NO342319B1 - Anti-beta7-antistoffer, nukleinsyrer som koder for antistoffene, vektorer, vertsceller og fremgangsmåte for fremstilling av antistoffene. - Google Patents

Anti-beta7-antistoffer, nukleinsyrer som koder for antistoffene, vektorer, vertsceller og fremgangsmåte for fremstilling av antistoffene. Download PDF

Info

Publication number
NO342319B1
NO342319B1 NO20171288A NO20171288A NO342319B1 NO 342319 B1 NO342319 B1 NO 342319B1 NO 20171288 A NO20171288 A NO 20171288A NO 20171288 A NO20171288 A NO 20171288A NO 342319 B1 NO342319 B1 NO 342319B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
thr
gly
ser
val
gin
Prior art date
Application number
NO20171288A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20171288A1 (no
Inventor
Mark S Dennis
Sherman Fong
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Publication of NO20171288A1 publication Critical patent/NO20171288A1/no
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of NO342319B1 publication Critical patent/NO342319B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Oppfinnelsen tilveiebringer terapeutiske anti-beta7-antistoffer, preparater som omfatter, og fremgangsmåter som benytter disse antistoffene.

Description

Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse relaterer seg generelt til området for molekylærbiologi og vekstfaktorregulering. Mer spesifikt vedrører oppfinnelsen modulatorer av den biologiske aktiviteten til integriner som inneholder beta7-subenheten og anvendelser av nevntemodulatorer.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Integrinene er a/p-heterodimere celleoverflatereseptorer som er involvert i utallige,cellulære prosesser fra celleadhesjon til genregulering (Hynes, R. 0., Cell, 1992, 69:11-25;og Hemler, M.E., Annu. Rev. Immunol., 1990, 8:365-368). Flere integriner er funnet å væredelaktige i sykdomsprosesser og har en generert utbredt interesse som potensielle mål for legemiddeloppdagelse (Sharar, S.R. et al.. Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16:359378). I immunsystemet er integriner involvert i leukocyttrafikkering, adhesjon og infiltrering i løpet av inflammatoriske prosesser (Nakajima, H. et al., J. Exp. Med., 1994, 179:11451154). Differensiell uttrykking av integriner regulerer de adderende egenskapene til celler og forskjellige integriner er involvert i ulike inflammatoriske responser. (Butcher, E.C. et al.. Science, 1996, 272:60-66). Beta7-integrinene (dvs. alfa4beta7 (a4p7) og alfaEbeta7 (aEp7))blir primært uttrykt på monocytter, lymfocytter, eosinofiler, basofiler og makrofager, men ikke på nøytrofiler. Elices, M.J. et al., Cell, 1990, 60:577-574). De primære ligandene fora4p7-integrin er endotel-overflateproteinenes slimhinneaddressin celleadhesjonsmolekyl(MAdCAM) og vaskulært celleadhesjonsmolekyl (VCAM-1) (Makarem, R. et al., J. Biol.Chem., 1994, 269:4005-4011). Bindingen av a4p7 til MAdCAM og/eller VCAM som er uttryktpå postkapillære venyler (HEV'er) på steder med inflammasjon fører til kraftig adhesjon av leukocyttene til endotelet etterfulgt av inntrengning inn i det betente vevet (Chuluyan, H.E. et al.. Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16:391-404). En primær ligand for a4p7integrin er intraepitellymfocytt (lEL)-overflateproteinet E-kadherein, som fremmer adderingav den a4p7-bærende cellen til epitellymfocytter. Monoklonale antistoffer som er rettet mota4p7, MAdCAM eller VCAM har blitt vist å være effektive modulatorer i dyremodeller med kronisk inflammatoriske sykdommer slik som astma (Laberge, S. et al.. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1995, 151:822-829), revmatoid artritt (RA; Barbadillo, C. et al.. Springer Semin.Immunopathol., 1995, 16:375-379), kolitt (Viney et al., J. Immunol., 1996, 157:2488-2497)og inflammatoriske tarmsykdommer (IBD; Podalski, D.K., N. Eng. J. Med., 1991, 325:928937; Powrie, F. et al., Ther. Immunol., 1995, 2:115-123). Monoklonale antistoffer som errettet mot beta7-subenhet har blitt vist å binde integrinsubenheten (Tidswell, M. et al.(1997) J. Immunol. 159:1497-1505), men som ikke-humane eller ikke-humaniserteantistoffer mangler de klinisk anvendbarhet.
Humaniserte monoklonale antistoffer eller antigen bindende fragmenter som inhiberer adhesjon av leukocytter som utrykker et integrin som inneholder B7-kjeden harblitt foreslått i WO96/24673.
Det eksisterer et behov for svært spesifikke forbindelser, slik som humaniserte antistoffer eller bindingsfragmenter derav som inhiberer interaksjonen mellom alfa4beta7integrinet og dens ligander MAdCAM og/eller VCAM i tillegg til interaksjonen mellom alfaEbeta7-integrinet og dens ligand E-kadherin. Disse forbindelsene er nyttige til behandlingav kroniske inflammatoriske sykdommer slik som astma, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, diabetes, komplikasjoner ved organtransplantasjon og allograftrelaterte forbindelser.
Beskrivelse av oppfinnelsen
Oppfinnelsen er som definert i kravene, og er rettet mot antistoffer, nukleinsyrer som koder for antistoffene i følge oppfinnelsen, vektorer, vertsceller og fremgangsmåter for fremstilling av nevte antistoffer.
Anti-beta7-antistoffet er kjennetegnet ved at det omfatter en variabel regions tungekjede rammeverksekvens som omfatter aminosyre-sekvenser gitt som SEKV. ID Nr.: 38,SEKV. ID Nr.: 39, SEKV, ID NR.: 45 og SEKV. ID NR.: 41, og en variabel regions lette kjede rammeverksekvens som omfatter aminsyrerester 1-23, 24-37, 38-69 og 70 til siste rest avaminsyresekvensen gitt som SEKV. ID Nr.: 15 og en HVR-L1, HVR-L2, HVR.-L3, HVR-H1,HVR-H2 og HVR-H3 hvor hver i rekkefølge omfatter RASESVDDLLH (SEKV, ID NR.: 9),KYASOSIS (SEKV. ID NR,: 2), OOGNSLPNT (SEKV. ID NR.: 3), GFFITNNYWG (SEO ID NR: 4), GYI-SYSGSTSYNPSLKS : 5), og RTGSSGY-FDF (SEKV. ID NR.: 66).
Oppfinnelsen er delvis basert på identifiseringen av en mengde antagonister av biologiske reaksjonsveier som involverer beta7-inneholdende integriner, som vanligvis erbiologiske/cellulære prosesser som viser seg som et viktig og fordelaktig terapeutisk mål. Slike biologiske reaksjonsveier inkluderer inflammasjon, spesielt kroniske inflammatoriske lidelser slik som astma, allergi, IBD, diabetes, transplantasjon og transplantat-mot-vertforstyrrelser. Oppfinnelsen tilveiebringer sammensetninger og fremgangs-måter som erbasert på å forstyrre beta7-integrinmediert, cellulær adhesjon og/eller rekruttering,inkludert å forstyrre MAdCAM og VCAM-l-binding til den ekstracellulære delen avalfa4beta7-integrin og E-kadherininteraksjon med alfaEbeta7-integrininteraksjon.Antagonister ifølge oppfinnelsen, som beskrevet her, tilveiebringer viktige terapeutiske og diagnostiske midler til anvendelse i målsøking av patologiske tilstander som er assosiert med unormal eller uønsket signalisering via et beta7-integrin. Følgelig tilveiebringer oppfinnelsenfremgangsmåter, preparater, sett og fremstilte artikler som vedrører modulering av beta7integrinmedierte reaksjonsveier, inkludert modulering av MAdCAM-alfa4beta7-binding ogleukocyttrekruttering til gastrointestinalepitel, binding og allergi, astma, IBD (slik som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt), diabetes, inflammasjon assosiert med transplantasjon, transplantat-mot-vert-forstyrrelser og/eller allograftforstyrrelser og andrebiologiske/fysiologiske aktiviteter som er mediert av beta7-integrin.
I ett aspekt vedrører oppfinnelsen terapeutiske anti-beta7-midler som er egnede tilterapeutisk anvendelse og som er i stand til å utføre varierende grader av forstyrrelse av en
beta7-integrinmediert reaksjonsvei. Beskrivelsen omtaler for eksempel et humanisert antibeta7-antistoff hvor antistoffet som et Fab-fragment i det vesentlige har den sammebindingsaffiniteten til humant beta7 som et murint Fab-fragment som omfatter, består aveller hovedsakelig består av en lettkjede og tungkjede variabelt domene sekvens som avbildet i fig. IA og IB eller fig. 9A og 9B. også beskrevet er et humanisert anti-beta7antistoff der antistoffet som et Fab-fragment har en bindingsaffinitet til humant beta7 somer lavere, for eksempel minst 3, minst 5, minst 7 eller minst 10 ganger lavere enn dem for et murint Fab-fragment eller rotte-Fab-fragment som omfatter, består av eller hovedsakeligbestår av en lettkjede og tungkjede variabelt domene sekvens som er avbildet i fig. IA og IB eller variabelt domene sekvensene som er avbildet i fig. 9A og 9B. Alternativt oppviser et humanisert anti-beta7-antistoff, eller beta7-bindingsfragment derav, ifølge oppfinnelsenmonovalent affinitet mot humant beta7, der affiniteten er vesentlig den samme som eller større enn monovalent affinitet mot humant beta7 for et antistoff som omfatter lettkjede og tungkjede variable sekvenser som avbildet i fig. IA (SEKV. ID nr. 10) og/eller fig. IB (SEKV. ID nr. 11), eller fig. 9A (SEKV. ID nr. 12) og/eller fig. 9B (SEKV. ID nr. 13). Antistoffet eller bindings-fragmentet derav som har stor affinitet mot humant beta7 oppviser en affinitet somer minst 2 ganger, minst 5 ganger, minst 10 ganger, minst 50 ganger, minst 100 ganger, minst 500 ganger, minst 1000 tanger, minst 500 ganger eller minst 10000 ganger høyere enn et antistoff som omfatter lettkjede- og tungkjedesekvensene som er avbildet i fig. IA(SEKV. ID nr. 10) og/eller fig. IB (SEKV. ID nr. 11) eller fig. 9A (SEKV. ID nr. 12) og/eller fig. 9B (SEKV. ID nr. 13).
I en annen utførelsesform vedrører oppfinnelsen et humanisert anti-beta7-antistoffder antistoffet som et Fab-fragment har en bindingsaffinitet til human beta7 som er større,for eksempel minst 3, minst 5, minst 7, minst 9, minst 10, minst 15, minst 20 eller minst 100 ganger større enn den for et gnager-(slik som rotte eller murint)-Fab-fragment somomfatter, består av eller hovedsakelig består av en lettkjede og tungkjede variabel sekvens som avbildet i fig. IA og fig. IB. I én utførelsesform har nevnte gnager-Fab-fragmentbindingsaffiniteten til et Fab-fragment som omfatter variabelt domenesekvenser fra etrotteantistoff som er betegnet FIB504.64 produsert av hybridomcellelinjen som er deponert hos the American Type Culture Collection med aksesjonsnr. ATCC HB.293. I en ytterligere utførelsesform har et humanisert Fab-fragment ifølge oppfinnelsen bindings-affiniteten til etFab-fragment som omfatter variabel domenesekvenser for et antistoff som er produsert avet hvilket som helst av de humaniserte anti-beta7-antistoffene ifølge oppfinnelsen. Slik somdet er veletablert på fagområdet kan bindingsaffinitet for en ligand til sin reseptor bestemmes ved å anvende en hvilken som helst av en rekke av analyser, og bli uttrykt i form av en rekke kvantitative verdier. I én utførelsesform blir følgelig bindings-affinitetenuttrykt som Kd-verdier og reflekterer iboende bindingsaffinitet (f.eks. med minimerteaviditetseffekter). Vanligvis og foretrukket blir bindingsaffinitet målt in vitro, enten i en cellefri eller celleassosiert setting. Som beskrevet i større detalj her kan forskjeller i
4 bindingsaffinitet bli kvantifisert i form av forholdet av bindingsaffinitetsverdien for et humanisert antistoff i Fab-form og bindingsaffinitetsverdien for et referanse/sammenlignings-Fab-antistoff (f.eks. et murint antistoff som har donor hypervariabel regionsekvenser), der bindingsaffinitetsverdiene er bestemt under lignende analysebetingelser. I én utførelsesform blir slik forskjell i bindingsaffinitet bestemt som forholdet mellom Kdverdiene for det humaniserte antistoffet i Fab-form og nevnte referanse/sammenligningsFab-antistoff. En hvilket som helst av et antall analyser som er kjent på fagområdet,inkludert de som er beskrevet her, kan bli benyttet for å fremskaffe bindingsaffinitetsmålinger, inkludert for eksempel «Biacore» (Biacore International Ab, Uppsala, Sverige) og ELISA.
Beskrevet her er også et antistoff som omfatter et anti-beta7-antistoff eller beta7bindingsfragment derav som omfatter:
(a) minst én, to, tre, fire eller fem hypervariabel region (HVR)-sekvenser som ervalgt fra gruppen som består av:
(i) HVR-L1 som omfatter sekvens Al-All, der Al-All er RASESVDTYLH(SEKV. ID nr. 1)
(ii) HVR-L2 som omfatter sekvens B1-B8, der B1-B8 er KYASQSIS (SEKV. IDnr. 2)
(iii) HVR-L3 som omfatter sekvens C1-C9, der C1-C9 er QQGNSLPNT (SEKV.ID nr. 3)
(iv) HVR-H1 som omfatter sekvens D1-D10, der D1-D10 er GFFITNNYWG(SEKV. ID nr. 4)
(v) HVR-H2 som omfatter sekvens E1-E17, der E1-D17 erGYISYSGSTSYNPSLKS (SEKV. ID nr. 5) og
(vi) HVR-H3 som omfatter sekvens F2-F11, der F2-F11 er MTGSSGYFDF(SEKV. ID nr. 6).
Også beskrevet er et polypeptidet eller antistoffet som omfatter minst én variantHVR, der variant-HVR-sekvensen omfatter modifiseringer i minst én rest med minst én avsekvensene som er avbildet i SEKV. ID nr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 og 9.
Også beskrevet er et anti-beta7-antistoff eller beta7-bindingsfragment derav somomfatter én, to, tre, fire, fem eller seks hypervariable regioner (HVR'er) som er valgt fra gruppen som består av HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der:
(i) HVR-L1 omfatter aminosyresekvens RASESVDTYLH (SEKV. ID nr. 1),RASESVDSLHH (SEKV. ID nr. 7), RASESVDTLLH (SEKV. ID nr. 8) eller RASESVDDLLH (SEKV. ID nr. 9),
(ii) HVR-L2 som omfatter aminosyresekvens KYASQSIS (SEKV. ID nr. 2), RYASQSIS(SEKV. ID nr. 67 eller XYASQSIS (SEKV. ID nr. 68), der X representerer en hvilken som helst aminosyre),
(iii) HVR-L3 omfatter QQGNSLPNT (SEKV. ID nr. 3),
(iv) HVR-H1 omfatter aminosyresekvens GFFITNNYWG (SEKV. ID nr. 4),
(v) HVR-H2 omfatter aminosyresekvens GYISYSGSTSYNPSLKS (SEKV. ID nr. 5), og
(vi) HVR-H3 omfatter aminosyresekvens MTGSSGYFDF (SEKV. ID nr. 6) ellerRTGSSGYFDF (SEKV. ID nr. 66) for relative posisjoner F2-F11, eller omfatter aminosyresekvens Fl-Fll, der Fl-Fll e AMTGSSGYFDF (SEKV. ID nr. 63), ARTGSSGYFDF (SEKV. IDnr. 64) eller AQTGSSGYFDF (SEKV. ID nr. 65).
Også beskrevet er et anti-beta7-antistoff eller beta7-bindingsfragment derav, somomfatter én, to, tre, fire, fem eller seks hypervariable regioner (HVR'er) som er valgt fra gruppen som består av HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der:
I. HVR-L1 omfatter aminosyresekvens Al-All, der Al-All er RASESVDTYLH
(SEKV. ID nr. 1), RASESVDSLLH (SEKV. ID nr. 7), RASESVDTLLH (SEKV. ID nr. 8) eller RASESVDDLLH (SEKV. ID nr. 9) eller en variant av SEKV. ID nr. 1, 7, 8 eller 9 der aminosyre A2 er valgt fra gruppen som består av A, G, S, T og V og/eller aminosyre A3 er valgt fra gruppen som består av S, G, I, K, N, P, Q, R og T, og/eller A4 er valgt fra gruppen som består av E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N og R og/eller aminosyre A5 er valgt fra gruppen som består av V, R, I, A, G, K, L, M og Q) og/eller aminosyre A6 er valgt fra gruppen som består av V, R, I, A, G, K, L, M og Q) og/eller aminosyre A7 er valgt fra gruppen som består av D, V, S, A, E, G H, I, K, L, N, P, S og T og/eller aminosyre A8 er valgt fra gruppen som består av D, G, N, E, T, P og S og/eller aminosyre A9 er valgt fra gruppen som består av L, Y, I og M og/eller aminosyre A10 er valgt fra gruppen som består av L, A, I, M og V og/eller aminosyre All er valgt fra gruppen som består av H, Y, F og S,
II. HVR-L2 omfatter aminosyresekvens B1-B8, der B1-B8 er KYASQSIS (SEKV. ID
nr. 2), RYASQSIS (SEKV. ID nr. 67 eller XYASQSIS (SEKV. ID nr. 68) der X representerer en hvilken som helst aminosyre) eller en variant av SEKV. ID nr. 2, 67 eller 68 der aminosyre Bl er valgt fra gruppen som består av K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y og X (der X representerer en hvilken som helst aminosyre) og/eller aminosyre B4 er valgt fra gruppen som består av S og D og/eller aminosyre B5 er valgt fra gruppen som består av Q og S og/eller aminosyre B6 er valgt fra gruppen som består av S, D, L og R og/eller aminosyre B7 er valgt fra gruppen som består av I, V, E og K,
Ill. HVR-L3 omfatter aminosyresekvens C1-C9, der C1-C9 er QQGNSLPNT (SEKV.
ID nr. 3) eller en variant av SEKV. ID nr. 3 der aminosyre C8 er valgt fra gruppen som består av N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I, L, M og Y,
iv. HVR-H1 omfatter aminosyresekvens D1-D10 der D1-D10 er GFFITNNYWG
(SEKV. ID nr. 4),
v. HVR-H2 omfatter aminosyresekvens E1-E17 der E1-E17 er
GYISYSGSTSYNPSLKS (SEKV. ID nr. 5) eller en variant av SEKV. ID nr. 5 der
aminosyre E2 er valgt fra gruppen som består av Y, F, V og D og/eller aminosyre E6 er valgt fra gruppen som består av S og G og/eller aminosyre E10 er valgt fra gruppen som består av S og Y og/eller aminosyre E12 er valgt fra gruppen som består av N, T, A og D og/eller aminosyre 13 er valgt fra gruppen som består av P, H, D og A og/eller aminosyre E15 er valgt fra gruppen som består av L og V og/eller aminosyre E17 er valgt fra gruppen som består av S og G, og
vi. HVR-H3 omfatter aminosyresekvens F2-F11 der F2-F11 er MTGSSGYFDF(SEKV. ID nr. 6) eller RTGSSGYFDF (SEKV. ID nr. 66) eller omfatter aminosyresekvens Fl-Fll, der Fl-Fll er AMTGSSGYFDF (SEKV. ID nr. 63),ARTGSSGYFDF (SEKV. ID nr. 64) eller AQTGSSGYFDF (SEKV. ID nr. 65), eller en variant av SEKV. ID nr. 6, 63, 64, 65 eller 66 der aminosyre F2 er R, M, A, E, G, Q, S og/eller aminosyre Fil er valgt fra gruppen som består av F og Y.
I ethvert av antistoffene ifølge beskrivelsen kan aminosyren på tungkjedens rammeverksposisjon 71 (ifølge Kabat-nummererings-systemet) velges fra gruppen sombestår av R, A og T og/eller aminosyren på tungkjedens rammeverksposisjon 73 (Kabatnummereringssystem) kan velges fra gruppen som består av N og T og/eller aminosyren på tungkjedens rammeverksposisjon 78 (Kabat-nummererings system) kan velkes fra gruppensom består av F, A og L.
I visse antistoffene beskrevet her omfatter HVR-L1 til et antistoff ifølge oppfinnelsensekvensen ifølge SEKV. ID nr. 1. I én utførelsesform omfatter HVR-L2 til et antistoff ifølgeoppfinnelsen sekvensen ifølge SEKV. ID nr. 2. I et eksempel omfatter HVR-L3 til et antistoffsekvensen ifølge SEKV. ID nr. 3. I et eksempel omfatter HVR-H1 for et antistoff sekvensenifølge SEKV. ID nr. 4. I et eksempel omfatter HVR-H2 til et antistoff sekvensen ifølge SEKV.ID nr. 5. I et eksempel omfatter HVR-H3 til et antistoff sekvensen ifølge SEKV. ID nr. 6 eller66 for relative posisjoner F2-F11 eller SEKV. ID nr. 63, 64 eller 65, for relative posisjonerFl-Fll. I et eksempel omfatter HVR-L1 RASESVDSLLH (SEKV. ID nr. 7). I et eksempelomfatter HVR-L1 RASESVDTLLH (SEKV. ID nr. 8). I et eksempel omfatter HVR-L1RASESVDDLLH (SEKV. ID nr. 9). I et eksempel er et antistoff som omfatter disse sekvensene (i kombinasjoner som beskrevet her) humanisert eller humant.
I ett aspekt omtaler beskrivelsen et antistoff som omfatter én, to, tre, fire, fem eller seks HVR'er, der hver HVR omfatter, består av eller hovedsakelig består av en sekvens som er valgt fra gruppen som består av SEKV. ID nr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 og 9, og der SEKV. ID nr. 1, 7, 8 eller 9 tilsvarer en HVR-L1, SEKV. ID nr. 2 tilsvarer en HVR-L2, SEKV. ID nr. 3tilsvarer en HVR-L3, SEKV. ID nr. 4 tilsvarer en HVR-H1, SEKV. ID nr. 5 tilsvarer en HVR-H2og SEKV. ID nr. 6 tilsvarer en HVR-H3. I én utførelsesform omfatter et antistoff ifølgebeskrivelsen HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3 , der hver irekkefølge omfatter SEKV. ID nr. 1, 2, 3, 4, 5 og 6. I én utførelsesform omfatter et antistoff
ifølge beskrivelsen HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3), der hver irekkefølge omfatter SEKV. ID nr. 7, 2, 3, 4, 5 og 6. I én utførelsesform omfatter et antistoff ifølge beskrivelsen HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3), der hver irekkefølge omfatter SEKV. ID nr. 8, 2, 3, 4, 5 og 6. I én utførelsesform omfatter et antistoff ifølge beskrivelsen HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver irekkefølge omfatter SEKV. ID nr. 9, 2, 3, 4, 5 og 6. I én utførelsesform omfatter et antistoff ifølge beskrivelsen HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver irekkefølge omfatter SEKV. ID nr. 9, 2, 3, 4, 5 og 66, eller SEKV. ID nr. 9, 2, 3, 4, 5, 63 eller SEKV. ID nr. 9, 2, 3, 4, 5, 64 eller SEKV. ID nr. 9, 2, 3, 4, 5 og 65 eller SEKV. ID nr. 9, 67, 3, 4, 5, 64 eller SEKV. ID nr. 9, 68, 3, 4, 5, 64).
Beskrevet her er antistoffer hvor det er en HVR- og/eller rammeverksmodifiseringinkluderer hvor A8 i en variant-HVR-Ll er S, D eller T og A9 er L.
I visse antistoffer ifølge beskrivelsen er minst en del av rammeverksekvensen er en human konsensusrammeverksekvens.
Beskrevet her er et antistoffet hvor en HVR-Ll-variant omfatter 1-10 (1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 ellerlO) substitusjoner i en hvilken som helst kombinasjon i de følgende posisjonene: A2 (G, S, T eller V), A3 (G, I, K, N, P, Q, R eller T), A4 (A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R eller V), A5 (A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V eller Y), A6 (A, G, I, K, L, M, Q eller R), A7 (A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T eller V), A8 (S, D, E, G, P eller N) og A9 (L, I eller M), A10 (A, I, M eller V) og All (F, S eller Y); eller
en HVR-L2-variant omfatter 1-4 (1, 2, 3 eller 4) substitusjoner i en hvilken somhelst kombinasjon på de følgende posisjonene: Bl (N), B5 (S), B6 (R eller L) og B7 (T, E, K eller V); eller
en HVR-L3-variant omfatter minst én substitusjon på posisjon C8 (W, Y, R, S, A, F,H, I, L, M, N, Teller V); eller
en HVR-H2-variant omfatter 1-7 (1, 2, 3, 4, 5, 6 eller 7) substitusjonene i enhvilken som helst kombinasjon på de følgende posisjonene: E2 (V, D eller F), E6 (G), E10 (Y), E12 (A, D eller T), E13 (D, A eller H), E15 (V), E17 (G); eller
en HVR-H3-variant omfatter 1 eller 2 substitusjoner i en hvilken som helstkombinasjon på de følgende posisjonene: F2 (A, E, G, Q, R eller S) og Fil (Y).
Også beskrevet her er et antistoff som omfatter en HVR-L1 som har sekvensenifølge SEKV. ID nr. 7;
en HVR-L1 som har sekvensen ifølge SEKV. ID nr. 8; elleren HVR-L1 som har sekvensen ifølge SEKV. ID nr. 9.
Visse antistoffer ifølge beskrivelsen omfatter en human tungkjede undergruppe-IIItungkjede konsensus rammeverksekvens som omfatter en substitusjon på posisjon 71, 73 og/eller 78.
Substitusjonen kan være R71A, N73T og/eller N78A.
Visse antistoffer ifølge beskrivelsen omfatter en HVR-L3 som har sekvensen ifølgeSEKV. ID nr. 3.
I noen antistoffer ifølge beskrivelsen er A8 i HVR-L1 S.
I andre er A8 i HVR-L1 D.
I noen antistoffer ifølge beskrivelsen er A9 i HVR-L1 L.
Beskrevet her er antistoffer hvor en rammeverksekvens mellom sekvens E1-E17 ogFl-Fll er HFR3-1-HFR3-31 og der HFR3-6 er A eller R, HFR3-8 er N eller T, og HFR3-13 er Leller A eller F.
For visse antistoffer ifølge oppfinnelsen er monovalent affinitet for antistoffet mot humant beta? vesentlig den samme som monovalent affinitet for et rotteantistoff som omfatter en lettkjede- og tungkjedevariabelsekvens som avbildet i fig. 9.
For visse antistoffer ifølge oppfinnelsen er monovalent affinitet for antistoffet mot humant beta? minst tre ganger høyere enn monovalent affinitet for et rotteantistoff som omfatter en lettkjede- og tungkjede variabelsekvens som avbildet i fig. 9.
Rotteantistoffet kan være produsert av hybridomcellelinjen som er deponert hos the American Type Culture Collection under aksesjonsnummer ATCC med betegnelse HB-293.
Bindingsaffiniteten kan være uttrykt som en Kd-verdi.
Bindingsaffiniteten kan være målt ved hjelp av Biacore™ eller radioimmunanalyse.
Antistoffet ifølge beskrivelsen kan omfatte human K-undergruppe-I lettkjedekonsensus-rammeverksekvens.
Antistoffet ifølge beskrivelsen kan omfatte human tungkjede undergruppe-IIItungkjede konsensus-rammeverksekvens.
Antistoffet ifølge beskrivelsen kan omfatte rammeverksekvensen som omfatter en substitusjon på posisjon 71, 73 og/eller 78.
Substitusjon kan være R71A, N73T og/eller N78A eller den substituerte aminosyren i posisjon 71 er R eller A, og/eller aminosyre-substitusjonen på posisjon 78 er N eller Tog/eller aminosyresubstitusjonen på posisjon 78 er L eller A eller F.
Substitusjon kan være L78F eller A78F eller A78L eller L78A.
Beskrivelsen omtaler en fremgangsmåte for å inhibere interaksjonen av en human beta7-integrinsubenhet med en andre integrinsubenhet og/eller en ligand ved å kontakteantistoffet ifølge et av kravene 1-30 med den andre integrinsubenheten og/eller liganden.
Den andre integrinsubenheten kan være alfa4-integrinsubenhet og ligandenMAdCAM, VCAM eller fibronektin.
Alfa4-integrinsubenheten kan være human.
Liganden kan være human.
Den andre integrinsubenheten kan være alfaE-integrinsubenhet og liganden Ekadherin.
AlfaE-integrinsubenheten kan være human.
Liganden kan være human.
Visse antistoffer tilveiebragt her er for anvendelse ved inhibering som reduserer eller lindrer symptomer på en forstyrrelse som er valgt fra inflammasjon, astma, inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, diabetes, inflammasjon som skyldes organtransplantasjon, transplantat versus vertssykdom og inflammasjon som er assosiert med allograftforstyrrelser.
I beskrivelsen kan HVR-L1 være SEKV. ID nr. 1, 7, 8 eller 9. Også beskrevet her eren HVR-Ll-variant av SEKV. ID nr. 1, 7, 8 eller 9 som omfatter 1-10 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9eller 10) substitusjoner på relative posisjoner Al-All, i enhver kombinasjon av de følgendeposisjonene: A2 (A, G, S, T eller V), A3 (S, G, I, K, N, P, Q, R eller T), A4 (E, A, D, G, H, I,
K, L, N, Q, R eller V), A5 (S, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V eller Y), A6 (V, A, G, I, K, L, M, Q eller R), A7 (D, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T eller V), A8 (T, S, D, E, G, T eller N) og A9 (Y,
L, I eller M), A10 (L, A, I, M eller V) og All (H, F, S eller Y). HVR-L2 kan være SEKV. ID nr.2, 67 eller 68 eller en HVR-L2-variant av SEKV. ID nr. 2, 67 eller 68 der HVR-L2-variantenomfatter 1-4 (1, 2, 3, 4 eller 5) substitusjoner på relative posisjoner B1-B8, i enhverkombinasjon av de følgende posisjonene: Bl (K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y eller X (der X representerer en hvilken som helst aminosyre), B4 (S), B5 (Q eller S), B6 (S, R eller L), og B7 (I, T, E, K eller V). HVR-L3 er SEKV. ID nr. 3 eller en HVR-L3-variant av SEKV. ID nr. 3som kan omfatte minst én substitusjon på relative posisjoner C1-C8 slik som på posisjon C8(W, Y, R, S, A, F, H, I, L, M, N, T eller V). HVR-H1 kan være SEKV. ID nr. 4. HVR-H2 erSEKV. ID nr. 5. Også beskrevet her er en HVR-H2-variant av SEKV. ID nr. 5 der HVR-H2varianten omfatter 1-7 (1, 2, 3, 4, 5, 6 eller 7) substitusjoner på relative posisjoner E1-E17 ienhver kombinasjon av de følgende posisjonene: E2 (Y, V, D eller F), E6 (S eller G), E10 (S eller Y), E12 (N, A, D eller T), E13 (P, D, A eller H), E15 (L eller V), E17 (S eller G). En HVRH3 kan være SEKV. ID nr. 6, 63, 64, 65 eller 66. En HVR-H3-variant av SEKV. ID nr. 6, 63,64, 65 eller 66 kan omfatte på relative posisjoner Fl-Fll for SEKV. ID nr. 63, 64 og 65 ellerpå relative posisjoner F2-F11 for SEKV. ID nr. 6 og 66, 1 eller 2 substitusjoner i enhverkombinasjon på de følgende posisjonene: F2 (M, A, E, G, Q, R eller S), og Fil (F eller Y). Bokstav(er) i parenteser etter hver posisjon indikerer en illustrerende substitusjonsaminosyre (dvs. erstatning) for en konsensusaminosyre eller annen aminosyre slik det er åpenbart for fagfolk på området, og hensiktsmessighet for andre aminosyrer som substitusjonsaminosyrer i konteksten som er beskrevet her kan rutinemessig bli vurdert ved å benytte teknikker som er kjent på fagområdet og/eller som er beskrevet her.
Også beskrevet her er en HVR-L1 sekvensen som omfatter SEKV. ID nr. 1. A8 i envariant-HVR-Ll kan være D eller S. A9 i en variant-HVR-Ll kan være L. I noen tilfeller er A8
I en variant-HVR-Ll D og A9 er i en variant-HVR-Ll L. I noen tilfeller er A8 i en variant-HVR
Il S og A9 er i en variant-HVR-Ll L. Et antistoff kan omfatte disse variasjonene i HVR-L1 ogHVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3 omfatter eller består av eller bestårhovedsakelig av, i rekkefølge, SEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5 og 6. HVR-H3 kan omfatte eller bestå
eller bestå hovedsakelig av SEKV. ID nr. 6 eller 66 (for relativ posisjoner F2-F11) eller SEKV.ID nr. 63 eller 64 eller 65 (for relative posisjoner Fl-Fll).
I noen antistoffer beskrevet her er A8 i en variant-HVR-Ll I og A9 i en variant-HVRL1 er er L, hvor varianten ytterligere omfatter HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVRH3, der hver HVR omfatter, består av eller hovedsakelig består av, i rekkefølge, SEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5 og 6.
I andre er A8, A9 og A10 i en variant-HVR-Ll henholdsvis D, L og V, der variantenytterligere omfatter HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver HVR omfatter,består av eller består essensielt av, i rekkefølge, SEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5 og 6.
I andre er A8 og A9 i en variant-HVR-Ll henholdsvis N og L, der variantenytterligere omfatter HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver HVR omfatter,består av eller består essensielt av, i rekkefølge, SEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5 og 6.
I andre er A8 og A9 i en variant-HVR-Ll henholdsvis P og L, og B6 og B7 er i envariant-HVR-L2 henholdsvis R og T, der varianten ytterligere omfatter HVR-L2, HVR-L3,HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver HVR omfatter, består av eller hovedsakelig består av,i rekkefølge, SEKV. ID nr. 3, 4, 5 og 6.
I andre er A2, A4, A8, A9 og A10 i en variant-HVR-Ll henholdsvis S, D, S, L og V,der varianten ytterligere omfatter HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hverHVR omfatter, består av eller hovedsakelig består av, i rekkefølge, SEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5 og 6.
I andre er A5 og A9 i en variant-HVR-Ll henholdsvis D og T, der variantenytterligere omfatter HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver HVR omfatter,består av eller hovedsakelig består av, i rekkefølge, SEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5 og 6.
I andre er A5 og A9 i en variant-HVR-1 henholdsvis N og L, der varianten ytterligereomfatter HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver HVR omfatter, består aveller hovedsakelig består av, i rekkefølge, SEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5 og 6.
I andre er A9 i en variant-HVR-Ll L, der varianten ytterligere omfatter HVR-L2,HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver HVR omfatter, består av eller hovedsakeligbestår av, i rekkefølge, SEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5 og 6.
Visse antistoffer ifølge beskrivelsen omfatter en HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1,HVR-H2 og HVR-H3, der hver HVR omfatter, består av eller hovedsakelig består av, irekkefølge, SEKV. ID nr. 9, 2, 3, 4, 5 og 64. I en annen utførelsesform omfatter, består av eller essensielt består hver HVR av, i rekkefølge, SEKV. ID nr. 9, 67, 3, 4, 5 og 64. I en annen utførelsesform omfatter, består eller essensielt består hver HVR av, i rekkefølge, SEKV. ID nr. 9, 68, 3, 4, 5 og 64. I en annen utførelsesform består, omfatter eller essensielt består hver HVR av, i rekkefølge, SEKV. ID nr. 9, 2 eller 67 eller 68, 3, 4, 5 og 66.
Også beskrevet her er variant-HVR-Ll-antistoff varianter som ytterligere omfatterHVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver omfatter, i rekkefølge, sekvensensom er avbildet i SEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5 og 6. Der antistoffvarianten omfatter HVR-L1, A8(P)
og A9(L) og HVR-L2 B6(R) og B7(T), omfatter nevnte HVR-L1, HVR-L2-variant ytterligereHVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver i rekkefølge omfatter sekvensen som eravbildet i SEKV. ID nr. 3, 4, 5 og 6.
I noen utførelsesformer omfatter disse antistoffene ytterligere en human undergruppe-III-tungkjede rammeverk-konsensussekvens. I én utførelsesform av disseantistoffene omfatter rammeverk-konsensussekvensen substitusjon på posisjon 71, 73og/eller 78. I noen utførelsesformer av disse antistoffene er posisjon 71 A, 73 er T og/eller 78 er A. I én utførelsesform av disse antistoffene omfatter disse antistoffene ytterligere en human Kl-lettkjede rammeverk-konsensussekvens.
I én utførelsesform omfatter et antistoff ifølge beskrivelsen en HVR-L1 som omfatterSEKV. ID nr. 1. I én utførelsesform omfatter et va ria ntanti stoff ifølge beskrivelsen en variant-HVR-Ll der A10 er V. I én utførelsesform omfatter nevnte va riantantistoff ytterligereHVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver i rekkefølge omfatter sekvensensom er avbildet i SEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5 og 6. I noen utførelsesformer omfatter disse antistoffene ytterligere en human undergruppe-III-tungkjede rammeverkkonsensussekvens. I én utførelsesform av disse antistoffene omfatter rammeverkkonsensussekvensen substitusjon på posisjon 71, 73 og/eller 78. I noen utførelsesformer av disse antistoffene er posisjon 71 A, 73 er T og/eller 78 er A. I én utførelsesform av disse antistoffene omfatter disse antistoffene ytterligere en human Kl-lettkjede-rammeverkkonsensussekvens.
I én utførelsesform omfatter et antistoff ifølge beskrivelsen en HVR-L3 som omfatterSEKV. ID nr. 3. Også beskrevet her er en variant-HVR-L3 der C8 er L. Variantantistoffet kanytterligere omfatte HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver i rekkefølgeomfatter sekvensen som er avbildet i SEKV. ID nr. 1, 2, 4, 5 og 6. I én utførelsesform omfatter et antistoff ifølge beskrivelsen en variant-HVR-L3 der C8 er W. I én utførelsesformomfatter nevnte va ria nt-antistoff ytterligere HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3,der hver i rekkefølge omfatter sekvensen som er avbildet i SEKV. ID nr. 1, 2, 4, 5 og 6. I noen utførelsesformer omfatter HVR-L1 SEKV. ID nr. 7, 8 eller 9. I noen utførelsesformeromfatter disse antistoffene ytterligere en human undergruppe-III-tungkjede-rammeverkkonsensus-sekvens. I én utførelsesform av disse antistoffene omfatter konsensusrammeverk-sekvensen substitusjon på posisjon 71, 73 og/eller 78. I noen utførelsesformerav disse antistoffene er posisjon 71 A, 73 er T og/eller 78 er A. I én utførelsesform av disse antistoffene omfatter disse antistoffene ytterligere en human kI lettkjede-rammeverkkonsensussekvens.
I et eksempel omfatter et antistoff ifølge beskrivelsen en HVR-H3 som omfatterSEKV. ID nr. 6. I andre eksempler omfatter en variant av nevnte antistoff en variant-HVRH3 der Fl er Q. I andre eksempler omfatter nevnte va ria ntantistoff ytterligere HVR-L1, HVRL2, HVR-L3, HVR-H1 og HVR-H2), der hver i rekkefølge omfatter sekvensen som er avbildet iSEKV. ID nr. 1, 2, 3, 4 og 5. I andre eksempler omfatter et antistoff ifølge beskrivelsen en
12 variant-HVR-H3 der Fl er R. I andre eksempler omfatter nevnte va ria ntantistoff ytterligereHVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 og HVR-H2, der hver rekkefølge omfatter sekvensen somer avbildet i SEKV. ID nr. 1, 2, 3, 4 og 5. I andre eksempler omfatter HVR-L1 SEKV. ID nr.7, 8 eller 9. I noen eksempler omfatter disse antistoffene ytterligere en human undergruppe-III-tungkjede-rammeverk-konsensus-sekvens. I noen eksempler av disse antistoffene omfatter ramme-verks-konsensus-sekvensen substitusjon på posisjon 71, 73og/eller 78. I noen eksempler av disse antistoffene er posisjon 71 A, 73 er T og/eller 78 er A. I noen eksempler av disse antistoffene omfatter disse antistoffene ytterligere en human Kl-lettkjede-rammeverk-konsensussekvens.
Et antistoff kan omfatte en HVR-L1 som omfatter SEKV. ID nr. 1. I noen eksempleromfatter antistoffet en variant-HVR-Ll der A4 er Q. I noen eksempler omfatter nevnteva ria ntantistoff ytterligere HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hverrekkefølge omfatter sekvensen som er avbildet i SEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5 og 6. At antistoff ifølge beskrivelsen kan omfatte en variant-HVR-Ll der A6 er I. I noen eksempler omfatternevnte va ria ntantistoff ytterligere HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver irekkefølge omfatter sekvensen som er avbildet i SEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5 og 6. I noen eksempler omfatter et antistoff ifølge beskrivelsen en variant-HVR-Ll der A7 er S. I noeneksempler omfatter nevnte variantantistoff ytterligere HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 ogHVR-H3, der hver i rekkefølge omfatter sekvensen som er avbildet i SEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5og 6. I andre eksempler omfatter et antistoff ifølge beskrivelsen en variant-HVR-Ll der A8 erD eller N. I noen eksempler omfatter nevnte variantantistoff ytterligere HVR-L2, HVR-L3,HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver i rekkefølge omfatter sekvensen som er avbildet iSEKV. ID nr. 2, 3, 4, 5 og 6. I noen eksempler omfatter disse antistoffene ytterligere en human undergruppe-III-tungkjede-rammeverk-konsensussekvens. I noen eksempler avdisse antistoffene omfatter rammeverk-konsensussekvensen substitusjon på posisjon 71, 73og/eller 78. I noen eksempler av disse antistoffene er posisjon 71 A, 73 er T og/eller 78 er A. I noen eksempler av disse antistoffene omfatter disse antistoffene ytterligere en human Kl-lettkjede-rammeverk-konsensussekvens.
Et antistoff ifølge beskrivelsen kan omfatte en HVR-L2 som omfatter SEKV. ID nr. 2.Et antistoff ifølge beskrivelsen kan omfatte en variant-HVR-L2 der Bl er N, eller der B5 er S,eller der B6 er L, eller der B7 er V, eller der B7 er E eller K. Noen variantantistoffer omfatter ytterligere HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3, der hver i rekkefølge omfattersekvensen som er avbildet i SEKV. ID nr. 1, 3, 4, 5 og 6. HVR-L1 kan omfatte SEKV. ID nr.7, 8 eller 9. Noen antistoffer kan ytterligere omfatte en human undergruppe-III-tungkjederammeverk-konsensussekvens. I noen av disse antistoffene omfatter rammeverkkonsensussekvensen substitusjon på posisjon 71, 73 og/eller 78. I noen av disse antistoffene er posisjon 71 A, 73 er T og/eller 78 er A. I noen av disse antistoffene omfatter disse antistoffene ytterligere en human Kl-lettkjede-rammeverk-konsensussekvens.
Et antistoff ifølge beskrivelsen kan omfatte en HVR-L3 som omfatter SEKV. ID nr. 3.Et antistoff ifølge beskrivelsen kan omfatte en variant-HVR-L3 der C8 er W, Y, R eller S.Nevnte variantantistoff omfatter eventuelt ytterligere HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 ogHVR-H3, der hver i rekkefølge omfatter sekvensen som er avbildet i SEKV. ID nr. 1, 2, 4, 5og 6. I noen utførelsesformer omfatter HVR-L1 SEKV. ID nr. 7, 8 eller 9. Eventuelt omfatterdisse antistoffene ytterligere en human undergruppe-III-tungkjede-rammeverk-konsensussekvens. Eventuelt omfatter rammeverk-konsensussekvensen substitusjon på posisjon 71,73 og/eller 78. I noen tilfeller er posisjon 71 A, 73 er T og/eller 78 er A. Disse antistoffene kan ytterligere omfatte en human Kl-lettkjede-rammeverk-konsensussekvens.
Et antistoff ifølge beskrivelsen kan omfatte en HVR-H2 som omfatter SEKV. ID nr. 5.Beskrevet her er en variant-HVR-H2 der E2 er F, eller der E2 er V eller D, eller der E6 er G,eller der E10 er Y,eller der E12 er A, D eller T, eller der E13 er D, A eller N, eller der E15 er V, eller der E17 er G. Nevnte variantantistoff kan ytterligere omfatte HVR-L1, HVR-L2, HVRL3, HVR-H1 og HVR-H3, der hver i rekkefølge omfatter sekvensen som er avbildet i SEKV. IDnr. 1, 2, 3, 4 og 6. I noen tilfeller omfatter HVR-L1 SEKV. ID nr. 7, 8 eller 9. Disse antistoffene kan ytterligere omfatte en human undergruppe-III-tungkjede-rammeverkkonsensussekvens. Rammeverk-konsensussekvensen kan omfatte substitusjon på posisjon71, 73 og/eller 78. I noen av disse antistoffene er posisjon 71 A, 73 er T og/eller 78 er A. Noen av disse antistoffene omfatter ytterligere en human Kl-lettkjede-rammeverkkonsensussekvens.
Et antistoff ifølge beskrivelsen kan omfatte en HVR-H3 som omfatter SEKV. ID nr. 6.Beskrevet her er en variant-HVR-H3 der Fil er Y. Nevnte variantantistoff omfatterytterligere HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 og HVR-H3, der hver i rekkefølge omfattersekvensen som er avbildet i SEKV. ID nr. 1, 2, 3, 4 og 6. I noen tilfeller omfatter HVR-L1SEKV. ID nr. 7, 8 eller 9. Noen av disse antistoffene omfatter ytterligere en human undergruppe-III-tungkjederammeverkskonsensussekvens. Rammeverkskonsensussekvensenomfatter eventuelt substitusjon på posisjon 71, 73 og/eller 78. I noen utførelsesformer av disse antistoffene er posisjon 71 A, 73 er T og/eller 78 er A. Noen av disse antistoffene omfatter ytterligere en human Kl-lettkjederammeverkskonsensussekvens.
Disse antistoffene kan ytterligere omfatte en human undergruppe-III-tungkjederammeverkskonsensussekvens. Rammeverkskonsensussekvensen kan omfatte substitusjon på posisjon 71, 73 og/eller 78. I noen utførelsesformer av disse antistoffene er posisjon 71 A, 73 er T og/eller 78 er A. Noen av disse antistoffene omfatter ytterligere en human kIlettkjederammeverkskonsensussekvens.
Et terapeutisk middel til anvendelse i et vertsindivid utløser fortrinnsvis lite til ingen immunogen respons mot midlet i nevnte individ. I én utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et slikt middel. I én utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen for eksempel et humanisert antistoff som utløser og/eller er forventet å utløse en human anti-gnagerantistoffrespons (slik som anti-muse- eller anti-rotterespons) eller en human anti-human
respons ved et vesentlig redusert nivå sammenlignet med et antistoff som omfatter sekvensen som omfatter SEKV. ID nr. 10 og/eller 11 (fig. IA og IB) eller SEKV. ID nr. 12 og/eller 13 (fig. 9A og 9B som avbilder rotte-anti-muse-Fib504-aminosyresekvenser) hos etvertsindivid. I et annet eksempel tilveiebringer oppfinnelsen et humanisert antistoff som utløser og/eller som er forventet å utløse ingen human anti-gnager (slik som human antimuse (HAMA) eller human anti-muse) eller human anti-human antistoffrespons (HAHA).
Et humanisert antistoff kan omfatte én eller flere humane og/eller humane konsensus-ikke-hypervariabel region (f.eks. rammeverk)-sekvenser på sitt tung kjedeog/eller lettkjede variabelt domene. Én eller flere ytterligere modifiseringerkan være tilstede i de humane og/eller humane konsensus-ikke-hypervariabel-region sekvensene. Dettungkjede variabelt domene til et antistoff omfatter eventuelt en human konsensus-rammeverksekvens, som i én utførelsesform er undergruppe-III-konsensus-rammeverksekvensen.Et antistoff kan eventuelt omfatte en variant undergruppe-III-konsensus-rammeverksekvens som er modifisert for minst én aminosyreposisjon. For eksempel kan en variantundergruppe-III-konsensus-rammeverksekvens omfatte en substitusjon på én eller flere avposisjonene 71, 73, 78 og/eller 94. For eksempel er nevnte substitusjon R71A, N73T, L78A og/eller R.94M, i enhver kombinasjon derav.
Slik det er kjent på fagområdet, og slik det i mer inngående detalj er beskrevet her, så kan aminosyre-posisjonen/grensen som avgrenser en hyper-variabelregion for et antistoffvariere avhengig av konteksten og de ulike definisjoner som er kjent på fagområdet (som beskrevet nedenfor). Noen posisjoner på et variabeldomene kan bli sett på som hybrid hypervariabel posisjoner ved at disse posisjonene kan bli ansett som å være innenfor en hypervariabel region under et sett med kriterier mens de kan bli ansett for å ligge på utsiden av en hypervariabel region under et ulikt sett med kriterier. En eller flere av disse posisjonene kan også bli funnet i utvidede hypervariable regioner (som ytterligere definert nedenfor). Beskrivelsen tilveiebringer antistoffer som omfatter modifiseringer på disse hybride hypervariable posisjonene. I én utførelsesform inkluderer disse hybride hypervariable posisjonene én eller flere av posisjonene 26-30, 33-35B, 47-49, 49, 57-65, 93, 94og 102 på et tungkjede variabelt domene. I én utførelsesform inkluderer disse hybride hypervariable posisjonene én eller flere av posisjonene 24-29, 35-36, 46-49, 49, 56 og 97på lettkjede variabelt domene. Et antistoff ifølge beskrivelsen kan omfatte en human variant undergruppe konsensus-rammeverksekvens som er modifisert på én eller flere hybridehypervariable posisjoner, for eksempel et tungkjede variabelt domene som omfatter en human variant undergruppe-III-konsensus-rammeverksekvens som er modifisert på én ellerflere av posisjoner 28-35, 49, 50, 52a, 53, 54, 58-61, 63, 65, 94 og 102. Antistoffet kanomfatte en T28F, F29I, S30T, S31N, Y32N, A33Y, M34W og S35G substitusjon. I ett tilfelle omfatter antistoffet en S49G-substitusjon, en V50F- eller F50D- eller V50Y-substitusjon, enG53Y-substitusjon, en G54S-substitusjon, en Y58F-substitusjon, en A60N- eller A60D- ellerA60T-substitusjon, en D61P- eller D61A- eller D61H-substitusjon, en V63L-substitusjon, en
G65S-substitusjon, en R94M-substitusjon, en R.94A- eller R.94- eller R.94G- eller R.94Q- ellerR94S-substitusjon, eller en G95P-substitusjon. Også beskrevet her er et antistoff somomfatter én eller flere av substitusjonene på posisjonene 28-35, 49, 50, 52a, 53, 54, 58-61,63, 65, 94 og 102 og omfatter ytterligere én eller flere av substitusjonene på posisjonene R71A eller N73T eller L78A eller L78F. Antistoffet kan omfatte en Y102F-substitusjon. Medreferanse til fig. IB kan det bli sett at disse substitusjonene foreligger i HVR-H1, HVR-H2og/eller HVR-H3 i den tunge kjeden.
Et antistoff ifølge beskrivelsen kan omfatte et lettkjede variabelt domene som omfatter en human variantundergruppe-I-konsensusrammeverksekvens som er modifisertpå én eller flere av posisjonene 27, 29-31, 33, 34, 49, 50, 53-55, 91 og 96. Antistoffet kanomfatte en Q27E-substitusjon, eller en I29V-substitusjon, eller en S30D-substitusjon, elleren N31T- eller N31S- eller N31D-substitusjon, eller en Y32L-substitusjon, eller en A34Hsubstitusjon, eller en Y49K-substitusjon, eller en A50Y-substitusjon, eller en S53Qsubstitusjon, eller en L54S-substitusjon, eller en E55I- eller E55V-substitusjon, eller enY91G-substitusjon, eller en W96N- eller W96L-substitusjon, eller en A25S-substitusjon. Ogsåbeskrevet her er et antistoff som omfatter en A25-substitusjon til G, S, T eller V. Ogsåbeskrevet her er et antistoff som omfatter en modifisering som er valgt fra én eller flere av de følgende gruppene med substitusjoner. For eksempel omfatter antistoffet en S26substitusjon til G, I, K, N, P, Q eller T, eller en Q27-substitusjon til E, A, D, G, H, I, K, L, N,Q, R eller V, eller en S28-substitusjon til A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V eller Y, eller en 129substitusjon til V, A, G, K, L, M, Q eller R, eller en S30-substitusjon til D, A, E, G, H, I, K, L,N, P, S, T eller V, eller en N31-substitusjon til D, T, E eller G, eller en Y32-substitusjon til L,I eller M, eller en L33-substitusjon til A, I, M eller V, eller en A34-substitusjon til H, F, Y ellerS, eller en Y49-substitusjon til K eller N, eller en A50Y-substitusjon, eller en S53Qsubstitusjon, eller en L54S-substitusjon, eller en E55-substitusjon til V, I eller K, eller enY91G-substitusjon, eller en W96-substitusjon til N, L, W, Y, R, S, A, F, H, I, M, N, R, S, T, Veller Y. Med referanse til fig. IA kan det bli observert at disse substitusjonene ligger i HVRLl, HVR-L2 og/eller HVR-L3 i den lette kjeden.
Et antistoff ifølge beskrivelsen kan omfatte enhver passende, human eller human konsensuslettkjede-rammeverksekvens, gitt at antistoffet oppviser de ønskede, biologiskekarakteristika (f.eks. en ønsket bindingsaffinitet). I ett eksempel omfatter et antistoff minst en del (eller hele) av rammeverksekvensen til human K-lettkjede. I ett eksempel omfatter etantistoff minst en del (eller hele) av human K-undergruppe-I-rammeverk-konsensussekvens.
Også beskrevet her er et antistoff som omfatter et tungkjede- og/eller lettkjedevariabelt domene som omfatter rammeverksekvenser som er avbildet i SEKV. ID nr. 34-41og i fig. 1, 7 og 8, gitt at posisjon 49 på lettkjeden og 94 på tungkjeden er inkludert i de utvidede HVR'ene og gitt at nevnte posisjon 49 er K og at nevnte posisjon 94 fortrinnsvis men ikke nødvendigvis er M og kan være R.
Antagonister ifølge beskrivelsen kan bli benyttet til å modulere ett eller flere aspekter av beta7-assosierte effekter, inkludert assosiering med alfa4-integrinsubenhet,assosiering med alfaE-integrinsubenhet, binding av alfa4beta7-integrin til MAdCAM, VCAM-1eller fibronektin og binding av alfaEbeta7-integrin til E-kadherin. Disse effektene kan blimodulert ved hjelp av enhver biologisk relevant mekanisme, inkludert ødeleggelse av ligandbinding til beta7-subenhet eller til alfa4beta7 eller alfaEbeta-dimert integrin og/ellerødelegge assosiering mellom alfa- og beta-integrinsubenhetene slik at dannelse av detdimere integrinet blir inhibert. Følgelig tilveiebringer beskrivelsen et beta7-antagonistantistoff som inhiberer binding av alfa4 til beta7. Også tilveiebragt er et beta7-antagonistantistoff som ødelegger binding av alfa4beta7 til MAdCAM, eller binding av alfa4beta7 til VCAM-1, eller bindingen av alfa4beta7 til fibronektin, eller binding av beta7 til alfaE, ellerbinding av alfaEbeta7-integrin til E-kadherin. Interferens kan være direkte eller indirekte. Etbeta7-antagonistantistoff kan for eksempel binde til beta7 på en sekvens i alfa4beta7- elleralfaEbeta7-dimeriseringsregionen og dermed inhibere interaksjon for integrinsubenhetene ogdannelse av en integrindimer. I et ytterligere eksempel kan et beta7-antagonistantistoffbinde til en sekvens på ligandbindingsdomenet til beta7-subenhet og derved inhibereinteraksjon av nevnte bundne domene med sin bindingspartner (slik som fibronektin, VCAM og/eller MAdCAM for alfa4beta7-integrin, eller E-kadherin for alfaEbeta7-integrin). I et anneteksempel kan et beta7-antagonistantistoff binde til en sekvens som ikke ligger på integrinsubenhetdimeriseringsdomenet eller et ligandbindingsdomene, men der nevnte beta7antagonistantistoffbinding fører til ødeleggelse av evnen for beta7-domenet til å interageremed sin bindingspartner (slik som en alfa4- eller alfaE-integrinsubenhet og/eller en ligandslik som fibronektin, VCAM, MAdCAM eller E-kadherin). Et antagonistantistoff ifølgebesrkivelsen binder til beta7 (for eksempel det ekstracellulære domenet) slik at beta7dimerisering med alfa4- eller alfaE-subenheten blir ødelagt. Også beskrevet her er etantagonistantistoff som binder til beta7 slik at evnen for beta7 og/eller et alfa4beta7og/eller et alfaEbeta7-integrin i å binde til sin respektive ligand eller ligander bli ødelagt. Foreksempel beskrivelsen tilveiebringer et antagonistantistoff som ved binding til et beta7molekyl inhiberer dimerisering av nevnte molekyl. Et beta7-antagonistantistoff kan bindespesifikt til en sekvens på ligandbindingsdomenet til beta7. Et beta7-antagonistantistoff kanbinde spesifikt til en sekvens på ligandbindingsdomente til beta7 slik at ligandbinding (dvs. fibronektin, VCAM og/eller MAdCAM) til alfa4beta7-integrinet blir ødelagt. Et beta7antagonistantistoff kan binde spesifikt til en sekvens på ligandbindingsdomenet til beta7 slik at ligandbinding (dvs. E-kadherin) til alfaEbeta7-integrinet blir ødelagt.
I Også beskrevet her er et antagonistantistoff som ødelegger beta7-dimeriseringsom omfatter heterodimerisering (dvs. beta7-dimerisering med et alfa4- eller alfaEintegrinsubenhetsmolekyl).
Også beskrevt her er et antagonistantistoff som binder en epitop på beta7-integrinsubenheten som er kartlagt til aminosyrene 176-237, og et antagonistantistoff som binder til
den samme epitopen på beta7-integrinet som vesentlig er den samme epitopen somFib504.64 (ATCC HB-293). Bestemmelse av epitopbinding blir utført ved standardteknikkerinkludert konkurranse-bindingsanalyse.
Også beskrevet her er et antistoff som omfatter en kombinasjon av én, to, tre, fire, fem eller alle HVR-sekvensene som er avbildet i tabellen med aminosyre-substitusjoner i fig.13.
Et terapeutisk middel til anvendelse hos et vertsindivid utløser fortrinnsvis lite eller ingen immunogen respons mot midlet hos nevnte individ. I én utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et slikt middel. I én utførelsesform tilveiebringer for eksempel oppfinnelsen et humanisert antistoff som utløser og/eller er forventet å utløse en human anti-rotte- ellerhuman anti-muse- eller human anti-human-antistoffrespons ved vesentlig redusert nivåsammenlignet med et antistoff som omfatter sekvensen ifølge SEKV. ID nr. 10, 11, 12 og/eller SEKV. ID nr. 13 (rotte-anti-muse-Fib504 (ATCC HB-293), fig. 1 og 9) hos etvertsindivid. I et annet eksempel tilveiebringer oppfinnelsen et humanisert antistoff som utløser og/eller er forventet å utløse ingen human anti-muse-, human anti-rotte- ellerhuman anti-human-antistoffrespons.
Et humanisert antistoff ifølge beskrivelsen kan omfatte én eller flere humane og/eller humane konsensus-ikke-hypervariabel region (f.eks. rammeverk)-sekvenser på sitttungkjede- og/eller lettkjede variable domene. I noen utførelsesformer foreligger én ellerflere ytterligere modifiseringer på de humane og/eller humane konsensus-ikke-hypervariabelregionsekvensene. I én utførelsesform omfatter det tungkjede variable domenet til et antistoff ifølge beskrivelsen en human konsensusrammeverksekvens, som i én utførelsesform er undergruppe-III-konsensusrammeverksekvensen. Et antistoff kan omfatte envariantundergruppe-III-konsensus-rammeverk-sekvens som er modifisert på minst énaminosyreposisjon. I én utførelsesform kan for eksempel en variantundergruppe-IIIkonsensusrammeverksekvens omfatte en substitusjon på én eller flere av posisjonene 71, 73, 78 og/eller 94, selv om posisjon 94 er en del av en utvidet tungkjedehypervariabel region-H3 ifølge foreliggende oppfinnelse. Nevnte substitusjon kan være R71A, N73T, N78Aog/eller R.94M, i en hvilken som helst kombinasjon derav.
Et antistoff ifølge beskrivelsen kan omfatte enhver passende human eller human konsensuslettkjede-rammeverksekvens, gitt at antistoffet oppviser de ønskede, biologiskekarakteristika (f.eks. en ønsket bindingsaffinitet). I noen tilfeller omfatter et antistoff minst en del av (eller hele) rammeverksekvensen for human K-lettkjede. I noen tilfeller omfatter etantistoff minst en del av (eller hele) human K-undergruppe-I-rammeverk-konsensussekvens.
Antagonister ifølge beskrivelsen kan bli benyttet til å modulere ett eller flere aspekter av beta7-assosierte effekter. Et beta7-antagonistantistoff kan for eksempel bindetil beta7 på en sekvens i alfa4beta7- eller alfEbeta7-dimeriseringsregionen og dervedinhibere interaksjon av integrinsubenhetene og dannelsen av en integrindimer. I et ytterligere eksempel kan et beta7-antagonistantistoff binde til en sekvens på ligand
bindingsdomenet til beta7-subenhet og derved inhibere interaksjon av nevnte bundnedomene med sin bindingspartner (slik som fibronektin, VCAM og/eller MAdCAM for alfa4beta7-integrinet, eller E-kadherin for alfaEbeta7-integrinet. I et annet eksempel kan etbeta7-antagonistantistoff binde til en sekvens som ikke ligger på integrinsubenhetdimeriseringsdomenet eller et ligandbindingsdomene, men der nevnte beta7-antagonistantistoffbinding fører til ødeleggelse av evnen for beta7-domenet til å interagere med sinbindingspartner (slik som en alfa4- eller alfaE-integrinsubenhet og/eller en ligand slik somfibronektin, VCAM, MAdCAM eller E-kadherin). I noen tilfeller binder et antagonist-antistoffifølge beskrivelsen til beta7 (for eksempel ekstracellulærdomenet) slik at beta7-dimeriseringmed alfa4- eller alfaE-subenheten blir ødelagt. I noen tilfeller binder et antagonistantistoffifølge beskrivelsen til beta7 slik at evnen for beta7 og/eller et alfa4beta7- og/eller etalfaEbeta7-integrin til å binde sin respektive ligand eller ligander bli ødelagt. I noen tilfellertilveiebringer beskrivelsen for eksempel et antagonistantistoff som ved binding til et beta7molekyl inhiberer en dimerisering av nevnte molekyl. I noen tilfeller binder et beta7antagonistantistoff ifølge beskrvelsen spesifikt til en sekvens på ligand-bindingsdomenet tilbeta7. I én utførelsesform binder et beta7-antagonistantistoff ifølge beskrivelsen spesifikt tilen sekvens på ligandbindingsdomenet til beta7 slik at ligandbinding (dvs. fibronektin, VCAM og/eller MAdCAM) til alfa4beta7-integrinet blir ødelagt. I noen tilfeller binder et beta7antagonistantistoff ifølge beskrivelsen spesifikt til en sekvens på ligandbindingsdomenet til beta7 slik at ligandbinding (dvs. E-kadherin) til alfaEbeta7-integrinet blir ødelagt.
I noen tilfeller ødelegger et antagonistantistoff ifølge beskrivelsen beta7dimerisering som omfatter heterodimerisering (dvs. beta7-dimerisering med et alfa4- elleralfaE-integrinsubenhetmolekyl).
I noen tilfeller kan det være fordelaktig å ha et beta7-antagonistantistoff som ikkeinterfererer med binding av en ligand (slik som fibronektin, VCAM, MAdCAM eller alfaE) til beta7-subenhet som en del av et integrin eller til et alfa4beta7-integrin eller et alfaEbeta7integrin som en dimer. Følgelig tilveiebringer beskrivelsen et antistoff som ikke binder et fibronektin-, VCAM-, MAdCAM- eller E-kadherinbindingssete på beta7, men som istedeninhiberer interaksjon mellom beta7-subenhet og en alfa-subenhet (slik som alfa4- elleralfaE-integrinsubenhet) slik at et biologisk aktivt integrin blir forhindret i å bli dannet. I etteksempel kan et antagonistantistoff ifølge oppfinnelsen bli benyttet sammen med én eller flere andre antagonister, der antagonistene blir målsøkt ved ulike prosesser og/eller funksjoner innenfor beta7-integrinaksen. I noen tilfeller binder således et beta7-antagonistantistoff ifølge beskrivelsen en epitop på beta7 som er forskjellig fra en epitop som blir bundet av et annet beta7- eller alfa/beta-integrinantagonistantistoff (slik som en alfa4beta7)inkludert monoklonalt antistoff eller et antistoff slik som et humanisert antistoff eller monoklonalt antistoff som er avledet fra og/eller som har de samme eller effektivt de samme bindingskarakteristikaene eller spesifisitet som et antistoff som er avledet fra et murint antistoff.
Beskrivelsen tilveiebringer ytterligere et beta7-antagonistantistoff som ødeleggerbeta?-, alfa4- eller alfaE-multimerisering til det respektive integrinet i tillegg til ligandbinding. Et antagonistantistoff som inhiberer beta7-dimerisering med alfa4- eller alfaEintegrinsubenhet kan for eksempel ytterligere omfatte en evne til å konkurrere med ligand for binding til beta? eller integrindimeren (f.eks. kan den interferere med bindingen av fibronektin, VCAM og/eller MAdCAM til beta? og/eller alfa4beta?, eller den kan interferere med bindingen av E-kadherin til beta? eller alfaEbeta?).
I noen tilfeller inhiberer binding av antagonisten til beta? ligandbindingsaktivert cellulær adhesjon. I en annen utførelsesform av et beta?-antagonistantistoff ifølgebeskrivelsen inhiberer binding av antagonisten til beta? i en celle rekruttering av cellen til celler og/eller vev der det beta?-inneholdende integrinet ble uttrykt.
Også beskrevet her er et beta?-antagonistantistoff som spesifikt binder minst en delav aminosyrene 176-250 (eventuelt aminosyrene 176-237) på det beta?-ekstracellulæredomenet (se Tidswell, M. et al. (1997) J. Immunol. 159:1497-1505) eller variant derav, ogreduserer eller blokkerer binding av ligandene MAdCAM, VCAM-1, fibronektin og/eller Ekadherin. I noen tilfeller ødelegger, reduserer og/eller forhindrer slik blokkering av ligandbinding adhesjon av en celle som uttrykker liganden til en celle som uttrykker den beta?inneholdende liganden. I noen tilfeller binder et antagonistantistoff ifølge beskrivelsen spesifikt til en aminosyresekvens for beta? som omfatter restene 176-237. I noen tilfellerbinder et antagonistantistoff ifølge beskrivelsen spesifikt til en konformasjonsmessig epitop som er dannet av en del av eller hele av minst én av sekvensene som er valgt fra gruppen som består av restene 176-237 i beta?. I noen tilfeller binder et antagonistantistoff ifølgebeskrivelsen spesifikt en aminosyresekvens som har minst 50 %, minst 60 %, minst 70 %, minst 80 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 98 %, minst 99 % sekvensidentitet eller likhet med aminosyresekvensen ifølge restene 176-237 eller restene 176-250 i human beta?. Inoen tilfeller binder antagonisten anti-beta?-antistoffet ifølge beskrivelsen den sammeepitopen som anti-beta?-antistoffet Fib504 som er produsert av hybridom ATCC HB-293.
Beskrevet her er sammensetninger som omfatter ett eller flere antagonistantistoffer ifølge oppfinnelsen og en bærer. Eventuelt er bæreren farmasøytisk akseptabel.
I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen nukleinsyrer som koder for et beta?antagonistantistoff ifølge oppfinnelsen.
I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen vektorer som omfatter en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen.
I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen vertsceller som omfatter en nukleinsyre eller en vektor ifølge oppfinnelsen. En vektor kan være av en hvilken som helst type, for eksempel en rekombinant vektor slik som en ekspresjons-vektor. Enhver av en mengdevertsceller kan bli benyttet. I én utførelsesform er en vertscelle en prokaryot celle, for eksempel E. coli. I én utførelsesform er en vertcelle en eukaryot celle, for eksempel en pattedyrcelle slik som kinesisk hamster ovarie(CHO)-celle.
I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for å fremstille en antagonist ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen tilveiebringer for eksempel en fremgangsmåte for å fremstille et beta7-antagonistantistoff (som slik det er definert her inkluderer fullengdeantistoff og fragmenter derav), der nevnte fremgangsmåte omfatter å uttrykke en rekombinant vektor ifølge oppfinnelsen som koder for nevnte antistoff (eller fragment derav) i en passende vertscelle og gjenvinne nevnte antistoff.
Beskrevet her er en fremstilt artikkel som omfatter en beholder og en sammensetning inneholdt i beholderen, der sammensetningen omfatter ett eller flere beta7antatonist-antistoffer ifølge oppfinnelsen. I én utførelsesform omfatter sammensetningen ennukleinsyre ifølge oppfinnelsen. I én utførelsesform omfatter en sammensetning som omfatter et antistoff ytterligere en bærer, som i noen utførelsesformer er farmasøytisk akseptabel. I én utførelsesform omfatter en fremstilt artikkel ifølge oppfinnelsen ytterligere instruksjoner for å administrere sammensetningen (for eksempel antagonistantistoffet) til et individ.
Beskrevet her er et sett som omfatter en første beholder som omfatter en sammensetning som omfatter ett eller flere beta7-antagonistantistoffer ifølge oppfinnelsen, og enandre beholder som omfatter en buffer. I én utførelsesform er bufferen farmasøytisk akseptabel. I én utførelsesform omfatter en sammensetning som omfatter et antagonistantistoff ytterligere en bærer, som i noen utførelsesformer er farmasøytisk akseptabel. I én utførelsesform omfatter et sett ytterligere instruksjoner for administrering av sammensetningen (for eksempel antagonistantistoffet) til et individ.
I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et sett som omfatter en første beholder som omfatter et preparat som omfatter ett eller flere beta7-antagonistantistoffer ifølgeoppfinnelsen og en andre beholder som omfatter en buffer. I én utførelsesform er bufferen farmasøytisk akseptabel. I én utførelsesform omfatter et preparat som omfatter et antagonistantistoff ytterligere en bærer, som i noen utførelsesformer er farmasøytisk akseptable. I én utførelsesform omfatter et sett ytterligere instruksjoner for administrering av preparatet (f.eks. antagonistantistoffet) til et individ.
Beta7-integriner og deres ligander blir forskjellig uttrykt i sykdomstilstander.Ekspresjonen av MAdCAM-1 på tarmendotel er økt på steder med slimhinneinflammasjonhos pasienter med inflammatorisk tarmsykdom (UC og CD) og tykktarm laminapropria hos UC- og CD-pasienter viser også økt CD3+- og a5b7+-celler sammenlignet med IBSkontroller (se Souza H., et al.. Gut 45:856 (1999)). MAdCAM-l-ekspresjon ble observert åvære assosiert med portaltraktus inflammasjon ved leversykdommer og kan være viktig i rekruttering av alfa4beta7+ lymfocytter til leveren ved inflammasjon. (Hillan, K., et al.. Liver. 19(6):509-18 (1999)). MAdCAM-1 på hepatiske blodkar støtter adhesjon av a4b7+lymfocytter fra pasienter med IBD og primær sklerosekolangitt. Adhesjonen ble inhibert med anti-MAdCAM-1-, anti-alfa4beta7- eller anti-alfa4-antistoffer (Grant AJ et al., Hepatology.33(5): 1065-72 (2001)). MAdCAM-1, VCAM-1 og E-kadherin blir uttrykt på hjerne-endotel
21 celler og/eller på mikroblodkar i det betente sentralnervesystemet. Beta7-integriner bidrar tildemyelinerende sykdom i CNS (Kanwar et al., J. Neuroimmunology 103, 146 (2000)). Ekspresjon av alfa4beta7 var vesentlig høyere i LPL i CD enn i kontroller og pasienter med UC (Oshitani, N. et al.. International Journal of Molecule Medicine 12, 715-719 (2003)).IEL'er fra CD-pasienter kan bli kronisk stimulert og rekruttert fra periferien (Meresse, B., etal.. Human Immunology, 62, 694-700 (2001)). Ved human leversykdom blir alfaEbeta7-Tceller (CD4+ og CD8+) fortrinnsvis akkumulert i human lever der E-kadherin blir uttrykt påhepatocytter og gallegangepitel (Shimizu, Y., et al.. Journal of Hepatology 39, 918-924(2003)). Ved kronisk pankreatitt infiltrerer CD8+CD103+-T-celler, analogt med intestinaleintraepitel-lymfocytter, pankreas ved kronisk pankreatitt (Matthias, P., et al.. Am JGastroenterol 93:2141-2147 (1998)). Oppregulering av alfaEbeta7 er funnet hos pasientermed systemisk lupus erytematosus med spesifikk epitel-involvering (Pang et al., Arthritis &Rheumatism 41:1456-1463 (1998)). Ved Sjøgrens syndrom adherer CD8+alfaEbeta7+Tceller og dreper acinøse epitelceller ved å indusere apoptose (Kroneld et al., Scand J Rheumatol 27:215-218, 1998). Integrin alfa4beta7 og alfaEbeta7 spilleren rolle i T-celleepidermotropisme ved hudinflammasjon og bidrar til hudtransplantatavstøtning (Sun et al., Transplantation 74, 1202, 2002). Teraki og Shiohara viste fortrinnsvis ekspresjon av aEb7integrin på CD8+-T-celler hos psoriasisrammet epidermis (Teraki og Shiohara, Br. J.Dermatology 147, 1118, 2002). Spytt-T-lymfocytter er aktiverte IEL'er (CD69+ CD103+)ved astma, KOLS og normale individer (Leckie et al., Thorax 58, 23, 2003). CD103 + (aEb7+) CTL akkumulerer med transplantatepitel ved klinisk nyretransplantatavstøtning (Hadley et al., Transplantation 72, 1548, 2001). I ett aspekt tilveiebringer således oppfinnelsen anvendelse av et beta7-antagonistantistoff ifølge oppfinnelsen for å inhiberebeta7-integrin ligandinteraksjon for å redusere eller lindre en sykdom slik som én eller flereav sykdomstilstandene som er beskrevet ovenfor. I én utførelsesform blir antistoffet ifølge oppfinnelsen benyttet i fremstillingen av et medikament for den terapeutiske og/eller profylaktiske behandlingen av en sykdom, slik som en inflammatorisk sykdom inkludert inflammatorisk tarmsykdom (slik som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt), inflammatorisk leversykdom, inflammasjon i CNS, kronisk pankreatitt, systemisk lupus erytematosus, Sjøgrens syndrom, psoriasis og hudinflammasjon, astma, kronisk obstruktiv pulmonal sykdom (KOLS), interstitiell lungesykdom, allergi, autoimmun sykdom, transplantasjonsavstøtning, nyretransplantatavstøtning, transplantat-versus-vert sykdom, diabetes og kreft.
Beskrevet her er anvendelse av en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen til fremstillingen av et medikament til den terapeutiske og/eller profylaktiske behandlingen av en sykdom, slik som en immun-forstyrrelse (slik som autoimmun forstyrrelse eller inflammatoriskforstyrrelse) inkludert inflammatorisk tarmsykdom (slik som Crohns sykdom eller ulcerøs kolitt) og allergisk reaksjon (slik som forstyrrelser i det respiratoriske systemet, hud, ledd, allergisk astma og andre organer som rammes av allergisk reaksjon som er mediert ved et beta7-inneholdende integrin).
Også beskrevet her er en ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen i fremstillingen av et medikament til den terapeutiske og/eller profylaktiske behandlingen av en sykdom slik som immunforstyrrelse (slik som autoimmun forstyrrelse eller inflammatorisk forstyrrelse) inkludert uten begrensning inflammatorisk tarmsykdom (slik som Crohns sykdom eller ulcerøs kolitt) og allergisk reaksjon (slik som forstyrrelser i det respiratoriske systemet, hud, ledd og andre organer som er rammet av allergisk reaksjon som er mediert ved et beta7inneholdende integrin).
Også beskrevet her er anvendelse av en vertscelle ifølge oppfinnelsen til fremstillingen av et medikament til den terapeutiske og/eller profylaktiske behandlingen av en sykdom, slik som en immun-forstyrrelse (slik som autoimmun forstyrrelse ellerinflammatorisk forstyrrelse) inkludert inflammatorisk tarmsykdom (slik som Crohns sykdom eller ulcerøs kolitt) og allergisk reaksjon (slik som forstyrrelser i det respiratoriske systemet, huden, leddene og andre organer som er rammet av allergisk reaksjon som er mediert ved et beta7-inneholdende integrin).
Også beskrevet her er anvendelsen av en fremstilt artikkel ved fremstillingen av et medikament for den terapeutiske og/eller profylaktiske behandlingen av en sykdom, slik som en immunforstyrrelse (slik som autoimmun forstyrrelse eller inflammatorisk forstyrrelse) inkludert inflammatorisk tarmsykdom (slik som Crohns sykdom eller ulcerøs kolitt) og allergisk reaksjon (slik som forstyrrelser i det respiratoriske systemet, huden, leveren og andre organer som er rammet av allergisk reaksjon som er mediert ved et beta7inneholdende integrin).
Også beskrevet her er anvendelse av et sett ifølge oppfinnelsen i fremstillingen av et medikament for den terapeutiske og/eller profylaktiske behandlingen av en sykdom, slik som en immun-forstyrrelse (slik som autoimmun forstyrrelse eller inflammatoriskforstyrrelse) inkludert inflammatorisk tarmsykdom (slik som Crohns sykdom eller ulcerøs kolitt) og allergisk reaksjon (slik som forstyrrelser i det respiratoriske systemet, huden, leddene og andre organer som er rammet av allergisk reaksjon som er mediert ved et beta7-inneholdende integrin).
Også beskrevet her er fremgangsmåter og sammensetninger som er nyttige for å modulere sykdomstilstander som er assosiert med feilregulering av den beta7integrinmedierte celle-celle-interaksjonsprosessen. Beta7-integrinene er involvert i flerebiologiske og fysiologiske funksjoner, inkludert for eksempel inflammatoriske forstyrrelser og allergiske reaksjoner.
Kort beskrivelse av figurene
Fig. IA og IB viser sammenstilling av sekvenser for de variabel lette og tunge kjedene for de følgende: human lettkjede-undergruppe-kappa-I-konsensussekvens (fig. IA,SEKV. ID nr. 23), human tungkjede-undergruppe-III-konsensussekvens (fig. IB, SEKV. IDnr. 24), rotte-anti-muse-beta7-antistoff (Fib504)-variabel lettkjede (fig. IA, SEKV. ID nr.
10), rotte-anti-muse-beta7-antistoff (Fib504)-variabel tungkjede (fig. IB, SEKV. ID nr. 11)og humaniserte antistoffvarianter: humanisert hu504Ktransplantatvariabel lettkjede (fig. IA, SEKV. ID nr. 25), humanisert hu504K-transplantatvariabel tungkjede (fig. IB, SEKV. ID nr.26), variant hu504.5 (aminosyrevariasjoner fra humanisert hu504K transplantat er indikert i fig. IA (lettkjede) og fig. IB (tungkjede) for variantene hu504.5, hu504.16 og hu504.32.
Ytterligere aminosyresubstitusjoner i HVR-H1 og HVR-H2 for hu504K-transplantat som førtetil beta7-bindende antistoffer er indikert i fig. 1C.
Fig. 2A og 2B viser fullengdesekvensen for human konsensus-undergruppe-IIIsekvens-lettkjede (fig. 2A, SEKV. ID nr. 27) og tungkjede (fig. 2B, SEKV. ID nr. 28). HVR'erunderstreket.
Fig. 3A og 3B viser fullengdesekvensen for de humaniserte 504-transplantatinneholdende rotte-Fib504-hypervariabel regionene (som beskrevet her) som ertransplantert på den humane kappa-I-konsensussekvenslettkjeden (fig. 3A, SEKV. ID nr. 29)og på den humane undergruppe-III-konsensussekvenstungkjeden (fig. 3B, SEKV. ID nr. 30).HVR'er er understreket.
Fig. 4A og 4B viser fullengdesekvensen for den humaniserte 504K-transplantat derposisjon 49 i lettkjeden til hu504-transplantat er en Y49K-substitusjon. hu504K-transplantatlettkjeden er avbildet i SEKV. ID nr. 31 og hu504K-transplantattungkjeden er avbildeti SEKV. ID nr. 30. HVR'er er understreket.
Fig. 5A og 5B viser fullengdesekvensen til hu504K-RF-transplantat der posisjonene71 og 78 i tungkjeden til hu504-transplantat er en A71R-substitusjon og en A78Fsubstitusjon fra hu504K-transplantatsekvensen. Hu504K-RF-transplantatlettkjeden eravbildet i SEKV. ID nr. 31 og hu504K-RF-transplantattungkjeden er avbildet i SEKV. ID nr.32. HVR'er er understreket.
Fig. 6A og 6B viser fullengdesekvensen for hu504.32-varianten som omfattertungkjeden til hu504K-RF-transplantat (SEKV. ID nr. 32) og T31D- og Y32L-substitusjonerpå lettkjeden til hu504K-transplantat (SEKV. ID nr. 33). HVR'er er understreket.
Fig. 7A-7B og fig. 8A-8B viser eksempelmessige humane akseptorkonsensusrammeverksekvenser til anvendelse i utøvelse av den foreliggende oppfinnelsen med sekvensidentifikatorer som følger:
Variabel lett (VL)-konsensusrammeverk (fig. 7A, B)
human VL-kappaundergruppe-I-konsensusrammeverk (SEKV. ID nr. 14)
human VL-kappaundergruppe-I-konsensusrammeverk minus forlenget HVR-L2 (SEKV. ID nr.15)
human VL-kappaundergruppe-II-konsensusrammeverk (SEKV. ID nr. 16)human VL-kappaundergruppe-III-konsensusrammeverk (SEKV. ID nr. 17)human VL-kappaundergruppe-IV-konsensusrammeverk (SEKV. ID nr. 18)Skyggelagte regioner representerer lettkjede-HVR'er (indikert som LI, L2 og L3).
Variabel tung (VH)-konsensusrammeverk (fig. 8A, B)human VH-undergruppe-I-konsensusrammeverk minus Kabat-CDR'er (SEKV. ID nr. 19)human VH-undergruppe-I-konsensusrammeverk minus forlengede hypervariable regioner(SEKV. ID nr. 20-22)
human VH-undergruppe-II-konsensusrammeverk minus Kabat-CDR'er (SEKV. ID nr. 48)human VH-undergruppe-II-konsensusrammeverk minus forlengede hypervariable regioner(SEKV. ID nr. 49-51)
human VH-undergruppe-III-konsensusrammeverk minus Kabat-CDR'er (SEKV. ID nr. 52)human VH-undergruppe-III-konsensusrammeverk minus forlengede hypervariable regioner(SEKV. ID nr. 53-55)
human VH-akseptorrammeverk minus Kabat-CDR'er (SEKV. ID nr. 56)
human VH-akseptorrammeverk minus forlengede hypervariable regioner (SEKV. ID nr. 5758)
human VH-akseptor-2-rammeverk minus Kabat-CDR'er (SEKV. ID nr. 59)human VH-akseptor-2-rammeverk minus forlengede hypervariable regioner (SEKV. ID nr.60-62).
Fig. 9A og 9B viser en aminosyresekvens for variabelkjedene til rotte-anti-museintegrin-beta7-Fib504-antistoffet produsert av hydridoma ATCC HB-293. HVR'er erunderstreket. Variabellettkjeder avbildet i fig. 9A (SEKV. ID nr. 12) og variabeltungkjeder avbildet i fig. 9B (SEKV. ID nr. 13).
Fig. 10A viser aminosyreposisjoner på tungkjeden til de ulike konsensussekvensene (hu-undergrupper I-III). Konsensussekvensen som er benyttet til utvikling av Herceptinanti-HER2-antistoffet, rotte-Fib504- og hu504-RL- og hu504-RF-rammeverk er beskrevet ieksemplene her. Fig. 10B er et stolpediagram som viser den relative bindingen av alfa4beta7 til hu504-transplantatantistoff og hu504K-transplantatantistoff som en funksjonav "RL" eller "RF"-rammeverksmodifiseringer som beskrevet i eksempel 1.
Fig. 11A-11C. Fig. 11A viser HVR-endringene som skyldes affinitetsmodning utførtved å tilby et begrenset utvalg av aminosyresubstitusjoner i hu504.16-varianten.Resultatene er fra biblioteker med individuelt modifiserte HVR'er i hu504.16-varianten sombeskrevet i eksempel 2 her. Aminosyreforkortelser i bokser er aminosyrer funnet hyppigere på de beta7-binende antistoffene (bakteriofagselekterte antistoffer). Fig. 11B og 11C erstolpediagrammer av resultatene i fig. 11A som viser antallet og type aminosyresubstitusjoner i hu504.16-varianten (lettkjede, fig. 11B, tungkjede, fig. 11C) som erpåvisbare ved hjelp av mutagenese- og seleksjonsfremgangsmåtene ifølge eksempel 2.
Fig. 12 viser resultatene av affinitetsmodning utført ved å tilby et bredt utvalg av mulige aminosyresubstitusjoner i HVR'ene til hu504.32-variant som beskrevet i eksempel 2.Boksene indikerer aminosyren som ble påvist hyppigst i antistoffene som ble påvist som
25 beta7-bindende antistoffer ved hjelp av mutagenese- og seleksjonsfremgangsmåtene ieksempel 2.
Fig. 13A og 13B viser HVR-sekvenser for rotte-anti-muse-Fib504 (ATCC-293) og denhumane konsensusen (kolonner på venstre side). Eksempler på aminosyresubstitusjonene som er observert for hver HVR-posisjon ved hjelp av analysene som er beskrevet ieksemplene (aminosyresubstitusjoner som er observert ved myk aminosyrerandomisering, bred aminosyresubstitusjonscanning og begrenset aminosyresubstitusjonscanning) er vist på høyre side (en nyttig fremgangsmåte for å modifisere HVR'er for humanisering, som er anvendbar på varianter ifølge foreliggende oppfinnelse er funnet i US søknad serienr. 60/545,840, innsendt 19. februar 2004).
Fig. 14 er en eksempelmessig grafisk representering av Fib504 og variantantistoffbinding til MAdCAM som en funksjon av antistoffkonsentrasjonen som beskrevet i eksempel 3. ICso- og ICgo-verdier for antistoffene ble bestemt.
Fig. 15A og 15B viser lettkjede- og tungkjede-HVR-aminosyresekvensene for504.32R-anti-beta7-antistoff med hensyn på posisjon ifølge Kabat-nummereringssystemetog et relativt nummereringssystem (A-F) for de seks HVR'ene i antistoffet. Aminosyrer påposisjon 71, 73 og 78 i tungkjede-FR3-regionen er også vist. Nyttige aminosyresubstitusjoner er også fremlagt for mange av posisjonene på HVR'ene eller tungkjede-FR3region.
Fig. 16 viser et stolpediagram for den relative evnen til 504.32M- og 504.32Rantistoffene i å blokkere målsøking av radiomerkede T-celler til kolon hos mus som oppleverinflammatorisk tarmsykdom.
Måter å utføre oppfinnelsen på
Generelle teknikker
Utøvelsen av foreliggende oppfinnelse vil hvis ikke annet er indikert benytte konvensjonelle teknikker for molekylærbiologi (inkludert rekombinante teknikker), mikrobiologi, cellebiologi, biokjemi og immunologi, som er innenfor emnet på fagområdet. Slike teknikker er fullt ut forklart i litteraturen, slik som i "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", annen utgave (Sambrook et al., 1989), "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, red., 1984), "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, red., 1987), "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.), "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., red., 1987, og periodiske oppdateringer), "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., red., 1994), "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Berbard V., 1988), "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001).
Definisjoner
Med "beta7-subenhet" eller "p7-subenhet" er det ment den humane p7-integrinsubenheten (Erle et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:11009-11016). Beta7-subenhetenassosieres med alfa4-integrinsubenheten slik som den humane a4-subenheten (Kilger ogHolzmann (1995) J. Mol. Biol. 73:347-354). Alfa4beta7-integrinet blir uttrykt på en hoveddelav modne lymfocytter, i tillegg til på en liten populasjon av tymocytter, benmargsceller og mastceller. (Kilshaw og Murant (1991) Eur. J. Immunol. 21:2591-2597, Gurish et al., (1992)149: 1964-1972, og Shaw, S.K. og Brenner, M.B. (1995) Semin. Immunol. 7:335). Beta7subenheten assosierer også med alfaE-subenheten, slik som den humane alfaE-integrinsubenheten (Cepek, K.L., et al. (1993) J. Immunol. 150:3459). AlfaEbeta7-integrinet bliruttrykt på intratarmepitellymfocytter (iIEL'er) (Cepek, K.L. (1993) ovenfor). Beta7-subenheten som binder til det humaniserte anti-beta7-antistoffet ifølge oppfinnelsen kan værenaturlig forekommende og kan være løselig eller lokalisert på overflaten til en celle.
Med "alfaE-subenhet" eller "alfaE-integrinsubenhet" eller "aE-subenhet" eller "aEintegrinsubenhet" eller "CD103" er det ment en integrinsubenhet som er funnet å være assosiert med beta7-integrin på intraepitel-lymfocytter, der alfaEbeta7-integrinet mediererbinding til iEL'ene på tarmepitel som uttrykker E-kadherin (Cepek, K.L. et al. (1993) J.Immunol. 150:3459, Shaw, S.K. og Brenner, M.B. (1995) Semin. Immunol. 7:335).
"MAdCAM" eller "MAdCAM-1" blir benyttet om hverandre i konteksten avforeliggende oppfinnelse og refererer til proteinet slimhinneaddressin-celleaddisjonsmolekyl1, som er et enkeltkjede polypeptid som omfatter en kort cytoplasmahale, en transmembranregion og en ekstracellulær sekvens sammensatt av tre immunglobulinlignende domener. cDNA for murin, human og makak-MAdCAM-1 har blitt klonet (Briskin, et al.,(1993) Nature, 363:461-464, Shyjan et al., (1996) J. Immunol. 156:2851-2857).
"VCAM-1" eller "vaskulærcelleadhesjonsmolekyl-1", "CD106" refererer til en ligandfor alfa4beta7 og alfa4betal, som er uttrykt på aktivert endotel og som er viktig i endotelleukocyttinteraksjoner slik som binding og transmigrasjon for leukocytter i løpet av inflammasjon.
"E-kadherin" refererer til et medlem av familien av kadheriner, der E-kadherin bliruttrykt på epitelceller. E-kadherin er en ligand for alfaEbeta7-integrinet og medierer bindingav iEL-uttrykt alfaEbeta7 til tarmepitel, selv om dens funksjon ved lymfocytt-målsøking eruklar (E-kadherinuttrykking er oppregulert av TGF-betal).
"Fibronektin" refererer til fibronektin som er involvert i vevsreparasjon, embryogenese, blodkoagulasjon og cellemigrasjon/adhesjon. Den virker som en linker i ECM (ekstracellulær matriks) og som dimer funnet i plasma (plasma-fibronektin). Plasmaformenblir syntetisert av hepatocytter, mens ECM-formen blir produsert av fibroblaster, kondrocytter, endotelceller, makrofager i tillegg til visse epitelceller. I denne konteksten interagerer den med alfa4beta7-integrin for å mediere aspekter av lymfocyttmålsøking eller adhesjon.ECM-formen av fibronektin virker som et generelt celleadhesjonsmolekyl ved å forankreceller til kollagen eller proteoglykansubstrater. Fibronektin kan også virke for å organisere
27 cellulær interaksjon med ECM ved å binde til ulike komponenter på ekstracellulærmatriksen og til membranbundne fibronektinreseptorer på celleoverflater. Til slutt er fibronektin viktig i cellemigrasjonshendelser i løpet av embryogenese.
"Gastrointestinale inflammatoriske lidelser" er en gruppe av kroniske lidelser som forårsaker inflammasjon og/eller sårdannelse i slimhinnemembran. Disse lidelsene inkluderer for eksempel inflammatorisk tarmsykdom (f.eks. Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, ubestemt kolitt og smittsom kolitt), mukositt (f.eks. oral mukositt, gastrointestinal mukositt, nesemukositt og proktitt), nekrotiserende enterokolitt og øsofagitt.
"Inflammatorisk tarmsykdom" eller "IBD" blir her benyttet om hverandre for å referere til sykdommer i tarmen som forårsaker inflammasjon og/eller sårdannelse og inkluderer Crohns sykdom og ulcerøs kolitt.
"Crohns sykdom (CD)" eller "ulcerøs kolitt (UC)" er kroniske, inflammatoriske tarmsykdommer av ukjent etiologi. Crohns sykdom, i motsetning til ulcerøs kolitt, kan ramme enhver del av tarmen. De mest fremherskende egenskapene ved Crohns sykdom er den granulære, rød-rosa ødemaktige fortykningen av tarmveggen. Med utviklingen avinflammasjon mister disse granulomene ofte deres grenser og integrerer i de omkringliggende vevene. Diaré og forstoppelse i tarmen er de dominerende, kliniske trekk. Som med ulcerøs kolitt kan utviklingen av Crohns sykdom være kontinuerlige eller tilbakefallende, mild eller alvorlig, men ulikt ulcerøs kolitt er ikke Crohns sykdom mulig å kurere ved fjerning av de involverte segmentene i tarmen. De fleste pasienter med Crohns sykdom er avhengig av kirurgi på et tidspunkt, men påfølgende tilbakefall er vanlig og kontinuerlig, medisinsk behandling er vanlig.
Crohns sykdom kan involvere en hvilken som helst del av fordøyelsessystemet fra munn til anus, men den fremkommer typisk i de ileokole områdene, tynntarmsområdet eller i kolon-rektumområdet. Histopatologisk manifesterer sykdommen seg ved diskontinuerligegranulomatomer, kryptabcesser, sprekker og aftøse sår. Det inflammatoriske infiltratet er blandet, bestående av lymfocytter (både T- og B-celler), plasmaceller, makrofager ognøytrofiler. Det er en uforholdsmessig økning i IgM- og IgG-utskillende plasmaceller, makrofager og nøytrofiler.
Antiinflammatoriske legemidler som sulfasalazin og 5-aminosalisylsyre (5-ASA) ernyttige for å behandle mild, aktiv kolon-Crohns-sykdom og blir ofte foreskrevet for åopprettholde remisjon av sykdommen. Metroidazol og ciprofloksasin er lignende i virkning som sulfasalazin og ser ut til å være spesielt nyttige for å behandle perianal sykdom. I mer alvorlige tilfeller er kortikosteroider effektive i å behandle aktive forverringer og kan til og med opprettholde remisjon. Azatioprin og 6-merkaptopurin har også vist suksess hospasienter som krever kronisk administrering av kortikosteroider. Det er også mulig at disse legemidlene kan spille en rolle i langtidsprofylaksen. Dessverre kan det være en svært lang forsinkelse (opptil seks måneder) før virkningen setter inn hos noen pasienter.
Antidiarélegemidler kan også tilveiebringe symptomatisk lindring hos noen pasienter. Næringsterapi eller elementdiett kan forbedre næringsstatusen for pasienter og indusere symptomatisk forbedring ved akutt sykdom, men den induserer ikke vedvarende, kliniske remisjoner. Antibiotika blir benyttet for å behandle sekundær, bakterieovervekst i tynntarm og i behandling av pyogene komplikasjoner.
"Ulcerøs kolitt (UC)" rammer tykktarmen. Utviklingen av sykdommen kan være kontinuerlig eller tilbakefallende, mild eller alvorlig. Den tidligste lesjonen er en inflammatorisk infiltrasjon med abscessdannelse ved basen av Lieberkuhns krypter. Sammenvoksing av disse oppsvulmede og sprukne kryptene har en tendens til å separere den overliggende slimhinnen fra dens blodtilførsel, noe som fører til sårdannelse. Symptomer på sykdommen inkluderer kramper, smerte i nedre del av buken, rektalblødning og hyppig løs avføring bestående i hovedsak av blod, puss og slim med spredte fekale partikler. En total kolektomi kan være nødvendig for akutt, alvorlig eller kronisk, ikkeforbedrende ulcerøs kolitt.
De kliniske trekkene ved UC er svært variable, og fremkomsten kan være snikende eller plutselig, og kan inkludere diaré, tenesmus og tilbakefallende rektal blødning. Ved full involvering av hele kolon, toksisk megakolon, så kan en livstruende tilstand oppstå. Manifesteringer på utsiden av tarmen inkluderer artritt, pyoderma gangrenosum, uveitt og erytema nodosum.
Behandling av UC inkluderer sulfasalazin og beslektede, salisylatinneholdende legemidler for milde tilfeller og kortikosteroidlegemidler i alvorlige tilfeller. Topisk administrering av enten salisylater eller kortikosteroider er noen ganger effektivt, spesielt når sykdommen er begrenset til den distale tarmen, og er assosiert med minskede bivirkninger sammenlignet med systemisk anvendelse. Tilleggstiltak slik som administrering av jern og antidiarémidler er noen ganger indikert. Azatioprin, 6-merkaptopurin og metotreksat blir noen ganger også foreskrevet for anvendelse i refraktoriske, kortikosteroidavhengige tilfeller.
En "modifisering" av en aminosyrerest/posisjon, som benyttet her, refererer til en endring av en primær aminosyresekvens sammenlignet med en utgangsaminosyresekvens, der endringen skyldes en sekvensendring som involverer nevnte aminosyrerest/posisjon. Typiske modifiseringer inkluderer for eksempel substitusjon av resten (eller på nevnte posisjon) med en annen aminosyre (f.eks. en konservativ eller ikke-konservativsubstitusjon), insersjon av én eller flere (vanligvis færre enn 5 eller 3) aminosyrer ved siden av nevnte rest/posisjon og delesjon av nevnte rest/posisjon. En "aminosyresubstitusjon", eller variasjon derav, refererer til erstatningen av en eksisterende aminosyrerest på en forhåndsbestemt (utgangs)aminosyresekvens med en annen aminosyrerest. Vanligvis og fortrinnsvis fører modifiseringen til endring i minst én fysiobiokjemisk aktivitet for variantpolypeptidet sammenlignet med polypeptid som omfatter utgangsaminosyresekvensen (eller "villtype aminosyresekvensen"). I tilfellet med et antistoff kan for eksempel en fysio
biokjemisk aktivitet som er endret være bindingsaffinitet, bindingsevne og/eller bindingseffekt til et målmolekyl.
Uttrykket "aminosyre" innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse blir benyttet i sin bredeste betydning og er ment å skulle inkludere de naturlig forekommende L-a-aminosyrene eller -restene. De vanlig benyttede enbokstavsforkortelsene eller trebokstavsforkortelsene for naturlig forekommende aminosyrer blir benyttet her (Lehninger, A.L., Biochemistry, 2. utgave, s. 71-92, (Worth Publishers, New York, New York, 1975). Uttrykketinkluderer D-aminosyrer i tillegg til kjemisk modifiserte aminosyrer slik som aminosyreanaloger, naturlig forekommende aminosyrer som vanligvis ikke blir inkorporert inn i proteinet slik som norleucin, og kjemisk syntetiserte forbindelser som har egenskaper som er kjent på fagområdet for å være karakteristiske for en aminosyre. For eksempel er analoger eller hermere av fenylalanin eller prolin som muliggjør den samme konformasjonsmessige begrensningen for peptidforbindelsene som naturlig Phe eller Pro inkludert innenfor definisjonen av aminosyre. Slike analoger og hermere blir her referert til som "funksjonelle ekvivalenter" for en aminosyre. Andre eksempler på aminosyrer er fremlagt av Roberts og Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Gross og Meiehofer, red., bind 5, s. 341 (Academic Press, Inc., New York, New York, 1983). Der en enkelt bokstav blir benyttet for å betegne én av de naturlig forekommende aminosyrene er betegnelsene som de vanligvis blir funnet i den relevante litteraturen (se for eksempel Alberts, B. et al. Molecular Biology of the Cell, 3. utgave, Garland Publishing, Inc. 1994, side 57).
Et "isolert" antistoff er ett som har blitt identifisert og separert og/eller gjenvunnet fra en komponent i sitt naturlige miljø. Forurensende komponenter fra dens naturlige miljø er materialer som vil interferere med diagnostiske eller terapeutiske anvendelser av antistoffet, og kan inkludere enzymer, hormoner og andre proteininneholdende eller ikkeproteininneholdende oppløste stoffer. I foretrukne utførelsesformer vil antistoffet være renset (1) til mer enn 95 % etter vekt av antistoff som bestemt ved Lowry-fremgangsmåten,og mest foretrukket mer enn 99 % etter vekt, (2) til en grad som er tilstrekkelig for å oppnå minst 15 rester av N-terminal eller intern aminosyresekvens ved anvendelse av en spinningcup-sekvenator eller (3) til homogenitet ved hjelp av SDS-PAGE ved reduserende eller ikkereduserende betingelser ved å benytte Coomassie blått eller fortrinnsvis sølvfarging. Isolert antistoff inkluderer antistoffet in situ innenfor rekombinante celler siden minst én komponent fra antistoffets naturlige miljø ikke vil være tilstede. Ordinært vil likevel isolert antistoff bli fremstilt ved hjelp av minst ett rensetrinn.
Uttrykket "variabelt domene rest-nummerering som i Kabat" eller "aminosyreposisjonsnummerering som i Kabat", og variasjoner derav, refererer til nummereringssystemet som blir benyttet for tungkjede variable domener eller lettkjede variable domener for samlingen av antistoffet i Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Ved å benytte dette nummereringssystemet kan den faktiske, lineære aminosyresekvensen
30 inneholde færre eller ytterligere aminosyrer som tilsvarer en forkortning av, eller insersjon i, en FR eller CDR i variabeldomenet. Et tungkjede variabelt domene kan for eksempel inkludere en enkel aminosyreinsersjon (rest 52a ifølge Kabat) etter rest 52 i H2 og innsatte rester (f.eks. restene 82a, 82b og 82c, osv., ifølge Kabat) etter tungkjede-FR-rest 82.Kabat-nummereringen av rester kan bli bestemt for et gitt antistoff ved å sammenstille vedregioner med homologi av sekvensen for antistoffet med en Kabat-nummerert"standardsekvens".
Uttrykket "vesentlig lik" eller "vesentlig den samme", slik det blir benyttet her, betegner en tilstrekkelig høy grad av likhet mellom to nummeriske verdier (vanligvis én som er assosiert med et antistoff ifølge oppfinnelsen og den andre assosiert med et referanse/sammenligningsantistoff) slik at en fagperson på området vil anse forskjellen mellom de to verdiene å være av liten eller ingen biologisk og/eller statistisk signifikans innenfor konteksten av de biologiske karakteristika som er målt ved nevnte verdier (f.eks. Kdverdier). Forskjellen mellom nevnte to verdier er fortrinnsvis mindre enn omtrent 50 %, fortrinnsvis mindre enn omtrent 40 %, fortrinnsvis mindre enn omtrent 30 %, fortrinnsvis mindre enn omtrent 20 %, fortrinnsvis mindre enn omtrent 10 % som en funksjon av verdien for referanse/sammenligningsantistoffet.
"Bindingsaffinitet" refererer vanligvis til styrken av den totale summen av ikkekovalente interaksjoner mellom et enkelt bindingssete på et molekyl (f.eks. et antistoff) og dets bindingspartner (f.eks. et antigen). Hvis ikke annet er indikert refererer "bindingsaffinitet", slik det er benyttet her, til iboende bindingsaffinitet som gjenspeiler en 1:1-interaksjon mellom medlemmer i et bindingspar (f.eks. antistoff og antigen). Affinitetenfor et molekyl X for sin partner Y kan generelt bli representert ved dissosiasjonskonstanten (Kd). Affinitet kan bli målt ved vanlige fremgangsmåter på fagområdet, inkludert de som er beskrevet her. Lavaffinitetsantistoffer binder vanligvis antigen sakte og har en tendens til å dissosiere lett, mens høyaffinitetsantistoffet vanligvis binder antigen raskere og har en tendens til å forbli bundet lengre. En mengde fremgangsmåter for å måle bindingsaffinitet er kjent på fagområdet, og en hvilken som helst av disse kan bli benyttet for formål ifølge foreliggende oppfinnelse. Spesifikke, illustrerende utførelsesformer er beskrevet i det følgende.
I én utførelsesform blir "Kd-verdien" eller "Kd" ifølge denne oppfinnelsen målt vedhjelp av en radiomerket antigenbindingsanalyse (RIA) som blir utført med Fab-versjonen avet antistoff av interesse og dets antigen som beskrevet ved den følgende analysen som måler løsningsbindingsaffinitet for Fab'er for antigen ved å balansere Fab med en minimal konsentrasjon av (125I)-merket antigen i nærvær av en titreringsserie med umerket antigen,deretter fange bundet antigen med en anti-Fab-antistoffbelagt plate (Chen, et al., (1999) J.Mol Biol 293:865-881). For å etablere betingelser for analysen blir mikrotiterplater (Dynex)belagt over natten med 5 pig/ml med et innfangende anti-Fab-antistoff (Cappel Labs) i 50mM natriumkarbonat (pH 9,6) og deretter blokkert med 2 % (vekt/volum) bovint serum
albumin i PBS i to til fem timer ved romtemperatur (omtrent 23 °C). På en ikkeadsorberende plate (Nunc kat.# 269620) blir 100 pM eller 26 pM [125I]-antigen blandet medseriefortynninger av en Fab av interesse (f.eks. i overensstemmelse med vurderingen av et anti-VEGF-antistoff, Fab-12 i Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Fab'en avinteresse blir deretter inkubert over natt, men inkuberingen kan likevel fortsette i en lengre periode (f.eks. 65 timer) for å sikre at likevekt blir nådd. Deretter blir blandingene overført til innfangningsplaten for inkubering ved romtemperatur (f.eks. 1 time). Løsningen blir deretter fjernet og platen blir vasket åtte ganger med 0,1 % Tween-20 i PBS. Når platenehar tørket blir 150 jil/brønn med scintillasjonsmiddel (MicroScint-20, Packard) tilsatt, ogplaten blir talt på en Topcount-gammateller (Packard) i 10 min. Konsentrasjonene for hverFab som gir mindre enn eller lik 20 % maksimal binding blir valgt til anvendelse i kompetitive bindingsanalyser. Ifølge en annen utførelsesform blir Kd eller Kd-verdien måltved å benytte surface-plasmon-resonance-analyse ved å benytte en BIAcore™-2000 eller enBIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) ved 25°C med immobilisert antigen CM5brikker ved ca. 10 responsenheter (RU). Kort fortalt blir karboksymetylerte dekstranbiosensorbrikker (CM5, BIAcore Inc.) aktivert med N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidhydroklorid (EDC) og N-hydroksysuksinimid (NHS) ifølge produsentensinstruksjoner. Antigen blir fortynnet med 10 mM natriumacetat, pH 4,8 i 5 pig/ml (ca. 0,2 jliM) før injeksjon med en strømningshastighet på 5 jud/min for å oppnå omtrent 10 responsenheter (RU) med koblet protein. Etter injeksjonen av antigen blir 1 M etanolamin injisert for å blokkere ureagerte grupper. For kinetiske målinger blir to ganger seriefortynninger med Fab (0,78 nM til 500 nM injisert i PBS med 0,05 % Tween-20 (PBST) ved 25°C ved enstrømningshastighet på omtrent 25 jil/min. Assosiasjonshastigheter (kon) og dissosiasjonshastigheter (koff) blir beregnet ved å benytte en enkel én-til-én Langmuir-bindingsmodell(BIAcore Evaluation Software versjon 3.2) ved samtidig å tilpasse assosiasjons- ogdissosiasjonssensorgrammet. Likevektsdissosiasjonskonstanten (Kd) blir beregnet som forholdet kOff/kon. Se f.eks. Chem, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Hvis påhastigheten overskrider 106 M 1 S 1 ved hjelp av surface-plasmon-resonansanalysen ovenforkan på-hastigheten bli bestemt ved å benytte en fluorescensslukkingsteknikk som målerøkningen eller minskningen i fluorescensemisjonsintensitet (eksitasjon = 295 nm, emisjon = 340 nm, 16 nm båndpassering) ved 25°C for et 20 nM anti-antigenantistoff (Fab-form) iPBS, pH 7,2 i nærvær av økende konsentrasjoner av antigen som målt i et spektrometer, slik som et stoppstrømningsutstyrt spektrofotometer (Aviv Instruments) eller et 8000-serieSLM-Aminco-spektrofotometer (ThermoSpectronic) med en omrørt kyvette.
En "på-hastighet" eller "assosieringshastighet" eller "assosieringshastighet" eller"kon" ifølge denne oppfinnelsen kan også bli bestemt ved hjelp av den samme surfaceplasmon-resonansteknikken som er beskrevet ovenfor ved å benytte en BIAcore-2000 elleren BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) ved 25 °C med immobilisert antigen CM5brikker ved ca. 10 responsenheter (RU). Kort fortalt blir karboksymetylerte dekstran
biosensorbrikker (CM5, BIAcore Inc.) aktivert med N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidhydroklorid (EDC) og N-hydroksysuksinimid (NHS) ifølge produsentensinstruksjoner. Antigen blir fortynnet med 10 mM natriumacetat, pH 4,8 i 5 pig/ml (ca. 0,2 jliM) før injeksjon ved en strømningshastighet på 5 jud/min for å oppnå omtrent 10 responsenheter (RU) med koblet protein. Etterpå blir 1 M etanolamin injisert for å blokkere ureareagerte grupper. For kinetikkmålinger blir to ganger seriefortynninger av Fab (0,78 nM til 500 nM) injisert i PBS med 0,05 % Tween-20 (PBST) ved 25 °C med en strømningshastighet på omtrent 25 jil/min. Assosiasjonshastigheter (kon) og dissosiasjonshastigheter (koff) blir beregnet ved å benytte en enkel én-til-én Langmuir-bindingsmodell (BIAcoreEvaluation Software versjon 3.2) ved samtidig å tilpasse assosiasjons- og dissosiasjonssensorgrammet. Likevektdissosiasjonskonstanten (Kd) ble beregnet som forholdet kOff/kon. Se f.eks. Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Hvis på-hastigheten overskrider106 M 1 S 1 ved surface-plasmon-resonansanalysen ovenfor blir likevel på-hastighetenfortrinnsvis bestemt ved å benytte en fluorescenslukkingsteknikk som måler økningen eller minskningen i fluorescensemisjonsintensitet (eksitasjon = 295 nm, emisjon = 340 nm, 16 nm båndpassering) ved 25 °C for et 20 nM anti-antigenantistoff (Fab-form) i PBS, pH 7,2 inærvær av økende konsentrasjoner av antigen som målt i et spektrometer, slik som et stoppstrømningsutstyrt spektrofotometer (Aviv Instruments) eller en 8000-serie SLMAminco-spektrofotometer (ThermoSpectronic) med en omrørt kyvette. "Kd-verdien" eller"Kd" ifølge denne oppfinnelsen blir i én utførelsesform målt i en bindingsanalyse med radiomerket antigen (RIA) utført med Fab-versjonen av antistoffet og antigenmolekyler sombeskrevet av den følgende analysen som måler løsningsbindingsaffinitet for Fab'er for antigen ved å balansere Fab med en minimal konsentrasjon av (125I)-merket antigen inærvær av en titreringsserie med umerket antigen, deretter fange bundet antigen med en anti-Fab-antistoffbelagt plate (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). For å etablerebetingelser for analysen blir mikrotiterplater (Dynex) belagt over natt med 5 pig/ml med anti-Fab-innfangningsantistoff (Cappel Labs) i 50 mM natriumkarbonat (pH 9,6) og deretterblokkert med 2 % (vekt/volum) bovint serumalbumin i PBS i 2-5 timer ved romtemperatur(omtrent 23 °C). På en ikke-adsorberende plate (Nunc kat.# 269620) blir 100 pM eller 26pM [125I]-antigen blandet med seriefortynninger av en Fab av interesse (i overensstemmelsemed vurdering av et anti-VEGF-antistoff, Fab-12, i Presta et al., (1997) Cancer Res.
57:4593-4599). Fab av interesse ble deretter inkubert over natt, selv om inkuberingen kanfortsette i en lengre periode (f.eks. 65 timer) for å sikre at likevekt blir nådd. Deretter blir blandingene overført til innfangingsplaten for inkubering ved romtemperatur i 1 time. Løsningen ble deretter fjernet og platen blir vasket 8 timer med 0,1 % Tween-20 i PBS. Nårplatene har tørket blir 150 jil/brønn med scintillasjonsmiddel (MicroScint-20, Packard) tilsattog platene blir talt på en Topcount gammateller (Packard) i 10 min. Konsentrasjoner av hver Fab som gir mindre enn eller likt med 20 % av maksimal binding blir valgt til anvendelse i kompetitive bindingsanalyser. Ifølge en annen utførelsesform blir Kd eller Kd-verdien målt
ved å benytte surface-plasmon-resonansanalyse ved å benytte BIAcore™-2000 eller enBIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) ved 25°C med immobilisert antigen CM5brikke ved ca. 10 responsenheter (RU). Kort fortalt blir karboksymetylerte dekstranbiosensorbrikker (CM5, BIAcore Inc.) aktivert med N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidhydroklorid (EDC) og N-hydroksysuksinimid (NHS) ifølge produsentensinstruksjoner. Antigen ble fortynnet med 10 mM natriumacetat, pH 4,8 i 5 pig/ml (ca. 0,2 jliM) før injeksjon i en strømningshastighet på 5 jil/min. for å oppnå omtrent 10 responsenheter (RU) med koblet protein. Etter injeksjonen av antigen blir 1 M etanolamin injisert for å blokkere ureagerte grupper. For kinetikkmålinger blir to ganger seriefortynninger av Fab (0,78 nM til 500 nM) injisert i PBS med 0,05 % Tween-20 (PBST) ved 25°C ved enstrømningshastighet på omtrent 25 jil/min. Assosiasjonshastigheter (kon) og dissosiasjonshastigheter (koff) blir beregnet ved å benytte en enkel én-til-én Langmuir-bindingsmodell(BIAcore Evaluation Software versjon 3.2) ved samtidig å tilpasse assosiasjons- ogdissosiasjonssensorgrammet. Likevektsdissosiasjonskonstanten (Kd) blir beregnet som forholdet kOff/kon. Se f.eks. Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Hvis påhastigheten overskrider 106 M 1 S 1 ved hjelp av surface-plasmon-resonansanalysen ovenforkan på-hastigheten bli bestemt ved å benytte en fluorescensslukkingsteknikk som målerøkningen eller minskingen i fluorescensemisjonsintensitet (eksitasjon = 295 mm, emisjon = 340 nm, 16 nm båndpassering) ved 25 °C for et 20 nM anti-antigenantistoff (Fab-form) iPBS, pH 7,2 i nærvær av økende konsentrasjoner av antigen som målt i et spektrometer, slik som et stoppstrømningsutstyrsspektrofotometer (Aviv Instruments) eller en 8000-serieSLM-Aminco-spektrofotometer (ThermoSpectronic) med en omrørt kyvette.
I én utførelsesform blir en "på-hastighet" eller "assosiasjonshastighet" eller "kon"ifølge denne oppfinnelsen bestemt ved hjelp av den samme surface-plasmon-resonansteknikken som er beskrevet ovenfor ved å benytte en BIAcore™-2000 eller en BIAcore™3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) ved 25 °C med immobilisert antigen CM5-brikke vedca. 10 responsenheter (RU). Kort fortalt blir karboksymetylerte dekstranbiosensorbrikker (CM5, BIAcore Inc.) aktivert med N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydroklorid(EDC) og N-hydroksysuksinimid (NHS) ifølge produsentens instruksjoner. Antigen blirfortynnet med 10 mM natriumacetat, pH 4,8 i 5 pig/ml (ca. 0,2 jliM) før injeksjon i en strømningshastighet på 5 jil/min. for å oppnå omtrent 10 responsenheter (RU) med koblet protein. Deretter blir 1 M etanolamin injisert for å blokkere ureagerte grupper. For kinetikkmålinger blir to ganger seriefortynninger av Fab (0,78 nM til 500 nM) injisert i PBS med 0,05 % Tween-20 (PBST) ved 25°C ved en strømningshastighet på omtrent 25 jil/min.Assosiasjonshastigheter (kon) og dissosiasjonshastigheter (koff) blir beregnet ved å benytte en enkel én-til-én Langmuir-bindingsmodell (BIAcore Evaluation Software versjon 3.2) vedsamtidig å tilpasse assosiasjons- og dissosiasjonssensorgrammet. Likevektsdissosiasjonskonstanten (Kd) blir beregnet som forholdet kOff/kon. Se f.eks. Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Hvis på-hastigheten overskrider 106 M 1 S 1 ved surface-plasmon
34 resonansanalysen ovenfor kan likevel på-hastigheten fortrinnsvis bli bestemt ved å benytteen fluorescensslukkingsteknikk som måler økningen eller minskingen i fluorescensemisjonsintensitet (eksitasjon = 295 nm, emisjon = 340 nm, 16 nm båndpassering) ved 25 °C for et 20 nM anti-antigenantistoff (Fab-form) i PBS, pH 7,2 i nærvær av økendekonsentrasjoner av antigen som målt i et spektrometer, slik som et stoppstrømningsutstyrt spektrofotometer (Aviv Instruments) eller et 8000-serie SLM-Aminco spektrofotometer(ThermoSpectronic) med en omrørt kyvette.
Uttrykket "vesentlig redusert" eller "vesentlig forskjellig", slik det blir benyttet her, betegner en tilstrekkelig høy grad av forskjell mellom to nummeriske verdier (vanligvis én som er assosiert med et antistoff ifølge oppfinnelsen og den andre assosiert med et referanse/sammenligningsantistoff) slik at en fagperson på området vil anse forskjellen mellom de to verdiene å være av statistisk signifikans i konteksten av det biologiske karakteristikum som blir målt ved nevnte verdier (Kd-verdier, HAMA-respons). Forskjellenmellom nevnte to verdier er fortrinnsvis større enn omtrent 10 %, fortrinnsvis større enn omtrent 20 %, fortrinnsvis større enn omtrent 30 %, fortrinnsvis større enn omtrent 40 %, fortrinnsvis omtrent større enn omtrent 50 % som en funksjon av verdien for referanse/sammenligningsantistoffet.
"Prosentvis (%) aminosyresekvensidentitet" med hensyn på en peptid- ellerpolypeptidsekvens er definert som prosentandelen av aminosyrerester i en kandidatsekvens som er identiske med aminosyrerestene i den spesifikke peptid- eller polypeptidsekvensen,etter å ha sammenstilt sekvensene og introdusert åpningen, hvis det er nødvendig, for å oppnå den maksimale, prosentvise sekvensidentiteten, og uten å overveie eventuelle konservative substitusjoner som del av sekvensidentiteten. Sammenstilling for formål av å bestemme prosentvis aminosyresekvensidentitet kan bli oppnådd på ulike måter som ligger innenfor kunnskapen på fagområdet, for eksempel ved å benytte allment tilgjengelig dataprogramvare slik som BLAST, BLAST-2, ALIGN eller Megalign (DNASTAR)-programvare.Fagfolk på området kan bestemme passende parametere for å måle sammenstilling, inkludert enhver algoritme som er nødvendig for å oppnå maksimal sammenstilling over den fulle lengden av sekvensene som blir sammenlignet. For formål her blir likevel prosentvise aminosyresekvensidentitetsverdier generert ved å benytte sekvenssammenligningsdataprogrammet ALIGN-2, der den fullstendige kildekoden for ALIGN-2-programmet ertilveiebrakt i tabell A nedenfor. ALIGN-2-sekvenssammenligningsdataprogrammet bleskrevet av Genentech, Inc., og kildekoden som er vist i tabell A nedenfor har blitt innsatt med brukerdokumentasjon til the US Copyright Office, Washington D.C., 20559, der den er registrert under US Copyright Registration nr. TXU510087. ALIGN-2-programmet er allmenttilgjengelig via Genentech, Inc., South San Francisco, California eller kan bli kompilert fra kildekoden som er tilveiebrakt i fig. 8 ovenfor. ALIGN-2-programmet bør bli kompilert foranvendelse på et UNIX-operasjonssystem, fortrinnsvis digital UNIX 4.0D. Alle sekvenssammenligningsparametere er satt i ALIGN-2-programmet og varierer ikke.
I situasjoner der ALIGN-2 blir benyttet til aminosyresekvenssammenligninger blirden prosentvise aminosyresekvensidentiteten for en gitt aminosyresekvens A til, med eller mot enhver gitt aminosyresekvens B (som alternativt kan bli betegnet som en gitt aminosyresekvens A som har eller omfatter en viss, prosentvis aminosyresekvensidentitet til, med
5 eller mot en gitt aminosyresekvens B) beregnet som følger:
100 ganger fraksjon X/Y
der X er antall aminosyrerester som er verdiskåret som identiske matcher ved hjelp av
io sekvenssammenstillingsprogrammet ALIGN-2 i dette programmets sammenstilling av A ogB, og der Y er det totale antallet aminosyrerester i B. Det er på det rene at der lengden av aminosyresekvens A ikke er lik lengden til aminosyresekvens B så vil ikke den prosentvise aminosyresekvensidentiteten for A i forhold til B være lik den prosentvise aminosyresekvensidentiteten for B i forhold til A.
is Dersom ikke annet spesifikt er bemerket, er alle prosentvise aminosyresekvens
identitetsverdier som blir benyttet her fremskaffet som beskrevet i det umiddelbart påfølgende avsnittet ved å benytte ALIGN-2-dataprogrammet.
Tabell A
* C-C increased from 12 to 15
* Z is average of EQ
* B is a verage of ND
* match with stop is _M; stop-stop — 0:1 (joker) match = 0
#define_M -8 /* value of a match with a stop */
int _day[26][26] = {
/* ABCDEFGHIJKL M N O P Q R S T U V W X Y Z */ /* A */ {2} 0,-2,0,0,-4,11 - i»0,-1 ,-2,-1, OJtf, 1,0,-2, l, 1,0,0,-6,0,-3,0},/* B */ { 0, 3,-4,3,2,-5,0,1,-2.0,0,-3,-2,2,_M,-l, 1,0,0,0,0.-2.-5,0,-3,1|-,7* C */ {-2,-4,15,-5,~5,-4,-3,-3,-2,0,-5,-6,-5,4,Jtf,-3,-5,^, 0,-2,0»-2,-8,0,0,-5},/♦ D */ { 0, 3,-5,4, 3,-6,1,1 ,-2,0,0,-4,-3,2,>1,-1., 2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,2},/* E */ { 0,2,-5, 3,4,-5,0,1,-2,0,0,-3,-2,1,_M,-1 > 2,-1,0,0,0,-2»-7,0,-4,3}f/* F */ {-4,-5,-4,-6,-5,9,-5,-2» 1, 0,-5,2,0,-4^M,-5,-5,A-3,-3,0,-1,0» 0,7,-5}.,/* 6 »/ (1,0,-3» 1,0,-5,5,-2,-3,0,-2,-4,-3,0^M,-I,-l,-3,1,0,0,-1 »-7,0,-5,0},/* H */ {-1,1 ,-3,1, 1 ,-2,-2,6,-2,0,0,-2,-2, 2,_M, 0, 3,2,-1,-i,-0,-2,-3,0,0,2},/* I */ {-1 ,-2,-2,-2,-2, l,.-3,-2,5,0,-2,2, 2,-2,_M,-2,-2»-2,-1,0,0,4,-5, 0,-1 ,-2},
/* J */ { 0,0,0,0,0,0,0,0,0,0» 0,0,0,0,_M, 0,0,0, 0, 0,0, 0,0,0, 0,0},
/* K */ {-i, 0,-5, 0» 0,-5,-2,0,-2,0,5,-3,0,1 ,_M,-1,1, 3,0,0, 0,-2,-3,0,-4» 0}»/* L */ {-2,-3,-6,-4,-3,2,-4,-2,2,0,-3,6,4,-3JL_M,-3,-2,-3,-3,-l, 0,2,-2,0,-1 .,-2},/* M */ (-I,-2,-5,-3,-2,0,-3,-2,2,0,0,4, 6,-2,_M,-2,-l, 0}-2,-l, 0,2,-4,0,-2,-!},/* N */ {0,2,-4,2,1,-4,0, 2,-2,0,1,-3,.-2,2,_M,-1,1,6,1,0, 0,-2,A 0,-2» 1},/* O */ "
0, _M,_M»_M, JA-M ,
/» P »/ { l,-l,-3,-l »-1 ,-5,-1,0,-2,0,-1,-3,-2,-l.^M, 6, 0,0,1,0,0,-l,-6,0,-5,0},/* Q */ { 0,1,-5, 2, 2,-5,-1,3,-2,0,1,-2,-1,1,_M, 0,4,1,-1 f-l, 0,-2,-5,0,-4, 3},/* R {-2,0,-4,-1,-1 ,-4-3,2,-2,0, 3,-3,0,0,_M, 0,1,6,0,-1,0,-2,2,0,A 0},
/* S */ {1,0,0,0,0,-3,1,-1,-1,0,0,-3,-2,1,_M, 1,-1» 0,2, 1,0,-1,-2,0,-3,0},/* T */ {1» 0,-2» 0,0,-3,0,-1,0,0» 0,-1,-1,0,_M, 0,-1,-1» 1,3,0, 0,-5,0,-3,0},/* U */ {0,0,0,0,0,0,0,0» 0,0,0, 0,0,0,_M, 0,0,0,0,0,0,0,0, 0,0, 0}s /*¥*/ { 0,-2,-2,-2»-2,-l,-l,-2,4, 0,-2, 2, 2,-2,_M,-l,-2,-2,-l» 0,0, 4,-6,0,-2,-2},
W */ {-6,-5,-8,-7,-7,0,-7,-3,-5,0,-3?-2,-4,-4,_M,-6,-5,2,-2,-5,0,-6,17,0,0,-6},/* X ♦/ { 0,0, 0,0,0,0,0, 0,0,0,0,0,0,0,_M, 0,0» 0,0,0,0,0,0,0,0,0},
/* Y */ {-3,-3, 0,-4,-4,7,-5,0,-1,0,-4,-I,-2,-2,_M0,-2,0,0,10,-4},/* Z */ { 0,1,-5,2,3,-5, 0, 2,-2,0,0,-2,-l, 1,_M, 0,3,0,0,0,0,-2,-6,0,-4,4}
Sindude <stdio.h>
-toelude <ctype.h>
sdeftoe MAXJMP
/* max jumps in a diag */
#defmeMAXGAP
don*t continue to penalize gaps larger than this */
Sdefine JMPS
1024
f* max jmps in an path */
«defineMX
/* save if there’s at least: MX-1 bases since last jmp *
SdefiaeDMAT
/* vakie of matching bases */
#defineDMIS
/* penalty for inismatched bases */
SdefineDINSO
/* penalty for a gap
ådefineDINSl
/* penalty per base */
SdefinePINSO
S
/* peualty for a gap */
#derwePINSl ,
Z* penaltyperresidue */
stract jmp {
short nfMAXIMP]; /* size of jmp (neg for dely) */
imsigned short x[MAXJMPJ; /* base no. of jmp in seq x */
/* liniits seq to 2A16 -1 */
struct diag {
int
score;
/* score at last jmp *7
tong
offset;
/* offset of prev block *.
sbørt
ijmp*
curreni jmp Index */
struct jmp
jp;
/* list of jmps */
stnict path {
int spe;
sliort nfJMPSJ;
int x[JMPSJ;
number of leading spaces
size of jmp (gap) */
toe of jmp (last elein before gap) */
ehar
*ofile;
/* output file nåme- */
char
*namex[2];
Z* seq names: getseqsO */
char
*prog:
/* prog name for en msgs */
ehar
*seqx[2];
/* seqs: getseqsO */
int
dmax;
/* best diag: nwQ
int
draaxO;
/* final diag */
tat
dna;
/* set if dna: mainØ */
tat
endgaps;
/* set if penalizing end gaps *
tat
gapx, gapy;
/* total gaps in seqs *Z
tat
lenO, lenl;
Z* seq lens */
tat
ngapx,ngapy;
Z* total size of gaps *Z
tat
smax;
Z* max score: nwØ *Z
tat
*xbm;
Z* bitmap for matching */
tong
offset:
/* cunent offset in jmp file */
strået diag
Mx;
/* holds diagonale */
strået path
pp[2]j
Z* holds path for seqs */
ehar
*calloc(), *malløc(X *tadex(), *strcpy();
ehar
^getseqO. *g_calloc();
/* Needleman-Wunsch aligmnent program
*
* usage: progs filel file2
* where filel and file2 are two dua or two protein sequences.
* The sequences can be in upper- or iower-case an may contain ambiguity
* Any lines beginning with ’>’ or are ignored
* Max file length is 65535 (limited by unsigned short x in the jmp struct)
* A sequence wifh 1Z3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA
* Output is in the file "aiign-out"
* Tire program may ereate a tmp file ln /tinp to hold info aboiit traceback.
* Original version developed under BSD 4,3 on a vax 8650
#mdude "nw.h"
jfinclude "day.h"
sfatie _dbva1[26]={
1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0
}; '
stade _pbval[26] = {
1, 2|(1«(T)VA^|(1«(^W)), 4,8, 16,32,64,
128,256, OxFFFFFEF, l«10,1«11,1«12,1«13,1«14,
i«15, 1«16, 1«I7,1«18, I«19, l«20, l«21, 1«22,
1«23, l«24,
mam(ac, av) . . . .niain
int ac; char *av[J; { . prog = av[OJ; if (ac != 3) { fpræif(8tderr."ii8age: %s filel fi1e2\n!t, prog); fprintf(stde!T,"where filel and file2 are two dna or two protein sequences.W’); fprintfitsiderr/The sequences can be in upper- or lower-caseW5);fprintflstderr,’'Any lines begsnning withor '<' are ignoredlti1'); lpriatfi(stden?,"Output is in the file exitfl); namexfOj = av[.l]; namesfl] = av[2]; seqx[0] = getseq(uamex[0], &len0); seqxfl] - getseq(naniex[l],.&lenl);xbm = (dna)? _dbval: pbval; endgaps - 0; /* l to penalize endgaps */
ofile = "align.out"; /* output file */
nw(); /■* f ill in ihe matris, get the possibk mips */
readjmpsC): /* get the actual jmps */ prinrø; f* pnnt stats, alignment *
cleanup(O): /* uulint asy tmp files */
/* do the alignmcnt, retum best score; rnainO
* dna: values in Fiteh and Smith, PNAS. 80, 1382-i 386, i 983
* pro: PAM 250 values
* When scores are equaL we prefcr misaiatches to any gap, prefer
* a new gap te exteiiding an ongoing gap. and prefer a gap in seqx
* to a gap in seq y.
tr-vø ., „ .. , _—ns>
’ ...
eltar *px. *py; /* seqs and ptrs */'
hit *ndely, *dely; /* keep track of dely■*/
int ndeix. delx; /* keep track of dd x */
int *taip; /* for styappingrowO.roxvl ■*/
iar mis; /* sedre for each type */
int ins0, insl: f* inseriioii;pcnalties */ ,
register id; /* diagonal itidex
register ij; /* jmp Index */
register *co!0, *coll; /* score for curr, last row */
register xx, yy; /* index inta seqs
rix - (stract diag *)g_calloc(::to get diags", IcnO-Hcnl s 1, sizeoffstruet diag));
nddy = {int callocfto get ndely", lenl-M, sueof(iat));
dely = (int *)g_calloc("to get dely", len 5+1, size-offini));
coiO = (int *)g cal1oc("to geicolO", lenl+l, sizeoffmt));
col I ~ (int *)g_ca! Ioc("io get col I", len 141. sizeof(Int));
InsO = (dna); DINSO : PINSO;
insl = (daa)? D1NS1 : PINS1;
smax = -10000;
if (endgaps) {
for (coIOfO] = dely[0] = -insO, yy = .1; yy <= lenl; yyH-) {colOfyy] = delyfyy] = coI0[yy-l] - insl;
ndelyfyy] = yy;
col0[0] = 0; /* Watennan Bull Math Biol 84 */
else
for (yy - 1; yy <= lenl; >7^)
<tely[yy] = -insO;
/* fill in match inatrix
f
for (px - seqx[0]. xx - 1; xx <= len.0; px-H-, xx-H-) {
/* initialize first' entry in col
4* /
t
if (endgaps) {
if(xx=l)
coil [0] ~ delx = -(insO+iiisl);
else
coil [0] = delx = col0[0] - insl;
ndelx = xx;
else { '
co11[0] = 0;
delx = -insO;
ndelx = 0;
. ....—.——...nw
for (py - seqx[l], yy = I: yy <= lenl; pyt-*,yy++) {
mis = colO[yy-l];
if (dna)
mis •*- (xbm[*px-,A,]&xbm[*py-‘A,J)? DMAT : DMIS:else
mis -r= _dayppx-Wlf^py-W];
/* update penalty for del in :< seq;
* favor new dei over ongong del
* ignore MAXGAP if weighting endgaps
if (endgaps |i nde1y[yy] < MAXGAP) {
if (colOfyyj - insO >= delyfyy]) {
dely[yy] =colO[yy] - (insO-rinsl);
rtdely[yy] = 1;
> else { dely[yy] insl;
nde1y[yy]-H-;
) else {
if (colO[y7j - (insO-Hnsl) >= dely[yyj) {dely[yy] = caiOfyy] - (insO-Hnsl):ndelyfyy] = i;
} else
ndely[yy]-H-:
/* update penalty for dei in y seq;
* favor new del over ongong del
if (endgaps | ndeix < MAXGAP) {
if (col 1 [yy-1] - insO >= delx) {
delx = col 1 [yy-1 ] - (insO-Hns l);
ndelx=1;
} élsé {
delx -= insl;
ndelx-H-;
} else {
if (col 1 [yy-1) - (insO-Hnsi) >= delx) {
delx = coil[yy-i ] - (iostH-insI);
ndelx= i;
} else
ndelx++:
/* pick the maximum score; weVe favoring
4 mis over any del and delx over dely
. . . ., ..---. ...nw id - xx - yy 4- len 1 - 1;
if (mis >= delx && mis >= delytyy])
collfyy] == mis:
else if (delx >= delyfyy]) {
coil [yy] = delx;
ij - dxfidJ.ijmp;
if (dx[id].jp.n[0] && (*dna || (ndelx >-.MAXJMP
&& xx > dx(id].jp.x.[ij]"r.MX) | mis > dx[id].scoiei-DINSO)) {dxj’id].ijnip-:-i-:
if (i r-j >= MAXJMP) { "
svTitejmpsfid);
ij = dx[id].ijmp==CJ;
dx[id].offset = offset;
offset 4= sizefjf(sfetiet jaip) + sixeoffoffket);
}
dx[id].jp.n[ij ] = ndelx;
dx[id].ip.x[ij] = xx;
dx[id].score - delx;
else {
coll[yy] = delyfyy];
ij = dxfidJJjmp;
if(dx[id].jp.ii[O] && (Mna || (ndely[yy] >= MAXJMP
&& xx > dxfid] jp.x[ij]+MX) || mis > dx[id].score+DINSO)) { dxfidj.ympw-;
writejmps(id);
ij = dx[id].ynip = 0;
dx[id] .offset - offset;
offset +« sizeoffstraet jmp) -r sizeaf(offset);
}
dx[id].jpji[ij] = -ndelyfyy];
dx[id].jp.x[ij] = xx;
dx[id].score - delyfyyj;
if (xx = lenO && yy < lenl) {
/* last col
*/
ff (endgaps)
coU[yy] -= insO*insI*(fcni-yy);
if (coil [yy] > smax) { smax — collfyy]; dnrax = id;
if (endgaps && xx < lenO)
coll[yy-l] -= insWnsl*(lenO-xx);
if (coll[yy- i] > smax) {
smax = col l [yy-1 ];
dmax = id;
tmp = colO; colO = coil; coil = tmp;
(yoid) free((char *)ndely):
(void) free((char *)dely);
(void) iree((char *)colø);
(void) free((char *)coll);
* print() — only routme visible oulsicie this module
*
* static:
* getmaif) - ■ trace back best path, cotini. matchcs: print(}
* pr alignO — print alignment of described in array p[]: print()
* dumpblockØ - dump a block of lines with mjmbers. stars: pr_alignØ
* numsø — put om a numbsr Hne: drnnpblockØ
* putiineQ — pm out a line (name, [num], seq, [num]): dumpblockØ
* starsØ - -put a line of stars: dumpblockØ
* stnpnameø — stri p any path and preiix fem a seqname
Smciudé "nw ,h"
^define SPC 3
fdefhéT J-IblE 256 /* iDaximum output line */
Sdefine P_SPC 3 /* space between tiame or num and seq */
extern _day[26]I26];
cien- /* set output Ifae feigth.*/
FILE *Ix; /* output Ille */
pnntQ ... .. . —---priiit
{
iftt lx, ly. firsigap, lustgap; f* overlap */
if ((lx ~ fopenfofile, == 0) {
ipnntt'(stderr.!‘%s: carft vmle %s\n", prog. ofile): cleanupø);
fprintflfx, "<Hrst sequenee: %s (iength = %d)m". namex[0]t ienO):
forintf(ix; '’<second sequence: %s (lenglh = %d)\n", namexfl], lenl);
alen = 60;
lx ~ lenO;
ly = lenl;
firstgap =■ lastgap = 0:
if (dmax < lenl • I ) { /* leading gap in x */
pp[O].spc = firstgap = lenl. - dmax -1;
ly -== pp[O].spc;
}
else if (dmax > lenl - 1) { /* leading gap in y */
pp[l].spc = firstgap - dmax - (lenl - 1);
lx -= pp[l].spc;
}
if (dmaxO < lenO -1) { /* trailmg gap in x */
lastgap = lenO - dmaxO -1;
lx -= lastgap;
else if (dmaxO > lenO -1) { /* trailing gap in y */
lastgap = draaxO - (lenO - 1);
ly -= lastgap; .
}
getmai(lx. ly, firstgap, lastgap);
pr_align();
* trace back the best path, eount matches
static
getmat(lx, ly, firstgap, lastgap) . . . -—-getmat
int lx, ly; f* "core" (minus endgaps) */
int firstgap, lastgap; Z* leading trailing overlap */
int nm, iO, il, sizO, sizl;
char ouix[32];
double pct;
register nO, nl;
register ehar *p0, *pl;
/* get total matches, score
iØ = f 1 = sizO = sizl = 0:
pO = seqx[OI + pp[l],spc;
pl = seqx[ll + ppfOJ.spc;
nø = pp[I].spc + I;
nl = pp[O].spc + l;
nm = 0:
wbile ( *p0 && *pl ) {
if (sizO) {
pm;
nl-r-r;
sizO--:
}
else if (sizl) {
pØ-M-;
sizl—;
else {
ifCxMV^AI&xbmrM-A’])
nmt-'-;
if (ntm = pp[O] „x[iOJ)
sizO = pp[0].n[i£H"4-];
if (nm==pp[l].x[ilj)
sizl = pp[i].n[:il-*~^];
pO-r+;
pl-i-4-;
/* pct homology:
* if penalizing endgaps. base is the shorter seq
* else, knock off overhangs and take shorter core
*/
if (endgaps)
lx = (lenO < len 1)? lenO : lenl:
else
lx = (lx < ly)? lx : ty;
pct = 100.* (doabfe)nm./(doubié)lx;
fprintf(fxs "kn'’)'
fprintf(fkf ’'<%(! rnateh%s in an overlap of %d: %.2fpercent similaritykn", nm, (nm = 1)? : "esty lx, pct);
fprintf(ix, "<gaps in first sequence: %d", gapx); ——-...getmat
if (gapx) {
(vold) sprintf(outx,55 (%d %s%s)"?
ngapx, (dna)? "base^Yesidue", (ngapx = 1)?
fprintfffx/^Bs", outx);
fprintfCfx,", gaps in second sequence: %d\ gapy);
if (gapy) {
(void) sprinttyoutx," (%d %s%s)",
ngapy. (dna)? "base":"residue", (ngapy ~ 1)? n":,ss");
fprint^fity^s", outx);
if (dna)
fprintiffk,
"kiKscore: %d (match - %d, mismatch = %d, gap penalty - %d 4- %d per baséfm",
smax, DM AT, DMIS, DINS0t DINS1); else
fprintf(fxt
"kn<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penalty = %d + %d per residue)W!, smax, PINSO, PINSI);
if (endgaps)
fprintfCfx,
"<endgaps penatized. teft endgap: %d %s%s? right endgap; %d %s%sW’, firstgap, (dna)? "base" : "residue*, (firstgap = 1)? : "s", lastgap, (dna)? "base" : "residue", (lastgap = 1)? ; "§**);
else
fprmtf(fe, ‘*<etidgaps notpenalized\n");
}
statie
nm; /* matches in core — for checking */
statie
imax; /* lengths of stripped file names *?
static
ij [2 j; /* jmp index for a path */
statie
nc[21; /* number at start of current line */
slatic
ni [2J; /* current elem number — for gapping
statie
siz[2];
statie char
*ps[2j; /* ptr to current element ♦/
statie char
*po[2J; /* pir to next output diar slot */
statie char
out[2][P_LINE]; /* output line */
statie char
star[P__LINE]: /* set by starsQ */
*
* print alignmeni of descnbed in struct path pp[]
stafie
pr alignØ . . . . . ...■prjilign
{
lut nn; /* char count */
int more; *
register i; .
for (i ~ 0, Imax — Q; i < 2; i-H-) {nn = stripname(namex[i]);
if (nn > Imax)
Imax = nn;
ncfi] "■ 1;
nifi] = 1;
S!z[i] = ij[i] = 0;
ps[i] - seqxfi];
po[j] — ouj[i]:
for (im = nm = 0: more = i; more; ) f ....pr align
for (i = more - 0: i < 2; i+ -) { ,
* do we have more of this sequenee?
ifCWD .
continae;
more44-;
if (ppfi] spe) { /* leading space */
pp[ij.spc--;
}
else if (siz[i]) { lx in a gap */
*po[i]
}
else { Z* we*re putting a seq element
*po[i] =
if (islower(*ps[i]))
*ps[i] = toupperPps[ij);
ps[i]
* are we at next gap for this seq?
if fiiifi] = {
* we neéd to merge all gaps
* at this locatidn
sizfi j =
while (ni[j] = pp[ i j.x[ij[i]]) siz[il -5-= pp[i].n[ij[t] s * ];
}
ni
if f-K-nn =~ oien 8 .'more && nn) {duæpb'iock();
fur (i = 0: i < 2; i-H-)po[i] = outfil;
mi - 0;
* dump a bloek of lines, ineluding minsbers, stars: pr_alignØ
static
durnpbiockf) „ . .;-—dumpbloek
register i;
for (i ~ 0: i < 2; i i >) *popl--^s;
...tlimipbloek
(void) pirtcp.n'. tx);
for ti = 0; i < 2: i-t-B {
if (*out[}J && (*out[i] !=’ ’ | *(pQ[f}) l=1')) { if (i == 0)
■numsfi):
if (i =f= 0 && *out[ 1 ])
starsQ;
putlinefi);
if (i = 0 *:&
fprintfffx, star);
if(i= I)
nurns(i);
* put out a number line: dumpbloekø
statie
numsfix) uums
int lx; /* index in out[] holding seq line */
char Bline[P_LINE];
register i,j;
register char *pnJ *px. *py;
for (pn = nline. i = 0; i < lmax+P_SPC; i++, pn-H-)
*pn =
for (i = acfix], py = out[ix]; *py; py++> pn-H-) {
if (*py = " p *py =
*ptl = > ’•
else {
If (i%10 = 01| (i = 1 && nc[ix] ’= 1)) { j = (i. < 0)? -i ; i :
for (px = pn; j; j /= 10, px-)
*px — j%I0 -P ‘0’;
if (i < 0)
*px =
}
else
*pn ='
i++;
*pn = V)5;
nc[ix] = i:
for (pn = nHne; *pn; pn-JH-)
(vofd) purcCpn, fx);
(void) putc(An\ fx):
}
* pui out a line (name, [num], seq. [num]): dumphiockO
statk
putlinefLx) ---putime
int ix: {
. ... .........putlme lat i:
register ehsr *px;
' fer (px =nan:ex[ix]T i ~ 0: *px && '"px != px+-K i+4-)
(vaki) pi>tc(*px, fx);
for ('. i < imax-; P_SPC: H+)(veid) putcf fx);
Z* thcse count fipm i:
* ni[] is current element (frum I) ' '
* nc[J is tiumber at start of current line .
for (pv = outfix]; *px; px+-r)
(voklj putc(*px&0x71-, fx);
(vold; putc(r'jn’, &);
* pur a iine of stars (seqs aiwavs in out[0], out[ I]); dumpblockø
■■
static
srarsQ ... ...stars
int i;
register char *pO. *pl, cx. *px:
jf (J*oui[0] ;i t/autrO] ~ ’1 && *(po(0]j — ‘') ii
• *out[1] p (*out[l] = *'&&. K(pani) ™ '')) retiira;
px = star;
før (i = lmax-t-P_SPC; i; i--)
*px^ = "
fer (pO = outfO], pl - out[] ]; *p0 && *pl; pO-H-, pl-H-) {if (isaIpha(*pO) && isalpha(*pl)) {
if (xbEn[*pO-'A'l&xbm[*pl-W]) {
cx =
nm-H-j
else if (!dna&& _da\ [*pO~<A'][*pl-'Ac{ > 0)ex = 7;
else
' cx-":
}
else
cx - 1 *;
*px;"r = cx;
}
*px-xA~\n’;
*px - M)*;
z*
* strip path or prefix from pn. return len: pr_align()
*/
stade
stripnamefan). —--stripname
char *pn; /* file name (may be path) */ {
register ehar *px, *py;
py = O;
for (px = pn; *px; px++)
if (*px — ’/')
py = px + l;
if (py)
(void) strcpyfpn, py); return(strlea(pn));
* cleanupO — clcanup any tmp file
* getseqtj — read in seq, xet dna, lenf maxlen
* g_callocØ — cailocØ with error checkin
* readjmpsØ — get the good jmps, from tap file if nccessary
* writejmpsQ -- write a filled array of jmps to a imp file: nwQ
#iadude "nw.h"
#in£lude <sys/file.h>
char *jname ~ "/tapzhomgXXXXXX": f* tmp file for jmps *7
FILE *fi;
tnt cleanupO; /* cleanup tap file *?
long lseek();
* remove any tnip file if we blow
cleanupfi) . . .. . .cleanup
hit i;
(yoid) unlinkfjname);
exitfi);
}
* rc ad, retum pir to seg, set dna( len, maxlen
* skip lines starting with or
* seg in upper or lower case
ehar *
getseq(file, len) ——gefseq
/* file nåme */
/* seq len */
Iine[l024]J *pseq;
*px»*py;
natgc, tien;
*fp;
char *file;
mf *len:
char
register ehar
int
FILE
if ((fp - fopen(fiie,"r")) === 0) {
fprintf(stderr('’%s: caift read prog, file); exit(l);
ilen - natgc ~ 0;
whiie (tgetsfline, 1024, fp)) {
if (*Iine = || *line — ’<’ || *Iine ~ ’>’) eoiitinne;
for (px = line; *px != W; px-H-)
If (isupper(*px) || islower(*px))
tten-H-; ■
if ((pseq = malloc{.(unsigned)(tlen-t-6)j) = 0) {
fprintfCstden/^és: maiiOoQ failed to gei %d bytes for %sn". prog. den-f-6. fiexit(l);
pseq[0] = pseq[l] = pseq[2j = pseqpl = \0';
-...geiseq
py = pscq.+4;
*icn = tien;
rewind(fb);
whiie (tgetsfline. 1024, fp)) {
jf (*line = V i| *line = '<■' ii *Hne ~<>i) contlmitq
for (px = line; *px. .'= In*; px-H-) {
if (isupperf^px))
*py^- = *px;
else if (isk>vver(*px)j
*py4-i- = touppei(*px);
if (index("ATGCT i V(py-1)))natgc-w-;
}
*py i ! = \O';
■ py ~ ''47;
(void) fclose(fp);
dna — natgc > (tien/3);
reiarn(pseq+4);
ehar *
g_ealloc(msg, nx, sz):
diar ^msg; /* program, calling routine */
-gjcalloc
int nx5 sz; number aad.size ofslemente */
char *px5 *calloc();
jf ((px " caIloc((uEsigned)nx. (unsigned)sz)) :== C>) {
if (*'msg) {
fprintf(stdm’f "%s: g_calltx-0 failed %s (n=%(L sz=%d)\n,,f progf msg, nx.
ri? i:
exii(l):
} •
ixturiXpx):
}
* get final jmps from dxi] or ide. set pp[]. reset dniax: mam()
W : ■ ■
readimPM'} . -readjraps
iiit fd • -i;
int siz, iO, il:
register i.j,xx;
if © {
(vold) fclose(fj);
if ((fd = openønante, O R.DONLY, 0)1 < 9) { ibi-intf{stdeiT. *'%s: ean’i øpenf) %s\n", prog. jname);cleanup(l);
}
for (i = i(i = 31—0, dmaxO =: dmax, x:< ~ lenO;; i-s-r) {
whiie (i) {
for (i = dx|dmaxj.ijnip; j >~ 0 && dxfdmaxj.jp.xfj) >= xx;
if (j < 0 &&. dx[dniax].offset && fi) {
(void) lseek(fd, dxfdmax].offset, 0);
(vold) read(fd, («har *)&dx(diaaxj.jpt sUeoffstruet jmp));
(void) readffd, (char *)&dx[djnax].ofiset5 sizeof(dx[diTiax],oiTset));
dx[dmax].ijmp = MAXJMP-1;
I
else
break;
}
if (i>= JMPS) {
fprintfCstderr, ,1%s: too many gaps in alignmenftn", prog);
cleanup(l);
}
if 0>= 0) {
siz=dx[dmax].jp.n[j];
xx - dx[drnax].jp.x[i];
dmax += siz;
if (siz: < 0) { /* gap in second seq */
pp[i].ii[il] - -siz;
xx siz;
/* id - xx - yy + lenl -1
pp[l].x[iI] = xx - dmax lenl -1;
gapy^.
ngapy -= siz;
/* ignore MAXGAP when doing endgaps ♦/
siz - (-siz < MAXGAP || endgaps)? -siz: MAXGAP;
il-H-; ' '
else if (siz > 0) { /* gap in first seq */
pp[0].n[i0] = siz;
Pp[0] .x[iO] = xx:
gapX-H-;
ngapx += siz;
/* ignore MAXGAP when. doing endgaps */
siz - (siz < MAXGAP endgaps)? siz : MAXGAP;
iO-H-;
}
else
break;
!* reverse the order nfjnips
for (j = 0, i0- ■; i < i0: j+ h iO-) (
i - pp[O].n[j]; PP[0]-nO] = pp[O].»[iOj; pp[0].if[i01 - i;
i = pp[O].x[j]; pp[O].x[j] -pp[0].x[i0j; pp[0].x[i0] = i;
ibr (j = 0, i! j < i 1; j-H-, i i --) {
i =;pp[i].n[j]; ppflJ.nOJ -pp[l].n[ilj; pp[I]-B[il] = i;
i = PP[l].x[j]: PP[1 Kil = pp[ 1 pp[l].x[il ] = i;
}
if (fd >= 0)
(votd) Giose(fd);
(yoid) uriHnkt jname);
5 = 0;
cffsev = 0;
1 I
' wnte a tiikdjmp struct otlset of the prev one (if any): nw()
Titejmps(ix)„. .. . ■ ..... j-—write|mps
int ix; char *niktempØ; if (Hj> {
if (niktemptjoarne) < 0) {
iprinif(stderr? <,%s: can‘t mktempO %sW. prog, jname);
cleariup(i);
if ((fj = fopenønaine, "w")) == 0) {
fprintflstderr, "%s: can’t wite %s\n", progt jname);
(vold) ftvT!te((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1, fj);
(vøid) fwrite((ehar *)&dx[ix].oHset, sizeof(dx[ix].offset), 1, i]);
Uttrykket "vektor" slik det blir benyttet her er ment å skulle referere til et nukleinsyremolekyl som er i stand til å transportere en annen nukleinsyre som den har blitt koblet til. En type vektor er et "plasmid" som refererer til en sirkulær, dobbelttrådet DNA-løkke påhvilken ytterligere DNA-segmenter kan bli ligert. En annen type vektor er en bakteriofagvektor. En annen type vektor er en virusvektor, der ytterligere DNA-segmenter kan bli ligerttil virusgenomet. Visse vektorer er i stand til å utføre autonom replikasjon i en vertscelle som de har blitt introdusert inn i (f.eks. bakterievektorer som har et replikasjonsorigo fra bakterier og episomale pattedyrvektorer). Andre vektorer (f.eks. ikke-episomale pattedyrvektorer) kan bli integrert inni genomet til en vertscelle ved introduksjon inn i vertscellen, og replikerer derved sammen med vertsgenomet. Visse vektorer er videre i stand til å styre ekspresjonen av gener som de er opererbart bundet til. Slike vektorer blir her referert til som "rekombinante ekspresjonsvektorer" (eller ganske enkelt "rekombinante vektorer"). Vanligvis foreligger ekspresjonsvektorer som kan benyttes i rekombinante DNA-teknikkerofte i form av plasmider. I foreliggende oppfinnelse kan "plasmid" og "vektor" bli benyttet om hverandre siden plasmidet er den mest vanlig benyttede formen for vektor.
"Polynukleotid" eller "nukleinsyre", slik de blir benyttet om hverandre her, refererer til polymerer av nukleotider med enhver lengde og inkluderer DNA og RNA. Nukleotidene kan være deoksyribonukleotider, ribonukleotider, modifiserte nukleotider eller baser og/eller deres analoger, eller et hvilket som helst substrat som kan bli inkorporert i en polymer ved hjelp av DNA- eller RNA-polymerase, eller ved hjelp av en syntetisk reaksjon. Et polynukleotid kan omfatte modifiserte nukleotider, slik som metylerte nukleotider og deres analoger. Hvis de er til stede kan modifiseringer av nukleotidstrukturen bli innført før eller etter sammensetning av polymeren. Sekvensene av nukleotider kan være avbrutt av ikkenukleotidkomponenter. Et polynukleotid kan ytterligere bli modifisert etter syntese, slik som ved konjugering med et merke. Andre typer av modifiseringer inkluderer for eksempel "caps", substitusjon av én eller flere av de naturlig forekommende nukleotidene med en analog, internukleotidmodifisering slik som for eksempel, de med uladede bindinger (f.eks. metylfosfonater, fosfotriestere, fosfoamidater, karbamater, osv.) og med ladede bindinger (f.eks. fosforotioater, fosforoditioater, osv.), de som inneholder vedhengende enheter, slik som for eksempel proteiner (f.eks. nukleaser, toksiner, antistoffer, signalpeptider, ply-L
lysin, osv.), de med interkalatorer (f.eks. akridin, psoralen, osv.), de som inneholder gelatorer (f.eks. metaller, radioaktive metaller, bor, oksidative metaller, osv.), de som inneholder alkylatorer, de med modifiserte bindinger (f.eks. alfaanomere nukleinsyrer, osv.), i tillegg til ikke-modifiserte former av polynukleotidene. Enhver av hydroksylgruppene somordinært foreligger på sukkertypene kan videre bli erstattet for eksempel med fosfonatgrupper, fosfatgrupper, beskyttet av standard beskyttelsesgrupper, eller aktivert for å lage ytterligere bindinger til ytterligere nukleotider, eller kan være konjugert til faste eller halvfaste bærere. Den 5'og 3'terminale OH kan være fosforylert eller substituert med aminer eller organiske cappinggruppeenheter på fra 1-20 karbonatomer. Andre hydroksylerkan også være derivatiserte til standard beskyttelsesgrupper. Polynukleotider kan også inneholde analoge former av ribose eller deoksyribosesukkertyper som generelt er kjent på fagområdet, inkludert for eksempel 2'-O-metyl-, 2'-O-allyl, 2'-fluor- eller 2'-azidoribose,karbosyklisk sukkeranaloger, alfa-anomere sukkertyper, epimere sukkertyper slik somarabinose, xyloser eller lyksoser, pyranosesukre, furanosesukre, sedoheptuloser, asykliske analoger og abasiske nukleosidanaloger slik som metylribosid. Én eller flere fosfodiesterbindinger kan bli erstattet med alternative linkergrupper. Disse alternative linkergruppene inkluderer utførelsesformer der fosfat blir erstattet av P(O)S("tioat"), P(S)S ("ditioat"), "(O)NR.sub.2 ("amidat"), P(O)R, P(O)OR', CO eller CH.sub.2 ("formacetal"), der hver R eller R' uavhengig er H eller substituert eller ikke-substituert alkyl (1-20 C.) eventueltinneholdende en eter(-O-)-binding, aryl, alkenyl, sykloalkyl, sykloalkenyl eller araldyl. Ikkealle bindinger i et polynukleotid trenger å være identiske. Den foregående beskrivelsen gjelder alle polynukleotider som er referert til her, inkludert RNA og DNA.
"Oligonukleotid", slik det blir benyttet her, refererer vanligvis til korte, vanligvis enkelttrådede, vanligvis syntetiske polynukleotider som vanligvis, men ikke nødvendigvis, er på mindre enn omtrent 200 nukleotider i lengde. Uttrykkene "oligonukleotid" og "polynukleotid" er ikke gjensidig utelukkende. Beskrivelsen ovenfor for polynukleotider er like og full anvendelig for oligonukleotider.
Uttrykkene "antistoff" og "immunglobulin" blir benyttet om hverandre i sin bredeste betydning og inkluderer monoklonale antistoffer (for eksempel fullengde eller intakte monoklonale antistoffer), polyklonale antistoffer, multivalente antistoffer, multi-spesifikkeantistoffer (f.eks. bispesifikke antistoffer så lenge de oppviser den ønskede, biologiske aktiviteten) og kan også inkludere visse antistoff-fragmenter (som beskrevet i større detaljher). Et antistoff kan være humant, humanisert og/eller affinitetsmodnet.
"Antistoff-fragmenter" omfatter kun en del av et intakt antistoff, der delenfortrinnsvis opprettholder minst én, fortrinnsvis de fleste eller alle, av funksjonene som normalt er assosiert med denne delen når den foreligger på et intakt antistoff. I én utførelsesform omfatter et antistoff-fragment et antigenbindingssete fra det intakteantistoffet og opprettholder slik evnen til å binde antigen. I en annen utførelsesform opprettholder et antistoff-fragment, f.eks. et som omfatter Fc-regionen, minst én av de
biologiske funksjonene som normalt er assosiert med Fc-regionen når den foreligger på etintakt antistoff, slik som FcRn-binding, antistoffhalveringstidmodulering, ADCC-funksjon ogkomplementbinding. I én utførelsesform er et antistoff-fragment et monovalent antistoffsom har en halveringstid in vivo som vesentlig er lik den for et intakt antistoff. Et slikt antistoff-fragment kan for eksempel omfatte en antigenbindende arm koblet til en Fcsekvens som er i stand til å overføre in vivo-stabilitet til fragmentet.
Uttrykket "monoklonalt antistoff" refererer slik det blir benyttet her til et antistoff som er fremskaffet fra en populasjon av vesentlig homogene antistoffer, dvs. at de individuelle antistoffene som utgjør populasjonen er identiske bortsett fra mulige, naturlig forekommende mutasjoner som kan foreligge i mindre mengder. Monoklonale antistoffer er svært spesifikke, i det de er rettet mot et enkelt antigen. I motsetning til polyklonale antistoffsammensetninger som typisk inkluderer ulike antistoffer som er rettet mot ulike determinanter (epitoper) så er videre hvert monoklonale antistoff rettet mot en enkelt determinant på antigenet.
De monoklonale antistoffene her inkluderer spesifikt "kimære" antistoffer der en del av den tunge og/eller lette kjeden er identisk med eller homolog med tilsvarende sekvenser i antistoffer som er avledet fra en spesiell art eller som tilhører en spesiell antistoffklasse eller -underklasse, der resten av kjeden(e) er identisk med eller homolog med tilsvarendesekvenser i antistoffer som er avledet fra en annen art eller som tilhører en annen antistoffklasse eller -underklasse, i tillegg til fragmenter av slike antistoffer, så lenge de oppviserden ønskede, biologiske aktiviteten (US patentskrift nr. 4 816 567 og Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
"Humaniserte" former av ikke-humane (f.eks. murine) antistoffer er kimæreantistoffer som inneholder minimalt med sekvens avledet fra ikke-humant immunglobulin.For det meste er humaniserte antistoffer humane immunglobuliner (mottakerantistoff) der rester fra en hypervariabel region hos mottakeren er erstattet med rester fra en hypervariabel region fra en ikke-human art (donorantistoff) slik som mus, rotte, kanin eller ikkehuman primat som har den ønskede spesifisiteten, affiniteten og kapasiteten. I noen tilfeller er rammeverksregionen (FR)-rester for det humane immunglobulinet erstattet medtilsvarende ikke-humane rester. Videre kan humaniserte antistoffer omfatte rester som ikkeer funnet i mottakerantistoffet eller i donorantistoffet. Disse modifiseringene ble gjort for ytterligere å forbedre antistoffytelsen. Vanligvis vil det humaniserte antistoff omfatte vesentlig alle eller minst én, og typisk to, variable domener, der alle eller vesentlig alle de hypervariable løkkene tilsvarer de fra et ikke-humant immunglobulin og der alle ellervesentlig alle FR'ene er de fra en human immunglobulinsekvens. Det humaniserte antistoffet vil eventuelt også omfatte minst en del av en immunglobulin konstantregion (Fc), typisk den for et humant immunglobulin. For ytterligere detaljer, se Jones et al., Nature 321:522-525(1986), Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988), og Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992). Se også de følgende i oppsummeringsartiklene og referansene som er
64 sitert der: Vaswani og Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998),Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995), Hurle og Gross, Curr. Op. Biotech.5:428-433 (1994).
Et "antigen" er et forhåndsbestemt antigen som et antistoff kan binde selektivt til. Malantigenet kan være polypeptid, karbohydrat, nukleinsyre, lipid, hapten eller annen naturlig forekommende eller syntetisk forbindelse. Fortrinnsvis er malantigenet et polypeptid. Et "humant akseptorrammeverk" for formålet her er et rammeverk som omfatter aminosyresekvensen til et VL- eller VH-rammeverk som er avledet fra et humantimmunglobulin-rammeverk, eller fra et humant konsensus-rammeverk. Et humantakseptorrammeverk "som er avledet fra" et humant immunglobulin-rammeverk eller humantkonsensus-rammeverk kan omfatte den samme aminosyresekvensen derav, eller kaninneholde allerede eksisterende aminosyresekvensendringer. Der allerede eksisterende aminosyreendringer foreligger er fortrinnsvis ikke mer enn 5 og fortrinnsvis 4 eller færre, eller 3 eller færre, forhåndseksisterende aminosyreendringer tilstede. Der allerede eksisterende aminosyreendringer foreligger i en VH foreligger fortrinnsvis disse endringene kun på tre, to eller én av posisjonene 71H, 73H og 78H, for eksempel kan aminosyrerestene på disse posisjonene være 71A, 73T og/eller 78A. I én utførelsesform er det humane VLakseptorrammeverket identisk i sekvens med den humane VL-immunglobulin-rammeverksekvensen eller den humane konsensus-rammeverksekvensen.
Et "humant konsensus-rammeverk" er et rammeverk som representerer den mestvanlige forekommende aminosyrerestn i et utvalg av humane immunglobulin-VL- eller -VHrammeverksekvenser. Generelt er utvalget av humane immunglobulin-VL- eller -VHsekvenser fra en undergruppe av variabeldomenesekvenser. Vanligvis er undergruppen av sekvenser en undergruppe som i Kabat et al. I én utførelsesform for VL er undergruppen undergruppe-kappa-I som i Kabat et al. I én utførelsesform for VH er undergruppenundergruppe-III som i Kabat et al.
Et "VL-undergruppe-I-konsensusrammeverk" omfatter konsensussekvensen som erfremskaffet fra aminosyresekvensene i variabel lett kappaundergruppe-I ifølge Kabat et al. Ién utførelsesform omfatter VL-undergruppe-I-konsensus-rammeverksaminosyresekvensenminst en del av eller alt av de følgende sekvensene:
DIQMTWSPSSLSASVGDRVTITC (SEKV. ID nr. 34)-Ll-WYQQKPGKAPKLLI (SEKV. ID nr. 35)L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEKV. ID nr. 36)-L3-FGQGTKVEIKR (SEKV. IDnr. 37).
Et "VH-undergruppe-III-konsensusrammeverk" omfatter konsensussekvensen somer fremskaffet fra aminosyresekvensene i variabeltungundergruppe-III ifølge Kabat et al. Ién utførelsesform omfatter VH-undergruppe-III-konsensusrammeverksaminosyresekvensenminst en del av eller alt av hver av de følgende sekvensene: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEKV. ID nr. 38)-Hl-WVRQAPGKGLEWV (SEKV. ID NR.
39)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEKV. ID nr. 40)-H3-WGQGTLVTVSS(SEKV. ID nr. 41).
Et "ikke-modifisert, humant rammeverk" er et humant rammeverk som har densamme aminosyresekvensen som det humane akseptorrammeverket, f.eks. mangler den humane til ikke-humane aminosyresubstitusjoner i det humane akseptorrammeverket.
En "endret hypervariabel region" for formålene her er en hypervariabel region som omfatter én eller flere (f.eks. 1 til omtrent 16) aminosyresubstitusjoner i denne.
En "ikke-modifisert hypervariabel region" for formålene her er en hypervariabelregion som har den samme aminosyresekvensen som et ikke-humant antistoff fra hvilketden er avledet, dvs. en som mangler én eller flere aminosyresubstitusjoner i denne.
Uttrykket "hypervariabel region", "HVR" eller "HV" refererer når de blir benyttet her til regionene på et antistoffvariabeldomene som er hypervariable i sekvens og/eller som danner strukturelt definerte løkker. Generelt omfatter antistoffer seks hypervariable regioner, tre i VH (Hl, H2, H3) og tre i VL (LI, L2, L3). Et antall hypervariabel regionutledninger er i bruk og er omfattet her. De komplementaritetsbestemmende regionene (CDR) ifølge Kabat er basert på sekvensvariabilitet og er de som er mest vanlig benyttet (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia refererer isteden til lokaliseringen for de strukturelle løkkene (Chothia og Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)). AbM-hypervariabel regionene representerer et kompromiss mellom CDR'en ifølgeKabat og strukturelle løkker ifølge Chothia, og blir benyttet av Oxford Molecular's AbMantistoffmodelleringsprogramvaren. "Kontakthypervariabel regionene" er basert på en analyse av de tilgjengelige, komplekse krystallstrukturene. Restene fra hver av disse hypervariable regionene er vist nedenfor.
Tabell 1
Løkke
Kabat
AbM
Chothia
Kontakt
LI
L24-L34
L24-L34
L26-L32
L30-L36
L2
L50-L56
L50-L56
L50-L52
L46-L55
L3
L89-L97
L89-L97
L91-L96
L89-L96
Hl
Kabatnummerering
H31-H35B
H26-H35B
H26-H32
H30-H35B
Hl
Chothianummerering
H31-H35
H26-H35
H26-H32
H30-H35
H2
H50-H65
H50-H58
H53-H55
H47-H58
H3
H95-H102
H95-H102
H96-H101
H93-H101
Hypervariable regioner kan omfatte "forlengede hypervariable regioner" som følger: 24-36 eller 24-34 (LI), 46-56 eller 49-56 eller 50-56 eller 52-56 (L2) og 89-97 (L3) i VL og26-35 (Hl), 50-65 eller 49-65 (H2) og 93-102, 94-102 eller 95-102 (H3) i VH. De variabledomenerestene er nummerert ifølge Kabat et al., ovenfor, for hver av disse definisjonene.
"Rammeverkrester" eller "FR-rester" er de variable domenerestene som erforskjellige fra de hypervariable regionrestene slik de er definert her.
Et "humant antistoff" er ett som innehar en aminosyresekvens som tilsvarer den for et antistoff som er produsert av et menneske og/eller har blitt fremstilt ved å benytte enhver av teknikkene for å fremstille humane antistoffer som er tilkjennegjort her. Denne definisjonen av et humant antistoff ekskluderer spesifikt et humanisert antistoff som omfatter ikke-humane, antigenbindende rester.
Et "affinitetsmodnet" antistoff er ett med én eller flere endringer i én eller flere CDR'er derav som fører til en forbedring i affiniteten for antistoffet for antigen, sammenlignet med et opphavsantistoff som ikke innehar disse endringene. Foretrukne, affinitetsmodnede antistoffer vil ha nanomolare eller til og med pikomolare affiniteter for målantigenet. Affinitetsmodnede antistoffer blir fremstilt ved hjelp av prosedyrer som er kjent på fagområdet. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) beskriver affinitetsmodning ved hjelp av VH- og VL-domeneombytting. Tilfeldig mutagenese av CDR og/ellerrammeverkrester er beskrevet av: Barbas et al. Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994), Schier et al. Gene 169:147-155 (1995), Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004(1995), Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995), og Hawkins et al., J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).
Et "blokkerende antistoff" eller et "antagonistantistoff" er ett som inhiberer eller reduserer biologisk aktivitet for antigene det binder til. Foretrukne blokkerende antistoffer eller antagonistantistoffer inhiberer vesentlig eller fullstendig den biologiske aktiviteten til antigenet.
Et "agonistantistoff" er slik det blir benyttet her et antistoff som hermer minst én av de funksjonelle aktivitetene til et polypeptid.
En "forstyrrelse" er enhver tilstand som vil dra nytte av behandling med et stoff/molekyl eller fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen. Disse inkluderer kroniske og akutte forstyrrelser eller sykdommer inkludert de patologiske tilstandene som predisponerer pattedyret overfor forstyrrelsen det er snakk om. Eksempler på forstyrrelse som skal bli behandlet her inkluderer maligne og godartede tumorer, ikke-leukemier og lymfoidemaligniteter, nevronforstyrrelse, gliforstyrrelse, asterocyttforstyrrelser, hypotalamusforstyrrelser og andre kjertel-, makrofag-, epitel-, stromal- og blastocyttforstyrrelser, oginflammatoriske forstyrrelser, immunologiske forstyrrelser og andre angiogenesebeslektede forstyrrelser.
Uttrykket "immunrelatert sykdom" betyr en sykdom der en komponent i immunsystemet hos et pattedyr forårsaker, medierer eller på annen måte bidrar til
67 sykelighet hos pattedyret. Også inkludert er sykdommer der stimulering eller intervensjon i immunresponsen har en lindrende effekt på utvikling av sykdommen. Inkludert innenfor dette uttrykket er immunmedierte, inflammatoriske sykdommer, ikke-immunmedierteinflammatoriske sykdommer, smittsomme sykdommer, immunsviktsykdommer, neoplasi, osv.
Eksempler på immunrelaterte sykdommer og inflammatoriske sykdommer, der noen er immuncellemedierte eller T-cellemedierte, som kan bli behandlet ifølge foreliggendeoppfinnelse inkluderer systemisk lupus erytematosus, revmatoid artritt, juvenil kronisk artritt, spondyloartropati, systemisk sklerose (skleroderma), idiopatisk inflammatoriske myopatier (dermatomyositt, polymyositt), Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolyttisk anemi (immunpancytopeni), paroksysmal nokturnal hemoglobinuri), autoimmun trombocytopeni (idiopatisk trombocytopenisk purpura, immunmediert trombocytopeni), tyroiditt (Graves sykdom, Hashimotos tyroiditt, juvenil lymfocytt tyroiditt, atrofisk tyroiditt), diabetes mellitus, immunmediert nyresykdom (glomerulonefritt, tubulointerstitiell nefritt), demyelinerende sykdommer i det sentrale og perifere nervesystem slik som multippel sklerose, idiopatisk demyelinerende polynevropati eller Guillain-Barré syndrom og kronisk inflammatorisk demyelinerende polynevropati,hepatobiliære sykdommer slik som smittsom hepatitt (hepatitt A, B, C, D, E og andre ikkehepatotropiske virus), autoimmun kronisk aktiv hepatitt, primær biliær chirrose, granulomatøs hepatitt og skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom (ulcerøs kolitt, Crohns sykdom), glutensensitiv enteropati og Whipples sykdom, autoimmun eller immunmedierte hudsykdommer inkludert bulløse hudsykdommer, erytema multiforme og kontaktdermatitt, psoriasis, allergiske sykdommer slik som astma, allergisk rinitt, atopisk dermatitt, matvarehypersensitivitet og urtikaria, immunologiske sykdommer i lunger slik som eosinofile lungebetennelser, idiopatisk pulmonal fibrose og en hypersensitivitetslungebetennelse, transplantasjonsassosierte sykdommer inkludert transplantatavstøtning og transplantat-versus-vert-sykdom. Smittsomme sykdommer inkluderer virussykdommer sliksom AIDS (HIV-infeksjon), hepatitt A, B, C, D og E, herpes, osv., bakterieinfeksjoner,soppinfeksjoner, protozoinfeksjoner og parasittinfeksjoner.
En "autoimmun forstyrrelse" eller "autoimmun sykdom" slik de blir benyttet om hverandre her er en ikke-malign sykdom eller forstyrrelse som fremkommer fra og som errettet mot et individs egne vev. De autoimmune sykdommene som er beskrevet her ekskluderer spesifikt maligne sykdommer eller kreftsykdommer eller krefttilstander, og ekskluderer spesielt B-cellelymfom, akutt lymfoblastleukemi (ALL), kronisk lymfocyttleukemi(CLL), hårcelleleukemi og kronisk myeloblastleukemi. Eksempler på autoimmune sykdommer eller forstyrrelser inkluderer inflammatoriske responser slik som inflammatoriske hudsykdommer inkludert psoriasis og dermatitt (for eksempel atopisk dermatitt), systemisk skleroderma og sklerose, responser som er assosiert med inflammatorisk tarmsykdom (slik som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt), respiratorisk distressyndrom (inkludert adult
respiratorisk distressyndrom, ARDS), dermatitt, meningitt, encefalitt, uveitis, kolitt, glomerulonefritt, allergiske tilstander slik som eksem og astma og andre tilstander som involverer infiltrering av T-celler og kroniske inflammatoriske responser, aterosklerose,leukocyttadhesjonsmangel, revmatoid artritt, systemisk lupus erytematosus (SLE), diabetes mellitus (f.eks. type I diabetes mellitus eller insulinavhengig diabetes mellitus), multippel sklerose, Reynauds syndrom, autoimmun tyroiditt, allergisk ensefalomyelitt, Sjøgrens syndrom, barnediabetes, og immunresponser som er assosiert med akutt og forsinket hypersensitivitet som er mediert av cytokiner og T-lymfocytter som vanligvis finnes vedtuberkulose, sarkoidose, polymyocitt, granulomatose og vaskulitt, pernisiøs anemi (Addisons sykdom), sykdommer som involverer leukocyttdiapedeser, sentralnervesystem (CNS)inflammatoriske forstyrrelser, multippel organskade syndrom, hemolyttisk anemi (inkludert kryoglobinemi eller Coombs positive anemi), myastenia gravis, antigen-antistoffkompleksmedierte sykdommer, anti-glomerulær basalmembransykdom, antifosfolipidsyndrom,allergisk nevritt. Graves sykdom, Lambert-Eaton myastenisk syndrom, pemfigoid bulløs,pemfigøs, autoimmune polyendokrinopatier, Reiters sykdom, stiff-man syndrom, Behcetssykdom, storcelleartritt, immunkompleksnefritt, IgA-nevropati, IgM-polynevropati, immuntrombocytopenisk purpura (ITP) eller autoimmun trombocyttopeni, osv.
Uttrykket "inflammatoriske gastrointestinale forstyrrelser" er en gruppe av kroniske forstyrrelser som forårsaker inflammasjon og/eller sårdannelse i slimhinnemembranen. Uttrykket inkluderer inflammatorisk tarmsykdom (f.eks. Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, ubestemt kolitt og smittsom kolitt), mukositt (f.eks. oral mukositt, gastrointestinal mukositt, nesemukositt og proktitt), nekrotiserende enterokolitt og øsofagitt.
Uttrykkene "celleproliferativ forstyrrelse" og "proliferativ forstyrrelse" refererer til forstyrrelser som er assosiert med noen grad av unormal celleproliferasjon. I én utførelsesform er den celleproliferative forstyrrelsen kreft.
"Tumor" refererer slik det blir benyttet her til all neoplastisk cellevekst og proliferasjon, uansett om den er malign eller godartet, og alle celler som er i ferd med å bli kreftceller og kreftrammede celler og vev. Uttrykkene "kreft", "kreftrammet", "celleproliferativ forstyrrelse", "proliferativ forstyrrelse" og "tumor" er ikke gjensidig utelukkende slik de blir referert til her.
Uttrykkene "kreft" og "kreftaktig" refererer til eller beskriver den fysiologiske tilstanden hos pattedyr som typisk er karakterisert ved uregulert cellevekst/proliferasjon. Eksempler på kreft inkluderer karsinom, lymfom, blastom, sarkom og leukemi. Mer spesielle eksempler på slike kreftformer inkluderer skvamøs cellekreft, småcellet lungekreft, ikkesmåcellet lungekreft, adenokarsinom i lungen, skvamøst karsinom i lungen, kreft i peritoneum, hepatocellulær kreft, gastrointestinal kreft, pankreaskreft, glioblastom, cervixkreft, ovariekreft, leverkreft, blærekreft, hepatom, brystkreft, kolonkreft, kolorektalkreft, endometrie- eller livmorkarsinom, spyttkjertelkarsinom, nyrekreft, leverkreft, prostatakreft,vulvakreft, tyroidkreft, hepatisk karsinom og ulike typer av hode- og nakkekreft.
Feilregulering av angiogenese kan føre til mange forstyrrelser som kan bli behandlet med preparatene og fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. Disse forstyrrelsene inkluderer både ikke-neoplastiske og neoplastiske tilstander. Neoplastiske forstyrrelser inkluderer desom er beskrevet ovenfor. Ikke-neoplastiske forstyrrelser inkluderer uønsket eller avvikendehypertrofi, artritt, revmatoid artritt (RA), psoriasis, psoriasisplakk, sarkoidose, aterosklerose, aterosklerotiske plakk, diabetes retinopatier og andre proliferative retinopatier inkludert retinopati ved prematuritet, retrolental fibroplasi, neovaskulært glaukom, aldersrelatert makulær degenerering, diabetesmakulært ødem, kornea neovaskularisering, kornea transplantatneovaskularisering, kornea transplantatavstøtning, retina/koroid neovaskularisering, neovaskularisering i angle (rubeose), okulær neovaskulariseringssykdom, vaskulær restenose, arteriovenøse feildannelser (AVM), meningiom, hemangiom, angiofibrom, tyroid hyperplasi (inkludert Graves sykdom), kornea- og annen vevstransplantasjon, kroniskinflammasjon, lungeinflammasjon, akutt lungeskade/ARDS, sepsis, primær pulmonal hypertensjon, maligne pulmonale effusjoner, cerebralt ødem (f.eks. assosiert med akutt slag/lukket hodeskade/traume), synovial inflammasjon, pannusdannelse ved RA, myositis ossificans, hypertrofisk bendannelse, osteoartritt (OA), refraktorisk ascites, polycystisk ovariesykdom, endometriose, 3. spacing ved fluidsykdommer (pankreatitt, compartmentsyndrom, brannskader, tarmsykdom), livmorfibroider, for tidlig fødsel, kronisk inflammasjon slik som IBD (Crohns sykdom og ulcerøs kolitt), nyreallograftavstøtning, inflammatorisk tarmsykdom, nefrotisk syndrom, uønsket eller avvikende vevsmassevekst (ikke-kreft),hemofile ledd, hypertrofiske arr, inhibering av hårvekst, Osler-Weber syndrom, pyogenegranulomaretrolentalfibroplasi, skleroderma, trakom, vaskulære adhesjoner, synovitt, dermatitt, preeklampsi, ascites, perikardial effusjon (slik som den som er assosiert med perikarditt) og pleural effusjon.
Som benyttet her refererer "behandling" til klinisk intervensjon i et forsøk på å endre den naturlige utviklingen for individet eller cellen som blir behandlet og kan bli utført enten for profylakse eller i løpet av utviklingen av klinisk patologi. Ønskede effekter ved behandling inkluderer å forhindre fremkomst eller tilbakekomst av sykdom, lindring av symptomer, minsking av enhver direkte eller indirekte patologisk konsekvens av sykdommen, forhindre metastaser, minske hastigheten på sykdomsprogresjon, lindre eller døyve sykdomstilstanden og remisjon eller forbedret prognose. I noen utførelsesformer blir antistoffer ifølge oppfinnelsen benyttet for å forsinke utviklingen av sykdommer og forstyrrelser.
En "effektiv mengde" refererer til en mengde som er effektiv ved doseringer og i tidsperioder som er nødvendig for å oppnå det ønskede, terapeutiske eller profylaktiske resultater.
En "terapeutisk effektiv mengde" av et stoff/molekyl ifølge oppfinnelsen, agonist eller antagonist kan variere i overensstemmelse med faktorer slik som sykdomstilstand, alder, kjønn og vekt for individet, og evnen til stoffet/molekylet, agonisten eller antagonisten
70 eller å utløse en ønsket respons hos individet. En terapeutisk effektiv mengde er også én der enhver toksisk eller skadelig effekt av stoffet/molekylet, agonisten eller antagonisten blir oppveid ved de terapeutisk, fordelaktige effektene. En "profylaktisk effektiv mengde" refererer til en mengde som ved dosering og tidsperioder som er nødvendige er effektiv for å oppnå det ønskede, profylaktiske resultatet. Vanligvis, men ikke nødvendigvis, siden en profylaktisk dose blir benyttet på individer før eller på et tidligere stadium av sykdommen så vil den profylaktisk, effektive mengden være mindre enn den terapeutisk, effektive mengden.
Uttrykket "cytotoksisk middel" refererer slik det blir benyttet her til et stoff som inhiberer eller forhindrer virkningen av celler og/eller forårsaker ødeleggelse av celler. Uttrykket er ment å skulle inkludere radioaktive isotoper (f.eks. At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, p32 og radioaktive isotoper av Lu), kjemoterapeutiske midler, f.eks. metotreksat, adriamycin, vinkaalkaloider (vinkristin, vinblastin, etopsid), doksorubisin, melfalan, mitomycin-C, klorambucil, daunorubicin eller andre interkalerende midler, enzymerog fragmenter derav slik som nukleolytiske enzymer, antibiotika og toksiner slik som småmolekyltoksiner eller enzymatisk aktive toksiner av bakterieopphav, soppopphav, planteopphav eller dyreopphav, inkludert fragmenter og/eller varianter derav og de ulike anti-tumor- eller anti-kreftmidlene som er tilkjennegjort nedenfor. Andre cytotoksiske midlerer beskrevet. Et tumordrepende middel forårsaker ødeleggelse av tumorceller.
Et "kjemoterapeutisk middel" er en kjemisk forbindelse som er nyttig i behandlingen av kreft. Eksempler på kjemoterapeutiske midler inkluderer alkylerende midler så som tiotepa og CYTOXAN syklofosfamid, alkylsulfonater slik som busulfan, improsulfan og piposulfan, aziridiner slik som benzodopa, karboquon, meturedopa og uredopa, etyleniminer og metylamelaminer inkludert altretamin, trietylenmelamin, trietylenfosforamid, trietylentiofosforamid og trimetylolomelamin, acetogeniner (spesielt bullatacin og bullatacinon), delta9-tetrahydrokannabinol (dronabinol, MARINOL), beta-lapachon, lapachol, kolchiciner,betulinsyre, et kamptotecin (inkludert den syntetiske analogen topotekan (HYCAMTIN), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR), acetylkamptotecin, skopolektin og 9-aminokamptotecin),bryostatin, kallystatin, CC-1065 (inkludert dens syntetiske adozelesin-, karzelesin- ogbizelesinanaloger), podofyllotoksin, podofyllinsyre, teniposid, kryptofysiner (spesielt kryptofysin-1 og kryptofysin-8), dolastatin, duokarmycin (inkludert de syntetiske analogeneKW-2189 og CB1-TM1), eleuterobin, pankreatistatin, et sarkodityin, spongistatin, nitrogensenneper så som klorambucil, klornafasin, kolofosfamid, estramustin, ifosfamid, mekloretamin, mekloretaminhydroksidhydroklorid, melfalan, novembichin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracilsennep, nitrozoureaer slik som karmustin, klorozotosin, fotemustin, lomustin, nimustin og ranimustin, antibiotika slik som enediynantibiotikaene (f.eks. kalicheamicin, spesielt kalicheamicin-gammall og kalicheamicin-omegall (se f.eks.Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)), dynemicin, inkludert dynemicin-A, etesperamicin, i tillegg til neokarsinostatinkromofor og beslektede kromoprotein-enediyn
antibiotiske kromoforer), aklasinomyciner, aktinomycin, autramycin, azaserin, bleomyciner, kaktinomycin, carabicin, karminomycin, karsinofilin, kromomycinis, daktinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, ADRIAMYCIN doksorubisin (inkludertmorfolinodoksorubisin), cyanomorfolinodoksorubicin, 2-pyrrolino-doksorubicin og deoksydoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomyciner slik som mitomycin-C, mykofenolsyre, nogalamycin, olivamyciner, peplomycin, potfyromycin,puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozosin, tubersidin, ubenimeks, asinostatin, sorubicin, antimetabolitter slik som metotreksat og 5-fluoruracil (5-FU),folsyreanaloger slik som denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat, purinanaloger slik som fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamitrin, tioguanin, pyrimidinanaloger slik somancitabin, azasitidin, 6-azauridin, karmofur, cytarabin, dideoksyuridin, doksifluridin,enocitabin, floksuridin, androgener slik som kalusteron, dromostanolonpropionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton, anti-adrenaler slik som aminoglutetimid, mitotan,trilostan, folsyreerstattere slik som frolinsyre, aceglaton, aldofosfamidglykosid, aminolevulinsyre, eniluracil, amsakrin, bestrabucil, bisantren, edatraksat, defofamin, demekolcin, diazikon, elfornitin, elliptiniumacetat, et epotilon, etoglucid, galliumnitrat, hydroksyurea, lentinan, lonidainin, maytansinoider slik som maytansin og ansamitociner, mitoguazon, mitoksantron, mopidanmol, nitraerin, pentostatin, fenamet, pirarubicin, losoksantron, 2-etylhydrazid, prokarbazin, PSK-polysakkaridkompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR),razoksan, rizoksin, sizofiran, spirogermanium, tenuazonsyre, triazikon, 2,2',2"-triklortrietylamin, trikotecener (spesielt T-2-toksin, verrakurin-A, roridin-A og anguidin), uretan,vindesin (ELDISIN, FILDESIN), dakarbazin, mannomustin, mitobronitol, mitolaktol, pipobroman, gacytosin, arabinosid ("Ara-C), tiotepa, taksoider, f.eks. TAXOL paklitaksel(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANE kreomoforfri, albuminfremstiltnanopartikkelformulering av paklitaksel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), og TAXOTERE doksetaksel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Frankrike), kloranbucil,gemcitabin (GEMZAR), 6-tioguanin, merkaptopurin, metotreksat, platinaanaloger slik somcisplatin og karboplatin, vinblastin (VELBAN), platina, etopsid (VP-16), ifosfamid,mitoksantron, vinkristin (ONCOVIN), oksaliplatin, leukovovin, vinorelbin (NAVELBINE), novantron, edatreksat, daunomycin, aminopterin, ibandronat, topoisomeraseinhibitor (RFS 2000, difluormetylornitin (DMFO), retionoider slik som retinolsyre, kapecitabin (XELODA), farmasøytisk akseptable salter, syrer eller derivater av enhver av de som er fremlagt ovenfor, i tillegg til kombinasjoner av to eller flere av de som er fremlagt ovenfor slik som CHOP, som er en forkortelse for en kombinert terapi med syklofosfamid, doksorubicin, vinkristin og prednisolon og FOLFOX som er en forkortelse for et behandlingsregime med oksaliplatin (ELOXATIN) kombinert med 5-FU og leukovovin.
Også inkludert i denne definisjonen er anti-hormonmidler som virker slik at detregulerer, reduserer, blokkerer eller inhiberer effekten av hormoner som kan fremme veksten av kreft, og foreligger ofte i form av systemisk behandling eller helkroppbehandling.
De kan være hormoner selv. Eksempler inkluderer antiøstrogener og selektive østrogenreseptormodulatorer (SERM), inkludert for eksempel tamoksifen (inkludert NOLVADEX tamoksifen), EVISTA raloksifen, droloksifen, 4-hydroksytamoksifen, trioksifen, keoksifen,LY117018, onapriston og FARESTON toremifen, anti-progesteroner, østrogenreseptornedregulatorer (ERD), midler som virker slik at de undertrykker eller slår av ovariene, for eksempel luteiniserende hormonfrigjørende hormon (LHRH)-agonister slik som LUPRON ogELIGARD-leuprolidacetat, goserelinacetat, buserelinacetat og tripterelin, andre antiandrogener slik som flutamid, nilutamid og bikalutamid, og aromataseinhibitorer som inhiberer enzymet aromatase, som regulerer østrogenproduksjon i binyrekjertlene, slik som for eksempel 4(5)-imidazoler, aminoglutetimid, MEGASE megestrolacetat, AROMASINeksemestan, formestani, fadrozol, RIVISOR vorozol, FEMARA letrozol og ARIMIDEX anastrozol. I tillegg inkluderer en slik definisjon av kjemoterapeutiske midler bisfosfonater slik som klodronat (for eksempel BONEFOS eller OSTAC), DIDROCAI etidronat, NE-58095,ZOMETA zoledronsyre/zoledronat, FOSAMAX alendronat, AREDIA pamidronat, SKELID tiludronat eller ACTONEL risedronat, i tillegg til troksacitabin (en 1,3-dioksolan-nukleosidcytosinanalog), antisensoligonukleotider, spesielt de som inhiberer uttrykking av gener i signaliseringsveier som er implisert i feilaktig celleproliferasjon slik som ffor eksempel PKCalfa. Raf, H-Ras og epidermal vekstfaktorreseptor (EGF-R), vaksiner slik som THERATOPEvaksine og genterapivaksiner, for eksempel ALLOVECTIN-vaksine, LEUVECTIN-vaksine ogVAXID-vaksine, LURTOTECAN-topoisomerase-l-inhibitor, ABRALIX rmRH, lapatinib ditosylat(en toverdig småmolekyl-ErbB-2- og EGFR-tyrosinkinaseinhibitor som også er kjent somGW572016) og farmasøytisk akseptable salter eller derivater av en hvilken som helst av de som er nevnt ovenfor.
Et "vekstinhibitorisk middel" refererer når det blir benyttet her til en forbindelse eller sammensetning som inhiberer vekst for en celle hvis vekst er avhengig av beta7-aktiveringenten in vitro eller in vivo. Slik kan det vekstinhibitoriske midlet være ett som vesentlig reduserer prosentandelen av beta7-avhengige celler i S-fase. Eksempler på vekstinhibitoriske midler inkluderer midler som blokkerer cellesyklusprogresjon (på et sted forskjellig fra S-fase), slik som midler som induserer Gl-arrest og M-fasearrest. Klassiske Mfaseblokkere inkluderer vinkaene (vinkristin og vinblastin), taksaner og topoisomerase-IIinhibitorer slik som doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopsid og bleomycin. De midlene som stopper Gl går også over i S-fasearrest, for eksempel DNA-alkylerende midler slik somtamoksifen, prednison, dakarbazin, mekloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluoruracil ogara-C. Ytterligere informasjon kan bli funnet i The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn ogIsrael, red., kapittel 1, med tittel "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" av Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), spesielt s. 13. Taksanene (paklitaksel og docetaksel) er antikreftlegemidler som begge er avledet fra barlind. Docetaksel (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer), som er avledet fra europeisk barlind er enhalvsyntetisk analog av paklitaksel (TAXOL, Bristol-Myers Squibb). Paklitaksel og dosetaksel
73 fremmer sammensetningen av mikrotubili fra tubilindimerer og stabiliserer mikrotubuli ved å forhindre depolymerisering, som fører til inhiberingen av mitose i celler.
"Doksorubicin" er et antrasyklinantibiotikum. Det fulle, kjemiske navnet til doksorubicin er (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoksy-a-L-lykso-heksapyranosyl)oksy]-7,8,9,10tetrahydro-6,8,ll-trihydroksy-8-(hydroksyacetyl)-l-metoksy-5,12-naftacendion.
Forbindelser som er nyttige i kombinasjonsterapi med et anti-beta7-antagonistantistoff ifølge oppfinnelsen inkluderer antistoffer (inkludert andre anti-beta7-antagonistantistoffer (Fib 21, 22, 27, 30 (Tidswell, M. (1997) ovenfor) eller humaniserte derivater derav), anti-alfa4-antistoffer (slik som ANTEGEN), anti-TNF (REMICADE)) eller ikke-proteinforbindelser inkludert 5-ASA-forbindelsene ASACOL, PENTASA, ROWASA, COLAZAL og andreforbindelser slik som Purinetol og steroider slik som prednison. I én utførelsesform omfatter beskrivelsen en fremgangsmåte for å behandle en pasient, slik som en human pasient, med anti-beta7-antagonistantistoffer ifølge oppfinnelsen alene eller i kombinasjon med en annenforbindelse som også er nyttig i å behandle inflammasjon. I én utførelsesform er den andre forbindelsen valgt fra gruppen som består av Fib 21, 22, 27, 30 eller humaniserte derivater derav), anti-alfa4-antistoffer, ANTEGEN, anti-TNF, REMICADE, 5-ASA-forbindelser, ASACOL,PENTASA, ROWASA, COLAZAL, Purinetol, steroider og prednison. I én utførelsesform av beskrivelsen reduserer administrering av anti-beta7-antagonistantistoffet ifølge oppfinnelsenvesentlig dosen av den andre forbindelsen. I én utførelsesform er nevnte reduksjon i dosen av den andre forbindelsen minst 30 %, minst 40 %, minst 50 %, minst 60 %, minst 70 %, minst 80 %, minst 90 %, minst 95 %. I én utførelsesform av beskrivelsen lindrer kombinasjonen av antistoffet ifølge oppfinnelsen og den reduserte dosen av den andre forbindelsen symptomer hos pasienten til vesentlig den samme graden eller bedre enn ved administrering av den andre forbindelsen alene.
Fremstilling av variantantistoffer som oppviser redusert eller fravær av HAMA-responsReduksjon eller eliminering av en HAMA-respons (human anti-muse (ogsåanvendbar på human anti-rotte eller human anti-human) er et vesentlig aspekt av kliniskutvikling av passende terapeutiske midler. Se f.eks. Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937, Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572, Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530, Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138, Miller et al., Blood (1983), 62-988, Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352, Reichmann et al., Nature(1988), 332:323, Junghans et al.. Cancer Res. (1990), 50:1495. Tilveiebragt her er antistoffer som er humaniserte slik at HAMA-responsen blir redusert eller eliminert.Varianter av disse antistoffene kan ytterligere bli fremskaffet ved å benytte rutinemessige fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, der noen av disse ytterligere er beskrevet nedenfor.
For eksempel kan en aminosyresekvens for et antistoff som er beskrevet her virke som en utgangssekvens for diversifisering av rammeverket og/eller de(n) hypervariable
sekvensen(e). En valgt rammeverksekvens til hvilken en utgangshypervariabel sekvens blir bundet, blir her referert til som et humant akseptorrammeverk. Mens de humane akseptorrammeverkene kan være fra, eller være avledet fra et humant immunglobulin (VL- og/ellerVH-regionene derav) så er fortrinnsvis de humane akseptorrammeverkene fra, eller avledetfra, en human konsensus-rammeverksekvens fordi slike rammeverk har blitt vist å haminimalt eller ingen immunogenisitet hos humane pasienter.
Der akseptoren er avledet fra et humant immunglobulin kan man eventuelt velge en human rammeverksekvens som er valgt basert på dens homologi med donor-rammeverksekvensen ved å sammenstille donor-rammeverksekvensen med ulike humane rammeverksekvenser i en samling av humane rammeverksekvenser og velge den mest homologe rammeverksekvensen som akseptoren.
I én utførelsesform er humane konsensusrammeverk her fra, eller avledet fra VHundergruppe-III- og/eller VL-kappa-undergruppe-I-konsensusrammeverksekvenser.
Slik kan det humane VH-akseptorrammeverket omfatte én, to, tre eller alle defølgende rammeverksekvensene:
FRI som omfatter EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEKV. ID nr. 38),
FR2 som omfatter WVRQAPGKGLEWV (SEKV. ID nr. 39),
FR3 som omfatter RFTISX1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEKV. ID nr. 42), hvor XI er A eller R, X2 er T eller N, og X3 er A, L eller F,
FR4 som omfatter WGQGTLVTVSS (SEKV. ID nr. 41).
Eksempler på VH-konsensusrammeverk inkluderer:
humant VH-undergruppe-I-konsensusrammeverk minus Kabat-CDR'er (SEKV. ID nr.19),
humant VH-undergruppe-I-konsensusrammeverk minus foreliggende hypervariableregioner (SEKV. ID nr. 20-22),
humant VH-undergruppe-II-konsensusrammeverk minus Kabat-CDR'er (SEKV. IDnr. 48),
humant VH-undergruppe-II-konsensusrammeverk minus forlengede hypervariableregionen (SEKV. ID nr. 49-51),
humant VH-undergruppe-III-konsensusrammeverk minus Kabat-CDR'er (SEKV. IDnr. 52),
humant VH-undergruppe-III-konsensusrammeverk minus forlengede hypervariableregioner (SEKV. ID nr. 53-55),
humant VH-akseptorrammeverk minus Kabat-CDR'er (SEKV. ID nr. 56),
humant VH-akseptorrammeverk minus forlengede hypervariable regioner (SEKV. IDnr. 57-58),
humant VH-akseptor-2-rammeverk minus Kabat-CDR'er (SEKV. ID nr. 59), ellerhumant VH-akseptor-2-rammeverk minus forlengede hypervariable regioner (SEKV.
ID nr. 60-62).
I én utførelsesform omfatter det humane VH-akseptorrammeverket én, to, tre elleralle de følgende rammeverksekvensene:
FRI som omfatter EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEKV. ID nr. 38),
FR2 som omfatter WVRQAPGKGLEWV (SEKV. ID nr. 39),
FR3 som omfatter RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEKV. ID nr. 43, RFTISRDTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEKV. ID nr. 44), RFTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEKV. ID nr. 45), RFTISADTSKNFYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEKV. ID nr. 46),
FR4 som omfatter WGQGTLVTVSS (SEKV. ID nr. 41).
Det humane VL-akseptorrammeverket kan omfatte én, to, tre eller alle de følgenderammeverksekvensene:
FRI som omfatter DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEKV. ID nr. 34),
FR2 som omfatter WYQQKPGKAPKLLI (SEKV. ID nr. 35),
FR3 som omfatter GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEKV. ID nr. 36),
FR4 som omfatter FGQGTKVEIKR (SEKV. ID nr. 37).
Eksempler på VL-konsensusrammeverk inkluderer:
humant VL-kappa-undergruppe-I-konsensusrammeverk (SEKV. ID nr. 14),humant VL-kappa-undergruppe-I-konsensusrammeverk (forlenget HVR-L2) (SEKV.
ID nr. 15),
humant VL-kappa-undergruppe-II-konsensusrammeverk (SEKV. ID nr. 16),humant VL-kappa-undergruppe-III-konsensusrammeverk (SEKV. ID nr. 17), ellerhumant VL-kappa-undergruppe-IV-konsensusrammeverk (SEKV. ID nr. 18).
Mens akseptoren kan være identisk i sekvens med den humane rammeverksekvensen som er valgt, uansett om den er fra et humant immunglobulin eller et humant konsensusrammeverk, så omfatter foreliggende oppfinnelse at akseptorsekvensen kan omfatte allerede eksisterende aminosyresubstitusjoner i forhold til den humane immunglobulinsekvensen eller den humane konsensusrammeverksekvensen. Disse allerede eksisterende substitusjonene er fortrinnsvis minimale, vanligvis fire, tre, to eller én aminosyreforskjell i forhold til den humane immunglobulinsekvensen eller konsensusrammeverksekvensen.
Hypervariabel regionrester i det ikke-humane antistoffet blir inkorporert inn i dehumane VL- og/eller VH-akseptorrammeverkene. Man kan for eksempel inkorporere restersom tilsvarer Kabat-CDR-restene, Chothia-hypervariabelløkkerestene, Abm-restene og/ellerkontaktrestene. Eventuelt blir restene i de forlengede hypervariable regionene som følger inkorporert: 24-34 (LI), 49-56 (L2) og 89-97 (L3), 26-35 (Hl), 50-65 eller 49-65 (H2) og93-102, 94-102 eller 95-102 (H3).
Mens "inkorporering" av hypervariabel regionrestt som diskutert her er det på det rene at dette kan bli oppnådd på ulik måte, for eksempel kan nukleinsyre som koder for den ønskede aminosyresekvensen bli generert ved å mutere nukleinsyre som koder for muse
76 variabeldomenesekvensen slik at rammeverkrestene derav blir endret til humane akseptorrammeverkrester, eller ved å mutere nukleinsyre som koder for den humane variabeldomenesekvensen slik at hypervariabeldomenerestene blir endret til ikke-humane rester,eller ved å syntetisere nukleinsyre som koder for den ønskede sekvensen, osv.
I eksemplene her ble hypervariabel regiontransplantatvarianter generert ved hjelp av Kunkel-mutagenese på nukleinsyre som koder for den humane akseptorsekvensen ved åbenytte et separat oligonukleotid for hver hypervariable region. Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987). Passende endringer kan bli introdusert på rammeverkog/eller hypervariabel region ved å benytte rutinemessige teknikker, for å korrigere og reetablere riktige hypervariabel region-antigeninteraksjoner.
Bakteriofag(mid)visning (også referert til her som phage-display i noen kontekster)kan bli benyttet som en hensiktsmessig og rask fremgangsmåte for å generere og screene mange ulike, potensielle variantantistoffer i et bibliotek som er generert ved hjelp av sekvensrandomisering. Andre fremgangsmåter for å fremstille og screene endrede antistoffer er imidlertid tilgjengelige for fagfolk på området.
Bakteriofag(mid)visningsteknologi har frembrakt et kraftig redskap for å generere og selektere nye proteiner som binder til en ligand, slik som et antigen. Ved å benytte teknikkene med bakteriofag(mid) visning muliggjøres fremstilling av store biblioteker av proteinvarianter som raskt kan bli sortert for de sekvensene som binder et målmolekyl med høy affinitet. Nukleinsyrer som koder for variantpolypeptider blir generelt fusjonert til en nukleinsyresekvens som koder for et viruskappeprotein, slik som gen-III-proteinet eller genVIII-proteinet. Monovalente fagmidvisningssystemer der nukleinsyresekvensen som koderfor proteinet eller polypeptidet er fusjonert til en nukleinsyresekvens som koder for en del av gen-III-proteinet har blitt utviklet. (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990), Lowman og Wells,Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991). I et monovalent fagmidvisningssystem blir genfusjonen uttrykt ved lave nivåer og villtype gen-III-proteinene blirogså uttrykt slik at smittsomheten til partiklene blir opprettholdt. Fremgangsmåte for å fremstille peptidbiblioteker og for å screene disse bibliotekene har blitt tilkjennegjort i mange patenter (f.eks. US patentskrift nr. 5 723 286, US patentskrift nr. 5 432 018, US patentskrift nr. 5 580 717, US patentskrift nr. 5 427 908 og US patentskrift nr. 5 498 530).
Biblioteker av antistoffer eller antigenbindende polypeptider har blitt fremstilt på et antall måter, inkludert ved å endre et enkelt gen ved å sette inn tilfeldige DNA-sekvensereller ved å klone en familie av beslektede gener. Fremgangsmåter for å fremvise antistoffer eller antigenbindingsfragmenter ved å benytte bakteriofagvisning har blitt beskrevet i US patentskrift nr. 5 750 373, 5 733 743, 5 837 242, 5 969 108, 6 172 197, 5 580 717 og 5 658 727. Biblioteket blir deretter screenet for uttrykking av antistoffer eller antigenbindende proteiner med de ønskede karakteristika.
Fremgangsmåter for å substituere en aminosyre som er valgt inn i en templatnukleinsyre er veletablert på fagområdet, der noen av disse er beskrevet her. Hypervariabel
regionrester kan for eksempel bli substituert ved å benytte Kunkel-fremgangsmåten. Se foreksempel Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987).
Sekvensen av oligonukleotider inkluderer ett eller flere av de designede kodonsettene for de hypervariable regionrestene som skal bli endret. Et kodonsett er et sett av forskjellige nukleotid-triplett-sekvenser som blir benyttet for å kode for ønskedevariantaminosyrer. Kodonsett kan bli representert ved hjelp av symboler for å betegne bestemte nukleotider eller ekvimolære blandinger av nukleotider som vist nedenfor i overensstemmelse med IUB-koden.
IllB-koder
G Guanin
A Adenin
T Tymin
C Cytosin
R (A eller G)
Y (C eller T)
M (A eller C) K (G eller T)
S (C eller G) W (A eller T)
H (A eller C eller T)
B (C eller G eller T)
V (A eller C eller G)
D (A eller G eller T) H
N (A eller C eller G eller T)
For eksempel i kodonsettet DVK kan det være nukleotidene A eller G eller T, V kan være A eller G eller C og K kan være G eller T. Dette kodonsettet kan representere atten ulike kodon og kan kode for aminosyrene Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly og Cys.
Oligonukleotid- eller primersett kan bli syntetisert ved å benytte standard fremgangsmåter. Et sett oligonukleotider kan bli syntetisert for eksempel ved fastfase-syntese,som inneholder sekvenser som representerer alle mulige kombinasjoner av nukleotidtripletter som er tilveiebrakt av kodonsettet og som vil kode for den ønskede gruppen av aminosyrer. Syntese av oligonukleotider med valgt nukleotid-«degenerering" på visseposisjoner er velkjent på fagområdet. Slike sett av nukleotider som har visse kodonsett kan bli syntetisert ved å benytte kommersielle nukleinsyrer-syntetisatorer (tilgjengelig foreksempel fra Applied Biosystems, Foster City, CA), eller kan bli fremskaffet kommersielt (for eksempel fra Life Technologies, Rockville, MD). Et sett av oligonukleotider som er syntetisert med et spesielt kodonsett vil derfor typisk inkludere en flerhet av oligonukleotider med
78 forskjellige sekvenser, der forskjellene er etablert av kodonsettet i den samlede sekvensen. Oligonukleotider, slik det blir benyttet ifølge foreliggende oppfinnelse, har sekvenser som muliggjør hybridisering på en variabelt domene nukleinsyretemplat og kan også inkludere restriksjonsenzymseter for kloningsformål.
I én fremgangsmåte kan nukleinsyresekvenser som koder for variantaminosyrer bli dannet ved hjelp av oligonukleotidmediert mutagenese. Denne teknikken er velkjent på fagområdet som beskrevet av Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10:6487-6504 (1987). Kortfortalt dannes nukleinsyresekvenser som koder for variantaminosyrer ved hybridisering av et oligonukleotidsett som koder for de ønskede kodonsettene til et DNA-templat, der templateter den enkelttrådede formen av plasmidet som inneholder en variabel region nukleinsyretemplat-sekvens. Etter hybridisering blir DNA-polymerase benyttet for å syntetisere en helandre komplementær tråd av templatet som på det vis vil inkorporere oligonukleotidprimeren, og vil inneholde kodonsettene slik de er tilveiebrakt av oligonukleotidsettet.
Vanligvis blir oligonukleotider med en lengde på minst 25 nukleotider benyttet. Et optimalt oligonukleotid vil ha 12-15 nukleotider som er fullstendig komplementære tiltemplatet på hver side av nukleotidet/ene som koder for mutasjonen(e). Dette sikrer at oligonukleotidet vil hybridisere korrekt til det enkelttrådede DNA-templatmolekylet.Oligonukleotidene kan enkelt bli syntetisert ved å benytte teknikker som er kjent på fagområdet, slik som de som er beskrevet av Crea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978).
DNA-templatet blir generert ved de vektorene som enten er avledet fra bakteriofagM13-vektorer (de kommersielt tilgjengelige M13mpl8- og M13mpl9-vektorene er egnet),eller de vektorene som inneholder et enkelttrådet bakteriofag replikasjonsorigo som beskrevet av Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Dermed kan DNA som skal bli mutert bli satt inn i én av disse vektorene for å generere enkelttrådet templat. Fremstilling av det enkelttrådede templatet blir beskrevet i avsnittene 4.21-4.41 i Sambrook et al.,ovenfor.
For å endre den native DNA-sekvensen blir oligonukleotidet hybridisert til detenkelttrådede templatet ved passende hybridiseringsbetingelser. Et DNA-polymeriserendeenzym, vanligvis T7-DNA-polymerase eller Klenow-fragmentet av DNA-polymerase-I, blirderetter tilsatt for å syntetisere den komplementære tråden til templatet ved å benytte oligonukleotidet som en primer for syntesen. Et hetero-dupleksmolekyl blir dermed dannetslik at én tråd av DNA koder for den muterte formen av gen-1 og den andre tråden (detopprinnelige templatet) koder for den native, uendrede sekvensen for gen-1. Dette heterodupleksmolekylet blir deretter transformert inn i en passende vertscelle, vanligvis en prokaryot celle slik som E. coli JM101. Etter å ha dyrket cellene blir de platet ut på agaroseplater og screenet ved å benytte oligonukleotidprimeren radiomerket med et 32-fosfat for åidentifisere bakteriekoloniene som inneholder det muterte DNAet.
Fremgangsmåten som er beskrevet umiddelbart ovenfor kan bli modifisert slik at et homo-dupleksmolekyl blir dannet der begge tråder i plasmidet inneholder mutasjonen(e).Modifiseringene er som følger: det enkelttrådede oligonukleotidet binder seg til det enkelttrådede templatet som beskrevet ovenfor. En blanding av tre deoksyribonukleotider, deoksyriboadenosin (dATP), deoksyriboguanosin (dGTP) og deoksyribotymidin (dTT) blir kombinert med et modifisert tiodeoksyribocytosin kalt dCTP-(aS) (som kan bli fremskaffetfra Amersham). Denne blandingen blir tilsatt til templat-oligonukleotid-komplekset. Vedtilsetning av DNA-polymerase til denne blandingen blir en tråd av DNA som er identisk medtemplatet bortsett fra de muterte basene generert. I tillegg vil denne nye DNA-trådeninneholde dCTP-(aS) istedenfor dCTP, som virker slik at den beskytter den fra restriksjonsendonukleasefordøying. Etter at templattråden forden dobbelttrådede hetero-dupleksen harfått innført et enkeltrådsbrudd med et passende restriksjonsenzym kan templattråden bli fordøyd med ExoIII-nuklease eller annen passende nuklease forbi regionen som inneholdersetet/ene som skal bli mutagenisert. Restriksjonen blir deretter stoppet for å få et molekyl som kun er delvis enkelttrådet. En fullstendig, dobbelttrådet DNA-homo-dupleks blir deretterdannet ved å benytte DNA-polymerase i nærvær av alle fire deoksyribonukleotid-trifosfater,ATP og DNA-ligase. Dette homo-dupleksmolekylet kan deretter bli transformert inn i enpassende vertscelle.
Som tidligere antydet er sekvensen for oligonukleotid-settet av tilstrekkelig lengdefor å hybridisere til templatnukleinsyren og kan også inneholde restriksjonssete. DNAtemplater kan bli generert ved hjelp av de vektorene som enten er avledet fra bakteriofagM13-vektorer eller vektorer som inneholder et enkelttrådet bakteriofagreplikasjonsorigo sombeskrevet av Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Slik må DNA som er mutert bli innsatt i én av disse vektorene for å generere et enkelttrådet templat. Fremstilling av det enkelttrådede templatet er beskrevet i avsnittene 4.21-4.41 i Sambrook et al., ovenfor.
Ifølge en annen fremgangsmåte kan et bibliotek bli generert ved å tilveiebringe oppstrøms- og nedstrøms-oligonukleotidsett, der hvert sett har en flerhet av oligonukleotider med forskjellige sekvenser, der de forskjellige sekvensene som er etablert av kodonsettene er tilveiebrakt innenfor sekvensen av oligonukleotidene. Oppstrøms- ognedstrøms-oligonukleotidsettene, sammen med en variabelt domene templat-nukleinsyresekvens, kan bli benyttet i en polymerasekjedereaksjon for å generere et "bibliotek" av PCRprodukter. PCR-produktene kan bli referert til som "nukleinsyrekassetter", siden de kan blifusjonert til andre beslektede eller ikke-beslektede nukleinsyresekvenser, for eksempelviruskappeproteiner og dimeriseringsdomener, ved å benytte etablerte molekylærbiologiske teknikker.
Sekvensen til PCR-primerne inkluderer ett eller flere av de designede kodonsettenefor de løsemiddeltilgjengelige og svært ulike delene i én hypervariabel region. Som beskrevet ovenfor er et kodonsett et sett med ulike nukleotid-triplettsekvenser som blirbenyttet for å kode for ønskede variantaminosyrer.
Valgte antistoffer som imøtegår de ønskede kriteriene, som er valgt via passende screening/seleksjonstrinn, kan bli isolert og klonet ved å benytte standard rekombinante teknikker.
Vektorer, vertsceller og rekombinante fremgangsmåter
For rekombinant produksjon av et antistoff ifølge oppfinnelsen blir nukleinsyren som koder for det isolert og satt inn i en repliserbar vektor for ytterligere kloning (amplifisering av DNA) eller for ekspresjon. DNA som koder for antistoffet kan enkelt bli isolert og sekvensert ved å benytte konvensjonelle prosedyrer (f.eks. ved å benytte oligonukleotid prober som er i stand til å bindes spesifikt til gener som koder for den tunge og den lette kjeden til antistoffet). Mange vektorer er tilgjengelige. Valget av vektor avhenger delvis av vertscellen som skal bli benyttet. Foretrukne vertsceller er vanligvis av enten prokaryot eller eukaryot (vanligvis pattedyropphav) opphav.
Fremstilling av antistoffer ved å benytte prokarvote vertsceller:
Vektorkonstruering
Polynukleotidsekvenser som koder for polypeptidkomponenter for antistoffet ifølge oppfinnelsen kan bli fremskaffet ved å benytte standard, rekombinante teknikker. Ønskede polynukleotidsekvenser kan bli isolert og sekvensert fra antistoffproduserende celler så som hybridomceller. Alternativt kan polynukleotider bli syntetisert ved å benytte nukleotidsyntetisatorer eller PCR-teknikker. Med én gang de er oppnådd blir sekvensene som koderfor polypeptidene satt inn i en rekombinant vektor som er i stand til å replikere og uttrykke heterologe polynukleotider i prokaryote verter. Mange vektorer som er tilgjengelige og kjente på fagområdet kan bli benyttet til formålet ifølge foreliggende oppfinnelse. Valg av en passende vektor vil i hovedsak være avhengig av størrelsen på nukleinsyren som skal bli satt inn i vektoren og den spesielle vertscellen som skal bli transformert med vektoren. Hver vektor inneholder ulike komponenter, avhengig av dens funksjon (amplifisering eller ekspresjon av heterologt polynukleotid, eller begge) og dens kompatibilitet med den spesielle vertscellen som den ligger i. Vektorkomponentene inkluderer vanligvis: et replikasjonsorigo, et seleksjonsmarkørgen, en promoter, et ribosombindingssete (RBS), en signalsekvens, det heterologe nukleinsyreinsersjonen og en transkripsjons-termineringssekvens.
Vanligvis blir plasmidvektorer som inneholder replikon- og kontrollsekvenser som eravledet fra arter som er kompatible med vertscellen benyttet i sammenheng med disse vertene. Vektoren bærer ordinært et replikasjonssete, i tillegg til markeringssekvenser som er i stand til å tilveiebringe fenotypisk seleksjon i transformerte celler. E. coil blir typisk transformert ved å benytte pBR.322, som er et plasmid som er avledet fra en E. co//-art.pBR.322 inneholder gener som koder for ampicillin (Amp)- og tetrasyklin (Tet)-resistens ogtilveiebringer slik en enkel måte for å identifisere transformerte celler. pBR.322, dens
derivater, eller andre mikrobielle plasmider eller bakteriofager kan også inneholde, eller modifisert slik at de inneholder promoterer som kan bli benyttet av mikroorganismen for uttrykking av endogene proteiner. Eksempler på pBR322-derivater som blir benyttet tiluttrykking av spesielle antistoffer er beskrevet i detalj i Carter et al., US patentskrift nr. 5 648 237.
I tillegg kan bakteriofagvektorer som inneholder replikon- og kontrollsekvenser somer kompatible med vertsorganismen bli benyttet som transformerende vektorer i sammenheng med disse vertene. For eksempel kan bakteriofag slik som XGEM.TM.-ll blibenyttet for å fremstille en rekombinant vektor som kan bli benyttet til å transformere mottakelige vertsceller slik som E. coli LE392.
Ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen kan omfatte to eller flere promotorcistronpar, som koder for hver av polypeptidkomponentene. En promotor er en ikketranslatert, regulatorisk sekvens som er lokalisert oppstrøms (5') for et cistron som modulerer dens uttrykking. Prokaryote promotorer faller typisk innenfor to klasser, induserbare og konstitutive. Induserbare promotor er en promotor som initierer økte nivåer av transkripsjonen av cistronene under dens kontroll som respons på endringer i dyrkningsbetingelser, f.eks. nærvær eller fravær av et næringsstoff eller en endring i temperatur.
Et stort antall promotorer som blir gjenkjent av en mangfoldighet av potensielle vertsceller er kjent. Den valgte promotoren kan være opererbart bundet til cistron-DNA somkoder for den lette eller den tunge kjeden ved å fjerne promotoren fra kilde-DNAet viarestriksjonsenzymfordøying og innsetting av den isolerte promotorsekvensen inn i vektoren ifølge oppfinnelsen. Både den native promotorsekvensen og mange heterologe promotorer kan bli benyttet for å styre amplifisering og/eller ekspresjon av målgenene. I noen utførelsesformer blir heterologe promotorer benyttet, siden de vanligvis tillater høyere transkripsjon og høyere utbytter av uttrykt målgen sammenlignet med den native målpolypeptid promotoren.
Promotorer som er egnet for anvendelse i prokaryote verter inkluderer PhoApromotoren, p-galaktamase- og laktosepromotorsystemer, et tryptofan (trp)-promotorsystem og hybride promotorer slik som tac- eller tre-pro motoren. Imidlertid er andrepromotorer som er funksjonelle i bakterier (slik som andre kjente, bakterielle promotorer eller bakteriofag pro motorer) også egnede. Deres nukleotidsekvenser har blitt publisert, og gjør derfor en erfaren fagperson i stand til å opererbart ligere dem til cistroner som koder for de mål-lette og -tunge kjedene (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) ved å benytte linkereeller adaptorer for å tilveiebringe alle nødvendige restriksjonsseter.
I ett aspekt av oppfinnelsen omfatter hvert cistron innenfor den rekombinante vektoren en sekresjon-signalsekvens-komponent som styrer translokasjon av de uttryktepolypeptidene over en membran. Vanligvis kan aignalsekvensen være en komponent i vektoren, eller den kan være en del av målpolypeptid-DNAet som er satt inn i vektoren.
Signalsekvensen som er valgt for formålet i denne oppfinnelsen bør være én som blir gjenkjent og prosessert (dvs. kløyvd av en signalpeptidase) av vertscellen. For prokaryote vertsceller som ikke gjenkjenner og prosesserer signalsekvensene som er native for de heterologe polypeptidene, kan signalsekvensen bli substituert med en prokaryot signalsekvens som for eksempel er valgt fra gruppen som består av alkalisk fosfatase, penicillinase, Ipp eller varmestabil enterotoksin-II (STII)-ledere, LamB, PhoE, PelB, OmpAog MBP. I én utførelsesform av oppfinnelsen er signalsekvensen som blir benyttet på begge cistroner i ekspresjonssystemet STII-signalsekvenser eller varianter derav.
I et annet aspekt kan fremstillingen av immunglobulinene ifølge oppfinnelsen foregå i cytoplasmaet til vertscellen, og krever derfor ikke tilstedeværelse av sekresjonssignalsekvenser på hvert cistron. I så henseende blir immunglobulin lette og tunge kjeder uttrykt, foldet og satt sammen for å danne funksjonelle immunglobuliner i cytoplasma. Visse vertsstammer (f.eks. E. coli trxB -stammer) tilveiebringer cytoplasmabetingelser som erfordelaktige for disulfidbindingsdannelse, for derved å tillate riktig folding og sammensetning av uttrykte proteinsubenheter. Proba og Pluckthun Gene, 159-203 (1995).
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer et ekspresjonssystem i hvilket det kvantitativt forhold av uttrykte polypeptidkomponenter kan bli modulert for å maksimere utbyttet av utskilte og riktig sammensatte antistoffer ifølge oppfinnelsen. Slik modulering blir i det minste delvis oppnådd ved samtidig å modulere translasjonsstyrker for polypeptidkomponentene.
Én teknikk for å modulere translasjonsstyrker er tilkjennegjort i Simmons et al., US patentskrift nr. 5 840 523. Den benytter varianter av translasjons-initieringsregionen (TIR)på et cistron. For en gitt TIR kan en rekke aminosyre- eller nukleinsyresekvensvarianter blidannet med en rekke av translasjonsstyrker, for derved å tilveiebringe en hensiktsmessig måte å justere denne faktoren på for det ønskede ekspresjonsnivået for den spesifikke kjeden. TIR-varianter kan bli fremstilt ved hjelp av konvensjonelle mutagenese-teknikkersom fører til kodonendringer som kan endre aminosyresekvensen, selv om sovende endringer i nukleotidsekvensen er foretrukket. Endringer i TIR kan for eksempel inkludere endringer i antallet eller fordelingen av Shine-Dalgarno-sekvenser, sammen med endringer isignalsekvensen. En fremgangsmåte for å generere mutantsignalsekvenser er fremstillingen av en "kodonbank" på begynnelsen av en kodonsekvens som ikke endrer aminosyresekvensen for signalsekvensen (dvs. endringene er sovende). Dette kan bli utført ved å endre den tredje nukleotidposisjonen på hvert kodon, og i tillegg har noen aminosyrer, slik som leucin, serin og arginin flere første posisjoner og andre posisjoner som kan tilføre kompleksitet i fremstillingen av banken. Denne fremgangsmåten for mutagenese er beskrevet i detalj i Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158.
Fortrinnsvis blir et sett med vektorer fremstilt med en rekke av TIR-styrker for hvertcistron i disse. Dette begrensede settet tilveiebringer en sammenligning av ekspresjons
83 nivåer for hver kjede i tillegg til utbyttet av de ønskede antistoffproduktene ved ulike TIRstyrkekombinasjoner. TIR-styrker kan bli bestemt ved å kvantifisere ekspresjonsnivået av etreportergen som beskrevet i detalj i Simmons et al., US patentskrift nr. 5 840 523. Basert på translasjonsstyrke-sammenligningen blir de ønskede, individuelle TIR'ene valgt for å blikombinert i ekspresjonsvektor-konstruksjonene ifølge oppfinnelsen.
Prokaryote vertsceller som er egnet for å uttrykke antistoffer ifølge oppfinnelsen inkluderer Archaebacteria og Eubacteria, slik som gram-negative eller gram-positiveorganismer. Eksempler på nyttige bakterier inkluderer escherichia (f.eks. E. colP), Bacilli (f.eks. B. subtilis), Enterobacteria, Pseudomonas-arter (f.eks. P. aeruginosa), Salmonellatyphimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla og Paracoccus. I én utførelsesform blir gram-negative celler benyttet. I én utførelsesform blir E.co//-celler benyttet som verter for oppfinnelsen. Eksempler på E. co//-stammer inkludererstamme W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biologv, bind 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), s. 1190-1219; ATCC-deponeringsnummer 27,325)og derivater derav, inkludert stamme 33D3 som har genotype W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacLS AompTA(nmpc-fepE) degP41 kanR (US patentskrift nr. 5 639 635). Andre stammerog derivater derav, slik som E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coliz 1776 (ATCC 31,537) og E. coli RV308 (ATCC 31,608) er også egnede. Disse eksemplene er illustrerende. Fremgangsmåter for å fremstille derivater av enhver av de ovenfor nevnte bakteriene som har definerte genotyper er kjent på fagområdet og for eksempel beskrevet i Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990). Det er vanligvis nødvendig å velge den egnede bakterien ved åoverveie replikerbarhet for replikonet i cellene for en bakterie. For eksempel kan E. coli, Serratia- eller Salmonella-arter være egnet å benytte som verten når velkjente plasmiderslik som pBR322, pBR325, pACYC177 eller pKN410 blir benyttet for å levere replikonet. Vanligvis bør vertscellen utskille minimale mengder med proteolytiske enzymer, og ytterligere proteaseinhibitorer kan om ønskelig bli inkorporert i cellekulturen.
Antistoff-fremstilling
Vertsceller blir transformert med den ovenfor beskrevne ekspresjonsvektoren og dyrket i konvensjonelle næringsmedier som er modifisert der det er hensiktsmessig for å indusere promotorer, velge transformanter eller amplifisere genet som koder for de ønskede sekvensene.
Transformasjon betyr å introdusere DNA inn i den prokaryote verten slik at DNA er replikerbart, enten som et ekstrakromosomalt element eller som en del av kromosomet. Avhengig av vertscellen som blir benyttet blir transformasjonen utført ved å benytte standardteknikker som er passende for slike celler. Kalsiumbehandlingen som benytter kalsiumklorid blir vanligvis benyttet i bakterieceller som inneholder kraftige celleveggsbarrierer. En annen fremgangsmåte for transformasjon benytter polyetylenglykol/DMSO. Nok en annen teknikk som blir benyttet er elektroporering.
Prokaryote celler som blir benyttet til å produsere polypeptidene ifølge oppfinnelsen ble dyrket i medier som er kjent på fagområdet og som er passende for dyrking av de valgte vertscellene. Eksempler på passende medier inkluderer luria broth (LB) pluss nødvendige næringstilskudd. I noen utførelsesformer inneholder mediene også et seleksjonsmiddel, som er valgt basert på konstruksjonen av ekspresjonsvektoren, for selektivt å tillate vekst av prokaryote celler som inneholder ekspresjonsvektoren. For eksempel blir ampicillin tilsatt til mediene for vekst av celler som uttrykker ampicillinresistensgen.
Eventuelle nødvendig tilskudd foruten karbon, nitrogen og uorganisk fosfat kilder kan også bli inkludert i passende konsentrasjoner introdusert alene eller som en blanding med annet tilskudd eller medium slik som en kompleks nitrogenkilde. Eventuelt kan kulturmediet inneholde ett eller flere reduserende midler som er valgt fra gruppen som består av glutation, cystein, cystamin, tioglykollat, ditioerytritol og ditiotreitol.
De prokaryote vertscellene er dyrket ved passende temperaturer. For E. co//-vekster for eksempel det foretrukne temperaturområdet fra omtrent 20 °C til omtrent 39 °C, mer foretrukket fra omtrent 25 °C til omtrent 37 °C, enda mer foretrukket ved omtrent 30 °C. pH i mediet kan være enhver pH som strekker seg fra omtrent 5 til omtrent 9, i hovedsak avhengig av vertsorganismen. For E. coli er pH fortrinnsvis fra omtrent 6,8 til omtrent 7,4, og mer foretrukket omtrent 7,0.
Hvis en induserbar promotor blir benyttet i ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen blir proteinekspresjon indusert ved betingelser som er egnet for aktiveringen av promotoren. I ett aspekt av oppfinnelsen blir PhoA-promotorer benyttet for å kontrollere transkripsjon avpolypeptidene. De transformerte vertscellene blir dermed dyrket i et fosfatbegrensende medium for induksjon. Fortrinnsvis er det fosfatbegrensende mediet C.R.A.P-mediet (se foreksempel Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). En mengde andreinducere kan bli benyttet, i overensstemmelse med vektorkonstruksjonen som blir benyttet, slik det er kjent på fagområdet.
I én utførelsesform blir de uttrykte polypeptidene ifølge oppfinnelsen utskilt i og gjenvunnet fra periplasma i vertscellene. Proteingjenvinning involverer typisk å ødelegge mikroorganismen, vanligvis ved hjelp av slike fremgangsmåter som osmotisk sjokk, sonikering eller lysis. Med én gang celler er ødelagt kan celleavfall eller hele celler bli fjernet ved hjelp av sentrifugering eller filtrering. Proteinene kan ytterligere bli renset, for eksempel ved hjelp av affinitetsresinkromatografi. Alternativt kan protein bli transportert over i kulturmediet og isolert der. Celler kan bli fjernet fra kulturen og kultursupernatanten kan bli filtrert og konsentrert for ytterligere rensing av proteinene som er fremstilt. De uttrykte polypeptidene kan ytterligere bli isolert og identifisert ved å benytte allment kjente fremgangsmåter slik som polyakrylamid-gelelektroforese (PAGE) og Western-blott-analyse.
I ett aspekt av oppfinnelsen blir antistoffproduksjon utført i stor mengde ved hjelp av en fermenteringsprosess. En rekke storskala-matet-parti-fermenteringsprosedyrer ertilgjengelige for produksjon av rekombinante proteiner. Storskalafermenteringer har en
kapasitet på minst 1000 liter, fortrinnsvis omtrent 1000-10 000 liter. Disse fermentorenebenytter omrøringinnretninger for å fordele oksygen og næringsmidler, spesielt glukose (den foretrukne karbon/energikilden). Småskalafermentering refererer vanligvis til fermentering i en fermentor som ikke er på mer enn omtrent 100 liter i volumkapasitet, og kan variere fra omtrent 1 liter til omtrent 100 liter.
I en fermenteringsprosess blir induksjon av proteinekspresjon typisk satt i gang etter at cellene har blitt dyrket ved passende betingelser til en ønsket tetthet, f.eks. en ODsso på omtrent 180-220, og ved dette stadiet er cellene i den tidlig stasjonære fasen. Enrekke inducere kan bli benyttet i overensstemmelse med vektorkonstruksjonen som blir benyttet, slik det er kjent på fagområdet og beskrevet ovenfor. Celler kan bli dyrket i kortere tidsperioder før induksjon. Celler blir vanligvis indusert i omtrent 12-50 timer, selvom lengre eller kortere induksjonstider kan bli benyttet.
For å forbedre produksjonsutbyttet og kvaliteten av polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan ulike fermenteringsbetingelser bli modifisert. For eksempel for å forbedre den riktige sammensetningen og foldingen av de utskilte antistoffpolypeptidene kan ytterligere vektorer som overuttrykker chaperonproteiner, slik som Dsb-proteinet (DsbA,DsbB, DsbC, DsbD og DsbG) eller FkpA (en peptidylprolyl-cis,trans-isomerase medchaperonaktivitet) bli benyttet for å kotransformere de prokaryote vertscellene. Chaperonproteinene har blitt vist å fremme den riktige sammensetningen og løseligheten av heterologe proteiner som er produsert i bakterievertsceller (Chen et al. (1999) J Biol Chem 274:19601-19605, Georgiou et al., US patentskrift nr. 6 083 715, Georgiou et al., USpatentskrift nr. 6 027 888, Bothmann og Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105,Ramm og Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113, Arie et al. (2001) Mol.Microbiol. 39:199-210.
For å minimalisere proteolyse av uttrykte, heterologe proteiner (spesielt de som er proteolytisk sensitive), kan visse vertsstammer som mangler proteolytiske enzymer bli benyttet i foreliggende oppfinnelse. Vertscellestammer kan for eksempel bli modifisert slik at det blir innført genetiske mutasjoner i genene som koder for kjente bakterielle proteaser slik som protease-III, OmpT, DegP, Tsp, Protease-I, Protease-Mi, Protease-V, Protease-VI ogkombinasjoner derav. Noen E. co//-proteasemanglende stammer er tilgjengelige ogbeskrevet for eksempel i Joly et al. (1998), ovenfor, Georgiou et al., US patentskrift nr.
5 264 365, Georgiou et al., US patentskrift nr. 5 508 192, Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
I én utførelsesform blir E. co//-stammer som mangler proteolytiske enzymer og somer transformert med plasmider som overuttrykker én eller flere chaperonproteiner benyttet som vertsceller i ekspresjonssystemet ifølge oppfinnelsen.
Antistoffrensing
I én utførelsesform blir antistoffproteinet som er produsert her ytterligere renset for
å oppnå sammensetninger som er vesentlig homogene for ytterligere analyse og anvendelser. Standard proteinrensefremgangsmåter som er kjent på fagområdet kan bli benyttet. De følgende prosedyrene er eksempler på passende renseprosedyrer: fraksjonering på immunaffinitets- eller ionebytterkolonner, etanolpresipitering, reversfaseHPLC, kromatografi på silika eller på et kationbytteresin slik som DEAE, kromatofokusering, SDS-PAGE, ammoniumsulfatpresipitering og gelfiltrering ved å benytte for eksempelSephadex G-75.
I ett aspekt blir protein-A som er immobilisert på en fast fase benyttet til immunaffinitetsrensing av fullengde antistoffproduktene ifølge oppfinnelsen. Protein-A er etcelleveggprotein på 41 kD fra Staphylococcus aureus som binder med en høy affinitet til Fcregionen på antistoffer. Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. Den faste fasensom protein-A er immobilisert på er fortrinnsvis en kolonne som omfatter en glass- ellersilikaoverflate, mer foretrukket en kolonne med kontrollert poreglass eller en kiselsyrekolonne. I noen applikasjoner har kolonnen blitt belagt med et reagens, slik som glyserol, i et forsøk på å forhindre ikke-spesifikk adhering av kontaminanter.
Som det første trinnet i rensing blir sammensetningen som er utvunnet fra cellekulturen som beskrevet ovenfor påsatt den protein-A-immobiliserte faste fasen for å tillatespesifikk binding av antistoffet av interesse til protein-A. Den faste fasen blir deretter vasketfor å fjerne kontaminanter som er ikke-spesifikt bundet til den faste fasen. Til slutt blirantistoffet av interesse gjenvunnet fra den faste fasen ved hjelp av eluering.
Fremstilling av antistoffer ved å benytte eukarvote vertsceller-,
Vektorkomponentene inkluderer vanligvis én eller flere av de følgende: en signalsekvens, et origo for replikasjon, ett eller flere markørgener, et enhancerelement, en promotor og en transkripsjons-termineringssekvens.
(i) Signalsekvenskomponent
En vektor til anvendelse i en eukaryot vertscelle kan også inneholde en signalsekvens eller annen polypeptid som har et spesifikt kløyvingssete på N-terminalen av detmodne proteinet eller polypeptidet av interesse. Den heterologe signalsekvensen som er valgt er fortrinnsvis én som blir gjenkjent og prosessert (dvs. kløyvd av en signalpeptidase) av vertscellen. Ved pattedyrcelle-ekspresjon er pattedyr-signalsekvenser i tillegg tilsekretoriske ledere fra virus, for eksempel herpes simplex-gD signalet tilgjengelig.
DNA for en slik forløperregion blir ligert i leseramme til DNA som koder for antistoffet.
(ii) Origo for replikasjon
Vanligvis er ikke et origo for replikasjonskomponent nødvendig for pattedyrekspresjonsvektorer. SV40-origoet kan for eksempel vanligvis bli benyttet bare fordi deninneholder den tidlige promotoren.
(iii) Seleksjons-genkomponent
Ekspresjons- og kloningsvektorer kan inneholde et seleksjonsgen, også betegnet enselekterbar markør. Typiske seleksjonsgener koder for proteiner som (a) overfører resistens overfor antibiotika eller andre toksiner, f.eks. ampicillin, neomycin, metotreksat eller tetrasyklin, (b) komplementerer auksotrofe mangler, der det er relevant, eller (c) tilfører kritiske næringsstoffer som ikke er tilgjengelige fra komplekse medier.
Ett eksempel på et seleksjonsskjema benytter et legemiddel for å stoppe veksten for en vertscelle. De cellene som er vellykket transformert med et heterologt gen produserer et protein som overfører legemiddelresistens og overlever på det viset seleksjonsregimet. Eksempler på slik dominant seleksjon benytter legemidlene neomycin, mykofenolsyre og hygromycin.
Et annet eksempel på passende selekterbare markører for pattedyrceller er de som muliggjør identifiseringen av celler som er kompetente til å ta opp antistoff-nukleinsyren,slik som DHFR, tymidinkinase, metallotienoein-I og -II, fortrinnsvis primat-metallotioneingener, adenosindeaminase, ornitindekarboksylase, osv.
For eksempel blir celler som er transformert med DHFR-seleksjonsgenet førstidentifisert ved å dyrke alle transformantene i et kulturmedium som inneholder metotreksat (Mtx), som er en kompetitiv antagonist av DHFR. En passende vertscelle når villtype-DHFRblir benyttet, er kinesisk hamster ovarie(CHO)-cellelinjen som mangler DHFR-aktivitet (f.eks.ATCC CRL-9096).
Alternativt kan vertsceller, (spesielt villtypeverter som inneholder endogent DHFR) som er transformert eller kotransformert med DNA-sekvenser som koder for et antistoff,villtype-DHFR-protein og en annen selekterbar markør slik som aminoglykosid-3'-fosfotransferase (APH) bli selektert ved cellevekst i medium inneholdende seleksjonsmiddel for den selekterbare markøren slik som et aminoglukosidantibiotika, f.eks. kanamycin, neomycin eller G418. Se US patentskrift nr. 4 965 199.
(iv) Promotorkomponent
Ekspresjons- og kloningsvektorer inneholder vanligvis en promotor som blirgjenkjent av vertsorganismen og som er opererbart bundet til antistoffpolypeptidnukleinsyren. Promotorsekvenser er kjent for eukaryoter. Nesten alle eukaryote gener har en AT-rik region lokalisert omtrent 25-30 baser oppstrøms fra stedet der transkripsjonen blirstartet. En annen sekvens som er funnet 70-80 baser oppstrøms fra transkripsjonsorigoetfor mange gener er en CNCAAT-region der N kan være ethvert nukleotid. På den 3' enden av
88 de fleste eukaryote gener ligger det en AATAAA-sekvens som kan være signalet forpåsetning av poly-A-halen på den 3' enden av den kodende sekvensen. Alle dissesekvensene blir hensiktsmessig innsatt i eukaryote ekspresjonsvektorer.
Antistoffpolypeptid-transkripsjon fra vektorer i pattedyrvertsceller blir kontrollert foreksempel av promoterer som er fremskaffet fra genomene til virus slik som polyomavirus, fuglekoppevirus, adenovirus (slik som adenovirus-2), bovint papillomvirus, fuglesarkomvirus, cytomegalovirus, et retrovirus, hepatitt-B-virus og apevirus-40 (SV40), fra heterologepattedyrpromotorer, f.eks. aktinpromotoren eller en immunglobulinpromotor, fra varmesjokkpromotorer, gitt at slike promotorer er kompatible med vertscellesystemene.
De tidlige og sene promotorene til SV40-viruset oppnås hensiktsmessig som etSV40-restriksjonsfragment som også inneholder replikasjonsorigoet for SV40. Denumiddelbart tidlige promotoren fra det humane cytomegaloviruset oppnås hensiktsmessig som et Hindlll E-restriksjonsfragment. Et system for å uttrykke DNA i pattedyrverter ved åbenytte det bovine papillomviruset som en vektor er tilkjennegjort i US patentskrift nr. 4 419 446. En modifisering av dette systemet er beskrevet i US patentskrift nr. 4 601 978. Se også Rayes et al., Nature 297:598-601 (1982) når det gjelder uttrykking av humant pinterferon-cDNA i museceller under kontrollen av en tymidinkinasepromotor fra herpessimplex-virus. Alternativt kan den lange terminale repetisjonen fra Rous sarkomvirus blibenyttet som promotoren.
(v) Enhancerelement-komponent
Transkripsjon av DNA som koder for antistoffpolypeptidet ifølge denne oppfinnelsen i høyere eukaryoter blir ofte økt ved å sette inn en enhancersekvens i vektoren. Mange enhancersekvenser er kjent fra pattedyrgener (globin, elastase, albumin, a-fetoprotein oginsulin). Vanligvis vil man imidlertid benyte en enhancerfra et eukaryot cellevirus. Eksempler inkluderer SV40-enhanceren på den sene siden av replikasjonsorigoet (bp 100270), enhanceren til den tidlige promotoren fra cytomegaloviruset, polyoma-enhanceren påden sene siden av replikasjonsorigoet og adenovirusenhancere. Se også Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) når det gjelder enhancerelementer for aktivering av eukaryotepromotorer. Enhanceren kan bli spleiset inn i vektoren på en posisjon 5'eller 3' i forhold til den antistoffpolypeptid-kodende sekvensen, men blir fortrinnsvis lokalisert på et sted 5' iforhold til promotoren.
(vi) Transkripsjonsterminerings-komponent
Ekspresjonsvektorer som blir benyttet i eukaryote vertsceller vil typisk også inneholde sekvenser som er nødvendig for terminering av transkripsjonen og for å stabilisere mRNA. Slike sekvenser er allment tilgjengelige fra de 5' og noen ganger fra de 3' ikketranslaterte regionene på eukaryote eller virus DNA eller cDNA. Disse regionene inneholder nukleotidsegmenter som blir transkribert som polyadenylerte fragmenter i den ikke
89 translaterte delen av mRNA som koder for et antistoff. En nyttig transkripsjonstermineringskomponent er den bovine veksthormon-polyadenyleringsregion. Se WO 94/11026 ogekspresjonsvektoren som er tilkjennegjort der.
(vii) Seleksjon og transformasjon av vertsceller
Egnede vertsceller for kloning eller ekspresjon av DNA i vektoren her inkluderer høyere eukaryote celler som er beskrevet her, inkludert virveldyr-vertsceller. Dyrking avvirveldyrceller i kultur (vevskultur) har blitt en rutinemessig prosedyre. Eksempler på nyttige pattedyrvertscellelinjer er apenyre-CVl-linjen som er transformert med SV40 (COS-7, ATCCCRL 1651), human embryonal nyrelinje (293- eller 293-cellesublonet for vekst isuspensjonskultur, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)), babyhamsternyrecelle (BHK, ATCC CCL 10), kinesisk hamster ovarieceller/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 77:4216 (1980)), muse-sertoliceller (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251(1980), apenyreceller (CV1 ATCC CCL 70), nyreceller fra afrikansk grønnape (VERO-76,ATCC CRL-1587), humane cervixkarsinomceller (HELA, ATCC CCL 2), hundenyreceller(MDCK, ATCC CCL 34), bøffelrotte-leverceller (BRL 3A, ATCC CRL 1442), humane lungeceller(W138, ATCC CCL 75), humane leverceller (Hep G2, HB 8065), musebryst-tumorceller (MMT060562, ATCC CCL51), TRI-celler (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)),MRC 5-celler, FS4-celler og en human hepatomlinje (Hep G2).
Vertsceller blir transformert med de ovenfor beskrevne ekspresjons- eller kloningsvektorene for antistoffproduksjon og dyrket i konvensjonelle næringsmedier som er modifisert slik at det er hensiktsmessig for å indusere promotorer, selektere transformanter eller amplifisere genene som koder for de ønskede sekvensene.
(vill) Dyrking av vertscellene
Vertscellene som blir benyttet for å produsere et antistoff ifølge denne oppfinnelsen kan bli dyrket i en rekke medier. Kommersielt tilgjengelig medium slik som Ham's F10 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Minimal Essential Medium (MEM), (Sigma), RPMI-1640(Sigma) og Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) er egnet for å dyrke vertscellene. I tillegg kan ethvert av mediene som er beskrevet i Ham et al., Meth. Enz. 5844 (1979), Barnes et al.. Anal. Biochem. 102:255 (1980), US patentskrifter nr. 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 eller 5 122 469, WO 90/03430, WO 87/00195 eller US patent Re. 30,985 kan bli benyttet som kulturmedier for vertscellene. Ethvert av disse mediene kan suppleres om nødvendig med hormoner og/eller andre vekstfaktorer (slik som insulin, transferin eller epidermal vekstfaktor), salter (slik som natriumklorid, kalsium, magnesium og fosfat), buffere (slik som HEPES), nukleotider (slik som adenosin og tymidin), antibiotika (slik som GENTAMYCIN-legemiddel), sporstoffer (definert som uorganiskeforbindelser som vanligvis foreligger ved sluttkonsentrasjoner i mikromolarområdet) og glukose eller en ekvivalent energikilde. Alle andre nødvendige tilsetninger kan også bli
90 inkludert ved passende konsentrasjoner som vil være kjent for fagfolk på området. Dyrkningsbetingelsene, slik som temperatur, pH og lignende, er de som tidligere er blitt benyttet med vertscellen som er valgt til ekspresjon, og vil være åpenbare for fagfolk på området.
(ix) Rensing av antistoff
Når man benytter rekombinante teknikker kan antistoffet bli produsert intracellulært eller direkte utskilt i mediet. Hvis antistoffet blir produsert intracellulært blir, som et første trinn, det partikulære avfallet, enten vertsceller eller lyserte fragmenter, fjernet, for eksempel ved sentrifugering eller ultrafiltrering. Der antistoffet blir utskilt i mediet blir supernatanter fra slike ekspresjonssystemer vanligvis først konsentrert ved å benytte et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentreringsfilter, for eksempel en ultrafiltreringsenhet fra Amicon eller Millipore Pellicon. En proteaseinhibitor slik som PMSF kan bli inkludert i ethvert av de foregående trinnene for å inhibere proteolyse og antibiotika kan bli inkludert for å hindre veksten av skadelige kontaminanter.
Antistoffsammensetningen som er fremstilt fra cellene kan bli renset ved å benytte for eksempel hydroksylapatittkromatografi, gelelektroforese, dialyse og affinitetskromatografi, der affinitetskromatografi er den foretrukne renseteknikken. Egnetheten av protein-Asom en affinitetsligand avhenger av typen og isotypen av et hvilket som helst immunglobulin Fc-domene som foreligger på antistoffet. Protein-A kan bli benyttet til å rense antistoffersom er basert på humane yl-, y2- eller y4-tunge kjeder (Lindmark et al., J. Immunol. Meth.62:1-13 (1983)). Protein-G blir anbefalt for alle muse-isotyper og for human y3 (Guss et al.,EMBO J. 5:15671575 (1986)). Matriksen som affinitetsliganden er koblet til er som oftest agarose, men andre matriser er tilgjengelige. Mekanisk stabile matriser slik som kontrollert poreglass eller poly(styrendivinyl)benzen muliggjør raskere strømningshastigheter og kortere prosesseringstider enn det som kan bli oppnådd med agarose. Der antistoffet omfatter CnS-domenet, er Bakerbond ABX™-resinet (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) nyttig tilrensing. Andre teknikker for proteinrensing slik som fraksjonering på en ionebytterkolonne, etanolpresipitering, reversfase-HPLC, kromatografi på silika, kromatografi på heparinSEPHAROSE, kromatografi på en anion- eller kation bytte rres in (slik sompolyasparaginsyrekolonne), kromatofokusering, SDS-PAGE, og ammoniumsulfatpresipiteringer også tilgjengelig avhengig av antistoffet som skal gjenvinnes.
Etter eventuelle forutgående rensetrinn kan blandingen som omfatter antistoffet av interesse og kontaminanter bli utsatt for hydrofobinteraksjons-kromatografi med lav pH vedå benytte en elueringsbuffer med en pH på mellom omtrent 2,5-4,5, fortrinnsvis utført vedlave saltkonsentrasjoner (f.eks. fra omtrent 0-0,25 M salt).
Aktivitetsanalyser
Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli karakterisert for deres fysiske/kjemiske egenskaper og biologiske funksjoner ved hjelp av ulike analyser som er kjent på fagområdet.
De rensede immunglobulinene kan ytterligere bli karakterisert ved hjelp av en serie analyser inkludert N-terminal sekvensering, aminosyreanalyser, ikke-denaturerendestørrelsesekskludering høytrykksvæske kromatografi (HPLC), massespektrometri, ionebytterkromatografi og papainspalting.
I visse utførelsesformer av oppfinnelsen blir immunglobilinene som er produsert her analysert for deres biologiske aktivitet. I noen utførelsesformer blir immunglobulinene ifølge foreliggende oppfinnelse testet for deres antigenbindingsaktivitet. Antigenbindingsanalysene som er kjent på fagområdet og som kan bli benyttet her inkluderer enhver direkte eller kompetitiv bindingsanalyse ved å benytte teknikker slik som Western-blotting, radioimmunanalyse, ELISA (enzymbundet immunosorbentanalyse), "sandwich"-immunanalyse, immunpresipiteringsanalyse, fluorescensimmunanalyser og protein-A-immunanalyse. Enillustrerende antigenbindingsanalyse blir tilveiebrakt nedenfor i eksempeldelen.
I én utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse et endret antistoff som innehar noen, men ikke alle, effektorfunksjoner, noe som gjør det til en ønsket kandidat for mange applikasjoner der halveringstiden av antistoffet in vivo er viktig, men likevel er visse vektorfunksjoner (slik som komplement og ADCC) unødvendig eller skadelig. I visse utførelsesformer blir Fc-aktivitetene til det produserte immunglobulinet målt for å sikre atkun de ønskede egenskapene blir opprettholdt. In vitro og/eller in vivo cytotoksisitetsanalyser kan bli utført for å bekrefte reduksjonen/deplesjonen av CDC- og/eller ADCCaktiviteter. Fc-reseptor-(FcR)-bindingsanalyse kan for eksempel bli utført for å sikre atantistoffet mangler FcyR-binding (og mangler dermed sannsynlig ADCC-aktivitet), menopprettholder FcRn-bindingsevne. De primære cellene for å mediere ADCC, NK-celler,uttrykker kun FcyRIII, mens monocytter uttrykker FcyRI, FcyRII og FcyRIII. FcR-ekspresjonpå hematopoietiske celler er oppsummert i tabell 3 på side 464 i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Et eksempel på en in v/tro-analyse for å undersøke ADCCaktivitet for et molekyl av interesse er beskrevet i US patentskrift nr. 5 500 362 eller 5 821 337. Nyttige effektorceller for slike analyser inkluderer perifere, mononukleære blodceller (PBMC) og naturlige dreperceller (NK)-celler. Alternativt, eller i tillegg, kan ADCCaktivitet for molekylet av interesse bli undersøkt in vivo, for eksempel i en dyremodell slik som den som er tilkjennegjort i Clynes et al., PNSA (USA) 95:652-656 (1998). Clqbindingsanalyse kan også bli utført for å bekrefte at antistoffet ikke er i stand til å binde Clq og dermed mangler CDC-aktivitet. For å undersøke komplementaktivering kan en CDCanalyse, for eksempel som beskrevet i Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods202:163 (1996), bli utført. FcRn-binding og in v/vo-klaring/halveringstids-bestemmelser kan
92 også bli utført ved å benytte fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, for eksempel de som er beskrevet i eksempeldelen.
Humaniserte antistoffer
Foreliggende oppfinnelse omfatter humaniserte antistoffer. Ulike fremgangsmåter for å humanisere ikke-humane antistoffer er kjent på fagområdet. For eksempel kan ethumanisert antistoff ha én eller flere aminosyrerester introdusert i seg fra en kilde som er ikke-human. Disse ikke-humane aminosyrerestene blir ofte refererert til som "importrester",som typisk blir tatt fra et "importvariabelt domene". Humanisering kan hovedsakelig bli utført ved å følge fremgangsmåten til Winter og samarbeidspartnere (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525, Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327, Verhoeyen et al. (1988)Science 321:1534-1536), ved å substituere hypervariabel regionsekvenser med tilsvarendesekvenser fra et humant antistoff. Følgelig er slike "humaniserte" antistoffer kimære antistoffer (US patentskrift nr. 4 816 567) der vesentlig mindre enn et intakt humant variabelt domene har blitt substituert med den tilsvarende sekvensen fra en ikke-human art. I praksiser humaniserte antistoffer typisk humane antistoffer der noen hypervariabel regionrester og muligens noen FR-rester er substituert med rester fra analoge seter i gnagerantistoffet.
Valget av humane variabeldomener, både lette og tunge, som skal bli benyttet i fremstilling av de humaniserte antistoffene er svært viktig for å redusere antigenisitet. Ifølge den såkalte "best-fit"-fremgangsmåten blir sekvensen til det variable domenet for et gnagerantistoff screenet mot hele biblioteket av kjente humane variabelt domene sekvenser. Den humane sekvensen som ligger nærmest gnagersekvensen blir deretter akseptert som det humane rammeverket for det humaniserte antistoffet (Sims et al. (1993) J. Immunol. 15:2296, Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. En annen fremgangsmåte benytter et spesielt rammeverk som er avledet fra konsensus-sekvensen til alle humane antistoffer i enspesiell undergruppe med lette eller tunge kjeder. Det samme rammeverket kan bli benyttet til flere ulike humaniserte antistoffer (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285, Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623.
Det er videre viktig at antistoffer blir humanisert med opprettholdelse av høy affinitet for antigenet og andre fordelaktige biologiske egenskaper. For å oppnå dette målet, ifølge én fremgangsmåte, så blir det humaniserte antistoffet fremstilt ved hjelp av en prosess med analyse av opphavssekvensene og ulike konseptmessige, humaniserte produkter ved å benytte tredimensjonale modeller av opphavssekvensene og de humaniserte sekvensene. Tredimensjonale immunglobulinmodeller er allment tilgjengelige og er kjent for fagfolk på området. Dataprogrammer er tilgjengelige som illustrerer og viser mulige, tredimensjonale, konformasjonelle strukturer for valgte kandidat immunglobulinsekvenser. Inspeksjon av disse visningene muliggjør analyse av den sannsynlige rollen til restene i virkningen til kandidat-immunglobulinsekvensen, dvs. analysen av rester sompåvirker evnen for kandidat-immunglobulinet til å binde sitt antigen. På denne måten kan
FR-resider bli valgt og kombinert fra mottaker- og importsekvensene slik at de ønskedeantistoffkarakteristika slik som økt affinitet for målantigenet/ene, blir oppnådd. Vanligvis er hypervariabel regionrestene direkte og mest vesentlig involvert i å påvirke antigenbinding.
A n tistoffvarian ter
Beskrivelsen tilveiebringer antistoff-fragmenter som omfatter modifiseringer pågrenseflaten til Fc-polypeptidene som omfatter Fc-regionen og hvor modifiseringenefremmer og/eller øker heterodimerisering. Disse modifiseringene omfatter introduksjon av et fremspring inn i et første Fc-polypeptid og et hulrom i et annet Fc-polypeptid, derfremspringet er posisjonerbart i hulrommet for å fremme kompleksering for det første og det andre Fc-polypeptidet. Fremgangsmåte for å fremstille antistoff med disse modifiseringeneer kjent på fagområdet, for eksempel som beskrevet i US patentskrift nr. 5 731 168.
I noen utførelsesformer er aminosyresekvensmodifisering(er) av antistoffene som er beskrevet her påtenkt. For eksempel kan det være ønskelig å forbedre bindingsaffiniteten og/eller andre biologiske egenskaper for antistoffet. Aminosyresekvensvarianter av antistoffet blir fremstilt ved å introdusere passende nukleotidendringer i antistoff-nukleinsyren,eller ved hjelp av peptidsyntese. Slike modifiseringer inkluderer for eksempel delesjoner fra og/eller insersjoner i og/eller substitusjoner av rester på aminosyresekvensen til antistoffet. Enhver kombinasjon av delesjon, insersjon og substitusjon blir gjort for å komme frem til den endelige konstruksjon, gitt at den endelige konstruksjonen innehar de ønskede karakteristika. Aminosyreendringene kan bli introdusert i antistoff-aminosyresekvensen pådet tidspunktet sekvensen blir fremstilt.
En nyttig fremgangsmåte for å identifisere visse rester eller regioner i antistoffet som er foretrukne lokaliseringer for mutagenese ble kalt "alanin-skanningsmutagenese" sombeskrevet av Cunningham og Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Her blir en rest ellergruppe av målrester identifisert (f.eks. ladede rester slik som arg, asp, his, lys og glu) og erstattet med nøytrale eller negativt ladede aminosyrer (mest foretrukket alanin eller polyalanin) for å påvirke interaksjonen av aminosyrene med antigen. De aminosyrelokaliseringene som viser funksjonell sensitivitet overfor substitusjonene ble deretter foredlet ved å introdusere ytterligere eller andre varianter på, eller istedenfor, setene med substitusjon. Mens setet for å introdusere en aminosyresekvens-variasjon er forutbestemt såtrenger således egenskapen til mutasjonen per se ikke å være forutbestemt. For eksempel for å analysere oppførselen til en mutasjon på et gitt sete blir ala-fjerning eller tilfeldigmutagenese utført på målkodonet eller regionen og de uttrykte immunglobulinene blir screenet for den ønskede aktiviteten.
Aminosyresekvens-insersjoner inkluderer amino- og/eller karboksyterminalefusjoner som varierer i lengde fra én rest til polypeptider som inneholder 100 eller flere rester, i tillegg til intrasekvens-insersjoner av enkelte eller flere aminosyrerester. Eksemplerpå terminale insersjon inkluderer et antistoff med en N-terminal metionylrest eller et anti
stoff som er fusjonert til et cytotoksisk polypeptid. Andre insersjonsvarianter av antistoffmolekylet inkluderer fusjonen til N- eller C-terminalen av antistoffet med et enzym (f.eks.ADEPT) eller et polypeptid som øker halveringstiden til antistoffet i serum.
En annen type variant er en aminosyre-substitusjonsvariant. Disse variantene har
5 fått minst én aminosyrerest i antistoffmolekylet erstattet med en annen rest. Setene av størst interesse for substitusjonsmutagenese inkluderer de hypervariable regionene, men FR-endringer er også påtenkt. Konservative substitusjoner er vist i tabell 2 under overskriften "foretrukne substitusjoner). Hvis slike substitusjoner resulterer i en endring i biologisk aktivitet så kan mer vesentlige endringer, betegnet "eksempelmessige
io substitusjoner" i tabell 2, eller som ytterligere beskrevet nedenfor med referanse til aminosyreklasser, bli introdusert og produktene kan bli screenet.
Tabell 2
Opprinnelig rest
Eksempelmessige substitusjoner
Foretrukne substitusjoner
Ala (A)
Val; Leu; Ile
Val
Arg (R)
Lys; Gin; Asn
Lys
Asn (N)
Gin; His; Asp, Lys; Arg
Gin
Asp (D)
Glu; Asn
Glu
Cys (C)
Ser; Ala
Ser
Gin (Q)
Asn; Glu
Asn
Glu (E)
Asp; Gin
Asp
Gly (G)
Ala
Ala
His (H)
Asn; Gin; Lys; Arg
Arg
He (I)
Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucin
Leu
Leu (L)
Norleucin; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Ile
Lys (K)
Arg; Gin; Asn
Arg
Met (M)
Leu; Phe; Ile
Leu
Phe (F)
Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Tyr
Pro (P)
Ala
Ala
Ser(S)
Thr
Thr
Thr(T)
Val; Ser
Ser
Trp (W)
Tyr; Phe
Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe; Thr; Ser
Phe
Val (V)
Ile; Leu; Met; Phe, Ala; Norleucin
Leu
Vesentlige modifiseringer i de biologiske egenskapene til antistoffet blir oppnådd ved
is å velge substitusjoner som avviker signifikant i deres virkning på å opprettholde (a) strukturen til polypeptid-ryggradstrukturen i området med substitusjonen, for eksempel som
en flak-konformasjon eller heliks-konformasjon, (b) ladningen eller hydrofobisiteten tilmolekylet på målstedet eller (c) omfanget av sidekjeden. Aminosyrer kan bli gruppert i overenstemmelse med likheter i egenskapene til deres sidekjeder (i A.L. Lehninger, i Biochemistry, andre utgave, s. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) ikke-polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) uladede polar: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gin (Q)
(3) sure: Asp (D), Glu (E)
(4) basiske: Lys (K), Arg (R), His(H)
Alternativt kan naturlig forekommende rester oppdeles i grupper basert på felles sidekjede-egenskaper:
(1) hydrofobe: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) nøytrale hydrofile: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) sure: Asp, Glu;
(4) basiske: His, Lys, Arg;
(5) rester som påvirker kjedeorienteringen: Gly, Pro;
(6) aromatiske: Trp, Tyr, Phe.
Ikke-konservative substitusjoner vil medføre å bytte én av disse klassene med enannen klasse. Slike substituerte rester kan også bli introdusert på de konservative substitusjonssetene, eller mer foretrukket, inn i de gjenværende (ikke-konserverte) setene.
En type av substitusjonsvariant omfatter å substituere én eller flere hypervariable regionrester for et opphavsantistoff (f.eks. et humanisert eller humant antistoff). Vanligvis vil den resulterende varianten som er valgt til ytterligere utvikling ha forbedrede biologiske egenskaper i forhold til opphavsantistoffet fra hvilket de er generert. En hensiktsmessig måte å generere slike substitusjonsvarianter på involverer affinitetsmodning ved å benytte phage-display. Kort fortalt blir flere hypervariabel regionseter (f.eks. 6-7 seter) mutert for ågenerere alle mulige aminosyresubstitusjoner på dette setet. Antistoffene som blir generert på denne måten blir vist på filamentøse bakteriofagpartikler som fusjoner til gen-IIIproduktet fra M13 pakket inne i hver partikkel. De bakteriofagviste variantene blir deretter screenet for deres biologiske aktivitet (f.eks. bindingsaffinitet) som tilkjennegjort her. For å identifisere kandidat-hypervariable regionseter for modifisering kan alanin-skanningsmutagenese bli utført for å identifisere hypervariable regionrester som bidrar vesentlig til antigenbinding. Alternativt, eller i tillegg, så kan det være fordelaktig å analysere en krystallstruktur for antigen-antistoffkomplekset for å identifisere kontaktpunkter mellomantistoffet og antigenet. Slike kontaktrester og naborester er kandidater for substitusjon ifølge teknikkene som er utarbeidet her. Med én gang slike varianter er generert blir panelet av varianter utsatt for screening som beskrvet her og antistoffer med overlegne egenskaper i én eller flere relevante analyser kan bli valgt for ytterligere utvikling.
Nukleinsyremolekyler som koder for aminosyresekvens-varianter av antistoffetfremstilles ved en rekke forskjellige fremgangsmåter som er kjente innen faget. Disse
96 fremgangsmåtene omfatter isolering fra en naturlig kilde (når det gjelder naturlig forekommende aminosyresekvens-varianter) eller fremstilling ved oligonukleotid-mediert(eller setestyrt) mutagenese, PCR-mutagenese og kassettmutagenese av en tidligerefremstilt variant eller en ikke-variantversjon av antistoffet.
Det kan være ønskelig å innføre én eller flere aminosyremodifikasjoner i en Fcregion i immunglobulin-polypeptidene ifølge oppfinnelsen, slik at det dannes en Fc-regionvariant. Fc-regionvarianten kan omfatte en human Fc-regionsekvens (f.eks. en humantIgGl-, IgG2-, IgG3- eller IgG4-Fc-region) som omfatter en aminosyremodifisering (f.eks. ensubstitusjon) i én eller flere aminosyreposisjoner, innbefattet posisjonen for et hengselcystein.
I samsvar med denne beskrivelsen og læren innen teknikkens stand er det påtenkt at et antistoff anvendt i fremgangsmåter ifølge beskrivelsen i noen utførelser kan omfatte én eller flere endringer sammenlignet med det tilsvarende villtypeantistoff, for eksempel i Fcregionen. Disse antistoffene vil ikke desto mindre beholde vesentlig de samme karakteristika som er nødvendig for terapeutisk bruk sammenlignet med deres villtypemotpart. For eksempel er det er antatt at visse endringer kan bli gjort på Fc-regionen som vil føre tilendret (dvs. enten forbedret eller minsket) Clq-binding og/eller komplementavhengigcytotoksisitet (CDC), for eksempel som beskrevet i WO 99/51642. Se også Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988), US patentskrift nr. 5 648 260, US patentskrift nr. 5 624 821 ogWO 94/29351 når det gjelder andre eksempler på Fc-regionvarianter.
Immunkoniuaater
Beskrivelsen omtaler også immunkonjugater eller antistoff-legemiddelkonjugater(ADC), som omfatter et antistoff konjugert til et cytotoksisk middel, slik som et kjemoterapeutisk middel, et legemiddel, et vekstinhiberende middel, et toksin (f.eks. et enzymatisk aktivt toksin med opphav fra bakterier, sopp, planter eller dyr eller fragmenter derav) eller en radioaktiv isotop (dvs. et radiokonjugat).
Anvendelse av antistoff-legemiddelkonjugater for lokal tilførsel av cytotoksiske ellercytostatiske midler, dvs. midler som dreper eller inhiberer tumorceller, i behandling av kreft (Syrigos og Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614, Niculescu-Duvaz og Springer(1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172, US patentskrift 4 975 278) tillater teoretisk målstyrttilførsel av legemiddelgruppen til tumorer og intracellulær akkumulering i disse, dersom systemisk tilførsel av disse ikke-konjugerte legemiddelmidlene kan føre til et uakseptabeltnivå av toksisitet overfor normale celler så vel som tumorcellene som man forsøker å fjerne (Baldwin et al., (1986) Lancet s. (mar. 15., 1986):603-05, Thorpe, (1985) "AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", i Monoclonal Antibodies '84: Biological And clinical Applications, A. Pinchera et al. (red.), s. 475-506). Maksimal virkningmed minimal toksisitet er det man prøver å oppnå. Både polyklonale antistoffer og monoklonale antistoffer har blitt rapportert å være anvendbare i disse strategiene (Rowland et al..
(1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). Legemiddelen som anvendes i dissefremgangsmåtene omfatter daunomycin, doksorubicin, metotreksat og vindesin (Rowland et al., (1986), ovenfor). Toksiner som anvendes i antistoff-toksinkonjugater omfatter bakterietoksiner som difteritoksin, plantetoksiner som ricin, lavmolekylære toksiner som geldanamycin (Mandler et al. (2000) Jour, of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1572-1581;Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028, Mandler et al. (2002)Bioconjugate Chem. 13:786-791), maytansinoider (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), og calicheamicin (Lode et al. (1998) Cancer Res.58:2928, Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Toksinene kan utøve sinecytotoksiske og cytostatiske virkningen ved mekanismer som omfatter tubulinbinding, DNAbinding eller topoisomeraseinhibering. Noen cytotoksiske legemiddelen har en tendens til å være inaktive eller mindre aktive sammenlignet med store antistoffer eller proteinreseptorligander.
ZEVALIN (ibritumomab-tiuxetan, Biogen/Idec) er et antistoff/radioisotopkonjugatsammensatt av et murint, monoklonalt IgGl kappa-antistoff rettet mot CD20-antigenetfunnet på overflaten av normale og maligne B-lymfocytter og niIn eller 90Y bundet via entiourealinker-chelator (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77, Wisemanet al. (2002) Blood 99(12):4336-42, Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63,Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Selv om ZEVALIN har aktivitet mot Bcelle-ikke-Hodgkins lymfom (NHL) som før administrering til alvorlige og forlengedecytopenier hos de fleste pasienter. MYLOTARG (gemtuzumab-ozogamicin, WyethPharmaceuticals), et antistoff-legemiddelkonjugat som består av et humant CD33-antistoffkoblet til kalicheamicin, ble i 2000 godkjent for behandling av akutt myeloid leukemi ved injeksjon (Drugs of the Future (2000) 25(7): 686, US patentskrift nr. 4 970 198, 5 079 233, 5 585 089, 5 606 040, 5 693 762, 5 739 116, 5 767 285, 5 773 001). Kantuzumabmertansin (Immunogen, Inc.), et antistoff-legemiddelkonjugat som består av hu242antistoffet bundet via disulfidlinkeren SPP til maytansinoidlegemiddelenheten DM1, er på vei inn i fase-II-utredningen for behandlingen av kreftformer som uttrykker CanAg, slik somkolonkreft, pankreaskreft, magekreft og andre. MLN-2704 (Millenium Pharm., BZL Biologics,Immunogen, Inc.), et antistoff-medikamentkonjugat som består av et monoklonalt antistoffrettet mot prostataspesifikt membranantigen (PSMA), koblet til maytansinoid-legemiddelgruppen DM1, er under utvikling for mulig behandling av prostatatumorer. Auristatinpeptidene, auristatin E (AE) og monometylauristatin (MMAE), syntetiske analoger av dolastatin, ble konjugert til de kimære monoklonale antistoffene cBR96 (spesifikt for Lewis Y på karsonimer) og cACIO (spesifikt for CD30 på hematologiske maligniteter) (Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) og Francisco, et al. (2003) Blood, 102, 14581465) og er under terapeutisk utvikling. Andre forbindelser til anvendelse som legemiddelkonjugatcytotoksisitetsmidler inkluderer auristatin-E (AE), MMAF (en variant av auristatin-E(MMAE) med et fenylalanin på den C-terminale enden av legemidlet) og AEVB (auristatin-E
98 valerylbenzylhydrazon, som er en syrelabil linker gjennom C-terminalen til AE). Nyttigekonjugatlinkere for å koble et legemiddel til et antistoff inkluderer uten begrensning MC (maleimidokaproyl). Val Cit (valin-sitrullin, dipeptidsete på proteasekløyvbar linker), Citrullin(2-amino-5-ureido-pentansyre), PAB (p-aminobenzylkarbamoyl, som er en "selvofrende" delav en linker). Me (N-metyl-valincitrullin der linkerpeptidbindingen har blitt modifisert for åforhindre dens kløyving ved katepsin-B), MC(PEG)6-OH (maleimidokaproyl-polyetylenglykol,bundet til antistoffcysteinet), SPP (N-suksinimidyl-4-(2-pyridyltio)pentanoat), og SMCC (Nsyksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)sykloheksan-l-karboksylat). Disse og andre nyttigelegemiddelkonjugater og deres fremstilling er for eksempel tilkjennegjort i Doronina, S.O. et al., Nature Biotechnology 21:778-794 (2003). Spesielt foretrukne linkermolekyler inkludererf.eks. N-suksinimidyl-3-(2-pyridyldito)propionat (SPDP) (se f.eks. Carlsson et al., Biochem.J., 173, 723-737 (1978)), N-suksinimidyl-4-(2-pyridylditio)butanoat (SPDB) (se f.eks. USpatentskrift nr. 4 563 304), N-suksinimidyl-4-(2-pyridylditio)pentanoat (SPP) (se f.eks. CASregistreringsnummer 341498-08-6), N-suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)sykloheksan-lkarboksylat (SMCC) (se f.eks. Yoshitake et al.. Eur. J. Biochem., 101, 395-399 (1979)) ogN-suksinimidyl-4-metyl-4-[2-(5-nitro-pyridyl)-ditio]pentanoat (SMNP) (se f.eks. USpatentskrift nr. 4 563 304).
Kjemoterapeutiske midler som er nyttige i fremstillingen av slike immunkonjugater har blitt beskrevet ovenfor. Enzymatisk aktive toksiner eller fragmenter derav som kan bli benyttet inkluderer difteri-A-kjede, ikke-bindende aktive fragmenter av difteritoksin,eksotoksin-A-kjede (fra Pseudomonoas aeruginosa), ricin-A-kjede, abrin-A-kjede, modeccinA-kjede, alfa-sarcin, Aleurites fordii-proteiner, diantinproteiner, Phytolaca americanaproteiner (PAPI, PAPII og PAP-S), momordica charanctia-inhibitor, kursin, krotin, sapaonariaofficinalis-inhibitorer, gelonin, mitogellin, restriktocin, fenomycin, enomycin ogtrikotecenene. En mengde radionuklider er tilgjengelige for fremstillingen av radiokonjugert antistoff. Eksempler inkluderer 212Bi, 131I, 131In, 90Y og 186Re. Konjugater av antistoffet og det cytotoksiske midlet blir fremstilt ved å benytte en mengde bifunksjonelle proteinkoblingsmidler slik som N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditiol)-propionat (SPDP), iminotiolan (IT),bifunksjonelle derivater av imidoestere (slik som dimetyladipimidat-HCI), aktive estere (sliksom disuksinimidylsuberat), aldehyder (slik som glutaraldehyd), bis-azido-forbindelser (sliksom bis-(p-azidobenzoyl)heksandiamin), bis-diazoniumderivater (slik som bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin), diisocyanater (slik som toluen-2,6-diisocyanat) og bis-aktivefluorforbindelser (slik som l,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Et ricinimmuntoksin kan f.eks. blifremstilt som beskrevet i Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Karbon-14-merket-lisotiocyanatbenzyl-3-metyldietylentriaminpentaeddiksyre (MX-DTPA) er et eksempelmessiggelaterende middel for konjugering av radionukleid til antistoffet. Se WO 94/11026.
Konjugater av et antistoff og ett eller flere småmolekyltoksiner, slik som kalicheamycin, maytansinoider, et trikotecen og CC1065, og derivatene av disse toksinene som har toksinaktivitet, er også påtenkt her.
Maytansin og maytansinoider
Et antistoff (fullengde eller fragment) ifølge oppfinnelsen kan bli konjugert til ett eller flere maytansinoidmolekyler.
Maytansinoider er mitotiske inhibitorer som virker ved å inhibere tubulinpolymerisering. Maytansin ble først isolert fra den øst afrikanske busken Maytenus serrata (US patentskrift nr. 3 896 111). Deretter ble det oppdaget at visse mikrober også produserer maytansinoider, slik som maytansinol og C-3-maytansinolestere (US patentskriftnr. 4 151 042). Syntetisk maytansinol og derivater og analoger derav f.eks. tilkjennegjort i US patentskrift nr. 4 137 230, 4 248 870, 4 256 746, 4 260 608, 4 265 814, 4 294 757, 4 307 016, 4 308 268, 4 308 269, 4 309 428, 4 313 946, 4 315 929, 4 317 821, 4 322 348, 4 331 598, 4 361 650, 4 364 866, 4 424 219, 4 450 254, 4 362 663 og 4 371 533.
Maytansinoid-antistoffkonjugater
I et forsøk på å forbedre den terapeutiske indeks har maytansin og maytansinoider blitt konjugert til antistoffer som spesifikt bindes til tumorcelleantigener. Immunkonjugater som omfatter maytansinoider og terapeutisk anvendelse av dem beskrives for eksempel i US patentskrifter nr. 5 208 020, 5 416 064 og europeisk patentskrift EP 0 425 235 Bl. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) beskrev immunkonjugater somomfattet et maytansinoid betegnet DM1 koblet til det monoklonale antistoff C242, som er rettet mot human kolorektal kreft. Konjugatet ble funnet å være svært cytotoksisk mot dyrkede kolonkreftceller og viste antitumoraktivitet i en in v/Vo-tumorvekstanalyse. Chari etal.. Cancer Research 52:127-131 (1992) beskriver immunkonjugater hvori et maytansionoidvar konjugert via en disulfidlinker til det murine antistoffet A7 som binder til et antigen på humane kolonkreftcellelinjer, eller til et annet murint, monoklonalt antistoff TA. 1 som binder HER2-/neu-onkogen. Cytotoksisiteten til TA. 1-maytansinoidkonjugatet ble testet in vitro påden humane brystkreftcellelinjen SK-BR-3, som uttrykker 3 x 105 HER-2-overflateantigenerpr. celle. Legemiddelkonjugatet oppnådde en cytotoksisitetsgrad lignende den for fritt maytansinoidlegemiddel, som kunne bli økt ved å øke antallet maytansinoidmolekyler pr. antistoffmolekyl. A7-maytansinoidkonjugatet viste lav systemisk cytotoksisitet hos mus.
Antistoff-maytansinoidkonjugater (immunkonjugater)
Antistoff-maytansinoidkonjugater blir fremstilt ved kjemisk å binde et antistoff til etmaytansinoidmolekyl uten vesentlig å minske den biologiske aktiviteten til verken antistoffet eller maytansinoidmolekylet. Et gjennomsnitt på 3-4 maytansinoidmolekyler konjugert pr.antistoffmolekyl har blitt vist effektivt i å forsterke cytotoksisitet for målceller uten negativt å påvirke virkningen eller løseligheten til antistoffet, selv om til og med ett molekyl med toksin/antistoff vil være forventet å forsterke cytotoksisitet i forhold til anvendelsen av nakent antistoff. Maytansinoider er velkjente på fagområdet og kan bli syntetisert ved hjelp
av kjente teknikker eller isolert fra naturlige kilder. Passende maytansinoider er for eksempel tilkjennegjort i US patentskrift nr. 5 208 020 og i de andre patentene og ikkepatentpublikasjonene som er referert til her ovenfor. Foretrukne maytansinoider er maytansinol og maytansinolanaloger som er modifisert på den aromatiske ringen eller på andre posisjoner på maytansinolmolekylet, slik som ulike maytansinolestere.
Det er kjent mange linkergrupper på fagområdet for å fremstille antistoffmaytansinoidkonjugater, inkludert for eksempel de som er tilkjennegjort i patentskrift nr. 5 208 020 eller EP patentskrift 0 425 235 Bl og Chari et al.. Cancer Research 52:127-131(1992). Linkergruppene inkluderer disulfidgrupper, tioetergrupper, syrelabile grupper, fotolabile grupper, peptidaselabile grupper eller esteraselabile grupper, som tilkjennegjort i de ovenfor identifiserte patentene, der disulfid- og tioetergrupper er foretrukket.
Konjugater mellom antistoffet og maytansinoid kan fremstilles ved anvendelse av en rekke forskjellige bifunksjonelle proteinkoblingsmidler, slik som N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)-propionat (SPDP), suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)-sykloheksan-l-karboksylat,iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere (slik som dimetyladipimidat-HCI),aktive estere (slik som disuksinimidylsuberat), aldehyder (slik som glutaraldehyd), bisazido-forbindelser (slik som bis(p-azidobenzoyl)-heksandiamin), bis-diazoniumderivater (sliksom bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin), diisocyanater (slik som toluen-2,6-diisocyanat), og bis-aktive fluorforbindelser (slik som l,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Spesieltforetrukne koblingsmidler omfatter N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat (SPDP)(Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978] og N-suksinimidyl-4-(2-pyridyltio)pentanoat (SPP) for dannelse av en disulfidbinding.
Linkeren kan være bundet til maytansinoidmolekylet i forskjellige posisjoner avhengig av typen binding. For eksempel kan en esterbinding dannes ved reaksjon med en hydroksylgruppe ved anvendelse av konvensjonelle koblingsteknikker. Reaksjonen kan skje i C-3-posisjonen med en hydroksylgruppe, C-14-posisjonen modifisert med hydroksymetyl,C-15-posisjonen modifisert med en hydroksylgruppe og C-20-posisjonen med en hydroksylgruppe. I en foretrukket utførelse dannes bindingen i C-3-posisjonen i maytansinol eller enmaytansinolanalog.
Kalicheamicin
Et annet immunkonjugat av interesse omfatter et antistoff konjugert til ett eller flere kalicheamicinmolekyler. Kaleicheamicinfamilien av antibiotika kan gi dobbelttrådede DNA-brudd i sub-pikomolare konsentrasjoner. For fremstilling av konjugater avkalicheamicinfamilien, se US patentskrifter nr. 5 712 374, 5 714 586, 5 739 116, 5 767 285, 5 770 701, 5 770 710, 5 773 001, 5 877 296 (alle tilhørende American Cyanamid Company). Strukturanaloger av kalicheamicin som kan anvendes omfatter yi1, a?1, as1, N-acetyl-yi1,PSAG og 9[i (Hinman et al.. Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al.. CancerResearch 58:2925-2928 (1998) og de ovenfor nevnte US patentskrifter tilhørende American
Cyanamid). Et annet anti-tumorlegemiddel som antistoffet kan bli konjugert til er QFA somer et antifolat. Bade kalicheamycin og QFA har intracellulære virkningsseter og krysser ikke enkelt plasmamembranen. Derfor øker cellulært opptak av disse midlene gjennom antistoffmediert internalisering kraftig deres cytotoksiske effekter.
Andre cytotoksiske midler
Andre antitumormidler som kan konjugeres til antistoffene ifølge oppfinnelsen omfatter BCNU, streptozoicin, vinkristin og 5-fluoruracil, familien av midler som under ettbetegnes LL-E33288-kompleks, som beskrives i US patentskrifter nr. 5 053 394 og5 770 710, så vel som esperamiciner (US patentskrift nr. 5 877 296).
Enzymatisk aktive toksiner og fragmenter derav som kan anvendes omfatter difteri A-kjede, ikke-bindende, aktive fragmenter av difteritoksin, eksotoksin A-kjede (fraPseudomonas aeruginosa), ricin A-kjede, abrin A-kjede, modeccin A-kjede, alfa-sarcin,Aleurites fordii- proteiner, diantinproteiner, Phytolaca americana-protein er (PAPI, PAPII ogPAP-S), momordica charanctia-inhibitor, kurcin, krotin, sapaonaria officinalis-inhibitor,gelonin, mitogellin, restriktocin, fenomycin, enomycin og trikotecenene. Se for eksempel WO 93/21232, offentliggjort 28. oktober 1993.
Foreliggende beskrivelse omtaler ytterligere et immunkonjugat som er dannet mellom et antistoff og en forbindelse med nukleolytisk aktivitet (f.eks. en ribonuklease eller en DNA-endonuklease slik som en deoksyribonuklease, DNase).
For selektiv ødeleggelse av tumoren kan antistoffet omfatte et svært radioaktivt atom. En mengde radioaktive isotoper er tilgjengelige for fremstillingen av radiokonjugerte antistoffer. Eksempler inkluderer Ar211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 og radioaktive isotoper av Lu. Når konjugatet blir benyttet til påvisning kan det omfatte et radioaktivt atom for scintigrafiske undersøkelser, f.eks. tc99m eller I123, eller et spinnmerke for nukleærmagnetisk resonans (NMR) synliggjøring (også kjent som magnetisk resonanssynliggjøring, mri), slik som jod-123 igjen, jod-131, indium-111, fluor-19, karbon-13,nitrogen-15, oksygen-17, gadolinium, mangan eller jern.
Radiomerkene eller de andre merkene kan bli inkorporert i konjugatet på kjente måter. Peptidet kan for eksempel bli biosyntetisert eller kan bli syntetisert ved hjelp av kjemisk aminosyresyntese ved å benytte passende aminosyreforløpere som f.eks. involverer fluor-19 i stedet for hydrogen. Merker slik som tc99m eller I123, Re186, Re188 og In111 kan blikoblet til via en cysteinrest på peptidet. Yttrium-90 kan bli koblet via en lysinrest. IODOGENfremgangsmåten (Frakeretal. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 kan blibenyttet for å inkorporere jod-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) beskriver andre fremgangsmåter i detalj.
Konjugater av antistoffer og det cytotoksiske middel kan fremstilles ved anvendelse av en rekke forskjellige bifunksjonelle proteinkoblingsmidler, slik som N-suksinimidyl-3-(2pyridylditio)propionat (SPDP), suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)sykloheksan-l
karboksylat, iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere (slik som dimetyladipimidat-HCI), aktive estere (slik som disuksinimidylsuberat), aldehyder (slik somglutaraldehyd), bis-azidoforbindelser (slik som bis(p-azidobenzoyl)heksandiamin), bisdiazoniumderivater (slik som bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin), diisocyanater (sliksom toluen-2,6-diisocyanat), og bis-aktive fluorforbindelser (slik som l,5-difluor-2,4dinitrobenzen). For eksempel kan et ricinimmuntoksin fremstilles som beskrevet i Vitetta et al.. Science 238:1098 (1987). Karbon-14-merket l-isotiocyanatobenzyl-3-metyldietylentriaminpentaeddiksyre (MX-DTPA) er et eksempel på et chelateringsmiddel for konjugeringav radionukleotid til antistoffet. Se WO 94/11026. Linkeren kan være en "kløyvbar linker" som fremmer frigjøring av det cytotoksiske legemidlet i cellen. For eksempel kan en syrelabil linker, peptidasesensitiv linker, fotolabil linker, dimetyllinker eller disulfidinneholdende linker (Chari et al.. Cancer Research 52: 127-131 (1992), US patentskrift nr. 5 208 020).
Forbindelsen ifølge beskrivelsen omfatter ADC fremstilt med krysslinkerreagenser: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH,sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC og sulfo-SMPB ogSVSB (suksinimidyl-(4-vinylsulfon)benzoat) som er kommersielt tilgjengelig (f.eks. fra PierceBiotechnology, Inc., Rockford, IL., USA). Se s. 467-498, 2003-2004 Applications Handbookog katalog.
Fremstilling av antistoff-legemiddelkonjugater
I antistoff-legemiddelkonjugater (ADC) er et antistoff (Ab) konjugert til én eller flerelegemiddelenheter (D), f.eks. omtrent 1 til omtrent 20 legemiddelenheter pr. antistoff, via en linker (L). ADC med formel I kan bli fremstilt på flere måter som benytter organiske kjemireaksjoner, betingelser og reagenser som er kjent for fagfolk på området inkludert: (1) reaksjon av en nukleofil gruppe på et antistoff med et bivalent linkerreagens for å danne AbL, via en kovalent binding, etterfulgt av reaksjon med en legemiddelenhet (D), og (2) reaksjon med en nukleofil gruppe på en legemiddelenhet med et bivalent linkerreagens for å danne D-L, via en kovalent binding, etterfulgt av reaksjon med den nukleofile gruppen på etantistoff.
Ab-(L-D)P (I)
Nukleofile grupper på antistoffer inkluderer: (i) N-terminale amingrupper, (ii)sidekjedeamingrupper, f.eks. lysin (iii) sidekjedetiolgrupper, f.eks. cystein og (iv) sukkerhydroksyl- eller aminogrupper der antistoffet er glykosylert. Amin-, tiol- og hydroksylgrupper er nukleofile og i stand til å reagere for å danne kovalente bindinger med elektrofile grupper på linkerenheter og linkerreagenser inkludert: (i) aktive estere slik som NHS-estere,HOBt-estere, haloformater og syrehalider, (ii) alkyl- og benzylhalider slik som haloacetamider, (iii) aldehyder, ketoner, karboksyl- og maleimidgrupper. Visse antistoffer harreduserbare interkjededisulfider, dvs. cysteinbroer. Antistoffer kan bli gjort reaktive for
konjugering med linkerreagenser ved behandling med et reduserende middel slik som DTT (ditiotreitol). Hver cysteinbro vil slik teoretisk danne to reaktive tiolnukleofiler. Ytterligere nukleofile grupper kan bli introdusert på antistoffene via reaksjonen av lysiner med 2iminotiolat (Trauts reagens) som fører til konvertering av et amin til en tiol.
Antistofflegemiddelkonjugater kan også bli fremstilt ved modifisering av antistoffet for å introdusere elektrofile enheter, som kan reagere med de nukleofile substituentene på linkerreagenset eller legemidlet. Sukkerne på glykosylerte antistoffer kan være oksiderte, f.eks. med periodatoksiderende reagenser, for å danne aldehyd- eller ketongrupper som kanreagere med amingruppen på linkerreagenset eller legemiddelenhetene. De resulterende imin-Schiff-basegruppene kan danne en stabil binding, eller kan bli redusert, f.eks. ved hjelpav borhydridreagenser for å danne stabile amin-bindinger. I én utførelsesform kan reaksjonav karbohydratdelen til et glykosylert antistoff med enten galaktoseoksidase eller natriummetaperiodat i karbonylgrupper (aldehyd- og ketongrupper) på proteinet som kanreagere med passende grupper på legemidlet (Hermanson, Bioconjugat Techniques). I en annen utførelsesform kan proteiner som inneholder N-terminale serin- eller treoninresterreagere med natriummetaperiodat, som fører til produksjon av et aldehyd istedenfor den første aminosyren (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146, US5 362 852). Slike aldehyder kan bli reagert med en legemiddelenhet eller en linkernukleofil.
Likeledes inkluderer nukleofile grupper på en legemiddelenhet: amin-, tiol-,hydroksyl-, hydrazid-, oksim-, hydrazin-, tiosemikarbazon-, hydrazinkarboksylat- ogarylhydrazidgrupper som er i stand til å reagere for å danne kovalente bindinger med elektrofile grupper på linkerenheter og linkerreagenser inkludert (i) aktive estere slik som NHS-estere, HOBt-estere, haloformater og syrehalider, (ii) alkyl- og benzylhalider slik somhaloacetamider, (iii) aldehyder, ketoner, karboksyl- og maleimidgrupper.
Alternativt kan et fusjonsprotein som omfatter antistoffet og det cytotoksiske midlet bli fremstilt, f.eks. ved hjelp av rekombinante teknikker eller peptidsyntese. Lengden av DNA kan omfatte respektive regioner som koder for de to delene av konjugatet enten inntil hverandre eller separert av en region som koder for et linkerpeptid som ikke ødelegger de ønskede egenskapene til konjugatet.
Antistoffet kan bli konjugert til en "reseptor" (slik som streptavidin) til anvendelse i tumorforhåndsmålsøking der antistoffreseptorkonjugatet blir administrert til pasienten etterfulgt av fjerning av ubundet konjugat fra sirkulasjon ved å benytte et klaringsmiddel og deretter administrering av en "ligand" (f.eks. avidin) som er konjugert til et cytotoksisk middel (f.eks. et radionukleotid).
Antistoffderivater
Antistoffene ifølge foreliggende beskrivelse kan ytterligere bli modifisert slik at de inneholder ytterligere ikke-proteininneholdende enheter som er kjent på fagområdet og somer enkelt tilgjengelige. Fortrinnsvis er enhetene som er passende til derivatisering av anti
104 stoffet vannløselige polymerer. Ikke-begrensende eksempler på vannløselige polymererinkluderer polyetylenglykol (PEG), kopolymerer av etylenglykol/-propylenglykol, karboksymetylcellulose, dekstran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, poly-l,3,-dioksolan, poly1,3,6-trioksan, etylen/eplesyreanhydridkopolymer, polyaminosyrer (enten homopolymerereller tilfeldige kopolymerer) og dekstran eller poly(n-vinylpyrrolidon)-polyetylenglykol,propropyleng ly kol homopolymerer, prolypropylenoksid/etylenoksid-kopolylerer, polyoksyetylerte polyoler (f.eks. glyserol), polyvinylalkohol og blandinger derav. Polyetylenglykolpropionaldehyd kan ha fordeler i fremstilling på grunn av dens stabilitet i vann. Polymeren kan være av enhver molekylvekt, og kan være forgrenet eller uforgrenet. Antallet polymerer som er koblet til antistoffet kan variere, og hvis mer enn én polymer er tilkoblet kan de være det samme molekylet eller ulike molekyler. Vanligvis kan antallet og/eller typen av polymerer som blir benyttet til derivatisering bli bestemt ved overveielser inkludert de spesielle egenskapene eller funksjonene til antistoffet som skal bli forbedret, uansett om antistoffderivatet vil bli benyttet i en terapi ved definerte betingelser, osv.
Farmasøytiske formuleringer
Terapeutiske formuleringer som omfatter et antistoff ifølge oppfinnelsen blir fremstilt for lagring ved å blande antistoffet som har den ønskede graden av renhet med eventuelt fysiologisk akseptable bærere, eksipienser eller stabilisatorer (R.emington's Pharmaceutical Sciences 16. utgave, Osol, A. red. (1980)), i form av vandige løsninger, lyofiliserte eller andre tørkede formuleringer. Akseptable bærere, eksipienser eller stabilisatorer er ikke-toksiske for mottakerne ved doseringene og konsentrasjonene som blirbenyttet, og inkluderer buffere slik som fosfat, sitrat, histidin og andre organiske syrer, antioksidanter inkludert askorbinsyre og metionin, preserveringsmidler (slik som oktadecyldimetylbenzylammoniumklorid, heksametoniumklorid, benzalkoniumklorid, benzetoniumklorid, fenol, butyl- eller benzylalkohol, alkylparabener slik som metyl-propylparaben,katechol, resorcinol, sykloheksanol, 3-pentanol og m-kresol), lavmolekylærvektspolypeptider(mindre enn omtrent 10 rester), proteiner slik som serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner, hydrofile polymerer slik som polyvinylpyrrolidon, amiosyrer slik som glysin, glutamin, asparagin, histidin, arginin eller lysin, monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater inkludert gluklose, mannose eller dekstriner, gelaterende midler slik som EDTA, sukkertyper slik som sukrose, mannitol, trehalose eller sorbitol, saltdannende motioner slik som natrium, metallkomplekser (f.eks. Zn-proteinkomplekser) og/eller ikkeioniske overflateaktive midler slik som TWEEN, PLURONICS eller polyetylenglykol (PEG).
Formuleringen her kan også inneholde mer enn én aktiv forbindelse slik det er nødvendig for den spesielle indikasjonen som blir behandlet, fortrinnsvis de med komplementære aktiviteter som ikke skadelig påvirker hverandre. Slike molekyler er hensiktsmessig tilstede i kombinasjon i mengder som er effektive for formålet som er påtenkt.
De aktive ingrediensene kan også bli fanget inn i mikrokapsler som for eksempel er fremstilt ved hjelp av koacerveringsteknikker eller ved grenseflatepolymerisering, for eksempel hydroksymetylcellulose eller gelatinmikrokapsler og poly-(metylmetacylat)mikrokapsler, i kolloidale legemiddelleveringssystemer (for eksempel liposomer, albuminmikrokuler, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler) eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er tilkjennegjort i Remington's Pharmaceutical Sciences 16. utgave, Osol, A. red. (1980).
Formuleringene som skal bli benyttet til in v/Vo-administrering må være sterile.Dette kan enkelt bli oppnådd ved filtrering gjennom sterilfiltreringsmembraner.
Sammensetninger med vedvarende frigjøring kan bli fremstilt. Passende eksempler på sammensetninger med vedvarende frigjøring inkluderer halvgjennomtrengelige matriser av faste, hydrofobe polymerer som inneholder immunglobulin ifølge oppfinnelsen, der matrisene foreligger i form av formgitte artikler, f.eks. filmer eller mikrokapsler. Eksempler på matriser med vedvarende frigjøring inkluderer polyestere, hydrogeler (for eksempel poly(2-hydroksyetylmetakrylat) eller poly(vinylalkohol)), polylaktider (US patentskrift nr.3 773 919), kopolymerer av L-glutaminsyre og y-etyl-L-glutamat, ikke-nedbrytbart etylenvinylacetat, nedbrytbare melkesyre-glykolsyrekopolymerer slik som LUPRON DEPOT(injiserbare mikrokuler sammensatt av melkesyre-glykolsyrekopolymer og leuprolidacetat)og poly-D-(-)-3-hydroksysmørsyre. Mens polymerer slik som etylenvinylacetat ogmelkesyre-glykolsyre muliggjør frigjøring av molekyler i mer enn 100 dager så frigjør vissehydrogeler proteinene i kortere tidsperioder. Når innkapslede immunglobuliner forblir i kroppen i lang tid kan de denaturere eller aggregere som et resultat av eksponering for fuktighet ved 37 °C, noe som fører til et tap av biologisk aktivitet og mulige endringer i immunogenisitet. Rasjonelle strategier kan bli benyttet for stabilisering avhengig av mekanismen som er involvert. For eksempel hvis aggregeringsmekanismen blir oppdaget å være intermolekylær S-S-bindingsdannelse via tiodisulfidinterendring så kan stabilisering blioppnådd ved å modifisere sulfhydrylrester, lyofilisere fra sure løsninger, kontrollere fuktighetsinnhold, benytte passende tilsetningsstoffer og utvikle spesifikke polymermatrikssammensetninger.
Anvendelser
Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan for eksempel bli benyttet i in vitro-, ex vivo- ogin v/Vo-terapeutiske fremgangsmåter. Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan bli benyttet som enantagonist for delvis eller fullstendig å blokkere den spesifikke antigenaktiviteten in vitro, ex vivo og/eller/n vivo. Minst noen av antistoffene ifølge oppfinnelsen kan videre nøytralisere antigenaktivitet fra andre arter. Dermed kan antistoffene ifølge oppfinnelsen bli benyttet for å inhibere en spesifikk antigenaktivitet, f.eks. i en cellekultur som inneholder antigenet, hos humane individer eller i andre pattedyrindivider som har antigenet som antistoff ifølge oppfinnelsen kryssreagerer med (f.eks. sjimpanse, bavian, marmosettape, cynomolgusape
og resusape, gris eller mus). I én utførelsesform kan antistoffet ifølge oppfinnelsen bli benyttet for å inhibere antigenaktiviteter ved å kontakte antistoffet med antigenet slik at antigenaktiviteten blir inhibert. Fortrinnsvis er antigenet et humant proteinmolekyl.
I én utførelsesform kan et antistoff ifølge oppfinnelsen bli benyttet i en fremgangsmåte for å inhibere et antigen hos et individ som lider av en forstyrrelse der antigenaktiviteten er skadelig, som omfatter å administrere et antistoff ifølge oppfinnelsen til individet slik at antigenaktiviteten hos individet ble inhibert. Fortrinnsvis er antigenet et humant proteinmolekyl og individet er et humant individ. Alternativt kan individet være et pattedyr som uttrykker antigenet som et antistoff ifølge oppfinnelsen binder til. Ytterligere kan individet være et pattedyr i hvilket antigenet har blitt introdusert (f.eks. ved administrering av antigenet eller ved uttrykking av et antigentransgen). Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan bli administrert til et humant individ for terapeutiske formål. Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan videre bli administrert til et ikke-humant pattedyr som uttrykker etantigen som immunglobulinet kryssreagerer med (f.eks. en primat, gris eller mus) for veterinærhensikter eller som en dyremodell for human sykdom. Når det gjelder det siste kan slike dyremodeller være nyttige for å evaluere den terapeutiske effektiviteten av antistoffer ifølge oppfinnelsen (f.eks. for å teste doseringer og tidsforløp ved administrering). Blokkerende antistoffer ifølge oppfinnelsen som er terapeutisk nyttige inkluderer for eksempel anti-HER2-, anti-VEGF-, anti-IgE-, anti-CDll-, anti-interferon- og antivevsfaktorantistoffer. Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan bli benyttet til å behandle, inhibere, forsinke progresjon av, forhindre/forsinke tilbakekomst av, lindre, eller forhindre sykdom, forstyrrelse eller tilstander som er assosiert med unormal uttrykking og/eller aktivitet for ett eller flere antigenmolekyler, inkludert maligne og godartede tumorer, ikkeleukemier og lymfoide maligniteter, nevronforstyrrelser, gliforstyrrelser, astrocyttforstyrrelser, hypotalamusforstyrrelser og andre glandulære forstyrrelser, makrofagforstyrrelser, epitelforstyrrelser, stromaforstyrrelser og blastokolforstyrrelser, og inflammatoriske, angiogene og immunologiske forstyrrelser.
I ett aspekt er et blokkerende antistoff ifølge beskrivelsen spesifikt for et ligandantigen og inhiberer antigenaktiviteten ved å blokkere eller interferere med ligand-reseptorinteraksjonen som involverer ligandantigenet, for derved å inhibere den tilsvarende signalveien og andre molekylære eller cellulære hendelser. Beskrivelsen fremmer også reseptorspesifikke antistoffer som ikke nødvendigvis forhindrer ligandbinding men som interfererer med reseptoraktivering, for derved å inhibere enhver respons som normalt vil bli satt i gang ved ligandbindingen. Beskrivelsen omfatter også antistoffer som enten fortrinnsvis eller eksklusivt binder til ligand-reseptorkomplekset. Et antistoff ifølgebeskrivelsen kan også virke som en agonist for en spesiell antigenreseptor, for derved å styrke, forsterke eller aktivere enten alle eller partielle aktiviteter for den ligandmedierte reseptoraktiveringen.
I visse utførelsesformer blir et immunkonjugat som omfatter et antistoff konjugert til et cytotoksisk middel administrert til pasienten. I noen utførelsesformer blir immunkonjugatet og/eller antigenet som de er bundet til internalisert av cellen, noe som fører til økt terapeutisk effektivitet for immunkonjugatet i å drepe den målsøkte cellen som det binder til. I én utførelsesform målsøker eller interfererer det cytotoksiske midlet med nukleinsyre i målcellen. Eksempler på slike cytotoksiske midler inkluderer ethvert av de kjemoterapeutiske midlene som er fremlagt her (slik som et maytansinoid eller et kalicheamycin), en radioaktiv isotop eller en ribonuklease eller en DNA-endonuklease.
Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan bli benyttet enten alene eller i kombinasjon med andre sammensetninger i en terapi. For eksempel kan et antistoff ifølge oppfinnelsen bli administrert sammen med et annet antistoff, kjemoterapeutisk middel/midler (inkludert blandinger av kjemoterapeutiske midler), andre cytotoksiske midler, antiangiogene midler, cytokiner og/eller vekstinhibitoriske midler. Der et antistoff ifølge oppfinnelsen inhiberer tumorvekst kan det være spesielt ønskelig å kombinere det med ett eller flere andre terapeutiske midler som også inhiberer tumorvekst. Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan f.eks. bli kombinert med et anti-VEGF-antistoff (f.eks. AVASTIN) og/eller anti-ErbBantistoffer (f.eks. HERCEPTIN anti-HER2-antistoff) i et behandlingsskjema, f.eks. vedbehandling av enhver av sykdommene som er beskrevet her, inkludert kolorektal kreft, metastatisk brystkreft og nyrekreft. Alternativt, eller i tillegg, så kan pasienten motta kombinert strålingsterapi (f.eks. ekstern strålebestrålning eller terapi med et radioaktivt merket middel, slik som et antistoff). Slike kombinerte terapier som er påpekt ovenfor inkluderer kombinert administrering (der de to eller flere midlene er inkludert i den samme eller i separate formuleringer) og separat administrering, i hvilket tilfelle administreringen av antistoffet ifølge oppfinnelsen kan foregå før og/eller etter administrering av den tilhørende terapien eller terapiene.
Antistoffet ifølge oppfinnelsen (og det tilhørende terapeutiske midlet) blir administrert på enhver passende måte, inkludert parenteralt, subkutant, intraperitonealt, intrapulmonært og intranasalt, og, hvis ønskelig for lokalbehandling, intralesjonal administrering. Parenterale infusjoner inkluderer intramuskulær, intravenøs, intraarteriell, intraperitoneal eller subkutan administrering. I tillegg blir antistoffet hensiktsmessig administrert ved hjelp av pulsinfusjon, spesielt med minskende doser av antistoffet. Dosering kan foregå på enhver passende måte, f.eks. ved injeksjoner, slik som intravenøse eller subkutane injeksjoner, delvis avhengig av hvorvidt administreringen er kort eller kronisk.
Antistoffsammensetningen ifølge oppfinnelsen vil bli formulert, dosert og administrert på en måte som er i overenstemmelse med god medisinsk utøvelse. Faktorer til overveielse i denne konteksten inkluderer den spesielle forstyrrelsen som blir behandlet, det spesielle pattedyret som blir behandlet, den kliniske tilstanden til den individuelle pasienten, årsaken til forstyrrelsen, stedet for levering av midlet, fremgangsmåten for administrering.
108 skjemaet for administrering og andre faktorer som er kjent for medisinske utøvere. Antistoffet behøver ikke å være, men er eventuelt formulert sammen med ett eller flere midler som pr. i dag blir benyttet til å forebygge eller behandle forstyrrelsen det er snakk om. Den effektive mengden av slike og andre midler avhengig av mengden av antistoffer ifølge oppfinnelsen som foreligger i formuleringen, typen av forstyrrelse eller behandling og andre faktorer som er diskutert ovenfor. Disse blir generelt benyttet i de samme doseringene og med administreringsmåter som er benyttet her før, eller omtrent fra 1-99 %av de inntil dette benyttede doseringene.
Til forebyggingen eller behandlingen av sykdom vil den passende doseringen av et antistoff ifølge oppfinnelsen (når det blir benyttet alene eller i kombinasjon med andre midler slik som kjemoterapeutiske midler) være avhengig av sykdomstypen som skal bli behandlet, antistofftypen, alvorligheten og utviklingen av sykdommen, hvorvidt antistoffet blir administrert for preventive eller terapeutiske formål, tidligere terapi, pasientens kliniske historie og respons på antistoffet, og vurderingene til den ansvarlige legen. Antistoffet blir hensiktsmessig administrert til pasienten én gang eller over en serie behandlinger. Avhengig av typen og alvorligheten av sykdommen er omtrent 1 jutg/kg til 15 mg/kg (f.eks. 0,1 mg/kg til 10 mg/kg) med antistoff en utgangskandidatdosering for administrering til pasienten, hvor dette f.eks. er ved én eller ved flere separate administreringer, eller ved kontinuelig infusjon. En typisk daglig dosering kan strekke seg fra omtrent 1 jutg/kg til 100 mg/kg eller mer, avhengig av faktorene som er nevnt ovenfor. For repeterte administreringer over flere dager eller lengre, avhengig av betingelsen, så blir behandlingen opprettholdt inntil en ønsket undertrykking av sykdomssymptomene forekommer. En eksempelmessig dosering av antistoffet vil ligge i området fra omtrent 0,05 mg/kg til omtrent 10 mg/kg. Slik kan én eller flere doser på omtrent 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg eller 10 mg/kg (eller enhver kombinasjon derav) bli administrert til pasienten. Slike doser kan bli administrert avbrutt, f.eks. hver uke eller hver tredje uke (f.eks. slik at pasienten mottar fra omtrent 2 til omtrent 20, f.eks. omtrent 6 doser av antistoffet). En første høyere dose, etterfulgt av én eller flere lavere doser kan bli administrert. Et eksempelmessig doseringsregime omfatter å administrere en utgangsdose på omtrent 4 mg/kg, etterfulgt av en ukentlig opprettholdelsesdose på omtrent 2 mg/kg med antistoffet. Imidlertid kan andre doserings-regimervære nyttige. Utviklingen av denne terapien er enkel å overvåke ved hjelp av konvensjonelle teknikker og analyser.
Fremstilte artikler
En fremstilt artikkel som inneholder materialer som er nyttige for behandlingen, forebyggingen og/eller diagnostiseringen av forstyrrelsen som er beskrevet ovenfor er tilveiebrakt. Den fremstilte artikkelen omfatter en beholder og et merke eller pakningsvedlegg på eller assosiert med beholderen. Passende beholdere inkluderer f.eks. flasker, rør, sprøyter, osv. Beholderne kan bli utformet fra en mengde materialer slik som glass eller plastikk. Beholderne inneholder en sammensetning som i seg selv eller når det blir kombinert med et annen sammensetning er effektivt til å behandle, forebygge og/eller diagnostisere tilstanden og kan ha en steril inngangsåpning (f.eks. kan beholderen være en intravenøs løsningspose eller et rør som har en åpning som er gjennomtrengbar med en hypoderm injeksjonsnål). Minst ett aktivt middel i sammensetningen er et antistoff ifølge oppfinnelsen. Merket eller pakningsvedlegget indikerer at sammensetningen blir benyttet for å behandle tilstanden som er valgt, slik som kreft. Den fremstilte artikkelen kan videre omfatte (a) en første beholder med en sammensetning inneholdt i denne, der sammensetningen omfatter et antistoff ifølge oppfinnelsen og (b) en andre beholder med en sammensetning inneholdt i denne, der sammensetningen omfatter et ytterligere cytotoksisk middel. Den fremstilte artikkelen i denne utførelsesformen av oppfinnelsen kan ytterligere omfatte et pakningsvedlegg som indikerer at det første og det andre antistoffsammensetningen kan bli benyttet til å behandle en spesiell tilstand, f.eks. kreft. Alternativt, eller i tillegg, så kan den fremstilte artikkelen ytterligere omfatte en andre (eller tredje) beholder som omfatter en farmasøytisk akseptabel buffer, slik som bakteriostatisk vann til injeksjon (BWFI), fosfatbufret saltløsning, Ringers løsning og dekstroseløsning. Den kan ytterligere inkludere andre materialer som er ønskelige fra et kommersielt ståtsted og et brukerståsted, inkludert andre buffere, fortynningsmidler, filtre, nåler og sprøyter.
Det følgende er eksempler på fremgangsmåtene og sammensetnigene ifølge oppfinnelsen.
EKSEMPLER
Eksemplene her beskriver fremstillingen av humaniserte anti-beta7-antistoffer fra etrotte-anti-museantistoff som binder til beta7-subenheten på alfa4beta7-integrinet.
Eksempel 1: Humanisering av et beta7-antagonistantistoff)Materialer og fremgangsmåter
Restnummereringer er ifølge Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5. utgave. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Enkeltbokstav aminosyreforkortelser blir benyttet. Degenereringer i DNA blir representert ved å benytte IUB-koden (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B =C/G/T, H = A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W = A/T, Y = C/T.
Direkte hypervariabel regiontransplanteringer på det humane akseptorkonsensusrammeverket. Fagemidet som blir benyttet i dette arbeidet, p\/O350-2b, var en monovalentFab-g3-oppvisningsvektor som har 2 åpne leserammer under kontroll av phoA-promotoren,essensielt som beskrevet i Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93. Den første åpneleserammen består av stll-signalsekvensen fusjonert til VL- og CHl-domenene på akseptorlettkjeden og den andre består av stll-signalsekvensen fusjonert til VH- og CHl-domenenepå akseptortungkjeden etterfulgt av en trunkert form av det mindre bakteriofagkappeproteinet P3 (Lowman, H. et al. (1990) Biochemistry 30:10832).
VL- og VH-domenene fra rotte-Fib504 (antistoff FIB504.64 produsert av hybridomATCC HB-293, American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA20108, USA) ble sammenstilt med de humane konsensuskappa-I (huKI) og de humaneundergruppe-III-konsensus-VH (huIII)-domenene. For å fremstille hypervariabel regionen(HVR)-transplantatene ble de følgende rammeverkene benyttet: HuKI ble benyttet tillettkjedevariabeldomenerammeverket (se fig. IA og 7). For tungkjedevariabelt domene rammeverket kan akseptor-VH-rammeverket, som er et modifisert, humant undergruppe-III(humlll)-konsensus-VH-domene som er forskjellig fra humlll-sekvensen på 3 posisjoner:R71A, N73T og L78A, bli benyttet (se Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)) (se fig. IB). Ved fremstilling av antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse blir 504KRF-transplantaten også fremstilt fra det modifiserte, humane undergruppe-III-konsensusVH-domene ved å innføre de følgende aminosyresubstitusjonene: A71R og A78F.
Hypervariable regioner fra rotte-Fib504-antistoff (produsert av hybridom ATCC HB293) ble satt inn i det humane akseptorundergruppe-III-konsensus-VH-rammeverket for ågenerere et direkte HVR-transplantat (Fib504-transplantat) (se fig. IB). I VL-domenet ble defølgende regionene fra rotte-Fib504 transplantert på den humane konsensusakseptoren,huKI: posisjoner 24-34 (LI), 50-56 (L2) og 89-97 (L3) (fig. IA). På VH-domenet bleposisjonene 26-35 (Hl), 49-65 (H2) og 94-102 (H3) transplantert (fig. IB). I tillegg ble etannet HVR-transplantat, Fib504Ktransplantat, konstruert som også inkluderte VL-posisjonen49 i HVR'en, basert på en utvidet definisjon for L2 (se MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)). MacCallum et al., har analysert antistoff og antigenkompleks-krystallstrukturer og funnet at posisjonen 49 på lettkjeden og posisjonene 49 og 94 på tungkjeden er en del av antigenkontaktregionen, og slik blir disse posisjonene inkludert i definisjonene for HVR-L2, HVR-H2 og HVR-H3 for humaniserte anti-beta7-antistoffer som er tilkjennegjorther.
De direkte transplanterte variantene ble generert ved hjelp av Kunkel-mutagenese(Kunkel et al. (1987) ovenfor) ved å benytte separat oligonukleotid for hver hypervariable region. Korrekte kloner ble undersøkt ved hjelp av DNA-sekvensering.
Myk randomisering av hypervariabel regionene:
Prosessen med "myk randomisering" (se US søknad serienr. 60/545,840) refererer til en prosedyre for ensidig mutagenese av en valgt proteinsekvens, slik som en hypervariabel region på et antistoff. Fremgangsmåten opprettholder en ensidighet mot utgangshypervariabel regionen fra mus, rotte eller annen utgangshypervariabel regionsekvens, mens man introduserer omtrent 10-50 % mutasjon på hver valgte posisjon. Denneteknikken øker kapasiteten til biblioteksscreeningen som blir benyttet og unngår en endring i antigenepitopen som blir gjenkjent av antistoffet. Ifølge denne myke randomiseringsteknikken blir sekvensdiversitet introdusert på hver hypervariabel region ved å benytte en strategi som opprettholder en gjensidighet mot den murine hypervariabel regionsekvensen. Dette ble oppnådd ved å benytte en forgiftet oligonukleotidsyntesestrategi som først ble beskrevet av Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233-1251 (1994). Andre fremgangsmåter forå opprettholde en ensidighet mot den ikke-humane hypervariabel regionrestn er likeveltilgjengelig, slik som feilutsatt PCR, DNA-ombytting, osv.
Ifølge fremgangsmåten som ble benyttet her, for en gitt posisjon innenfor en hypervariabel region som blir mutert, så blir kodonet som koder for villtypeaminosyren forgiftet med en blanding (f.eks. 70-10-10-10 blanding) av nukleotider som fører til enmutasjonsrate på omtrent 50 % på hver valgte hypervariabel regionposisjon. For å oppnå dette blir kodonet som koder for villtypehypervariabel regionaminosyren som skal bli mutert syntetisert med et lavt nivå av kontaminerende blanding av de andre tre nukleotidene, slik som en 70-10-10-10-blanding av nukleotider. For eksempelets del, når det gjelder mykrandomisering av PRO (CCG), så er slik den første posisjonen som blir syntetisert en blanding av 70 % C og 10 % hver av G, T og A, den andre posisjonen er en blanding av 70 % C og 10 % hver av A, G og T, og den tredje posisjonen er en blanding av 70 % G og 10 % hver av A, C og T. Det er på det rene at ensidigheten kan bli justert opp eller ned avhengig av kodonet som blir syntetisert på en gitt posisjon, antallet kodon som koder for en spesiell aminosyre og graden som oligonukleotidsyntese blir forgiftet ved av nukleotidsammensetningen i synteseblandingen.
Mykt randomiserte oligonukleotider kan bli gitt mønster etter utgangshypervariabel regionsekvenser for mus, rotte eller andre utgangshypervariabel regionsekvenser og omfatter de samme regionene som er definert av de direkte hypervariabel regiontransplantatene. Eventuelt kan to posisjoner, aminosyrer på begynnelsen av H2 og H3 i VHdomenet, bli begrenset i deres diversitet: kodonet RGC kan bli benyttet på posisjon 49 som koder for A, G, S eller T og på posisjon 94, kodonet AKG kan bli benyttet som koder for M eller R.
Fremstilling av bakteriofagbiblioteker - Randomiserte oligonukleotidsamlinger somer desinget for hver hypervariable region ble fosforylert separat i seks 20 jil reaksjoner inneholdende 600 ng med oligonukleotid (50 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCI?, 1 mM ATP, 20 mM DTT og 5 U polynukleotidkinase i 1 time ved 37°C. De seks fosforylerte
oligonukleotidsamlingene ble deretter kombinert med 20 jig Kunkel-templat i 50 mM Tris pH7,5, 10 mM MgCI? i et sluttvolum på 500 jil som førte til et forhold mellom oligonukleotid og templat på 3. Blandingen ble anilet ved 90°C i 4 min., 50°C i 5 min. og deretter avkjølt på is. Overskudd av ikke-anilet oligonukleotid ble fjernet med et QIAQUICK PCR-rensesett (Qiagenkit 28106, Qiagen, Valencia, CA) ved å benytte en modifisert protokoll for å forhindre overdreven denaturering av det tilbundede DNA. Til de 500 jil med anilet blanding ble 150 jil Qiagen-buffer PB tilsatt og blandingen ble fordelt på to silikakolonner. Etter en vasking avhver kolonne med 750 jil Qiagen-buffer PE og en ekstra sentrifugering for å tørke kolonneneble hver kolonne eluert med 110 jil 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8. Det tilbunded og opprensede templatet (220 jil) ble deretter fylt inn ved å tilsette 1 jil 100 mM ATP, 10 jil 25 mM dNTP'er (25 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP), 15 gl 100 mM DTT, 25 gl 10X TMbuffer (0,5 M Tris, pH 7,5, 0,1 M MgCb), 2400 U T4-ligase og 30 U T7-polymerase i 3 timerved romtemperatur.
Det innfylte produktet ble analysert på Tris-acetat-EDTA/agarosegeler (Sidhu et al.,Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)). Tre bånd er vanligvis synlige: det nederstebåndet er korrekt fylt og ligert produkt, det midtre båndet er fylt men ikke ligert og det øverste båndet er tråd som er fortrengt. Det øverste båndet blir produsert av en iboende sideaktivitet for T7-polymerase og er vanskelig å unngå (Lechner et al., J. Biol. Chem.258:11174-11184 (1983)), likevel transformerer dette båndet 30 ganger mindre effektivtenn det nederste båndet og bidrar vanligvis lite til biblioteket. Det midtre båndet skilles fra hverandre av en 5' fosfat for den endelige ligeringsreaksjonen, og dette båndet transformeres effektivt og gir i hovedsak villtypesekvens.
Det innfylte produktet ble deretter renset opp og elektroporert inn i SS320-celler ogdyrket i nærvær av M13/KO7-hjelperbakteriefag som beskrevet av Sidhu et al., Methods inEnzymology 328:333-363 (2000). Bibliotekstørrelser strakk seg fra 1-2 x 109 uavhengigkoloni. Tilfeldige kloner fra utgangsbiblioteker ble sekvensert for å vurdere bibliotekkvalitet.
Bakteriofagseleksjon - humant fullengde-integrin-alfa4beta7 ble uttrykt i 293-celler(Graham et al., J. Gen Viroi. 36:59 (1977)), renset ved hjelp av Fib504-affinitetskromatografi og benyttet som målet for bakteriofagseleksjon. For immobilisering på MaxiSorp™-mikrotiterplater (Nalge Nunc, Rochester, NY), ble 100 gl med humant integrinalfa4beta7 belagt ved 5 gg/ml i 150 mM NaCI, 50 mM ris, pH 7,5, 2 mM CaCI?, 2 mM MgCI? og 2 mM MnCI? (TBSM), over natt ved 4°C. Brønner ble blokkert i 1 time ved å benytte TBSM inneholdende 1 % BSA. I den første runden med seleksjon ble 8 brønner belagt med mål benyttet, én enkelt målbelagt brønn ble benyttet i påfølgende runder med seleksjon. Bakteriofag ble høstet fra kultursupernatant og suspendert i TBSM inneholdende 1 % BSA og 0,05 % Tween-20 (TBSMBT). Etter binding til brønnene i 2 timer ble ubundne fag fjernet vedomfattende vasking med TBS inneholdende 0,05 % Tween-20 (TBST). Bundne fag ble eluertved å inkubere brønnene med 100 mM HCI i 30 min. Fag ble amplifisert ved å benytte topp 10-celler og M13/KO7-hjelperfag og dyrket over natt ved 37°C i 2 YT, 50 gg/ml karbanacillin.
Titerne av fag eluert fra en målbelagt brønn ble sammenlignet med titere for fag gjenvunnet fra en ikke-målbelagt brønn for å vurdere anriking. Etter at fire runder med seleksjon varutført ble tilfeldige kloner valgt til sekvensanalyse.
Fab-produksjon og affinitetsbestemmelse - For å uttrykke Fab-protein tilaffinitetsmålinger ble et stoppkodon introdusert mellom den tunge kjeden og g3 i bakteriofagvisningsvektoren. Kloner ble transformert inn i E. coli 34B8-celler og dyrket iAP5-medium ved 30°C (Presta, L. et al.. Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Celler blehøstet ved hjeøp av sentrifugering, suspendert i 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8, og brutt åpne ved å benytte en mikrofluidiserer. Fab ble renset med protein-G-affinitetskromatografi.
Affinitetsbestemmelser ble utført ved hjelp av surface-plasmon-resonans ved åbenytte en BIAcore™-3000 (Biacore, Piscataway, NJ). Humaniserte Fib504-Fab-varianter bleimmobilisert i 10 mM acetat, pH 4,5 (i området fra 250-1500 responsenheter (RU)) på enCM5-sensorbrikke og to ganger fortynninger med humant integrin alfa4beta7 (1,5-770 nM) iTBSM inneholdende 2 % n-oktylglukosid ble injisert. Hver prøve ble analysert med 5 min.assosiering og 5-60 min. dissosieringstider. Etter hver injeksjon ble brikken regenerert ved åbenytte tre 1 min. injeksjoner med 8 M urea. Bindingsrespons ble korrigert ved å trekke RUverdien fra en nullprøvestrømningscelle. En 1:1 Langmuir-modell med samtidig tilpasning avkon og koff ble benyttet for kinetikkanalyser.
Resultater og diskusjon
Humanisering av rotte-Fib504 - Det humane akseptorrammeverket som ble benyttettil humanisering er basert på rammeverket som er benyttet for HERCEPTIN® og består av det humane konsensus-kappa-I (huKI)-VL-domenet og en variant av det humaneundergruppe-III (humlll)-konsensus-VH-domenet. Dette variant-VH-domenet har treendringer i forhold til den humane konsensusen: R71A, N73T og L78A. VL- og VH-domenenei rotte-Fib504 ble hver sammenstilt med de humane kappa-I- og undergruppe-IIIdomenene, hver hypervariabel region (HVR) ble identifisert og transplantert på det humane akseptorrammeverket for å generere et HVR-transplantat (504-transplantat) som kunne blioppvist som en Fab på bakteriofag (fig. IA og IB).
Basert på analysen av tilgjengelige antistoff- og antigenkomplekskrystallstrukturerforeslå MacCallum et al. (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)) HVRdefinisjoner basert på variabeldomenerester som hyppig kontakter antigener. Slik ble posisjonene 49G og 94M i tungkjeden inkludert i HVR-transplantatet Fig504 (fig. IB). Itillegg ble en annen HVR-transplantat, Fib504K-transplantat, også generert som inkluderteposisjonen 29K på lettkjeden, fordi denne posisjonen også ligger innenfor kontaktdefinisjonen i HVR-L2 og kan virke som en antigenkontakt (fig. IA). Når en hvilken somhelst av Fib504- eller Fib504K-transplantatene ble oppvist på bakteriofag og testet forbinding til immobilisert alfa4beta7 ble ingen binding observert.
Biblioteker ble generert ved å benytte både Fib504- og Fib504-K-HVRtransplantatene der hver av HVR-regionene ble mykt randomisert samtidig. Hvert HVRtransplantatbibliotek ble panert mot immobilisrt alfa4beta7 i fire runder med seleksjon. Ingen anrikning ble observert og kloner som ble plukket for DNA-sekvensanalyse oppvistekun tilfeldige sekvensendringer rettet mot de seks HVR-regionene.
To ytterligere VH-rammeverksekvenser, "RL" og "RF" ble undersøkt somakseptorrammeverk og inneholdt endringene på posisjon 71 og 78. Posisjon 71 ble endret til et arginin som i den humane undergruppe-III-konsensusen, og posisjon 78 ble endret til etleucin som i den humane undergruppe-III-konsensusen (akseptorrammeverk "RL") eller etfenylalanin som i den humane undergruppe II-konsensusen og rotte-Fib504-VHrammeverket (akseptorrammeverk "RF") (fig. 10A). Når en hvilken som helst av Fib504eller Fib504K-transplantatet på "RL" (Fib504-RL og Fib504K-RL) eller "RF" (Fib504-RF ogFib504K-RF)-akseptorrammeverk ble oppvist på bakteriofag og testet for binding tilmobilisert alfa4beta7. Spesifikk bakteriofagbinding ble kun observert for Fib504Ktransplantatet ved å benytte "RF"-rammeverket (fig. 10B). Den moderate bindingen avbakteriofag som oppviser Fib504-RF-transplantatet i forhold til andre transplantater sommangler i Y49K (lettkjede) og L78F (tungkjede) viser viktigheten til disse posisjonene i å velge et nyttig akseptorrammeverk.
Biblioteket ble generert som før ved å benytte en myk randomiseringsstrategi samtidig på hver av de seks HVR'ene for Fib504K-RL og Fib504K-RF-transplantatene ogsortert på immobilisert alfa4beta7 i fire runder med seleksjon som beskrevet ovenfor. Anrikning ble kun observert for biblioteker basert på Fib504K-RF-transplantatet. Kloner frarunde fire i Fib504K-RF-biblioteket ble valgt til sekvensanalyse og avslørte aminosyreendringer rettet mot HVR-L1. De løste kloner inneholdt endringen Y32L, i tillegg var posisjon31 hyppig endret til D, S, P eller N (fig. 1C). I tillegg til utgangstransplantatet, Fib504K-RF,så ble tre kloner uttrykt og renset som Fab-protein og ytterligere analysert ved hjelp avBiacore som beskrevet ovenfor. Klonene hu504-5, hu504-16 og hu504-32 (varianter avSEKV. ID nr. 1 inneholdende substitusjonene T31S pluss Y32L (variant hu504.5), Y32L (variant hu504.16) eller T31D pluss Y32L (variant hu504.32), se fig. 1C) viste uovertruffen binding til alfa4beta7 i forhold til Fib504K-RF-transplantatet og imøtekom eller overskredaffiniteten til den kimære Fib504-Fab for binding til alfa4beta7. Resultatene av Biacoreanalysen er vist i tabell 3 nedenfor og indikerer at valgt variasjon i HVR'ene og/eller rammeverksregionene, som er tilkjennegjort her, genererte antagonistantistoffer mot alfa4beta7 som hadde forbedret affinitet i forhold til utgangsantistoffet. Resultatene i tabell 3 indikerer at humanisert variant 504.32 viste den største økningen i affinitet i forhold til utgangsrotteantistoffet ved å binde tre ganger tettere til alfa4beta7.
Tabell 3
Fab (BIAcore™-analyse)
Affinitet mot alfa4beta7 (nM)
Fib504
Variant 504.5
Variant 504.16
Variant 504.32
Resultatene i tabell 3 indikerer også at redesigningen av HVR-L1 var viktig forgjenopprettelsen av høyaffinitetsantigenbinding. Spesielt var mutasjonen Y32L mest hyppig blant de ulike klonene. Andre endringer på posisjon 31 og utallige andre substitusjoner i HVR-H1 ser ut til å være godt tolererte og kan tilveiebringe ytterligere forbedring. Ut fradisse resultatene er det klart at det foreligger flere sekvensendringer som kan forbedre affiniteten til Fib504 som er transplantert på et humant rammeverk for å generere affiniteter som imøtegår eller overskrider affiniteten til det opprinnelige rotteantistoffet.
Ved å starte fra transplanteringen av de seks rotte Fib504-HVR'ene inn i dethumane akseptorrammeverket ble utvidelsen av HVR-L2 for å inkludere posisjon 49 (lysin),utvidelsen av HVR-H2 for å inkludere posisjon 49 (glysin) og utvidelsen av HVR-94 for åinkludere posisjon 94 (metionin) i tillegg til aminosyreendringer på posisjon 32 i VHR-L1 (derL eller I erstatter Y) og eventuelt på posisjon 31 i VHR-L1 (der T blir erstattet med D eller S,f.eks.) utført. Nyttige rammeverksaminosyreendringer ble gjort på posisjonene 71 (A71R) og 78 (L78F) på VH-domenet. Slike aminosyreendringer fører til et fullt humant antistoff,variant hu504.32 f.eks., med tre ganger forbedret bindingsaffinitet for alfa4beta7-integrinet.Videre har valgte humaniserte antistoffer som er beskrevet her blitt bestemt å ha minst sammenlignbar biologisk aktivitet med opphavs-rotte-Fib504-antistoffet (se eksempel 3her).
Eksempel 2: Ytterligere, humaniserte Fib504-HVR-varianter
HVR-aminosyresekvensene til humanisert variant Fib504.32 ble ytterligeremodifisert for å generere ytterligere varianter som var i stand til å antagonisere aktiviteten til beta7-integrinsubenheten og/eller integriner som inneholder beta7-subenheten.
Fremstilling av et bredt aminosyreskanningsbibliotek - Et bibliotek for å skannevalgte HVR-posisjoner for andre aminosyrerester som er i stand til å generere beta7bindingsvarianter av variant hu504.32 ble generert ved å benytte tre oligonukleotider: 504Ll, designet for å mykt randomisere en del av HVR-L1 med en helning mot hu504.32-HVRLl-sekvensen (dvs. sekvensen ASESVDDLLH (SEKV. ID nr. 47, for relative posisjoner A2All) ble mykt randomisert som beskrevet ovenfor) og HVR-L3 504-N96 og HVR-H3 504M94 som introduserer NNS på posisjoner HVR-L3 posisjon 96 på lettkjeden og HVR-H3posisjon 94 på tungkjeden, for slik å tillate alle 20 aminosyrer på disse posisjonene. Med disse tre oligonukleotidene ble det brede aminosyreskanningsbiblioteket generert som
beskrevet ovenfor ved å benytte et templat inneholdende tre stoppkodon på lettkjeden (posisjonene 31 og 32 i HVR-L1 og posisjon 96 i HVR-L3) og et stoppkodon på tungkjeden(posisjon 94 i HVR-H3).
Bred aminosyreskanning av hu504-32 - For mer inngående å utforske deforetrukne sekvensene som er tillatt i HVR-L1 og for å forsterke stabiliteten til 504-32designet i et bakteriofagbibliotek som a) mykt randomiserte HVR-L1 i 504-32 på regionender endringer ble observert (dvs. ASESVDDLLH (SEKV. ID nr. 47, for relative posisjoner A2All) i løpet av humanisering (fig. 1C) og b) tillot alle mulige amiosyrer på N96 i HVR-L3 ogM94 i HVR-H3. Etter fire runder med seleksjon mot immobilisert, humant fullendeintegrinalfa4beta7 som beskrevet ovenfor ble 96 tilfeldige kloner valgt til sekvensanalyse. Hyppigheten ved hvilken aminosyrene ble funnet på hver posisjon i det brede aminosyreskanningsbiblioteket tyder på at HVR-Ll-sekvensen som foreligger i hu504-32 ogmetioninet på posisjon 94 på tungkjeden er optimalt for høyaffinitetsbinding (fig. 12). De mest foretrukne aminosyrene fremskaffet ved seleksjonene ved å starte fra variant 504.32 (fig. 12) er vist i gult. Selv om asparagin foreligger på posisjon 96 i lettkjeden i hu504-32tyder i motsetning til dette den høye hyppigheten av leucin observert på denne posisjonen i den brede aminosyreskanningen på at mutasjonen N96L ytterligere kunne forbedre affiniteten til humanisert Fib504-varianter for alfa4beta7 og også eliminere alle muligedeamideringsproblemer på denne posisjonen. Informasjonen i fig. 12 tyder også på at et antall erstatningsaminosyrer sannsynligvis vil bli tolerert på de fleste posisjoner uten vesentlig tap i affinitet. For å eliminere oksidering av M94 på HVR.-H3 kan f.eks. glutamineller arginin sannsynligvis bli substituert.
Fremstilling av de begrensedeaminosyreskanningsbibliotekene - Seks biblioteker foren begrenset aminosyreskanning benyttet seks ulike Kunkel-templater, der hvert inneholdtet stoppkodon lokalisert innenfor én av de seks HVR/ene. Hvert bibliotek ble generert ved å benytte et enkelt oligonukleotid som koder for én enkelt HVR og ved å benytte de kodonene som er fremlagt i fig. 11A ("kodon"-kolonne) for å endre aminosyrerester for påfølgendetesting av binding til beta7 eller alfa4beta7. Den samme prosedyren som ble benyttet for å endre aminosyrerester for anti-beta7-antistoffer og teste dem for binding til alfaEbeta7integrinet.
Begrenset aminosyreskanning av hu504-32 - Den begrensede aminosyreskanningen av hu504-16 ble designet for å gjøre hu504-16 enda mer lik den humanelettkjede- og tungkjedekonsensussekvensen og i prosessen identifisere de minimalesekvenselementene for rotte-Fib504 som er nødvendig for binding. Seks biblioteker blegenerert og målsøkt på hver HVR på posisjoner som var forskjellige mellom hu504-16 og dehumane konsensus-kappa-I-lettkjede eller undergruppe-II-tungkjedene (fig. IA og IB),enten rotteaminosyren eller den humane aminosyren ble tillatt på disse posisjonene i biblioteket (fig. 11A). For å tilpasse koding for begge aminosyrer i løpet av oligonukleotidsyntesen og mutagenesen ble ytterligere aminosyrer også introdusert i noen tilfeller (se
117 kodede aminosyrer, fig. 11A). De begrensede aminosyreskanningsbibliotekene ble selektert mot immobilisert, humant fullengdeintegrin alfa4beta7 som beskrevet ovenfor og omtrent 32 tilfeldige kloner ble sekvensert for hvert bibliotek etter runde 3. Hyppigheten av hver aminosyre som ble funnet på hver posisjon er vist i fig. 11B og 11C.
Slik som for den brede aminosyreskanningen kan den begrensede aminosyreskanningen også tilveiebringe informasjon omkring hvilke endringer som er tolerert på mange posisjoner i humanisert Fib504. Ulikt den brede aminosyreskanningen var likevel diversiteten som er tillatt på hver posisjon som er randomisert i den begrensede aminosyreskanningen begrenset til noen få aminosyrer. Mangelen på enhver observert substitusjon på en gitt posisjon indikerer slik ikke at en spesiell rest ikke kan bli endret og heller ikke indikerer den høye hyppigheten av enhver spesiell aminosyre på en gitt posisjon at den er den beste løsningen for høy affinitet.
På noen posisjoner (posisjonene 27, 29, 30, 53, 54 i lettkjeden og 50, 54, 58, 60, 61 og 65 på tungkjeden) blir den humane konsensusaminosyren valgt ganske hyppig, noe som tyder på at en tilbakemutasjon til den humane konsensusen ikke dramatisk ville endre binding til human alfa4beta7. På posisjon 54 av lettkjeden (i HVR-L2) ble faktisk denhumane konsensusaminosyren valgt hyppigere enn aminosyren fra rotte-Fib, noe som tyderpå at denne endringen som er innført i 504-32 tilveiebringer et nyttig beta7-bindingsantistoff.
Som et resultat av bibliotekutformingen blir ytterligere aminosyrer som ikke er avledet fra verken den humane konsensusen eller rotte-Fib504 valgt hyppigere på noenposisjoner og tilveiebringer potensielle substitusjoner for å forbedre affiniteten til humaniserte Fib504-varianter. Disse inkluderer uten begrensning D30A og I55V pålettkjeden og Y50F på tungkjeden. Resultatene fra disse to bibliotekene tyder på at mange HVR-posisjoner tolererer andre aminosyresubstitusjoner og de opprettholder fremdelessammenlignbar biologisk aktivitet.
Oppsummeringer av observerte aminosyreendringer er vist i fig. 13 og 15. Fig. 15 oppsummerer de ulike aminosyrene som nyttige på hver av posisjonene i CDR'ene på antistoffvarianten ifølge oppfinnelsen på posisjoner nummerert ifølge Kabat-nummereringeller et relativt nummereringssystem. Hvert av de ytterligere antistoffene som er omfattet av variantene som er avbildet i fig. 13 og 15 er en utførelsesform av oppfinnelsen.
Eksempel 3: Celleadhesjonsanalvser
Evnen til noen av de humaniserte Fib504-variantene ifølge oppfinnelsen til å bindeligander som er uttrykt på en celleoverflate ble testet ved hjelp av celleadhesjonsanalyse. Binding til alfa4beta7 og et annet beta7-integrin, alfaEbeta7, ble testet ved evnen for dehumaniserte variantene til å ødelegge binding av integrinet til sin naturlige reseptor. Binding av de humaniserte Fib504-varianter til alfa4beta7-subenhet alene uttrykt på encelleoverflate ble tilsvarende testet. Prosedyrene og resultatene er beskrevet nedenfor.
IgG-produksjon - Humaniserte Fib504-IgG-varianter ble uttrykt transient i 293celler (Graham et al. (1977) ovenfor) ved å benytte en separat vektor for lettkjeden og tungkjeden. Vektorene ble konstruert ved å subklone lettkjede- og tungkjededomenene inn ipassende ekspresjonsvektorer for hver av lettkjeden og tungkjeden. Supernatant fra 1.1 L CHO-cellekultur for en humanisert Fib504-variant ble filtrert gjennom et filter på 0,45 pim ogpåsatt en ny 1 ml HiTrap-protein-A-HP-kolonne (Amersham/Pharmacia) balansert i buffer-A(10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCI). Prøver ble påsatt ved 0,8 ml/min. over natt, 4°C. Hver kolonne ble deretter vasket og balansert med 30 ml buffer-A. Eluering av antistoff ble utførtved hjelp av kromatografi ved romtemperatur på en FPLC (Amersham/Pharmacia) ved å benytte en lineær gradient ved 14 min. ved 1 ml/min. fra 0-100 % buffer-B (100 mM glysin,pH 3,0). Resulterende fraksjoner på 1 ml ble straks nøytralisert ved tilsetningen av 75 jul 1 M Tris, pH 8. Eluert protein ble påvist ved absorpsjon ved 280 nm, og toppfraksjonene ble slått sammenog avsaltet i PBS på PD10-G-25-sefadekskolonner (Amersham/Pharmacia). Proteinble påvist ved hjelp av OD280 og toppfraksjonene slått sammen. Antistoffet i PBS ble filtrert gjennom 0,22 jim og lagret ved 4°C. Aminosyreanalyser ble benyttet for å kvantifisere konsentrasjonene av disse rensede antistoffene, og verdier ble tilordnet fra gjennomsnittet av to separate bestemmelser.
BCECF-merkinq:
I hver av analysene som er vist i eksempel 3 ble celler merket i overenstemmelse med den følgende prosedyren. Alle celler som ble benyttet i adhesjonsanalysene ble merket med 2', 7'-bis-(2-karboksyletyl)-5-(og-6)-karboksyfluorescein, acetoksymetylester (BCECF)ved 10 jiM i RPMI1640-medium inneholdende 10 % FBS for RPMI8866-celler og 38C13-cellertransfektert med beta7-subenhet (38C13-beta7-celler) og i F-12:DMEM-blanding (50:50)inneholdende 10 % FBS for alfaEbeta7-transfekterte 293-celler (alfaEbeta7-293-celler).Celler ble merket i 30 min. og vasket to ganger med analysemedium. Celletetthet ble justert til 3 x 106 celler/ml for RPMI8866- og 38C13beta7-celler og 2,2 x 106 celler/ml foralfaEbeta7-293-celler.
Humaniserte Fib504-varianter ødelegger alfa4beta7-binding til MAdCAMRPMI8866/MAdCAM-l-Iq-celleadhes1on: RPMI8866-celler uttrykker alfa4beta7 påsin overflate (Roswell Park Memorial Institute, Buffalo, NY). Humaniserte Fib504-varianter(hu504-varianter) ble kontaktet med en blanding av RPMI8866-celler og MAdCAM fusjonerttil IgG belagt på en fast bærer. Konsentrasjoner av humanisert Fib504-variant som fører til50 % inhibering (ICso) av bindingen av RPMI8866-celler til MAdCAM ble målt ved å beleggeNunc Maxisorp™ 96-brønners plater med 2 jig/ml i PBS, 100 pil/brønn MAdCAM-l-Ig(Genentech, Inc., der lg refererer til fusjon av MAdCAM-1 til en Fc-region) over natt ved4°C. Etter å ha blokkert platene med 200 pil/brønn med 5 mg/ml BSA i 1 time ved romtemperatur ble 50 jutl humaniserte Fib504-varianter i analysemedium (RPMI1640
medium, Hyclone®, Logan Utah, USA, tilsatt 5 mg/ml BSA) tilsatt til hver brønn og 150000 BCECF-merkede celler (BCECF, Molecular Probes, Eugene, OR) i 50 jil analysemedium bletilsatt til hver brønn og inkubert i 15 min. ved 37°C. Brønnene ble vasket to ganger med 150 jul analysemedium for å fjerne ubundne celler. De bundne cellene ble løseliggjort med 100 jul 0,1 % FBS i 50 mM Tris/HCI, pH 7,5. Mengden av fluorescens som ble frigjort fra lyserte celler ble målt ved hjelp av SPECTRAmax GEMINI™ (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ved 485 nm eksitasjons-530 nm emisjonsbølgelengder. Fluorescensverdiene bleanalysert som en funksjon av konsentrasjonene for de humaniserte Fib504-variantene somer tilsatt i hver analyse ved å benytte en fire-para meters, ikke-lineær minste kvadratstilpasning for å oppnå ICso-verdiene for hver humaniserte Fib504-variant i analysen. ICso- ogICgo-verdier ble beregnet fra fire-parameterstilpasningen. Fig. 14 er et eksempelmessig plottav resultatene. ICgo- og ICso-verdiene for hver av variantene som ble testet er vist nedenfori tabell 4.
Tabell 4
Antistoffbinding til human MAdCAM-1
Antistoff testet: Fib504- oghu504-varianter
ICso (nM) Eksp. 1/eksp. 2*
ICgo (nM) Eksp. 1/eksp. 2*
Rotte-Fib504
0,098/0,197
0,483/0,703
Variant hu504.5
0,067/0,248
0,361/0,880
Variant hu504.16
0,0768/0,206
0,244/0,551
Variant hu504.32
0,036/0,119
0,150/0,396
6B11 (ikke-blokkerendekontroll)
>100
>100
*Eksp. 1/eksp. 2 refererer til resultatene i gjentatte analyser.
Humanisert Fib504-variant ødelegger alfa4beta7-bindinq til VCAMRPMI8866/7dVCAM-l-celleadhes1on: RPMI8866/7dVCAM-l-analysen er lignende iformat med RPMI8866/MAdCAM-l-Ig bortsett fra at 7dVCAM-l (ADP5, R&D Systems,Minneapolis, MN) ble benyttet ved 2 jig/ml for å belegge plater. Resultatene ble analysert som beskrevet ovenfor for MadCAM-bindingseksperimentene. ICso-verdiene for hver avvariantene som ble testet er vist nedenfor i tabell 5.
Tabell 5
Antistoffbinding til human VCAM
Antistoff testet: Fib504- oghu504-varianter
ICso (nM) Eksp. 1/eksp. 2*
ICgo (nM) Eksp. 1/eksp. 2*
Rotte-Fib504
0,107/0,193
0,396/0,580
Variant hu504.5
0,088/0,270
0,396/0,726
Variant hu504.16
0,098/0,223
0,261/0,774
Variant hu504.32
0,059/0,110
0,183/0,337
6B11 (ikke-blokkerendekontroll)
>100
>100
*Eksp. 1/eksp. 2 refererer til resultatene i gjentatte analyser.
Humanisert Fib504-variant ødelegger alfaEbeta7-bindinq til humant E-kadherinAlfaEbeta7-293/huE-kadherincelleadhes1on: 293-celler (Graham et al. (1977)ovenfor) ble transfektert med alfaE og beta7 (Genentech, Inc.). Analyseformatet er lignende RPMI8866/MAdCAM-l-Ig-analysen bortsett fra at huE-kadherin (648-EC, R&D Systems,Minneapolis, MN) ble benyttet ved 2 jig/ml for å belegge platene. Plater ble deretter blokkert med 5 mg/ml BSA som nevnt ovenfor og 50 jil Fib504-varianter i analysemedium (F12:DMEM (50:50) tilsatt 5 mg/ml BSA) ble tilsatt til hver brønn og 110000 BCECF-merkedeceller i 50 jil analysemedium tilsatt til hver brønn og inkubert i 15 min. ved 37°C. Brønnene ble vasket to ganger med 150 jil analysemedium og mengden av fluorescens som ble frigjort av de lyserte cellene ble målt og analysert som beskrevet ovenfor. Analyseresultatene fra tre eksperimenter er vist i tabell 6.
Tabell 6
Antistoffbinding til humant E-kadherin
Antistoff testet: Fib504- oghu504-varianter
ICso (nM)
IC90 (nM)
Rotte-Fib504
2,047/89/4,19
8,80/24,5/9,95
Variant hu504.5
2,132/10,18/4,77
7,99/28,7/10,19
Variant hu504.16
1,957/10,05/4,58
7,03/33,7/13,51
Variant hu504.32
1,814/6,99/3,47
8,8/24,5/11,73
HP2/1 (anti-alfa4, kontroll)
>100/>100/>100
>100/>100/>100
Humanisert Fin504-variant ødelegger beta7-binding til MAdCAM38Cl3beta7/muMAdCAM-l-Io-celleadhes1onsanalvse: 38C13beta7/muMAdCAM-l
Ig-analysen var lignende i format med RPMI8866/MAdCAM-l-Ig bortsett fra at muMAdCAM1-Ig (Genentech, Inc.) ble benyttet ved 2 pig/ml for å belegge plater. 38C13-alfa4+ murinelymfomceller (Crowe, D.T. et al., J. Biol. Chem. 269:14411-14418 (1994) ble transfektertmed DNA som koder for integrin beta7 slik at alfa4beta7 ble uttrykt på celleoverflaten. Evnen for antistoffvariantene til å ødelegge interaksjon mellom cellemembranassosiert alfa4beta7 og MAdCAM ble utført som ovenfor. Analyseresultatene er vist i tabell 7. Analyseresultater er vist i tabell 7. (ICso- og ICgo-verdier for 2 eksperimenter er vist).
Tabell 7
Aktivitet for hu504-variantantistoffer i 38C13-beta7-uttrykkende celler
Binding til murint MAdCAM
Antistoff testet: Fib504- oghu504-varianter
ICso (nM)
IC90 (nM)
Rotte-Fib504
0,682/0,306
2,869/1,51
Variant hu504.5
0,8587/0,466
2,322/2,61
Variant hu504.16
0,998/0,610
3,717/4,08
Variant hu504.32
0,718/0,458
4,08/1,51
Humanisert Fib504-variant ødelegger beta7-bindinq til murin VCAM38Cl3beta7/muVCAM-l-Ig-celleadhes1onsanalvse: 38C13beta7/muVCAM-l-Iganalysen utført i overenstemmelse med den murine MAdCAM-l-Ig/RPMI8866cellebindingsanalysen ovenfor, bortsett fra at muVCAM-l-Ig (Genentech, Inc.) ble benyttetved 2 pig/ml for å belegge plater. Resultater av analysen er vist i tabell 8. (ICso- og ICgoverdier for 2 eksperimenter er vist).
Tabell 8
Aktivitet for hu504-variantantistoffer i 38C13-beta7-uttrykkende celler
Binding til muring VCAM-l-Ig
Antistoff testet: Fib504- oghu504-varianter
ICso (nM)
IC90 (nM)
Rotte-Fib504
0,845/0,447
2,903/2,30
Variant hu504.5
0,763/0,407
3,074/2,30
Variant hu504.16
0,835/0,584
2,857/1,84
Variant hu504.32
0,562/0,330
2,004/1,84
Resultatene av bindingsundersøkelsene for humanisert Fib504-variant viste at dethumaniserte antistoffet ifølge oppfinnelsen binder sitt mål, beta7-integrinsubenhet, i tilleggtil alfa4beta7- og alfaEbeta7-integrin med omtrent affiniteten til utgangsrotteantistoffet, og inoen tilfeller med høyere affinitet. Slik har et humanisert anti-beta7-antistoff ifølgeoppfinnelsen anvendelser i anti-beta7-integrinterapier, spesielt humane terapier.
Relativ aktivitet for hu504.32-varianter ifølge oppfinnelsen
Ulike aminosyrevarianter av hu504.32-antistoffet ble testet i humanecelleadhesjonsanalyser og musecelleadhesjonsanalyser for deres evne til å inhibere beta7inneholdende reseptorbinding til sin ligand i overenstemmelse med celleadhesjonsanalysefremgangsmåten som er tilkjennegjort her. RPMI8866/MAdCAM-l-Fc-analysen bleutført som beskrevet her ovenfor. AlfaEbeta7-293/hu-E-kadherinanalysen ble modifisert ved
anvendelsen av humant E-kadherin-Fc som liganden (humant E-kadherin-Fc, 648-EC, R&DSystems, Minneapolis, MN). Den relative evnen for hu504.32-varianter i å inhibereinteraksjon av humant fibronektin (huFN40) med human alfa4beta7-reseptor på RPMI8866celler ble også undersøkt. RPMI8866/hu-fibronektin (huFN40)-analysen som ble benyttet idisse undersøkelsene var lignende i format med RPMI8866/MAdCAM-l-Ig-analysen som ertilkjennegjort her bortsett fra at humant fibronektin-alfa-chymotryptisk fragment 40 kDa(F1903, Chemicon Internationa. Temecula, CA) ble benyttet ved 2 pig/ml for å belegge plater.
Evnen for hu504.32-variantene i å inhibere interaksjon for murine beta7inneholdende reseptorer med murint MAdCAM-1 eller murint VCAM-1 ble undersøkt. MuringMAdCAM-l-Fc og murint VCAM-l-Fc ble inhibert fra å interagere med murine lymfomalfa4+-celler som uttrykker murine beta7 (38C13beta7-celler) ved hu504.32-variantene. Demurine MAdCAM-l-Fc- og VCAM-l-Fc-celleadhesjonsanalysene ble utført lignende med desom er beskrevet her ovenfor for human MAdCAM og VCAM. Der ligandene var fusjonert til Fc-regioner ble Fc-reseptorene på cellene blokkert med 0,5 jig anti-CD16/32-antistoff (antiFcy-III/II-reseptorantistoff, katalog nr. 553142, BD Biosciences, San Jose, CA) pr. 1 millionceller i 5 min. ved romtemperatur. 150000 mekede celler i 50 jil analysemedium ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 13 min. ved 37°C. Cellene ble vasket og mengden av fluorescens ble frigjort fra lyserte celler ble målt som tilkjennegjort her ovenfor. Kontrollantistoffet for de humane celleadhesjonsanalysene var det monoklonale museantistoffet mot human serumalbumin, 6B11 (katalog nr. abl0244, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). Kontrollantistoffet for de murine celleadhesjonsanalysene var rotte-anti-museintegrin-beta7antistoffet M293 (BD Biosciences, San Jose, CA), som ikke konkurrerer med ligand eller med Fib504 for binding til integrin-beta7.
Resultatene av triplikatanalyser for de humane og de murine celleadhesjonsanalysene er tilveiebrakt i tabellene 9 og 10.
Tabell 9
Aktivitet for hu504.32-variantantistoffer i humane celleadhesjonsanalyser
Antistoffvariant
ICso Ave + SD
RPMI8866/ huMAdCAM-l-Fc
RPMI866/ hu7dVCAM-l
aEp7-293/huE-kadherin-Fc
RPMI8866/ huFN40
hu504.32
0,088 ±0,035
0,101 ± 0,021
3,970 ± 1,664
0,100 ± 0,046
hu504.32 M94Q
0,090 ± 0,045
0,111 ± 0,035
4,130 ± 1,212
0,124 + 0,056
hu504.32M94R
0,075 ± 0,034
0,089 ± 0,009
3,963 ± 1,776
0,119 ± 0,056
Kontroll (6B11)
>100
>100
>100
>100
Tabell 10
Aktivitet for hu504.32-variantantistoffer i murine celleadhesjonsanalyser
Antistoffvariant
ICso Ave + SD
38C13beta7/muMAdCAM-l-Fc
38C13beta7/mu7dVCAM-l-Fc
hu504.32
0,270 ± 0,041
0,228 ±0,065
hu504.32M94Q
0,370 ± 0,102
0,264 ±0,083
hu504.32M94R
0,391 ± 0,112
0,228 ± 0,081
Kontroll (M293)
>100
>100
hu504.32-antistoffet baret metionin på posisjon 94 på tungkjede-CDR.3. VarianteneM94Q (eller hu504.32Q) og M94R eller hu504.32R) har henholdsvis glutamin og arginin på posisjon 94 i hu504.32-antistoffvarianten. hu504.32M-, Q- og R-antistoffene redusertevesentlig integrin-beta7-reseptorligandinteraksjon i hver av analysene og er slik sterkeinhibitorer av beta7-mediert celleadhesjon.
hu504.32R-antistoffaktivitet in vivo
hu504.32R-antistoffvarianten ble testet in vivo for dens evne til å redusere integrinbeta7-reseptorligandinteraksjon og redusere lymfocyttrekruttering til inflammert kolon i enmurin in vivo-inflammatorisk tarmsykdomsmodell. BALB/c-mus og CB17-SCID-mus blefremskaffet fra Charles River Laboratories International, Inc. (Wilmington, MA, USA). CD4+CD45Rb-high-T-cellerekonstituerte SCID-kolittmus ble klargjort ved å isolereCD4+CD45Rb-high-T-celler fra BALB/c-donormus og overfører 3 x 105 celler til 100 jil PBSintravenøst. SCID-kontrollmus mottok ikke CD4+CD45Rb-high-T-celler. Rekonstituerte CD4+mus som oppfylte behandlingsgruppeinnrulleringskriteriene med 10 % vekttap fra baselinje eller 15 % fra toppvekt ved uke 4 ble ansett å ha fått indusert inflammatorisk tarmsykdom og ble valgt for behandling.
På dagen med behandling med testantistoffer ble mesenteriske lymfeknyteceller (MLN) fra BALB/c-donormus høstet og radiomerket med Cr51. Behandling involverte tidligereadministrering av anti-GP120-antistoff, hu504.32-anti-beta7-antistoff, hu504.32R-antibeta7-antistoff eller ikke noe antistoff (kontroll) intravenøst, 200 jutg/lOO jil PBS. 30 min.etter antistoffadministrering ble Cr51-merkede MLM-celler injisert, 4 x 106 celler/100 jil. 1time etter injeksjon av merkede celler ble mus avlivet og milt, kolon og peyers plakk samlet inn, veid og total Cr51-radioaktivitet pr. organ ble bestemt. Fig. 16 er stolpediagram ogresultatene fra disse testene som viser den relative evnen til antistoffene i å blokkere målretting av de radiomerkede T-cellene til kolon i mus som opplever inflammatorisktarmsykdom. Styring av T-celler til inflammert kolon ble inhibert ved hu504.32- oghu504.32R-anti-beta7-antistoffer i forhold til negativ kontroll, anti-GP120-antistoff.Fordeling til milt var lignende for alle antistoffene. hu504.32 og hu504.32R-anti-beta7antistoffene inhiberer slik effektivt styring av T-celler til inflammert kolon in vivo.
Antistoffglykosylering påvirker ikke evnen for hu504.32R-varianten i å blokkereMAdCAM-l-binding til alfa4beta7-reseptor.
Glysering, som er den ikke-enzymatiske glykosyleringen av proteiner, kan rammeantistoff-ligandinteraksjonen (se f.eks. Kennedy, D. M. et al., Clin Exp Immunol. 98(2):24551 (1994). Glysering av lysin på posisjon 49 i 504.32R. Glysering på lysinet på lettkjedeposisjon 49 i hu504.32R-varianten (HVR-L2 med relativ posisjon Bl) ble observertmen hadde ingen vesentlig effekt på evnen til antistoffvarianten i å blokkere binding av MAdCAM-1 til alfa4beta7-reseptoruttrykkende RPMI8866-celler. Bestemmelse av glyseringog glyseringsnivåer ble utført ved å benytte standard elektrosprayionisering-massespektroskopi (ESI-MS) og boronataffnitetskromagografi. Boronataffinitets-HPLCfremgangsmåter som er nyttig for å teste glysering blir f.eks. funnet i Quan C.P. et al., Analytical Chemistry 71(20):4445-4454 (1999) og Li Y.C. et al., J. Chromatography A,909:137-145 (2001). Celleadhesjonsanalysen blir utført i overenstemmelse medRPMI8866/MAdCAM-l-Fc-celleadhesjonsanalysen som er tilkjennegjort her.
I alternative utførelsesformer av oppfinnelsen blir glysering på posisjon 49 redusert eller eliminert der posisjon 49 omfatter en aminosyre som er forskjellig fra lysin. Polypeptidet eller antistoffet ifølge oppfinnelsen omfatter som en aminosyre på posisjon 49 (HVR-L2 relativ posisjon Bl) enhver av aminosyrene A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R,S, T, V, W eller Y, der hver bokstav refererer til en aminosyre ifølge standard énbokstavs aminosyrebetegnelsen. Alternativt er aminosyren på posisjon 49 og lettkjeden til en 504.32R-variant (eller annen 504-variant) valgt fra gruppen som består av R, N, V, A, F, Q,H, P, I eller L. En aminosyre som er nyttig på posisjon 49 er f.eks. valgt ved å oppvise (frembringe et bakteriofagbibliotek av) hu504.32R-Fab på bakteriofag (variant) ogsubstituere separat, på kodonet for posisjon 49, et kodon for hver av de 20 naturlig forekommende aminosyrene. Bakteriofag som uttrykker 504.32R-variantene som er endretpå posisjon 49 blir testet for binding til integrin-beta7 og/eller en reseptor som omfatterintegrin-beta7, slik som alfa4beta7- eller alfaEbeta7-reseptorer. De variantene som binderbeta7-integrin eller alfa4beta7- eller alfaEbeta7-reseptorene blir ytterligere screenet forevnen til å inhibere integrin-beta7-reseptor-ligandbinding og in vivo-effektivitet sombeskrevet her. Alternativt kan naturlige eller ikke-naturlig forekommende aminosyrer blisubstituert på posisjon 49 ved hjelp av standard mutagenesetknikker og testet i celleadhesjons- og in vivo-analysene som er beskrevet her. Alternativt er aminosyren påposisjon 49 i lettkjeden en aminosyre som er forskjellig fra lysin (K), og aminosyrer på enhver annen HVR- eller rammeverksposisjon eller posisjoner på lettkjeden og/ellertungkjeden blir endret for å velge et variant-anti-beta7-bindingspolypeptid eller antistoffsom oppviser bindingsaffinitet, in vitro og in vivo biologisk aktivitet, farmakokinetikk, legemiddeluttømming og immunogenisitet nyttig for reduksjon av inflammasjon ved å redusere den biologiske aktivitetn til integrin-beta7. Mutagenese og seleksjon av et sliktpolypeptid eller antistoffvariant blir utført som tilkjennegjort her og ifølge andre
standardteknikker. Et slikt variant-anti-beta7-bindingspolypeptid eller -antistoff oppviserintegrin-beta7-bindingsaffinitet innenfor 10000 ganger, 1000 ganger, alternativt innenfor100 ganger, alternativt innenfor 10 ganger, alternativt innenfor 5 ganger, alternativt innenfor 2 ganger av bindingsaffiniteten som er oppvist av enhver av de humaniserte
5 Fib504-variantene som er tilkjennegjort her.
Den foregående skrevne beskrivelsen er ansett for å være tilstrekkelig for å muliggjøre en fagperson på området å utøve oppfinnelsen.

Claims (5)

Patentkrav
1. Anti-beta7-antistoff
som omfatter en variabei regions tunge kjede rammeverksekvens som omfatter aminosyresekvenser gitt som SEKV. ID Nr.: 38, SEKV. ID Nr,: 39, SEKV. ID NR..: 45 og SEKV. ID NR..: 41, og en variabel regions lette kjede rammeverksekvens som omfatter aminsyrerester 12.3, 24-37, 38-69 og 70 til siste rest av aminsyresekvensen gitt som SEKV. ID Nr.: 15 og enHVR-L1, HVR.-L2, HVR.-L3, HVR-H1, HVR-H2 og HVR-H3 hvor hver i rekkefølge omfatterRASESVDDLLH (SEKV. ID NR,: 9), KYASOSIS (SEKV, ID NR.: 2), OOGNSLPNT (SEKV. ID NR.: 3), GFFITNNYWG (SEO ID NR: 4), GYI-SYSGSTSYNPSLKS : 5), og RTGSSGY-FDF(SEKV. ID NR.: 66).
2. Et anti-beta7 antistoff ifølge krav 1, som omfatter en lett kjede som haraminosyresekvensen ifølge SEKV. ID Nr.: 33
3. En isolert nukleinsyre som koder for et anti-beta7 antistoff ifølge krav 1 eller krav 2
4. En vektor som omfatter nukleinsyren ifølge krav 3.
5. En vertscelle som omfatter vektoren ifølge krav 4.
6. Vertscellen ifølge krav 5, hvor vertscellen er en prokaryotisk celle.
7. Vertscellen ifølge krav 6, hvor vertscellen is E. coli.
8. Vertscellen ifølge krav 5, hvor vertscellen er en eukaryotisk celle.
9. Vertscellen ifølge krav 8, hvor vertscellen er en pattedyr celle.
10. Vertscellen ifølge krav 9, hvor vertscellen er en kinesisk hamster ovariecelle.
11. En fremgangsmåte for fremstilling av et anti-beta7 antistoff, nevnte fremgangsmåteomfatter å utrykke i en vertscelle ifølge et hvilket som helst av kravene 5 til 10 en rekombinant vektor ifølge krav 4, og gjenvinne nevnte antistoff.
342319
Seqpence listing
<110> GSNWFEC»/ INC.
<120 HVMANI ZED ANTI-BETA7 røTAGCWSTS W5 USES THEREFOR
<130 SWFP6974392
<140
<141> 2QQ5--09--02
<140 EP10177407.3
<141> 2305-09-02
<150> EP0581Q856.4
<151> 2005-09-02
<150 PCT/US2005/031401
<151> 2005-09-02
<150 US 50/607,377
<151> 2004-09-03
<260 68
<21C> X
<211> 11
<212> PRT
<213> Artlficial sequenae
<220>
<223> sequence is synthesiEed
<400< 1
Arg Ala Ser Slu Ser Val Asp Thr Tyr Leu His ' .5 ' " ' .10 .
<210>
&
<211>
<212>
PRT
<213>
Artificial seqyence
<22 0>
<223>
sequenae is synthesised
<400
Ays Tyr Ala Ser Gin Ser Ile Ser .5.
<210>
<211>
<212>
PRT
<213>
Artificial
sequence
<22 0>
<223>
seque«C!é:. iis
» synthesired
<400>
Gla Gla Gly Asn Ser lev ?rø Asri Thr
<210 4
<211> 10
342319
<2i2> PRT
<213> Åstifieial sequence
<220
<223v sequence is synthesi^ad
<400> 4
Gly Ph® Phé ile Thr Asn Asti 'Tyr Trp Gly
5 10
<210>
<211>
<212>
<213>
5 17 PRT Artificial
séquenca
<220»
<223>
Seguencé is
S syrstfeesiied
<400>
Gly Tyr Ile Ser ryr Ser Gly Ser Thr Sér Tyr Asr Pro Sei Ler I 5 10 15
liys 'Ser'
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Arhifiaial sequence
<22 0>
<223> sequence is synt^esized
x4Q0> 6
Met Thr Gly Ser Ser Gly "yr Phe Asp Phe ■ ■ ■ ■ ■ " 5 ' 1Q
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequénce
<220>
<223> sequence is sywtliesized
<40G> 7
Arg Ala Ser Glu Sér Val Asp Ser Lee liéu His 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificiai saquence
<220 >
<223> seguence is syhthesized
<400> 8
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp thr Leu Lee His 5 10
<210» 9
<211>. 11
342319
<212> PRT
<213> Artificial
secjrérica
<22&>
<22:3> sequence .1'8 syr.thesized
<400> 9
Arg Ala Ser Slu Ser Val Asp Asp Leu .s¥ .
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificlal sequence
<220>
<223* se^juence is Syiithésiied
<4Q0> 10
Len
His
Asp Val Val
Met
Thr
S
Gin
Ser Pro
Ala
Thr
Leu
Ser
Val
Thr
pro
Gly Giu Arg
Ile
Sér
Lev
Ser CyS Arg
Aia
ser
Glu
8®r
Val
ASp
Thr Tyr Lea
Kis
Trp
Tyr
Clr GlU
lys
Pro
Asn
Ser
Pro
Arg
Leu Leu Ile
Lys
Tyr
Ala
Ser Gin
Ser
Ile
5<
Ser
Gly
Ile
Pro
Sér
Arg Phe Ser
Gly
Ser Gly
W '
Ser Gly
Thr
Asp Phe
Thr
Leu
Ser
ile
Asn Gly Val
Glu
Leu
SXti
Asp Leu
Ser
Ile
Tyr
Tyr
Cys
Gin
Gin
'3S-
4'3
4S
Gly Asn Ser tøu Pro 95
Leu lys Arg
<210> 11
<211> 117
<212> PRT
<213> Artifxeial sggi
<22 0»
<223'* segugstig® 18 Syr
<490> 11
Asn
jøsg®
iS-hefi
Thr Ph®
t
lizéd
Gly Ala Gly
TKr
Lys
Ler
Glu
Glu Val Gin
I
Leu
Gin
Glu
Ser Gly
Pra Gly
Leu
Val
lys
Pro
Sér
Gin Ser Leu
Sér
Leu
Thr
Cys Sér
Val
Thr
Gly
Phe
Phe
Ile
Thr
Asn Asrl Tyr
Trp
W
Trp
ile Arg
Lys
.Phé
Pro
Gly
Asn Lys
Met
5$
Glu Tip Jietr
Gly
Tyr
Ile
Ser Tyr
Ser
Gly
Ser
Thx
Ser
Tyr
Asa
Pro Sar Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys 342319
s
€5 70 75
Asn Gin phe Phe leu Gin Léu Asn Ser val Tte Thr Gle Asp Thr 80 85 90
Ala Thr Tyr Tyr Cys Åla Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp . 95 100 105
Phe Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser . .110 .115
<210> 12
<21i> 174
<212> PRT
3#
<213> Artificial sequence
<22 0>
<223> seguence is synthesized
«S00> 12
Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro
1 5 10 15
Gly Glu Årg Ile Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp
' 20 ' ' -SS" ■ ■ ■ ■ ■ S£)
Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asn Glu Ser Pro Arg
' 35 40 45
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60
Åig Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr leu Ser Ile ' 70 "75
Asn Gly Val Glu Len Glu Asp Len Ser Ile Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90
Gly Asn Ser Leu Pro Asn Thr Phe Gly Ala ©Xy Thr Lys Leu Glu 95 100 105
Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 11® Phe pro Pro
110 115 120
Ser Met Glu Gin Leu Thr Ser Gly Gly Ala Thr Val Val Cys Phe
. 125 130 135
Val Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys II®
140 145 150
Asp Gly Ser Glu Gin Arg Asp Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp
155 160 lfi5
Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
<210> 13
<2U> 146
<212> PRT
<213> Artxfieial sequenca
342319
<220>
<223> setfjusnpe -is synfehesia^ci
<40G> 13
Ser
Gly Pro Gly
Leu Val Lys
Pre
Ser
Glu
Val Gin
Leu Gin Glu
Gl«
Ser Leu
Ser Leu Thr 2:0:' '
Cys
Ser Val Thr . 25
Gly Ph« Ph®
Ile
Thr
Asft
Asn Tyr Trp Gly Trp
Ile
Arg Lys Phe
Pro Gly Asn
Lys
Met .45'
Gin
Trp Met
Gly Tyr Ile
Ser
Tyr Ser Gly
Ser Thr Ser
Tyr
Ash
Bro
Ser Leu
Lys Ser Arg
Ile
Ser Ile Thr
Arp Asp Thr
Ser
Lys
Asn
Gl» Phe
Phe heu Gin
Leu
Asn Ser Val
Thr Thr Glu
Asp
Thr
Ala
Thr Tyr
Tyr Cys Ala
Mét
Thr Gly Ser
Ser Gly Tyr
rfce
ASp j-Co
Bhe
Trp Gly
Pro Gly Thr
Met
Val Thr Val
Ser Ser Ala
Glu
Thr 120
Thr
Ser
<2103
<211>
<212>
*.213>
<2203
<?23>
<400>
Ala Bro Ser Val Tyr Pro lieu Ala Prp 125 130
As» Ser Met Val Thr lee Gly Cys Leo 140 145
■ '14
■ 80
■ PRT
• Artlficial sequerce
- sequence is syntjiesired;
• 14
Gly Thr Ala
Val
Leu
^ys
Asp
Ile; Gla
Met.Thr Gl» S
Ser
Pro Ser Ser
Leu Ser Ala
Ser
Val
Gly ASp Arg
Val Thr 11® 2'0.
Thr
Cys Trp Tyr
' " 25'
Gin Gl» Lys
Pro
Gly
lys
Ala Pro
Lys Léu lea
Ile
Tyr Gly Val ' 40
Pro Ser Arg
Phe
Ser
Gly
Ser Gly
Ser Gly Thr Asp
Phé Thr Lee
Thr Ile Ser
Ser
Léu
Gl»
Pro Glu
Asp Phe Ala
Thr
Tyr Tyr Cys
Ph® Gly Gin
Gly
Thr
65 7Q 75
lys Val Glu xlé lys
<21 (J> 15
<211> 73
342319
<212'- PRT
-.213-" Artifieial scgvence
-.22 0>
<223> sequetlqS is synthéSizéd
<460> 15
Asp Ile Gin Met Thr Gl» Ser
1 s
Prp Ser
Sér
.Léu
Ser Ala
Ser Val
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
Cys Trp
Tyr .25.
Gin
Gin Lys
Pro Gly
l.ys Ala Pro lys leu Sali II®
Gly Val
Prp
Ser
Arg
Phs
Ser Gly
$5
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
TUr Leu
Thr
ile.
Ser
Ser
Leu Gin
Prp Glii Asp Phe Ala Thr Tyr 65
Val Glu ile Lys
Tyr Cys
Phe
Gly
Gin
Gly
Thr Lys
2$ ■
<210> 16
<211> 80
<212> PRT
<213> Artifipial sequenee
<220>
<223* seguence is synthesisej
i
3Q
<40Q> 15
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser
1 ' 5 ' '
Pro Lea;
Ser
Len
Pre
val
Th.r Pro
Gly Gl» Pro Ala Ser Ile Ser .20 '
Cys Trp
Tyr
Len
Gin
LyS
Pro Gly
Gla Ser Pro Gin Leu Leu Ile . 35
Tyr Gly
Val
Prp
Asp
Arg
Phe Ser
■4Q:
Gly Ser Gly Ser Gly T&r Asp
Rh® Thr
Leu
Lys.
Ile
Ser
Arg Val
Glu Ala Glu Asp val Gly Val
Tyr Tyr
Cys
Phe
Gly
Gin
Gly Thr
lys Val Glu Ile Lys
<21Q> 17
<211> 80
<212> Rrt
<213> Artificial sstjuéaqé
<220 >
«223a- sequence is aynthésized
5S
<400> 17
Glu ile Val Leu tiir Glh Ser
1 5
Pro Gly
Thr
ieu
Ser
Leu
Ser Pro
342319
Gly GXu Arcj Ala Thr Leu
Ser Cys
Trp Tyr Gin
Gin
Lys Pro Gly
Gin Ala Pro Arg Leu Léu
Ile Tyr
Gly Ile
pr©
Asp
Arg Pne
Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr " .' ' ' " 50
Asp Phe
Thr Leu
Thr
Ile
Ser Arg
Leu
sd
Glu prp Glu Asp phe Ala
Val Tyr
Tyr Cys
?o
Phe
Gly
Gin Gly
Thr
Lys Val Glu Ile Lys
IS
<210> 18
<211> 80
<212> PRT
<213> Artificial setjuerca
<22 0>
<223> seguence is synthei
slzed
<400> 18
Asp ile Val Met $hr Gin
1 ;§
Ser Pro
Asp Ser
Leu
Ala
Val Ser
Leu
Gly Gla Arg Ala Thr Ile
Ash Cys
Ttp Tyr
Gin
Gin Lys Pro
Gly
Girt Pro Pro Lys ieu Leu
Ile Tyr
Gly Val
Pro
Asp Arg fehe
Ser
Gly Ser Giy Ser Gly Thr ' ' 50
Asp Phe
Thr Leu Thr " 55
Ile
Ser Ser
Leu
JS
Gin Ala Glu Asp Val Ala " W/ " "
Val Tyr
Tyr Cys
Phg
Gly
Gin Gly
Thr
75.
Lys Val Glu Ila Lys
4>J
<210> 19
■<211> 87
<212> PRT
<213> Artificial seguenee
<22 0>
<223> sequence is synt hes i sted
<400> IS
Gin Val Gin Leu Val Gin
1 ' "5
Ser Gly
Åla Giu
Val
Lys
Lys Prp
Gly
sa
Ala Ser Val Lys val Ser . .20 '"
CyS Lys
Ala Ser
Gly
Tyr
Thr Phe
Thr
Tip Val Arg Gin Ala Prp
Gly Gin
Gly Leu
GXu
Trp
Met Gly Arg 45'.
55’
Val Thr Ile Thr Ala Asp
Thr Ser
Thr sér
Thr
Ala
Tyr Met
Glu
342319
Leu Ser Ser Leu
Arg
Ser
Glu Asp Thr Ala
Vo
val
Tyr
Tyr
Cys
Ala
■s
Arg Txp (jly Girt
Gly
Thr
Leu Val Thr Val
Ser
Ser
<210> 20
<21x> 81
<212* PRT
<213* Artxficial
sequence
<220>
<223> séquence is
5 synthesizer!
>s
<400> 20
Gin Val Gin Leu
Val
Gin
Ser Gly Ala Glu Val
Lys
Lys
Pro Gly
Ala Ser Val Lys
Val
Ser
Cys Lys Ala Ser
Trp Val
Arg
Gin
Ala
Pro Gly Gin Gly
iieu
35:
Glu
Trp «et Arg val
Thr
Ile
Thi:
Ala
Asp
Thr Ser Th± Ser
Thr
Ala.
Tyr Met: Glu Leu .55
Ser Ser
Lou Arg
Ser
Glu Asp Thr Ala Val
Syr
Tyr Cys Ala Arg
Trp Gly
Gin
Gly
Thr
Léu Val Thr Val
Ser
Ser
<210> 21
<211> 80
<212> PRT
<213> Artificial sequenc<a
<220>
<223> seguence is syrrtliesiKed
<400> 21
Gin Val Gin Leu Val
1 5
Gin
Ser Gly
Ala
Glu
Val
Lys
Lys
Pro Gly
Ala
Ser Val Lys Val
Ser
■CyS Lys.'
Ala
Ser
Trp
Val
Arg
Gin Ala
Pro
Gly Gin Gly Leu
Glu
Trp Mefc
Arg
Val
Thr
Iln
Thr
Ala Asp
Thr
Ser Thr Ser Thr
Ala
Tyr Het
Glu
Leu
Ser
Ser
..Leu
Arg Ser
JjO 55. 60
Glu Asp Thr Ala Val Tyr
Tyr Cys Ala Trp Gly Gin Gly Thr Leu
— g§
70 75
Val Thr val Sét Ser
S0
<2X1> 79
342319
<212> PRT
<213» Artifiqial sequenqe
<220>
<223> sequence is syntSiesixecI
<4Q0> 22
Gin val Gin Leti Val Gin set Gly Ala Glti val Lys Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Sér Val Lys Val Ser Cys Lys Åla Ser Trjp Val Aig GLnsÅla ' ' ' 20 ' ■ - ' .gg. ' ■ jr»
Pro Gly Sin Gly leu Glu Trp Met Arg Val Thr Ile TÅr Ala Asp
35 <5
ihr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Gly- Len ser Ser Leg Arg ser
50 . 55 50
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gin Gly Thr Len Val
65 70 75
Thr Val Ser Ser
<210> 23
<211> 1Q8
<212* PRT
<213» Artifieial sequ^nce
<22 p>
<223> sequsnce is synfcHøsiiKeii
<4Q0> 23
Asp Ile
Gin Mefc
Thr
Gin Ser
Prp Ser Ser
1:0
Lev
Ser Ala ser Val
Gly Asp
Arg Val
TKr
Ile Thr
Gys Arg Ala " 25
Ser
Gin Ser Ile Ser
Åsn Tyr
Xn6U
Trp
Tyr Gin
Gla Lys Pro
Gly
Lys Åla Pre Lys
Leu Leu
Ile Tyr
Ala
Ala Ser
Ser Leu Glu
Ser
Gly Val Pro Ser .60
Arg Phe
Ser Gly
Ser
Gly Ser
Gly Thr Asp
Phe
Thr Lev Thr ile
Ser Ser
Leu 'Gin
Pro
Glu Asp
Phe Ala Thr
. 85
Tyr
Tyr Cys Glii Gin
Tyr Asn
Ser Leu
Pro
Trp Thr
Phe Gly Gin
Gly
Thr Lys Val Glu
Ile Lys Ars
<210> 24
<211» 113
<212> PRT
<213> Artificial sequerce
342319
<220>
<223> sequenqe is synthesi^ed
<400>
Gin
: 1
*• 24
Val
Gin Leu
Val
Glo
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin
Pro
Gly
(Sly
Ser
Leu ..Årg
Leu
Ser
Cj s Ala
Åla
Ser
Gly Phe TAr
Pbe
Ser
.«?
Ser
Tyr
Åla Met
Ser
Trp
Val Arg Gin Ala
Pro Gly Lys
GLy
Len
Glu
W
Val Ser
Val
ile
Sei Gly Asp Gly .55
Gly Ser Thr
Tyr
Tyr
7.5
Ala
Asp
Ser Val
Lys
S5
Gly Årg Phe
Thr
Ile
Ser Arg Asp
Asn
Ser
Lys
Asft
Thr lieu
Tyr
XifBU
Gin Ket
Asa
Ser
8:5
Leu Arg Ala
Glu
Asp
M
Thr
Ala. Val Tyr Tyr Cys ' SS
Ala Arg Gly
Phe
Asp Tyr Ti'p Gly Girt
■-15 ••
Gly
<210>
<211?
<212>
<213>
Thr Leu Val
• 25
■ PRT
• Artificial
Thr Val Ser Ser 110
secruence
<220>
<223>
séqueincé ii
5 syntheslzed
■35
<400>
Asp
■ 25
Ile
Gin Met
Thr
Gin
Ser Pro
Ser
Ser
Lee Ser Ala
Ser
Val
Gly
Asp
Årg Val
Thr
Ile
Tl»r Cy s
Arg
Ala
Ser Glu Ser
Val Asp
30'
Thr
i?vr
Len His
Trp
■Tyr.
Gin Gin
Lys
Prp
Gly lys Ala
Prp
Lys
Lee
Leu
Ile tys
Tyr
Ala
Ser Gin
Ser
ile
Ser Gly val
Pro
Ser
Arg'
?he
Ser Gly Ser
Gly
Ser Gly
thr
Asp
Fbe Thr Leu
Tfar
ile
Ser
Sér
LéU Gin
Prq
Glu
Asp plie
Ala
Thi
Tyr Tyr Cys
Gin
Gin
Giy
Asp
Ser Len
Bro
Asn
Thr Ph© Gly
Gin
100.
Gly TTir Lys
Val
Gin
Ile lys Arg
<210> 26
<211> 117
342319
<212> PRT
Artifissial se<jtier»c^
<220>
<223> sequénq© £é synthesized
<4M> 2$
Glu Val Sin teu Val Gla Sat Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu taj teu Ser Cys »la Ala Ser Gly Phe Fhe He Thr
20 25 30
Asn Åsh Tyr Trp G1V Tsp Val Arg Gli» Ala Pro Gly I>ya Glj Leu
35 40 45
Glu Trp Val Gly Tyr Ile Ser tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Åsn
50 55 60
Sré Sssr Leir Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys
65 70 75
Åsn t&r Åla Tyr Len G1A Met Åsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp thr
. Sø 85 9Q
Ala Val Tyr Tyr Gys Ala Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp
95 . 100 105
Phe Trp Gly Gin Gly Thr Le-i Val Thr Val ser Ser
.110' ' ' ' ' .115; ' ' '
<210> 27
<211> 214
<212> PRT
<213>
Artificial sequenpe:
<220>
<22 3>
sequence is synthesired
<400> 27
Asp ile Gin ffet
1 ' '
Thr
Gin Ser
Pre
Ser
Ser
Leu
Ser
Ala
Ser
Val
Gly Asp Arg Val
Thr
Ile Thr
Gys
Arg
Ala
25:
set
■Gin"
Ser
Ile
Ser
ASA Tyr Lcu Ala
Trp
Tyr Gin
Gin
lys
Pro
Gly Lys Ala
Pro
lys
Len Len ile Tyr
Ala
Ala Ser
Ser
l.-eu
Glu
Sér
Gly
Val
Pt®
Ssr
SO
Arg Phe Ser Gly
Ser.
Gly Ser
Gly Thr Aap tØ;
Phe
Thr
Leu
thr
Ile
Ser Ser Leu Girt
Pro Glu Aso
W '
Phe
Ala
The
Tyr
Tyr Cys
Gin
Sin
Tyt Åsn Ser Leu
Pre
Trp Thr
Phe
Gly
Gin Gly
Thr
Ly®
Val
Glu
ile Lys Arg Thr
val
Ala Ala
Pre
Ser
Val
Phe
Ilé
Phe
Pro
Pro
342319
Sec
Asp
Slu Gin Lev
12S
lys
Ser Gly
The
Ala ser
val val Cy$
Lfiu
Le»
ASn
As ii phe Tyr
Pro
Arg Glu
Ala
Lys Val 145
Gin Trp Lys
Val
Asp
Asn
Alé Lev Glh
Ser
Gly Asn
Ser
Gin Glu
Ser Val Thr
Glu
rø
Gin
Asp
Sex- Lys Asp
' ' 170
Sex
Thr: Tyr
Ser
Leu Ser
Ser Thr Leu
Thr
Lea
Sep
Lys Ala Asp ' ' ' 1S5
Tys
Glu Lys
His
Lys Val 130
Tyr Ala Cys
Glu
rå-:
Val
The
His Gin Gly
Léa
Ser Ser
?ro
Val Thr
Lys Set The
Asn
21Q
Arg Gly Glu Cys
a»
<220> 28
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223* seguence is synthesizéd
<400> 28
Leu Val Gin
Pto Gly
Glu
.Gly
Val Glu
Leu Val Glu Ser Gly
Gly Gly
Ser
Leu
•3 "
Gly
Phe Thr
Phe
Ser
Arg Leu Ser Cys Ala
Ala Ser
Ser
Tyr
Ala:'
Met Sec Trp Val Arg ' 35 ' '
Gin Ala
Pro
Gly'iys
Gly
Leu
Glu
Trp
Val
Ser val ile Ser Gly
Asp Gly
Gly
Ser Thr
Tyr
Tyr
Ala
Asp
Ser
Val Lys Gly Arg Phe
65.
Thr Ile
Ser
Ar g Asp
Asn
Ser
LyS
Asn
Thr
Leu Tyr Leu Glh Met 8ø
Asn Ser
Leu
Arg Ala
Glu
Asp
Thr
Ala
val
Tyr Tyr Cys Ala Met
Thr Gly
Ser
Sec Gly
Tyr
Phe
Asp
Phe
Trp
Gly Glu Gly Thr Leu .110
Val Thr
Val
Ser Ser
Ala:
Ser
3 20
Thr.
Lys
Gly
Pre Sec Val Phe Pro
125 "
Leu Ala
Pro
Ser Ser
Lys
Ser
Thr
Ser
Gly
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
140 145
Léu
Val Lys
Asp
Tyr
'The
Pro
Glu
Pro Val Thr Val S«r
Trp Asn
Set
Gly Ala
Leu
Thr
342319
Sésf
Tys
Giy
Ser
Val
L«u
His
Ser
Thr 170
Ser ISS
Fhe
Val
pro Ala Val
Val Thr Val
Leu
PlO
Gin
Ser
Ser
Sei
Sei
Ser
Gly
Leu
Leu 180
Gly 195
Thr
Gin
Thr
Tyr
ile
Cys
Asn
Val
Asn
His
Lys
Pro
Ser
Asn
Thr
Ly;;
Val
Asp
Lys
Ljs
Val
Glu
Pro
Lys
Ser
Cys
Asp Lys
Thr
His 225
Thr
Cys
Pro
Prp
Cys
Pro Ala Pro
Glu
Leu
Leu
Gly Gly Pro
Ser
Val
Phe
Léu
Phe
Fro
Pro
Lys
Pro
Lys
Asp
Thr
Leu
Mel
Tie
Ser
Åsgr
Thr
Pro
Glu
Val
2fiØ
Thr
Cys
Val
Val
Val Asp
Val
Ser
His
Glu
Asp
Pro
GLu
Val
Lys
2^5
Pha
Asn Trp
Tyr
Val Asp Gly 280
Val
Glu
Val
His
Asn Ala Lys
Thr
T^O
TyS
Prp Arg
Glu
Glu
Gin
Tyr
Asn
Ser
Thr 300
Tyr
Arg Val
Val
Ser
Val
..■Léu
Thr
Val
Leu
Sis
Gin
Asp
Trp
Leu
As»
Gly Lys
Glp
Tyr Lys
Cys Lys
Val
Ser
Asn Lys
Ala
Lesr
Pro
Ai.a
Prp
He
Glu
Lys
Thr
Ile
'Ser
Lys
AXa
Lys Gly
Gin
Pra
Arg 345
Gltx
Pro
Glii
Val
Tyr.
Thr
Léu
Pro
Pro
Ser
Arg
Glu
Glu
Mat
Thr
Lys
Asn
Gin
Val
Ser
3S5
Leu
Thr
Cys
leu
Val
Lys
Gly Phe
Tyr
Pro
Ser Asp
Ile Ala
val
Glu Trp
Glu
Ser
Asn
Gly
Gin
Pro
Glu
Asn
Asn Tyr
Lys
Thr
Thr
Pro
prp
Val
Leu
Asp
Ser
ASp
Gly
Ser
Phe
Phe
Leu Tyr
'Ser
Lys
Leu
Thi Val Asp
Lys
Sér
Arg
Tpp
Gin
Gin
Gly
Asti
Val
Phe
Ser
Cys Ser Val Mei
His
Glu
Ala
Leu
His
ASn
His
Tyr
Thr
Gin
Iitys
Ser
Leu
Ser
Leu
Sei
Pro
Gly
Lys
<21Q> 29
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial senuetice
342319
<220> .
14 <223> Sécpiéiiae 1* syx>thesized
<40(» 29
■s
Aap Ile Gin Mét Xhr Gin Ser Pro Ser Set
Leu Ser
Ala Ser Val
i 5 10
Gly Asp Arg Val ®hr Zié Thr Cys Arg Ala
20 25
.Séi; Glu
Ser Val Asp
JO
Thr Tyr Léui His Trp Tyr Gla Gli» Lys Pro
35 40
Gly Lys
Ala Pro Lya
Leu LeU Ile Tyr Tyt Ala Sei Gin Ser Ile
S0 55
Ser Gly
Val Pro Ser
Arg Phe Ser Gly Set Gly Ser Gly Thr Asp
65 70
Phe Thr
Leu Thr xle
Ser Ser Len Gin Pro Gle Asp Phe Ala Thr
80 85
Tyr Tyr
Cys Gin Gin
Gly Asn Ser Lee Pro Asn Thr Fhe Gly Gin
. 95 100
Gly Thr
Lys Val Glu
2S
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
110 115
Phe Ile
Phe Pro Pro
Ser Asp Glu Gin Len Lys Ser Gly Thr Ala
125 130
Ser Val
val Cys Leu
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
140 145
Val Gin
Trp Lys Val
Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn S®r Gin
155 160
Glu Ser
Val Thr Glu
Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Len . 170 ' 175
Ser Ser
Thr Lee Thr
Leu Ser Lye Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
185. 190
Val Tyr
Ala Cys Glu
■4$
■4S:
Val Tht His Gin. Gly Lcu Ser Ser Pro Val . 200 205
Arg Gly Glu Cys
<210> 30
<211> 447
<212> PRT
<213> Axiificxal sequence
<220>
<223> seqtietice is Synthesizéd
<400> 30
Thr Lys
Ser Ph© Asn
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
1 5 10
Leu Val
Gin Prp Gly
^■.
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
Gly Ph®
Ph® ile Thr
342319
&sn
Asn Tyr Trp
Gly
Trp Val
Arg Glu Ala
40:
Pro Gly
Lys
Gly
Léu
Gla
Trp val Gly
Tyt
ile Ser
Tyr Ser Gly ' 55
Ser Thr
Ser Tyr
Asn
Prp
Ser Leu iys
Ser
Arg Phe
Thr Ile Ser
Ala Asp
Thr
Ser
Lys 75
Asn
Thr Ala Tyr
Lell.
Gin Jiefc
Asn Ser Leu
Arg Ala
Glu
Asp
Thr
Ala
Val Tyr Tyr
Cys
Ala Met
Thr Gly Ser "10:0'
Ser Gly
Tyr
Phe
Asp 105
Phis
Trp Gly Gin
Gly 110
Thr Leu
Val Thr Val
Ser Ser
Ala
Ser
Thr' 120
iys
Gly Pro Ser
Val
Pne Prp
Leu Ala Pro
Ser Ser
Lys
Ser
Thr 135
Ser
Gly Gly "hr
Ala
Ala Leu
Gly Cys Leu .14 5
Val Lys
Asp Tyr
Phe 150
Pro
G1H Pro Val
Thr
Val Ser
Trp Asa Ser
ISO
Gly Ala
Leu
Thr
Ser
Gly
Val His Thr
Phe
Pro Ala
Val Leu Glh
Ser Ser
Gly
Leu
Tyr
Sar
Len Ser Sér
Val
1S5
Val Thr
Val Pro Ser
ISO
Ser Ser
Leu
Gly
Thr 195
Gin
Thr Tyr Ile
Cys
2G0
Asn Val
Asn His Lys
Prp Ser
Asn
Thr
Lys 210
Val
Asp I»ys lys
lai
~15
Glu Pro
Lys Ser Cys Asp Lys
Thr
His
Thr
Cys
.Pro. Prp: CyS
Pro
Ala Pro'
Glu Leu Leu Gly Gly
Pro
Ser
Val
Phe
Leu. Pi'.e Pro
Pro 245
Lys Prp
lys Asp Thr
Léu Met
Ile
Ser
Arg 255
Thr
Pro Glu VAl
Thr
Cys Val
Val Val Asp
Val Ser
His
Glu
Asp 270
Pro
Glu Val I>ys
Phe
Asn Trp
Tyr Val Asp
Gly Val
Glu
Val
His 285
Asn
Ala Lys "hr Lys
Pro Arg
Glu Glu Glu
Tyr Ash
Ser
Thr
Tyr
Arg
Vpi val Ser
Val
Léu Thr
val Leu His
Gin ASp Trp Leu Asn
siy
Lys Glu Tyr
Lvs
Cys Lys
Val Ser Asn
Lys Ala
Leu
Pro
A1A 330
Pro
Xle Glu Lys
Thr
Ile Sei
tys Ala Lys
Gly Gin
Pro
Arg Glu
335 340 345
342319
Pro Gin val
Tyr
Xhr
Leu
yro
Prp
Ser Arg
Glu Glu
Met
Thr
Lys
Asii Sin
Val
Ser
Len
Thr
Cys
Lee
Val
Lys
370:
Giy phe
Tyr
Pro
Ser
Asp Ile
Aia
Val
Glu
Trp
Gla
S®r
Ash
Giy
3S5
Glii Pro
Gl»
Asn
Asn
Tyr Lys
Thr
Thr
Pro
Pro
val
Leu
Asp
Ser
Asp Gly
S;er
Phe
Ph®
Lw Tyr
Ser Lys
LSU:
Thr
v®l
Asp
Lys
Ser
Arg Trp
:Gisi
Gin
Gly
Asn Val
Ph®
Ser
Cys
Ser
Val
M®t
His
Gle
Ala Leu
His
Asn
His
Tyf Thr
Gift Lys
Ser
Leu
Ser
Leu
Ser
Pro
Gly Lys
<210 31
<211> 214
<212> PST
<213> Artifici^i seguence
<220
<223> seguence is synthesized
<4GO 31
Asp Ile Glh
Met Thr Gin Ser Pro Ser
Ser Leu Ser Ala Ser
Val
Gly Asp Arg
Val Thr Ile Thr Cys Arg
Ala Ser Glu Ser Val
Asp
Thr Tyr Len
His Trp Tyr Gin Gin Lys
Pro Gly Lys Ala Pro
Lys
Leu Lee ile
Lys Tyr Ala Ser Gin Ser 50
Tie Ser Gly Val prp
55.
Ser
Arg Phe Ser
Gly Ser Gly Ser Gly Thr 65
Asp Phé Thr Leu Thr 70
Ile 75
Ser Ser Leii
Gin Pro Glo Asp Phe Ala 80
Thr Tyr Tyr Gys Gin 85
Gin 90
Gly Asn Ser
Leu Pro ASn Thr Ph® Gly 95
Gin Gly Thr Lys Val 100
Glu
Ile Lys Arg
Thr Val Ala Ala Pro Ser " 110 '
val Phe Ile Phe Pro
115 .
Pro
Ser Asp Glu
Gin Leu Lya Ser Gly Thr 125
Ala Ser Val Val Cys
130 .
Léu 135
Lau Asn Asn
Ffce lyr Pro Arg Glu Ala 140
Lys Val Gin Trp Lys 145
Val
ISO
Asp Asn Ala
L®u Gin Ser Gly Asn Ser
Gin Glu Ser Val Thr 160
Glu
342319
Gin
I»eu
vai
Arg
Asp Ser Lys Asp Ser ' 170
Ser Lys Ala Asp Tyr iss
Thr His Gin Gly Leu
Giy Giv Cys
Thr Tyr Sér Les Ser Ser Thr Leu
Thr 180
GlU 195
Asn 210
Glu
Ser
Lys His
Lys Val
Tyr
Lys
Ala Cys
Ser
Pro
Val
Thr
Ser
Phe
£5
<210> 32
<211> 447
<212> PRT
<213> Art i f ici. al seguance
<220>
<223> sBiquena®! is synthésized
<4<30> 32
Gin
i
Val Gin Lev Val Gin
Sgr
Gly
Gly
Giy Leu
Val
Gin
.'■pr®.
Gly
25’
.■Gly
Ser lev Arg Len Ser . 20 ' "
Cys
■Ala
Ala
Ser
Gly
Ph®
phe
ile
Thr
"30
A A (1
Asn Tyr Trp Gly Trp
Val
Arg
Gin
: :Ala..
Pro Gly
Lys
Giy
I>nu.
Glu
Trp Val.. Gly Tyr' Ile
'' ' 50
Ser
Tyr
Ser
Giy
Ser
Thr
Ser Tyr
Asn
Pro
Ser Lev Lys Ser Arg
Ph®
Thr
Ile
Ser
Arg Asp Thr
Ser
Lys
Asxj
Thr Plxe Tyr Lev Gin
Het
Asn
Ser
Lee
Arg
Ala
Glg
Asp
Thr
Ala
Val Tyr Tyr Cys Ala Mei
Thr
Gly
Ser
1Q0
Ser
Sly
Tyr
Ph<
Asp
Phe
Trp Giy Gin Gly Thr
Lee
Val
Thr
Val
Ser
S®r
Ala
Ser
Thr
ICO
Xys
Gly Pro Ser Val Phe
Pro
Lev
Ala
■Prp'
Sér
Ser
Lys
Ser
Thr
•4$.
Ser
Gly Gly Thr Ala Ala
Leu
Gly
Cys
Leu
Val
Lys
Asp
Tyr
Phe
ISO
2ro
Glu Prp Val Thr Val
Ser
Trp Asn
Ser
Gly
Ala
Leé
Thr
Ser
■,sd
Gly:
Val His Thr Phe Pra
Ala
Val
■Lev
Gin
Ser
Ser
Giy
Lau
Tyr
ISO
Ser
Leu ser Ser Val Val
Thr
Pro
ber
Ser
Ser
Leu
Gly
Thr
19S
Gin
Thr Tyr Ile Cys Asn
val
His.
Lys
Pro
Ser
Asn
Thr
Lys
342319
Val Asp
Cys Pro
Lys
Pro
Lys
Gys
Val Gl© Pro Lys 215
Ser Cy<
Asp Lys Thr Bis
Thr
Val 240
LSu
Lev
Pré Ala 230
Pro Gle
Gly
Gly Pro Ser
Phe Lea
Ph©
Pro
Pro
Lys
Pro
Lys
Asp
Thr
Leu
Meh
ile
Ser
Arg
Thr Pro
Glu
Val
Thr 2S0
Cys
Val
Val
Val
Asp Val 265
Ser
His
Glu
Asp 270
Pro Glut
Val
Lys
Phe 275
Asn
Trp
Tyr
Val
Asp
Gly
Val
Gla
Val
Hrs 285
Asn Ala Lys
Thr
Lys
Pro- Arq
Glu
Giv
Gin 235
Tyr
Aan
Ser
Thr
■■Tyr' 300
Arg Val
Val
Ser
val
Lev
Thr
val
Leu
His 310
Gin
Asp
Trp
isu
Asn 315
Gly Lys
Gin
Tyr
Lys 320
Cys Lys
Val
Ser
Asn
Lys
ÅXs
leu
Pro
Ala
Pro. Ile:':
Glu Lys
Thr 335
I1©
Ser
lys
Ala
Lys
Gly
Gin
Pro Arg Giv
pro Gin
val
Tyr'
Thr 350
Lev
Pro
Prp
Ser Arg Giv 355
Giv
Mét
Thr Lys
Asn Gin
Val
Ser
Lev
Thr
Cys
Léu
Val
Lys Gly Phé 370
Tyr
Pro
Ser 375
Asp Ile
Ala
Val
du
Trp
Glu
Ser
Asn
Gly 385
Gin
Pro
Glu
Asn
Asn
Tyr Lys
Thr
Thr
Pro
.Prp
Val
Le ti
Asp
Ser
Åsp Gly
Ser
Phe
Ph©
Leu Tyr
Ser
Lys
Leu 410
Thr
Val
Asp
Lys
Ser 415
Arg
Trp.
Gin
Gin
Gly 420
Asn Val
Ph©
Ser
Cys 425
Ser
Val
Met
His
Gly
Ala
Len
His
Asn
His
Tyr Thr
Gin
Lys
Ser
Lev
■Ser
Lee
Ser
Pro
Gly Lys
s
440 445
<210> 33
<211> 214
<212> PRT
<213> Artific.tal seguence
<22 0>
<223> sequence is synthasised
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gin Ser Pro ser Ser I>eu Ser Ala Ser Val
i 5 1& 15
Gly Asp Arg Val Thr ile Thr Cys Arg Ala Ser Giv Ser Val Asp
20 25 30
342319
Asp
.Léu"
ieu
His
Trp
Tyr
Gin Gin Lys
Pro Gly
Lys Ala
Pro Lys
Lee
Leu
Ile
I*y?
Tyr
Ser Gin
Ser
Ile
Ser
Gly Val
Pro
Ser
Arg
Fhe
Sør
Gly
Ser
§5
Gly
Ser Gly
Thr
Asp
Phe
Thr
Leu
Thr
Ile
Ser
Ser
iea
Gin
Pro
Glu
Asp Phe
Ala
Thr 85
Tyr
Tyr
Cys
Gin Gin
Gly
Asn
Ser
Pro
Asn
Thr Phe
Gly
Gin
Gly
Thr
ly 5
Val
Glu 105
JS:'
Ile
Ays
Arg
Thr
■Val nø
AI. cl
Ala Pro
Ser
Val 115
Phe
Ile
Phe
Pro
Pro 120
Ser
Asp
Glu
Gin
Leu Ays 125 '
Ser Gly
Thr
Ala
Ser
Val
Val
Cys
Leu 135
L©ts
Asn
Asn
Phe
Tyr 140
Pre
Årg Glu
Ål»
Lys 145
Val
Gin Trp
Lys
Val
ÅSp Asn
Ala
Leu
Gin 135
Ser
Gly Asn
■■Ser
Gin 160
Glu
Ser
Val
Thr
Gle 165
Gin Asp
Ser Lys Asp
Ser
Thr Tyr
Ser
Leu 175
Ser
Ser
Thr
XiÉiU
Thr
ISO
s?
xeu
Ser.
Lys Ala Asp
Tyr
Glu Lys
Kis
Lys 158
Val
Tyr
Åla Cys
Glu 195
Val
The
His
gIh
Gly 200
liGii
Ser Ser
.Pro
Val 205
Thr
tys
Ser
Phe
Asn
Arg
Gly
Glu
Cys
3S
<21Q> 34
<21L> 23
<212> PRT
40 <213> Artificial secjuence
<22(}>
<223 ■■ sequénce is syntliesized
<400> 34
,j£j ' ' ' . . . . . . .
Asp Ile Gin ftet Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 ' ' ' '.15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
' 20
<21G>
<211>
<212>
<213>
14 PKT Artificial
sequence
<22 0>
<223>
seguenqe is
s synthesized
342319
<400* 35
Trp Tys? Gin Gin Lys ®xo Gly I>ys
' ' 5
Ala Pro Lys Løn L®u ile
<210> 35
<2xl> 32
<212> PRT
■^213> Artificial sequence
<220>
<223> séquéncé is syhthesiæéd
<400 36
Gly Val Pro Sfer ArgPhe Ser Gly
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
■1: 5 '
Thr Leu Thi Ilé Ser Seir Leu Glri
10 15
Pro Glu Asp Phe Ala Thr "yr
35.
□x/;
Tyr Cys
<210> 37
<211> 11
<212-> PR1
<213> Zirtificial sequenae
<220>
<223> ^eqvtence is synfth.eKiæed
<400> 37
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu " " 5 " " ' ' '
<210> 38
<211> 25
<212> PRT
<213> Artxficxal sequence
<220>
<223> sequence is synthssiped
<400> 38
GLu Val Gla Lea Val Glu Ser Gly
25 30
Ile Lys Arg
Gly Gly leu Vdl Glis Pro Gly
.1:-. ?5 .
Gly Sør Leu Arg Leu Ser CyS Ala 20
<210 39
<210 13
<212> PST
<213> Artificial séqdencé
<22 0>
<223> ségdenee is synthésizéd
<400> 33
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys " 5'
10 15
Ala Ser
2$
Gly Leu Glu Trp Val
4o
<211> 31
<212> PRT 342319
^213?" &fti£iaial sesjUene®
<■22^
•TQ
W:
<223> sequance is synthesiKed
<400> 40
Arg Ph® Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Lev.
1 5 10 15
Gin Ket As»- Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala <
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220 >
<223> sequer.ce is synthesiaed
■:<4'00>- 41:
Trp Gly Gin Gly Thr Leu val Thr Val Ser Ser . 5 ' 10
<210> 42
<211> 31
<212> PRT
<213» ArtificsiM saguerics
■35
<220
<223> sequence is synthéslzed
<400* 42
Arg Phe Thr Ile Ser 5£aa Asp Xaa Ser Lys Asn Thr Xaa Tyr Len
1 5 10 15
Gin biet Asn Ser Len Arg Ala Giv Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
.' ' ' ' 20 ' ' ".' 25. ' 3Q
Ala
<210 43
<211> 31
§5
<212» PRT
<213> Artificial sé$uencé
<220>
<223> sequence ±s synthesized
<400» 43
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Xsn Thr Ala Tyr Leu 1 S . 10 15
Gin Mat Asn Ser Leu Arg Ala Giv Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys . 20 25 . 30
Ala
342319
<210> 44
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial .«e^asncse
<223> sequenae is synthesi^ed
<400> 44
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ase Thr Ala Tyr Leu
•'f£
1 § 18 15
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys . 20 25 30
.7 V
S6
2S
<210> 45
<211> 31
^212> PRT
<213> Artificial seguence
<220>
<223> aéquencé is synthesized
<408> 45
Arg Fhe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ash Thr >hé Tyr Leu
1 5 10 15
Gin Met Asn Ser Lsu Arg Ala Glu Asp Thr A.la Val Tyr Tyr Cys
3Q
4®
20 . 25 30
Ala
<210> 46
<21l> 31
<212> PRT
<213> Artificial seguence
<220>
<223> sequersce is synthesised
<400> 46
Arg Phé Thr Ilé Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
4S;.
1 5 10 15
Gin Mat Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
Ala
<216> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial seguance
<220^
^223> saqaence is synthesized
342319
<400> 47
Ala Sa» Glu Ser
Val Asp Asp Aeu Leii His
5. 10
<210 48
<211> 87
<212> PRT
<213> Artificial
sequence
7Q: ■
<220
<223> sequer.ce ia syathesired
<4p0> 48
Gin val Gin Lau
Gin Glu Ser Gly Prp Glj
5 IV
Len Val
Lys
Pro
Ser
£5
Gin Thr Leu Ser
Aéu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly
20 25
Ser
val
Ser
2{)
Trp Ile Arg Gin
Pro Pro Gly Lys Gly Len
35 40
Glu
Trp
Ile Gly Arg
"45
Val Thr Ilé Sér
Val Asp Thr Ser Lys Aen
50 55
Gin
Phe
Ser
Leu
Lys
Leu Ser Ser Val
Thr Ala Ala Asp Thr Ala "55". 70
Val
lyr
Tyr
Cys
Ala
Arg Trp Gly Gin
Gly Thr Len Val Thr Val
80 85
Ser
Ser
<210 49
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial
seqvéncé
<220>
<223> seejuence is synth.esized
<4G0> 43
Gin Val Gin Leu
Gin Giv Ser Gly Prb Gly
5 1[}
Len
Val
Lys
Prp
Ser
^0
Gin Thr Leu Ser
leu Thr Cys Thr Val Ser Trp
20 25
Ile Arg
Gin
Pre
&ro Gly Lys Gly
Len Giv Trp ile Arg Val
35 40
Thr
Ile’
Ser
Val
Asp
45'
Thr S®r lys Asn
Gin Phe Ser Len Lys Leu
50 . 55
Ser
Ser
val
TKr
Ala
Ala Asp Thr Ala
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly
65 70
Gin Gly
Thr
Aen val Thr Val
Ser Ser
<210 50
<211> 80
<212> PRT
<213> Artificial
342319
<220>
<223> sequéncé is syiitlsafiisød
<■■50 0> 50
Gle Val
■1
Gin te®
Girt Ser
Gly Pro
Gly Leu Val Lys Pro Ser
IQ
Gin Thr
Leu Ser
leu
•2G:
Thr Cys
Thr Val
Ser Trp Tie Arg
Gin Pro
.30
&ro Gly
I>ys Gly
Leu
Glu Trp
Ile Arg
Val Thr Xle Ser 40
Val Asp
Thr Set...
Lys ASn
Gin
Phe Ser
Leu Lyé
Leu Sei Ser val 55
TM Aid
Ala. Asp
The Ala
Val
Tyr' Tyr.
Cys Ala
Trp Gly Gin Gly
70 '
Thr Leu
Val Thr Val Sér Ser
<210> 51
<211>
<212>
<213>
PRT
Artifiolal seguefece
<220>
<22 3>
sequanoe is syntbesixed
<400>
Gin Val Gin Len
Gin
S
Glu
Ser
Gly
Prp
Gly
Leu
Val
T.ys
Prp:
Ser
Gin Thr L®u Ser
Leu
■Thr
Cys
Thr
Val
Ser
Prp
ile
Arg
Gin
Prp
Pro Gly Lys Gly
Leu
Glu
Trp
Ile
Arg
Val
Thr
Ile
Ser
Val
Asp
Thr Ser Lys Asa Gin
Phe
Ser
Leu
LyB
Len
5:S
Ser
Ser
val
Thr
Ala
Ala Asp Thr Ala
Val
Tyr Tyr
Cys
Trp
Gly
Girt
Gly
Thr
Len
Val
Thr Val Ser Ser
<210> 52
<2.1 i> 87
<212> PRT
<213> Arriflcial sequencs
«22 0>.
<223> éequenqé is sypthesiied
<400> 52
Glu Val Girt Leu Val Giv Ser -Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
1 5 10 15
Gly•'■'Ser Lee &c$ ieu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Bhe S®r
20 25 30
342319
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Len Glw ?rp val Ser Arg
25 ' 35 40 45
Phe Thr ilé Ser Arg Åsp Asii Ser Lys Asn Thr len Lyr Leu Gin
5 g0 ' g5
Het Asn ser Len Arg Ala Glu Asp ihr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 yg 75
Arg Trp Gly Gin Gly Tfer Leu Val Thr Val Ser Ser
w 80 85
<210> 53
<21L> 81
<212> PRT
<213> ArtiSicial segtience
<220>
<223* sequence is synthesized
<400> 53
æ ■
'251
Glu '1
Gly
'.5x:Q'
Val Gin
Sex Leu
Len Val
Gl» Ser Gly Gly
Ser Cys Ala Ala
Glu Trp Val Arg
Gly
Ser
Bhe
l&a Val
Gin Pro Gly
Arg Gin Ala
Ser Arg Asp
45:
Trg
Thr
Val
Ile
Arg
Gly
Len
Leu
35:
Gly
Lys
Asn
Ser
Lys
Asn
Thr
Leu Tyr Lea Gla
Met
Asn
Ser
Leu Asig Ala 50
Glu
Ley
Asp
Val
Tftr
Thr
Ala
Val
Val
■Ser
Tyr Tyr Cys Ala
Ser
Arg
Trp
SXy
Gin Gly Thr
8(3
<210 54
<211> 80
<212> PRT
<213> Artificial seguénaé
<220>
<223> sécfuegcé is synthesised
<400 54
■.®'
Glu
Val Gin
Leu
Val
e: •j
Glu
Ser
Gly
Gly Gly Leu 10 "
i&i
Gin
Pro Gly
<Uy
Ser Leu Arg
Leu
Ser
Cys
Ala
Ala
Ser Trp 25 '
vai
Arg
Gin Ala
.30
®xo
Gly Lys
Giy
Leu
Glu
Trp
val
Arg
Phe Thr
4 <3
Ile
Ser
Arg Asp
Asn
Ser Lys
Asn
Thr
Leu Tyr
Léu
Gin
Mat Asn
sex
Leu
Arg Ala
Glu Asp Thr
Ala
Val
Tyr
Tyr Cys
Ala
Trp Gly
Gin Gly
Thr Leu
S5 70 75
342319
Val Thr Val Ser Ser
SO
<2 lt» <211* <212> <213>
PRT
Artificxal se<j«ence
<220>
<223> sequence is synthesizad
-400> 55
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
1 5 1Q .is
Gly Ser Leu Arg Leu SSr Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala ' 20 25 30
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 35 40 45
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 _5
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gin Gly Thr Leti Val
. 65 70 .75
Thr Val Ser Ser
<210> 56
»■
4JJ
<211> 87
<212> FRT
<213> Artificial seqpenae
<220>
<223> sequende is synthesiKeé
<400^- 56
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Lev. Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Xle Lys
. 20 25 30
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Len Glu Trp Val Ser Arg
35 40 45
Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin.
50 55 60
Met. Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
65 . 70 . 75
Arg Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
80 85
<210> 57
<211> Sl
<212> FRT
<213> Årtificial sequence
342319
k220>
<,223> s&qu«nce is synthssiaed
<400> 57
G1U
Val Gin leu Val
S
Glu Ser Gly
Gly
Gly Le» lø
Val Gin Pro Gly
Gly
Ser Leu Aig Xéu
Ser Cys Ala
Ala
Ser Trp
Val Arg Gin Ala
Pio
Gly Lys Gly Leu
Gin Trp Val
Arg
Phe Thr
Ile Ser Ala Asp
Thr
Ser Lys Asn Thr
Ala Tyr Leu
Gin
Met Asn
5S
Ser Len Årg Ala
Giu
Leu
Asp Thr Åla Val .65
Val Thr Val Ser
Tyr Tyr Cys
Ser
Ser Arg Trp
Gly Gin Gly Thr
"" ' ' "" "■8:b
<210 58
<211> 80
<212> PRT
<213> Artifxaxal seguence
<22 0>
<223? sequence is synthesised
<400> 58
Gin
I
Val
Gin
Leu Val
Glu Ser
Gly Gly Gly Leu Val ' 10 '
Gin Prp Gly
.15
Gly
Ser
Leu:
Arg Leu
Ser Cys
Ala Ala Ser Trp val ' ' ' 25 '
Arg Gin Ala
Pro
Gly LyS
Gly Len " 35
Glis Trp
Val Arg Ph® Thr Ile ' 40
Ser Ala Asp
:Thr
Ser
Lys
AS» Thr
Ala Tyr
Leu Gin Mat Asn Ser
Leu Arg Ala 60
Gitt Asp
Thr
Ala Val
Tyt ■ Tyr
Cys Ser Trp Gly Gin 70
Gly Thr Leu
Val Thr Val Ser Ser 80
<210 58
<211> 87
<212> PRT
■<213> Artificial sequenée
<220
<223> séqsiencé is synthasizéd
<400> 59
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly
Gly Gly Leu Val
Gin Pro Gly
Gly
Sér Seu Arg Leu Ser Cys Ala
Ala Ser Gly Plie "" 25 '
Asn Ile Lys
342319
Trp val Arg Gin *la
.35
Pr© Gly Lys Gly Leu . 40
Glu Trp
Val Ser Arg
Phe Thr Ila Ser Al»
Asp Thr Ser Lys Asn
' sS':
Thr Ala
Tyr Lau Gin
:?a
Met Asrt Ser Leu Årg Ala Glu Asp Thr Ala 55 70
Arg Trp Gly Gin Gly Tbr Xæu Val Thr val 80 85
<210> 60
<211> 81
<212> PRT
<213> Axtificial saguence
<'220->
<223> segnende is synthSslzed
<40p> 60
Val Tyr
Ser Ser
Tyr cys Ala
Glu val Gin Leu Val
1 '5
Glu Ser Gly Gly Gly .10
Leu yal
Gin Pro Gly
Gly Ser Leu Arg Leu
Ser Gys Ala Ala Ser
" .25
Trp Val
Arg Gin Ala
Pro Gly lys Gly leu
Glu Trp Val Arg Phe
thr Ile
Ser Ala Asp
Thr Ser Lyg Asn Thr
Ala Tyr Leu Gin Met
Ash Sér
Leu Arg Aid
Glu Asp Thr Åla Val Tyr Tyr Cys Åla Arg
65 70
leu Val Thr Val Ser Ser
<210> 61
<211> 80
<212> PRT
<213> Artifipial seguenoe
<220>
<223> seguenoe rs synthééired
<400> 61
Trp Gly
Glh Gly Thr
<5
Glu val Gin Leu Val
1 5
Glu Ses Gly Gly Gly
Leu Val
Glh Pro Gly
Gly Ser ieu Årg leu
Ser Cys Ala Åla Ser . 25
Trp val
Arg Gin Ala
Pro Gly lys Gly Xeu
Glu Trp Val Arg Phe
Thr: He
Ser Ala Asp:
Thr ser Lys Ash Thr
Ala Tyr Leu Giii Mét
Asa Sér
Léu Arg Ala
Glu Asp Thr Ala Val
Tyr Tyr Cys Ala trp
Gly Gin Gly Thr Leu
342319
Val Hir Val Ser S®r
■5'
<210> 62
<211> 79
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> se<juencé is synthesized
<400> 62
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly
1 . 5 ' ■■■■■■ ,0 ■ 15
»■
Gly Ser Lea Arg Len Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala . 20 ' ' 23 " ....
Pro Gly Lys Gly Len Glu Trp Val Ang Phé Thr Ile Ser Ala Asj>
35 40 45
Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Len Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala
50 55 g0
Glu Asp Thr Ala val Tyr ryr cys Trp Gly Gin Gly Thr Leu val
65 70 75
as
Thr Val Ser Ser
<210> 53
<2U> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<22 0>
<223> sequence is synthesized
<400> 63
Ala Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Fhe Psn ^he
5 10
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> Artifiqial sequence
<220>
<223> sequence is syiithesized
<400v 64
Ala Arg Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe
5 io
w 4* v
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
55/
<213> Artificial seguenee
<220>
<223> seqyence is synthesired
<400> 65 342319
Må Gin Thx- Gly Ser Ser Gly Tyr Fhe As» »h<e
5 10
t£>
jS
<210> 66
<211> 10
<212> FRT
<213> Artifieial sequence
<22 0>
<223> sequence is synthesiaed
<40p> 66
Arg Thr Gly S»r Ser Gly Tyr Phe Asp Phe
5. 10
<210> 67
<211> 8
<212> PRT
<213> Artxficial sequence
<220*
<223> seguerice is sy»thesir<ad
<400> 67
Arg Tyr Ala Ser Gin Ser Ile Ser . ,5:' ' '
<210> 68
<211> 8
3?
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<22Q>
<223> sequériée is synthesizad
Xaa Tyr Ala Ser Gin Ser Ile Ser
4S
NO20171288A 2004-09-03 2017-08-02 Anti-beta7-antistoffer, nukleinsyrer som koder for antistoffene, vektorer, vertsceller og fremgangsmåte for fremstilling av antistoffene. NO342319B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US60737704P 2004-09-03 2004-09-03
PCT/US2005/031401 WO2006026759A2 (en) 2004-09-03 2005-09-02 Humanized anti-beta7 antagonists and uses therefor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20171288A1 NO20171288A1 (no) 2007-06-01
NO342319B1 true NO342319B1 (no) 2018-05-07

Family

ID=36000753

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20071740A NO341308B1 (no) 2004-09-03 2007-04-02 Humaniserte anti-beta7-antagonister og anvendelser av disse i terapeutisk og/eller profylaktisk behandling av sykdom, samt til fremstilling av et medikament, og en sammensetning.
NO20171288A NO342319B1 (no) 2004-09-03 2017-08-02 Anti-beta7-antistoffer, nukleinsyrer som koder for antistoffene, vektorer, vertsceller og fremgangsmåte for fremstilling av antistoffene.
NO20171287A NO342491B1 (no) 2004-09-03 2017-08-02 Humaniserte anti-beta7-antagonister og anvendelser av disse

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20071740A NO341308B1 (no) 2004-09-03 2007-04-02 Humaniserte anti-beta7-antagonister og anvendelser av disse i terapeutisk og/eller profylaktisk behandling av sykdom, samt til fremstilling av et medikament, og en sammensetning.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20171287A NO342491B1 (no) 2004-09-03 2017-08-02 Humaniserte anti-beta7-antagonister og anvendelser av disse

Country Status (27)

Country Link
US (10) US7528236B2 (no)
EP (4) EP2990422B1 (no)
JP (2) JP5062887B2 (no)
KR (2) KR101364276B1 (no)
CN (3) CN104710532B (no)
AT (1) ATE534668T1 (no)
AU (1) AU2005279720B2 (no)
BR (1) BRPI0515602B1 (no)
CA (1) CA2577678C (no)
CY (2) CY1112277T1 (no)
DK (4) DK2990422T3 (no)
ES (4) ES2377979T3 (no)
HK (5) HK1112002A1 (no)
HR (3) HRP20120171T1 (no)
HU (3) HUE039591T2 (no)
IL (3) IL181473A (no)
LT (2) LT2990422T (no)
MX (3) MX2007002675A (no)
NO (3) NO341308B1 (no)
NZ (2) NZ553328A (no)
PL (4) PL2990422T3 (no)
PT (3) PT2990422T (no)
RS (3) RS52213B (no)
RU (1) RU2453558C2 (no)
SI (4) SI1784426T1 (no)
WO (1) WO2006026759A2 (no)
ZA (1) ZA200701575B (no)

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003287099A1 (en) * 2002-11-08 2004-06-03 Kin-Ping Wong Extract of trapa natans and methods of using the same
CA2478458A1 (en) * 2004-08-20 2006-02-20 Michael Panzara Treatment of pediatric multiple sclerosis
CN104710532B (zh) 2004-09-03 2019-01-18 健泰科生物技术公司 人源化的抗-β7拮抗剂及其应用
CA2587597A1 (en) * 2004-11-19 2006-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Treatment for multiple sclerosis
US10982250B2 (en) * 2006-09-18 2021-04-20 Genentech, Inc. Methods of protein production
EP2109480B1 (en) 2006-12-07 2017-06-28 The Government of the United States of America as Represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Use of antagonists of the interaction between hiv gp120 and alpha4beta7 integrin
US7875431B2 (en) 2007-02-22 2011-01-25 Genentech, Inc. Methods for detecting inflammatory bowel disease
CN101687037B (zh) * 2007-05-08 2013-07-10 健泰科生物技术公司 半胱氨酸改造的抗muc16抗体和抗体药物偶联物
PL2243829T3 (pl) 2008-01-11 2015-04-30 Astellas Pharma Inc Polepszone humanizowane przeciwciało anty-ludzka integryna alfa9,
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
BRPI0910482A2 (pt) * 2008-04-29 2019-09-24 Abbott Lab imunoglobinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
KR101361905B1 (ko) * 2008-05-16 2014-02-21 제넨테크, 인크. 베타7 인테그린 길항제를 이용한 위장관 염증 장애의 치료를 평가하기 위한 바이오마커의 용도
BRPI0913406A2 (pt) * 2008-06-03 2018-01-09 Abbott Lab imunoglobulinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
EP2297208A4 (en) * 2008-06-03 2012-07-11 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
WO2010006060A2 (en) * 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
AU2010236257A1 (en) * 2009-04-17 2011-11-03 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods to treat acute myelogenous leukemia
US8399625B1 (en) * 2009-06-25 2013-03-19 ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit, LLC Acceptor framework for CDR grafting
TW201109438A (en) * 2009-07-29 2011-03-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN102612524A (zh) * 2009-09-01 2012-07-25 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
CN102666875A (zh) * 2009-10-15 2012-09-12 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
EP2494354A1 (en) * 2009-10-30 2012-09-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Pcsk9 immunoassay
KR20180028561A (ko) * 2010-02-23 2018-03-16 제넨테크, 인크. 난소암의 치료를 위한 항혈관신생 요법
CA2796205A1 (en) * 2010-04-15 2011-10-20 Vegenics Pty Limited Combination treatment with vegf-c antagonists
EP3466977B1 (en) 2010-04-16 2022-01-05 Biogen MA Inc. Anti-vla-4 antibodies
CA2807014A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2013113225A (ru) 2010-08-26 2014-10-10 Эббви Инк. Иммуноглобулины с двумя вариабельными доменами и их применение
SG191712A1 (en) * 2010-11-02 2013-08-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP6248029B2 (ja) * 2011-03-31 2017-12-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド ベータ７インテグリンアンタゴニストの投与方法
UA116189C2 (uk) 2011-05-02 2018-02-26 Мілленніум Фармасьютікалз, Інк. КОМПОЗИЦІЯ АНТИ-α4β7 АНТИТІЛА
WO2012151247A2 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. FORMULATION FOR ANTI-α4β7 ANTIBODY
UY34558A (es) 2011-12-30 2013-07-31 Abbvie Inc Proteínas de unión específicas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17
WO2013126595A1 (en) * 2012-02-21 2013-08-29 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods for treating corneal and conjunctival inflammation and inflammatory disorders
JP6563197B2 (ja) 2012-03-13 2019-08-21 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 卵巣癌の治療のための併用療法
CN113234142B (zh) 2012-08-22 2024-03-05 财团法人牧岩生命工学研究所 超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用
EP2903691B1 (en) 2012-10-05 2019-05-22 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods for diagnosing and treating inflammatory bowel disease
UY35110A (es) 2012-11-01 2014-05-30 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual anti-vegf/dll4 y usos de las mismas
CA2904448A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Tariq Ghayur Dual specific binding proteins directed against il-1.beta. and/or il-17
EP3495814A3 (en) 2013-03-27 2019-07-17 F. Hoffmann-La Roche AG Use of biomarkers for assessing treatment of gastrointestinal inflammatory disorders with beta7 integrin antagonists
AR099856A1 (es) 2014-03-27 2016-08-24 Genentech Inc Métodos para diagnosticar y tratar la enfermedad de intestino inflamado
EP3581585A1 (en) 2014-11-26 2019-12-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Vedolizumab for the treatment of fistulizing crohn's disease
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
MX2017010336A (es) 2015-02-26 2017-12-20 Genentech Inc Antagonistas de integrina beta7 y métodos para el tratamiento de la enfermedad de crohn.
MA41636A (fr) 2015-03-06 2018-01-09 Millennium Pharm Inc Méthode de traitement de la cholangite sclérosante primitive
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
CN108139385A (zh) * 2015-07-27 2018-06-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于诊断和治疗炎症性肠病的方法
US20200002422A1 (en) 2016-03-14 2020-01-02 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method of preventing graft versus host disease
EP3430053A1 (en) 2016-03-14 2019-01-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating or preventing graft versus host disease
WO2017165778A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in immune oncology treatments
WO2017165742A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in anti-ctla4 anti-pd-1 combination treatments
BR112018074922B1 (pt) 2016-06-02 2022-10-25 Abbvie Inc Compostos agonistas de receptores de glucocorticoides, composição farmacêutica compreendendo ditos compostos e uso terapêutico dos mesmos
WO2017218434A1 (en) 2016-06-12 2017-12-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease
US20200179486A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method of treating pediatric disorders
EP3658192B1 (en) 2017-12-01 2021-04-28 AbbVie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
MA52249A (fr) 2018-04-12 2021-05-05 Morphic Therapeutic Inc Antagonistes de l'intégrine humaine (alpha4) (beta7)
JP7457661B2 (ja) 2018-06-04 2024-03-28 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド 低減したエフェクター機能を有する抗ｖｌａ－４抗体
US20220372132A1 (en) * 2019-01-10 2022-11-24 Sg Medical Inc. Anti-beta 1 integrin humanized antibody, and pharmaceutical composition for treating cancer, comprising same
MX2021015302A (es) * 2019-06-10 2022-01-18 Takeda Pharmaceuticals Co Metodos de purificacion de anticuerpos y composiciones de estos.
EP4045039A4 (en) 2019-10-16 2023-12-13 Morphic Therapeutic, Inc. INHIBITION OF HUMAN INTEGRIN ALPHA4BETA7
CA3190109A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 Genentech, Inc. Anti-integrin beta7 antibody formulations and devices
WO2023086910A1 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Genentech, Inc. Methods of treating crohn's disease using integrin beta7 antagonists

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996024673A1 (en) * 1995-02-10 1996-08-15 Leukosite, Inc. Mucosal vascular addressins and uses thereof
WO2000040604A2 (en) * 1999-01-08 2000-07-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING CYTOKINE RELEASE BY αEβ7-EXPRESSING CELLS
WO2005080432A2 (en) * 2004-02-19 2005-09-01 Genentech, Inc. Cdr-repaired antibodies

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
US4308428A (en) * 1979-12-26 1981-12-29 Cbs Inc. System for electronically simulating radiation effects produced by a rotary loudspeaker
US4331348A (en) * 1980-01-09 1982-05-25 Raidel John E Vehicle suspension
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
DE69233367T2 (de) 1991-04-10 2005-05-25 The Scripps Research Institute, La Jolla Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
EP0605522B1 (en) * 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
JP3720353B2 (ja) 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5610281A (en) 1994-05-03 1997-03-11 Brigham & Women's Hospital, Inc. Antibodies for modulating heterotypic E-cadherin interactions with human T lymphocytes
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US6551593B1 (en) 1995-02-10 2003-04-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Inflammatory bowel disease by inhibiting binding and/or signalling through α 4 β 7 and its ligands and madcam
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6027888A (en) 1996-04-05 2000-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide-bond containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US7147851B1 (en) * 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
US6037454A (en) * 1996-11-27 2000-03-14 Genentech, Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
ES2292236T3 (es) 1998-04-02 2008-03-01 Genentech, Inc. Variantes de anticuerpos y sus fragmentos.
DE69929712T2 (de) 1998-11-25 2006-10-19 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antagonisten des Alpha-E-Beta-7 Integrins als therapeutische Agenzien gegen Entzündungskrankheiten
US20010046496A1 (en) 2000-04-14 2001-11-29 Brettman Lee R. Method of administering an antibody
DE60308326T2 (de) * 2002-02-06 2007-04-19 Koninklijke Philips Electronics N.V. System für die persönliche pflege mit hygienevorrichtung und kühlvorrichtung
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
MY140862A (en) 2004-01-09 2010-01-29 Pfizer ANTIBODIES TO MAdCAM
CN104710532B (zh) 2004-09-03 2019-01-18 健泰科生物技术公司 人源化的抗-β7拮抗剂及其应用
US10982250B2 (en) 2006-09-18 2021-04-20 Genentech, Inc. Methods of protein production
JP2007302676A (ja) 2007-05-29 2007-11-22 Genentech Inc ヒト化抗β７アンタゴニストおよびその使用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996024673A1 (en) * 1995-02-10 1996-08-15 Leukosite, Inc. Mucosal vascular addressins and uses thereof
WO2000040604A2 (en) * 1999-01-08 2000-07-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING CYTOKINE RELEASE BY αEβ7-EXPRESSING CELLS
WO2005080432A2 (en) * 2004-02-19 2005-09-01 Genentech, Inc. Cdr-repaired antibodies

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HANES J. et al. Picomolar affinity antibodies from a fully synthetic naive library selected and evolved by ribosome display. Nat Biotechnol. 2000, vol. 18, no. 12, side 1287-1292. , Dated: 01.01.0001 *
LEE CV. et al. High-affinity human antibodies from phage-displayed synthetic Fab libraries with a single framework scaffold. J Mol Biol. 2004, vol. 340, no. 5, side 1073-1093. , Dated: 01.01.0001 *
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Human press inc, Totowa, USA, ED:BKC LO, ISBN 1-58829-092-1, release date December 2003, PART III: Antibody Expression and optimization, Chapters 18-21: Directed mutagenesis of antibody variable domains (p. 319), Antibody affinity maturation by Chain shuffling (p. 327), Antibody affinity maturation by random mutagenesis (p. 343), Developing a minimally immunogenic humanized antibody by SDR grafting (p. 361)., Dated: 01.01.0001 *
PICARELLA D. et al. Monoclonal antibodies specific for beta 7 integrin and mucosal addressin cell adhesion molecule-1 (MAdCAM-1) reduce inflammation in the colon of scid mice reconstituted with CD45RBhigh CD4+ T cells. J Immunol. 1997, vol. 158, no. 5, side 2099-2106. , Dated: 01.01.0001 *
RADER C. et al. A phage display approach for rapid antibody humanization: designed combinatorial V gene libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998, vol. 95, no. 15, side 8910-8915. , Dated: 01.01.0001 *
SUN X. et al. Beta7 integrins contribute to skin graft rejection. Transplantation. 2002, vol. 74, no. 8, side 1202-1203. , Dated: 01.01.0001 *
TIDSWELL M. et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. J Immunol. 1997, vol. 159, no. 3, side 1497-1505. , Dated: 01.01.0001 *
TORAN JL. et al. Improvement in affinity and HIV-1 neutralization by somatic mutation in the heavy chain first complementarity-determining region of antibodies triggered by HIV-1 infection. Eur J Immunol. 2001, vol. 31, no. 1, side 128-137 , Dated: 01.01.0001 *
WU H. et al. Stepwise in vitro affinity maturation of Vitaxin, an alphav beta3-specific humanized mAb. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998, vol. 95, no. 11, side 6037-6042. , Dated: 01.01.0001 *
YANG WP. et al. CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of a potent human anti-HIV-1 antibody into the picomolar range. J Mol Biol. 1995, vol. 254, no. 3, side 392-403. , Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
NO20071740L (no) 2007-06-01
US8835133B2 (en) 2014-09-16
CA2577678A1 (en) 2006-03-09
EP3530673B1 (en) 2022-03-30
JP2012107050A (ja) 2012-06-07
LT3530673T (lt) 2022-06-10
US20150197560A1 (en) 2015-07-16
KR20120115587A (ko) 2012-10-18
EP1784426B1 (en) 2011-11-23
HRP20181459T1 (hr) 2018-10-19
NO20171288A1 (no) 2007-06-01
IL181473A0 (en) 2007-07-04
NZ585628A (en) 2012-01-12
JP5062887B2 (ja) 2012-10-31
MX337423B (es) 2016-03-04
US20090226437A1 (en) 2009-09-10
DK1784426T3 (da) 2012-03-12
WO2006026759A9 (en) 2006-05-18
KR101433494B1 (ko) 2014-08-22
KR20070050986A (ko) 2007-05-16
BRPI0515602B1 (pt) 2021-08-17
CN101094868B (zh) 2013-07-10
HK1156955A1 (zh) 2012-06-22
WO2006026759A3 (en) 2006-10-05
PT1784426E (pt) 2012-03-06
HUE028441T2 (hu) 2016-12-28
PL2322556T3 (pl) 2016-04-29
BRPI0515602A (pt) 2008-07-29
HRP20120171T1 (hr) 2012-03-31
EP2990422B1 (en) 2018-07-11
NO342491B1 (no) 2018-06-04
CN101094868A (zh) 2007-12-26
KR101364276B1 (ko) 2014-02-20
WO2006026759A2 (en) 2006-03-09
CY1117124T1 (el) 2017-04-05
US20180291104A1 (en) 2018-10-11
US7687605B2 (en) 2010-03-30
LT2990422T (lt) 2018-10-10
PT2322556E (pt) 2016-02-15
RS54409B1 (en) 2016-04-28
IL181473A (en) 2013-07-31
US8124082B2 (en) 2012-02-28
CY1112277T1 (el) 2015-12-09
EP2322556B1 (en) 2015-10-21
PL3530673T3 (pl) 2022-08-01
HK1112002A1 (en) 2008-08-22
CN103304667A (zh) 2013-09-18
US7528236B2 (en) 2009-05-05
ES2690079T3 (es) 2018-11-19
PL1784426T3 (pl) 2012-04-30
CA2577678C (en) 2014-12-02
DK2990422T3 (en) 2018-09-17
NO341308B1 (no) 2017-10-02
US8779100B2 (en) 2014-07-15
IL244803B (en) 2018-02-28
RS52213B (en) 2012-10-31
RU2007112102A (ru) 2008-10-10
NO20171287A1 (no) 2007-06-01
US20060093601A1 (en) 2006-05-04
HUE058817T2 (hu) 2022-09-28
EP2322556A1 (en) 2011-05-18
AU2005279720B2 (en) 2011-07-28
HK1221473A1 (zh) 2017-06-02
DK2322556T3 (en) 2016-01-25
US20120208984A1 (en) 2012-08-16
JP5255135B2 (ja) 2013-08-07
RU2453558C2 (ru) 2012-06-20
IL226717A (en) 2016-04-21
EP2990422A1 (en) 2016-03-02
CN103304667B (zh) 2015-04-08
HK1188798A1 (en) 2014-05-16
PT2990422T (pt) 2018-10-18
US20080025971A1 (en) 2008-01-31
US20200048354A1 (en) 2020-02-13
DK3530673T3 (da) 2022-04-19
MX341370B (es) 2016-08-17
IL244803A0 (en) 2016-04-21
EP3530673A1 (en) 2019-08-28
ES2377979T3 (es) 2012-04-03
CN104710532A (zh) 2015-06-17
AU2005279720A1 (en) 2006-03-09
PL2990422T3 (pl) 2018-11-30
EP1784426A2 (en) 2007-05-16
SI1784426T1 (sl) 2012-03-30
US20170210807A1 (en) 2017-07-27
US20170044261A1 (en) 2017-02-16
HK1210977A1 (en) 2016-05-13
HRP20160034T1 (hr) 2016-02-12
SI3530673T1 (sl) 2022-08-31
ES2911482T3 (es) 2022-05-19
IL226717A0 (en) 2013-07-31
HUE039591T2 (hu) 2019-01-28
JP2008512382A (ja) 2008-04-24
RS57636B1 (sr) 2018-11-30
ATE534668T1 (de) 2011-12-15
US20130288302A1 (en) 2013-10-31
ZA200701575B (en) 2008-09-25
CN104710532B (zh) 2019-01-18
MX2007002675A (es) 2007-06-11
SI2322556T1 (sl) 2016-02-29
NZ553328A (en) 2010-06-25
ES2555355T3 (es) 2015-12-30
SI2990422T1 (sl) 2018-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO342319B1 (no) Anti-beta7-antistoffer, nukleinsyrer som koder for antistoffene, vektorer, vertsceller og fremgangsmåte for fremstilling av antistoffene.
WO2006015371A2 (en) Humanized anti-cmet antagonists
EP1976884A2 (en) Anti-ephrinb2 antiboies and methods using same
JP2007302676A (ja) ヒト化抗β７アンタゴニストおよびその使用
AU2012202209A1 (en) Humanized anti-cmet antagonists
AU2011244856A1 (en) Humanized anti-beta7 antagonists and uses therefor