero que expressa o antigénio ao qual um anticorpo da invenção se liga. Ainda adicionalmente, o indivíduo pode ser um mamífero em que o antigénio foi introduzido (e.g., por administração do antigénio ou por expressão de um transgene do antigénio). Um anticorpo da invenção pode ser administrado a um indivíduo humano para fins terapêuticos. Adicionalmente, um anticorpo da invenção pode ser administrado a um mamífero não humano que expressa um antigénio com o qual a imunoglobulina reage cruzadamente (e.g., um primata, um porco ou um ratinho) para fins veterinários ou como modelo animal de doença humana. Relativamente a este último, estes modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos da invenção (e.g., teste de dosagens e decursos no tempo da administração). Os anticorpos bloqueadores da invenção que são terapeuticamente úteis incluem, por exemplo, mas não se lhes limitando, anticorpos anti-HER2, anti-VEGF, anti-IgE, anti-CD11, anti-interferão e anti-factor tissular. Os anticorpos da invenção podem ser utilizados para tratar, inibir, retardar a progressão de, prevenir/retardar a reocorrência de, melhorar ou prevenir doenças, desordens ou condições associadas a expressão e/ou actividade anormais de uma ou mais moléculas de 147 ΕΡ 1 784 426 PT antigénio, incluindo, mas não se lhes limitando, tumores malignos e benignos; malignidades não leucémicas e linfóides; desordens neuronais, gliais, astrocitárias, hipotalâmicas e outras desordens glandulares, macrofágicas, epiteliais, estromais e blastocélicas; e desordens inflamatórias, angiogénicas e imunológicas.
Num aspecto, um anticorpo de bloqueio da invenção é especifico para um antigénio ligando e inibe a actividade do antigénio por bloqueio ou interferência com a interacção ligando-receptor que envolve o antigénio ligando, desse modo inibindo a via de sinal correspondente e outros eventos moleculares ou celulares. A invenção também se concretiza em anticorpos específicos de receptores que não previnem necessariamente a ligação do ligando mas interferem com a activação do receptor, desse modo inibindo quaisquer respostas que podiam normalmente ser iniciadas pela ligação do ligando. A invenção também abrange anticorpos que preferivelmente ou exclusivamente se ligam a complexos ligando-receptor. Um anticorpo da invenção pode também actuar como agonista de um receptor de antigénios particular, desse modo potenciando, melhorando ou activando todas ou algumas actividades da activação do receptor mediada pelo ligando.
Em determinadas concretizações, é administrado ao paciente um imunoconjugado compreendendo um anticorpo conjugado com um agente citotóxico. Em algumas concretizações, o imunoconj ugado e/ou o antigénio ao qual é ligado é/são internalizado(s) pela célula, resultando uma eficácia terapêutica melhorada do imunoconjugado na morte da célula alvo à qual se ligam. Numa concretização, o agente citotóxico tem como alvo ou interfere com ácido nucleico na célula alvo. Os exemplos destes agentes citotóxicos incluem quaisquer dos agentes quimioterapêuticos aqui referidos (tais como um maitansinóide ou uma caliqueamicina) , um isótopo radioactivo ou uma ribonuclease ou uma ADN-endonuclease.
Os anticorpos da invenção podem ser utilizados individualmente ou em combinação com outras composições numa terapia. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser co-administrado com outro anticorpo, agente (s) quimioterapêutico (s) (incluindo cocktails de agentes 148 ΕΡ 1 784 426 PT quimioterapêuticos), outro (s) agente(s) citotóxico (s), agente(s) anti-angiogénico(s), citóquinas e/ou agente(s) inibidor(es) do crescimento. Quando um anticorpo da invenção inibe o crescimento tumoral, pode ser particularmente desejável combiná-lo com um ou mais outro(s) agente(s) terapêutico(s) que também inibem o crescimento tumoral. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser combinado com um anticorpo anti-VEGF (e.g., AVASTIN) e/ou anticorpos anti-ErbB (e.g. anticorpo anti-HER2 HERCEPTIN®) num esquema de tratamento, e.g. no tratamento de quaisquer das doenças aqui descritas, incluindo cancro colorrectal, cancro da mama metastático e cancro dos rins. Alternativamente ou adicionalmente, o paciente pode receber uma terapia de radiação combinada (e.g. irradiação com feixes externos ou terapia com um agente radioactivo marcado, tal como um anticorpo). Estas terapias combinadas acima referidas incluem a administração combinada (quando dois ou mais agentes são incluídos na mesma formulação ou em formulações separadas) e a administração separada, caso em que a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes e/ou depois da administração da terapia ou terapias adjuntas. 0 anticorpo da invenção (e o agente terapêutico adjunto) é/são administrado(s) por qualquer meio adequado, incluindo administração parentérica, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As infusões parentéricas incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Em adição, o anticorpo é adequadamente administrado por infusão por pulsos, particularmente com doses decrescentes do anticorpo. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo por injecções, tais como injecções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte do facto da administração ser breve ou crónica. A composição de anticorpo da invenção será formulada, doseada e administrada de uma maneira consistente com a boa prática médica. Os factores a ter em consideração neste contexto incluem a desordem particular a tratar, o mamífero particular a tratar, a condição clínica do paciente individual, a causa da desordem, o local da entrega do agente, o método de administração, o programa de administração e 149 ΕΡ 1 784 426 PT outros factores conhecidos dos praticantes de medicina. 0 anticorpo não precisa de ser, mas é opcionalmente, formulado com um ou mais agentes vulgarmente utilizados para prevenir ou tratar a desordem em questão. A quantidade eficaz destes outros agentes depende da quantidade de anticorpos da invenção presentes na formulação, do tipo de desordem ou de tratamento e de outros factores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e pelas mesmas vias de administração que utilizaram até agora ou de cerca de 1 a 99% das dosagens empregues até agora.
Para a prevenção ou o tratamento de doenças, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção (quando utilizado individualmente ou em combinação com outros agentes tais como agentes quimioterapêuticos) dependerá do tipo de doença a tratar, do tipo de anticorpo, da gravidade e decurso da doença, do facto de o anticorpo ser administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, do historial clinico e da resposta ao anticorpo do paciente e da discrição do médico assistente. 0 anticorpo é adequadamente administrado ao paciente de uma só vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (e.g. 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de anticorpo constituem uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente, seja, por exemplo, numa ou mais administrações separadas ou por infusão continua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores acima mencionados. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra uma supressão desejada de sintomas da doença. Uma dosagem exemplif icativa do anticorpo será na gama de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Assim, podem ser administradas ao paciente uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer sua combinação). Estas doses podem ser administradas intermitentemente, e.g. semanalmente ou de três em três semanas (e.g. de modo a que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte, e.g. cerca de seis doses do anticorpo). Podem ser administradas uma dose de carga inicial superior, seguida por uma ou mais doses inferiores. Um exemplo de um regime de dosagem compreende a administração de uma dose de carga inicial de cerca de 150 ΕΡ 1 784 426 PT 4 mg/kg, seguida por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. Contudo, podem ser úteis outros regimes de dosagem. A progressão desta terapia é facilmente monitorada por técnicas e ensaios convencionais.
Artigos de Fabrico É descrito um artigo de fabrico contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico das desordens acima descritas. O artigo de fabrico compreende um recipiente e um rótulo ou bula de embalagem sobre, ou associados ao recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é, por si só ou quando combinada com outra composição, eficaz para o tratamento, a prevenção e/ou o diagnóstico da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco possuindo uma tampa perfurável com uma agulha de injecção hipodérmica). Pelo menos um agente activo na composição é um anticorpo da invenção. O rótulo ou bula de embalagem indicam que a composição é utilizada para o tratamento da condição de eleição, tal como cancro. Adicionalmente, o artigo de fabrico pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um anticorpo da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um agente citotóxico adicional. O artigo de fabrico nesta concretização da invenção pode ainda compreender uma bula de embalagem indicando que a primeira e a segunda composições de anticorpo podem ser utilizadas para tratar uma condição particular, por exemplo cancro. Alternativamente ou adicionalmente, o artigo de fabrico pode ainda compreender um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injecção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode adicionalmente incluir outros materiais desejáveis, do ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. 151
ΕΡ 1 784 426 PT
Seguem-se exemplos dos métodos e composições da invenção. Entenda-se que podem ser postas em prática várias outras concretizações, dada a descrição geral acima proporcionada.
EXEMPLOS
Os presentes exemplos descrevem a geração de anticorpos humanizados anti-beta7 a partir de um anticorpo anti-ratinho de rato que se liga à subunidade beta7 da integrina alfa4beta7.
Exemplo 1: Humanização de um anticorpo antagonista de beta7 Materiais e Métodos
Os números dos resíduo são de acordo com Kabat (Kabat et al. , Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) . São utilizadas as abreviaturas de uma única letra dos aminoácido. As degenerescências do ADN são representadas utilizando o código IUB (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B= C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W= A/T, Y = C/T).
Enxertos directos na região hipervariável no esqueleto de consenso humano aceitador - 0 fagemídeo utilizado para este trabalho, o pVO350-2b, era um vector de exibição Fab-g3 monovalente possuindo 2 grelhas de leitura abertas sob o controlo do promotor phoA, essencialmente como descrito em Lee et al. , J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93. A primeira grelha de leitura aberta consiste na sequência de sinal stll fundida com os domínios VL e CHI da cadeia leve aceitadora e a segunda consiste na sequência de sinal stll fundida com os domínios VH e CHI da cadeia pesada aceitadora seguida por uma forma truncada da proteína menor P3 do revestimento fágico (Lowman, H. et al. (1990) Biochemistry 30:10832).
Os domínios VL e VH de Fib504 de rato (anticorpo FIB504.64 produzido pelo hibridoma ATCC HB-293, American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, EUA) foram alinhados com os domínios de consenso humano capa I (huKI) e de consenso humano VH do subgrupo III (huIII) . Para fazer os enxertos da região hipervariável (HVR), utilizaram-se os seguintes esqueletos: utilizou-se HuKI para o esqueleto do 152 ΕΡ 1 784 426 PT domínio variável de cadeia leve (vejam-se as FIG. IA e 7) . Para o esqueleto do domínio variável da cadeia pesada, pode ser utilizado o esqueleto VH aceitador, um domínio VH de consenso humano do subgrupo III (humIII) modificado que difere da sequência de humIII em 3 posições: R71A, N73T e L78A (veja-se Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4285 (1992)) (veja-se a Fig. 1B) . Na geração de anticorpos da presente invenção, o enxerto 504K-RF foi também preparado a partir do domínio VH de consenso humano do subgrupo III modificado fazendo as seguintes substituições de aminoácidos: A71R e A78F.
As regiões hipervariáveis do anticorpo Fib504 de rato (produzido pelo hibridoma ATCC HB-293) foram manipuladas no esqueleto de VH de consenso humano do subgrupo III aceitador para gerar um enxerto de HVR directo (enxerto Fib504) (veja-se a Fig. 1B) . No domínio VL foram enxertadas as regiões que se seguem de Fib504 de rato no aceitador de consenso humano, huKI: posições 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) (Fig. IA).
No domínio VH, foram enxertadas as posições 26-35 (Hl), 49-65 (H2) e 94-102 (H3) (Fig. 1B) . Em adição, foi construído um segundo enxerto de HVR, enxerto Fib504K, que também incluía no interior da HVR, a posição 49 de VL, com base numa definição alargada para L2 (veja-se MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)). MacCallum et al. analisaram as estruturas cristalinas do complexo de anticorpo e antigénio e verificaram que a posição 49 da cadeia leve e as posições 49 e 94 da cadeia pesada faziam parte da região de contacto com o antigénio, e assim, estas posições foram incluídas nas definições de HVR-L2, HVR-H2 e HVR-H3 para os anticorpos humanizados anti-beta7 aqui divulgados.
As variantes de enxerto directo foram geradas por mutagénese de Kunkel (Kunkel et al. (1987) supra) utilizando um oligonucleótido separado para cada região hipervariável. Os clones correctos foram avaliados por sequenciação do ADN.
Randomização suave das regiões hipervariáveis: - O processo de "randomização suave" (veja-se o pedido de patente com número de série US 60/545,840) refere-se a um procedimento para mutagénese desviada ("biased") de uma sequência de uma proteína seleccionada, tal como uma região 153 ΕΡ 1 784 426 PT hipervariável de um anticorpo. 0 método mantém um desvio no sentido da sequência da região hipervariável de murino, rato ou outra sequência de região hipervariável de partida, enquanto introduz uma mutação de aproximadamente 10-50 porcento em cada posição seleccionada. Esta técnica aumenta a capacidade do rastreio de bibliotecas empregue e evita uma alteração no epitopo antigénico reconhecido pelo anticorpo. De acordo com esta técnica de randomização suave, a diversidade de sequências é introduzida em cada região hipervariável utilizando uma estratégia que mantém um desvio no sentido da sequência da região hipervariável murina. Isto foi realizado utilizando uma estratégia de síntese de oligonucleótidos envenenados descrita pela primeira vez por Gallop et al. , J. Med. Chem. 37:1233-1251 (1994). Contudo, estão disponíveis outros métodos para a manutenção de um desvio no sentido do resíduo da região hipervariável não humana, tal como PCR propensa a erros, baralhamento de ADN ("DNA shuffling"), etc.
De acordo com o método aqui utilizado, para uma determinada posição no interior de uma região hipervariável ser mutada, o codão que codifica o aminoácido de tipo selvagem é envenenado com uma mistura (e.g. uma mistura a 70-10-10-10) de nucleótidos resultando numa taxa de mutação de aproximadamente 50 porcento em cada posição da região hipervariável seleccionada. Para o conseguir, o codão que codifica o aminoácido da região hipervariável de tipo selvagem a mutar é sintetizado com um baixo nível de mistura contaminante dos outros três nucleótidos, tal como uma mistura de nucleótidos a 70-10-10-10. Assim, a título de exemplo, para a randomização suave de PRO (CCG), a primeira posição sintetizada é uma mistura de 70% de C e 10% de cada um de G, T e A; a segunda posição é uma mistura de 70% de C e 10% de cada um de A, Ge T; e a terceira posição é uma mistura de 70% de G e 10% de cada um de A, C e T. Entenda-se que o desvio pode ser ajustado para cima ou para baixo dependendo do codão que está a ser sintetizado numa determinada posição, do número de codões que codificam para um aminoácido particular e do grau em que a síntese de oligonucleótidos é envenenada pela composição de nucleótidos da mistura de síntese.
Os oligonucleótidos após a randomização suave podem ser normalizados face às sequências da região hipervariável de 154 ΕΡ 1 784 426 PT murino, rato ou outra região hipervariável de partida e abranger as mesmas regiões que foram definidas pelos enxertos directos da região hipervariável. Opcionalmente, duas posições, aminoácidos no inicio de H2 e H3 no domínio VH, podem ser limitadas na sua diversidade: o codão RGC pode ser utilizado para a posição 49 que codifica A, G, S ou T e na posição 94, pode ser utilizado o codão AKG que codifica M ou R.
Geração de bibliotecas de fagos - Conjuntos de oligonucleótidos randomizados concebidos para cada região hipervariável, foram fosforilados separadamente em seis reacções de 20 μΐ contendo 660 ng de oligonucleótido, Tris 50 mM a pH 7,5, MgCl2 10 mM, ATP 1 mM, DTT 20 mM e 5 U de polinucleótido-quinase durante lh a 37°C. Os seis conjuntos de oligonucleótidos fosforilados foram então combinados com 20 pg de molde de Kunkel em Tris 50 mM a pH 7,5, MgCl2 10 mM num volume final de 500 μΐ, resultando uma razão de oligonucleótido para molde de 3. A mistura foi hibridada a 90°C durante 4 min, 50°C durante 5 min e depois arrefecida em gelo. O excesso de oligonucleótido não hibridado foi removido com um kit de purificação por PCR QIAQUICK™ (kit 28106 Qiagen, Qiagen, Valência, CA) utilizando um protocolo modificado para prevenir a desnaturação excessiva do ADN hibridado. Aos 500 μΐ de mistura hibridada, adicionaram-se 150 μΐ de tampão PB da Qiagen e dividiu-se a mistura entre 2 colunas de sílica. Após uma lavagem de cada coluna com 750 μΐ de tampão PE da Qiagen e uma centrifugação extra para secar as colunas, cada coluna foi eluída com 110 μΐ de Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8. O molde hibridado e limpo (220 μΐ) foi então preenchido por adição de 1 μΐ de ATP 100 mM, 10 μΐ dos dNTP 25 mM (25 mM para cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP) , 15 μΐ de DTT 100 mM, 25 μΐ de tampão TM 10X (Tris 0,5 M a pH 7,5, MgCl2 0,1 M) , 2400 U de ligase de T4 e 30 U de polimerase de T7 durante 3 h à temperatura ambiente. 0 produto preenchido foi analisado em géis de Tris-Acetato-EDTA/agarose (Sidhu et ai., Methods in Enzymoiogy 328:333-363 (2000)). São usualmente visíveis três bandas: a banda do fundo é um produto correctamente preenchido e ligado, a banda do meio é preenchido mas não ligado e a banda do topo tem cadeias deslocadas. A banda do topo é produzida por uma 155 ΕΡ 1 784 426 PT actividade secundária intrínseca da polimerase de T7 e é difícil de evitar (Lechner et al. , J. Biol. Chem. 258:11174-11184 (1983)); contudo, esta banda é transformada de forma 30 vezes menos eficiente do que a banda do fundo e usualmente contribui pouco para a biblioteca. A banda do meio é devida à ausência de um fosfato 5' para a reacção de ligação final; esta banda é transformada eficientemente e origina principalmente a sequência de tipo selvagem. 0 produto preenchido foi então limpo e electroporado em células SS320 e propagado na presença de fago auxiliar M13/K07 como descrito por Sidhu et al., Methods in Enzymology 328:333-363 (2000) . As dimensões das bibliotecas variaram de 1 - 2 x 109 clones independentes. Clones aleatórios das bibliotecas iniciais foram sequenciados para avaliar a qualidade das bibliotecas.
Selecção em fagos - A integrina alfa4beta7 humana de comprimento completo foi expressa em células 293 (Graham et al. , J. Gen Virol. 36:59 (1977)), purificada por cromatografia de afinidade com Fib504 e utilizada como alvo para selecção em fagos. Para a imobilização em placas de microtítulo MaxiSorp™ (Nalge Nunc, Rochester, NY), revestiram-se as placas com 100 μΐ de integrina alfa4beta7 humana a 5 pg/ml em NaCl 150 mM, Tris 50 mM a pH 7,5, CaCl2 2 mM, MgCÍ2 2 mM e MnCl2 2 mM (TBSM) , durante a noite a 4 graus C. Bloquearam-se os poços durante 1 h utilizando TBSM contendo 1% de BSA. Para o primeiro ciclo de selecção, utilizaram-se 8 poços revestidos com alvo; utilizou-se um único poço revestido com alvo para ciclos sucessivos de selecção. Os fagos foram colhidos do sobrenadante da cultura e suspensos em TBSM contendo 1% de BSA e 0,05% de TWEEN™ 20 (TBSMBT) . Após a ligação aos poços durante 2 h, os fagos não ligados foram removidos por lavagem intensiva com TBS contendo 0,05% de TWEEN 20 (TBST) . Os fagos ligados foram eluídos por incubação dos poços com HC1 100 mM durante 30 min. Os fagos foram amplificados utilizando células ToplO e fago auxiliar M13/K07 e crescidos durante a noite a 37 °C em 2YT, com 50 pg/ml de carbanacilina. Os títulos de fagos eluídos de um poço revestido com alvo foram comparados com títulos de fagos recuperados de um poço não revestido com alvo para avaliar o enriquecimento. Depois de realizados 156 ΕΡ 1 784 426 PT quatro ciclos de selecção, seleccionaram-se clones aleatórios para análise da sequência.
Produção de Fab e Determinação da Afinidade - Para expressar a proteína Fab para medições de afinidade, introduziu-se um codão de paragem entre a cadeia pesada e g3 no vector de exibição em fagos. Transformaram-se os clones em células E. coli 34B8 e cresceram-se em meios AP5 a 30°C (Presta, L. et al., Câncer Res. 57:4593-4599 (1997)). As células foram colhidas por centrifugação, suspensas em Tris 10 mM, EDTA 1 mM a pH 8 e rompidas utilizando um microfluidizador. O Fab foi purificado por cromatografia de afinidade com Proteína G.
As determinações da afinidade foram realizadas por ressonância plasmónica de superfície utilizando um BIAcore”-3000 (Biacore, Piscataway, NJ) . Imobilizaram-se variantes de Fab de Fib504 humanizadas em acetato 10 mM a pH 4,5 (variando de 250 a 1500 unidades de resposta (UR)) num chip sensor CM5 e injectaram-se diluições de 2 vezes de integrina alfa4beta7 humana (1,5 a 770 nM) em TBSM contendo 2% de n-octilglucósido. Cada amostra foi analisada com tempos de associação de 5 minutos e de dissociação de 5 a 60 minutos. Após cada injecção, regenerou-se o chip utilizando três injecções de 1 minuto de ureia 8 Μ. A resposta de ligação foi corrigida por subtracção das UR de uma célula de fluxo branco. Utilizou-se um modelo de Languir 1:1 de ajuste simultâneo de kon e k0ff para a análise cinética.
Resultados e Discussão
Humanização de Flb504 de rato - O esqueleto aceitador humano utilizado para a humanização é baseado no esqueleto utilizado para HERCEPTIN® e consiste no domínio VL de consenso humano capa I (huKI) e uma variante do domínio VH de consenso humano do subgrupo III (humIII). Este domínio VH variante tem 3 alterações relativamente ao consenso humano: R71A, N73T e L7 8A. Os domínios VL e VH de Fib504 de rato foram, cada um, alinhados com os domínios humanos capa I e do subgrupo III; cada região hipervariável (HVR) foi identificada e enxertada no esqueleto aceitador humano para gerar um enxerto de HVR (enxerto 504) que podia ser exibido na forma de um Fab sobre o fago (Fig. IA e 1B). 157
ΕΡ 1 784 426 PT
Com base na análise de estruturas cristalinas disponíveis do complexo de anticorpo e antigénio, MacCallum et al. (MacCallum et ai. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)) propuseram definições de HVR baseadas em resíduos do domínio variável que frequentemente entravam em contacto com antigénios. Assim, as posições 49G e 94M da cadeia pesada foram incluídas no enxerto de HVR de Fib504 (Fig. 1B) . Em adição, foi também gerado um segundo enxerto de HVR, enxerto Fib504K, que incluía a posição 49K da cadeia leve, pois esta posição está também no interior da definição de contacto de HVR-L2 e pode servir como contacto com o antigénio (Fig. IA) . Quando foram exibidos os enxertos Fib504 ou Fib504K nos fagos e foram testados quanto a ligação a alfa4beta7 imobilizada, não se observou ligação.
As bibliotecas foram geradas utilizando ambos os enxertos de HVR, Fib504 e Fib504-K, em que cada uma das regiões HVR foi simultaneamente submetida a randomização suave. Cada biblioteca de enxertos de HVR foi seleccionada ("panned") contra alfa4beta7 imobilizada em 4 ciclos de selecção. Não se observou enriquecimento e os clones escolhidos para análise da sequência de ADN apresentaram apenas alterações aleatórias na sequência direccionadas para as 6 regiões HVR.
Foram investigadas duas sequências de esqueletos de VH adicionais, "RL" e "RF", como esqueletos aceitadores, e continham alterações nas posições 71 e 78. A posição 71 foi alterada para uma Arginina como no consenso humano do subgrupo III e a posição 78 foi alterada para uma Leucina como no consenso humano do subgrupo III (esqueleto aceitador "RL") ou uma Fenilalanina como no consenso humano do subgrupo II e o esqueleto VH de Fib504 de rato (esqueleto aceitador "RF") (Fig. 10A) . Quando foram exibidos nos fagos o enxerto Fib504 ou o Fib504K no esqueleto aceitador "RL" (Fib504-RL e Fib504K-RL) ou "RF' (Fib504-RF e Fib504K-RF) e foram testados quanto a ligação a alfa4beta7 imobilizada, foi observada ligação específica de fagos apenas para o enxerto Fib504K utilizando o esqueleto "RF" (Fig. 10B) . A modesta ligação de fagos que exibem o enxerto Fib504-RF relativamente aos outros enxertos que não possuem Y49K (cadeia leve) e L78F (cadeia pesada) 158 ΕΡ 1 784 426 PT indica a importância destas posições na selecção de um esqueleto aceitador útil.
Foram geradas bibliotecas como acima utilizando uma estratégia de randomização suave simultaneamente em cada uma das 6 HVR para os enxertos Fib504K-RL e Fib504K-RF e seleccionaram-se em alfa4beta7 imobilizada em 4 ciclos de selecção como descrito acima. 0 enriquecimento foi apenas observado para a biblioteca baseada no enxerto Fib504K-RF. Os clones do ciclo 4 da biblioteca de Fib504K-RF foram seleccionados para análise da sequência e revelaram alterações de aminoácidos direccionadas para HVR-L1. A maioria dos clones continha a alteração Y32L; em adição, a posição 31 foi frequentemente alterada para D, S, P ou N (Fig. 1C). Em adição ao enxerto de partida, Fib504K-RF, foram expressos e purificados 3 clones na forma de proteína Fab e adicionalmente foram analisados por Biacore como descrito acima. Os clones hu504-5, hu504-16 e hu504-32 (variantes de SEQ ID N0:1 contendo substituições T31S mais Y32L (variante hu504.5), Y32L (variante hu504.16) ou T31D mais Y32L (variante hu504.32); veja-se a Figura 1C), apresentaram excelente ligação a alfa4beta7 relativamente ao enxerto Fib504K-RF e igualaram ou excederam a afinidade do Fab de Fib504 quimérico quanto a ligação a alfa4beta7. Os resultados da análise Biacore estão apresentados na Tabela 3 adiante, e indicam que a variação seleccionada nas regiões HVR e/ou de esqueleto, aqui divulgada, gerou anticorpos antagonistas para alfa4beta7 possuindo afinidade melhorada relativamente ao anticorpo de partida. Os resultados na Tabela 3 indicam que a variante humanizada 504.32 apresentou o maior aumento de afinidade relativamente ao anticorpo de rato de partida ligando-se 3 vezes mais fortemente a alfa4beta7.
Tabela 3
Fab (análise BIAcore™) Afinidade para com Alfa4beta7 (nM) Fib504 11 Variante 504.5 9 Variante 504.16 23 Variante 504.32 3 159
ΕΡ 1 784 426 PT
Os resultados na Tabela 3 também indicam que o re-desenho de HVR-L1 foi importante para o restabelecimento da ligação ao antigénio de elevada afinidade. Em particular, a mutação Y32L foi a mais frequente entre os vários clones. Outras alterações na posição 31 e numerosas outras substituições ao longo de toda a HVR-H1 parecem ser bem toleradas e podem proporcionar melhorias adicionais. A partir destes resultados fica claro que existem múltiplas alterações da sequência que podem melhorar a afinidade de Fib504 enxertado num esqueleto humano para gerar afinidades que igualam ou superam a do anticorpo de rato inicial.
Assim, partindo do enxerto das 6 HVR de Fib504 de rato no esqueleto aceitador humano, a expansão de HVR-L2 para incluir a posição 49 (Lisina), a expansão de HVR-H2 para incluir a posição 49 (Glicina) e a expansão de HVR-94 para incluir a posição 94 (Metionina) assim como alterações de aminoácidos na posição 32 de VHR-L1 (onde L ou I substituem Y) e, opcionalmente, na posição 31 da VHR-L1 (onde T é substituída por D ou S, por exemplo) . As alterações de aminoácidos do esqueleto úteis foram efectuadas nas posições 71 (A71R) e 78 (L78F) no domínio VH. Estas alterações de aminoácidos conduzem a um anticorpo completamente humano, a variante hu504.32, por exemplo, com afinidade de ligação 3 vezes melhorada para com a integrina alfa4beta7. Adicionalmente, determinou-se que os anticorpos humanizados seleccionados aqui descritos possuem actividade biológica pelo menos comparável à do anticorpo de rato Fib504 progenitor (veja-se o Exemplo 3).
Exemplo 2: Variantes de HVR de Fib504 humanizadas adicionais
As sequências de aminoácidos de HVR da variante humanizada Fib504.32 foram ainda modificadas para gerar variantes adicionais capazes de antagonizar a actividade da subunidade beta7 da integrina e/ou integrinas contendo a subunidade beta7.
Geração de uma biblioteca de varrimento amplo de aminoácidos - Foi gerada uma biblioteca para o varrimento de posições de HVR seleccionadas quanto a outros resíduos de aminoácido capazes de gerar variantes de ligação a beta7 de hu504.32 variante, utilizando 3 oligonucleótidos: 504-L1, 160 ΕΡ 1 784 426 PT concebido para randomização suave de uma porção de HVR-L1 com um desvio no sentido da sequência de HVR-L1 de hu504.32 (i.e. a sequência ASESVDDLLH (SEQ ID NO:47, para as posições relativas A2-A11), foi submetida a randomização suave como descrito acima); e 504-N96 de HVR-L3 e 504-M94 de HVR-H3 que introduzem NNS nas posições: posição 96 de HVR-L3 na cadeia leve e posição 94 de HVR-H3 na cadeia pesada, desse modo permitindo todos os 20 aminoácidos nestas posições. Com estes três oligonucleótidos, a biblioteca de varrimento amplo de aminoácidos foi gerada como descrito acima utilizando um molde contendo três codões de paragem na cadeia leve (posições 31 e 32 em HVR-L1 e posição 96 em HVR-L3) e 1 codão de paragem na cadeia pesada (posição 94 na HVR-H3).
Varrimento amplo de aminoácido de hu504-32 - Para mais completamente explorar as sequências preferidas permitidas em HVR-L1 e para melhorar a estabilidade de 504-32, desenhámos uma biblioteca de fagos que a) efectuou a randomização suave de HVR-L1 de 504-32 na região em que foram observadas alterações (i.e. ASESVDDLLH (SEQ ID NO:47, para as posições relativas A2-A11) durante a humanização (Figura 1C) e b) permitiu todos os possíveis aminoácidos em N96 em HVR-L3 e M94 em HVR-H3. Após 4 ciclos de selecção contra integrina alfa4beta7 humana de comprimento completo imobilizada como descrito acima, seleccionaram-se 96 clones aleatórios para análise de sequência. A frequência a que os aminoácidos eram encontrados em cada posição na biblioteca de varrimento amplo de aminoácidos sugere que a sequência de HVR-Ll presente em hu504-32 e a metionina na posição 94 na cadeia pesada são óptimas para ligação de elevada afinidade (Figura 12) . Os aminoácidos mais preferidos obtidos pelas selecções partindo da variante 504.32 (Fig. 12) estão apresentadas a amarelo. Em contraste, embora esteja presente asparagina na posição 96 na cadeia leve de hu504-32, a elevada frequência de leucina observada nesta posição no varrimento amplo de aminoácidos sugere que a mutação N96L pode adicionalmente melhorar a afinidade de variantes de Fib504 humanizadas para com alfa4beta7 e também elimina quaisquer problemas potenciais de desamidação nesta posição. A informação na Figura 12 também sugere que é provável que um número de aminoácidos de substituição sejam tolerados na maioria das posições sem uma perda substancial na afinidade. Por exemplo, para eliminar a 161 ΕΡ 1 784 426 PT oxidação de M94 em HVR-H3, podem provavelmente ser substituídas glutamina ou arginina.
Geração das bibliotecas de varrimento limitado de aminoácidos - Seis bibliotecas para um varrimento limitado de aminoácidos utilizaram seis moldes de Kunkel diferentes, cada um contendo um codão de paragem localizado no interior de uma das seis HVR. Cada biblioteca foi gerada utilizando um único oligonucleótido que codifica uma única HVR e utilizando os codões enumerados na Fig. 11A (coluna "codão") para alterar resíduos de aminoácido para subsequente teste quanto a ligação a beta7 ou alfa4beta7. Utilizam-se os mesmos procedimentos para alterar resíduos de aminoácido de anticorpos anti-beta7 e os testar quanto a ligação a integrinas alfaEbeta7.
Varrimento limitado de aminoácidos de hu504-32 - 0 varrimento limitado de aminoácidos de hu504-16 foi desenhado para tornar hu504-16 ainda mais similar à sequência de consenso humana de cadeia leve e pesada e no processo identificar os elementos mínimos da sequência de Fib504 de rato que são necessários para a ligação. Foram geradas seis bibliotecas que foram direccionadas a cada HVR nas posições que diferiam entre o hu504-16 e as cadeias pesada do subgrupo III ou leve capa I de consenso humanas (Figura IA e 1B) ; quer o aminoácido de rato quer o humano foram permitidos nestas posições na biblioteca (Figura 11A) . Para acomodar a codificação para ambos os aminoácidos durante a síntese oligonucleotidica e a mutagénese, foram também introduzidos aminoácidos adicionais em alguns casos (vejam-se os aminoácidos codificados, Figura 11A) . As bibliotecas de varrimento limitado de aminoácidos foram seleccionadas contra integrina alfa4beta7 humana de comprimento completo imobilizada como descrito acima e foram sequenciados aproximadamente 32 clones aleatórios de cada biblioteca após o ciclo 3. A frequência de cada aminoácido encontrado em cada posição está apresentada na Figura 11B e 11C.
Tal como o varrimento amplo de aminoácidos, o varrimento limitado de aminoácidos também proporciona informação acerca de que alterações são toleradas em muitas posições no Fib504 humanizado. Ao contrário do varrimento amplo de aminoácidos, contudo, a diversidade permitida em cada posição randomizada 162 ΕΡ 1 784 426 PT no varrimento limitado de aminoácidos foi restrita a um par de aminoácidos. Assim, a falta de qualquer substituição observada numa determinada posição não é indicativa de que um resíduo particular não pode ser alterado nem a frequência elevada de qualquer aminoácido particular numa determinada posição indica necessariamente que essa é a melhor solução para elevada afinidade.
Em algumas posições (posições 27, 29, 30, 53, 54 da cadeia leve e 50, 54, 58, 60, 61 e 65 da cadeia pesada) o aminoácido de consenso humano é seleccionado bastante frequentemente sugerindo que uma reversão da mutação para o consenso humano não alteraria drasticamente a ligação a alfa4beta7 humana. De facto, na posição 54 da cadeia leve (em HVR-L2), o aminoácido de consenso humano é seleccionado mais frequentemente do que o aminoácido de Fib504 de rato indicando que esta alteração feita em 504-32 proporciona um anticorpo de ligação a beta7 útil.
Adicionalmente, em resultado do desenho da biblioteca, os aminoácidos que não são derivados nem do consenso humano nem de Fib504 de rato são seleccionados mais frequentemente em algumas posições e proporcionam potenciais substituições para melhorar a afinidade de variantes humanizadas de Fib504. Estas incluem, sem limitação, D30A e I55V na cadeia leve e Y50F na cadeia pesada. Os resultados destas 2 bibliotecas indicam que muitas posições de HVR toleram outras substituições de aminoácidos e retêm ainda uma actividade biológica comparável.
Sumários de alterações de aminoácidos observadas estão apresentados nas Figuras 13 e 15. A Figura 15 resume os vários aminoácidos úteis em cada uma das posições nas CDR das variantes de anticorpos da invenção em posições numeradas de acordo com a numeração de Kabat ou um sistema de numeração relativa. Cada um dos anticorpos adicionais abrangidos pelas variantes representadas nas Figuras 13 e 15 constitui uma concretização da invenção.
Exemplo 3: Ensaios de Adesão Celular
A capacidade de algumas das variantes humanizadas de Fib504 da invenção ligarem ligandos expressos na superfície de uma célula foi testada por ensaios de adesão celular. A 163 ΕΡ 1 784 426 PT ligação a alfa4beta7 e a outra integrina beta7, alfaEbeta7, foi testada pela capacidade das variantes humanizadas destruírem a ligação da integrina ao seu receptor natural. A ligação das variantes humanizadas de Fib504 à subunidade beta7 sozinha expressa na superfície de uma célula foi similarmente testada. Os procedimentos e os resultados estão descritos adiante.
Produção de IgG - IgG variantes humanizadas de Fib504 foram expressas transientemente em células 293 (Graham et al. (1977) supra) utilizando um vector separado para as cadeias leves e pesadas. Os vectores foram construídos por subclonagem dos domínios variáveis leves ou pesados em vectores de expressão adequados para cada uma das cadeias leves e pesadas. 0 sobrenadante de 1,1 L de cultura de células CHO de uma variante humanizada de Fib504 foi filtrado através de um filtro de 0, 45 um e aplicado numa nova coluna HP de HiTrap Proteína A de 1 mL (Amersham/Pharmacia) equilibrada em
Tampão A (tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) . Aplicaram-se as amostras a 0,8 mL/min, durante a noite, 4 graus C. Cada coluna foi então lavada e equilibrada com 30 mL de Tampão A. A eluição do anticorpo foi realizada por cromatografia à temperatura ambiente numa FPLC (Amersham/Pharmacia) utilizando um gradiente linear de 14 min a 1 mL/min de 0 a 100% de Tampão B (Glicina 100 mM, pH 3,0). As fracções de 1 mL resultantes foram imediatamente neutralizadas pela adição de 75 uL de tris 1 M, pH 8. A proteína aluída foi detectada por absorção a 280 nm e as fracções de pico foram reunidas e dessalinizadas em PBS em colunas de dimensionamento descartáveis de PD10 G-25 Sephadex (Amersham/Pharmacia). A proteína foi detectada por DO280 e as fracções de pico foram reunidas. O anticorpo em PBS foi filtrado por 0,22 um e armazenado a 4 graus C. Utilizou-se análise de aminoácidos para quantificar as concentrações destes anticorpos purificados e foram atribuídos valores a partir da média de duas determinações separadas.
Marcação com BCECF:
Em cada um dos ensaios apresentados neste Exemplo 3, as células foram marcadas de acordo com o procedimento seguinte. Todas as células utilizadas nos ensaios de adesão foram marcadas com éster acetoximetílico de 2',7'-bis-(2- 164 ΕΡ 1 784 426 PT carboxiletil)-5-(e-6)-carboxifluoresceína (BCECF) a 10 uM em meios RPMI1640 contendo 10% de FBS para células RPMI8866 e células 38C13 transfectadas com a subunidade beta7 (células 38C13 beta7) e em mistura F-12:DMEM (50:50) contendo 10% de FBS para células 293 transfectadas com alfaEbeta7 (células alfaEbeta7 293). As células foram marcadas durante 30 minutos e lavadas duas vezes com meio de ensaio. A densidade celular foi ajustada a 3 xlO6 células por ml para as células RPMI8866 e 38C13beta7 e a 2,2 x 106 células por ml para células alfaEbeta7 293.
As variantes humanizadas de Fib504 destroem a ligação de alfa4beta7 a MAdCAM
Adesão celular RPMI8866/MAdCAM-l-Ig: As células RPMI8866 expressam alfa4beta7 na sua superfície (Roswell Park Memorial Institute, Buffalo, NY) . As variantes humanizadas de Fib504 (variantes hu504) foram colocadas em contacto com uma mistura de células RMPI8866 e MAdCAM fundido com IgG que revestia um suporte sólido. As concentrações de variante humanizada de Fib504 que resultavam numa inibição de 50% (IC50) da ligação de células RPMI8866 a MAdCAM-1 foram medidas por revestimento de placas Nunc Maxisorp™ de 96 poços com MAdCAM-l-Ig a 2 pg/ml em PBS, 100 μΐ/poço (Genentech, Inc., onde Ig se refere à fusão de MAdCAM-1 com uma região Fc) durante a noite a 4°C. Após bloqueio das placas com 200 ul/poço de BSA a 5 mg/ml durante uma hora à temperatura ambiente, adicionaram-se a cada poço 50 μΐ de variantes humanizadas de Fib504 em meio de ensaio (meio RPMI 1640, Hyclone®, Logan Utah, EUA, suplementado com BSA a 5 mg/mL) e adicionaram-se a cada poço 150 000 de células marcadas com BCECF (BCECF, Molecular Probes, Eugene OR) em 50 μΐ de meio de ensaio e incubou-se durante 15 minutos a 37°C. Lavaram-se os poços duas vezes com 150 μΐ de meio de ensaio para remover células não ligadas. Solubilizaram-se as células ligadas com 100 μΐ de SDS a 0, 1% em Tris 50 mM/HCl pH7,5. A quantidade de fluorescência libertada pelas células lisadas foi medida por SPECTRAmax GEMINT™ (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) com comprimentos de onda de excitação de 485 nm e de emissão de 530 nm. Os valores de fluorescência foram analisados em função das concentrações das variantes humanizadas de Fib504 adicionadas em cada ensaio, utilizando um ajustamento não linear de quatro parâmetros dos mínimos quadrados, para obter os valores de 165
ΕΡ 1 784 426 PT IC5o de cada variante humanizada de Fib504 no ensaio. Os valores de IC50 e IC90 foram estimados a partir do ajustamento de quatro parâmetros. A Fig. 14 é um gráfico exemplificativo dos resultados. Os valores de IC90 e IC50 para cada uma das variantes testadas estão apresentados adiante na Tabela 4.
Tabela 4. Ligação do anticorpo a MAdCAM-1 humana
Anticorpo Testado: Fib504 e variantes hu504 IC50 (nM) Exp 1/Exp 2* IC90 (nM) Exp 1/Exp 2* Fib504 de Rato 0,098/0,197 0,483/0,703 Variante hu504.5 0,067/0,248 0,361/0,880 Variante hu504.16 0,0768/0,206 0,244,/0,551 Variante hu504.32 0,036/0,119 0,150/0,396 6B11 (controlo não bloqueador) >100 >100 *Exp 1/Exp 2 referem-se aos resultados de ensaios repetidos.
Destruição pela variante humanizada de Fib504 da ligação de alfa4beta7 a VCAM
Adesão_Celular RPM18866/7dVCAM-l: 0 ensaio de RPMI8866/7dVCAM é de formato similar ao de RPMI8866/MAdCAM-l-Ig excepto utilizando 7dVCAM-l (ADP5, R&D Systems, Minneapolis, MN) a 2 ug/ml para revestir as placas. Os resultados foram analisados como descrito acima para as experiências de ligação de MAdCAM. Os valores de IC50 para cada uma das variantes testadas estão apresentados adiante na Tabela 5.
Tabela 5. Ligação do anticorpo a VCAM humana
Anticorpo Testado: Fib504 e variantes hu504 IC50 (nM) Exp 1/Exp 2* IC90 (nM) Exp 1/Exp 2* Fib504 de Rato 0,107/0,193 0,396/0,580 Variante hu504.5 0,088/0,270 0,396/0,726 Variante hu504.16 0,098/0,223 0,261/0,774 Variante hu504.32 0,059/0,110 0, 183/0,337 6B11 (controlo não bloqueador) >100 >100 *Exp 1/Exp 2 referem-se aos resultados de ensaios repetidos. 166
ΕΡ 1 784 426 PT
Destruição pela variante humanizada de Fib504 da ligação de alfaEbeta7 a E-caderina humana
Adesão Celular AlfaEbeta7 293/huE-Caderina: Células 293 (Graham et al. (1977) supra) foram transfectadas com alfaE e beta7 (Genentech, Inc.) . 0 formato do ensaio é similar ao ensaio de RPMI8866/MAdCAM-l-Ig excepto utilizando huE-Caderina (648-EC, R&D Systems, Minneapolis, MN) a 2 pg/ml para revestir as placas. As placas foram depois bloqueadas com BSA a 5 mg/ml como mencionado acima e adicionaram-se a cada poço 50 μΐ de variantes de FIB504 em meio de ensaio (F-12:DMEM (50:50) suplementado com BSA a 5 mg/ml) e adicionaram-se a cada poço 110 000 células marcadas com BCECF em 50 ul de meio de ensaio e incubou-se durante 15 minutos a 37°C. Lavaram-se os poços duas vezes com 150 μΐ de meio de ensaio e mediu-se a quantidade de fluorescência libertada pelas células lisadas e analisou-se como descrito acima. Os resultados do ensaio de três experiências estão apresentados na Tabela 6.
Tabela 6. Ligação do anticorpo a E-Caderina humana
Anticorpo Testado: Fib504 e variantes hu504 IC50 (nM) IC90 (nM) Fib504 de Rato 2,047/7,89/4,19 8,80/24,5/9,95 Variante hu504.5 2,132/10,18/4,77 7,99/28,7/10,19 Variante hu504.16 1,957/10,05/4,58 7,03/33,7/13,51 Variante hu504.32 1,814/6,99/3,47 8,8/24,5/11,73 HP2/1 (anti-alfa4, controlo) >100/>100/>100 >100/>100/>100
Destruição pela variante humanizada de Fib504 da ligação de beta7 a MAdCAM
Ensaio de Adesão Celular 38C13beta7/muMAdCAM-l-Ig: O ensaio de 38C13beta7/muMAdCAM-l-Ig foi de formato similar ao de RPMI8866/MAdCAM-l-Ig excepto utilizando muMAdCAM-1-Ig (Genentech, Inc.) a 2 pg/ml para revestir as placas. Transfectaram-se células 38C13 alfa4+ de linfoma murino (Crowe, D.T. et al. , J. Biol. Chem. 269:14411-14418 (1994)) com ADN que codifica integrina beta7 de forma que a alfa4beta7 foi expressa sobre a superfície das células. A capacidade dos 167 ΕΡ 1 784 426 PT anticorpos variantes destruírem a interacção entre a alfa4beta7 associada à membrana celular e MAdCAM foi avaliada como acima. Os resultados do ensaio estão apresentados na Tabela 7. Os resultados do ensaio estão apresentados na Tabela 7. (estão apresentados valores de IC50 e IC90 para 2 experiências).
Tabela 7. Actividade de anticorpos variantes hu504 na ligação de células que expressam 38C13-beta7 a MAdCAM murina
Anticorpo Testado: Fib504 e variantes hu504 IC50 (nM) IC90 (nM) Fib504 de Rato 0,682/0,306 2,869/1,51 Variante hu504.5 0, 8587/0,466 2,322/2,61 Variante hu504.16 0,998/0,610 3,717/4,08 Variante hu504.32 0,718/0,458 4,08/1,51
Destruição pela variante humanizada de Fib504 da ligação de beta7 a VCAM murina
Ensaio de Adesão Celular 38C13beta7/muVCAM-l-Iq: 0 ensaio de 38C13beta7/muVCAM-l-Ig foi realizado de acordo com o ensaio de ligação de MAdCAM murina-l-Ig/células RPMI8866 anterior, excepto utilizando muVCAM-l-Ig (Genentech, Inc.) a 2 pg/ml para revestir as placas. Os resultados do ensaio estão apresentados na Tabela 8. (Estão mostrados os valores de IC50 e IC90 para 2 experiências).
Tabela 8. Actividade de anticorpos variantes hu504 na ligação de células que expressam 38C13-beta7 a VCAM-l-Ig murina
Anticorpo Testado: Fib504 e variantes hu504 IC50 (nM) IC90 (nM) Fib504 de Rato 0,845/0,447 2,903/2,30 Variante hu504.5 0,763/0,407 3,074/2,30 Variante hu504.16 0,835/0,584 2,857/1,84 Variante hu504.32 0,562/0,330 2,004/1,84 168
ΕΡ 1 784 426 PT
Os resultados dos estudos de ligação da variante humanizada de Fib504 demonstram que o anticorpo humanizado da invenção liga a sua subunidade beta7 de integrina alvo assim como a integrina alfa4beta7 e alfaEbeta7 com aproximadamente a mesma afinidade que o anticorpo de rato de partida e, em algumas concretizações, com maior afinidade. Assim, um anticorpo humanizado anti-beta7 de acordo com a invenção tem utilidade em terapias anti-integrina beta7, particularmente terapias humanas.
Actividade relativa de variantes hu504.32 da invenção
Diferentes variantes de aminoácidos do anticorpo hu504.32 foram testadas num ensaio de adesão celular com células humanas e de ratinho quanto à sua capacidade para inibir a ligação do receptor contendo beta7 ao seu ligando de acordo com os métodos de ensaio de adesão celular aqui divulgados. 0 ensaio de RPMI8866/MAdCAM-l-Fc foi realizado como aqui descrito acima. 0 ensaio de alfaEbeta7-293/hu E-caderina foi modificado pela utilização de E-caderina humana-Fc como ligando (E-caderina humana-Fc, 648-EC, R&D Systems, Minneapolis, MN). A capacidade relativa de variantes hu504.32 inibirem a interacção de fibronectina humana (huFN40) com receptor alfa4beta7 humana em células PRMI8866 foi também examinada. 0 ensaio de RPMI8866/hu Fibronectina (huFN40) utilizado para estes estudos foi similar em formato ao ensaio de RPMI8866/MAdCAM-l-Ig aqui divulgado excepto utilizando o fragmento alfa-quimiotriptico de 40 kDa de fibronectina humana (F1903, Chemicon International, Temecula, CA) a 2 pg/ml para revestir as placas.
Foi examinada a capacidade das variantes hu504.32 inibirem a interacção de receptores contendo beta7 murina com MAdCAM-1 murina ou VCAM-1 murina. A MAdCAM-l-Fc murina e a VCAM-l-Fc murina foram inibidas em termos da interacção com células de linfoma murino alfa4+ que expressam beta7 murina (células 38C13beta7) pelas variantes hu504.32. Os ensaios de adesão celular de MAdCAM-l-Fc e VCAM-l-Fc murinas foram realizados similarmente aos aqui descritos acima para MAdCAM e VCAM humanas. Quando os ligandos estavam fundidos com regiões Fc, os receptores de Fc nas células foram bloqueados com 0,5 pg de anticorpo anti-CD16/32 (anticorpo anti-receptor Fcgama III/II, n.° de catálogo 553142, BD Biosciences, San 169
ΕΡ 1 784 426 PT
Jose, CA) por 1 milhão de células durante 5 minutos à temperatura ambiente. Adicionaram-se 150 000 células marcadas em 50 μΐ de meio de ensaio a cada poço e incubou-se durante 13 minutos a 37°C. Lavaram-se os poços e mediu-se a quantidade de fluorescência libertada das células lisadas como aqui divulgado acima. O anticorpo de controlo para os ensaios de adesão de células humanas foi o anticorpo monoclonal de ratinho contra albumina sérica humana, 6B11 (N.° de Catálogo abl0244, Novus Biologicals, Littleton, CO, EUA). O anticorpo de controlo para os ensaios de adesão de células murinas foi o anticorpo de rato anti-integrina beta7 de ratinho, M293 (BD Biosciences, San Jose, CA) , que não compete com o ligando ou com Fib504 pela ligação a integrina beta7.
Os resultados de ensaios em triplicado para os ensaios de adesão de células humanas e murinas estão apresentados nas Tabelas 9 e 10, respectivamente.
Tabela 9. Actividade de anticorpos variantes hu504.32 em Ensaios de Adesão de Células Humanas
Anticorpo Variante IC50 Média ± DP RPMI8866/ huMAdCAM-l-Fc RPMI8866/ hu7dVCAM-l αΕβ7-2 93/ huE-Caderina-Fc RPMI8866/ huFN4 0 hu504.32 0,088 ± 0,035 0,101 ± 0,021 3, 970 ± 1,664 0,100 ± 0,046 hu504.32M94Q 0,090 ± 0,045 0,111 ± 0,035 4,130 ± 1,212 0,124 ± 0,056 hu504.32M94R 0,075 ± 0,034 0,089 ± 0,009 3,963 ± 1, 776 0,119 ± 0,056 Controlo >100 >100 >100 >100 (6B11)
Tabela 10. Actividade de anticorpos variantes hu504.32 em Ensaios de Adesão de Células Murinas
Anticorpo Variante IC5 0 Média ± DP 38C13beta7/ muMAdCAM-1-Fc 38C13beta7/ mu7dVCAM-l-Fc hu504.32 0,270 ± 0,041 0,228 ± 0,065 hu504.32M94Q 0,370 ± 0,102 0,264 ± 0,083 hu504.32M94R 0,391 ± 0,112 0,228 ± 0,081 Controlo (M293) >100 >100 170
ΕΡ 1 784 426 PT Ο anticorpo hu504.32 possui uma metionina na posição 94 da CDR3 da cadeia pesada. As variantes M94Q (ou hu504.32Q) e M94R (ou hu504.32R) possuem glutamina ou arginina, respectivamente, na posição 94 da variante do anticorpo hu504.32. Os anticorpos hu504.32M, Q e R reduziram substancialmente a interacção receptor-ligando da integrina beta7 em cada um dos ensaios e são, portanto, potentes inibidores da adesão celular mediada por beta7.
Actividade In Vivo do Anticorpo hu504.32R 0 anticorpo variante hu504.32R foi testado in vivo quanto à sua capacidade para reduzir a interacção receptor-ligando da de integrina beta7 e reduzir o recrutamento de linfócitos para o cólon inflamado num modelo murino in vivo de doença inflamatória do intestino. Ratinhos BALB/c e ratinhos CB 17 SCID foram obtidos de Charles River Laboratories International, Inc. (Wilmington, MA, EUA). Prepararam-se os ratinhos SCID colíticos reconstituídos com células T CD4+CD45Rb(high) por isolamento de células T CD4+CD45Rb(high) de ratinhos BALB/c dadores e transferindo intravenosamente 3xl05 células em 100 μΐ de PBS. Os ratinhos SCID de controlo não recebem células T CD4+CD45Rb (high) . Considerou-se que os ratinhos CD4+ reconstituídos que cumprem os critérios de arrolamento no grupo de tratamento de 10% de perda de peso relativamente à linha de base ou 15% de peso de pico na 4.a semana têm doença inflamatória do intestino induzida e foram seleccionados para tratamento.
No dia do tratamento com os anticorpos de teste, colheram-se células de nódulos linfáticos mesentéricos (MLN) de ratinhos BALB/c dadores e radiomarcaram-se com Cr51. O tratamento envolveu administração prévia intravenosa de anticorpo anti-GPl20, anticorpo anti-beta7 hu504.32, anticorpo anti-beta7 hu504.32R ou não administração de anticorpo (controlo), a 200 pg/100 μΐ de PBS. Trinta minutos após a administração do anticorpo, injectaram-se células de MLN marcadas com Cr51, a 4xl06 células/100 μΐ. Uma hora após a injecção de células marcadas, mataram-se os ratinhos e colheram-se o baço, o cólon e placas de Peyer, pesaram-se e determinou-se a radioactividade total de Cr51 por órgão. A Figura 16 é um gráfico de barras dos resultados destes testes 171 ΕΡ 1 784 426 PT que mostra a capacidade relativa dos anticorpos bloquearem o alojamento de células T radiomarcadas no cólon de ratinhos com doença inflamatória do intestino. 0 alojamento de células T no cólon inflamado foi inibido por anticorpos anti-beta7 hu504.32 e hu504.32R relativamente ao controlo negativo, anticorpo anti-GP120. A distribuição no baço foi similar para todos os anticorpos. Assim, os anticorpos anti-beta7 hu504.32 e hu504.32R inibem eficazmente o alojamento de células T no cólon inflamado in vivo. A glicação de anticorpos não afecta a capacidade da variante hu504.32R bloquear a ligação de MAdCAM-1 ao receptor alfa4beta7. A glicação, a glicosilação não enzimática de proteínas, pode afectar interacções anticorpo-ligando (veja-se, por exemplo, Kennedy, D.M. et al., Clin Exp Immunol. 98(2):245-51 (1994). A glicação de lisina na posição 49 de 504.32R A glicação da lisina na posição 49 da cadeia leve da variante hu504.32R (HVR-L2 posição relativa Bl) foi observada mas não tinha efeito significativo sobre a capacidade do anticorpo variante bloquear a ligação de MAdCAM-1 a células RPMI8866 que expressam receptor alfa4beta7. A determinação da glicação e dos níveis da glicação foi realizada utilizando espectroscopia de massa com ionização por electrovaporização (ESI-MS) convencional e por cromatografia de afinidade com boronato. Os métodos de HPLC de afinidade com boronato úteis para testar a glicação encontram-se, por exemplo, em Quan C.P. et al. , Analytical Chemistry 71(20):4445-4454 (1999) e Li Y.C. et al., J. Chromatography A, 909:137-145 (2001). O ensaio de adesão celular foi realizado de acordo com o ensaio de adesão celular de RPMI8866/MAdCAM-l-Fc aqui divulgado.
Em concretizações alternativas da invenção, a glicação na posição 49 é reduzida ou eliminada quando a posição 49 compreende um aminoácido que não lisina. 0 polipéptido ou anticorpo da invenção abrange como aminoácido da posição 49 (HVR-L2 posição relativa Bl) qualquer dos aminoácidos A, C, D, E, F, G, Η, I, L, Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y, onde cada letra se refere a um aminoácido de acordo com a designação padrão de aminoácidos de letra única. Alternativamente, o aminoácido na posição 49 da cadeia leve de uma variante 172
ΕΡ 1 784 426 PT 504.32R (ou outra variante 504) é seleccionada do grupo que consiste em R, N, V, A, F, Q, Η, P, I ou L. Um aminoácido útil na posição 49 é seleccionado, por exemplo, por exibição (preparação de uma biblioteca de fagos) do Fab de hu504.32R sobre fagos (variante) e substituindo separadamente, no codão para a posição 49, um codão por cada um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural. Os fagos que expressam as variantes hu504.32R alteradas na posição 49 são testados quanto a ligação a integrina beta7 e/ou a um receptor compreendendo integrina beta7, tal como receptores alfa4beta7 ou alfaEbeta7. As variantes que se ligam a integrina beta7 ou aos receptores alfa4beta7 ou alfaEbeta7 são adicionalmente rastreadas quanto à capacidade de inibirem a ligação receptor-ligando da de integrina beta7 e à eficácia in vivo como descrito aqui. Alternativamente, os aminoácidos de ocorrência natural ou não, podem ser substituídos na posição 49 por técnicas padrão de mutagénese e testados nos ensaios de adesão celular e in vivo aqui descritos. Alternativamente, o aminoácido na posição 49 da cadeia leve é um aminoácido que não lisina (K) e os aminoácidos em qualquer outra posição ou posições de HVR ou do esqueleto na cadeia leve e/ou na cadeia pesada são alterados para seleccionar um polipéptido de ligação ou anticorpo variante anti-beta7 que exibe afinidade de ligação, actividade biológica in vitro e in vivo, farmacocinética, depuração de fármacos e imunogenicidade úteis para redução da inflamação por redução da actividade biológica da integrina beta7. A mutagénese e a selecção destes polipéptidos ou anticorpos variantes são realizadas como aqui divulgado e de acordo com outras técnicas padrão. Este polipéptido de ligação ou anticorpo variante anti-beta7 exibem afinidade de ligação para com integrina beta7 10 000 vezes, 1000 vezes, alternativamente 100 vezes, alternativamente 10 vezes, alternativamente 5 vezes, alternativamente 2 vezes superior à afinidade de ligação exibida por qualquer das variantes humanizadas de Fib504 aqui divulgadas.
Lisboa, 2012-02-23

Claims (42)

  1. ΕΡ 1 784 426 PT 1/7 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo humanizado anti-beta7 compreendendo: uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, por ordem, compreende RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9), KYASQSIS (SEQ ID N0:2), QQGNSLPNT (SEQ ID N0:3), GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4), GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5) e ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO:64).
  2. 2. Anticorpo humanizado anti-beta7 compreendendo: uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, por ordem, compreende RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9), KYASQSIS (SEQ ID NO:2), QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3), GFFITNNYWG (SEQ ID NO: 4) , GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5) e MTGSSGYFDF (SEQ ID NO:6).
  3. 3. Anticorpo humanizado anti-beta7 compreendendo: uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, por ordem, compreende RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9), KYASQSIS (SEQ ID NO:2), QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3), GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4), GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5) e AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO:63).
  4. 4. Anticorpo humanizado anti-beta7 compreendendo: uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, por ordem, compreende RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9), KYASQSIS (SEQ ID NO:2), QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3), GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4), GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5) e RTGSSGYFDF (SEQ ID NO:66).
  5. 5. Anticorpo humanizado anti-beta7 compreendendo: uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, por ordem, compreende RASESVDSLLH (SEQ ID NO:7), SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:64.
  6. 6. Anticorpo humanizado anti-beta7 compreendendo: uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, por ordem, compreende RASESVDSLLH (SEQ ID NO:7), SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 e SEQ ID NO:6. ΕΡ 1 784 426 PT 2/7
  7. 7. Anticorpo humanizado anti-beta7 compreendendo: uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, por ordem, compreende RASESVDTLLH (SEQ ID N0:8), SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:64.
  8. 8. Anticorpo humanizado anti-beta7 compreendendo: uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, por ordem, compreende RASESVDTLLH (SEQ ID NO:8), SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6.
  9. 9. Anticorpo humanizado anti-beta7 como reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o anticorpo anti-beta7 compreende uma ou mais sequências de esqueleto humanas e/ou de consenso humanas no seu dominio variável de cadeia pesada e/ou leve.
  10. 10. Anticorpo humanizado anti-beta7 da reivindicação 9, em que o anticorpo anti-beta7 compreende pelo menos uma porção ou a totalidade de uma sequência de consenso do esqueleto do subgrupo I κ humano.
  11. 11. Anticorpo humanizado anti-beta7 da reivindicação 9, em que o dominio variável da cadeia pesada do anticorpo anti-beta7 compreende uma sequência de esqueleto de consenso do subgrupo III humano.
  12. 12. Anticorpo humanizado anti-beta7 de qualquer uma das reivindicações 9 a 11, em que o aminoácido na posição 71 do esqueleto da cadeia pesada é seleccionado entre o grupo de R, A e T, e/ou o aminoácido na posição 73 do esqueleto da cadeia pesada é seleccionado do grupo que consiste em N e T, e/ou o aminoácido na posição 78 da cadeia pesada é seleccionado do grupo que consiste em F, A e L.
  13. 13. Anticorpo humanizado anti-beta7 da reivindicação 9, em que o anticorpo anti-beta7 compreende uma sequência de consenso do esqueleto da cadeia pesada do subgrupo III variante compreendendo uma substituição em uma ou mais das posições 71, 73, 78 e/ou 94.
  14. 14. Anticorpo humanizado anti-beta7 da reivindicação 13, em que a substituição é R71A, N73T, L78A e/ou R94M. ΕΡ 1 784 426 PT 3/7
  15. 15. Anticorpo humanizado anti-beta7 ou seu fragmento de ligação a beta7, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 em que a afinidade monovalente do anticorpo ou do fragmento de ligação para com beta7 humana é substancialmente idêntica ou superior à afinidade monovalente de um anticorpo compreendendo as sequências variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada como representado na SEQ ID NO: 10 da Fig. IA e/ou SEQ ID NO:11 da Fig. 1B ou SEQ ID NO:12 da Fig. 9A e/ou SEQ ID NO:13 da Fig. 9B.
  16. 16. Anticorpo humanizado ou seu fragmento de ligação da reivindicação 15, em que a afinidade é pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 1000 vezes, pelo menos 5000 vezes ou pelo menos 10 000 vezes superior à de um anticorpo compreendendo as sequências de cadeia leve e de cadeia pesada representadas na SEQ ID NO: 10 da Fig. IA e SEQ ID NO: 11 da Fig. 1B ou SEQ ID NO: 12 da Fig. 9A e SEQ ID NO:13 da Fig. 9B.
  17. 17. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação da reivindicação 16, em que a afinidade monovalente do anticorpo para com beta7 humana é pelo menos 3 vezes superior à afinidade monovalente de um anticorpo compreendendo as sequências de cadeia leve e de cadeia pesada representadas na SEQ ID NO: 10 da Fig. IA e SEQ ID NO: 11 da Fig. 1B ou SEQ ID NO:12 da Fig. 9A e SEQ ID NO:13 da Fig. 9B.
  18. 18. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação da reivindicação 15 ou 16 em que o anticorpo compreendendo as sequências de cadeia leve e de cadeia pesada representadas na SEQ ID NO: 10 da Fig. IA e SEQ ID NO: 11 da Fig. 1B ou SEQ ID NO: 12 da Fig. 9A e SEQ ID NO: 13 da Fig. 9B, é produzido pela linha celular de hibridoma depositada na American Type Culture Collection com o Número de Acesso ATCC com a designação HB-293.
  19. 19. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação da reivindicação 15, em que a afinidade de ligação é expressa na forma de um valor de Kd. ΕΡ 1 784 426 PT 4/7
  20. 20. Anticorpo humanizado ou fragmento de ligação da reivindicação 15, em que a afinidade de ligação é medida por Biacore™ ou radioimunoensaio.
  21. 21. Anticorpo humanizado anti-beta7 de qualquer uma das reivindicações 9 a 14, em que a afinidade monovalente do anticorpo para com beta7 humana é substancialmente idêntica ou superior à afinidade monovalente para com beta7 humana de um anticorpo compreendendo as sequências variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada como representado na SEQ ID NO: 10 da Fig. IA e/ou SEQ ID NO: 11 da Fig. 1B ou SEQ ID NO: 12 da Fig. 9A e/ou SEQ ID NO:13 da Fig. 9B.
  22. 22. Método de inibição da interacção de uma subunidade beta7 de integrina humana com uma segunda subunidade de integrina e/ou um ligando in vitro, por contacto do anticorpo anti-beta7 de qualquer uma das reivindicações 1 a 21 com a integrina beta7.
  23. 23. Método da reivindicação 22, em que a segunda subunidade de integrina é a subunidade alfa4 da integrina e em que o ligando é MAdCAM, VCAM ou fibronectina.
  24. 24. Método da reivindicação 23, em que a subunidade alfa4 de integrina é de um ser humano.
  25. 25. Método da reivindicação 24, em que o ligando é de um ser humano.
  26. 26. Método da reivindicação 25, em que a segunda subunidade de integrina é a subunidade alfaE da integrina e em que o ligando é E-caderina.
  27. 27. Método da reivindicação 26, em que a subunidade alfaE da integrina é de um ser humano.
  28. 28. Método da reivindicação 27, em que o ligando é de um ser humano.
  29. 29. Anticorpo anti-beta7 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 para utilização no tratamento terapêutico e/ou profiláctico de uma doença. ΕΡ 1 784 426 PT 5/7
  30. 30. Anticorpo anti-beta7 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 para utilização no tratamento terapêutico e/ou profiláctico de doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória do fígado, inflamação do SNC, pancreatite crónica, lúpus eritematoso sistémico, síndrome de Sjorgen, psoríase e inflamação cutânea, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, doença pulmonar intersticial, alergia, doença auto-imune, rejeição de transplantações, rejeição de enxerto renal, doença de enxerto versus hospedeiro, diabetes ou cancro.
  31. 31. Utilização de um anticorpo anti-beta7 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 para a preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profiláctico de doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória do fígado, inflamação do SNC, pancreatite crónica, lúpus eritematoso sistémico, síndrome de Sjorgen, psoríase e inflamação cutânea, asma, doença pulmonar obstrutiva crónica, doença pulmonar intersticial, alergia, doença auto-imune, rejeição de transplantações, rejeição de enxerto renal, doença de enxerto versus hospedeiro, diabetes ou cancro.
  32. 32. Anticorpo anti-beta7 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 para utilização num método de inibição da interacção de uma subunidade beta7 de integrina humana com uma segunda subunidade de integrina e/ou um ligando por contacto com a integrina beta7, em que a inibição reduz ou alivia os sintomas de uma desordem seleccionada do grupo que consiste em inflamação, asma, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, diabetes, inflamação resultante de transplantação de órgãos, desordem de enxerto versus hospedeiro e inflamação associada com desordens relacionadas com aloenxertos.
  33. 33. Utilização de um anticorpo anti-beta7 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 para a preparação de um medicamento para utilização num método de inibição da interacção de uma subunidade beta7 de integrina humana com uma segunda subunidade de integrina e/ou um ligando por contacto com a integrina beta7, em que a inibição reduz ou alivia os ΕΡ 1 784 426 PT 6/7 sintomas de uma desordem seleccionada do grupo que consiste em inflamação, asma, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, diabetes, inflamação resultante de transplantação de órgãos, desordem de enxerto versus hospedeiro e inflamação associada com desordens relacionadas com aloenxertos.
  34. 34. Utilização de uma composição compreendendo um anticorpo anti-beta7 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 e um transportador farmacêutico para a preparação de um medicamento para utilização num método de modulação da adesão e/ou do recrutamento celulares mediados por integrina beta7 num mamífero que sofre de uma desordem; em que a desordem é seleccionada do grupo que consiste em inflamação, asma, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, diabetes, inflamação resultante de transplantação de órgãos, desordem de enxerto versus hospedeiro e inflamação associada com desordens relacionadas com aloenxertos.
  35. 35. Utilização da reivindicação 34, em que o mamífero é um ser humano.
  36. 36. Utilização de qualquer uma das reivindicações 34 ou 35, em que a composição compreende ainda um segundo agente biofarmacêutico ou agente quimioterapêutico.
  37. 37. Utilização de qualquer uma das reivindicações 34 a 36, em que a modulação inibe a interacção de integrina beta7 com integrina alfa4, integrina alfaE, MAdCam, VCAM, E-caderina e/ou fibronectina.
  38. 38. Composição compreendendo um anticorpo humanizado anti-beta7 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
  39. 39. Composição compreendendo um anticorpo anti-beta7 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 e um transportador farmacêutico para utilização num método de modulação da adesão e/ou do recrutamento celulares mediados por integrina beta7 num mamífero que sofre de uma desordem; em que a desordem é seleccionada do grupo que consiste em ΕΡ 1 784 426 PT 7/7 inflamação, asma, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, colite ulcerativa, diabetes, inflamação resultante de transplantação de órgãos, desordem de enxerto versus hospedeiro e inflamação associada com desordens relacionadas com aloenxertos.
  40. 40. Composição da reivindicação 39, em que o mamífero é um ser humano.
  41. 41. Composição da reivindicação 39, em que a composição compreende ainda um segundo agente biofarmacêutico ou agente quimioterapêutico.
  42. 42. Composição de qualquer uma das reivindicações 39-41, em que a modulação inibe a interacção de integrina beta7 com integrina alfa4, integrina alfaE, MAdCam, VCAM, E-caderina e/ou fibronectina. Lisboa, 2012-02-23
PT05810856T 2004-09-03 2005-09-02 Antagonistas humanizados anti-beta7 e suas utilizações PT1784426E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US60737704P 2004-09-03 2004-09-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1784426E true PT1784426E (pt) 2012-03-06

Family

ID=36000753

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT101774073T PT2322556E (pt) 2004-09-03 2005-09-02 Antagonistas humanizados anti-beta7 e suas utilizações
PT05810856T PT1784426E (pt) 2004-09-03 2005-09-02 Antagonistas humanizados anti-beta7 e suas utilizações
PT15185749T PT2990422T (pt) 2004-09-03 2005-09-02 Antagonistas humanizados anti-beta7 e suas utilizações

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT101774073T PT2322556E (pt) 2004-09-03 2005-09-02 Antagonistas humanizados anti-beta7 e suas utilizações

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT15185749T PT2990422T (pt) 2004-09-03 2005-09-02 Antagonistas humanizados anti-beta7 e suas utilizações

Country Status (27)

Country Link
US (10) US7528236B2 (pt)
EP (4) EP3530673B1 (pt)
JP (2) JP5062887B2 (pt)
KR (2) KR101364276B1 (pt)
CN (3) CN103304667B (pt)
AT (1) ATE534668T1 (pt)
AU (1) AU2005279720B2 (pt)
BR (1) BRPI0515602B1 (pt)
CA (1) CA2577678C (pt)
CY (2) CY1112277T1 (pt)
DK (4) DK3530673T3 (pt)
ES (4) ES2911482T3 (pt)
HK (5) HK1112002A1 (pt)
HR (3) HRP20120171T1 (pt)
HU (3) HUE058817T2 (pt)
IL (3) IL181473A (pt)
LT (2) LT3530673T (pt)
MX (3) MX341370B (pt)
NO (3) NO341308B1 (pt)
NZ (2) NZ553328A (pt)
PL (4) PL2990422T3 (pt)
PT (3) PT2322556E (pt)
RS (3) RS54409B1 (pt)
RU (1) RU2453558C2 (pt)
SI (4) SI2322556T1 (pt)
WO (1) WO2006026759A2 (pt)
ZA (1) ZA200701575B (pt)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004043345A2 (en) * 2002-11-08 2004-05-27 Kin-Ping Wong Extract of trapa natans and methods of using the same
CA2478458A1 (en) * 2004-08-20 2006-02-20 Michael Panzara Treatment of pediatric multiple sclerosis
SI2322556T1 (sl) * 2004-09-03 2016-02-29 Genentech, Inc. Humanizirani antagonisti proti beta7 in njihove uporabe
EP1827491A4 (en) * 2004-11-19 2010-07-14 Biogen Idec Inc TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS
US10982250B2 (en) * 2006-09-18 2021-04-20 Genentech, Inc. Methods of protein production
EP2109480B1 (en) 2006-12-07 2017-06-28 The Government of the United States of America as Represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Use of antagonists of the interaction between hiv gp120 and alpha4beta7 integrin
AU2008218199B2 (en) 2007-02-22 2013-10-31 Genentech, Inc. Methods for detecting inflammatory bowel disease
EP2144628B1 (en) * 2007-05-08 2012-10-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
JPWO2009088065A1 (ja) 2008-01-11 2011-05-26 一般財団法人化学及血清療法研究所 ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
KR20110014607A (ko) * 2008-04-29 2011-02-11 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CA2723614C (en) * 2008-05-16 2015-07-14 Genentech, Inc. Use of biomarkers for assessing treatment of gastrointestinal inflammatory disorders with beta7 integrin antagonists
WO2009149189A2 (en) * 2008-06-03 2009-12-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN102112494A (zh) * 2008-06-03 2011-06-29 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
BRPI0915448A2 (pt) * 2008-07-08 2015-11-10 Abbott Lab imunoglobulinas de domínio variável duplo para prostaglandina e2 e usos das mesmas
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
CA2758548A1 (en) * 2009-04-17 2010-10-21 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods to treat acute myelogenous leukemia
US8399624B1 (en) * 2009-06-25 2013-03-19 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Acceptor framework for CDR grafting
TW201109438A (en) * 2009-07-29 2011-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP2013503607A (ja) * 2009-09-01 2013-02-04 アボット・ラボラトリーズ 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
RU2012119756A (ru) * 2009-10-15 2013-11-20 Эбботт Лэборетриз Иммуноглобулины с двумя вариабельными доменами и их применение
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2494354A1 (en) * 2009-10-30 2012-09-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Pcsk9 immunoassay
SG183414A1 (en) * 2010-02-23 2012-09-27 Genentech Inc Anti-angiogenesis therapy for the treatment of ovarian cancer
US20120207671A1 (en) * 2010-04-15 2012-08-16 Vegenics Pty Limited Combination treatment with vegf-c antagonists
LT2558499T (lt) 2010-04-16 2017-07-25 Biogen Ma Inc. Antikūnai prieš vla-4
EP3252072A3 (en) 2010-08-03 2018-03-14 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2012027570A2 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2013125479A (ru) * 2010-11-02 2014-12-10 Эбботт Лэборетриз Иммуноглобулины с двумя вариабельными доменами и их применение
CN114642731A (zh) * 2011-03-31 2022-06-21 豪夫迈·罗氏有限公司 施用β7整联蛋白拮抗剂的方法
EA032625B1 (ru) 2011-05-02 2019-06-28 Милленниум Фармасьютикалз, Инк. КОМПОЗИЦИЯ АНТИ-α4β7 АНТИТЕЛА
UA116189C2 (uk) * 2011-05-02 2018-02-26 Мілленніум Фармасьютікалз, Інк. КОМПОЗИЦІЯ АНТИ-α4β7 АНТИТІЛА
JP2015508994A (ja) 2011-12-30 2015-03-26 アッヴィ・インコーポレイテッド Ｉｌ−１３および／またはｉｌ−１７に対する二重可変ドメイン免疫グロブリン
US20150010563A1 (en) * 2012-02-21 2015-01-08 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Methods for Treating Corneal and Conjunctival Inflammation and Inflammatory Disorders
LT2825558T (lt) 2012-03-13 2019-08-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Derinių terapija, skirta kiaušidžių vėžiui gydyti
KR101796689B1 (ko) * 2012-08-22 2017-11-10 재단법인 목암생명과학연구소 안정화된 면역글로불린가변도메인 선별방법 및 선별된 도메인의 응용
CN104870056A (zh) 2012-10-05 2015-08-26 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于诊断和治疗炎性肠病的方法
EP2914625A2 (en) 2012-11-01 2015-09-09 AbbVie Inc. Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9062108B2 (en) 2013-03-15 2015-06-23 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-1 and/or IL-17
EP3933401A3 (en) 2013-03-27 2022-04-13 F. Hoffmann-La Roche AG Use of biomarkers for assessing treatment of gastrointestinal inflammatory disorders with beta7 integrin antagonists
RU2016136716A (ru) 2014-03-27 2018-04-28 Дженентек, Инк. Способы диагностики и лечения воспалительного заболевания кишечника
EP3581585A1 (en) 2014-11-26 2019-12-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Vedolizumab for the treatment of fistulizing crohn's disease
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
EP3978530A1 (en) * 2015-02-26 2022-04-06 F. Hoffmann-La Roche AG Integrin beta7 antagonists and methods of treating crohn's disease
MA41636A (fr) 2015-03-06 2018-01-09 Millennium Pharm Inc Méthode de traitement de la cholangite sclérosante primitive
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
CN108139385A (zh) * 2015-07-27 2018-06-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于诊断和治疗炎症性肠病的方法
MA44408A (fr) 2016-03-14 2019-01-23 Millennium Pharm Inc Méthode de traitement de la réaction du greffon contre l'hôte (gvd)
CA3017758A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating or preventing graft versus host disease
WO2017165742A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in anti-ctla4 anti-pd-1 combination treatments
US11760803B2 (en) 2016-03-24 2023-09-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in immune oncology treatments
RU2745748C2 (ru) 2016-06-02 2021-03-31 Эббви Инк. Агонист глюкокортикоидного рецептора и его иммуноконъюгаты
CN109414502A (zh) 2016-06-12 2019-03-01 千禧制药公司 治疗炎症性肠病的方法
KR20190141148A (ko) 2017-04-28 2019-12-23 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 소아 장애를 치료하는 방법
JP6813712B2 (ja) 2017-12-01 2021-01-13 アッヴィ・インコーポレイテッド グルココルチコイド受容体作動薬及びそのイムノコンジュゲート
MA52249A (fr) 2018-04-12 2021-05-05 Morphic Therapeutic Inc Antagonistes de l'intégrine humaine (alpha4) (beta7)
US20220372132A1 (en) * 2019-01-10 2022-11-24 Sg Medical Inc. Anti-beta 1 integrin humanized antibody, and pharmaceutical composition for treating cancer, comprising same
PL439807A1 (pl) * 2019-06-10 2022-12-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Sposoby oczyszczania przeciwciał i ich kompozycje
KR20220102669A (ko) 2019-10-16 2022-07-20 모픽 테라퓨틱, 인코포레이티드 인간 인테그린 α4β7의 억제
JP2023536158A (ja) 2020-07-31 2023-08-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗インテグリンβ７抗体製剤及び装置
TW202330613A (zh) 2021-11-12 2023-08-01 美商建南德克公司 使用整聯蛋白β７拮抗劑治療克隆氏病之方法

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
US4308428A (en) * 1979-12-26 1981-12-29 Cbs Inc. System for electronically simulating radiation effects produced by a rotary loudspeaker
US4331348A (en) * 1980-01-09 1982-05-25 Raidel John E Vehicle suspension
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
AU662148B2 (en) 1991-04-10 1995-08-24 Scripps Research Institute, The Heterodimeric receptor libraries using phagemids
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
JP3951062B2 (ja) 1991-09-19 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、２官能性Ｆ（ａｂ’）２抗体の産生のための使用
DE69229477T2 (de) 1991-09-23 1999-12-09 Cambridge Antibody Tech Methoden zur Herstellung humanisierter Antikörper
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
DK0669836T3 (da) 1992-11-13 1996-10-14 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimære og radioaktivt mærkede antistoffer og humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantigen til behandling af B-cellelymfom
EP0672142B1 (en) 1992-12-04 2001-02-28 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5610281A (en) 1994-05-03 1997-03-11 Brigham & Women's Hospital, Inc. Antibodies for modulating heterotypic E-cadherin interactions with human T lymphocytes
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US6551593B1 (en) * 1995-02-10 2003-04-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Inflammatory bowel disease by inhibiting binding and/or signalling through α 4 β 7 and its ligands and madcam
NZ303523A (en) * 1995-02-10 2002-02-01 Millennium Pharm Inc Recombinant nucleic acids that encode primate MAdCAMs, proteins and polypeptides thereof and use in treating bowel disease
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
AU2660397A (en) 1996-04-05 1997-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US7147851B1 (en) * 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
US6037454A (en) * 1996-11-27 2000-03-14 Genentech, Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
EP1133315B1 (en) 1998-11-25 2006-02-01 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Antagonists of the alpha e beta 7 integrin as therapeutic agents for inflammatory diseases
WO2000040604A2 (en) * 1999-01-08 2000-07-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING CYTOKINE RELEASE BY αEβ7-EXPRESSING CELLS
US20010046496A1 (en) * 2000-04-14 2001-11-29 Brettman Lee R. Method of administering an antibody
AU2003201135A1 (en) * 2002-02-06 2003-09-02 Koninklijke Philips Electronics N.V. Personal care system with a personal care device and a cooling device
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
CN1956738B (zh) 2004-01-09 2013-05-29 辉瑞大药厂 MAdCAM抗体
EP2168986A3 (en) 2004-02-19 2010-07-28 Genentech, Inc. CDR-repaired antibodies
SI2322556T1 (sl) * 2004-09-03 2016-02-29 Genentech, Inc. Humanizirani antagonisti proti beta7 in njihove uporabe
US10982250B2 (en) 2006-09-18 2021-04-20 Genentech, Inc. Methods of protein production
JP2007302676A (ja) 2007-05-29 2007-11-22 Genentech Inc ヒト化抗β７アンタゴニストおよびその使用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012107050A (ja) 2012-06-07
CN101094868B (zh) 2013-07-10
ES2555355T3 (es) 2015-12-30
KR20120115587A (ko) 2012-10-18
SI3530673T1 (sl) 2022-08-31
IL226717A0 (en) 2013-07-31
EP1784426A2 (en) 2007-05-16
CN104710532A (zh) 2015-06-17
AU2005279720A1 (en) 2006-03-09
EP2990422B1 (en) 2018-07-11
HUE028441T2 (hu) 2016-12-28
MX2007002675A (es) 2007-06-11
NO20071740L (no) 2007-06-01
SI2990422T1 (sl) 2018-10-30
LT3530673T (lt) 2022-06-10
DK3530673T3 (da) 2022-04-19
CA2577678A1 (en) 2006-03-09
DK2990422T3 (en) 2018-09-17
EP2322556A1 (en) 2011-05-18
PT2990422T (pt) 2018-10-18
HUE058817T2 (hu) 2022-09-28
MX337423B (es) 2016-03-04
CN101094868A (zh) 2007-12-26
KR101364276B1 (ko) 2014-02-20
SI1784426T1 (sl) 2012-03-30
HRP20181459T1 (hr) 2018-10-19
KR20070050986A (ko) 2007-05-16
US20170210807A1 (en) 2017-07-27
ZA200701575B (en) 2008-09-25
RS57636B1 (sr) 2018-11-30
AU2005279720B2 (en) 2011-07-28
MX341370B (es) 2016-08-17
US20200048354A1 (en) 2020-02-13
RU2007112102A (ru) 2008-10-10
NO341308B1 (no) 2017-10-02
BRPI0515602B1 (pt) 2021-08-17
HK1210977A1 (en) 2016-05-13
DK2322556T3 (en) 2016-01-25
US8779100B2 (en) 2014-07-15
CN103304667B (zh) 2015-04-08
EP3530673B1 (en) 2022-03-30
US20060093601A1 (en) 2006-05-04
IL244803B (en) 2018-02-28
DK1784426T3 (da) 2012-03-12
HRP20160034T1 (hr) 2016-02-12
PL2322556T3 (pl) 2016-04-29
NO342491B1 (no) 2018-06-04
RU2453558C2 (ru) 2012-06-20
KR101433494B1 (ko) 2014-08-22
CY1117124T1 (el) 2017-04-05
HK1112002A1 (en) 2008-08-22
JP5255135B2 (ja) 2013-08-07
IL181473A (en) 2013-07-31
NO20171287A1 (no) 2007-06-01
HK1156955A1 (zh) 2012-06-22
US20120208984A1 (en) 2012-08-16
PT2322556E (pt) 2016-02-15
HK1188798A1 (en) 2014-05-16
ATE534668T1 (de) 2011-12-15
IL226717A (en) 2016-04-21
LT2990422T (lt) 2018-10-10
US20150197560A1 (en) 2015-07-16
RS52213B (en) 2012-10-31
US20080025971A1 (en) 2008-01-31
EP2322556B1 (en) 2015-10-21
CY1112277T1 (el) 2015-12-09
WO2006026759A3 (en) 2006-10-05
US20130288302A1 (en) 2013-10-31
BRPI0515602A (pt) 2008-07-29
CN104710532B (zh) 2019-01-18
ES2377979T3 (es) 2012-04-03
PL1784426T3 (pl) 2012-04-30
US8835133B2 (en) 2014-09-16
EP1784426B1 (en) 2011-11-23
ES2911482T3 (es) 2022-05-19
SI2322556T1 (sl) 2016-02-29
ES2690079T3 (es) 2018-11-19
NO20171288A1 (no) 2007-06-01
US20170044261A1 (en) 2017-02-16
US7687605B2 (en) 2010-03-30
EP2990422A1 (en) 2016-03-02
NZ553328A (en) 2010-06-25
WO2006026759A2 (en) 2006-03-09
PL2990422T3 (pl) 2018-11-30
IL181473A0 (en) 2007-07-04
EP3530673A1 (en) 2019-08-28
CA2577678C (en) 2014-12-02
US20180291104A1 (en) 2018-10-11
US7528236B2 (en) 2009-05-05
US20090226437A1 (en) 2009-09-10
PL3530673T3 (pl) 2022-08-01
HRP20120171T1 (hr) 2012-03-31
HUE039591T2 (hu) 2019-01-28
US8124082B2 (en) 2012-02-28
IL244803A0 (en) 2016-04-21
RS54409B1 (en) 2016-04-28
JP5062887B2 (ja) 2012-10-31
HK1221473A1 (zh) 2017-06-02
CN103304667A (zh) 2013-09-18
WO2006026759A9 (en) 2006-05-18
JP2008512382A (ja) 2008-04-24
NZ585628A (en) 2012-01-12
NO342319B1 (no) 2018-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2911482T3 (es) Antagonistas anti-beta7 humanizados y usos para los mismos
AU2005267720B2 (en) Humanized anti-cmet antagonists
WO2007127506A2 (en) Anti-ephrinb2 antibodies and methods using same
AU2011244856A1 (en) Humanized anti-beta7 antagonists and uses therefor
AU2012202209A1 (en) Humanized anti-cmet antagonists