KR20070050986A - 인간화 항-베타７ 길항제 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치료적 항-베타7 항체, 상기 항체를 포함하는 조성물 및 상기 항체의 사용 방법을 제공한다.
항-베타7 항체, 염증, 중쇄 및 경쇄 가변 서열

Description

인간화 항-베타７ 길항제 및 그의 용도 {HUMANIZED ANTI-BETA7 ANTAGONISTS AND USES THEREFOR}
본 출원은 2004년 9월 3일자로 출원된 미국 가출원 제60/607,377호 (그 전체 내용은 본원에 참고로 도입됨)에 대해 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권을 주장하는, 37 CFR § 1.53(b)(1) 하에 출원된 비-가출원이다.
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 성장 인자 조절 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 베타7 서브유닛을 함유하는 인테그린의 생물학적 활성의 조절, 및 상기 조절제의 용도에 관한 것이다.
인테그린은 세포 부착에서 유전자 조절까지의 수많은 세포 과정에 관여하는 α/β 이종이량체성 세포 표면 수용체이다 (문헌 [Hynes, R.O., Cell, 1992, 69:11-25]; 및 [Hemler, M.E., Annu. Rev. Immunol., 1990, 8:365-368]). 몇몇 인테그린은 질환 과정에 관련되며, 약물 개발을 위한 잠재적인 표적으로서 광범위한 관심을 생성해 왔다 (문헌 [Sharar, S.R. et al., Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16:359-378]). 면역계에서, 인테그린은 염증성 과정 동안 백혈구 운송(trafficking), 부착 및 침윤에 관여한다 (문헌 [Nakajima, H. et al., J. Exp. Med., 1994, 179:1145-1154]). 인테그린의 상이한 발현은 세포의 부착 특성을 조절하며, 상이한 인테그린은 상이한 염증성 반응에 관여한다 (문헌 [Butcher, E.C. et al., Science, 1996, 272:60-66]). 베타7 인테그린 (즉, 알파4베타7 (α4β7) 및 알파E베타7 (αEβ7))은 단핵구, 림프구, 호산구, 호염기구 및 대식세포 상에서 주로 발현되지만, 중성구 상에서는 발현되지 않는다 (문헌 [Elices, M.J. et al., Cell, 1990, 60:577-584]). α4β7 인테그린에 대한 일차 리간드는 내피 표면 단백질 점막 어드레신 세포 부착 분자 (MAdCAM) 및 혈관 세포 부착 분자 (VCAM-1)이다 (문헌 [Makarem, R. et al., J. Biol. Chem., 1994, 269:4005-4011]). 염증 부위에서 높은 내피 정맥 (HEV) 상에 발현된 MAdCAM 및/또는 VCAM에의 α4β7의 결합은, 내피에의 백혈구의 부착의 고정에 이어지는, 염증화된 조직 내로의 분출을 초래한다 (문헌 [Chuluyan, H.E. et al., Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16:391-404]). αEβ7 인테그린에 대한 일차 리간드는 αEβ7-함유 세포의 상피 림프구에의 부착을 용이하게 하는 상피내 림프구 (IEL) 표면 단백질인 E-카드헤린이다. α4β7, MAdCAM 또는 VCAM에 대해 지정된 모노클로날 항체는 천식 (문헌 [Laberge, S. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1995, 151:822-829]), 류마티스성 관절염 (RA; 문헌 [Barbadillo, C. et al., Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16:375-379]), 결장염 (문헌 [Viney et al, J. Immunol., 1996, 157: 2488-2497]) 및 염증성 장 질환 (IBD; 문헌 [Podalski, D.K., N. Eng. J. Med., 1991, 325:928-937]; [Powrie, F. et al., Ther. Immunol., 1995, 2:115-123])과 같은 만성 염증성 질환의 동물 모델에서 효과적인 조절제인 것으로 나타났 다. 베타7 서브유닛에 대해 지정된 모노클로날 항체는 인테그린 서브유닛에 결합하는 것으로 나타났지만 (문헌 [Tidswell, M. et al. (1997) J. Immunol. 159:1497-1505]), 비-인간 또는 비-인간화 항체로서 이들은 임상적 유용성은 없다.
알파4베타7 인테그린과 그의 리간드 MAdCAM 및/또는 VCAM 사이의 상호작용, 뿐만 아니라 알파E베타7 인테그린과 그의 리간드 E-카드헤린 사이의 상호작용을 억제하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편과 같은 고도로 특이적인 화합물에 대한 필요가 존재한다. 상기 화합물은 천식, 크론병, 궤양성 결장염, 당뇨병, 기관 이식의 합병증 및 동종이식-관련된 장애와 같은 만성 염증성 질환의 치료에 유용하다.
특허 출원 및 공개를 비롯한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참고로 도입된다.
본 발명은 일반적으로 중요하고 유리한 치료 표적으로서 제시되는 생물학적/세포적 과정인 베타7-함유 인테그린이 관여하는 생물학적 경로의 다양한 길항제의 확인에 부분적으로 기초한다. 이러한 생물학적 경로로는 염증, 특히 천식, 알러지, IBD, 당뇨병, 이식 및 이식편대 숙주 장애와 같은 만성 염증 장애를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명은 알파4베타7 인테그린 및 E-카드헤린 상호작용과 알파E베타7 인테그린 상호작용의 세포외 부분에 대한 MAdCAM 및 VCAM-1 결합을 간섭하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는, 베타7 인테그린-매개된 세포 부착 및/또는 동원의 간섭에 기초한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 길항제는 베타7 인테그린을 통한 비정상적이거나 원하지 않는 신호전달과 관련된 병리학적 증상을 표적화하는데 사용하기 위한 중요한 치료제 및 진단제를 제공한다. 따라서, 본 발명은 MAdCAM-알파4베타7 결합 및 위장관 상피에의 백혈구 동원, 결합 및 알러지, 천식, IBD (예를 들어 크론병 및 궤양성 결장염), 당뇨병, 이식과 관련된 염증, 이식편대 숙주 장애 및/또는 동종이식 장애, 및 베타7 인테그린에 의해 매개되는 다른 생물학적/생리학적 활성의 조절을 비롯한, 베타7 인테그린-매개된 경로의 조절과 관련된 방법, 조성물, 키트 및 제조품을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 치료 용도에 적합하고 베타7 인테그린-매개된 경로의 붕괴 정도를 다양화할 수 있는 항-베타7 치료제를 제공한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 본 발명은 Fab 단편으로서의 항체가 도 1A 및 1B 또는 도 9A 및 9B에 나타낸 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진 뮤린 Fab 단편과 실질적으로 동일한 인간 베타7에 대한 결합 친화도를 갖는 인간화 항-베타7 항체를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 Fab 단편으로서의 항체가 도 1A 및 1B에 나타낸 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열 또는 도 9A 및 9B에 나타낸 가변 도메인 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진 뮤린 또는 토끼 Fab 단편의 것보다 더 적은, 예를 들어 3배 이상, 5배 이상, 7배 이상 또는 10배 이상 더 적은, 인간 베타7에 대한 결합 친화도를 갖는 인간화 항-베타7 항체를 제공한다. 별법으로, 본 발명의 인간화 항-베타7 항체 또는 그의 베타7 결합 단편은, 친화도가 도 1A (서열 10) 및/또는 도 1B (서열 11) 또는 도 9A (서열 12) 및/또는 도 9B (서열 13)에 나타낸 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 항체의 인간 베타7에 대한 일가 친화도와 실질적으로 동일하거나 더 큰, 인간 베타7에 대한 일가 친화도를 나타낸다. 인간 베타7에 대한 큰 친화도를 갖는 항체 또는 결합 단편은 도 1A (서열 10) 및/또는 도 1B (서열 11) 또는 도 9A (서열 12) 및/또는 도 9B (서열 13)에 나타낸 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는 항체보다 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 500배 이상, 1000배 이상, 5000배 이상 또는 10,000배 이상 더 큰 친화도를 나타낸다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 Fab 단편으로서의 항체가 각각 도 1A 및 도 1B에 나타낸 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진 설치류 (예를 들어 래트 또는 뮤린) Fab 단편의 것보다 더 큰, 예를 들어 3배 이상, 5배 이상, 7배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상 또는 100배 이상 더 큰 인간 베타7에 대한 결합 친화도를 갖는 항-베타7 인간화 항체를 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 설치류 Fab 단편은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 ATCC 수탁 번호 HB-293하에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 FIB504.64라는 명칭의 래트 항체의 가변 도메인 서열을 포함하는 Fab 단편의 결합 친화도를 갖는다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 인간화 Fab 단편은 임의의 본 발명의 인간화 항-베타7 항체에 의해 생산된 항체의 가변 도메인 서열을 포함하는 Fab 단편의 결합 친화도를 갖는다. 당업계에 널리 확립된 바와 같이, 그의 수용체에 대한 리간드의 결합 친화도는 임의의 다양한 분석법을 이용하여 측정되며, 다양한 정량적인 값의 용어로 표현된다. 따라서, 일 실시양태에서, 결합 친화도는 Kd 값으로 표현되고 (예를 들어 최소화된 결합력(avidity) 효과를 갖는) 고유 결합 친화도를 반영한다. 일반적으로 및 바람직하게는, 결합 친화도는 세포-무함유 세팅에서든 세포-결합된 세팅에서든 시험관내에서 측정된다. 본원에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 결합 친화도의 배수 차이는 Fab 형태의 인간화 항체의 결합 친화도 값 대 참조/비교자 Fab 항체 (예를 들어, 공여자 초가변 영역 서열을 갖는 뮤린 항체)의 결합 친화도 값의 비율의 용어로 정량화될 수 있으며, 여기서 결합 친화도 값은 유사한 분석 조건하에서 측정된다. 따라서, 일 실시양태에서, 결합 친화도의 배수 차이는 Fab 형태의 인간화 항체와 상기 참조/비교자 Fab 항체의 Kd 값의 비율로서 측정된다. 예를 들어 비아코어(Biacore)(등록상표) (스웨덴 웁살라에 소재하는 비아코어 인터내셔날 에이비(Biacore International Ab)) 및 ELISA를 비롯한 본원에 기재된 것을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 다수의 분석법을 이용하여 결합 친화도 측정치를 수득할 수 있다.
그의 다양한 측면 및 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 본 출원에 대한 하기 세트의 잠재적인 청구항에 관한 것이다:
(a) (i) RASESVDTYLH (서열 1)인 서열 A1 내지 A11을 포함하는 HVR-L1,
(ii) KYASQSIS (서열 2)인 서열 B1 내지 B8을 포함하는 HVR-L2,
(iii) QQGNSLPNT (서열 3)인 서열 C1 내지 C9를 포함하는 HVR-L3,
(iv) GFFITNNYWG (서열 4)인 서열 D1 내지 D1O을 포함하는 HVR-H1,
(v) GYISYSGSTSYNPSLKS (서열 5)인 서열 E1 내지 E17을 포함하는 HVR-H2, 및
(vi) MTGSSGYFDF (서열 6)인 서열 F2 내지 F11을 포함하는 HVR-H3
으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함하는 항-베타7 항체 또는 그의 베타7 결합 단편을 포함하는 항체.
제1항의 폴리펩티드 또는 항체의 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 변이체 HVR 서열이 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9에 나타낸 하나 이상의 서열의 하나 이상의 잔기의 변형을 포함하는, 하나 이상의 변이체 HVR을 포함한다. 제1항 또는 제2항의 또다른 실시양태에서, 본 발명은 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 초가변 영역 (HVR)을 포함하며,
(i) HVR-L1이 아미노산 서열 RASESVDTYLH (서열 1); RASESVDSLLH (서열 7), RASESVDTLLH (서열 8) 또는 RASESVDDLLH (서열 9)를 포함하고;
(ii) HVR-L2가 아미노산 서열 KYASQSIS (서열 2), RYASQSIS (서열 67) 또는 XYASQSIS (서열 68, 여기서, X는 임의의 아미노산을 나타냄)를 포함하고,
(iii) HVR-L3이 QQGNSLPNT (서열 3)를 포함하고,
(iv) HVR-H1이 아미노산 서열 GFFITNNYWG (서열 4)를 포함하고,
(v) HVR-H2가 아미노산 서열 GYISYSGSTSYNPSLKS (서열 5)를 포함하고,
(vi) HVR-H3이 상대 위치 F2 내지 F11에 대해 아미노산 서열 MTGSSGYFDF (서열 6) 또는 RTGSSGYFDF (서열 66)를 포함하거나; AMTGSSGYFDF (서열 63), ARTGSSGYFDF (서열 64) 또는 AQTGSSGYFDF (서열 65)인 F1 내지 F11을 포함하는, 항-베타7 항체 또는 그의 베타7 결합 단편을 포함한다.
제1항의 또다른 실시양태 또는 임의의 실시양태에서, 본 발명은 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 초가변 영역 (HVR)을 포함하며,
(i) HVR-L1은 RASESVDTYLH (서열 1); RASESVDSLLH (서열 7), RASESVDTLLH (서열 8) 또는 RASESVDDLLH (서열 9)인 아미노산 서열 A1 내지 A11, 또는 서열 1, 7, 8 또는 9의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 A2가 A, G, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A3이 S, G, I, K, N, P, Q, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, A4가 E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A5가 S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A6이 V, R, I, A, G, K, L, M 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A7이 D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A8이 D, G, N, E, T, P 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A9가 L, Y, I 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A1O이 L, A, I, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A11이 H, Y, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(ii) HVR-L2는 KYASQSIS (서열 2), RYASQSIS (서열 67) 또는 XYASQSIS (서열 68, 여기서, X는 임의의 아미노산을 나타냄)인 아미노산 서열 B1 내지 B8, 또는 서열 2, 67 또는 68의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 B1이 K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y 및 X (여기서, X는 임의의 아미노산을 나타냄)로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B4가 S 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B5가 Q 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B6이 S, D, L 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B7이 I, V, E 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(iii) HVR-L3은 QQGNSLPNT (서열 3)인 아미노산 서열 C1 내지 C9, 또는 서열 3의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 C8은 N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I, L, M 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(iv) HVR-H1은 GFFITNNYWG (서열 4)인 아미노산 서열 D1 내지 D1O을 포함하고;
(v) HVR-H2는 GYISYSGSTSYNPSLKS (서열 5)인 아미노산 서열 E1 내지 E17, 또는 서열 5의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 E2가 Y, F, V 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E6이 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E1O이 S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E12가 N, T, A 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E13이 P, H, D 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E15가 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E17이 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(vi) HVR-H3은 MTGSSGYFDF (서열 6) 또는 RTGSSGYFDF (서열 66)인 아미노산 서열 F2 내지 F11을 포함하거나; AMTGSSGYFDF (서열 63), ARTGSSGYFDF (서열 64) 또는 AQTGSSGYFDF (서열 65)인 아미노산 서열 F1 내지 F11, 또는 서열 6, 63, 64, 65 또는 66의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 F2가 R, M, A, E, G, Q, S이고/거나, 아미노산 F11이 F 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항-베타7 항체 또는 그의 베타7 결합 단편을 포함한다.
제1항의 또는 본 발명의 임의의 항체의 실시양태에서, 중쇄 프레임워크 위치 71의 아미노산 (카바트(Kabat) 넘버링 시스템에 따라)이 R, A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 중쇄 프레임워크 위치 73의 아미노산 (카바트 넘버링 시스템)이 N 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 중쇄 프레임워크 위치 78의 아미노산 (카바트 넘버링 시스템)이 F, A 및 L로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제1항 또는 본 발명의 임의의 항체의 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-L1은 서열 1의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-L2는 서열 2의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-L3은 서열 3의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-H1은 서열 4의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-H2는 서열 5의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 HVR-H3은 상대 위치 F2 내지 F11에 대해 서열 6 또는 66의 서열, 또는 상대 위치 F1 내지 F11에 대해 서열 63, 64 또는 65의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, HVR-L1은 RASESVDSLLH (서열 7)를 포함한다. 일 실시양태에서, HVR-L1은 RASESVDTLLH (서열 8)를 포함한다. 일 실시양태에서, HVR-L1은 RASESVDDLLH (서열 9)를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 서열을 (본원에 기재된 바와 같은 조합으로) 포함하는 본 발명의 항체는 인간화된 것 또는 인간의 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항체를 제공하며, 각각의 HVR은 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 서열 1, 7, 8 또는 9는 HVR-L1에 상응하고, 서열 2는 HVR-L2에 상응하고, 서열 3은 HVR-L3에 상응하고, 서열 4는 HVR-H1에 상응하고, 서열 5는 HVR-H2에 상응하고, 서열 6은 HVR-H3에 상응한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 각각은 순서대로 서열 7, 2, 3, 4, 5 및 6을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 각각은 순서대로 서열 8, 2, 3, 4, 5 및 6을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 각각은 순서대로 서열 9, 2, 3, 4, 5 및 6을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 각각은 순서대로 서열 9, 2, 3, 4, 5 및 66 또는 서열 9, 2, 3, 4, 5, 63 또는 서열 9, 2, 3, 4, 5, 64 또는 서열 9, 2, 3, 4, 5 및 65 또는 서열 9, 67, 3, 4, 5, 64 또는 서열 9, 68, 3, 4, 5, 64를 포함한다.
본 발명의 항체의 변이체 HVR은 HVR 및 HVR들 내에 하나 이상의 잔기의 변형을 가질 수 있고/거나 프레임워크 영역은 인간화될 수 있다. HVR 및/또는 프레임워크 변형이 있는 본 발명의 실시양태는 본 출원에 대한 하기 잠재적인 청구항을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
2. 변이체 HVR-L1 내의 A8이 S, D 또는 T이고, A9가 L인 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
3. 항체가 인간화된 것인 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
4. 적어도 일부의 프레임워크 서열이 인간 컨센서스 프레임워크 서열인 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
5. 상기 변형이 치환, 삽입 또는 결실인 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
6. HVR-L1 변이체가 하기 위치: A2 (G, S, T 또는 V); A3 (G, I, K, N, P, Q, R 또는 T), A4 (A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R 또는 V), A5 (A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V 또는 Y), A6 (A, G, I, K, L, M, Q 또는 R), A7 (A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T 또는 V), A8 (S, D, E, G, P 또는 N) 및 A9 (L, I 또는 M), A1O (A, I, M 또는 V) 및 A11 (F, S 또는 Y)의 임의의 조합으로 1 내지 10 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)개의 치환을 포함하는 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
7. HVR-L2 변이체가 하기 위치: B1 (N), B5 (S), B6 (R 또는 L) 및 B7 (T, E, K 또는 V)의 임의의 조합으로 1 내지 4 (1, 2, 3 또는 4)개의 치환을 포함하는 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
8. HVR-L3 변이체가 위치 C8 (W, Y, R, S, A, F, H, I, L, M, N, T 또는 V)에 하나 이상의 치환을 포함하는 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
9. HVR-H2 변이체가 하기 위치: E2 (V, D 또는 F), E6 (G), E1O (Y), E12 (A, D 또는 T), E13 (D, A 또는 H), E15 (V), E17 (G)의 임의의 조합체 1 내지 7 (1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7)개의 치환을 포함하는 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
10. HVR-H3 변이체가 하기 위치: F2 (A, E, G, Q, R 또는 S) 및 F11 (Y)의 임의의 조합으로 1 또는 2개의 치환을 포함하는 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
11. 서열 7의 서열을 갖는 HVR-L1을 포함하는 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
12. 서열 8의 서열을 갖는 HVR-L1을 포함하는 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
13. 서열 9의 서열을 갖는 HVR-L1을 포함하는 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
14. 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함하는 중쇄 인간 아군 III 중쇄 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체.
15. 치환이 R71A, N73T 및/또는 N78A인 제14항의 항체.
16. 서열 3의 서열을 갖는 HVR-L3을 포함하는 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
17. 변이체 HVR-L1 내의 A8이 S인 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
18. 변이체 HVR-L1 내의 A8이 D인 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
19. 변이체 HVR-L1 내의 A9가 L인 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
20. 서열 E1 내지 E17 및 F1 내지 F11 사이의 프레임워크 서열이 HFR3-1-HFR3-31이고, HFR3-6이 A 또는 R이고, HFR3-8이 N 또는 T이고, HFR3-13이 L 또는 A 또는 F인 제1항 또는 임의의 그의 실시양태의 항체.
21. 인간 베타7에 대한 항체의 일가 친화도가 도 9에 나타낸 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 래트 항체의 일가 친화도와 실질적으로 동일한 인간화 항- 베타7 항체.
22. 인간 베타7에 대한 항체의 일가 친화도가 도 9에 나타낸 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 래트 항체의 일가 친화도보다 3배 이상 더 큰 인간화 항-베타7 항체.
23. 래트 항체가 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 ATCC 하에 수탁 번호 HB-293으로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 것인 제21항 또는 제22항의 인간화 항체.
24. 결합 친화도가 Kd 값으로 표현되는 것인 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체.
25. 결합 친화도가 비아코어(상표명) 또는 방사성면역분석법에 의해 측정되는 것인 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체.
26. 인간 κ 아군 I 경쇄 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 제1항의 항체.
27. 중쇄 인간 아군 III 중쇄 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 제1항의 항체.
28. 프레임워크 서열이 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함하는 것인 제27항의 항체.
29. 상기 치환이 R71A, N73T 및/또는 N78A이거나, 위치 71에서 치환된 아미노산이 R 또는 A이고/거나, 위치 78의 아미노산 치환이 N 또는 T이고/거나, 위치 78의 아미노산 치환이 L 또는 A 또는 F인 제28항의 항체.
30. 상기 치환이 L78F 또는 A78F 또는 A78L 또는 L78A인 제28항의 항체.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 항체와 제2 인테그린 서브유닛 및/또는 리간드를 접촉시킴으로써, 인간 베타7 인테그린 서브유닛과 제2 인테그린 서브유닛 및/또는 리간드의 상호작용을 억제하는 방법.
32. 제2 인테그린 서브유닛이 알파4 인테그린 서브유닛이고, 리간드가 MAdCAM, VCAM 또는 피브로넥틴인 제31항의 방법.
33. 알파4 인테그린 서브유닛이 인간의 것인 제32항의 방법.
34. 리간드가 인간의 것인 제33항의 방법.
35. 제2 인테그린 서브유닛이 알파E 인테그린 서브유닛이고, 리간드가 E-카드헤린인 제32항의 방법.
36. 알파E 인테그린 서브유닛이 인간의 것인 제35항의 방법.
37. 리간드가 인간의 것인 제36항의 방법.
38. 억제가 염증, 천식, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 결장염, 당뇨병, 기관 이식으로 초래된 염증, 이식편대 숙주 장애, 및 동종이식 장애와 관련된 염증으로부터 선택된 장애의 증상을 감소시키거나 경감시키는 것인 제31항의 방법.
본 발명의 추가의 실시양태는 하기를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일 실시양태에서, HVR-L1은 서열 1, 7, 8 또는 9이거나, 하기 위치: A2 (A, G, S, T 또는 V); A3 (S, G, I, K, N, P, Q, R 또는 T), A4 (E, A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R 또는 V), A5 (S, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V 또는 Y), A6 (V, A, G, I, K, L, M, Q 또는 R), A7 (D, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T 또는 V), A8 (T, S, D, E, G, P 또는 N) 및 A9 (Y, L, I 또는 M), A1O (L, A, I, M 또는 V) 및 A11 (H, F, S 또는 Y)의 임의의 조합으로 상대 위치 A1 내지 A11에 1 내지 10 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)개의 치환을 포함하는 서열 1, 7, 8 또는 9의 HVR-L1 변이체이다. 일 실시양태에서, HVR-L2는 서열 2, 67 또는 68이거나, 하기 위치: B1 (K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y 또는 X (여기서, X는 임의의 아미노산을 나타냄), B4 (S), B5 (Q 또는 S), B6 (S, R 또는 L) 및 B7 (I, T, E, K 또는 V)의 임의의 조합으로 상대 위치 B1 내지 B8에 1 내지 4 (1, 2, 3, 4, 4 또는 5)개의 치환을 포함하는 서열 2, 67 또는 68의 HVR-L2 변이체이다. 일 실시양태에서, HVR-L3은 서열 3이거나, 위치 C8 (W, Y, R, S, A, F, H, I, L, M, N, T 또는 V)과 같은 상대 위치 C1 내지 C8에 하나 이상의 치환을 포함하는 서열 3의 HVR-L3 변이체이다. 일 실시양태에서, HVR-H1인 서열 4이다. 일 실시양태에서, HVR-H2는 서열 5이거나, HVR-H2 변이체가 하기 위치: E2 (Y, V, D 또는 F), E6 (S 또는 G), E1O (S 또는 Y), E12 (N, A, D 또는 T), E13 (P, D, A 또는 H), E15 (L 또는 V), E17 (S 또는 G)의 임의의 조합으로 상대 위치 E1 내지 E17에 1 내지 7 (1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7)개의 치환을 포함하는 서열 5의 HVR-H2 변이체이다. 일 실시양태에서, HVR-H3은 서열 6, 63, 64, 65 또는 66이거나, 하기 위치: F2 (M, A, E, G, Q, R 또는 S) 및 F11 (F 또는 Y)의 임의의 조합으로 서열 63, 64 및 65에 대해 상대 위치 F1 내지 F11, 또는 서열 6 및 66에 대해 상대 위치 F2 내지 F11에 1 또는 2개의 치환을 포함하는 서열 6, 63, 64, 65 또는 66의 HVR-H3 변이체이다. 각각의 위치 뒤에 있는 괄호 안의 문자(들)는 당업자에게 명백할 것과 같이 컨센서스에 대해 예시적인 치환 (예를 들어 대체) 아미노산 또는 다른 아미노산을 지시하며, 본원에 기재된 내용에서 치환 아미노산으로서의 다른 아미노산의 적합성은 당업계에 공지된 기술 및/또는 본원에 기재된 기술을 이용하여 통상적으로 평가될 수 있다.
일 실시양태에서, HVR-L1은 서열 1의 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 변이체 HVR-L1 내의 A8은 D이다. 일 실시양태에서, 변이체 HVR-L1 내의 A8은 S이다. 일 실시양태에서, 변이체 HVR-L1 내의 A9는 L이다. 일 실시양태에서, 변이체 HVR-L1 내의 A8은 D이고, 변이체 HVR-L1 내의 A9는 L이다. 일 실시양태에서, 변이체 HVR-L1 내의 A8은 S이고, 변이체 HVR-L1 내의 A9는 L이다. 본 발명의 일부 실시양태는 HVR-L1 내의 상기 변이를 포함하며, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, HVR-H3은 서열 6 또는 66 (상대 위치 F2 내지 F11에 대해) 또는 서열 63, 64 또는 65 (상대 위치 F1 내지 F11에 대해)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
일 실시양태에서, 변이체 HVR-L1 내의 A8은 I이고, 변이체 HVR-L1 내의 A9는 L이며, 변이체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각의 HVR은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
일 실시양태에서, 변이체 HVR-L1 내의 A8, A9 및 A1O은 각각 D, L 및 V이고, 변이체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각의 HVR은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
일 실시양태에서, 변이체 HVR-L1 내의 A8 및 A9는 각각 N 및 L이고, 변이체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각의 HVR은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
일 실시양태에서, 변이체 HVR-L1 내의 A8 및 A9는 각각 P 및 L이고, 변이체 HVR-L2 내의 B6 및 B7은 각각 R 및 T이고, 변이체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각의 HVR은 순서대로 서열 3, 4, 5 및 6을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
일 실시양태에서, 변이체 HVR-L1 내의 A2, A4, A8, A9 및 A1O은 각각 S, D, S, L 및 V이고, 변이체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각의 HVR은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
일 실시양태에서, 변이체 HVR-L1 내의 A5 및 A9는 각각 D 및 T이고, 변이체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각의 HVR은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
일 실시양태에서, 변이체 HVR-L1 내의 A5 및 A9는 각각 N 및 L이고, 변이체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각의 HVR은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
일 실시양태에서, 변이체 HVR-L1 내의 A9는 L이고, 변이체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각의 HVR은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항-베타7 결합 폴리펩티드는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 각각의 HVR은 순서대로 서열 9, 2, 3, 4, 5 및 64를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 또다른 실시양태에서, 각각의 HVR은 순서대로 서열 9, 67, 3, 4, 5 및 64를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 또다른 실시양태에서, 각각의 HVR은 순서대로 서열 9, 68, 3, 4, 5 및 64를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 또다른 실시양태에서, 각각의 HVR은 순서대로 서열 9, 2 또는 67 또는 68, 3, 4, 5 및 66을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 상기 변이체 HVR-L1 항체 변이체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하고, 각각은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6에 나타낸 서열을 포함한다. 항체 변이체가 HVR-L1 A8(P) 및 A9(L) 및 HVR-L2 B6(R) 및 B7(T)를 포함할 경우, 일부 실시양태에서, 상기 HVR-L1, HVR-L2 변이체는 HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각은 순서대로 서열 3, 4, 5 및 6에 나타낸 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 아군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나, 78은 A이다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 1을 포함하는 HVR-L1을 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 변이체 항체는 A10이 V인 변이체 HVR-L1을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 변이체 항체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 아군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나, 78은 A이다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 3을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 변이체 항체는 C8이 L인 변이체 HVR-L3을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 변이체 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 4, 5 및 6에 나타낸 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 C8이 W인 변이체 HVR-L3을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 변이체 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 4, 5 및 6에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HVR-L1은 서열 7, 8 또는 9를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 아군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나, 78은 A이다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 6을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 항체의 변이체는 F1이 Q인 변이체 HVR-H3을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 변이체 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 및 HVR-H2를 추가로 포함하고, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 3, 4 및 5에 나타낸 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 F1이 R인 변이체 HVR-H3을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 변이체 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 및 HVR-H2를 포함하고, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 3, 4 및 5에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HVR-L1은 서열 7, 8 또는 9를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 아군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나, 78은 A이다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 1을 포함하는 HVR-L1을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 A4가 Q인 변이체 HVR-L1을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 변이체 항체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6에 나타낸 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 A6이 I인 변이체 HVR-L1을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 변이체 항체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6에 나타낸 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 A7이 S인 변이체 HVR-L1을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 변이체 항체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR- H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6에 나타낸 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 A8이 D 또는 N인 변이체 HVR-L1을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 변이체 항체는 HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각은 순서대로 서열 2, 3, 4, 5 및 6에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 아군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나, 78은 A이다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 2를 포함하는 HVR-L2를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 B1이 N인 변이체 HVR-L2를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 B5가 S인 변이체 HVR-L2를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 B6이 L인 변이체 HVR-L2를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 B7이 V인 변이체 HVR-L2를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 B7이 E 또는 K인 변이체 HVR-L2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체 항체는 HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각은 순서대로 서열 1, 3, 4, 5 및 6에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HVR-L1은 서열 7, 8 또는 9를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 아군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나, 78은 A이다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 3을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 C8이 W, Y, R 또는 S인 변이체 HVR-L3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 4, 5 및 6에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HVR-L1은 서열 7, 8 또는 9을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 아군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나, 78은 A이다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 5를 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 E2가 F인 변이체 HVR-H2를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 E2가 V 또는 D인 변이체 HVR-H2를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 E6이 G인 변이체 HVR-H2를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 E10이 Y인 변이체 HVR-H2를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 E12가 A, D 또는 T인 변이체 HVR-H2를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 E13이 D, A 또는 N인 변이체 HVR-H2를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 E15가 V인 변이체 HVR-H2를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 E17이 G인 변이체 HVR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 및 HVR-H3을 추가로 포함하며, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 3, 4 및 6에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HVR-L1은 서열 7, 8 또는 9를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 아군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나, 78은 A이다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 6을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 F11이 Y인 변이체 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 변이체 항체는 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 및 HVR-H3을 추가로 포함하고, 각각은 순서대로 서열 1, 2, 3, 4 및 6에 나타낸 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HVR-L1은 서열 7, 8 또는 9를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 아군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나, 78은 A이다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 아군 III 중쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 프레임워크 컨센서스 서열은 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함한다. 상기 항체의 일부 실시양태에서, 위치 71은 A이고/거나, 73은 T이고/거나, 78은 A이다. 상기 항체의 일 실시양태에서, 상기 항체는 인간 κI 경쇄 프레임워크 컨센서스 서열을 추가로 포함한다.
숙주 대상체에 사용하기 위한 치료제는 바람직하게는 상기 대상체에서 작용제에 대한 면역원성 반응을 거의 내지 전혀 유발하지 않는다. 일 실시양태에서, 본 발명은 이러한 작용제를 제공한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 본 발명은 숙주 대상체에서 서열 10 및/또는 11 (도 1A 및 1B) 또는 서열 12 및/또는 13 (래트 항-마우스 Fib504 아미노산 서열을 나타낸 도 9A 및 9B)을 포함하는 서열을 포함하는 항체에 비해 실질적으로 감소된 수준으로 인간 항-설치류 항체 반응 (예를 들어 항-마우스 또는 항-래트 반응) 또는 인간 항-인간 반응을 유도하고/거나 유도할 것으로 예상되는 인간화 항체를 제공한다. 또다른 예에서, 본 발명은 인간 항-설치류 (예를 들어 인간 항-마우스 (HAMA) 또는 인간 항-마우스) 또는 인간 항-인간 항체 반응 (HAHA)을 유도하고/거나 유도할 것으로 예상되는 인간화 항체를 제공한다.
본 발명의 인간화 항체는 그의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인에 하나 이상의 인간 및/또는 인간 컨센서스 비-초가변 영역 (예를 들어 프레임워크)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 변형은 인간 및/또는 인간 컨센서스 비-초가변 영역 서열 내에 존재한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 중쇄 가변 도메인은 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하고, 일 실시양태에서 이는 아군 III 컨센서스 프레임워크 서열이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 변형된 변이체 아군 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 변이체 아군 III 컨센서스 프레임워크 서열은 위치 71, 73, 78 및/또는 94 중 하나 이상에 치환을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 치환은 그의 임의의 조합으로 R71A, N73T, L78A, 및/또는 R94M이다.
당업계에 공지된 바와 같이, 그리고 하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 항체의 초가변 영역을 나타내는 아미노산 위치/경계는 본 내용 및 당업계에 공지된 다양한 정의 (하기 기재된 바와 같음)에 따라 다양할 수 있다. 가변 도메인 내의 일부 위치는 상기 위치가 한 세트의 범주 하의 초가변 영역 내인 것으로 간주될 수 있으면서 상이한 세트의 범주 하의 초가변 영역 밖인 것으로 간주될 수 있다는 점에서, 혼성 초가변 위치로서 검토될 수 있다. 하나 이상의 상기 위치는 또한 연장된 초가변 영역 (하기에 추가로 정의된 바와 같음)에서 발견될 수 있다. 본 발명은 상기 혼성 초가변 위치 내에 변형을 포함하는 항체를 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 혼성 초가변 위치는 중쇄 가변 도메인 내에 위치 26 내지 30, 33 내지 35B, 47 내지 49, 49, 57 내지 65, 93, 94 및 102 중 하나 이상을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 혼성 초가변 위치는 경쇄 가변 도메인 내에 위치 24 내지 29, 35 내지 36, 46 내지 49, 49, 56 및 97 중 하나 이상을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 혼성 초가변 위치에서 변형된 변이체 인간 아군 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 위치 28 내지 35, 49, 50, 52a, 53, 54, 58 내지 61, 63, 65, 94 및 102 중 하나 이상에서 변형된 변이체 인간 아군 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 T28F, F29I, S30T, S31N, Y32N, A33Y, M34W 및 S35G 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 S49G 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 V50F 또는 V50D 또는 V50Y 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 G53Y 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 G54S 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 Y58S 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 A60N 또는 A60D 또는 A60T 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 D61P 또는 D61A 또는 D61H 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 V63L 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 G65S 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 R94M 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 R94A 또는 R94E 또는 R94G 또는 R94Q 또는 R94S 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 G95T 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 위치 28 내지 35, 49, 50, 52a, 53, 54, 58 내지 61, 63, 65, 94 및 102에 하나 이상의 치환을 포함하며, 위치 R71A 또는 N73T 또는 L78A 또는 L78F에 하나 이상의 치환을 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 Y102F 치환을 포함한다. 도 1B를 참조하면, 상기 치환은 중쇄의 HVR-H1, HVR-H2, 및/또는 HVR-H3 내에 있음을 알 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 위치 27, 29 내지 31, 33, 34, 49, 50, 53 내지 55, 91 및 96 중 하나 이상에서 변형된 변이체 인간 아군 I 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 Q27E 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 I29V 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 S30D 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 N31T 또는 N31S 또는 N31D 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 Y32L을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 A34H 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 Y49K 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 A50Y 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 S53Q 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 L54S 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 E55I 또는 E55V 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 Y91G 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 W96N 또는 W96L 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 A25S 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 G, S, T 또는 V 치환에 대해 A25를 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 하기 군의 치환으로부터 선택된 변형을 포함한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 항체는 G, I, K, N, P, Q 또는 T 치환에 대해 S26을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 E, A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R 또는 V 치환에 대해 Q27을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V 또는 Y 치환에 대해 S28을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 V, A, G, K, L, M, Q 또는 R 치환에 대해 I29를 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 D, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T 또는 V 치환에 대해 S30을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 D, T, E 또는 G 치환에 대해 N31을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 L, I 또는 M 치환에 대해 Y32를 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 A, I, M 또는 V 치환에 대해 L33을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 H, F, Y 또는 S 치환에 대해 A34를 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 K 또는 N 치환에 대해 Y49를 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 A50Y 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 S53Q 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 L54S 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 V, I 또는 K 치환에 대해 E55를 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 Y91G 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체는 N, L, W, Y, R, S, A, F, H, I, M, N, R, S, T, V 또는 Y 치환에 대해 W96을 포함한다. 도 1A를 참고하면, 상기 치환은 경쇄의 HVR-L1, HVR-L2 및/또는 HVR-L3 내임을 알 수 있다.
본 발명의 항체는, 항체가 목적하는 생물학적 특징 (예를 들어 목적하는 결합 친화도)을 나타낸다면, 임의의 적합한 인간 또는 인간 컨센서스 경쇄 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 적어도 일부 (또는 전부)의 인간 κI 경쇄의 프레임워크 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 적어도 일부 (또는 전부)의 인간 κ 아군 I 프레임워크 컨센서스 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 경쇄의 위치 49 및 중쇄의 94가 연장된 HVR 내에 포함되고, 상기 위치 49가 K이고, 위치 94가 반드시 그럴 필요는 없지만 바람직하게는 M이고, R일 수 있다면, 서열 34 내지 41 및 도 1, 7 및 8에 나타낸 프레임워크 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 길항제는 알파4 인테그린 서브유닛과의 회합, 알파E 인테그린 서브유닛과의 회합, 알파4베타7 인테그린의 MAdCAM, VCAM-1 또는 피브로넥틴에의 결합, 및 알파E베타7 인테그린의 E-카드헤린에의 결합을 포함하나 이에 제한되지 않는 베타7 관련된 효과의 하나 이상의 측면을 조절하는데 사용될 수 있다. 상기 효과는 베타7 서브유닛, 또는 알파4베타7 또는 알파E베타 이량체성 인테그린에의 리간드 결합의 붕괴를 비롯한 임의의 생물학적 관련 메카니즘, 및/또는 이량체성 인테그린의 형성이 억제되도록 알파 및 베타 인테그린 서브유닛 사이의 회합을 붕괴시킴으로서 조절될 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 알파4의 베타7에의 결합을 억제하는 베타7 길항제 항체를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 알파4베타7의 MAdCAM에의 결합을 붕괴시킨다. 일 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 알파4베타7의 VCAM-1에의 결합을 붕괴시킨다. 일 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 알파4베타7의 피브로넥틴에의 결합을 붕괴시킨다. 일 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 베타7의 알파E에의 결합을 붕괴시킨다. 일 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 알파E베타7 인테그린의 E-카드헤린에의 결합을 붕괴시킨다. 간섭은 직접적이거나 간접적일 수 있다. 예를 들어, 베타7 길항제 항체는 알파4베타7 또는 알파E베타7 이량체화 영역의 서열 내의 베타7에 결합함으로써, 인테그린 서브유닛의 상호작용 및 인테그린 이량체의 형성을 억제할 수 있다. 추가의 예에서, 베타7 길항제 항체는 베타7 서브유닛의 리간드 결합 도메인 내의 서열에 결합함으로써, 상기 결합된 도메인과 그의 결합 상대 (예를 들어 알파4베타7 인테그린에 대해 피브로넥틴, VCAM 및/또는 MAdCAM; 또는 알파E베타7 인테그린에 대해 E-카드헤린) 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 또다른 예에서, 베타7 길항제 항체는 인테그린 서브유닛 이량체화 도메인 또는 리간드 결합 도메인 내에 있지 않은 서열에 결합할 수 있지만, 상기 베타7 길항제 항체 결합은 베타7 도메인이 그의 결합 상대 (예를 들어 알파4 또는 알파E 인테그린 서브유닛 및/또는 리간드, 예를 들어 피브로넥틴, VCAM, MAdCAM 또는 E-카드헤린)와 상호작용하는 능력의 붕괴를 초래한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항체는 알파4 또는 알파E 서브유닛과의 베타7 이량체화가 붕괴되도록 베타7 (예를 들어 세포외 도메인)에 결합한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항체는 베타7 및/또는 알파4베타7 및/또는 알파E베타7 인테그린이 그의 상대적인 리간드 또는 리간드들에 결합하는 능력이 붕괴되도록 베타7에 결합한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 본 발명은 베타7 분자에의 결합시 상기 분자의 이량체화를 억제하는 길항제 항체를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 베타7의 리간드 결합 도메인 내의 서열에 특이적으로 결합한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 알파4베타7 인테그린에 대한 리간드 결합 (즉, 피브로넥틴, VCAM 및/또는 MAdCAM)이 붕괴되도록 베타7의 리간드 결합 도메인 내의 서열에 특이적으로 결합한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 알파E베타7 인테그린에 대한 리간드 결합 (즉, E-카드헤린)이 붕괴되도록 베타7의 리간드 결합 도메인 내의 서열에 특이적으로 결합한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항체는 이종이량체화 (즉, 알파4 또는 알파E 인테그린 서브유닛 분자와의 베타7 이량체화)를 포함하는 베타7 이량체화를 붕괴시킨다.
일 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항체는 아미노산 176 내지 237에 매핑하는 베타7 인테그린 서브유닛 상의 에피토프에 결합한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항체는 Fib504.64 (ATCC HB-293)와 실질적으로 동일한 에피토프인 베타7 인테그린 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 에피토프 결합은 경쟁 결합 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 표준 기술에 의해 측정된다.
일 측면에서, 본 발명은 도 13의 아미노산 치환의 표에 나타낸 1, 2, 3, 4, 5 또는 모든 HVR 서열의 조합을 포함하는 항체를 제공한다.
숙주 대상체에 사용하기 위한 치료제는 바람직하게는 상기 대상체에서 작용제에 대한 면역 반응을 거의 내지 전혀 유도하지 않는다. 일 실시양태에서, 본 발명은 이러한 작용제를 제공한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 본 발명은 숙주 대상체에서 서열 10, 11, 12 및/또는 서열 13 (래트 항-마우스 Fib504 (ATCC HB-293), 도 1 및 9)의 서열을 포함하는 항체에 비해 실질적으로 감소된 수준으로 인간 항-래트 또는 인간 항-마우스 또는 인간 항-인간 항체 반응을 유도하고/거나 유도할 것으로 예상된다. 또다른 예에서, 본 발명은 인간 항-마우스, 인간 항-래트 또는 인간 항-인간 항체 반응을 유도하지 않고/거나 유도하지 않을 것으로 예상되는 인간화 항체를 제공한다.
본 발명의 인간화 항체는 그의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 내에 하나 이상의 인간 및/또는 인간 컨센서스 비-초가변 영역 (예를 들어 프레임워크) 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 변형은 인간 및/또는 인간 컨센서스 비-초가변 영역 서열 내에 존재한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 중쇄 가변 도메인은 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하며, 일 실시양태에서 이는 아군 III 컨센서스 프레임워크 서열이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 변형된 변이체 아군 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 변이체 아군 III 컨센서스 프레임워크 서열은 위치 71, 73, 78 및/또는 94 중 하나 이상에 치환을 포함할 수 있지만, 위치 94는 본 발명의 연장된 중쇄 초가변 영역-H3의 일부이다. 일 실시양태에서, 상기 치환은 그의 임의의 조합으로 R71A, N73T, N78A 및/또는 R94M이다.
본 발명의 항체는, 항체가 목적하는 생물학적 특징 (예를 들어 목적하는 결합 친화도)를 나타낸다면, 임의의 적합한 인간 또는 인간 컨센서스 경쇄 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 κI 경쇄의 프레임워크 서열의 적어도 일부 (또는 전부)를 포함한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 κ 아군 I 프레임워크 컨센서스 서열의 적어도 일부 (또는 전부)를 포함한다.
본 발명의 길항제는 베타7 관련된 효과의 하나 이상의 측면을 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 베타7 길항제 항체는 알파4베타7 또는 알파E베타7 이량체화 영역의 서열 내의 베타7에 결합함으로써, 인테그린 서브유닛의 상호작용 및 인테그린 이량체의 형성을 억제할 수 있다. 추가의 에에서, 베타7 길항제 항체는 베타7 서브유닛의 리간드 결합 도메인 내의 서열에 결합함으로써, 상기 결합된 도메인과 그의 결합 상대 (예를 들어 알파4베타7 인테그린에 대해 피브로넥틴, VCAM 및/또는 MAdCAM; 또는 알파E베타7 인테그린에 대해 E-카드헤린)의 상호작용을 억제할 수 있다. 또다른 예에서, 베타7 길항제 항체는 인테그린 서브유닛 이량체화 도메인 또는 리간드 결합 도메인 내에 있지 않은 서열에 결합할 수 있지만, 상기 베타7 길항제 항체 결합은 베타7 도메인이 그의 결합 상대 (예를 들어 알파4 또는 알파E 인테그린 서브유닛 및/또는 리간드, 예를 들어 피브로넥틴, VCAM, MAdCAM 또는 E-카드헤린)와 상호작용하는 능력의 붕괴를 초래한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항체는 알파4 또는 알파E 서브유닛과의 베타7 이량체화가 붕괴되도록 베타7 (예를 들어 세포외 도메인)에 결합한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항체는 베타7 및/또는 알파4베타7 및/또는 알파E베타7 인테그린이 그의 상대적인 리간드 또는 리간드들에 결합하는 능력이 붕괴되도록 베타7에 결합한다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 본 발명은 베타7 분자에의 결합시 상기 분자의 이량체화를 억제하는 길항제 항체를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 베타7의 리간드 결합 도메인 내의 서열에 특이적으로 결합한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 알파4베타7 인테그린에의 리간드 결합 (즉, 피브로넥틴, VCAM, 및/또는 MAdCAM)이 붕괴되도록 베타7의 리간드 결합 도메인 내의 서열에 특이적으로 결합한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 알파E베타7 인테그린에의 리간드 결합 (즉, E-카드헤린)이 붕괴되도록 베타7의 리간드 결합 도메인 내의 서열에 특이적으로 결합한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항체는 이종이량체화 (즉, 알파4 또는 알파E 인테그린 서브유닛 분자와의 베타7 이량체화)를 포함하는 베타7 이량체화를 붕괴시킨다.
일부 예에서, 리간드 (예를 들어 피브로넥틴, VCAM, MAdCAM 또는 알파E)의 인테그린의 일부로서의 베타7 서브유닛에의 또는 이량체로서의 알파4베타7 인테그린 또는 알파E베타7 인테그린에의 결합을 간섭하지 않는 베타7 길항제 항체를 갖는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 베타7 상의 피브로넥틴, VCAM, MAdCAM 또는 E-카드헤린 결합 부위에 결합하지 않지만, 대신 베타7 서브유닛 및 알파 서브유닛 (예를 들어 알파4 또는 알파E 인테그린 서브유닛) 사이의 상호작용을 억제하여 생물학적 활성 인테그린의 형성이 방지되도록 하는 항체를 제공한다. 일 예에서, 본 발명의 길항제 항체는, 길항제가 상이한 과정에서 표적화되고/거나 베타7 인테그린 중추 내에서 작용하는 하나 이상의 다른 길항제와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 모노클로날 항체를 비롯한 또다른 베타7 또는 알파/베타 인테그린 길항제, 예를 들어 알파4베타7 항체, 또는 뮤린 항체로부터 유래되고/거나 뮤린 항체로부터 유래된 항체와 동일하거나 효과적으로 동일한 결합 특징 또는 특이성을 갖는 인간화 항체 또는 모노클로날 항체와 같은 항체에 의해 결합된 에피토프와 별개의 베타7 상의 에피토프에 결합한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 각각의 인테그린으로의 베타7- 알파4 또는 -알파E 다량체화 뿐만 아니라 리간드 결합을 붕괴시키는 베타7 길항제 항체를 제공한다. 예를 들어, 알파4 또는 알파E 인테그린 서브유닛과의 베타7 이량체화를 억제하는 본 발명의 길항제 항체는 베타7 또는 인테그린 이량체에의 결합에 대해 리간드와 경쟁하는 능력을 추가로 포함할 수 있다 (예를 들어, 이는 피브로넥틴, VCAM, 및/또는 MAdCAM의 베타7 및/또는 알파4베타7에의 결합을 간섭할 수 있거나, 이는 E-카드헤린의 베타7 또는 알파E베타7에의 결합을 간섭할 수 있다).
본 발명의 베타7 길항제 항체의 일 실시양태에서, 길항제의 베타7에의 결합은 리간드 결합 활성화된 세포 부착을 억제한다. 본 발명의 베타7 길항제 항체의 또다른 실시양태에서, 세포 내에서의 길항제의 베타7에의 결합은 베타7-함유 인테그린이 발현되는 세포 및/또는 조직에 대한 세포의 동원을 억제한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 베타7 길항제 항체는 베타7 세포외 도메인 (문헌 [Tidswell, M. et al. (1997) J. Immunol. 159:1497-1505] 참조) 또는 그의 변이체 아미노산 176 내지 250 (임의로 아미노산 176 내지 237)의 적어도 일부분에 특이적으로 결합하며, 리간드 MAdCAM, VCAM-1, 피브로넥틴 및/또는 E-카드헤린의 결합을 감소시키거나 차단한다. 일 실시양태에서, 리간드 결합의 이러한 차단은, 리간드를 발현하는 세포의 베타7-함유 리간드를 발현하는 세포에의 부착을 붕괴시키고/거나, 감소시키고/거나, 방지한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항체는 잔기 176 내지 237을 포함하는 베타7의 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항체는 베타7의 잔기 176 내지 237로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열의 일부 또는 전부에 의해 형성된 형태적인 에피토프에 결합한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항체는 인간 베타7의 잔기 176 내지 237 또는 잔기 176 내지 250의 아미노산 서열과 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항-베타7 항체는 하이브리도마 ATCC HB-293에 의해 생산된 항-베타7 항체 Fib504과 동일한 에피토프에 결합한다.
일 측면에서, 본 발명은 1종 이상의 본 발명의 길항제 항체 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 담체는 제약상 허용된다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 베타7 길항제 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 벡터는 임의의 형태, 예를 들어 발현 벡터와 같은 재조합 벡터일 수 있다. 임의의 다양한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli)이다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 포유동물 세포이다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 길항제 항체의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 베타7 길항제 항체 (또는 그의 단편)를 코딩하는 본 발명의 재조합 벡터를 적합한 숙주 세포에서 발현시키고, 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는, 베타7 길항제 항체 (본원에서 정의된 바와 같이 전장 및 그의 단편을 포함함)의 제조 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 용기; 및 용기 내에 함유된 1종 이상의 본 발명의 베타7 길항제 항체를 포함하는 조성물을 포함하는 제조품을 제공한다. 일 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 핵산을 포함한다. 일 실시양태에서, 길항제 항체를 포함하는 조성물은 담체를 추가로 포함하며, 일부 실시양태에서 이는 제약상 허용된다. 일 실시양태에서, 본 발명의 제조품은 조성물 (예를 들어 길항제 항체)을 대상체에게 투여하기 위한 지시서를 추가로 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 1종 이상의 본 발명의 베타7 길항제 항체를 포함하는 조성물을 포함하는 제1 용기; 및 완충제를 포함하는 제2 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 일 실시양태에서, 완충제는 제약상 허용된다. 일 실시양태에서, 길항제 항체를 포함하는 조성물은 담체를 추가로 포함하며, 일부 실시양태에서 이는 제약상 허용된다. 일 실시양태에서, 키트는 조성물 (예를 들어 길항제 항체)를 대상체에게 투여하기 위한 지시서를 추가로 포함한다.
베타7 인테그린 및 그의 리간드는 질환 상태에서 다양하게 발현된다. 장 내피 상의 MAdCAM-1의 발현은 염증성 장 질환 (UC 및 CD)을 갖는 환자의 점막 염증의 부위에서 증가되며, UC 및 CD의 결장 고유판은 또한 IBS 대조군에 비해 증가된 CD3+ 및 a4b7+ 세포를 나타낸다 (문헌 [Souza H., et al., Gut 45:856 (1999)] 참조). MAdCAM-1 발현은 간 질환에서의 문맥로와 관련되는 것으로 관찰되었으며, 염증 동안 간에 대한 알파4베타7+ 림프구의 동원에서 중요할 수 있다 (문헌 [Hillan, K., et al., Liver. 19(6):509-18 (1999)]). 간 혈관 상의 MAdCAM-1은 IBD 및 원발성 경화성 담관염을 갖는 환자로부터의 a4b7+ 림프구의 부착을 지지한다. 부착은 항-MAdCAM-1, 항-알파4베타7 또는 항-알파4 항체에 의해 억제되었다 (문헌 [Grant AJ. et al., Hepatology. 33(5): 1065-72 (2001)]). MAdCAM-1, VCAM-1 및 E-카드헤린은 뇌 내피 세포 및/또는 염증화된 중추 신경계 내의 미세혈관 상에서 발현된다. 베타7 인테그린은 CNS의 수초제거 질환에 기여한다 (문헌 [Kanwar et al., J. Neuroimmunology 103, 146 (2000)]). 알파4베타7의 발현은 대조군 및 UC를 갖는 환자에서보다 CD의 LPL에서 유의하게 더 높았다 (문헌 [Oshitani, N. et al., International Journal of Molecule Medicine 12, 715-719 (2003)]). CD 환자로부터의 IEL은 만성적으로 자극되며 주변부로부터 동원될 수 있다 (문헌 [Meresse, B., et al., Human Immunology, 62, 694-700 (2001)]). 인간 간 질환에서, 알파E베타7 T 세포 (CD4+ 및 CD8+)는 E-카드헤린이 간세포 및 담관 내피 상에서 발현되는 인간 간에서 선호적으로 축적된다 (문헌 [Shimizu, Y., et al., Journal of Hepatology 39, 918-924 (2003)]). 만성 췌장염에서, 장 상피내 림프구와 유사한 CD8+CD103+ T 세포는 만성 췌장염에서 췌장을 침윤시킨다 (문헌 [Matthias, P., et al., Am J Gastroenterol 93:2141-2147 (1998)]). 알파E베타7의 상향조절은 특정 상피 관련을 갖는 전신성 홍반성 루푸스 환자에서 발견된다 (문헌 [Pang et al., Arthritis & Rheumatism 41: 1456-1463 (1998)]). 쇼그렌 증후군에서, CD8+ 알파E베타7+ T 세포는 아폽토시스를 유도함으로써 선방 상피 세포에 부착되고 이를 사멸시킨다 (문헌 [Kroneld et al., Scand J Rheumatol 27:215-218, 1998]). 인테그린 알파4베타7 및 알파E베타7은 피부 염증 동안 T 세포 표피친화성에 역할을 하며, 피부 동종이식 거부반응에 기여한다 (문헌 [Sun et al., Transplantation 74, 1202, 2002]). 데라끼(Teraki) 및 시오하라(Shiohara)는 건선성 표피에서 CD8+ T 세포 상의 aEb7 인테그린의 선호적인 발현을 보여주었다 (문헌 [Teraki and Shiohara, Br. J. Dermatology 147, 1118, 2002]). 가래 T 림프구는 천식, COPD 및 정상 대상체에서 활성화된 IEL (CD69+ CD103+)이다 (문헌 [Leckie et. al., Thorax 58, 23, 2003]). CD103+ (aEb7+) CTL은 임상적 신장 동종이식 거부반응 동안 이식물 상피와 함께 축적된다 (문헌 [Hadley et al., Transplantation 72, 1548, 2001]). 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 베타7 인테그린-리간드 상호작용이 하나 이상의 상기 기재된 질환 상태와 같은 질환을 감소시키거나 경감시키는 것을 억제하는 본 발명의 베타7 길항제 항체의 용도를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 염증성 장 질환 (예를 들어 크론병 및 궤양성 결장염)을 포함하나 이에 제한되지 않는 염증성 질환, 염증성 간 질환, CNS의 염증, 만성 췌장염, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 건선 및 피부 염증, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 사이질 폐 질환, 알러지, 자가면역 질환, 이식 거부반응, 신장 이식 거부반응, 이식편대 숙주 질환, 당뇨병 및 암과 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에 사용된다.
일 측면에서, 본 발명은 염증성 장 질환 (예를 들어 크론병 또는 궤양성 결장염)을 포함하나 이에 제한되지 않는 염증 (예를 들어 자가면역 또는 염증성) 장애 및 알러지 반응 (예를 들어 호흡계, 피부, 관절, 알러지성 천식 및 베타7-함유 인테그린에 의해 매개된 알러지 반응에 의해 영향받는 다른 기관의 장애)과 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 핵산의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 염증성 장 질환 (예를 들어 크론병 또는 궤양성 결장염)을 포함하나 이에 제한되지 않는 염증 (예를 들어 자가면역 또는 염증성) 장애 및 알러지 반응 (예를 들어 호흡계, 피부, 관절, 알러지성 천식 및 베타7-함유 인테그린에 의해 매개된 알러지 반응에 의해 영향받는 다른 기관의 장애)과 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 발현 벡터의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 염증성 장 질환 (예를 들어 크론병 또는 궤양성 결장염)을 포함하나 이에 제한되지 않는 염증 (예를 들어 자가면역 또는 염증성) 장애 및 알러지 반응 (예를 들어 호흡계, 피부, 관절, 알러지성 천식 및 베타7-함유 인테그린에 의해 매개된 알러지 반응에 의해 영향받는 다른 기관의 장애)과 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 숙주 세포의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 염증성 장 질환 (예를 들어 크론병 또는 궤양성 결장염)을 포함하나 이에 제한되지 않는 염증 (예를 들어 자가면역 또는 염증성) 장애 및 알러지 반응 (예를 들어 호흡계, 피부, 관절, 알러지성 천식 및 베타7-함유 인테그린에 의해 매개된 알러지 반응에 의해 영향받는 다른 기관의 장애)과 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 제조품의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 염증성 장 질환 (예를 들어 크론병 또는 궤양성 결장염)을 포함하나 이에 제한되지 않는 염증 (예를 들어 자가면역 또는 염증성) 장애 및 알러지 반응 (예를 들어 호흡계, 피부, 관절, 알러지성 천식 및 베타7-함유 인테그린에 의해 매개된 알러지 반응에 의해 영향받는 다른 기관의 장애)과 같은 질환의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위한 의약의 제조에서의 본 발명의 키트의 용도를 제공한다.
본 발명은 베타7 인테그린 매개된 세포-세포 상호작용 과정의 조절이상과 관련된 질환 상태의 조절에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 베타7 인테그린은 예를 들어 염증성 장애 및 알러지 반응을 비롯한 다중 생물학적 및 물리학적 기능에 관여한다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 세포 또는 조직을 유효량의 본 발명의 항체와 접촉시킴으로써 림프구 또는 B-세포 상호작용 및 베타7 인테그린-발현 세포에의 결합이 억제되는 것을 포함하는, 베타7 인테그린 매개된 염증의 억제 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 대상체에게 투여함으로써 베타7 인테그린 결합의 조절이상과 관련된 병리학적 상태가 치료되는 것을 포함하는, 베타7 인테그린 결합의 조절이상과 관련된 병리학적 상태의 치료 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 베타7 인테그린을 발현하는 세포를 본 발명의 항체와 접촉시킴으로써 세포의 부착을 억제하거나 방지하고 염증성 반응의 감소를 유발하는 것을 포함하는, 베타7 인테그린 리간드를 발현하는 림프구 (예를 들어 MAdCAM, VCAM, E-카드헤린 또는 피브로넥틴을 발현하는 세포)의 베타7 인테그린 (예를 들어 알파4베타7 또는 알파E베타7 인테그린)을 발현하는 세포에의 결합의 억제 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체를 치료가 필요한 대상체에게 투여함으로써 염증성 장애를 효과적으로 치료하거나 예방하는 것을 포함하는, 베타7 인테그린의 증가된 발현 또는 활성 또는 하나의 세포 상의 베타7 인테그린 및 또다른 세포 상의 베타7 인테그린 수용체 사이의 증가된 상호작용과 관련된 염증성 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 염증성 장애는 염증성 장 질환 (IBD)이다. 또다른 실시양태에서, 상기 염증성 장애는 알러지 반응이다.
본 발명의 방법은 임의의 적합한 병리학적 상태, 예를 들어 베타7 인테그린 결합 경로의 조절이상과 관련된 세포 및/또는 조직에 영향을 주는데 사용될 수 있다. 베타7 인테그린은 백혈구 상에서 주로 발현된다 ([Tidswell, M. et al. (1997)] 상기 문헌). 일 실시양태에서, 백혈구는 본 발명의 방법에서 표적화되며, 베타7 인테그린의 리간드를 발현하는 세포에의 결합이 방지된다. 예를 들어, E-카드헤린을 발현하는 상피내 림프구는 본 발명의 방법에 따라 길항제 항-베타7 항체에 의해 알파E베타7-발현 세포에의 결합이 방지된다. MAdCAM, VCAM-1 또는 피브로넥틴을 발현하는 세포는 본 발명의 길항제 항-베타7 항체에 의해 알파4베타7을 발현하는 백혈구에의 결합이 방지된다.
본 발명의 방법은 추가의 치료 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 방법은 표적화된 세포 및/또는 조직 (예를 들어 장 내용물의 내피 세포)가 항-TNF 항체 또는 5-ASA 화합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 소분자 치료제에 노출되는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 베타7 인테그린은 그의 조절이상이 다수의 병리학적 상태를 초래하는 중요한 생물학적 과정을 매개한다. 따라서, 본 발명의 방법의 일 실시양태에서, 표적화되는 세포 (예를 들어 내피 세포)는 베타7 인테그린의 베타7 인테그린 리간드를 발현하는 세포 (세포는 제한 없이 림프구일 수 있으며, 리간드는 MAdCAM, VCAM 또는 E-카드헤린일 수 있음)의 부착이 본 발명의 항-베타7 길항제 항체의 부재하에서의 세포에 비해 붕괴되거나, 억제되거나, 방지되는 것이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 림프구 귀환을 억제함으로써, 베타7 인테그린 발현의 부위에서 염증을 억제한다. 예를 들어, 본 발명의 길항제와의 접촉은, 세포의 베타7 인테그린의 리간드를 발현하는 세포에의 부착 불능성을 초래한다.
도 1A 및 1B는 하기에 대한 가변 경쇄 및 중쇄의 서열의 정렬을 나타낸다: 경쇄 인간 아군 카파 I 컨센서스 서열 (도 1A, 서열 23), 중쇄 인간 아군 III 컨센서스 서열 (도 1B, 서열 24), 래트 항-마우스 베타7 항체 (Fib504) 가변 경쇄 (도 1A, 서열 10), 래트 항-마우스 베타7 항체 (Fib504) 가변 중쇄 (도 1B, 서열 11), 및 인간화 항체 변이체: 인간화 hu504K 이식물 가변 경쇄 (도 1A, 서열 25), 인간화 hu504K 이식물 가변 중쇄 (도 1B, 서열 26), 변이체 hu504.5 (인간화 hu504K 이식물로부터의 아미노산 변이체는 변이체 hu504.5, hu504.16 및 hu504.32에 대해 도 1A (경쇄) 및 도 1B (중쇄)에 지시됨). 베타7 결합 항체를 초래하는 hu504K 이식물의 HVR-H1 및 HVR-H2 내의 추가의 아미노산 치환은 도 1C에 지시된다.
도 2A 및 2B는 인간 컨센서스 아군 III 서열 경쇄 (도 2A, 서열 27) 및 중쇄 (도 2B, 서열 28)의 전장 서열을 나타낸다. HVR은 밑줄쳐 있다.
도 3A 및 3B는 인간 카파 I 컨센서스 서열 경쇄 (도 3A, 서열 29)로 및 인간 아군 III 컨센서스 서열 중쇄 (도 3B, 서열 30)로 이식된 래트 Fib504 초가변 영역 (본원에 기재된 바와 같음)을 함유하는 인간화504 이식물을 나타낸다. HVR은 밑줄쳐 있다.
도 4A 및 4B는 hu504 이식물의 경쇄의 위치 49가 Y49K 치환인 인간화 504K 이식물의 전장 서열을 나타낸다. hu504K 이식물 경쇄는 서열 31로 나타내어지며, hu504K 이식물 중쇄는 서열 30으로 나타내어진다. HVR은 밑줄쳐 있다.
도 5A 및 5B는 hu504 이식물의 중쇄의 위치 71 및 78이 hu504K 이식물 서열로부터의 A71R 치환 및 A78F 치환인 hu504K-RF 이식물의 전장 서열을 나타낸다. hu504K-RF 이식물 경쇄는 서열 31로 나타내어지고, hu504K-RF 이식물 중쇄는 서열 32로 나타내어진다. HVR은 밑줄쳐 있다.
도 6A 및 6B는 hu504K-RF 이식물 (서열 32)의 중쇄 및 hu504K 이식물 (서열 33)의 경쇄 내에 T31D 및 Y32L 치환을 포함하는 hu504.32 변이체의 전장 서열을 나타낸다. HVR은 밑줄쳐 있다.
도 7A 및 도 7B 및 도 8A 및 도 8B는 하기와 같은 서열 확인자를 갖는 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 예시적인 수용자 인간 컨센서스 프레임워크 서열을 나타낸다:
가변 경쇄 (VL) 컨센서스 프레임워크 (도 7A, B)
인간 VL 카파 아군 I 컨센서스 프레임워크 (서열 14)
인간 VL 카파 아군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 연장된 HVR-L2 (서열 15)
인간 VL 카파 아군 II 컨센서스 프레임워크 (서열 16)
인간 VL 카파 아군 III 컨센서스 프레임워크 (서열 17)
인간 VL 카파 아군 IV 컨센서스 프레임워크 (서열 18)
어두운 영역은 경쇄 HVR을 나타낸다 (L1, L2 및 L3으로 지시됨).
가변 중쇄 (VH) 컨센서스 프레임워크 (도 8A, B)
인간 VH 아군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 19)
인간 VH 아군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 영역 (서열 20 내지 22)
인간 VH 아군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 48)
인간 VH 아군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 영역 (서열 49 내지 51)
인간 VH 아군 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 52)
인간 VH 아군 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 영역 (서열 53 내지 55)
인간 VH 수용자 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 56)
인간 VH 수용자 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 영역 (서열 57 내지 58)
인간 VH 수용자 2 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 59)
인간 VH 수용자 2 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 영역 (서열 60 내지 62)
도 9A 및 9B는 하이브리도마 ATCC HB-293에 의해 생산된 래트 항-마우스 인테그린 베타7 Fib504 항체의 가변 쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. HVR은 밑줄쳐 있다. 가변 경쇄는 도 9A (서열 12)에 나타나 있으며, 가변 중쇄는 도 9B (서열 13)에 나타나 있다.
도 1OA는 다양한 컨센서스 서열 (hu 아군 I 내지 III)의 중쇄 내의 아미노산 위치를 나타낸다. 헤르셉틴(Herceptin)(등록상표) 항-HER2 항체, 래트 Fib504 및 hu504-RL 및 hu504-RF 프레임워크의 개발에 사용된 컨센서스 서열은 본원의 실시예에 기재되어 있다. 도 1OB는 실시예 1에 기재된 바와 같은 "RL" 또는 "RF" 프레임워크 변형의 함수로서의 알파4베타7의 hu504 이식물 항체 및 hu504K 이식물 항체에의 상대적인 결합을 나타내는 막대 그래프이다.
도 11A 내지 11C. 도 11A는 hu504.16 변이체 내의 아미노산 치환의 제한된 범위를 제공함으로써 수행된 친화도-성숙으로부터 초래된 HVR 변화를 표로 나타낸 것이다. 결과는 본원의 실시예 2에 기재된 바와 같은 hu504.16 변이체 내의 개별적으로 변형된 HVR을 갖는 라이브러리로부터이다. 박스 안의 아미노산 약어는 베타7-결합 항체 (파지-선택된 항체)에서 보다 빈번히 발견되는 아미노산이다. 도 11B 및 11C는 실시예 2의 돌연변이유발법 및 선별 방법에 의해 검출가능한 hu504.16 변이체 (경쇄, 도 11B; 중쇄, 도 11C) 내의 아미노산 치환의 수 및 형태를 지시하는 도 11A의 결과의 막대 그래프이다.
도 12는 실시예 2에 기재된 바와 같은 hu504.32 변이체의 HVR 내의 가능한 아미노산 치환의 넓은 범위를 제공함으로서 수행된 친화도 성숙의 결과를 표로 나타낸 것이다. 박스는 실시예 2의 돌연변이유발법 및 선별 방법에 의해 베타7-결합 항체로서 검출된 항체에서 가장 빈번히 검출된 아미노산을 지시한다.
도 13A 및 13B는 래트 항-마우스 Fib504 (ATCC-293) 및 인간 컨센서스 (좌측 컬럼)의 HVR 서열을 나타낸다. 실시예에 기재된 분석법에 의해 각각의 HVR 위치 (제한되는 것을 의미하지 않음)에 대해 관찰된 아미노산 치환 (연성 아미노산 무작위화, 광범위 아미노산 치환 스캔 및 제한된 아미노산 치환 스캔에 의해 관찰된 아 미노산 치환)의 예는 좌측에 나타나 있다 (본 발명의 변이체에 적용가능한 인간화에 대한 HVR을 변형하는 유용한 방법은 2004년 2월 19일자로 출원된 미국 출원 제60/545,840호에서 발견된다).
도 14는 실시예 3에 기재된 바와 같은 항체 농도의 함수로서의 MAdCAM에의 Fib504 및 변이체 항체 결합의 예시적인 그래프적 제시이다. 항체에 대한 IC50 및 IC90 값이 측정되었다.
도 15A 및 15B는 카바트 넘버링 시스템 및 항체의 6개의 HVR에 대한 상대적인 넘버링 시스템 (A 내지 F)에 따른 위치에 대한 504.32R 항-베타7 항체에 대한 경쇄 및 중쇄 HVR 아미노산 서열을 나타낸다. 중쇄 FR3 영역의 위치 71, 73 및 78에서의 아미노산이 또한 나타나 있다. 유용한 아미노산 치환이 또한 HVR 또는 중쇄 FR3 영역 내의 다수의 위치에 대해 열거되어 있다.
도 16은 504.32M 및 504.32R 항체가 방사성표지된 T 세포의 염증성 장 질환을 앓는 마우스의 결장에의 귀환을 차단하는 상대적인 능력의 막대 그래프를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 형태
본 발명은 베타7 신호전달 경로의 억제제를 확인하고/거나 이용하기 위한 방법, 조성물, 키트 및 제조품을 제공한다.
상기 방법, 조성물, 키트 및 제조품의 상세한 내용이 본원에서 제공된다.
일반적 기술
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는다면 당업자의 범위 내인 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994)]; ["A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988)]; ["Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001)]과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
정의
"베타7 서브유닛" 또는 "β7 서브유닛"은 인간 β7 인테그린 서브유닛을 의미한다 (문헌 [Erie et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:11009-11016]). 베타7 서브유닛은 인간 α4 서브유닛과 같은 알파4 인테그린 서브유닛과 관련된다 (문헌 [Kilger and Holzmann (1995) J. Mol. Biol. 73:347-354]). 알파4베타7 인테그린은 대다수의 성숙한 림프구, 뿐만 아니라 흉선세포, 골수 세포 및 비만 세포의 소집단 상에 발현된다 (문헌 [Kilshaw and Murant (1991) Eur. J. Immunol. 21:2591-2597]; [Gurish etal, (1992) 149: 1964-1972]; 및 [Shaw, S.K. and Brenner, M.B. (1995) Semin. Immunol. 7:335]). 베타7 서브유닛은 또한 인간 알파E 인테그린 서브유닛과 같은 알파E 서브유닛과 관련된다 (문헌 [Cepek, K.L, et al. (1993) J. Immunol. 150:3459]). 알파E베타7 인테그린은 장내 상피 림프구 (ilEL) 상에 발현된다 ([Cepek, K.L. (1993)] 상기 문헌). 본 발명의 인간화 항-베타7 항체에 결합하는 베타7 서브유닛은 천연적으로 발생될 수 있으며, 가용성이거나 세포의 표면에 편재될 수 있다.
"알파E 서브유닛" 또는 "알파E 인테그린 서브유닛" 또는 "αE 서브유닛" 또는 "αE 인테그린 서브유닛" 또는 "CD103"은, 알파E베타7 인테그린이 E-카드헤린을 발현하는 장 상피에의 iEL의 결합을 매개하는, 상피내 림프구 상의 베타7 인테그린과 관련된 것으로 밝혀진 인테그린 서브유닛을 의미한다 (문헌 [Cepek, K.L. et al. (1993) J. Immunol. 150:3459]; [Shaw, S.K. and Brenner, M.B. (1995) Semin. Immunol. 7:335]).
"MAdCAM" 또는 "MAdCAM-1"은 본 발명의 내용에서 호환적으로 사용되며, 짧은 세포질 꼬리, 막관통 영역, 및 3개의 이뮤노글로불린-유사 도메인으로 이루어진 세포외 서열을 포함하는 단일쇄 폴리펩티드인 단백질 점막 어드레신 세포 부착 분자-1을 지칭한다. 뮤린, 인간 및 짧은꼬리원숭이 MAdCAM-1에 대한 cDNA가 클로닝되었다 (문헌 [Briskin, et al, (1993) Nature, 363:461-464]; [Shyjan et al., (1996) J. Immunol. 156:2851-2857]).
"VCAM-1" 또는 "혈관 세포 부착 분자-1", "CD106"은 활성화된 내피 상에 발현되며 염증 동안 백혈구의 결합 및 이주와 같은 내피-백혈구 상호작용에 중요한 알파4베타7의 리간드를 지칭한다.
"E-카드헤린"은 E-카드헤린이 상피 세포 상에 발현되는 카드헤린의 족의 구 성원을 지칭한다. E-카드헤린은 알파E베타7 인테그린의 리간드이며, iEL-발현된 알파E베타7의 장 상피에의 결합을 매개하지만, 림프구 귀환에서의 그의 기능은 불명확하다. E-카드헤린 발현은 TGF-베타1에 의해 상향조절된다.
"피브로넥틴"은 조직 복구, 배아형성, 혈액 응고 및 세포 이동/부착에 관여하는 피브로넥틴을 지칭한다. 이는 ECM (세포외 매트릭스)에서 링커로서 및 혈장에서 발견된 이량체로서 (혈장 피브로넥틴) 기능한다. 혈장 형태는 간세포에 의해 합성되는 반면, ECM 형태는 섬유모세포, 연골세포, 내피 세포, 대식세포, 뿐만 아니라 특정 상피 세포에 의해 만들어진다. 본 내용에서, 이는 알파4베타7 인테그린과 상호작용하여 림프구 귀환 또는 부착의 측면을 매개한다. 피브로넥틴의 ECM 형태는 세포를 콜라겐 또는 프로테오글리칸 기질에 부착시킴으로써 일반적인 세포 부착 분자로서 기능한다. 피브로넥틴은 또한 세포외 기질의 상이한 구성원 및 세포 표면 상의 막-결합된 피브로넥틴 수용체에의 결합에 의한 ECM과의 세포 상호작용을 조직화하는 기능을 할 수 있다. 마지막으로, 피브로넥틴은 배아형성 동안 세포 이동 사건에 중요하다.
"위장관 염증성 장애"는 점막 내의 염증 및/또는 궤양을 유발하는 만성 장애의 군이다. 상기 장애로는 예를 들어 염증성 장 질환 (예를 들어, 크론병, 궤양성 결장염, 부정형 결장염 및 감염성 결장염), 점막염 (예를 들어 경구 점막염, 위장관 점막염, 비강 점막염 및 직장염), 괴사 소장결장염 및 식도염을 들 수 있다.
"염증성 장 질환" 또는 "IBD"는 본원에서 호환적으로 사용되며, 염증 및/또는 궤양을 유발하는 장의 질환을 지칭하고, 크론병 및 궤양성 결장염을 들 수 있으 나, 이에 제한되지는 않는다.
"크론병 (CD)" 또는 "궤양성 결장염 (UC)"은 병인이 알려지지 않은 만성 염증성 장 질환이다. 궤양성 결장염과는 다르게 크론병은 장의 임의의 부분에 영향을 줄 수 있다. 크론병의 가장 우세한 특징은 장 벽의 과립성의 적자색 부종성 비후이다. 염증의 발달과 함께, 상기 육아종은 종종 그의 주위를 둘러싼 경계를 잃으며, 주위의 조직과 통합된다. 설사 및 장의 폐쇄는 우세한 임상적 특징이다. 궤양성 결장염과 같이, 크론병의 과정은 연속적이거나 반복적이거나, 온건하거나 중증일 수 있지만, 궤양성 결장염과는 다르게 크론병은 장의 관련된 절편의 절제에 의해 치료가능하지 않다. 크론병을 갖는 대부분의 환자는 일부 지점에서 수술을 요하지만, 후속의 재발이 통상적이며 연속적인 의학 치료가 일상적이다.
크론병은 입으로부터 항문까지 소화관의 임의의 부분에 관여할 수 있지만, 전형적으로 이는 회결장, 소장 또는 결장-항문직장 영역에서 나타난다. 조직병리학적으로, 질환은 불연속성 육아종, 움농양, 열창 및 아프트 궤양에 의해 나타난다. 염증성 침윤은 혼합되고, 림프구 (T 및 B 세포 둘다), 혈장 세포, 대식세포 및 중성구로 이루어진다. IgM- 및 IgG-분비 혈장 세포, 대식세포 및 중성구에서의 불균형한 증가가 있다.
항-염증성 약물 술파살라진 및 5-아미노살리실산 (5-ASA)은 온건하게 활성인 결장 크론병을 치료하는데 유용하며, 질환의 완화를 유지하기 위해 통상적으로 처방된다. 메트로이다졸 및 시프로플록사신은 술파살라진과 효능에서 유사하며, 항문주위 질환의 치료에 특히 유용한 것으로 나타난다. 보다 중증 경우에서, 코르티 코스테로이드는 활성 악화를 치료하는데 효과적이며, 심지어 완화를 유지할 수 있다. 아자티오프린 및 6-머캅토퓨린은 또한 코르티코스테로이드의 만성 투여를 요하는 환자에서 성공적인 것으로 나타났다. 또한 상기 약물은 장기 예방에 역할을 할 수 있다. 불행히도, 일부 환자에서 작용의 개시 전에 매우 오랜 지연 (6개월 이하)이 있을 수 있다.
항설사 약물은 또한 일부 환자에서 증상적 완화를 제공할 수 있다. 영양 요법 또는 기본식은 환자의 영양 상태를 개선하고 급성 질환의 증상적 발달을 유도할 수 있지만, 이는 지연된 임상적 완화를 유도하지 않는다. 항생제는 이차 소장 박테리아 과잉성장의 치료 및 화농 합병증의 치료에 사용된다.
"궤양성 결장염 (UC)"은 대장을 나쁘게 한다. 질환의 과정은 연속성 또는 반복성, 온건 또는 중증일 수 있다. 초기 병변은 리버쿤와의 기저에서 농양 형성을 갖는 염증성 침윤이다. 상기 팽창되고 파열된 움의 융합은 혈액 공급으로부터 위에 놓인 점막을 분리하여 궤양을 유발한다. 질환의 증상은 복통, 하복부 통증, 직장 출혈, 및 소량 태아 입자를 갖는 혈액, 고름 및 점액으로 주로 이루어진 빈번한 느슨한 유출을 들 수 있다. 총 결장절제술은 급성, 중증 또는 만성 끊임없는 궤양성 결장염에 대해 요구될 수 있다.
UC의 임상적 특징은 매우 다양하며, 개시는 잠행성이거나 갑작스러울 수 있으며, 설사, 뒤무직 및 재발 직장 출혈을 들 수 있다. 전체 결장의 전격성 관련과 함께, 독성 거대결장증, 생명을 위협하는 응급사항이 일어날 수 있다. 장외 소견으로는 관절염, 괴저 화농, 포도막염 및 결절 홍반을 들 수 있다.
UC에 대한 치료는 온건 경우에 대해 술파살라진 및 관련 살리실레이트-함유 약물 및 중증 경우에 코르티코스테로이드 약물을 포함한다. 살리실레이트 또는 코르티코스테로이드의 국소 투여는, 특히 질환이 말단 장에 제한되고 전신성 용도에 비해 감소된 부작용과 관련될 경우 때때로 효과적이다. 철분 및 항설사제의 투여와 같은 지지적인 수단은 때때로 지시된다. 아파티오프린, 6-머캅토퓨린 및 메토트렉세이트는 또한 때때로 닌치성 코르티코스테로이드-의존성 경우에 사용하기 위해 처방된다.
본원에서 사용된 아미노산 잔기/위치의 "변형"은 출발 아미노산 서열에 비해 일차 아미노산 서열의 변화를 지칭하며, 상기 변화는 상기 아미노산 잔기/위치를 포함하는 서열 변경으로부터 초래된다. 예를 들어, 전형적인 변형은 잔기의 (또는 상기 위치에서) 또다른 아미노산으로의 치환 (예를 들어 보존적 또는 비-보존적 치환), 상기 잔기/위치에 인접한 하나 이상의 (일반적으로 5 또는 3 미만) 아미노산의 삽입, 및 상기 진기/위치의 결실을 포함한다. "아미노산 치환" 또는 그의 변형어는 예정된 (출발) 아미노산 서열의 기존의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 일반적으로 및 바람직하게는, 변형은 출발 (또는 "야생형") 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 비해 변이체 폴리펩티드의 하나 이상의 물리생화학적 활성의 변경을 초래한다. 예를 들어, 항체의 경우에, 변경되는 물리생화학적 활성은 표적 분자에 대한 결합 친화도, 결합 용량 및/또는 결합 효과이다.
본 발명의 범위 내에서 "아미노산"이라는 용어는 그의 가장 넓은 의미로 사 용되며, 천연 발생 L α-아미노산 또는 잔기를 포함하는 것을 의미한다. 천연 발생 아미노산에 대해 통상적으로 사용되는 1- 및 3-문자 약어가 본원에서 사용된다 (문헌 [Lehninger, A.L., Biochemistry, 2d ed., pp. 71-92, (Worth Publishers, New York, New York, 1975]). 상기 용어는 D-아미노산 뿐만 아니라 아미노산 유사체, 노르류신과 같은 단백질 내로 통상적으로 혼입되지 않는 천연 발생 아미노산 및 아미노산의 특징인 것으로 당업계에 공지된 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물과 같은 화학적으로 변형된 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 천연 Phe 또는 Pro와 펩티드 화합물의 동일한 형태적 제한을 허용하는 페닐알라닌 또는 프롤린의 유사체 또는 모방체는 본원에서 아미노산의 "기능적 등가물"로 지칭된다. 아미노산의 다른 예는 문헌 [Roberts and Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Gross and Meiehofer, Eds., Vol. 5, p. 341 (Academic Press, Inc., New York, New York, 1983]) (본원에 참고로 도입됨)에 열거되어 있다. 단일 문자가 천연 발생 아미노산의 하나를 표시하는데 사용될 경우, 명칭은 관련 문헌에서 통상적으로 발견되는 것과 같다 (예를 들어 문헌 [Alberts, B. et al. Molecular Biology of the Cell, 3rd ed., Garland Publishing, Inc. 1994, page 57] 참조).
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리되고/거나 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 간섭할 물질이며, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 들 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정된 바 로 항체 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과까지, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 15 잔기 이상의 N-말단 또는 내부 아미노산 서열을 수득하는데 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시(Coomassie) 블루, 또는 바람직하게는 실버 염료를 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 동질성으로 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 계내에서 재조합 세포 내의 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"카바트에서와 같이 넘버링된 가변 도메인 잔기" 또는 "카바트에서와 같이 넘버링된 아미노산 위치"라는 용어 및 그의 변형어는 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]의 항체의 편집체의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용되는 넘버링 체계를 지칭한다. 상기 넘버링 체계를 사용하면, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축화 또는 그 내로의 삽입에 상응하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따르면 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기 (예를 들어 카바트에 따르면 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 주어진 항체에 대해 "표준" 카바트 넘버링된 서열을 갖는 항체의 서열의 상동성의 영역에서의 정렬에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"이라는 어구 는 2개의 수치값 (일반적으로 본 발명의 항체와 관련된 하나 및 참조/비교자 항체와 관련된 다른 것) 사이의 유사성이 충분히 높은 정도여서 당업자가 상기 2개의 값 사이의 차이가 상기 값 (예를 들어 Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 내용 내에서 생물학적 및/또는 통계학적 유의성이 거의 없거나 전혀 없는 것으로 간주할 것을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교자 항체에 대한 값의 함수로서 바람직하게는 약 50％ 미만, 바람직하게는 약 40％ 미만, 바람직하게는 약 30％ 미만, 바람직하게는 약 20％ 미만, 바람직하게는 약 10％ 미만이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어 항체)와 그의 결합 상대 (예를 들어 항원)의 단일 결합 부위 사이의 비공유 상호작용의 전체 합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는다면, 본원에서 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어 항원과 항체) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 상대 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 비롯한 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 천천히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 보다 빨리 결합하고 보다 오래 결합을 유지한다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시양태는 하기에 기재된다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 비표지된 항원의 적 정 계열의 존재하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 후, 결합된 항체를 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도를 측정하는 분석법에 의해 기재된 바와 같이 관심의 항체의 Fab 형태 및 그의 항원으로 수행된 방사성표지된 항원 결합 분석법 (RIA)에 의해 측정된다 (문헌 [Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)]). 분석 조건을 수립하기 위해, 미세역가판 (다이넥스(Dynex))을 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs) 5 ㎍/mL으로 밤새 코팅하고, 이어서 PBS 중 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 실온 (대략 23℃)에서 2 내지 5시간 동안 차단시킨다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심의 Fab (예를 들어 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에서의 항-VEGF 항체인 Fab-12의 평가와 일치함)의 일련 희석액과 혼합한다. 그 후, 관심의 Fab를 밤새 인큐베이션한다. 하지만, 인큐베이션은 오랜 시간 동안 계속하여 (예를 들어 65시간) 평형 도달을 보장할 수 있다. 그 후, 혼합물을 실온에서 (예를 들어 1시간 동안) 인큐베이션하기 위해 포획 플레이트에 옮긴다. 그 후, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1％ 트윈(Tween)-20으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되면, 섬광액 (마이크로신트(MicroScint)-20; 패커드(Packard)) 150 ㎕/웰을 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 탑카운트(Topcount) 감마 계수기 (패커드) 상에서 계수한다. 최대 결합의 20％ 이하의 각각의 Fab의 농도를 경쟁적 결합 분석법에 사용하기 위해 선택한다. 또다른 실시양태에 따르면, Kd 또는 Kd 값 은 비아코어(상표명)-2000 또는 비아코어(상표명)-3000 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.))를 사용하여 약 10 반응 단위 (RU)에서 고정화된 항원 CM5로 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 분석법을 이용하여 측정한다. 간략히, 공급자의 지시서에 따라, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 1O mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)로 5 ㎍/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주사하여 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)에 도달시킨다. 항원의 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 비반응된 기를 차단시킨다. 동력학 측정을 위해, Fab의 2배 일련 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 대략 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ 트윈 20 (PBST)을 갖는 PBS에 주사한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 결합 및 해리 센서그램을 동시 적합화시킴으로써 단일 일대일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 이벨류에이션 소프트웨어(BIAcore Evaluation Software) 버전 3.2)를 이용하여 계산된다. 평형 해리 계수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산된다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 온-레이트(on-rate)가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1S-1을 초과할 경우, 온-레이트는 정지-플로우가 구비된 분광계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반된 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-이민코(Aminco) 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic)와 같은 분광계에서 측정된 바로, 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon"은 또한 비아코어(상표명)-2000 또는 비아코어(상표명)-3000 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 비아코어, 인크.)를 이용하여 25℃에서 고정화된 항원 CM 칩으로 약 10 반응 단위 (RU)에서 상기 기재된 동일한 표면 플라즈몬 공명 기술로 측정된다. 간략히, 공급자의 지시서에 따라, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 1O mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)로 5 ㎍/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주사하여 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)에 도달시킨다. 항원의 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 비반응된 기를 차단시킨다. 동력학 측정을 위해, Fab의 2배 일련 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 대략 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ 트윈 20 (PBST)을 갖는 PBS에 주사한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 결합 및 해리 센서그램을 동시 적합화시킴으로써 단일 일대일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 이벨류에이션 소프트웨어 버전 3.2)를 이용하여 계산한다. 평형 해리 계수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산된다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 그러나, 온-레 이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1S-1을 초과할 경우, 온-레이트는 정지-플로우가 구비된 분광계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반된 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-이민코 분광광도계 (써모스펙트로닉)와 같은 분광계에서 측정된 바로, 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술에 의해 측정될 수 있다. 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은 일 실시양태에서, 비표지된 항원의 적정 계열의 존재하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 후, 결합된 항체를 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도를 측정하는 분석법에 의해 기재된 바와 같이 항체의 Fab 형태 및 항원 분자로 수행된 방사성표지된 항원 결합 분석법 (RIA)에 의해 측정된다 (문헌 [Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)]). 분석 조건을 수립하기 위해, 미세역가판 (다이넥스)을 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스 5 ㎍/mL으로 밤새 코팅하고, 이어서 PBS 중 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 실온 (대략 23℃)에서 2 내지 5시간 동안 차단시킨다. 비-흡착 플레이트 (눈크 #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심의 Fab (예를 들어 문헌 [Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에서 항-VEGF 항체인 Fab-12의 평가와 일치함)의 일련 희석액과 혼합한다. 그 후, 관심의 Fab를 밤새 인큐베이션한다. 하지만, 인큐베이션은 오랜 시간 동안 계속하여 (예를 들어 65시간) 평형 도달을 보장할 수 있다. 그 후, 혼합물을 실온에서 (예를 들어 1시간 동안) 인큐베이션하기 위해 포획 플레이트에 옮긴다. 그 후, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1％ 트윈-20으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되면, 섬광액 (마이크로신트-20; 패커드) 150 ㎕/웰을 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 탑카운트 감마 계수기 (패커드) 상에서 계수한다. 최대 결합의 20％ 이하의 각각의 Fab의 농도를 경쟁적 결합 분석법에 사용하기 위해 선택한다. 또다른 실시양태에 따르면, Kd 또는 Kd 값은 비아코어(상표명) 2000 또는 비아코어(상표명) 3000 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 비아코어, 인크.)를 이용하여 고정화된 항원 CM5로 25℃에서 약 10 반응 단위 (RU)에서 표면 플라즈몬 공명 분석법을 이용하여 측정한다. 간략히, 공급자의 지시서에 따라, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 1O mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)로 5 ㎍/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주사하여 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)에 도달시킨다. 항원의 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 비반응된 기를 차단시킨다. 동력학 측정을 위해, Fab의 2배 일련 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 대략 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ 트윈 20 (PBST)을 갖는 PBS에 주사한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 결합 및 해리 센서그램을 동시 적합화시킴으로써 단일 일대일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 이벨류에이션 소프트웨어 버전 3.2)를 이용하여 계산한다. 평형 해리 계수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산된다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1S-1을 초과할 경우, 온-레이트는 바람직하게는 정지-플로우가 구비된 분광계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반된 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-이민코 분광광도계 (써모스펙트로닉)와 같은 분광계에서 측정된 바로, 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술에 의해 측정된다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon"은 또한 비아코어(상표명)-2000 또는 비아코어(상표명)-3000 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 비아코어, 인크.)를 이용하여 25℃에서 고정화된 항원 CM5 칩으로 약 10 반응 단위 (RU)에서 상기 기재된 동일한 표면 플라즈몬 공명 기술로 측정된다. 간략히, 공급자의 지시서에 따라, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 1O mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)로 5 ㎍/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주사하여 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)에 도달시킨다. 항원의 주사 후, 1M 에탄올아민을 주사하여 비반응된 기를 차단시킨다. 동력학 측정을 위해, Fab의 2배 일련 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃ 에서 대략 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ 트윈 20 (PBST)을 갖는 PBS에 주사한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 결합 및 해리 센서그램을 동시 적합화시킴으로써 단일 일대일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 이벨류에이션 소프트웨어 버전 3.2)를 이용하여 계산한다. 평형 해리 계수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]을 참조한다. 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1S-1을 초과할 경우, 온-레이트는 바람직하게는 정지-플로우가 구비된 분광계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반된 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-이민코 분광광도계 (써모스펙트로닉)와 같은 분광계에서 측정된 바로, 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 PBS (pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술에 의해 측정된다.
본원에서 사용된 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"이라는 어구는 2개의 수치값 (일반적으로 본 발명의 항체와 관련된 하나 및 참조/비교자 항체와 관련된 다른 것) 사이의 차이가 충분히 높은 정도여서 당업자가 상기 2개의 값 사이의 차이가 상기 값 (예를 들어 Kd 값, HAMA 반응)에 의해 측정된 생물학적 특징의 내용 내에서 통계학적 유의성이 있는 것으로 간주할 것을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교자 항체에 대한 값의 함수로서 바람직하게는 약 10％ 초과, 바람직하게는 약 20％ 초과, 바람직하게는 약 30％ 초과, 바람직하게는 약 40％ 초과, 바람직하게는 약 50％ 초과이다.
펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일률 (％)"은 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭(gap)을 도입하여 최대 서열 동일률을 달성하며, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환은 전혀 고려하지 않은 후에, 특이적 펩티드 또는 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기 비율 (％)로서 규정된다. 아미노산 서열 동일률 (％)의 결정을 목적으로 한 정렬은 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 블라스트(BLAST), 블라스트-2, 얼라인(ALIGN), 또는 맥얼라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내의 다양한 방식으로 달성할 수 있다. 당업자는 정렬을 측정하는데 비교될 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일률 (％) 값은 서열 비교용 컴퓨터 프로그램 얼라인-2를 사용하여 생성시키는데, 얼라인-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 A에 제공된다. 얼라인-2 서열 비교용 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.)에 의해 만들어졌고, 하기 표 A에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권국 (U.S. Copyright Office, 워싱턴 D.C., 20559)에 사용자 문서로 출원되었는데, 이는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. 얼라인-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코에 소재하는 제넨테크, 인크.를 통하여 공개적으로 입수가능하거나, 또는 하기 도 8에 제공된 원시 코드로부터 편집할 수 있다. 얼라인-2 프로그램은 유닉스(UNIX) 작동 시스템, 바람직하게는 디지털 유닉스 V4.0D 상에서 사용하도록 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터가 얼라인-2 프로그램에 의해 설정되고 이는 달라지지 않는다.
아미노산 서열 비교를 위해 얼라인-2를 이용하는 상황 하에서는, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이와의 또는 이에 대항한 소정의 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일률 (％) (대안적으로, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이와의 또는 이에 대항한 특정의 아미노산 서열 동일률 (％)을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산한다:
100 x 분율 X/Y
상기에서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매칭물 (match)로서 스코어링된 아미노산 잔기 수이고; Y는 B 중의 아미노산 잔기 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우에는, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일률 (％)이 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일률 (％)과 동일하지 않다는 것을 인지해야 할 것이다.
구체적으로 달리 언급되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일률 ％ 값은 얼라인-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 선행 문단에서 기재된 바와 같이 수득된다.
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본원에서 사용된 "벡터"라는 용어는, 그것이 연결된 또다른 핵산으로 이동할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 벡터의 또다른 유형은 파지 벡터이다. 벡터의 또다른 유형은 바이러스 벡터이며, 여기서 추가의 DNA 절편은 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자기 복제할 수 있다 (예를 들어 박테리아 복제 원점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지정할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "재조합 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는, 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문에 호환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 호환적으로 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재할 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조합 전후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지와의 컨쥬게이션에 의해서와 같이 합성 후 추가로 변형될 수 있다. 변형의 다른 형태로는 예를 들어 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드가 유사체로 치환되는 "캡", 예를 들어 비하전된 결합 (예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등)을 갖는 것들 및 하전된 결합 (예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것들, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, ply-L-리신 등)과 같은 펜던트 잔기를 함유하는 것들, 인터칼레이터(intercalator) (예를 들어 아크리딘, 프소랄렌 등)을 갖는 것들, 킬레이터 (예를 들어 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 것들, 알킬레이터를 함유하는 것들, 변형된 결합 (예를 들어 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것들과 같은 뉴클레오티드 변형, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형된 형태를 들 수 있다. 또한, 당에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실기는 예를 들어 표준 보호기에 의해 보호된, 또는 추가의 뉴클레오티드에의 추가의 결합을 만들기 위해 활성화된 포스포네이트기, 포스페이트기로 대체될 수 있거나, 고체 또는 반-고체 지지체에 컨쥬게이션될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 탄소 원자수 1 내지 20의 아민 또는 유기 캡핑기 잔기로 인산화되거나 대체될 수 있다. 다른 히드록실은 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예를 들어 아라비노스, 크실로스 또는 릴록스, 피라노스 당, 파라노스 당, 세도헵툴로스, 아크릴산 유사체 및 비염기성 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 메틸 리보시드를 비롯한, 당업계에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사한 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합은 별도의 연결기로 대체될 수 있다. 상기 별도의 연결기로는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), "(O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는 에테르 (-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜을 임의로 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬 (1-20 C.)임)인 실시양태를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 선행 기재는 RNA 및 DNA를 비롯한 본원에서 지칭된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에서 사용된 "올리고뉴크레오티드"는 반드시 그럴 필요는 없지만 일반적으로 길이가 약 200 뉴클레오티드 미만인, 짧은 일반적으로 단일 가닥인, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. "올리고뉴크레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 상호 배타적이다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 대해서 동일하고 완전하게 적용가능하다.
"항체" 및 "이뮤노글로불린"이라는 용어는 가장 넓은 의미에서 호환적으로 사용되며, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 비손상(intact) 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 그들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체)를 포함하며, 또한 (본원에서 보다 상세히 기재된 바와 같은) 특정 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체는 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙된 항체일 수 있다.
"항체 단편"은 비손상 항체의 일부분만을 포함하며, 상기 부분은 바람직하게는 비손상 항체에 존재할 경우 상기 부분과 통상적으로 관련되는 하나 이상의, 바람직하게는 대부분 또는 모든 기능을 보유한다. 일 실시양태에서, 항체 단편은 비손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하며, 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 또다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 것은 FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합과 같은 비손상 항체에 존재할 경우 Fc 영역과 통상적으로 관련되는 하나 이상의 생물학적 기능을 보유한다. 일 실시양태에서, 항체 단편은 생체내 반감기가 비손상 항체와 실질적으로 유사한 일가 항체이다. 예를 들어 이러한 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 팔(arm)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원에 대해 지정된다. 또한, 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지정된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제조물에 비해, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지정된다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면 쇄(들)의 나머지는 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 및 그들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
비-인간 (예를 들어 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분, 인간화 항체는 수여자의 초가변 영역으로부터의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수여자 항체)이다. 일부의 예에서, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형이 이루어져 항체 성능을 추가로 개량한다. 일반적으로, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프가 비-인간 이뮤노글로불린의 그것과 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 이뮤노글로불린 서열의 그것인 실질적으로 모든 하나 이상의, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 일부분의 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 그것을 포함할 것이다. 추가의 상세한 사항에 대해서는 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 하기 검토 논문 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다: 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
"항원"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 예정된 항원이다. 표적 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 다른 천연 발생 또는 합성 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 표적 항원은 폴리펩티드이다. 본원의 목적을 위한 "수용자 인간 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 프레임워크로부터, 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크, 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 기존의 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 기존의 아미노산 변화가 존재할 경우, 바람직하게는 5개 이하, 바람직하게는 4개 이하 또는 3개 이하의 기존의 아미노산 변화가 존재한다. 기존의 아미노산 변화가 VH에 존재할 경우, 바람직하게는 상기 변화는 위치 71H, 73H 및 78H 중 3개, 2개 또는 하나에서만이며, 예를 들어 상기 위치에서의 아미노산 잔기는 71A, 73T 및/또는 78A일 수 있다. 일 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열에 대한 서열과 동일하다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터이다. 일반적으로, 서열의 하위군은 카바트 등에서와 같은 하위군이다. 일 실시양태에서, VL에 대해, 하위군은 카바트 등에서와 같은 하위군 카파 I이다. 일 실시양태에서, VH에 대해, 하위군은 카바트 등에서와 같은 하위군 III이다.
"VL 하위군 I 컨센서스 프레임워크"는 카바트 등의 가변 경쇄 하위군 I의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 하기 서열 중 적어도 일부 또는 전부를 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 34)-L1-WYQQKPGKAPKLLY (서열 35)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 36)-L3-FGQGTKVEIK (서열 37).
"VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크"는 카바트 등의 가변 중쇄 하위군 III에서의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 하기 서열 중 적어도 일부 또는 전부를 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 38)-H1-WVRQAPGKGLEWV (서열 39)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (서열 40)-H3-WGQGTLVTVSS (서열 41).
"비변형된 인간 프레임워크"는 예를 들어 수용자 인간 프레임워크에서 비-인간 아미노산으로의 인간 아미노산 치환(들)이 없는 수용자 인간 프레임워크와 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간 프레임워크이다.
본원의 목적을 위한 "변경된 초가변 영역"은 그에 하나 이상의 (예를 들어 1 내지 약 16개) 아미노산 치환(들)을 포함하는 초가변 영역이다.
본원의 목적을 위한 "비-변형된 초가변 영역"은 그것이 유래된 비-인간 항체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역, 즉 그에 하나 이상의 아미노산 치환이 없는 것이다.
본원에서 사용될 경우 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열 및/또는 형태 구조적으로 한정된 루프에서 초가변인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함한다: VH에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL에 3개 (L1, L2, L3). 다수의 초가변 영역 묘사가 사용중이며, 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 변이성을 기초로 하며, 가장 통상적으로 사용된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Protenis of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 대신 지칭한다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM 초가변 영역은 카바트 CDR과 코티아 구조적 루프 사이의 타협안을 나타내며, 옥스포드 몰리큘러(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" 초가변 영역은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 각각의 상기 초가변 영역으로부터의 잔기를 하기에 나타낸다.
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초가변 영역은 하기와 같은 "연장된 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL에서 24 내지 36 또는 24 내지 34 (L1), 46 내지 56 또는 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3), 및 VH에서 26 내지 35 (H1), 50 내지 65 또는 49 내지 65 (H2), 93 내지 102, 94 내지 102 또는 95 내지 102 (H3). 가변 도메인 잔기는 상기 정의의 각각에 대해 카바트 등의 상기 문헌에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 인간 항체 제조 기술을 이용하여 제조된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 상기 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
"친화도 성숙된" 항체는 상기 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해, 항원에 대한 항체의 친화도의 개선을 초래하는 하나 이상의 그의 CDR에서 하나 이상의 변경을 갖는 것이다. 바람직한 친화도 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙된 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생성된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화도 성숙이 기재되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에서 사용된 "아고니스트 항체"는 관심의 폴리펩티드의 하나 이상의 기능적 활성을 모방하는 항체이다.
"장애"는 본 발명의 물질/분자 또는 방법을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 임의의 상태이다. 이는 포유동물을 문제의 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 상태를 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료될 장애의 비-제한적 예로는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프양 악성종양; 신경, 아교, 별아교, 시상하부 및 기타 선, 대식세포, 표피, 위 및 모세포(blastocoelic) 장애; 및 염증성, 면역원성 및 기타 혈관신생-관련된 장애를 들 수 있다.
"면역 관련된 질환"이라는 용어는 포유동물의 면역계의 성분이 포유동물에서 이환을 유발하거나 매개하거나, 다르게는 기여하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 개재가 질환의 진행에 개량 효과를 갖는 질환이 포함된다. 상기 용어 내에는 면역-매개된 염증성 질환, 비-면역-매개된 염증성 질환, 감염성 질환, 면역결핍성 질환, 신생물 등이 포함된다.
일부가 면역 또는 T 세포 매개되고, 본 발명에 따라 치료될 수 있는 면역-관련된 및 염증성 질환의 예로는 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 연소성 만성 관절염, 척추관절병증, 전신성 경화증 (공피증), 특발성 염증성 근육병증 (피부근육염, 다발근육염), 쇼그렌 증후군, 전신성 혈관염, 사르코이드증, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역성 범혈구감소증, 발작성 야간혈색소뇨증), 자가면역 저혈소판증 (특발성 혈소판감소성 자색반증, 면역-매개된 저혈소판증), 갑상선염 (그레이브병, 하시모토 갑상선염, 소아 림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 당뇨병, 면역-매개된 신장 질환 (사구체신염, 뇨세관간질 신장염), 중추 및 말초 신경계의 수초제거 질환, 예를 들어 다발성 경화증, 특발성 수초제거 다발신경병증 또는 길랑-바레 증후군 및 만성 염증성 수초제거 다발신경병증, 간담즙 질환, 예를 들어 감염성 간염 (A, B, C, D, E형 간염 및 기타 비-간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담관성 간경화증, 육아종 간염 및 경화성 담관염, 염증성 장 질환 (궤양성 결장염: 크론병), 글루텐-민감성 장병증 및 휘플병, 자가면역 또는 면역-매개된 피부 질환, 예를 들어 수포성 피부 질환, 다형 홍반 및 접촉 피부염, 건선, 알러지 질환, 예를 들어 천식, 알러지성 비염, 아토피 피부염, 음식 과민증 및 두드러기, 폐의 면역학적 질환, 예를 들어 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴, 이식 관련된 질환, 예를 들어 이식편 거부반응 및 이식편대 숙주 질환을 들 수 있다. 감염성 질환으로는 바이러스 질환, 예를 들어 AIDS (HIV 감염), A, B, C, D 및 E형 간염, 헤르페스 등, 박테리아 감염, 진균 감염, 원충 감염 및 기생충 감염을 들 수 있다.
본원에서 호환적으로 사용된 "자가면역 장애" 또는 "자가면역 질환"은 개체 자신의 조직에 대해 일어나고 지정된 비-악성 질환 또는 장애이다. 본원에 기재된 자가면역 질환은 구체적으로 악성 또는 암성 질환 또는 상태를 배제하며, 특히 B 세포 림프종, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발상 세포 백혈병 및 만성 골수모세포 백혈병을 배제한다. 자가면역 질환 또는 장애의 예로는 염증성 반응, 예를 들어 건선 및 피부염 (예를 들어 아토피 피부염)을 비롯한 염증성 피부 질환; 전신성 공피증 및 경화증; 염증성 장 질환 (예를 들어 크론병 및 궤양성 결장염)과 관련된 반응; 호흡 곤란 증후군 (성인 호흡 곤란 증후군; ARDS 포함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 결장염; 사구체신염; 알러지성 상태, 예를 들어 습진 및 천식, 및 T 세포의 침윤과 관련된 기타 상태 및 만성 염증성 반응; 죽상동맥경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류마티스성 관절염; 전신성 홍반성 루푸스 (SLE); 당뇨병 (예를 들어 I형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노(Reynaud) 증후군; 자가면역 갑상선염; 알러지성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 유년 발병형 당뇨병; 및 결핵, 사르코이드증, 다발근육염, 육아종증 및 혈관염에서 전형적으로 발견되는 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연된 과민증과 관련된 면역 반응; 악성 빈혈 (애디슨병); 백혈구 혈구누출과 관련된 질환; 중추 신경계 (CNS) 염증성 장애; 다발성 기관 손상 증후군; 용혈성 빈혈 (한랭글로불린혈증 또는 쿰브스 양성 빈혈을 포함하나 이에 제한되지 않음); 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 매개된 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질 증후군; 알러지성 신경염; 그레이브스병; 램버트-이튼 근무력증 증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다중내분비병증; 라이터병; 근육강직 증후군; 베체트병; 거대세포 동맥염; 면역 복합 신장염; IgA 신장병증; IgM 신경병증; 면역 혈소판감소 자색반증 (ITP) 또는 자가면역 저혈소판증 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
"위장관 염증성 장애"라는 용어는 점막에서 염증 및/또는 궤양을 유발하는 만성 장애의 군이다. 따라서, 상기 용어는 염증성 장 질환 (예를 들어, 크론병, 궤양성 결장염, 부정형 결장염 및 감염성 결장염), 점막염 (예를 들어 경구 점막염, 위장관 점막염, 비강 점막염 및 직장염), 괴사성 장결장염 및 식도염을 포함한다.
"세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"라는 용어는 일부 정도의 비정상적 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다. 일 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
본원에서 사용된 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에서 언급된 바와 같이 상호 배타적이지 않다.
"암" 및 "암성"이라는 용어는 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 이를 묘사한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예로는 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막의 암, 간세포성 암, 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장결장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간 암종, 및 다양한 종류의 두경부암을 들 수 있다.
혈관신생의 조절곤란은 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 많은 장애를 초래할 것이다. 상기 장애는 비-신생물 및 신생물 상태 둘다를 포함한다. 신생물로는 상기 기재된 것들을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 비-신생물 장애로는 바람직하지 않은 또는 비정상적인 비대증, 관절염, 류마티스성 관절염 (RA), 건선, 건선 플라크, 사르코이드증, 죽상동맥경화증, 죽상동맥경화 플라크, 당뇨 및 기타 증식성 망막병증, 예를 들어 미숙의 망막병증, 수정체후부 섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 연령-관련 황반 퇴행, 당뇨병성 황반 부종, 각막 혈관신생, 각막 이식 혈관신생, 각막 이식 거부반응, 망막/맥락막 혈관신생, 각 (홍채)의 혈관신생, 안구 신생혈관 질환, 혈관 재협착, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 비대증 (그라브병 포함), 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 원발성 폐 고혈압증, 악성 폐 삼출, 뇌 부종 (예를 들어, 급성 뇌졸중/폐쇄 두부 손상/외상과 관련된), 윤활막 염증, RA에서의 판누스 형성, 골화 근육염, 비대성 골 형성, 골관절염 (OA), 난치성 복수, 다낭성 난소 질환, 자궁내막증, 체액 질환의 3차 스페이싱 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 자궁 섬유증, 조숙분만 진통, 만성 염증, 예를 들어 IBD (크론병 및 궤양성 결장염), 신장 동종이식 거부반응, 염증성 장 질환, 신장 증후군, 바람직하지 않은 또는 비정상 조직 덩어리 성장 (비-암), 혈우병성 관절, 비대성 흉터, 모발 성장의 억제, 오슬러-웨버(Osler-Weber) 증후군, 화농성 육아종 수정체후 섬유증식증, 공피증, 트라코마, 혈관 유착, 윤활막염, 피부염, 자간전증, 복수, 심낭 삼출 (예를 들어 심장막염과 관련된 것), 및 흉막 삼출을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용된 "치료"라는 용어는 치료될 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경하려는 시도에서의 임상적인 개입을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상적 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 목적하는 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 감소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 예후의 개선을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 장애의 발달을 지연시키는데 사용된다.
"유효량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 및 시간 동안 유효한 양을 지칭한다.
본 발명의 물질/분자, 아고니스트 또는 길항제의 "치료 유효량"은 질환 상태, 연령, 성별 및 개체의 체중, 및 물질/분자, 아고니스트 또는 길항제가 개체에서 목적하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 치료 유효량은 또한 물질/분자, 아고니스트 또는 길항제의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료적으로 유익한 효과에 의해 능가되는 것이다. "예방 유효량"은 목적하는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 및 시간 유효한 양을 지칭한다. 반드시 그럴 필요는 없지만 전형적으로, 예방 투여량은 질환의 초기 상태 전에 또는 그때에 대상체에게 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다.
본원에서 사용된 "세포독성제"라는 용어는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At211 , I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 중격제, 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵분해 효소, 항생제, 및 독소, 예를 들어 소분자 독소, 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 및 그의 단편 및/또는 변이체, 및 하기 개시된 다양한 항종양제 및 항암제를 포함한다. 다른 세포독성제는 하기에 기재되어 있다. 살종양제(tumoricidal agent)는 종양 세포의 파괴를 유발한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN)(등록상표) 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)(등록상표)); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히신; 베툴린산; 캄토테신 (합성 유사체 토포테칸 (히캄틴(HYCAMTIN(등록상표)) 포함), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)(등록상표)), 아세틸캄토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류트레로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 에네디인 항생제 (예를 들어 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마 II 및 칼리케아미신 오메가 II (예를 들어 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조); 디네미신 A를 비롯한 디네미신; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 크로모포르 및 관련 크로모프로테인 에네디인 항생제 크로모포르), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)(등록상표) 독소루비신, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C와 같은 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예를 들어 메토트렉세이트, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플룩수리딘, 항-아드레날린제, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 루니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표) 다당류 복합체 (미국 오레곤주 유진에 소재하는 JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products)); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘; 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)(등록상표), 필데신(FILDESIN)(등록상표)); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 탁솔(TAXOL)(등록상표) 파클리탁셀 (미국 뉴저지주 프린스톤에 소재하는 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology)), 아브락산(ABRAXANE)(상표명) 크레모포어-무함유 파클리탁셀의 알부민-유전자조작된 나노입자 제제 (미국 일리노이주 샤움버그에 소재하는 아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners)), 및 탁소테레(TAXOTERE)(등록상표) 도세탁셀 (프랑스 안토니에 소재하는 롱-플랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer)); 클로란부실; 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)(등록상표)); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 플라티눔 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)(등록상표)), 플라티눔; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)(등록상표)), 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)(등록상표)); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소메라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산, 카페시타빈 (크셀로다(XELODA)(등록상표)); 임의의 상기 것들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 것들의 2종 이상의 조합, 예를 들어 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴(ELOXATIN(상표명))을 사용한 치료 처방의 약어 폴폭스(FOLFOX)를 들 수 있다.
또한, 상기 정의에는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하며 종종 전신 또는 전체-신체 치료의 형태인 항-호르몬제가 포함된다. 이는 호르몬 자체일 수 있다. 그 예로는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절자 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)(등록상표) 타목시펜), 에비스타(EVISTA)(등록상표) 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 테옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON)(등록상표) 토레미펜 포함); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 난소를 저해하거나 막는 기능을 하는 작용제, 예를 들어 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 아고니스트, 예를 들어 루프론(LUPRON)(등록상표) 및 엘리가르드(ELIGARD)(등록상표) 류프롤리드 아세테이트, 고세릴린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린; 다른 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가스(MEGASE)(등록상표) 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)(등록상표) 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)(등록상표) 보로졸, 페마라(FEMARA)(등록상표) 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)(등록상표) 아나스트로졸을 들 수 있다. 또한, 화학요법제의 이러한 정의에는 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트 (예를 들어 보네포스(BONEFOS)(등록상표) 또는 오스타크(OSTAC)(등록상표)), 디드로칼(DIDROCAL)(등록상표) 에티드로네이트, NE-58095, 조메타(ZOMETA)(등록상표) 틸루드로네이트 또는 악토넬(ACTONEL)(등록상표) 리세드로네이트; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴크레오티드; 특히 비정상적 세포 증식과 관련된 신호전달 경로에서 유전자 발현을 억제하는 것들, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 빈카, 예를 들어 테라토프(THERATOPE)(등록상표) 백신 및 유전자 백신; 루르토테칸(LURTOTECAN)(등록상표) 토포이소머라제 1 억제제, 아바렐릭스(ABARELIX)(등록상표) rmRH; 라파티니브 디토실레이트 (ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소-분자 억제제 (GW572016으로도 공지됨)) 및 임의의 상기 것들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에서 사용될 경우 "성장 억제제"는 그의 성장이 HGF/c-met 활성화에 의존하는 세포의 성장을 시험관내 또는 생체내에서 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성정 억제제는 S기의 HGF/c-met-의존성 세포의 퍼센트를 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예로는 G1 정지 및 M-기 정지를 유도하는 제제와 같은 세포 주기 진행 (S 기 이외의 장소에서)을 차단하는 제제를 들 수 있다. 전통적인 M-기 차단제로는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신과 같은 토포이소머라제 II 억제제를 들 수 있다. 정지 G1이 또한 S-기 정지 내로 넘어가는 제제는 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C와 같은 DNA 알킬화제이다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)], 특히 제13면에서 발견할 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘다 주목 나무로부터 유래된 항암 약물이다. 유럽 주목으로부터 유래된 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE(등록상표), 롱-플랑 로러)는 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)(등록상표), 브리스톨-마이어스 스퀴브)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미소구의 집합을 촉진시키며, 탈중합을 방지함으로써 미소구를 안정화시켜, 세포 내의 유사분열의 억제를 초래한다.
"독소루비신"은 안트라시클린 항생제이다. 독소루비신의 완전한 화학명은 (8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온이다.
본 발명의 길항제 항-베타7 항체를 사용한 조합 요법에 유용한 화합물은 항체 (다른 항-베타7 길항제 항체 (Fib 21, 22, 27, 30 ([Tidswell, M. (1997)] 상기 문헌) 또는 그의 인간화 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않음), 항-알파4 항체 (예를 들어 안테겐(ANTEGEN)(등록상표), 항-TNF (레미카드(REMICADE)(등록상표)) 또는 비-단백질, 예를 들어 5-ASA 화합물 아사콜(ASACOL)(등록상표), 펜타사(PENTASA)(상표명), 로와사(ROWASA)(상표명), 콜라잘(COLAZAL)(상표명)을 포함 (이에 제한되지 않음), 및 푸리네톨과 같은 다른 화합물 및 프레드니손과 같은 스테로이드를 들 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 길항제 항-베타7 항체를 단독으로, 또는 염증의 치료에 또한 유용한 제2 화합물과 조합으로 사용한, 인간 환자와 같은 환자의 치료 방법을 포함한다. 일 실시양태에서, 제2 화합물은 Fib 21, 22, 27, 30, 또는 그의 인간화 유도체, 항-알파4 항체, 안테겐(등록상표), 항-TNF, 레미카드(등록상표), 5-ASA 화합물, 아사콜(등록상표), 펜타사(상표명), 로와사(상표명), 콜라잘(상표명), 푸리네톨, 스테로이드 및 프레드니손으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명의 길항제 항-베타7 항체의 투여는 제2 화합물의 투여량을 실질적으로 감소시킨다. 일 실시양태에서, 제2 화합물의 투여량의 상기 감소는 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상이다. 본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명의 항체 및 감소된 투여량의 제2 화합물의 조합물은 환자에서의 증상을 제2 화합물 단독의 투여보다 실질적으로 동일한 정도로 또는 우수하게 완화시킨다.
감소된 HAMA 반응을 나타내거나 HAMA 반응이 없는 변이체 항체의 생성
HAMA 반응의 감소 또는 제거는 적합한 치료제의 임상적 개발의 중요한 측면이다. 예를 들어 문헌 [Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937]; [Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572]; [Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530]; [Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138]; [Miller et al., Blood (1983), 62:988]; [Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352]; [Reichmann et al., Nature (1988), 332:323]; [Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495]을 참조한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 HAMA 반응이 감소되거나 제거된 인간화된 항체를 제공한다. 상기 항체의 변이체는 또한 그 중 일부가 하기에 기재된 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용하여 수득될 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항체로부터의 아미노산 서열은 프레임워크 및/또는 초가변 서열(들)의 다양화를 위한 출발 (모) 서열로서 기능할 수 있다. 출발 초가변 서열이 연결된 선택된 프레임워크 서열은 본원에서 수용자 인간 프레임워크로 지칭된다. 수용자 인간 프레임워크가 인간 이뮤노글로불린 (그의 VH 및/또는 VH 영역)으로부터이거나 그로부터 유래될 수 있는 반면, 바람직하게는 수용자 인간 프레임워크는 인간 컨센서스 프레임워크 서열로부터이거나 그로부터 유래되는데, 이는 이러한 프레임워크가 인간 환자에서 면역원성이 최소이거나 없는 것으로 입증되었기 때문이다.
수용자가 인간 이뮤노글로불린으로부터 유래될 경우, 공여자 프레임워크 서열을 인간 프레임워크 서열의 집합으로 다양한 인간 프레임워크 서열로 정렬함으로써 공여자 프레임워크 서열에 대한 그의 상동성에 기초하여 선택된 인간 프레임워크 서열을 임의로 선택하고, 수용자와 가장 상동성인 프레임워크 서열을 선택할 수 있다.
일 실시양태에서, 본원에서 인간 컨센서스 프레임워크는 VH 하위군 III 및/또는 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 서열로부터이거나 그로부터 유래된다.
따라서, VH 수용자 인간 프레임워크는 하기 프레임워크 서열 중 1, 2, 3개 또는 전부를 포함할 수 있다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 38)를 포함하는 FR1,
WVRQAPGKGLEWV (서열 39)를 포함하는 FR2,
RFTISX1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYC (여기서, X1은 A 또는 R이고, X2는 T 또는 N이고, X3은 A 또는 L임) (서열 42)를 포함하는 FR3,
WGQGTLVTVSS (서열 41)를 포함하는 FR4.
VH 컨센서스 프레임워크의 예로는 다음을 들 수 있다.
인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 19);
인간 VH 하위군 I 컨센서스 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 영역 (서열20 내지 22);
인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 48);
인간 VH 하위군 II 컨센서스 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 영역 (서열 49 내지 51);
인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 52);
인간 VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 영역 (서열 53 내지 55);
인간 VH 수용자 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 56);
인간 VH 수용자 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 영역 (서열 57 내지 58);
인간 VH 수용자 2 프레임워크 마이너스 카바트 CDR (서열 59); 또는
인간 VH 수용자 2 프레임워크 마이너스 연장된 초가변 영역 (서열 60 내지 62).
일 실시양태에서, VH 수용자 인간 프레임워크는 하기 프레임워크 서열 중 1, 2, 3개 또는 전부를 포함한다.
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 38)를 포함하는 FR1,
WVRQAPGKGLEWV (서열 39)를 포함하는 FR2,
RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (서열 43),
RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (서열 44),
RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (서열 45),
RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (서열 46) 또는
RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (서열 41)을 포함하는 FR3
WGQGTLVTVSS (서열 45)를 포함하는 FR4.
VL 수용자 인간 프레임워크는 하기 프레임워크 서열 중 1, 2, 3개 또는 전부를 포함할 수 있다.
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 34)를 포함하는 FR1,
WYQQKPGKAPKLLI (서열 35)를 포함하는 FR2,
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 36)를 포함하는 FR3,
FGQGTKVEIKR (서열 37)를 포함하는 FR4.
VL 컨센서스 프레임워크의 예로는 다음을 들 수 있다.
인간 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 (서열 14);
인간 VL 카파 하위군 I 컨센서스 프레임워크 (연장된 HVR-L2) (서열 15);
인간 VL 카파 하위군 II 컨센서스 프레임워크 (서열 16);
인간 VL 카파 하위군 III 컨센서스 프레임워크 (서열 17); 또는
인간 VL 카파 하위군 IV 컨센서스 프레임워크 (서열 18).
수용자가 선택된 인간 프레임워크 서열과 서열이 동일할 수 있지만, 인간 이뮤노글로불린으로부터이든 인간 컨센서스 프레임워크로부터이든, 본 발명은 수용자 서열이 인간 이뮤노글로불린 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열에 비해 기존의 아미노산 치환을 포함할 수 있음을 고려한다. 상기 기존의 치환은 바람직하게는 인간 이뮤노글로불린 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열에 비해 최소, 통상적으로 4, 3, 2 또는 1개 아미노산만의 차이이다.
비-인간 항체의 초가변 영역 잔기는 VL 및/또는 VH 수용자 인간 프레임워크 내로 혼입된다. 예를 들어, 카바트 CDR 잔기, 코티아 초가변 루프 잔기, Abm 잔기 및/또는 접촉 잔기에 상응하는 잔기를 혼입시킬 수 있다. 임의로, 하기와 같은 연장된 초가변 영역 잔기가 혼입된다: 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3), 26 내지 35 (H1), 50 내지 65 또는 49 내지 65 (H2) 및 93 내지 102, 94 내지 102 또는 95 내지 102 (H3).
초가변 영역 잔기의 "혼입"이 본원에서 논의되지만, 이는 다양한 방식으로 달성될 수 있음이 명백하며, 예를 들어 목적하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산은 마우스 가변 도메인 서열을 코딩하는 핵산을 돌연변이시켜 그의 프레임워크 잔기를 수용자 인간 프레임워크 잔기로 변화시키거나, 인간 가변 도메인 서열을 코딩하는 핵산을 돌연변이시켜 초가변 도메인 잔기를 비-인간 잔기로 변화시키거나, 목적하는 서열을 코딩하는 핵산을 합성함으로써 등에 의해 생성될 수 있다.
본원의 예에서, 초가변 영역-이식된 변이체는 각각의 초가변 영역에 대한 별개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 인간 수용자 서열을 코딩하는 핵산의 쿤켈(Kunkel) 돌연변이유발에 의해 생성되었다 (문헌 [Kunkel et al, Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)]). 적절한 변화를 통상적인 기술을 이용하여 프레임워크 및/또는 초가변 영역 내에 도입하여 완전한 초가변 영역-항원 상호작용을 교정하거나 재수립할 수 있다.
파지(미드) 제시 (본원에서 일부 내용에서는 파지 제시로도 지칭됨)는 서열 무작위화에 의해 생성된 라이브러리 내의 많은 상이한 잠재적인 변이체 항체를 생성하고 스크리닝하는 편리하고 신속한 방법으로서 사용될 수 있다. 그러나, 변경된 항체를 제조하고 스크리닝하는 다른 방법이 당업자에게 이용가능하다.
파지(미드) 제시 기술은 항원과 같은 리간드에 결합하는 신규한 단백질을 생성하고 선별하는 강력한 도구로서 제공되었다. 파지(미드) 제시의 기술을 이용하면 고 친화도로 표적 분자에 결합하는 서열에 대해 신속하게 분류할 수 있는 단백질 변이체의 거대 라이브러리를 생성할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 일반적으로 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질과 같은 바이러스 외피 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 융합된다. 단백질 또는 폴레펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 유전자 III 단백질의 일부를 코딩하는 핵산 서열에 융합된 일가 파지미드 제시 시스템이 개발되었다 (문헌 [Bass, S., Proteins, 8:309 (1990)]; [Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)]). 일가 파지미드 제시 시스템에서, 유전자 융합은 저 수준으로 발현되며, 야생형 유전자 III 단백질은 또한 입자의 감염성이 보유되도록 발현된다. 펩티드 라이브러리의 생성 및 상기 라이브러리의 스크리닝 방법은 다수의 특허에 개시되었다 (예를 들어 미국 특허 제5,723,286호, 미국 특허 제5,432,018호, 미국 특허 제5,580,717호, 미국 특허 제5,427,908호 및 미국 특허 제5,498,530호).
항체 또는 항원 결합 폴리펩티드의 라이브러리는 무작위 DNA 서열을 삽입하여 단일 유전자를 변경하거나 관련된 유전자의 족을 클로닝함으로써와 같은 것을 비롯한 다수의 방식으로 제조되었다. 파지(미드) 제시를 이용한 항체 또는 항원 결합 단편을 제시하는 기술은 미국 특허 제5,750,373호 제,5,733,743호, 제5,837,242호, 제5,969,108호, 제6,172,197호, 제5,580,717호 및 제5,658,727호에 기재되었다. 그 후, 라이브러리를 목적하는 특징을 갖는 항체 또는 항원 결합 단백질의 발현에 대해 스크리닝한다.
선택의 아미노산을 주형 핵산 내로 치환하는 방법은 당업계에 잘 수립되어 있으며, 이들 중 일부는 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 초가변 영역 잔기를 쿤켈 방법을 이용하여 치환할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)]을 참조한다.
올리고뉴클레오티드의 서열은 변경될 초가변 영역 잔기에 대한 설계된 코돈 세트 하나 이상을 포함한다. 코돈 세트는 목적하는 변이체 아미노산을 코딩하는데 사용되는 상이한 뉴클레오티드 트리플렛 서열의 세트이다. 코돈 세트는 하기 IUB 코드에 따라 나타낸 바와 같은 특정 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 동몰 혼합물을 표시하는 기호를 사용하여 나타내어질 수 있다.
IUB 코드
G 구아닌
A 아데닌
T 티민
C 시토신
R (A 또는 G)
Y (C 또는 T)
M (A 또는 C)
K (G 또는 T)
S (C 또는 G)
W (A 또는 T)
H (A 또는 C 또는 T)
B (C 또는 G 또는 T)
V (A 또는 C 또는 G)
D (A 또는 G 또는 T) H
N (A 또는 C 또는 G 또는 T)
예를 들어, 코돈 세트 DVK에서, D는 뉴클레오티드 A 또는 G 또는 T일 수 있고; V는 A 또는 G 또는 C일 수 있고; K는 G 또는 T일 수 있다. 상기 코돈 세트는 18개의 상이한 코돈을 제시할 수 있으며, 아미노산 Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly 및 Cys를 코딩할 수 있다.
올리고뉴크레오티드 또는 프라이머 세트는 표준 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 세트는 예를 들어 코돈 세트에 의해 제공된 뉴클레오티드 트리플렛의 모든 가능한 조합을 나타내며 아미노산의 목적하는 기를 코딩할 서열을 함유하는 고상 합성에 의해 합성될 수 있다. 특정 위치에서 선택된 뉴클레오티드 "변성"을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 널리 공지되어 있다. 특정 코돈 세트를 갖는 뉴클레오티드의 이러한 세트는 시판되는 핵산 합성기 (예를 들어 미국 캘리포니아주 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)에서 시판됨)를 이용하여 합성될 수 있거나, 상업적으로 (예를 들어 미국 메릴랜드주 록크빌에 소재하는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)에서) 수득될 수 있다. 따라서, 특정 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드의 세트는 전형적으로 상이한 서열을 갖는 복수의 올리고뉴클레오티드 (차이는 전체 서열 내에서 코돈 세트에 의해 수립됨)을 포함할 것이다. 본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형에의 혼성화를 허용하는 서열을 가지며, 또한 클로닝 목적으로 제한 효소 부위를 포함할 수 있다.
한 방법에서, 변이체 아미노산을 코딩하는 핵산 서열은 올리고뉴클레오티드-매개된 돌연변이유발법에 의해 생성될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10:6487-6504(1987)]에 기재된 바와 같이 당업계에 널리 공지되어 있다. 간략히, 목적하는 코돈 세트를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 세트를 DNA 주형에 혼성화함으로써 변이체 아미노산을 코딩하는 핵산 서열을 생성하며, 여기서 주형은 가변 영역 핵산 주형 서열을 함유하는 플라스미드의 단일-가닥 형태이다. 혼성화 후, DNA 폴리머라제를 사용하여 주형의 전체 제2 상보적 가닥을 합성하는데, 이는 따라서 올리고뉴크레오티드 프라이머를 혼입시키고, 올리고뉴클레오티드 세트에 의해 제공된 코돈 세트를 함유할 것이다.
일반적으로, 길이가 25 뉴클레오티드 이상인 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 최적 올리고뉴크레오티드는 돌연변이(들)에 대해 코딩하는 뉴클레오티드(들)의 어느 측면 상에서든 주형에 대해 완전히 상보적인 12 내지 15 뉴클레오티드를 가질 것이다. 이는 올리고뉴클레오티드가 단일-가닥 DNA 주형 분자에 완전히 혼성화될 것을 보장한다. 올리고뉴클레오티드는 문헌 [Crea et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978)]에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 용이하게 합성된다.
DNA 주형은 박테리오파지 M13 벡터 (시판되는 M13mp18 및 M13mp19 벡터가 적합함)로부터 유래된 벡터, 또는 문헌 [Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987)]에 기재된 바와 같은 단일-가닥 파지 복제 원점을 함유하는 벡터에 의해 생성된다. 따라서, 돌연변이될 DNA를 상기 벡터 중 하나 내로 삽입하여 단일-가닥 주형을 생성한다. 단일-가닥 주형의 생성은 샘브루크(Sambrook) 등의 상기 문헌의 섹션 4.21 내지 4.41에 기재되어 있다.
천연 DNA 서열을 변경하기 위해, 올리고뉴크레오티드를 적합한 혼성화 조건하에서 단일 가닥 주형에 혼성화한다. 그 후, 통상적으로 T7 DNA 폴리머라제, 또는 DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편인 DNA 중합 효소를 첨가하여, 합성용 프라이머로서 올리고뉴클레오티드를 이용하여 주형의 상보적 가닥을 합성한다. 이렇게 형성된 이종이중나선 분자를, DNA의 한 가닥은 유전자 1의 돌연변이된 형태를 코딩하고, 다른 가닥 (원래 주형)은 천연의 비변경된 유전자 1의 서열을 코딩하게 한다. 그 후, 상기 이종이중가닥 분자를 적합한 숙주 세포, 통상적으로 이. 콜라이(E. coli) JM1O1 내로 형질전환시킨다. 세포를 성장시킨 후, 이를 아가로스 플레이트 상에 플레이팅하고, 32-포스페이트로 방사성표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 스크리낭하여 돌연변이된 DNA를 함유하는 박테리아 콜로니를 확인한다.
바로 상기에 기재된 방법은, 플라스미드의 가닥 둘다가 돌연변이(들)을 함유하는 동종이중나선 분자가 생성되도록 변형될 수 있다. 변형은 하기와 같다: 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 상기 기재된 바와 같은 단일-가닥 주형으로 어닐링한다. 3가지 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보아데노신 (dATP), 데옥시리보구아노신 (dGTP) 및 데옥시리보티미딘 (dTT)의 혼합물을 dCTP-(aS) (아머샴(Amersham)으로부터 수득될 수 있음)라 불리는 변형된 티오데옥시리보시토신과 혼합한다. 상기 혼합물을 주형-올리고뉴크레오티드 복합체에 첨가한다. DNA 폴리머라제를 상기 혼합물에 첨가할 때, 돌연변이된 염기를 제외한 주형과 동일한 DNA의 가닥이 생성된다. 또한, 상기 새로운 DNA의 가닥은 dCTP 대신 dCTP-(aS)를 함유할 것이며, 이는 제한 엔도뉴클레아제 소화로부터 이를 보호하는 기능을 한다. 이중-가닥 이종이중나선의 주형 가닥을 적절한 제한 효소로 니킹한 후, 주형 가닥을 돌연변이될 부위(들)을 함유하는 영역 뒤에서 ExoIII 뉴클레아제 또는 또다른 적절한 뉴클레아제로 소화시킨다. 그 후, 반응을 정지시켜 부분적으로만 단일-가닥인 분자를 방출시킨다. 그 후, 완전한 이중-가닥 DNA 동종이중나선을 모든 4개의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, ATP 및 DNA 리가제의 존재하에서 DNA 폴리머라제를 사용하여 형성한다. 그 후, 상기 동종이중나선 분자를 적합한 숙주 세포 내로 형질전환시킬 수 있다.
앞에서 지시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 세트의 서열은 주형 핵산에 혼성화하기에 충분한 길이이며, 또한, 반드시 그럴 필요는 없지만 제한 부위를 함유할 수 있다. DNA 주형을 문헌 [Viera et al. Meth. Enzymol., 153:3 (1987)]에 기재된 바와 같이 박테리오파지 M13 벡터, 또는 단일-가닥 파지 복제 원점을 함유하는 벡터로부터 유래된 벡터에 의해 생성할 수 있다. 따라서, 단일-가닥 주형을 생성하기 위해서, 돌연변이된 DNA를 상기 벡터 중 하나에 삽입하여야 한다. 단일-가닥 주형의 생성은 샘브루크 등의 상기 문헌의 섹션 4.21 내지 4.41에 기재되어 있다.
또다른 방법에 따르면, 라이브러리는, 각각의 세트가 상이한 서열을 갖는 복수의 올리고뉴클레오티드를 갖고, 상이한 서열은 올리고뉴클레오티드의 서열 내에 제공된 코돈 세트에 의해 수립된 것인 상류 및 하류 올리고뉴클레오티드 세트를 제공함으로써 생성될 수 있다. 가변 도메인 주형 핵산 서열과 함께 상류 및 하류 올리고뉴클레오티드 세트를 중합 효소 연쇄 반응에 사용하여 PCR 생성물의 "라이브러리"를 생성할 수 있다. PCR 생성물은, 이들이 수립된 분자 생물학 기술을 이용하여 다른 관련된 또는 비관련된 핵산 서열, 예를 들어 바이러스 외피 단백질 및 이량체화 도메인으로 융합될 수 있기 때문에 "핵산 카세트"로 지칭될 수 있다.
PCR 프라이머의 서열은 초가변 영역에 용매 접근가능하고 고도로 다양한 위치에 대해 하나 이상의 설계된 코돈 세트를 포함한다. 상기 기재된 바와 같이, 코돈 세트는 목적하는 변이체 아미노산을 코딩하는데 사용되는 상이한 뉴클레오티드 트리플렛 서열의 세트이다.
적절한 스크리닝/선별 단계를 통해 선별된 목적하는 범주를 충족시키는 항체 선별체를 단리하고, 표준 재조합 기술을 이용하여 클로닝할 수 있다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합 생성을 위해, 이를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현용의 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 시퀀싱한다. 다수의 벡터가 이용가능하다. 벡터의 선택은 부분적으로 사용되는 숙주 세포에 의존한다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 (일반적으로 포유동물) 기원의 것이다.
원핵 숙주 세포를 이용한 항체의 생성:
벡터 구축
본 발명의 항체의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 재조합 기술을 이용하여 수득될 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열은 하이브리도마 세포와 같은 항체 생성 세포로부터 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 별법으로, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 일단 수득되면, 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 원핵 숙주 내에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제하고 발현할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입한다. 이용가능하고 당업계에 공지된 다수의 벡터가 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 벡터 내로 삽입될 핵산이 크기 및 벡터로 형질전환될 특정 숙주 세포에 주로 의존할 것이다. 각각의 벡터는 그의 기능 (이종 폴리뉴클레오티드의 증폭 또는 발현, 또는 둘다) 및 그것이 존재하는 특정 숙주 세포와의 적합성에 따라 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분은 일반적으로 복제 원점, 선별 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종 핵산 삽입물 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일반적으로, 숙주 세포와 적합성인 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 상기 숙주와 함께 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 부위, 뿐만 아니라 형질전환된 세포에 형태적 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열을 운반한다. 예를 들어, 이. 콜라이는 전형적으로 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 이용하여 형질전환된다. pBR322는 암피실린 (Amp) 및 테트라시클린 (Tet) 내성을 코딩하는 유전자를 함유하며, 따라서 형질전환된 세포를 확인하는 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 그의 유도체 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파지는 또한 내인성 단백질의 발현을 위한 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 이를 함유하도록 변형될 수 있다. 특정 항체의 발현에 사용되는 pBR322 유도체의 예는 카터(Carter) 등의 미국 특허 제5,648,237호에 기재되어 있다.
또한, 숙주 유기체에 적합성인 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 파지 벡터는 상기 숙주와 함께 형질전환 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, λGEM.TM.-11과 같은 박테리오파지는 이. 콜라이 LE392와 같은 감수성 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 재조합 벡터의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 2 이상의 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 그의 발현을 조절하는 시스트론에 상류 (5') 위치된 비번역된 조절 서열이다. 원핵 프로모터는 전형적으로 유도성 및 구조적 프로모터의 2개의 부류에 해당한다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 변화, 예를 들어 영양물의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 그의 제어하에 증가된 수준의 시스트론 전사를 개시하는 프로모터이다.
다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인지되는 다수의 프로모터가 널리 공지되어 있다. 선택된 프로모터는, 프로모터를 제한 효소 소화를 통해 원시 DNA로부터 제거하고, 단리된 프로모터 서열을 본 발명의 벡터 내로 삽입함으로써 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 시스트론 DNA에 작동적으로 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터 둘다는 표적 유전자의 직접적 증폭 및/또는 발현에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이종 프로모터가 이용되는데, 이는 이들이 일반적으로 천연 표적 폴리펩티드 프로모터에 비해 발현된 표적 유전자의 보다 큰 전사 및 보다 높은 수율을 허용하기 때문이다.
원핵 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 PhoA 프로모터, β-갈락타마스 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 tac 또는 trc 프로모터와 같은 혼성 프로모터를 들 수 있다. 그러나, 박테리아에서 기능적인 다른 프로모터 (예를 들어 다른 공지된 박테리아 또는 파지 프로모터)도 또한 적합하다. 그의 뉴클레오티드 서열은 공개되었으므로, 당업자가 임의의 필요한 제한 부위를 공급하는 링커 또는 적응자를 사용하여 표적 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 시스트론에 이를 작동적으로 라이게이션할 수 있다 (문헌 [Siebenlist et al. (1980) Cell 20:269]).
본 발명의 일 측면에서, 재조합 벡터 내의 각각의 시스트론은 막을 가로질러 발현된 폴리펩티드의 전위를 지정하는 분비 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 벡터 내로 삽입된 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인지되고 프로세싱된 (즉 신호 펩티드에 의해 절단된) 것이어야 한다. 이종 폴리펩티드에 대해 천연인 신호 서열을 인지하고 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포에 대해, 신호 서열은 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 엔테로톡신 II (STII) 선도자, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다. 본 발명의 일 실시양태에서, 발현 시스템의 시스트론 둘다에 사용되는 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 그의 변이체이다.
또다른 측면에서, 본 발명에 따른 이뮤노글로불린의 생성은 숙주 세포의 세포질에서 일어날 수 있으며, 따라서 각각의 시스트론 내의 분비 신호 서열의 존재를 요구하지 않는다. 그 점에서, 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄가 발현되고, 폴딩되고, 집합되어 세포질 내에서 기능적 이뮤노글로불린을 형성한다. 특정 숙주 균주 (예를 들어 이. 콜라이 trxB- 균주)는 디술피드 결합 형성에 바람직한 세포질 조건을 제공함으로써, 발현된 단백질 서브유닛의 완전한 폴딩 및 집합을 허용한다 (문헌 [Proba and Pluckthun, Gene, 159:203 (1995)]).
본 발명은 발현된 폴리펩티드 성분의 정량적인 비율을 본 발명의 분비되고 완전히 집합된 항체의 수율을 최대화하기 위해 조절할 수 있는 발현 시스템을 제공한다. 이러한 조절은 폴리펩티드 성분의 번역 강도의 동시 조절에 의해 적어도 부분적으로 달성된다.
번역 강도의 조절을 위한 한 가지 기술은 시몬스(Simmons) 등의 미국 특허 제5,840,523호에 개시되어 있다. 이는 시스트론 내의 번역 개시 영역 (TIR)의 변이체를 이용한다. 소정의 TIR에 대해, 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체는 번역 강도의 범위로 생성됨으로써, 상기 인자를 특정 쇄의 목적하는 발현 수준에 대해 조정하는 편리한 수단을 제공할 수 있다. TIR 변이체는 아미노산 서열을 변경할 수 있는 코돈 변화를 초래하는 통상적인 돌연변이유발 기술에 의해 생성될 수 있지만, 뉴클레오티드 서열 내의 침묵 변화가 바람직하다. TIR의 변경은 예를 들어 신호 서열의 변경과 함께 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열의 스플라이싱 수의 변경을 포함한다. 돌연변이체 신호 서열을 생성하는 한 가지 방법은 신호 서열의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 (즉, 변화가 침묵인) 코딩 서열의 시작점에서의 "코돈 뱅크(codon bank)"의 생성이다. 이는 각각의 코돈의 제3 뉴클레오티드 위치의 변화에 의해 달성될 수 있으며, 또한 류신, 세린 및 아르기닌과 같은 일부 아미노산은 상기 뱅크를 제조하는데 있어서 복잡성을 추가할 수 있는 다중 제1 및 제2 위치를 갖는다. 상기 돌연변이유발 방법은 문헌 [Yansura et al. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158]에 상세히 기재되어 있다.
바람직하게는, 벡터의 세트는 그 안의 각각의 시스트론에 대한 TIR 강도의 범위 내에서 생성된다. 상기 제한된 세트는 각각의 쇄의 발현 수준 뿐만 아니라 다양한 TIR 강도 조합하의 목적하는 항체 생성물의 수율의 비교를 제공한다. TIR 강도는 시몬스 등의 미국 특허 제5,840,523호에 상세히 기재된 바와 같이 수용체 유전자의 발현 수준을 정량화함으로써 측정될 수 있다. 번역 강도 비교에 기초하여, 목적하는 개별 TIR을 선택하여 본 발명의 발현 벡터 구조물에 조합한다.
본 발명의 항체를 발현하기에 적합한 원핵 숙주 세포는 원시세균 및 진정세균, 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체를 포함한다. 유용한 박테리아의 예로는 에쉐리키아(Escherichia) (예를 들어, 이. 콜라이), 바실러스(Bacilli) (예를 들어, 비. 서브틸리스(B. subtilis)), 장내세균, 슈도모나스(Pseudomonas) 종 (예를 들어, 피. 애루기노사(P. aeruginosa)), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르케스칸스(Serratia marcescans), 클레비시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 시겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla) 또는 파라코쿠스(Paracoccus)를 들 수 있다. 일 실시양태에서, 그람-음성 세포가 사용된다. 일 실시양태에서, 이. 콜라이 세포가 본 발명의 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 균주의 예로는 유전자형 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kan R (미국 특허 제5,639,635호)을 갖는 균주 33D3를 비롯한 균주 W3110 (문헌 [Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]; ATCC 기탁 번호 27,325) 및 그의 유도체를 들 수 있다. 다른 균주 및 그의 유도체, 예를 들어 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 이. 콜라이λ 1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 RV308(ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 상기 예는 제한적이라기 보다는 예시적이다. 한정된 유전자형을 갖는 임의의 상기 언급된 박테리아의 유도체를 구축하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)]에 기재되어 있다. 박테리아 세포 내의 레플리콘의 복제능을 고려하여 적절한 박테리아를 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, 이. 콜라이, 세라티아(Serratia) 또는 살모넬라 종은 pBR322, pBR325, pACYC177 또는 pKN410과 같은 널리 공지된 플라스미드가 레플리콘을 공급하는데 사용될 경우 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 최소량의 단백질분해 효소를 분비해야 하며, 추가의 프로테아제 억제제는 바람직하게는 세포 배양물에 혼입될 수 있다.
항체 생성
숙주 세포를 상기 기재된 발현 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하기에 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양시킨다.
DNA를 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 DNA를 원핵 숙주 내로 도입시키는 형질전환 수단. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리는 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 박테리아 세포에 일반적으로 사용된다. 또다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 또다른 기술은 전기천공을 이용한다.
본 발명의 폴리펩티드를 제조하는데 사용되는 원핵 세포를 당업계에 공지되고 선별된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예는 필수 영양 공급물이 더해진 루리아 브로쓰(luria broth) (LB)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하는 발현 벡터의 구조를 기초로 선택된 선별제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린은 암피실린 저항성 유전자를 발현하는 세포의 성장용의 배지에 첨가된다. 탄소, 질소 및 무기 포스페이트 공급원 이외의 임의의 필요한 공급물은 또한 적절한 농도로 단독으로 또는 복합체 질소 공급원과 같은 또다른 공급물 또는 배지와의 혼합물로서 도입되도록 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포를 적합한 온도에서 배양한다. 이. 콜라이 성장을 위해, 예를 들어 바람직한 온도는 약 20℃ 내지 약 39℃, 보다 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃ 범위, 보다 더 바람직하게는 약 30℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. 이. 콜라이에 대해, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 보다 바람직하게는 약 7.0이다.
유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에 사용될 경우, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건하에서 유도된다. 본 발명의 일 측면에서, PhoA 프로모터가 폴리펩티드의 전사 제어에 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포를 유도용의 포스페이트-제한 배지에서 배양한다. 바람직하게는, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (예를 들어, 문헌 [Simmons et al., J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147] 참조). 당업계에 공지된 바와 같이, 사용되는 벡터 구조물에 따라 다양한 다른 유도자가 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 숙주 세포의 원형질막 공간 내로 분비되고 그로부터 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로, 일반적으로 삼투 쇼크, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분쇄하는 것을 포함한다. 세포를 분쇄하면, 세포 데브리스 또는 전체 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 단백질을 예를 들어 친화도 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다. 별법으로, 단백질을 배양 배지 내로 옮기고, 그 안에서 단리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상청액을 여과하고 농축하여 생성된 단백질을 추가 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩티드를 추가로 단리하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 분석법과 같은 통상적으로 공지된 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 항체 생성은 발효 과정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 공급-배치 발효 절차는 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 1000 리터 이상의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 상기 발효기는 산소 및 영양물, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)를 분산시키는 교반기 추진기를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 부피 용량으로 대략 100 리터 이하인 발효기에서의 발효를 지칭하며, 약 1 리터 내지 약 100 리터의 범위일 수 있다.
발효 과정에서, 단백질 발현의 유도는 전형적으로 세포를 적합한 조건하에서 목적하는 밀도, 예를 들어 약 180 내지 220의 OD550으로 성장시키며, 이 단계에서 세포는 초기 정지상이다. 당업계에 공지되고 상기 기재된 바와 같이, 사용되는 벡터 구조물에 따라 다양한 유도자를 사용할 수 있다. 세포를 유도 전에 보다 짧은 기간 동안 성장시킬 수 있다. 세포를 통상적으로 약 12 내지 50시간 동안 유도하지만, 보다 길거나 보다 짧은 유도 시간이 사용될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 양을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 완전한 집합 및 폴딩을 개선하기 위해, Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (카페론 활성을 갖는 펩티딜프로필 시스,트랜스-이소머라제)와 같은 카페론 단백질을 발현하는 추가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵 세포를 공동-형질전환시킬 수 있다. 카페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생산된 이종 단백질의 완전한 폴딩 및 가용성을 용이하게 하는 것으로 입증되었다 (문헌 [Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605]; 조지오(Georgiou) 등, 미국 특허 제6,083,715호; 조지오 등, 미국 특허 제6,027,888호; 문헌 [Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105]; [Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113]; [Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210]).
발현된 이종 단백질 (특히 단백질분해적으로 감수성인 것들)의 단백질분해를 최소화하기 위해, 단백질분해 효소에 대해 결핍성인 특정 숙주 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이들의 조합과 같은 공지된 박테리아 프로테아제를 코딩하는 유전자에서 유전적 돌연변이(들)를 수행하도록 변형될 수 있다. 일부 이. 콜라이 프로테아제-결핍 균주가 이용가능하며, 예를 들어 졸리(Joly) 등의 상기 문헌 (1998); 조지오 등, 미국 특허 제5,264,365호; 조지오 등, 미국 특허 제5,508,192호; 문헌 [Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기재되어 있다.
일 실시양태에서, 단백질분해 효소에 대해 결핍성이고 1종 이상의 카페론 단백질을 발현하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 균주가 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로 사용된다.
항체 정제
일 실시양태에서, 본원에서 생산된 항체 단백질을 추가의 분석 및 용도를 위해 추가로 정제하여 실질적으로 동종인 제제를 수득한다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법이 이용될 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예시이다: 면역친화도 또는 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 상 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전법, 및 예를 들어 세파덱스(Sephadex) G-75를 이용한 겔 여과.
일 측면에서, 고체상 상에 고정화된 단백질 A는 본 발명의 전장 항체 생성물의 면역친화도 정제에 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 고 친화도로 결합하는 스타필로코커스 아우레아스(Staphylococcus aureas)로부터의 41kD 세포벽 단백질이다 (문헌 [Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13]). 단백질 A가 고정화되는 고체상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면, 보다 바람직하게는 제어된 공극 유리 컬럼 또는 규산 컬럼을 포함하는 컬럼이다. 일부 적용에서, 컬럼은 오염물의 비특이적 부착을 방지하기 위한 시도에서 글리콜과 같은 시약으로 코팅되었다.
정제의 첫번째 단계로서, 상기 기재된 바와 같은 세포 배양물로부터 유래된 제조물을 단백질 A 고정화된 고체상 상에 적용하여 관심의 항체가 단백질 A에 특이적으로 결합하게 한다. 그 후, 고체상을 세척하여 고체상에 비-특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 최종적으로, 관심의 항체를 용리에 의해 고체상으로부터 회수한다.
진핵 숙주 세포를 이용한 항체의 생성:
벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상: 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
(i) 신호 서열 성분
진핵 숙주 세포에 사용하기 위한 벡터는 또한 관심의 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열, 또는 다른 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인지되고 프로세싱된 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단된) 것이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 선도자, 예를 들어 헤르페스 심플렉스 gD 신호가 이용가능하다.
이러한 프리커서 영역을 위한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 대한 리딩 프레임에서 라이게이션된다.
(ii) 복제 원점
일반적으로, 복제 원점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 원점은 전형적으로, 이것이 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다.
(iii) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별가능한 마커라고도 지칭되는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 내성을 부여하거나, (b) 관련될 경우 영양요구성 결핍을 보충하거나, (c) 복합체 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양물을 공급하는 단백질을 코딩한다.
선별 계획의 일 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고, 따라서 선별 처방에도 생존한다. 이러한 우세한 선별의 예는 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 또다른 예는 항체 핵산, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 취해내는 세포 성분의 확인을 가능하게 하는 것이다.
예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포를 먼저 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR이 사용될 경우, 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.
별법으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 또다른 선별가능한 마커, 예를 들어 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공동-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 아미노글리코시드산 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선별가능한 마커에 대한 선별제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 숙주 유기체에 의해 인지되며 항체 폴리펩티드 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 통상적으로 함유한다. 프로모터 서열은 진핵세포에 대해 공지되어 있다. 실제적으로, 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30 염기 상류에 위치된 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사의 출발로부터 70 내지 80 염기 상류에서 발견되는 또다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에, 코딩 서열의 3' 말단에 대한 폴리 A 꼬리의 첨가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 상기 서열은 적합하게는 진핵 발현 벡터 내로 삽입된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 폴리펩티드 전사는, 이러한 프로모터가 숙주 세포 시스템과 적합하다면 예를 들어 폴리오마 바이러스, 수두 바이러스 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안(Simian) 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 히트-쇼크 프로모터에 의해 제어된다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 원점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 바로 초기 프로모터는 힌드(Hind)III E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용한 포유동물 숙주에서의 DNA를 발현하는 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 단순 헤르페스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어하의 마우스 세포에서의 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 관한 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조한다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복은 프로모터로서 사용될 수 있다.
(v) 인핸서 요소 성분
고등 진핵세포에 의한 본 발명의 항체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열은 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)으로 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 이용할 것이다. 그 예로는 복제 원점 (bp 100 내지 270)의 후기 측면 상의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 후기 측면 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 들 수 있다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 관한 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 항체 폴리펩티드-코딩 서열에 대해 위치 5' 내지 3' 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터의 부위 5'에 위치한다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포에 사용되는 발현 벡터는 전형적으로 또한 전사의 종결 및 niRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유한다. 이러한 서열은 통상적으로 5' 말단으로부터 이용가능하며, 때때로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 3'의 비번역된 영역으로부터 이용가능하다. 상기 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역된 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO 94/11026 및 본원에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
(vii) 숙주 세포의 선별 및 형질전환
본원에서 벡터 내의 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 척추동물 숙주 세포를 비롯한, 본원에 기재된 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 배양물 (조직 배양물) 내의 척추동물 세포의 전파는 통상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장 주 (현탁액 배지에서 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니스 햄스터 난소 세포/- DHFR (문헌 [CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]) ; 마우스 버팀 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 항체 생산을 위한 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하기에 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
(viii) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 함(Ham) F1O (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 ((MEM), 시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ((DMEM), 시그마)와 같은 시판되는 배지는 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195에 기재된 임의의 배지; 또는 미국 특허 Re. 30,985를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 상기 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어 젠타마이신(GENTAMYCIN)(상표명) 약물), 추적 요소 (마이크로몰 범위로 최종 농도에서 통상적으로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 다른 필요한 보충물은 또한 적절한 농도에서 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것들이며, 당업자에게 명백할 것이다.
(ix) 항체의 정제
재조합 기술을 이용할 경우, 항체는 세포내에서 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산될 경우, 제1 단계로서, 미립자 데브리스, 숙주 세포 또는 용해된 단편을 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 항체가 배지 내로 분비될 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 농축한다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질분해를 억제하기 위해 임의의 상기 단계에 포함될 수 있으며, 항생제는 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있으며, 친화도 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화도 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 한 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (문헌 [Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)]). 친화도 리간드에 부착되는 매트릭스는 가장 흔히 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 조절된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 공정 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함할 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX(상표명) 수지 (미국 뉴저지주 필립스버그의 제이. 티. 베이커(J. T. Baker))가 정제에 유용하다. 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(상표명) 상의 크로마토그래피, 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전법과 같은 다른 단백질 정제 기술은 또한 회수될 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 기본 정제 단계(들) 후, 관심의 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물을 바람직하게는 저 염 농도 (예를 들어 약 0 내지 0.25 M 염)에서 수행되는, 약 2.5 내지 4.5의 pH에서 용리 완충액을 사용하여 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용한다.
활성 분석
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 분석법에 의해 그의 물리적/화학적 특성 및 생물학적 기능에 대해 특성화될 수 있다.
정제된 이뮤노글로불린은 N-말단 시퀀싱, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화를 포함하나 이에 제한되지 않는 일련의 분석법에 의해 추가로 특성화될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본원에서 생산된 이뮤노글로불린을 그의 생물학적 활성에 대해 분석한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이뮤노글로불린을 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다. 당업계에 공지되고 본원에서 사용될 수 있는 항원 결합 분석법은 웨스턴 블롯, 방사성 면역분석법, ELISA (효소 결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역침전 분석법, 형광 면역분석법 및 단백질 A 면역분석법과 같은 기술을 이용한 임의의 직접적 또는 경쟁적 결합 분석법을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 항원 결합 분석법은 하기 실시예 섹션에 제공된다.
일 실시양태에서, 본 발명은 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 특정 효과가 기능 (예를 들어 보체 및 ADCC)에는 불필요하거나 유해한 많은 적용에 대한 바람직한 후보자로 만드는, 전부는 아니지만 일부 효과기 기능을 갖는 변경된 항체를 고려한다. 특정 실시양태에서, 생성된 이뮤노글로불린의 Fc 활성은 목적하는 특성만이 유지되는 것을 확인하도록 측정된다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석법을 수행하여 CDC 및/도는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석을 수행하여, 항체가 FcγR 결합이 없지만 (따라서 또한 ADCC 활성이 없지만) FcRn 결합 능력을 보유하는지를 확인할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 제464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심의 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석법의 예는 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재되어 있다. 이러한 분석법에 유용한 효과기 세포로는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 들 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 관심의 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다. 또한, C1q 결합 분석을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 없는지를 확인할 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다. 또한, FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 측정을 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 실시예 섹션에 기재된 것들을 이용하여 수행할 수 있다.
인간화 항체
본 발명은 인간화 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 그 내로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 상기 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입(import)" 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법에 따라, 초가변 영역 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써 수행된다 (문헌 [Jones et al. (1986) Nature, 321:522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature, 332:323-327]; [Verhoeyen et al. (1988) Science, 239:1534-1536]). 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 덜 비손상인 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 제4,816,567호). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄 둘다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적(best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 그 후, 설치류의 것과 가장 가까운 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 수용한다 (문헌 [Sims et al. (1993) J. Immunol., 151:2296]; [Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol., 196:901]). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 이용한다. 동일한 프레임워크는 몇몇 여러가지 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 (문헌 [Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285]; [Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623]).
항체가 항원에 대한 고 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것은 또한 중요하다. 상기 목적을 달성하기 위해, 한 방법에 따르면, 인간화 항체를 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념적인 인간화 생성물의 분석의 방법에 의해 제조한다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하며, 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형태적 구조를 예시 및 제시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 점검은 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린의 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기를 선택하고, 수여자 및 도입 서열로부터 결합하여 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도와 같은 목적하는 항체 특징이 달성되도록 할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는 것에 관여한다.
항체 변이체
일 측면에서, 본 발명은 Fc 영역을 포함하는 Fc 폴리펩티드의 계면에서 변형을 포함하며, 이 변형은 이종이량체화를 용이하게 하고/거나 촉진하는, 항체 단편을 제공한다. 상기 변형은 제1 Fc 폴리펩티드 내로의 돌기 및 제2 Fc 폴리펩티드 내로의 공동의 도입을 포함하며, 돌기는 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 복합화를 촉진하도록 공동에 위치가능하다. 상기 변형을 갖는 항체의 생성 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제5,731,168에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산 내로 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및/또는 잔기 내로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구조물이 목적하는 특징을 갖는다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어져 최종 구조물에 도달한다. 아미노산 변경은 서열이 만들어질 때 대상 항체 아미노산에 도입될 수 있다.
돌연변이유발에 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발법"이라 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 기를 확인하고 (예를 들어 arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기), 이를 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 준다. 그 후, 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 상기 아미노산 위치를 치환 부위에서, 또는 그에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 예정되는 반면, 돌연변이의 성질 그 자체는 예정될 필요가 없다. 예를 들어, 돌연변이의 성능을 소정의 부위에서 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고, 발현된 이뮤노글로불린을 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기 내지 100 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 들 수 있다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 효소 (예를 들어 ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에의 융합을 포함한다.
또다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 상기 변이체는 상이한 잔기로 대체된 항체 분자 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이유발법에 가장 큰 관심 부위로는 초가변 영역을 들 수 있지만, FR 변경도 고려된다. 보존적 치환은 표 2에 "바람직한 치환"이라는 표제하에 나타낸다. 이러한 치환이 생물학적 활성에 변화를 초래할 경우, 표 2의 "예시적인 치환"으로 명명된, 또는 아미노산 부류에 대해 하기에 추가로 기재된 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물이 스크리닝될 수 있다.
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항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 쉬트 또는 나선 형태로서의 치환의 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지하는 그의 효과에 있어서 상당히 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 아미노산은 그의 측쇄의 특성에 있어서의 유사성에 따라 분류된다 (문헌 [A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]):
(1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 비하전된 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H)
별법으로, 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기재한 기로 나누어질 수 있다.
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 부류 중 하나의 구성원으로 또다른 구성원을 교환하는 것을 수반할 것이다. 이러한 치환된 잔기는 또한 보존적 치환 부위, 또는 보다 바람직하게는 잔류 (비-보존적) 부위 내로 도입될 수 있다.
한 유형의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어 인간화 항체 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 이들이 생성되는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 제시를 사용한 친화도 성숙을 포함한다. 간략히, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어 6 내지 7 부위)를 돌연변이시켜 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성할 수 있다. 이렇게 생성된 항체는 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에의 융합물로서 필라멘트성 파지 입자로부터 제시된다. 그 후, 파지-제시된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그의 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 확인하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 본원에 설명된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 이러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선별할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 상기 방법으로는 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 부위-지정된) 돌연변이유발법, PCR 돌연변이유발법, 및 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 형태의 카세트 돌연변이유발법에 의한 제조를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 이뮤노글로불린 폴리펩티드의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여 Fc 영역 변이체를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 것을 비롯한 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
본 명세서 및 당업계의 교시에 따르면, 일부 실시양태에서 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 예를 들어 Fc 영역 내의 야생형 반대 항체, 하나 이상의 변경을 포함할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 상기 항체는 그의 야생형 반대 항체에 비해 치료 유용성에 대해 요구되는 동일한 특징을 실질적으로 보유할 것이다. 예를 들어, WO 99/51642에 기재된 바와 같이 특정 변경은 Fc 영역에 이루어져 C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)를 변경 (즉 개선 또는 감소)시킬 것이다. 또한, 다른 Fc 영역 변이체의 다른 예에 관한 문헌 [Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 WO 94/29351를 참조한다.
이뮤노컨쥬게이트
본 발명은 또한 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소 (예를 들어 방사성컨쥬게이트)에 컨쥬게이션된 항체를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트, 또는 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)에 관한 것이다.
암 치료시 세포독성제 또는 세포증식 억제제, 즉 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물을 국소 전달하기 위해 항체-약물 컨쥬게이트를 사용하게 되면 (문헌 [Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614]; [Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172]; 미국 특허 제4,975,278호), 이론적으로는 상기 약물 부분을 종양에 표적화 전달할 수 있고 종양 내에 약물이 세포내 축적되게 할 수 있는데, 상기 약물 작용제를 컨쥬게이션시키지 않은 채로 전신 투여하게 되면, 제거하고자 하는 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포에 대해서도 허용가능하지 않은 수준의 독성이 야기될 수 있다 (문헌 [Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05]; [Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, "in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds), pp. 475-506]). 따라서, 최소 독성을 나타내면서 최대 효능을 나타내고자 하였다. 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 둘다가 이들 전략에 유용한 것으로 보고되었다 (문헌 [Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87]). 이들 방법에 사용된 약물에는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신이 포함된다 ([Rowland et al., (1986)] 상기 문헌]. 항체-독소 컨쥬게이트에 사용된 독소에는 박테리아 독소, 예를 들어 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어 리신, 소분자 독소, 예를 들어 겔다나마이신 (문헌 [Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92 (19):1573-1581]; [Mandler et al (2000) Bioorganic ＆ Med. Chem. Letters 10: 1025-1028]; [Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791]), 마이탄시노이드 [EP 1391213; 문헌 [Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623]), 및 칼리케아미신 (문헌 [Lode et al (1998) Cancer Res. 58: 2928]; [Hinman et al (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342])이 포함된다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 비롯한 메카니즘에 의해 자신의 세포독성 및 세포증식 억제 효과를 발휘할 수 있다. 몇몇 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 컨쥬게이션될 때 불활성화되거나 덜 활성을 나타내는 경향이 있다.
제발린(ZEVALIN)(등록상표) (이브리투모마브 티욱세탄, 바이오젠/이덱(Biogen/Idec))은 정상 및 악성 B 림프구의 표면 상에 발견된 CD20 항원에 대해 지정된 뮤린 IgG1 카파 모노클로날 항체 및 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된 111In 또는 90Y 방사성 동위원소로 구성된 항체-방사성 동위원소 컨쥬게이트이다 (문헌 [Wiseman et al (2000) Eur. J. Nucl. Med. 27(7):766-77]; [Wiseman et al (2002) Blood 99 (12):4336-42]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10):2453-63]; [Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15): 3262-69]). 제발린이 B-세포 비호지킨 림프종 (NHL)에 대항한 활성을 지니고 있긴 하지만, 이를 투여하게 되면 대부분의 환자에게서 중증의 혈구감소증이 장기간 나타난다. 칼리케아미신과 연결된 hu CD33 항체로 구성된 항체-약물 컨쥬게이트인 밀로타르그(MYLOTARG)(상표명) (겜투주마브 오조가미신; 와이어스 파마슈티칼스(Wyeth Pharmaceuticals))은 주사에 의해 급성 골수성 백혈병을 치료하기 위한 것으로 2000년에 승인되었다 (문헌 [Drugs of the Future (2000) 25 (7):686]; 미국 특허 제4970198호; 제5079233호; 제5585089호; 제5606040호; 제5693762호; 제5739116호; 제5767285호; 제5773001호). 디술피드 링커 SPP를 통하여 마이탄시노이드 약물 부분 DM1에 연결된 huC242 항체로 구성된 항체-약물 컨쥬게이트인 칸투주마브 메르탄신 (이뮤노젠, 인크.(Immunogen, Inc.))을 대상으로 하여, CanAg를 발현하는 암, 예를 들어 결장암, 췌장암, 위암 등을 치료하기 위한 제II상 시험이 진행되고 있다. MLN-2704 (밀레니엄 팜.(Millennium Pharm.), BZL 바이올로직스(BZL Biologics), 이뮤노젠, 인크.)는 마이탄시노이드 약물 부분 DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 구성된 항체 약물 컨쥬게이트로서, 현재 전립선 종양의 잠재적 치료를 위해 개발 중이다. 아우리스타틴 펩티드인 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체)을 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스 Y에 특이적임) 및 cAClO (혈액학적 악성종양 상의 CD30에 특이적임) (문헌 [Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784])에 컨쥬게이션시켰고, 이는 치료제 개발 중에 있다. 약물 컨쥬게이트 세포독성제로서 사용하기 위한 다른 화합물로는 아우리스타틴 E (AE), MMAF (약물의 C-말단에 페닐알라닌을 갖는 아우리스타틴 E (MMAE)의 변이체) 및 AEVB (아우리스타틴 E 발레릴 벤질히드라존, AE의 C-말단을 통한 산 불안정성 링커)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 약물을 항체에 부착시키기 위한 유용한 컨쥬게이트 링커로는 MC (말레이미도카프로일), Val Cit (발린-시트랄린, 프로테아제 절단가능한 링커의 디펩티드 부위), 시트랄린 (2-아미노-5-우레이도 펜탄산), PAB (p-아미노벤질카르바모일, 링커의 "자가 희생(self immolative)" 부분), Me (링커 펩티드 결합이 카텝신 B에 의해 그의 절단이 방지되도록 변형된 N-메틸-발린 시트랄린), MC(PEG)6-OH (말레이미도카프로일-폴리에틸렌 글리콜, 항체 시스테인에 부착됨), SPP (N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트), 및 SMCC (N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트)를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 및 다른 유용한 약물 컨쥬게이트 및 그의 제조는 예를 들어 문헌 [Doronina, S.O. et al., Nature Biotechnology 21:778-794 (2003)] (그 전문이 본원에 참고로 도입됨)에 개시되어 있다. 특히 바람직한 링커 분자로는 예를 들어 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) (예를 들어 문헌 [Carlsson et al., Biochem. J., 173, 723-737 (1978)] 참조), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트 (SPDB) (예를 들어 미국 특허 제4,563,304호 참조), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트 (SPP) (예를 들어 CAS 등록 번호 341498-08-6), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC) (예를 들어 문헌 [Yoshitake et al., Eur. J. Biochem., 101, 395-399 (1979)] 참조) 및 N-숙신이미딜 4-메틸-4-[2-(5-니트로-피리딜)-디티오펜타노에이트 (SMNP) (예를 들어 미국 특허 제4,563,304호 참조)를 들 수 있다.
이러한 이뮤노컨쥬게이트를 생성시키는데 유용한 화학요법제가 상기 언급되었다. 사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모노르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 각종 방사성핵종이 방사성컨쥬게이션된 합체 생성을 위해 이용 가능하다. 이의 예에는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re가 포함된다. 각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여, 항체와 세포독성제의 컨쥬게이트를 만들 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [Vitetta et al., Science. 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이, 방사뉴클레오티드를 항체에 컨쥬게이션시키기 위한 킬레이트제의 한 예이다. WO 94/11026을 참조한다.
항체와 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신, 마이탄시노이드, 트리코테센 및 CC1065, 및 독소 활성을 지닌 이들 독소의 유도체의 컨쥬게이트가 또한 본원에 고려된다.
마이탄신 및 마이탄시노이드
일 실시양태에서, 본 발명의 항체 (전장 또는 단편)를 하나 이상의 마이탄시노이드 분자에 컨쥬게이션시킨다.
마이탄시노이드는 튜불린 중합 반응을 억제함으로써 작용하는 핵분열 억제제이다. 마이탄신은 동아프리카산 관목 마이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 분리하였다 (미국 특허 제3,896,111호). 연속해서, 특정 미생물이 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄시놀 및 C-3 마이탄시놀 에스테르를 생성시키는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 제4,151,042호). 합성 마이탄시놀 및 그의 유사체 및 유사체가, 예를 들어 미국 특허 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제4,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,254호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호 (이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 보고되었다.
마이탄시노이드-항체 컨쥬게이트
그들의 치료 지수를 개선시키기 위한 시도로, 마이탄신 및 마이탄시노이드를 종양 세포 항원과 특이적으로 결합하는 항체와 컨쥬게이션시켰다. 마이탄시노이드를 함유하는 이뮤노컨쥬게이트 및 그들의 치료적 용도가, 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 (이들 각각의 전문이 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다. 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대항하여 유도된 모노클로날 항체 C242와 연결된 DM1로 명명된 마이탄시노이드를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트가 기재되었다. 이러한 컨쥬게이트는 배양된 결장암 세포에 대하여 고도로 세포독성인 것으로 밝혀졌으며, 생체내 종양 성장 검정에서 항종양 활성을 나타내었다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)]에는 마이탄시노이드를 디술피드 링커를 통하여, 인간 결장암 세포주 상의 항원과 결합하는 뮤린 항체 A7과 컨쥬게이션시키거나, 또는 HER-2/neu 종양형성 유전자와 결합하는 또다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1과 컨쥬게이션시켰다. TA.1-마이탄시노이드 컨쥬게이트의 세포독성을, 세포당 3 x 105개 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3 상에서 시험관내 시험하였다. 이러한 약물 컨쥬게이트는 자유 마이탄시노이드 약물과 유사한 세포독성도를 달성하였는데, 이는 항체 분자당 마이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 증가시킬 수 있었다. A7-마이탄시노이드 컨쥬게이트는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 나타내었다.
항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트 (이뮤노컨쥬게이트)
항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트는 항체 또는 마이탄시노이드 분자의 생물학적 활성은 상당히 감소시키지 않으면서 항체를 마이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결시킴으로써 제조한다. 항체 분자당 평균 3 내지 4개의 마이탄시노이드 분자가 컨쥬게이션되는 것이, 항체의 기능 또는 용해도에 불리한 영향을 미치지 않으면서도 표적 세포의 세포독성을 증강시키는데 효능이 있는 것을 밝혀지긴 하였지만, 심지어 항체당 1개의 독소 분자도 있는 네이키드(naked) 항체를 사용하는 것에 비해 세포독성을 증강시키는 것으로 예상된다. 마이탄시노이드는 당업계에 널리 공지되어 있고, 공지된 기술에 의해 합성할 수 있거나 천연 공급원으로부터 분리할 수 있다. 적합한 마이탄시노이드가, 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호, 및 상기 인용된 기타 특허 및 비특허 공보에 기재되어 있다. 바람직한 마이탄시노이드는 방향족 환 내에서 변형되거나 마이탄시놀 분자의 기타 위치에서 변형된 마이탄시놀 및 마이탄시놀 유사체, 예를 들어 각종 마이탄시놀 에스테르이다.
항체-마이탄시노이드 컨쥬게이트를 제조하기 위한 많은 연결기, 예를 들어 미국 특허 제5,208,020호 또는 EP 특허 제0 425 235 B1호; 및 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)]에 기재된 것들이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 연결기에는 상기 언급된 특허에 기재된 바와 같은 디술피드기, 티오에테르기, 산 불안정한 기, 광불안정한 기, 펩티다제 불안정한 기, 또는 에스테라제 불안정한 기가 포함되는데, 디술피드기 및 티오에테르기가 바람직하다.
항체와 마이탄시노이드의 컨쥬게이트는 각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들 수 있다. 디술피드 결합을 제공하는데 특히 바람직한 커플링제에는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) (문헌 [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)]) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)가 포함된다.
링커는 연결물 종류에 따라서 각종 위치에서 마이탄시노이드 분자에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 에스테르 결합은 통상적인 커플링 기술을 이용하여 히드록실기와 반응시킴으로써 형성시킬 수 있다. 이러한 반응은 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형시킨 C-14 위치, 히드록실기로 변형시킨 C-15 위치, 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 양태에서는, 상기 연쇄가 마이탄시놀 또는 마이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
칼리케아미신
관심의 또다른 이뮤노컨쥬게이트는 하나 이상의 칼리케아미신 분자와 컨쥬게이션된 항체를 포함한다. 칼리케아미신 계열의 항생제는 이중 가닥 DNA 절단물을 피코몰 이하 농도로 생성시킬 수 있다. 칼리케아미신 계열의 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 관해서는 미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 제5,877,296호 (아메리칸 시아나미드 캄파니(American Cyanamid Company))를 참고할 수 있다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체에는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다 (문헌 [Hinman et al., Cancer Research, 53: 3336-3342 (1993)], [Lode et al., Cancer Research, 58: 2925-2928 (1998)]; 및 전술된 아메리칸 시아나미드의 미국 특허들). 항체와 컨쥬게이션될 수 있는 또다른 항종양 약물은 항엽산제인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA 둘 다는 세포내 작용 부위를 갖고 있고 혈장 막을 용이하게 교차하지 않는다. 따라서, 항체 매개된 내재화를 통한 이들 작용제의 세포성 섭취는 그들의 세포독성 효과를 상당히 증강시켜 준다.
기타 세포독성제
본 발명의 항체와 컨쥬게이션될 수 있는 기타 항종양제에는 BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 제5,053,394호, 제5,770,710호에 기재되고 집합적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 계열의 작용제 뿐만 아니라 에스페라미신스 (미국 특허 제5,877,296호)가 포함된다.
사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모노르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 예를 들어 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
본 발명은 특정 항체와, 핵산분해 활성을 지닌 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 이뮤노컨쥬게이트를 추가로 고려한다.
종양을 선택적으로 파괴시키기 위해, 항체가 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 각종 방사성 동위원소가 방사성컨쥬게이션된 항체 생성을 위해 이용 가능하다. 이의 예에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 컨쥬게이트를 검출용으로 사용하는 경우에는, 컨쥬게이트가 섬광조영 연구를 위해서는 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함할 수 있거나, 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로서 공지되기도 함)를 위해서는 스핀 표지, 예를 들어 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성 표지 또는 기타 표지를 공지된 방식으로 컨쥬게이트에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성할 수 있거나, 또는 수소 대신, 예를 들어 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 이용하는 화학적 아미노산 합성에 의해 합성할 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111 등의 표지를 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통하여 부착시킬 수 있다. 요오도겐(IODOGEN) 방법 (문헌 [Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57])을 사용하여 요오드-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 기타 방법이 상세히 기재되어 있다.
다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 [예를 들어 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민], 비스-디아조늄 유도체 [예를 들어 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민], 디이소시아네이트 (예를 들어 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여, 항체와 세포독성제의 컨쥬게이트를 만들 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [Vitetta et al., Science. 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이, 방사성뉴클레오티드를 항체에 컨쥬게이션시키기 위한 킬레이트제의 한 예이다. WO 94/11026을 참조한다. 이러한 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시켜 주는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드 함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Research, 52: 127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호)를 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 특별히, 가교제 시약: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (미국 일리노이주 로크포드에 소재하는 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.))을 사용하여 제조된 ADC를 고려하지만, 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [pages 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog]을 참조한다.
항체-약물 컨쥬게이트의 제조
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트 (ADC)에서는, 항체(Ab)를 하나 이상의 약물 부분 (D), 예를 들어 항체당 약 1 내지 약 20개 약물 부분에 링커 (L)를 통하여 컨쥬게이션시킨다. 화학식 I의 ADC는 다음을 포함한, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 이용하여 여러 경로에 의해 제조할 수 있다: (1) 항체의 친핵기를 이가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 Ab-L을 형성시킨 다음, 이를 약물 부분 D와 반응시키는 방법; 및 (2) 약물 부분의 친핵기를 이가 링커 시약과 반응시켜, 공유 결합을 통하여 D-L을 형성시킨 다음, 이를 항체의 친핵기와 반응시키는 방법.
Ab-(L-D) p
항체 상의 친핵기에는 (i) N-말단 아민기; (ii) 측쇄 아민기, 예를 들어 리신; (iii) 측쇄 티올기, 예를 들어 시스테인; 및 (iv) 당 히드록실 또는 아미노기 (여기서, 항체가 당화된다)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 아민, 티올 및 히드록실기는 친핵성이고, 반응하여 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원 가능한 쇄간 디설파이드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체를 환원제, 예를 들어 DTT (디티오트레이톨)로 처리함으로써 링커 시약과의 컨쥬게이션을 위해 반응성이 되도록 할 수 있다. 이로써, 각 시스테인 브릿지는 이론적으로, 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 아민을 티올로 전환시켜 주는 리신과 2-아미노티올란 (트라우트(Traut) 시약)의 반응을 통하여 부가의 친핵기를 항체 내로 도입할 수 있다.
링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 부분을 도입하도록 항체를 변형시킴으로써 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트를 또한 생성시킬 수 있다. 당화 항체의 당을, 예를 들어 퍼요오데이트 산화 시약으로 산화시켜 링커 시약 또는 약물 부분의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤기를 형성할 수 있다. 이로써 생성된 이민 쉬프(Schiff) 염기 기는 안정한 결합을 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어, 수소화붕소 시약에 의해 환원시켜 안정한 아민 결합을 형성시킬 수 있다. 한 양태에서는, 당화 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 약물 상의 적당한 기와 반응할 수 있는 단백질 내에 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기가 생성될 수 있다 (문헌 [Hermanson, Bioconjugate Techniques]). 또다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질을 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응시키면, 제1 아미노산 대신 알데히드가 생성될 수 있다 (문헌 [Geoghegan ＆ Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146]; US 5362852). 이러한 알데히드는 약물 부분 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
마찬가지로, 약물 부분 상의 친핵기에는 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자기, 예를 들어 (i) 활성 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어, 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실 및 말레이미드기와 공유 결합을 형성하기 위해 반응할 수 있는, 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
별법으로, 항체와 세포독성제를 포함하는 융합 단백질을 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 일정 길이의 DNA는 컨쥬게이트의 목적하는 특성을 파괴시키지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 격리되거나 또는 서로 인접해 있는 컨쥬게이트의 두 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 항체를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (예를 들어 스트렙타비딘)에 컨쥬게이션시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 컨쥬게이트를 환자에게 투여한 다음, 청소제를 사용하여 결합되지 않은 컨쥬게이트를 순환물로부터 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어 방사성뉴클레오티드)와 컨쥬게이션되는 "리간드" (예를 들어 아비딘)를 투여한다.
항체 유도체
본 발명의 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백질원성 부분을 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 유도체화에 적합한 부분은 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물을 들 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성에 기인하여 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있으며, 분지되거나 비분지될 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 초과의 중합체가 부착될 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 종류는 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건하에서 치료요법에 사용될 것인지 여부 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 고려사항을 기초로 측정될 수 있다.
제약 제제
본 발명의 조성물의 치료 제제는 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 조성물을 혼합함으로써 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]) 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 저장용으로 제조될 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류; 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터-이온; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 및/또는 트윈(TWEEN)(상표명), 플루로닉스(PLURONICS)(상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 들 수 있다.
본원의 제제는 또한 치료될 특정 증상에 필요한 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 보충적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도되는 목적에 유효한 양으로 조합물 내에 존재한다.
활성 성분은 또한 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에서, 또는 매크로에멀젼에서, 코아세르베이션 기술에 의해, 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
서방형 제제는 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 매트릭스가 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태인 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 루프론 데포(LUPRON DEPOT)(상표명) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 들 수 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 동안에 걸쳐 분자의 방출을 가능하게 하는 반면, 특정 히드로겔은 보다 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 이뮤노글로불린이 체내에 오랜 시간 동안 잔류할 경우, 이들은 37℃에서 수분에 노출된 결과로 변성되거나 응집되어 생물학적 활성의 소실 및 면역원성의 가능한 변화를 초래할 수 있다. 합리적인 전략이 관련된 메카니즘에 따른 안정화를 위해 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통해 분자내 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀질 경우, 안정화는 술프히드릴 잔기를 개질하고, 산성 용액으로부터 동결건조하고, 적절한 첨가제를 사용하여 수분 함량을 조절하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.
용도
본 발명의 항체는 예를 들어 시험관내, 생체외 및 생체내 치료 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 시험관내, 생체외 및/또는 생체내에서 특정 항원 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하는 길항제로서 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체의 적어도 일부는 다른 종으로부터 항원 활성을 중화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 예를 들어 항원을 함유하는 세포 배양물에서, 인간 대상체에서, 또는 본 발명의 항체가 교차-반응하는 항원을 갖는 다른 포유동물 대상체 (예를 들어 침팬지, 비비, 명주원숭이, 시노몰구스 및 레수스, 돼지 또는 마우스)에서 특정 항원 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 항체를 항원과 접촉시켜 항원 활성이 억제되도록 함으로써 항원 활성을 억제하는데 사용된다. 바람직하게는, 항원은 인간 단백질 분자이다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 대상체에서의 항원 활성이 억제되도록 본 발명의 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 항원 활성이 결정적인 장애 를 앓고 있는 대상체에서 항원을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 항원은 인간 단백질 분자이며, 대상체는 인간 대상체이다. 별법으로, 대상체는 본 발명의 항체가 결합하는 항원을 발현하는 포유동물일 수 있다. 추가의 대상체는 항원이 도입되는 (예를 들어 항원의 투여에 의해 또는 항원 트랜스진의 발현에 의해) 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료 목적을 위해 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 수의학 목적으로서 또는 인간 질환의 동물 모델로서, 이뮤노글로불린이 교차-반응하는 항원을 발현하는 비-인간 포유동물 (예를 들어 영장류, 돼지 또는 마우스)에 투여될 수 있다. 후자에 관해서, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는데 (예를 들어 투여량 및 투여의 시간 과정을 시험하는데) 유용할 수 있다. 치료적으로 유용한 본 발명의 차단 항체는 예를 들어 항-HER2, 항-VEGF, 항-IgE, 항-CD11, 항-인터페론 및 항-조직 인자 항체를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 항체는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프양 악성종양; 신경, 아교, 별아교, 시상하부, 및 다른 선, 대식세포, 표피, 간질 및 모세포 장애; 및 염증성, 혈관신생 및 면역원성 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 항원 분자의 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 질환, 장애 또는 상태의 치료, 억제, 진행의 지연, 발생의 방지/지연, 경감 또는 예방에 사용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 차단 항체는 리간드 항원에 특이적이며, 리간드 항원에 관여하는 리간드-수용체 상호작용을 차단하거나 간섭하여 상응하는 신호 경로 및 다른 분자 또는 세포 이벤트를 억제함으로써 항원 활성을 억제한다. 본 발명은 또한 반드시 리간드 결합을 억제하지는 않지만 수용체 활성화를 간섭함으로써, 리간드 결합에 의해 통상적으로 개시될 임의의 반응을 억제하는 수용체-특이적 항체를 특징으로 한다. 본 발명은 또한 바람직하게는 또는 배타적으로 리간드-수용체 복합체에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 또한 특정 항원 수용체의 아고니스트로 작용하여 리간드-매개된 수용체 활성화의 모든 또는 부분적 활성을 증강, 증진 또는 활성화시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포독성제와 컨쥬게이션된 항체를 포함하는 이뮤노컨쥬게이트가 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 그가 결합된 이뮤노컨쥬게이트 및/또는 항원은 세포에 의해 내재화되어 이것이 결합하는 표적 세포를 사멸시키는 이뮤노컨쥬게이트의 치료 효능을 증가시킨다. 일 실시양태에서, 세포독성제는 표적 세포에서 핵산을 표적화하거나 간섭한다. 이러한 세포독성제의 예로는 본원에 언급된 임의의 화학요법제 (예를 들어 마이탄시노이드 또는 칼리케아미신), 방사성 동위원소, 또는 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제를 들 수 있다.
본 발명의 항체는 치료요법에서 단독으로 또는 다른 조성물과 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 또다른 항체, 화학요법제(들) (화학요법제의 칵테일 포함), 다른 세포독성제(들), 항-혈관신생제(들), 사이토킨 및/또는 성장 억제제(들)과 함께 공동-투여될 수 있다. 본 발명의 항체가 종양 성장을 억제할 경우, 이는 또한 종양 성장을 억제하는 1종 이상의 다른 치료제(들)과 조합되는 것이 특히 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 치료 계획에서, 예를 들어 직장결장암, 전이성 유방암 및 신장암을 비롯한 본원에 기재된 임의의 질환의 치료에 있어서, 항-VEGF 항체 (예를 들어, 아바스틴(AVASTIN)) 및/또는 항-ErbB 항체 (예를 들어 헤르셉틴(등록상표) 항-HER2 항체)와 조합될 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 환자는 조합된 방사선 요법 (예를 들어 외부 빔 조사 또는 항체와 같은 방사선 표지된 제제를 사용한 요법)을 받을 수 있다. 상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합된 투여 (2종 이상의 작용제가 동일한 또는 별개의 제제에 포함될 경우), 및 개별 투여를 포함하며, 이 경우 본 발명의 항체의 투여는 부가 요법 또는 요법들의 투여 전 및/또는 후에 일어날 수 있다.
본 발명의 항체 (및 부가 치료제)는 비경구, 피하, 복막내, 폐내 및 비내, 및 필요할 경우 국소 치료용으로, 병변내 투여를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는 적합하게는 특히 항체의 감소하는 투여량으로 펄스 주입에 의해 투여된다. 투여량은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로 투여가 간단한지 또는 만성인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해서일 수 있다.
본 발명의 항체 조성물은 우수한 의학적 실시와 일치하는 방식으로 제제화, 투여량화 및 투여될 것이다. 본 내용에서 고려하는 인자로는 치료될 특정 장애, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의학 실시자에게 공지된 다른 인자를 들 수 있다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로 해당 장애를 예방하거나 치료하는데 통상적으로 사용되는 1종 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 본 발명의 항체의 양, 장애 또는 치료의 종류, 및 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이는 일반적으로 상기 사용된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로 또는 지금까지 사용된 1 내지 99％가 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 화학요법제와 같은 다른 작용제와 조합으로 사용될 경우)은 치료될 질환의 종류, 항체의 종류, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지, 이전의 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 참여하는 의사의 결정에 의존할 것이다. 항체는 적합하게는 1회로 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 질환의 종류 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 별개 투여로든 연속 주입으로든, 항체 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어 O.1 mg/kg 내지 1O mg/kg)이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 한 가지 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상이다. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 치료는 상태에 따라 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지연된다. 항체의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투여량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 매 3주마다 (예를 들어 환자가 약 2 내지 20, 예를 들어 약 6 투여량의 항체를 받도록) 투여될 수 있다. 보다 높은 초기 부하 투여량 후 1회 이상의 투여량이 투여될 수 있다. 예시적인 투여량 처방은 약 4 mg/kg의 항체의 초기 부하 투여량 후 약 2 mg/kg의 항체를 매주 유지 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투여량 처방도 유용할 수 있다. 상기 치료요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링된다.
제조품
본 발명의 또다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기, 및 상기 용기 상에 또는 그와 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 들 수 있다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물을 그 자체로, 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또다른 조성물과 조합으로 포함하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 천공가능한 스토퍼를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 1종 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 암과 같은 선택의 상태를 치료하는데 유용함을 지시한다. 더욱이, 제조품은 (a) 그 안에 함유된 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 갖는 제1 용기; 및 (b) 그 안에 함유된 추가의 세포독성제를 포함하는 조성물을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서 제조품은 제1 및 제2 항체 조성물이 특정 상태, 예를 들어 암을 치료하는데 사용될 수 있음을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 제조품은 주사용 정균수 (BWFI), 인산염-완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 비롯한 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
이하는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적 기재가 주어졌으므로 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있음이 이해된다.
본원의 실시예는 알파4베타7 인테그린의 베타7 서브유닛에 결합하는 래트 항-마우스 항체로부터의 인간화 항-베타7 항체의 생성을 기재한다.
실시예 1: 베타7 길항제 항체의 인간화
재료 및 방법
잔기 수는 카바트에 따른다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). 단일 문자 아미노산 약어가 사용된다. DNA 축퇴는 IUB 코드를 이용하여 표시된다 (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B = C/G/T, H = A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W = A/T, Y = C/T).
수용자 인간 컨센서스 프레임워크 상으로의 직접 초가변 영역 이식물 - 본 작업에 사용하기 위한 파지미드 pVO350-2b는 본질적으로 문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93]에 기재된 바와 같이 phoA 프로모터의 제어하의 2개의 오픈 리딩 프레임을 갖는 일가 Fab-g3 제시 벡터이다. 제1 오픈 리딩 프레임은 수용자 경쇄의 VL 및 CH1 도메인에 융합된 stII 신호 서열로 이루어지며, 제2 오픈 리딩 프레임은 부 파지 외피 단백질 P3의 말단절단된 형태에 이어진 수용자 중쇄의 VH 및 CH1 도메인에 융합된 stII 신호 서열로 이루어진다 (문헌 [Lowman, H. et al. (1990) Biochemistry 30:10832]).
래트 Fib504 (하이브리도마 ATCC HB-293에 의해 생산된 항체 FIB504.64, 미국 20108 버지니아주 마나사스 피.오.박스 1549 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))의 VL 및 VH 도메인은 인간 컨센서스 카파 I (huKI) 및 인간 아군 III 컨센서스 VH (huIII) 도메인과 함께 정렬된다. 초가변 영역 (HVR) 이식물을 제조하기 위해, 하기 프레임워크를 사용하였다: HuKI를 경쇄 가변 도메인 프레임워크에 대해 사용하였다 (도 1A 및 7 참조). 중쇄 가변 도메인 프레임워크인 수용자 VH 프레임워크에 대해, 3개 위치 R71A, N73T 및 L78A에서 humIII 서열과 상이한 변형된 인간 아군 III (humIII) 컨센서스 VH 도메인을 사용할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)] 참조) (도 1B 참조). 본 발명의 항체의 생성에서, 504K-RF 이식물은 하기 아미노산 치환: A71R 및 A78F의 생성에 의해, 변형된 인간 아군 III 컨센서스 VH 도메인으로부터 제조되었다.
래트 Fib504 (하이브리도마 ATCC HB-293에 의해 생산됨) 항체로부터의 초가변 영역을 수용자 인간 아군 III 컨센서스 VH 프레임워크로 유전자조작하여 직접 HVR-이식물 (Fib504 이식물)을 생성하였다 (도 1B 참조). VL 도메인에서, 래트 Fib504로부터의 하기 영역을 인간 컨센서스 수용자, huKI에 이식하였다: 위치 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3) (도 1A). VH 도메인에서, 위치 26 내지 35 (H1), 49 내지 65 (H2) 및 94 내지 102 (H3)를 이식하였다 (도 1B). 또한, L2에 대한 확장된 정의에 기초하여, HVR, VL 위치 49 내에 또한 포함된 제2 HVR 이식물, Fib504K 이식물을 구축하였다 (문헌 [MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]). 맥칼럼(MacCallum) 등은 항체 및 항원 복합체 결정 구조를 분석하였고, 경쇄의 위치 49 및 중쇄의 위치 49 및 94가 항원 접촉 영역의 일부이며, 따라서 상기 위치는 본원에 개시된 인간화 항-베타7 항체에 대한 HVR-L2, HVR-H2 및 HVR-H3의 정의에 포함되었다.
직접-이식물 변이체를 각각의 초가변 영역에 대한 별개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 쿤켈(Kunkel) 돌연변이유발법에 의해 생성하였다 ([Kunkel et al. (1987)] 상기 문헌). 정확한 클론을 DNA 시퀀싱에 의해 평가하였다.
초가변 영역의 연성 무작위화:
"연성 무작위화"의 과정 (미국 출원 제60/545,840호 참조)은 항체의 초가변 영역과 같은 선택된 단백질 서열의 편향된 돌연변이유발 절차를 지칭한다. 상기 방법은 각각의 선택된 위치에서 대략 10 내지 50％ 돌연변이를 도입하면서, 뮤린, 래트 또는 다른 출발 초가변 영역 서열을 향한 편향성을 유지한다. 상기 기술은 사용되는 라이브러리 스크리닝의 용량을 증가시키고 항체에 의해 인식된 항원 에피토프의 변화를 회피한다. 상기 연성 무작위화 기술에 따라, 뮤린 초가변 영역 서열을 향한 편향성을 유지하는 전략을 이용하여 서열 다양성이 각각의 초가변 영역 내로 도입된다. 이는 문헌 [Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233-1251 (1994)]에 의해 최초로 기재된 독성화 올리고뉴클레오티드 합성 전략을 이용하여 달성되었다. 그러나, 실수 유발 PCR, DNA 셔플링(shuffling) 등과 같은 비-인간 초가변 영 역 잔기를 향한 편향성을 유지하기 위한 다른 방법이 이용가능하다.
본원에서 사용된 방법에 따르면, 돌연변이될 초가변 영역 내의 주어진 위치에 대해, 야생형 아미노산을 코딩하는 코돈은 각각의 선택된 초가변 영역 위치에서 대략 50％ 돌연변이율을 초래하는 뉴클레오티드의 혼합물 (예를 들어 70-10-10-10 혼합물)로 독성화된다. 이를 달성하기 위해, 돌연변이될 야생형 초가변 영역 아미노산을 코딩하는 코돈은 뉴클레오티드의 70-10-10-10 혼합물과 같은 다른 3개의 뉴클레오티드의 저 수준의 오염 혼합물로 합성된다. 따라서, 예로서, PRO (CCG)의 연성 무작위화를 위해, 합성된 제1 위치는 70％의 C 및 10％의 각각의 G, T 및 A의 혼합물이고, 제2 위치는 70％의 C 및 10％의 각각의 A, G 및 T의 혼합물이고, 제3 위치는 70％ G 및 10％의 각각의 A, C 및 T의 혼합물이다. 편향성은 주어진 위치에서 합성될 코돈, 특정 아미노산을 암호화하는 코돈의 수, 및 올리고뉴클레오티드 합성이 합성 혼합물의 뉴클레오티드 조성물에 의해 독성화되는 정도에 따라 상향 또는 하향 조정될 수 있다.
연성 무작위화된 올리고뉴클레오티드는 뮤린, 래트 또는 다른 출발 초가변 영역 서열 뒤에 패턴화되며, 직접 초가변 영역 이식물에 의해 한정된 동일한 영역을 포함할 수 있다. 임의로, VH 도메인의 H2 및 H3의 시작부에서 2개 위치, 아미노산은 그의 다양성에서 제한될 수 있으며; 코돈 RGC는 A, G, S 또는 T를 코딩하는 위치 49에 대해 사용될 수 있고, 위치 94에서 코돈 AKG는 M 또는 R을 코딩하는데 사용될 수 있다.
파지 라이브러리의 생성 - 각각의 초가변 영역에 대해 설계된 무작위화된 올 리고뉴클레오티드 풀(pool)을 올리고뉴크레오티드 660 ng, 50 mM 트리스(Tris) (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 20 mM DTT 및 폴리뉴클레오티드 키나제 5 U를 함유하는 6개의 20 ㎕ 반응물에서 37℃에서 1시간 동안 개별적으로 인산화시켰다. 그 후, 6개의 인산화된 올리고뉴클레오티드 풀을 50 mM 트리스 (pH 7.5), 10 mM MgCl2 중 쿤넬 주형 20 ㎍과 합하여 최종 부피 500 ㎕로 함으로써 올리고뉴클레오티드 대 주형 비율 3을 얻었다. 혼합물을 90℃에서 4분 동안, 50℃에서 5분 동안 어닐링한 후, 얼음 상에서 냉각시켰다. 과량의 비-어닐링된 올리고뉴클레오티드를 변형된 프로토콜을 이용하여 퀴아퀵(QIAQUICK)(상표명) PCR 정제 키트 (퀴아젠(Qiagen) 키트 28106, 미국 캘리포니아주 발렌시아에 소재하는 퀴아젠)로 제거하여 어닐링된 DNA의 초과 변성을 방지하였다. 어닐링된 혼합물 500 ㎕에 퀴아젠 완충액 PB 150 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 2개의 실리카 컬럼 사이에 나누었다. 각각의 컬럼을 퀴아젠 완충액 PE 750 ㎕로 세척하고, 여분을 스핀하여 컬럼을 건조시킨 후, 각각의 컬럼을 10 mM 트리스, 1 mM EDTA (pH 8) 110 ㎕로 용리하였다. 그 후, 어닐링되고 세척된 주형 (220 ㎕)을, 10O mM ATP 1 ㎕, 25 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 25 mM) 10 ㎕, 10O mM DTT 15 ㎕, 1OX TM 완충액 (0.5 M 트리스 (pH 7.5), 0.1 M MgCl2) 25 ㎕, T4 리가제 2400 U 및 T7 폴리머라제 30 U를 실온에서 3시간 동안 첨가함으로써 충전하였다.
충전된 생성물을 트리스-아세테이트-EDTA/아가로스 겔 상에서 분석하였다 (문헌 [Sidhu et al., Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)]). 3개의 밴드 를 보통 볼 수 있다: 바닥 밴드는 정확하게 충전되고 라이게이션된 생성물이고, 중간 밴드는 충전되지만 비-라이게이션된 생성물이고, 상부 밴드는 가닥이 대체된 생성물이다. 상부 밴드는 T7 폴리머라제의 고유 부활성에 의해 생산되며 회피되기 어렵지만 (문헌 [Lechner et al., J. Biol. Chem. 258:11174-11184 (1983)]); 상기 밴드는 바닥 밴드보다 30배 덜 효과적으로 형질전환되며, 통상적으로 라이브러리에 거의 기여하지 않는다. 중간 밴드는 최종 라이게이션 생성물에 대한 5' 포스페이트의 부재 때문이며, 상기 밴드는 효과적으로 형질전환되고 주로 야생형 서열을 생성한다.
그 후, 충전된 생성물을 문헌 [Sidhu et al., Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)]에 기재된 바와 같이 세척하고, SS320 세포 내로 전기천공하고, M13/KO7 헬퍼 파지의 존재하에서 번식시켰다. 라이브러리 크기는 1 내지 2 x 109 비의존성 클론 범위였다. 초기 라이브러리로부터의 무작위 클론을 시퀀싱하여 라이브러리 양을 평가하였다.
파지 선별 - 전장 인간 인테그린 알파4베타7을 293 세포에서 발현시키고 (문헌 [Graham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977)]), Fib504 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하고, 파지 선별을 위한 표적으로서 사용하였다. 맥시소르프(MaxiSorp) 미세역가판 (미국 뉴욕주 로체스터에 소재하는 낼지 눈크(Nalge Nunc)) 상에 고정하기 위해, 인간 인테그린 알파4베타7 100 ㎕을 150 mM NaCl, 50 mM 트리스 pH 7.5, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 및 2 mM MnCl2 (TBSM) 중 5 ㎍/mL로 4℃ 에서 밤새 코팅하였다. 웰을 1％ BSA를 함유하는 TBSM을 사용하여 1시간 동안 차단하였다. 선택의 제1 라운드에 대해, 표적으로 코팅된 8개의 웰을 사용하고, 단일 표적 코팅된 웰을 선택의 후속 라운드에 대해 사용하였다. 파지를 배양물 상청액으로부터 수거하고, 1％ BSA 및 0.05％ 트윈(상표명) 20 (TBSMBT)을 함유하는 TBSM에 현탁시켰다. 2시간 동안 웰에 결합시킨 후, 비-결합된 파지를, 0.05％ 트윈 20 (TBST)을 함유하는 TBS로 심도있게 세척함으로써 제거하였다. 결합된 파지를, 웰을 100 mM HCl과 함께 30분 동안 인큐베이션함으로써 용리하였다. 파지를 탑10 세포 및 M13/KO7 헬퍼 파지를 사용하여 증폭하고, 2YT, 50 ㎍/mL 카르바나실린에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 표적 코팅된 웰로부터 용리된 파지의 역가를 비-표적 코팅된 웰로부터 회수된 파지의 역가와 비교하여 풍부도를 평가하였다. 선택의 4 라운드를 수행한 후, 무작위 클론을 서열 분석을 위해 선별하였다.
Fab 생성 및 친화도 결정 - 친화도 측정에 대해 Fab 단백질을 표현하기 위해, 정지 코돈을 파지 제시 벡터의 중쇄 및 g3 사이에 도입하였다. 클론을 이. 콜라이 34B8 세포 내로 형질전환하고, AP5 배지에서 30℃에서 성장시켰다 (문헌 [Presta, L. et al., Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)]). 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 10 mM 트리스, 1 mM EDTA (pH 8)에 현탁시키고, 미세유동화기를 사용하여 파쇄 개방하였다. Fab를 단백질 G 친화도 크로마토그래피로 정제하였다.
친화도 결정을 비아코어(상표명)-3000 (미국 뉴저지주 피스캐터웨이에 소재하는 비아코어)을 사용한 표면 플라즈몬 공명법에 의해 수행하였다. 인간화 Fib504 Fab 변이체를 CM5 센서 칩 상의 1O mM 아세테이트 pH 4.5 (250 내지 1500 반응 단위 (RU) 범위)에 고정화시키고, 2% n-옥틸글루코시드를 함유하는 TBSM 중 인간 인테그린 알파4베타7의 2배 희석액을 주사하였다. 각각의 샘플을 5-분 결합 및 5 내지 60-분 해리 시간으로 분석하였다. 각각의 주사 후, 칩을 8 M 우레아의 3회 1-분 주사를 이용하여 재생성하였다. RU를 블랭크 유동 세포로부터 뺌으로써 결합 반응을 보정하였다. kon 및 koff의 동시 적합화 1:1 랭뮤어 모델을 동력학 분석에 이용하였다.
결과 및 토의
래트 Fib504의 인간화 - 인간화에 사용된 인간 수용자 프레임워크는 헤르셉틴(등록상표)에 대해 사용된 프레임워크를 기초로 하며, 컨센서스 인간 카파 I (huKI) VL 도메인 및 인간 아군 III (humIII) 컨센서스 VH 도메인의 변이체로 이루어진다. 상기 변이체 VH 도메인은 인간 컨센서스로부터의 3개의 변화: R71A, N73T 및 L78A를 갖는다. 래트 Fib504의 VL 및 VH 도메인을 인간 카파 I 및 아군 III 도메인과 함께 정렬하였으며, 각각의 초가변 영역 (HVR)을 확인하고, 인간 수용자 프레임워크 내로 이식하여, 파지 상에 Fab로서 제시될 수 있는 HVR 이식물 (504 이식물)을 생성하였다 (도 1A 및 1B).
이용가능한 항체 및 항원 복합체 결정 구조의 분석에 기초하여, 맥칼럼 등 (문헌 [MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)])은 항원과 빈번히 접촉하는 가변 도메인 잔기에 기초하여 HVR 정의를 제안하였다. 따라서, 중쇄의 위치 49G 및 94M은 Fib504의 HVR 이식물에 포함되었다 (도 1B). 또한, 경쇄의 위 치 49K를 포함하는 제2 HVR 이식물인 Fib504K 이식물이 생성되었는데, 이는 상기 위치가 HVR-L2의 접촉 정의 내이고 항원 접촉으로서 기능할 수 있기 때문이다 (도 1A). Fib504 또는 Fib504K 이식물을 파지 상에 제시하고, 고정화된 알파4베타7에의 결합에 대해 시험하였을 때, 결합이 관찰되지 않았다.
각각의 HVR 영역이 동시에 연성 무작위화된 Fib504 및 Fib504-K HVR 이식물 둘다를 사용하여 라이브러리를 생성하였다. 각각의 HVR 이식물 라이브러리를 고정화된 알파4베타7에 대해 선택의 4개 라운드에 대해 패닝하였다. 풍부화가 관찰되지 않았으며, DNA 서열 분석을 위해 고른 서열은 6개의 HVR 영역에 대해 표적화된 무작위 서열 변화만을 나타냈다.
2개의 추가의 VH 프레임워크 서열인 "RL" 및 "RF"를 수용자 프레임워크로서 검사하였고, 이는 위치 71 및 78에서 변화를 함유하였다. 위치 71은 인간 아군 III 컨센서스에서와 같이 아르기닌으로 변화되었고, 위치 78은 인간 아군 III 컨센서스 (수용자 프레임워크 "RL")에서와 같이 류신, 또는 인간 아군 II 컨센서스 및 래트 Fib504 VH 프레임워크 (수용자 프레임워크 "RF")에서와 같이 페닐알라닌으로 변화되었다 (도 10A). "RL" (Fib504-RL 및 Fib504K-RL) 또는 "RF" (Fib504-RF 및 Fib504K-RF) 수용자 프레임워크 내의 Fib504 또는 Fib504K 이식물을 파지 상에 제시하고, 고정화된 알파4베타7에 대한 결합에 대해 시험하였을 때, "RF" 프레임워크를 사용하여 특이적 파지 결합만이 Fib504K 이식물에 대해 관찰되었다 (도 10B). Y49K (경쇄) 및 L78F (중쇄)가 없는 다른 이식물에 비해 Fib504-RF 이식물을 제시하는 파지의 적당한 결합은 유용한 수용자 프레임워크를 선택하는데 있어서 상기 위치의 중요성을 지시한다.
Fib504K-RL 및 Fib504K-RF 이식물에 대해 각각의 6개의 HVR에서 동시에 연성 무작위화 전략을 이용하기 전 라이브러리를 생성하고, 상기 기재된 바와 같이 고정화된 알파4베타7 상에서 선택의 4개 라운드에 대해 분류하였다. 풍부화는 Fib504K-RF 이식물을 기초로 한 라이브러리에 대해서만 관찰되었다. Fib504K-RF 라이브러리의 라운드 4로부터의 클론을 서열 분석을 위해 선별하고, HVR-L1에 표적화된 아미노산 변화를 밝혀내었다. 대부분의 클론은 변화 Y32L을 포함하였으며, 또한, 위치 31은 빈번히 D, S, P 또는 N으로 변화되었다 (도 1C). 출발 이식물인 Fib504K-RF 이외에, 3개의 클론을 발현시키고, Fab 단백질로서 정제하고, 상기 기재된 바와 같이 비아코어에 의해 추가로 분석하였다. 클론 hu504-5, hu504-16 및 hu504-32 (치환 T31S 플러스 Y32L (변이체 hu504.5), Y32L (변이체 hu504.16) 또는 T31D 플러스 Y32L (변이체 hu504.32)를 함유하는 서열 1의 변이체; 도 1C 참조)는 Fib504K-RF에 비해 알파4베타7에의 우수한 결합을 나타내며, 알파4베타7에의 결합에 대한 키메라 Fib504 Fab의 친화도를 충족시키거나 초과한다. 비아코어 분석 결과는 하기 표 3에 나타나 있으며, 이는 본원에 개시된 HVR 및/또는 프레임워크 영역에서의 선택된 변이가 출발 항체에 대해 개선된 친화도를 갖는 알파4베타7에 대한 길항제 항체를 생성함을 지시한다. 표 3의 결과는 인간화 변이체 504.32가 출발 래트 항체에 비해 알파4베타7에의 3배 더 긴밀한 결합에 의해 친화도의 가장 큰 증가를 나타냈음을 지시한다.
표 3의 결과는 또한 HVR-L1의 재설계가 고 친화도 항원 결합의 복구에 중요함을 지시한다. 특히, 돌연변이 Y32L은 다양한 클론 중에서 가장 빈번하였다. 위치 31에서의 다른 변화 및 HVR-H1 전반에 걸친 다른 치환은 잘 내성인 것으로 보이며, 추가의 개선을 제공할 수 있다. 상기 결과로부터, 인간 프레임워크 상으로 이식된 Fib504의 친화도를 개선시켜 초기 래트 항체의 친화도를 충족시키거나 초과하는 친화도를 생성할 수 있는 다중 서열 변화가 있음이 명백하다.
따라서, 인간 수용자 스캐폴드(scaffold) 내로의 6개의 래트 Fib504 HVR의 이식물로부터 출발하여, 위치 49를 포함하는 HVR-L2의 확장 (리신), 위치 49를 포함하는 HVR-H2의 확장 (글리신) 및 위치 94를 포함하는 HVR-94의 확장 (메티오닌), 뿐만 아니라 VHR-L1의 위치 32의 아미노산 변화 (L 또는 I가 Y를 대체할 경우), 및 임의로 VHR-L1의 위치 31에서의 아미노산 변화 (예를 들어 T가 D 또는 S로 대체될 경우). 유용한 프레임워크 아미노산 변화는 VH 도메인에서 위치 71 (A71R) 및 78 (L78F)에서 이루어졌다. 이러한 아미노산 변화는 예를 들어 알파4베타7 인테그린에 대해 3배 개선된 결합 친화도를 갖는 완전한 인간 항체, 변이체 hu504.32를 초래한다. 또한, 본원에 기재된 선별된 인간화 항체는 모 래트 Fib504 항체만큼 적어도 필적할 만한 생물학적 활성을 갖는 것으로 측정되었다 (본원의 실시예 3 참조).
실시예 2: 추가의 인간화 Fib504 HVR 변이체
인간화 변이체 Fib504.32의 HVR 아미노산 서열을 추가로 변형시켜 베타7 인테그린 서브유닛 및/또는 베타7 서브유닛을 함유하는 인테그린의 활성을 길항할 수 있는 추가의 변이체를 생성하였다.
광범위 아미노산 스캔 라이브러리 생성 - 변이체 hu504.32의 베타7-결합 변이체를 생성할 수 있는 다른 아미노산 잔기에 대해 선택된 HVR 위치를 스캔하기 위한 라이브러리를 3개의 올리고뉴클레오티드: hu504.32 HVR-L1 서열을 향한 편향성을 갖는 HVR-L1의 일부분을 연성 무작위화하도록 설계된 504-L1 (즉, 서열 ASESVDDLLH (상대 위치 A2 내지 A11에 대해 서열 47)은 상기 기재된 바와 같이 연성 무작위화됨); 및 경쇄의 HVR-L3 위치 96 및 중쇄의 HVR-H3 위치 94에서 NNS를 도입하여 상기 위치에서 모든 20개의 아미노산을 허용하는 HVR-L3 504-N96 및 HVR-H3 504-M94를 이용하여 생성하였다. 상기 3개의 올리고뉴클레오티드로, 광범위 아미노산 스캔 라이브러리를, 경쇄에 3개의 정지 코돈 (HVR-L1 내의 위치 31 및 32 및 HVR-L3 내의 위치 96) 및 중쇄에 1개의 정지 코돈 (HVR-H3 내의 위치 94)을 함유하는 주형을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 생성하였다.
hu504-32의 광범위 아미노산 스캔 - HVR-L1에 허용된 바람직한 서열을 보다 완전히 조사하고 504-32의 안정성을 증진시키기 위해, 본 발명자들은 파지 라이브러리를 a) 인간화 동안 변화가 관찰된 영역 내의 504-32의 HVR-L1을 연성 무작위화하고 (즉, ASESVDDLLH (상대 위치 A2 내지 A11에 대해 서열 47) (도 1C)) 및 b) HVR-L3 내의 N96 및 HVR-H3 내의 M94에서 모든 가능한 아미노산을 허용하도록 설계하였다. 상기 기재된 바와 같은 고정화된 전장 인간 인테그린 알파4베타7에 대해 선택의 4개 라운드 후, 96개의 무작위 클론을 서열 분석을 위해 선별하였다. 아미노산이 광범위 아미노산 스캔 라이브러리 내의 각각의 위치에서 발견되는 빈도는, hu504-32에 존재하는 HVR-L1 서열 및 중쇄 내의 위치 94에서의 메티오닌이 고 친화도 결합을 위해 최적임을 암시한다 (도 12). 변이체 504.32로부터 출발한 선택에 의해 수득된 가장 바람직한 아미노산 (도 12)은 황색으로 나타낸다. 반대로, 아스파라긴은 hu504-32의 경쇄 내의 위치 96에 존재하지만, 광범위 아미노산 스캔에서 상기 위치에서 관찰된 류신의 높은 빈도는 알파4베타7에 대한 인간화 Fib504 변이체의 친화도를 추가로 개선하고, 또한 상기 위치에서 임의의 잠재적인 탈아미노화 문제를 제거할 수 있었음을 암시한다. 도 12에서의 정보는 또한 다수의 대체 아미노산이 친화도의 잠재적인 손실 없이 대부분의 위치에서 내성일 것임을 암시한다. 예를 들어, HVR-H3 내의 M94의 산화를 제거하기 위해, 글루타민 또는 아르기닌이 치환될 수 있다.
제한된 아미노산 스캔 라이브러리 생성 - 제한된 아미노산 스캔에 대한 6개의 라이브러리는 6개의 상이한 쿤켈 주형을 이용하였으며, 각각은 6개의 HVR 중 하나 내에 위치된 하나의 정지 코돈을 함유한다. 각각의 라이브러리를 단일 HVR을 코딩하는 단일 올리고뉴클레오티드를 이용하고 도 11A ("코돈" 컬럼)에 열거된 코돈을 이용하여 생성하여, 아미노산 잔기를 베타7 또는 알파4베타7에의 결합에 대해 후속 시험하기 위해 변경시켰다. 동일한 절차를 이용하여 항-베타7 항체의 아미노산 잔기를 변경시키고, 이를 알파E베타7 인테그린에의 결합에 대해 시험하였다.
hu504-32의 제한된 아미노산 스캔 - hu504-16의 제한된 아미노산 스캔을 설계하여 인간 경쇄 및 중쇄 컨센서스 서열과 보다 유사한 hu504-16을 제조하고, 상기 방법에서 결합에 요구되는 래트 Fib504의 최소 서열 요소을 확인하였다. 6개의 라이브러리를 생성하고, hu504-16 및 인간 컨센서스 카파 I 경쇄 또는 아군 III 중쇄 사이에 상이한 위치에서 각각의 HVR에 표적화하였다 (도 1A 및 1B); 래트 또는 인간 아미노산은 라이브러리 내의 상기 위치에서 허용되었다 (도 11A). 올리고뉴클레오티드 합성 및 돌연변이유발 동안 아미노산 둘다에 대한 코딩을 수용하기 위해, 또한 추가의 아미노산을 일부 경우에 도입하였다 (코딩된 아미노산 참조, 도 11A). 제한된 아미노산 스캔 라이브러리를 상기 기재된 바와 같이 고정화된 전장 인간 인테그린 알파4베타7에 대해 선별하고, 대략 32개의 무작위 클론을 라운드 3 후에 각각의 라이브러리로부터 시퀀싱하였다. 각각의 위치에서 발견된 각각의 아미노산의 빈도는 도 11B 및 11C에 나타나 있다.
광범위 아미노산 스캔과 같이, 제한된 아미노산 스캔은 또한 인간화 Fib504 내의 많은 위치에서 무슨 변화가 내성인지에 대한 정보를 제공한다. 그러나, 광범위 아미노산 스캔과 달리, 제한된 아미노산 스캔에 무작위화된 각각의 위치에서 허용되는 다양성은 한 쌍의 아미노산에 제한되었다. 따라서, 주어진 위치에서 임의의 관찰된 치환의 결여는 특정 잔기가 변화될 수 없음을 지시하지 않으며, 주어진 위치에서의 임의의 특정 아미노산의 높은 빈도는 이것이 반드시 고 친화도에 대한 가장 좋은 해결책임을 지시하지는 않는다.
일부 위치 (경쇄의 위치 27, 29, 30, 53, 54 및 중쇄의 50, 54, 58, 60, 61 및 65)에서, 인간 컨센서스 아미노산이 상당히 자주 선택되었고, 이는 인간 컨센서스에 대한 역 돌연변이가 인간 알파4베타7에의 결합을 극적으로 변화시키지 않을 것을 암시한다. 사실, 경쇄 (HVR-L2 내)의 위치 54에서, 인간 컨센서스 아미노산은 래트 Fib504로부터의 아미노산보다 더 빈번히 선택되며, 이는 504-32에 대해 이루어진 상기 변화가 유용한 베타7 결합 항체를 제공함을 지시한다.
또한, 라이브러리 설계의 결과로서, 인간 컨센서스 또는 래트 Fib504로부터 유래되지 않은 아미노산은 일부 위치에서 보다 빈번히 선택되며, 인간화 Fib504 변이체의 친화도를 개선하는 잠재적인 치환을 제공한다. 이는 경쇄 내의 D30A 및 I55V 및 중쇄 내의 Y50F를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 2개의 라이브러리로부터의 결과는, 많은 HVR 위치가 다른 아미노산 치환에 내성이 있으며 여전히 필적할 만한 생물학적 활성을 보유함을 지시한다.
관찰된 아미노산 변화의 요약은 도 13 및 15에 나타나 있다. 도 15는 카바트 넘버링 또는 상대 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치에서의 본 발명의 항체 변이체의 CDR 내의 각각의 위치에서 유용한 다양한 아미노산을 요약한다. 도 13 및 15에 나타낸 변이체에 의해 포함된 각각의 추가의 항체는 본 발명의 실시양태이다.
실시예 3: 세포 부착 분석
본 발명의 일부의 인간화 Fib504 변이체가 세포 표면 상에 발현된 리간드에 결합하는 능력을 세포 부착 분석에 의해 시험하였다. 알파4베타7 및 또다른 베타7 인테그린에 결합하여, 인간화 변이체가 인테그린의 그의 천연 수용체에의 결합을 붕괴시키는 능력에 의해 알파E베타7을 시험하였다. 세포 표면 상에 단독으로 발현된 인간화 Fib504 변이체의 베타7 서브유닛에의 결합을 유사하게 시험하였다. 절차 및 결과는 하기에 기재되어 있다.
IgG 생성 - 인간화 Fib 504 IgG 변이체를 경쇄 및 중쇄에 대한 별개의 벡터를 사용하여 293개 세포에서 일시적으로 발현시켰다 ([Graham et al. (1977)] 상기 문헌). 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인을 각각의 경쇄 및 중쇄에 대한 적합한 발현 벡터 내로 서브클로닝함으로써 벡터를 구축하였다. 인간화 Fib504 변이체의 1.1 L CHO 세포 배양물로부터의 상청액을 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 완충액 A (10 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl)에 평형화된 새로운 1 mL 하이트랩 프로테인(HiTrap Protein) A HP 컬럼 (아머샴/파마시아)에 적용하였다. 샘플을 0.8 mL/분에서 4℃에서 밤새 적용하였다. 그 후, 각각의 컬럼을 세척하고, 30 mL 완충액 A로 평형화시켰다. 항체의 용리를 0 내지 100％ 완충액 B (100 mM 글리신, pH 3.0)로부터의 1 mL/분에서 14분의 선형 구배를 이용하여 FPLC (아머샴/파마시아) 상에서 실온에서 크로마토그래피에 의해 달성하였다. 생성된 1 mL 분획을 1 M 트리스 (pH 8) 75 ㎕를 첨가함으로써 즉시 중화하였다. 용리된 단백질을 280 nm에서 흡수함으로써 검출하고, 피크 분획을 풀링하고, PD1O G-25 세파덱스 일회용 사이징 컬럼 (아머샴/파마시아) 상에 PBS 상으로 탈염시켰다. 단백질을 OD280에 의해 검출하고, 피크 분획을 풀링하였다. PBS 중 항체를 0.22 ㎛ 여과하고, 4℃에서 저장하였다. 아미노산 분석을 이용하여 상기 정제된 항체의 농도를 정량화하고, 값을 2개의 별개의 측정의 평균으로부터 할당하였다.
BCECF 표지:
상기 실시예 3에서 제시된 각각의 분석에서, 세포를 하기 절차에 따라 표지하였다. 부착 분석에 사용된 모든 세포를 베타7 서브유닛로 감염된 RPMI8866 세포 및 38C13 세포 (38C13 베타7 세포)에 대해 10％ FBS를 함유하는 RPMI1640 배지 중 및 알파E베타7-형질감염된 293 세포 (알파E베타7 293 세포)에 대해 10％ FBS를 함유하는 F-12:DMEM 혼합물 (50:50) 중 10 μM의 2',7'-비스-(2-카르복실에틸)-5-(및-6)-카르복시플루오레세인, 아세톡시메틸 에스테르 (BCECF)로 표지하였다. 세포를 30분 동안 표지하고, 분석 배지로 2회 세척하였다. 세포 밀도를 RPMI8866 및 38C13베타7 세포에 대해 3 x 106 세포/mL 및 알파E베타7 293 세포에 대해 2.2 x 106 세포/mL로 조정하였다.
인간화 Fib504 변이체는 MAdCAM에의 알파4베타7 결합을 붕괴시킨다
RPMI8866/MAdCAM-1-Ig 세포 부착: RPMI8866 세포는 그의 표면 상에 알파4베타7을 발현한다 (미국 뉴욕주 버팔로에 소재하는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute)). 인간화 Fib504 변이체 (hu504 변이체)를 고체 지지체 상에 코팅된 IgG에 융합된 RMPI8866 세포 및 MAdCAM의 혼합물과 접촉시켰다. RPMI8866 세포의 MAdCAM-1에의 결합의 50％ 억제를 초래하는 인간화 Fib504 변이체 농도 (IC50)를, 눈크 맥시소르프(상표명) 96-웰 플레이트를 PBS 중 2 ㎍/mL, 100 ㎕/웰 MAdCAM-1-Ig (제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.), Ig는 MAdCAM-1의 Fc 영역에의 융합을 지칭함)로 4℃에서 밤새 측정하였다. 플레이트를 5 mg/mL BSA의 200 ㎕/웰로 실온에서 1시간 동안 차단한 후, 분석 배지 (RPMI 1640 배지, 하이클론(Hyclone)(등록상표), 미국 로간 유타, 5 mg/mL BSA가 보충됨) 중 인간화 Fib504 변이체 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 분석 배지 50 ㎕ 중 150,000 BCECF-표지된 세포 (BCECF, 미국 오레곤주 유진에 소재하는 몰리큘러 프로브스(Molecular Probes))를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 분석 배지 150 ㎕로 2회 세척하여 비-결합된 세포를 제거하였다. 결합된 세포를 50 mM 트리스/HCl pH 7.5 중 0.1％ SDS 100 ㎕로 가용화하였다. 용해된 세포로부터 방출된 형광의 양을 485 nm 여기 530 nm 방출 파장에서 스펙트라맥스 게미니(SPECTRAmax GEMINI)(상표명) (미국 캘리포니아주 서니베일에 소재하는 몰리큘라 디바이시즈(Molecular Devices))에 의해 측정하였다. 4-변수 비선형 최소 제곱 적합치를 이용하여, 형광 값을 각각의 분석에 첨가된 인간화 Fib504 변이체의 농도의 함수로서 분석하여 분석에서 각각의 인간화 Fib504 변이체의 IC50 값을 수득하였다. IC50 및 IC90 값을 4-변수 적합치로부터 추정하였다. 도 14는 결과의 예시적인 플롯이다. 시험된 각각의 변이체에 대한 IC90 및 IC50 값은 하기 표 4에 나타나 있다.
Figure 112007025400271-PCT00030
VCAM에의 알파4베타7 결합의 인간화 Fib504 변이체 붕괴
RPMI8866/7dVCAM-1 세포 부착: RPMI8866/7dVCAM-1 분석은, 7dVCAM-1 (ADP5, 미국 미네소타주 미네아폴리스에 소재하는 알앤디 시스템스(R&D Systems))를 플레이트를 코팅하는데 2 ㎍/mL로 사용한 것을 제외하고는, RPMI8866/MAdCAM-1-Ig와 유사한 형식이다. 결과를 MAdCAM 결합 실험에 대해 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. 시험된 각각의 변이체에 대한 IC50 값은 하기 표 5에 나타나 있다.
Figure 112007025400271-PCT00031
인간 E-카드헤린에의 알파E베타7 결합의 인간화 Fib504 변이체 붕괴
알파E베타7 293/huE-카드헤린 세포 부착: 293 세포 ([Graham et al. (1977)] 상기 문헌)를 알파E 및 베타7 (제넨테크, 인크.)로 형질감염시켰다. 분석 형식은, huE-카드헤린 (648-EC, 미국 미네소타주 미네아폴리스에 소재하는 알앤디 시스템즈)을 플레이트를 코팅하는데 2 ㎍/mL로 사용한 것을 제외하고는, RPMI8866/MAdCAM-1-Ig 분석과 유사하다. 그 후, 플레이트를 상기 언급된 바와 같이 5 mg/mL BSA로 차단하고, 분석 배지 (5 mg/mL BSA가 보충된 F-12:DMEM (50:50)) 중 FIB504 변이체 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 분석 배지 50 ㎕ 중 110,000 BCECF 표지된 세포를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 분석 배지 150 ㎕로 2회 세척하고, 용해된 세포에 의해 방출된 형광의 양을 상기 기재된 바와 같이 측정하고 분석하였다. 상기 실험으로부터의 분석 결과는 표 6에 나타나 있다.
Figure 112007025400271-PCT00032
MAdCAM에의 베타7 결합의 인간화 Fib504 변이체 붕괴
38C13베타7/muMAdCAM-1-Ig 세포 부착 분석: 38C13베타7/muMAdCAM-1-Ig 분석은, muMAdCAM-1-Ig (제넨테크, 인크)를 플레이트를 코팅하는데 2 ㎍/mL로 사용한 것을 제외하고는, RPMI8866/MAdCAM-1-Ig와 유사한 형식이었다. 38C13 알파4+ 뮤린 림프종 세포 (문헌 [Crowe, D.T. et al., J. Biol. Chem. 269:14411-14418 (1994)])를 인테그린 베타7을 코딩하는 DNA로 형질감염시켜 알파4베타7을 세포 표면 상에 발현시켰다. 항체 변이체가 세포막 회합된 알파4베타7 및 MAdCAM 사이의 상호작용을 붕괴시키는 능력을 상기와 같이 수행하였다. 분석 결과는 표 7에 나타나 있다 (2회 실험에 대한 IC50 및 IC90 값을 나타낸다).
Figure 112007025400271-PCT00033
뮤린 VCAM에의 베타7 결합의 인간화 Fib504 변이체 붕괴
38C13베타7/muVCAM-1-Ig 세포 부착 분석: 38C13베타7/muVCAM-1-Ig 분석을, VCAM-1-Ig (제넨테크, 인크.)를 플레이트를 코팅하는데 2 ㎍/mL로 사용한 것을 제외하고는, 상기 뮤린 MAdCAM-1-Ig/RPMI8866 세포 결합 분석에 따라 수행하였다. 분석 결과는 표 8에 나타나 있다 (2회 실험에 대한 IC50 및 IC90 값을 나타낸다).
Figure 112007025400271-PCT00034
인간화 Fib504 변이체 결합 연구의 결과는 본 발명의 인간화 항체가 출발 래트 항체의 친화도로, 일부 실시양태에서는 보다 큰 친화도로, 그의 표적 베타7 인테그린 서브유닛 뿐만 아니라 알파4베타7 및 알파E베타7 인테그린에 결합함을 입증한다. 따라서, 본 발명에 따른 인간화 항-베타7 항체는 항-베타7 인테그린 요법, 특히 인간 요법에 용도를 갖는다.
본 발명의 hu504.32 변이체의 상대 활성
hu504.32 항체의 여러가지 아미노산 변이체를 그의 리간드에의 베타7-함유 수용체 결합을 억제하는 그의 능력에 대해 본원에 개시된 세포 부착 분석 방법에 따라 인간 및 마우스 세포 부착 분석에서 시험하였다. RPMI8866/MAdCAM-1-Fc 분석을 상기 본원에 기재된 바와 같이 수행하였다. 알파E베타7-293/hu E-카드헤린 분석을, 리간드로서 인간 E-카드헤린-Fc (인간 E-카드헤린-Fc, 648-EC, 미국 미네소타주 미네아폴리스에 소재하는 알앤디 시스템스)를 사용하여 변형시켰다. hu504.32 변이체가 인간 피브로넥틴 (huFN40)과 PRMI8866 세포 상의 인간 알파4베타7 수용체의 상호작용을 억제하는 상대적 능력을 또한 검사하였다. 상기 연구에 사용된 RPMI8866/hu 피브로넥틴 (huFN40) 분석은, 인간 피브로넥틴 알파-키모트립신 단편 40 kDa (F1903, 미국 캘리포니아주 테메쿨라에 소재하는 케미콘 인터내셔날(Chemicon International))을 플레이트를 코팅하는데 2 ㎍/mL로 사용한 것을 제외하고는, 본원에 개시된 RPMI8866/MAdCAM-1-Ig 분석에 대한 형식과 유사하다.
hu504.32 변이체가 뮤린 베타7-함유 수용체와 뮤린 MAdCAM-1 또는 뮤린 VCAM-1의 상호작용을 억제하는 능력을 검사하였다. 뮤린 MAdCAM-1-Fc 및 뮤린 VCAM-1-Fc는 hu504.32 변이체에 의해 뮤린 베타7 (38C13베타7 세포)를 발현하는 뮤린 림프종 알파4+ 세포와의 상호작용이 억제되었다. 뮤린 MAdCAM-1-Fc 및 VCAM-1-Fc 세포 부착 분석을, 인간 MAdCAM 및 VCAM에 대해 상기 본원에 기재된 것과 유사하게 수행하였다. 리간드가 Fc 영역에 융합될 경우, 세포 상의 Fc 수용체는 1백만 세포당 0.5 ㎍ 항-CD16/32 항체 (항-Fc감마 III/II 수용체 항체, 카탈로그 번호 553142, 미국 캘리포니아주 산 조스에 소재하는 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences))로 실온에서 5분 동안 차단하였다. 분석 배지 50 ㎕ 중 150,000 표지된 세포를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 13분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 용해된 세포로부터 방출된 형광의 양을 상기 본원에 기재된 바와 같이 측정하였다. 인간 세포 부착 분석에 대한 대조군 항체는 인간 혈청 알부민에 대한 마우스 모노클로날 항체 6B11 (카탈로그 번호 ab 10244, 미국 콜로라도주 리틀레톤에 소재하는 노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals))였다. 뮤린 세포 부착 분석에 대한 대조군 항체는 인테그린 베타7에의 결합에 대해 리간드 또는 Fib504와 경쟁하지 않는 래트 항-마우스 인테그린 베타7 항체 M293 (미국 캘리포니아주 산 조스에 소재하는 비디 바이오사이언시즈)였다.
인간 및 뮤린 세포 부착 분석에 대한 3벌 분석의 결과는 각각 표 9 및 10에 제공된다.
Figure 112007025400271-PCT00035
Figure 112007025400271-PCT00036
hu504.32 항체는 중쇄 CDR3의 위치 94에 메티오닌을 갖는다. 변이체 M94Q (또는 hu504.32Q) 및 M94R (또는 hu504.32R)은 hu504.32 항체 변이체의 위치 94에 각각 글루타민 또는 아르기닌을 갖는다. hu504.32M, Q 및 R 항체는 각각의 분석에서 인테그린 베타7 수용체-리간드 상호작용을 실질적으로 감소시켰으며, 따라서 베타7-매개된 세포 부착의 강력한 억제제이다.
생체내 항체 hu504.32R 활성
hu504.32R 항체 변이체를, 인테그린 베타7 수용체-리간드 상호작용을 감소시키고 생체내 뮤린 염증성 장 질환 모델에서 염증화된 결장에의 림프구 동원을 감소시키는 그의 능력에 대해 생체내에서 시험하였다. BALB/c 마우스 및 CB 17 SCID 마우스를 찰스 리버 래버러토리스 인터내셔날, 인크.(Charles River Laboratories International, Inc.) (미국 메사추세츠주 윌밍톤)로부터 수득하였다. CD4+CD45Rb 고 T 세포 재구성된 SCDD 결장 마우스를, 공여체 BALB/c 마우스로부터의 CD4+CD45Rb 고 T 세포를 단리하고, 100 ㎕ PBS 중 3 x 105 세포를 정맥내로 옮김으로써 제조하였다. 대조군 SCID 마우스는 CD4+CD45Rb 고 T 세포를 투여받지 않았다. 기준선으로부터 10％ 중량 소실 또는 4주에 피크 중량으로부터 15％의 처리군 등록 범주를 충족시키는 재구성된 CD4+ 마우스를 유도된 염증성 장 질환을 갖는 것으로 간주하였으며, 이를 처리를 위해 선택하였다.
시험 항체로 처리한 날에, 공여자 BALB/c 마우스 창자간막 림프절 (MLN) 세포를 수거하고, Cr51로 방사성표지하였다. 처리는 항-GP120 항체, hu504.32 항-베타7 항체, hu504.32R 항-베타7 항체 투여 전, 또는 항체 없음 (대조군) (정맥내 200 ㎍/100 ㎕ PBS)를 포함하였다. 항체 투여 30분 후, Cr51-표지된 MLN 세포를 4 x 106 세포/100 ㎕로 주사하였다. 표지된 세포의 주사 1시간 후, 마우스를 안락사시키고, 비장, 결장 및 파이어판을 수집하고, 칭량하고, 기관당 총 Cr51 방사능을 측정하였다. 도 16은 항체가 염증성 장 질환을 앓는 마우스의 결장에의 방사성표지된 T 세포의 귀환을 차단하는 상대적 능력을 나타내는 상기 시험의 결과의 막대 그래프이다. 염증화된 결장에의 T 세포의 귀환은 음성 대조군 항-GP120 항체에 비해 hu504.32 및 hu504.32R 항-베타7 항체에 의해 억제되었다. 결장에 대한 분포는 모든 항체에 대해 유사하였다. 따라서, hu504.32 및 hu504.32R 항-베타7 항체는 생체내에서 염증화된 결장에의 T 세포의 귀환을 효과적으로 억제한다.
항체 글리케이션은 hu504.32R 변이체가 알파4베타7 수용체에의 MAdCAM-1 결합을 차단하는 능력에 영향을 주지 않는다.
단백질의 비-효소적 글리코실화인 글리케이션은 항체-리간드 상호작용에 영향을 줄 수 있다 (예를 들어 문헌 [Kennedy, D.M. et al., Clin Exp Immunol. 98(2):245-51 (1994)]).
504.32R의 위치 49에서의 리신의 글리케이션. hu504.32R 변이체의 경쇄 위치 49에서의 리신의 글리케이션 (HVR-L2 상대 위치 B1)이 관찰되었지만, 항체 변이체가 MAdCAM-1의 알파4베타7 수용체-발현 RPMI8866 세포에의 결합을 차단하는 능력에 유의한 영향을 갖지 않는다. 글리케이션 및 글리케이션 수준의 측정은 표준 전기분사 이온화-질량 분광법 (ESI-MS)을 이용하고 보로네이트 친화도 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 글리케이션에 대한 시험에 유용한 보로네이트 친화도 HPLC 방법은 예를 들어 문헌 [Quan C.P. et al., Analytical Chemistry 71(20):4445-4454 (1999)] 및 [Li Y.C. et al., J. Chromatography A, 909:137-145 (2001)]에서 발견된다. 세포 부착 분석을 본원에 기재된 RPMI8866/MAdCAM-1-Fc 세포 부착 분석에 따라 수행하였다.
본 발명의 별법의 실시양태에서, 위치 49에서의 글리케이션은 위치 49가 리신 이외의 아미노산을 포함할 경우 감소되거나 제거된다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 위치 49 (HVR-L2 상대 위치 B1)에서의 아미노산으로서 임의의 아미노산 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y를 포함하며, 각각의 문자는 표준 단일-문자 아미노산 명칭에 따른 아미노산을 지칭한다. 별법으로, 504.32R 변이체 (또는 다른 504 변이체)의 경쇄의 위치 49에서의 아미노산은 R, N, V, A, F, Q, H, P, I 또는 L로 이루어진 군으로부터 선택된다. 위치 49에서 유용한 아미노산은 예를 들어 hu504.32R Fab를 파지 (변이체) 상에 제시하고 (그의 파지 라이브러리를 제조하고), 위치 49에 대한 코돈에서, 각각의 20개의 천연 발생 아미노산을 코돈으로 별개로 치환함으로서 선택된다. 위치 49에서 변경된 hu504.32R 변이체를 발현하는 파지를, 인테그린 베타7, 및/또는 알파4베타7 또는 알파E베타7 수용체와 같은 인테그린 베타7을 포함하는 수용체에의 결합에 대해 시험하였다. 베타7 인테그린 또는 알파4베타7 또는 알파E베타7 수용체에 결합하는 상기 변이체를, 본원에 기재된 바와 같이 인테그린 베타7 수용체-리간드 결합을 억제하는 능력 및 생체내 효능에 대해 추가로 스크리닝하였다. 별도의 천연 또는 비-천연 발생 아미노산을 표준 돌연변이유발 기술에 의해 위치 49에서 치환하고, 세포 부착 및 본원에 기재된 생체내 분석에서 시험할 수 있다. 별법으로, 경쇄의 위치 49에서의 아미노산은 리신 (K) 이외의 아미노산이며, 인테그린 베타7의 생물학적 활성을 감소시킴으로써, 경쇄 및/또는 중쇄 내의 임의의 다른 HVR 또는 프레임워크 위치 또는 위치들에서의 아미노산을 변경하여, 결합 친화도, 시험관내 및 생체내 생물학적 활성, 약물동력학, 약물 청소 및 염증의 감소에 유용한 면역원성을 나타내는 변이체 항-베타7 결합 폴리펩티드 또는 항체에 대해 선택하였다. 이러한 폴리펩티드 또는 항체 변이체의 돌연변이유발 및 선별은 본원에 기재된 바와 같이 및 다른 표준 기술에 따라 수행하였다. 이러한 변이체 항-베타7 결합 폴리펩티드 또는 항체는 본원에 개시된 임의의 인간화 Fib504 변이체에 의해 나타나는 결합 친화도의 10,000배 내, 1000배 내, 별법으로 100배 내, 별법으로 10배 내, 별법으로 5배 내, 별법으로 2배 내의 인테그린 베타7 결합 친화도를 나타낸다.
상기 기재된 명세서는 당업자가 본 발명을 실시하는데 충분한 것으로 고려된다. 설명된 실시양태가 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되며, 기능적으로 등가인 임의의 구성이 본 발명의 범위 내에 있기 때문에, 본 발명은 제시된 구성에 의해 범위가 제한되지 않는다. 본원의 재료의 기탁은 그의 최상의 형태를 비롯한 본원에 포함된 기재가 본 발명의 임의의 측면을 실시하도록 하는데 부적당하다고 승인함을 구성하지 않으며, 특허청구범위를 이것이 제시하는 특정 예에 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 사실, 본원에 제시 및 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 당업자에게 명백할 것이며, 이는 첨부된 특허청구범위 내에 있다.
<110> GENENTECH, INC. <120> HUMANIZED ANTI-BETA7 ANTAGONISTS AND USES THEREFOR <130> P2159R1 PCT <140> PCT/US2005/031401 <141> 2005-09-02 <150> US 60/607,377 <151> 2004-09-03 <160> 68 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 1 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr Leu His 5 10 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 2 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 3 Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Asn Thr 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 4 Gly Phe Phe Ile Thr Asn Asn Tyr Trp Gly 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 5 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 1 5 10 15 Lys Ser <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized 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His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 320 325 330 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 335 340 345 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 350 355 360 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 365 370 375 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 380 385 390 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 395 400 405 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 410 415 420 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 425 430 435 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 440 445 <210> 31 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 31 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp 20 25 30 Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Gly Asn Ser Leu Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 140 145 150 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210 Arg Gly Glu Cys <210> 32 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Phe Ile Thr 20 25 30 Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn 50 55 60 Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys 65 70 75 Asn Thr Phe Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 80 85 90 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp 95 100 105 Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 110 115 120 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 125 130 135 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 140 145 150 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 155 160 165 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 170 175 180 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 185 190 195 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 200 205 210 Val Asp 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38 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 39 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 5 10 <210> 40 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 40 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 41 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 5 10 <210> 42 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 42 Arg Phe Thr Ile Ser Xaa Asp Xaa Ser Lys Asn Thr Xaa Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala 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<213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 47 Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Leu Leu His 5 10 <210> 48 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser 20 25 30 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg 35 40 45 Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 50 55 60 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75 Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 49 <211> 81 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 49 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 35 40 45 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 50 55 60 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr 65 70 75 Leu Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 50 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 50 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 35 40 45 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 50 55 60 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu 65 70 75 Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 51 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 51 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Arg Val Thr Ile Ser Val Asp 35 40 45 Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 50 55 60 Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 65 70 75 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<211> 80 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 54 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 35 40 45 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu 65 70 75 Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 55 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 35 40 45 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 65 70 75 Thr Val Ser Ser <210> 56 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg 35 40 45 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 50 55 60 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser 65 70 75 Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 57 <211> 81 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp 35 40 45 Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gln Gly Thr 65 70 75 Leu Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 58 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp 35 40 45 Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 65 70 75 Val Thr Val Ser Ser 80 <210> 59 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 59 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg 35 40 45 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 50 55 60 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 65 70 75 Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80 85 <210> 60 <211> 81 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 60 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 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Ala Ala Ser Trp Val Arg Gln Ala 20 25 30 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp 35 40 45 Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 50 55 60 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 65 70 75 Thr Val Ser Ser <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 63 Ala Met Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe 5 10 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 64 Ala Arg Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe 5 10 <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 65 Ala Gln Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 66 Arg Thr Gly Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Phe 5 10 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 67 Arg Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 5 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 68 Xaa Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser 5

Claims (50)

  1. (a) (i) RASESVDTYLH (서열 1)인 서열 A1 내지 A11을 포함하는 HVR-L1,
    (ii) KYASQSIS (서열 2)인 서열 B1 내지 B8을 포함하는 HVR-L2,
    (iii) QQGNSLLPNT (서열 3)인 서열 C1 내지 C10을 포함하는 HVR-L3,
    (iv) GFFITNNYWG (서열 4)인 D1 내지 D1O을 포함하는 HVR-H1,
    (v) GYISYSGSTSYNPSLKS (서열 5)인 서열 E1 내지 E17을 포함하는 HVR-H2; 및
    (vi) MTGSSGYFDF (서열 6)인 서열 F1 내지 F11을 포함하는 HVR-H3
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HVR 서열을 포함하는 항-베타7 결합 폴리펩티드 또는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 변이체 HVR이 서열 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로 나타낸 임의의 서열의 하나 이상의 잔기의 변형을 포함하는 하나 이상의 변이체 HVR을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체.
  3. 제2항에 있어서, 변이체 HVR-L1 내의 A8이 S, D 또는 T이고, A9가 L인 폴리펩티드 또는 항체.
  4. 제2항에 있어서, HVR-L1이 서열 1, 7, 8 또는 9를 포함하고, HVR-L2가 서열 2, 67 또는 68을 포함하고, HVR-L3이 서열 3을 포함하고, HVR-H1이 서열 4를 포함 하고, HVR-H2가 서열 5를 포함하고, HVR-H3이 상대 위치 F2 내지 F11에 대해 서열 6 또는 66을 포함하거나 상대 위치 F1 내지 F11에 대해 서열 63, 64 또는 65를 포함하는 것인 폴리펩티드 또는 항체.
  5. 제2항에 있어서, 폴리펩티드 또는 항체가 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 초가변 영역 (HVR)을 포함하며,
    (i) HVR-L1은 RASESVDTYLH (서열 1); RASESVDSLLH (서열 7), RASESVDTLLH (서열 8) 또는 RASESVDDLLH (서열 9)인 아미노산 서열 A1 내지 A11, 또는 서열 1, 7, 8 또는 9의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 A2가 A, G, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A3이 S, G, I, K, N, P, Q, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, A4가 E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A5가 S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A6이 V, R, I, A, G, K, L, M 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A7이 D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A8이 D, G, N, E, T, P 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A9가 L, Y, I 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A1O이 L, A, I, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A11이 H, Y, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (ii) HVR-L2는 KYASQSIS (서열 2), RYASQSIS (서열 67) 또는 XYASQSIS (서열 68, 여기서, X는 임의의 아미노산을 나타냄)인 아미노산 서열 B1 내지 B8, 또는 서열 2, 67 또는 68의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 B1이 K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y 및 X (여기서, X는 임의의 아미노산을 나타냄)로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B4가 S 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B5가 Q 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B6이 S, D, L 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B7이 I, V, E 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (iii) HVR-L3은 QQGNSLPNT (서열 3)인 아미노산 서열 C1 내지 C9, 또는 서열 3의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 C8이 N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I, L, M 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (iv) HVR-H1은 GFFITNNYWG (서열 4)인 아미노산 서열 D1 내지 D1O을 포함하고;
    (v) HVR-H2는 GYISYSGSTSYNPSLKS (서열 5)인 아미노산 서열 E1 내지 E17, 또는 서열 5의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 E2가 Y, F, V 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E6이 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E1O이 S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E12가 N, T, A 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E13이 P, H, D 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E15가 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E17이 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되 고;
    (vi) HVR-H3은 MTGSSGYFDF (서열 6) 또는 RTGSSGYFDF (서열 66)인 아미노산 서열 F2 내지 F11을 포함하거나; AMTGSSGYFDF (서열 63), ARTGSSGYFDF (서열 64) 또는 AQTGSSGYFDF (서열 65)인 아미노산 서열 F1 내지 F11, 또는 서열 6, 63, 64, 65 또는 66의 변이체를 포함하고, 아미노산 F2가 R, M, A, E, G, Q, S이고/거나, 아미노산 F11이 F 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드 또는 항체.
  6. 제2항에 있어서, 항체가 인간화된 것인 폴리펩티드 또는 항체.
  7. 제2항에 있어서, 프레임워크(framework) 서열의 적어도 일부분이 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열인 폴리펩티드 또는 항체.
  8. 제2항에 있어서, 상기 변형이 치환, 삽입 또는 결실인 폴리펩티드 또는 항체.
  9. 제2항에 있어서, HVR-L1 변이체가 하기 위치: A2 (A, G, S, T 또는 V); A3 (S, G, I, K, N, P, Q, R 또는 T), A4 (E, A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R 또는 V), A5 (S, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V 또는 Y), A6 (V, A, G, I, K, L, M, Q 또는 R), A7 (D, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T 또는 V), A8 (S, D, E, G, P, T 또는 N), A9 (L, Y, I 또는 M), A1O (L, A, I, M 또는 V) 및 A11 (H, F, S 또는 Y)의 임의의 조합으로 1 내지 10 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)개의 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드 또는 항체.
  10. 제2항에 있어서, HVR-L2 변이체가 하기 위치: B1 (K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y, T, H, S, E, C, D, G 또는 M), B5 (Q 또는 S), B6 (S, R 또는 L) 및 B7 (I, T, E, K 또는 V)의 임의의 조합으로 1 내지 4 (1, 2, 3 또는 4)개의 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드 또는 항체.
  11. 제2항에 있어서, HVR-L3 변이체가 위치 C8 (W, Y, R, S, A, F, H, I, L, M, N, T 또는 V)에 하나 이상의 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드 또는 항체.
  12. 제2항에 있어서, HVR-H2 변이체가 하기 위치: E2 (Y, V, D 또는 F), E6 (S 또는 G), E1O (S 또는 Y), E12 (N, A, D 또는 T), E13 (P, D, A 또는 H), E15 (L 또는 V), E17 (S 또는 G)의 임의의 조합으로 1 내지 7 (1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7)개의 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드 또는 항체.
  13. 제2항에 있어서, HVR-H3 변이체가 하기 위치: F2 (R, M, A, E, G, Q, R 또는 S) 및 F11 (F 또는 Y)의 임의의 조합으로 1 또는 2개의 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드 또는 항체.
  14. 제2항에 있어서, 서열 7의 서열을 갖는 HVR-L1을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체.
  15. 제2항에 있어서, 서열 8의 서열을 갖는 HVR-L1을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체.
  16. 제2항에 있어서, 서열 9의 서열을 갖는 HVR-L1을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체.
  17. 제2항에 있어서, 프레임워크 위치에 하나 이상의 변형을 추가로 포함하며, 하나 이상의 변형이 중쇄 위치 71, 73 또는 78에 있는 것인 폴리펩티드 또는 항체.
  18. 제17항에 있어서, 위치 71의 아미노산이 R 또는 A이고, 위치 73의 아미노산이 N 또는 T이고, 위치 78의 아미노산이 F, A 또는 L인 폴리펩티드 또는 항체.
  19. 제17항에 있어서, 위치 71, 73 및/또는 78에 치환을 포함하는 중쇄 인간 아군 III 중쇄 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체.
  20. 제19항에 있어서, 치환이 R71A, N73T, L78A 또는 L78F인 폴리펩티드 또는 항 체.
  21. 제2항에 있어서, 서열 3의 서열을 갖는 HVR-L3을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체.
  22. 제2항에 있어서, 변이체 HVR-L1 내의 A8이 S인 폴리펩티드 또는 항체.
  23. 제2항에 있어서, 변이체 HVR-L1 내의 A8이 D인 폴리펩티드 또는 항체.
  24. 제2항에 있어서, 변이체 HVR-L1 내의 A9가 L인 폴리펩티드 또는 항체.
  25. 제2항에 있어서, 서열 HVR-H2 위치 E1 내지 E17 및 HVR-H3 위치 F1 내지 F11 사이의 프레임워크 서열이 HFR3-1-HFR3-31이고, HFR3-6이 A 또는 R이고, HFR3-8이 N 또는 T이고, HFR3-13이 L, A 또는 F인 폴리펩티드 또는 항체.
  26. 인간 베타7에 대한 항체 또는 결합 단편의 일가 친화도가 도 1A (서열 10) 및/또는 도 1B (서열 11) 또는 도 9A (서열 12) 및/또는 도 9B (서열 13)에 나타낸 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 포함하는 항체의 일가 친화도와 실질적으로 동일하거나 더 큰 인간화 항-베타7 항체 또는 그의 베타7 결합 단편.
  27. 제26항에 있어서, 친화도가 도 1A (서열 10) 및 도 1B (서열 11) 또는 도 9A (서열 12) 및 도 9B (서열 13)에 나타낸 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는 항체보다 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 500배 이상, 1000배 이상, 5000배 이상 또는 10,000배 이상 더 큰 항체 또는 그의 결합 단편.
  28. 제27항에 있어서, 인간 베타7에 대한 항체의 일가 친화도가 도 1A (서열 10) 및 도 1B (서열 11) 또는 도 9A (서열 12) 및 도 9B (서열 13)에 나타낸 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는 항체의 일가 친화도보다 3배 이상 더 큰 항체 또는 결합 단편.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, 도 1A (서열 10) 및 도 1B (서열 11) 또는 도 9A (서열 12) 및 도 9B (서열 13)에 나타낸 경쇄 및 중쇄 서열을 포함하는 항체가 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection; ATCC) 하에 수탁 번호 HB-293로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 것인 항체 또는 결합 단편.
  30. 제26항에 있어서, 결합 친화도가 Kd 값으로서 표현되는 것인 항체 또는 결합 단편.
  31. 제26항에 있어서, 결합 친화도가 비아코어(Biacore)(상표명) 또는 방사성면 역분석법에 의해 측정되는 것인 항체 또는 결합 단편.
  32. 제1항에 있어서, 인간 κ 아군 I 경쇄 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체.
  33. 제1항에 있어서, 중쇄 인간 아군 III 중쇄 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체.
  34. 제26항에 있어서, 폴리펩티드 또는 항체가 HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 초가변 영역 (HVR)을 포함하며,
    (i) HVR-L1은 RASESVDTYLH (서열 1); RASESVDSLLH (서열 7), RASESVDTLLH (서열 8) 또는 RASESVDDLLH (서열 9)인 아미노산 서열 A1 내지 A11, 또는 서열 1, 7, 8 또는 9의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 A2가 A, G, S, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A3이 S, G, I, K, N, P, Q, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, A4가 E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A5가 S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A6이 V, R, I, A, G, K, L, M 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A7이 D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노 산 A8이 D, G, N, E, T, P 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A9가 L, Y, I 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A1O이 L, A, I, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 A11이 H, Y, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (ii) HVR-L2는 KYASQSIS (서열 2), RYASQSIS (서열 67) 또는 XYASQSIS (서열 68, 여기서, X는 임의의 아미노산을 나타냄)인 아미노산 서열 B1 내지 B8, 또는 서열 2, 67 또는 68의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 B1이 K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y 및 X (여기서, X는 임의의 아미노산을 나타냄)로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B4가 S 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B5가 Q 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B6이 S, D, L 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 B7이 I, V, E 및 K로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (iii) HVR-L3은 QQGNSLPNT (서열 3)인 아미노산 서열 C1 내지 C9, 또는 서열 3의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 C8이 N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I, L, M 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (iv) HVR-H1은 GFFITNNYWG (서열 4)인 아미노산 서열 D1 내지 D1O을 포함하고;
    (v) HVR-H2는 GYISYSGSTSYNPSLKS (서열 5)인 아미노산 서열 E1 내지 E17, 또는 서열 5의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 E2가 Y, F, V 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E6이 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고 /거나, 아미노산 E1O이 S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E12가 N, T, A 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E13이 P, H, D 및 A로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E15가 L 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고/거나, 아미노산 E17이 S 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    (vi) HVR-H3은 MTGSSGYFDF (서열 6) 또는 RTGSSGYFDF (서열 66)인 아미노산 서열 F2 내지 F11을 포함하거나; AMTGSSGYFDF (서열 63), ARTGSSGYFDF (서열 64) 또는 AQTGSSGYFDF (서열 65)인 아미노산 서열 F1 내지 F11, 또는 서열 6, 63, 64, 65 또는 66의 변이체를 포함하고, 여기서 아미노산 F2가 R, M, A, E, G, Q, S이고/거나, 아미노산 F11이 F 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 또는 결합 단편.
  35. 제34항에 있어서, 중쇄 프레임워크 위치 71이 아미노산 R 또는 A를 포함하고/거나, 중쇄 프레임워크 위치 73이 T 또는 N을 포함하고/거나, 중쇄 프레임워크 위치 78이 F, A 또는 L을 포함하는 것인 항체 또는 결합 단편.
  36. 제2항의 항체를 베타7 인테그린과 접촉시킴으로써 인간 베타7 인테그린 서브유닛과 제2 인테그린 서브유닛 및/또는 리간드의 상호작용을 억제하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 제2 인테그린 서브유닛이 알파4 인테그린 서브유닛이고, 리간드가 MAdCAM, VCAM 또는 피브로넥틴인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 알파4 인테그린 서브유닛이 인간으로부터의 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 리간드가 인간으로부터의 것인 방법.
  40. 제36항에 있어서, 제2 인테그린 서브유닛이 알파E 인테그린 서브유닛이고, 리간드가 E-카드헤린인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 알파E 인테그린 서브유닛이 인간으로부터의 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 리간드가 인간으로부터의 것인 방법.
  43. 제36항에 있어서, 억제가 염증, 천식, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 결장염, 당뇨병, 기관 이식으로 초래된 염증, 이식편대 숙주 장애, 및 동종이식 장애와 관련된 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 장애의 증상을 감소시키거나 경감시키는 것인 방법.
  44. 제2항의 폴리펩티드 또는 항체 및 제약 담체를 포함하는 유효량의 조성물을 장애를 앓고 있는 포유동물에게 투여함으로써, 장애를 앓고 있는 포유동물에서의 베타7 인테그린-매개된 세포 부착 및/또는 동원의 조절 방법.
  45. 제44항에 있어서, 장애가 염증, 천식, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 결장염, 당뇨병, 기관 이식으로 초래된 염증, 이식편대 숙주 장애, 및 동종이식 장애와 관련된 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  47. 제44항에 있어서, 제2 생물약제 또는 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  48. 제44항에 있어서, 조절이 베타7 인테그린과 알파4 인테그린, 알파E 인테그린, MAdCam, VCAM, E-카드헤린 및/또는 피브로넥틴의 상호작용을 억제하는 것인 방법.
  49. 제1항, 제2항, 제5항, 제26항 및 제34항 중 어느 한 항에 따른 항-베타7 결합 폴리펩티드, 항체 또는 그의 결합 단편 및 제약 담체를 포함하는 조성물.
  50. 제1항, 제2항, 제5항, 제26항 및 제34항 중 어느 한 항에 따른 항-베타7 결합 폴리펩티드, 항체 또는 그의 결합 단편 및 제약 담체를 포함하는 조성물, 및 상 기 조성물이 염증, 천식, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 결장염, 당뇨병, 기관 이식으로 초래된 염증, 이식편대 숙주 장애, 및 동종이식 장애와 관련된 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 장애의 치료 방법에 사용하기 위한 것임을 지시하는 라벨을 포함하는 제조품.
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