PT1756111E - Indoloquinoxalinas com radicais alquilo como substituintes - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"INDOLOQUINOXALINAS COM RADICAIS ALQUILO COMO SUBSTITUINTES" A presente invenção diz respeito a novas indoloquinoxalinas com radicais alquilo como substituintes de fórmula geral (I)

(D na qual R1 é hidrogénio ou representa um ou mais substituintes iguais ou diferentes, nas posições 7 a 10 escolhidos de entre um grupo halogeneto, e.g. Cloro, fluoro, bromo, alquilo/alquilóxido curto, hidróxido, trifluorometilo, triclorometilo, trifluorometóxido. R2 representa substituintes alquilo C1-C4, iguais ou diferentes X é CO. Y é OH, NH2, NH-(CH2)n-R3 onde R3 representa alquilos curtos, OH, NH2, NHR4 ou NR5R6 onde R4, R5 e R6 são independentemente alquilos curtos ou cicloalquilos e n é um número inteiro de 2 a 4. e sais farmacologicamente aceitáveis destas.

As novas indoloquinoxalinas com radicais alquilo como substituintes da presnete invenção são úteis como medicamentos e em particular para prevenir e/ou tratar doenças autoimunes, e.g. Para prevenção e/ou tratamento de 2 artrite reumatóide (AR) e esclerose múltipla (EM).

Nesta especificação o termo halogeneto significa cloro, fluor ou bromo. 0 termo alquilo curto significa grupos alquilo lineares ou ramificados, com 1 a 4 átomos de carbono, como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, tert-butilo, preferencialmente metilo ou etilo. 0 termo alquilóxido significa grupos alquilóxido lineares ou ramificados, com 1 a 4 átomos de carbono, como metóxido, etilóxido, propilóxido, isopropilóxido, butilóxido, isobutilóxido, sec-butilóxido, tert-butilóxido. 0 termo cicloalquilo significa um grupo cicloalquilo C5 a C7, como ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo.

Um grupo de compostos adequado, são compostos de fórmula (I) onde ambos os R2 são grupos metilo.

Outro grupo adequado de compostos são compostos de fórmula (I) onde R1 é um grupo halogeneto e ambos os grupos R2 são grupos metilo.

Um grupo preferencial de compostos são compostos de fórmula (I) onde R1 é um grupo flúor ou cloro.

Um outro grupo preferencial de compostos são compostos de fórmula (I) onde Y é NR5R6, especialmente quando R5 e R6 são grupos semelhantes ou diferentes de grupos alquilo curtos. Compostos de fórmula (I) são objecto da presente invenção para serem usados como medicamentos. 3

Outro objecto da presente invenção é o uso de compostos de fórmula (I) para a prevenção e/ou tratamento de doenças autoimunes, especialmente na prevenção e tratamento de artrite reumatóide (RA) e esclerose múltipla (EM). A invenção diz respeito também a métodos para a preparação de novas indoloquinoxalinas com grupos alquilo como substituintes.

Enquadramento

Sob certas condições, incluindo alguns estados de doença, o sistema imunitário de um indivíduo identifica os seus próprios constituintes como não próprios, e inicia uma resposta imunitária contra si mesmo, por vezes causando mais danos ou desconforto que o causado aquando da invasão de um micróbio ou material estranho, e produzindo doenças sérias num indivíduo. Doenças autoimunes ocorrem quando o sistema imunitário de um indivíduo ataca os seus orgãos ou tecidos, produzindo uma situação clínica associada à destruição desse tecido, como exemplificado por doenças como a artrite reumatóide (AR), diabetes mellitus insulino-dependente, síndroma da imunodeficiência adquirida (SIDA), anémias hemolíticas, febre reumática, doença de Alzheimer, asma, aterosclerose, doença inflamatória intestinal, lesão isquémica, doença de Parkinson, miastenia grave, anemia, escleroderma, doença de Addison, choque séptico, psoríase, tiróidite, glomerulonefrite, hepatite autoimune, esclerose múltipla (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), etc. Bloqueando, neutralizando ou inibindo a resposta imunitária, contrabalançando as consequências da actividade do sistema imunológico ou removendo a causa da sua activação, é nestes casos, por isso, desejável. 4

Pensa-se que a artrite reumatóide resulta da apresentação de um antigénio relevante a um hospedeiro imunogeneticamente susceptível. Os antigénios que podem potencialmente iniciar uma resposta imunitária na artrite reumatóide podem ser endógenos ou exógenos. Antigénios endógenos possíveis incluem colagénio, mucopolissacáridos e factores reumatóides. Antigénios exógenos incluem e.g. Mycoplasmas, mycobacteria, espiroquetas e vírus. Subprodutos (e.g. Prostaglandinas e radicais de oxigénio) da reacção imunológica causam inflamação das membranas sinoviais e despoletam mudanças destrutivas nas articulações (e.g. Colagenase). A artrite reumatóide (envolvendo a destruição de tecido conjuntivo das articulações) é caracterizada por ser o resultado de uma resposta autoimune maioritariamente mediada por células e parece ser devida primariamente à acção de células T (ver Sinha et al., Science 248:1380 (1990)).

Existe um largo espectro de gravidade da doença mas muitos doentes sofrem um ciclo de recaídas intermitentes e recuperações, com um padrão geral de destruição das articulações e formação de deformidades progressivamente crescente e lento. As manifestações clínicas podem incluir poliartrite simétrica das articulações periféricas com dor, moleza, inchaço e perda de função das articulações afectadas, rigidez matinal, e perda de cartilagem, erosão de matéria óssea, e subluxação das articulações após inflamação persistente. Manifestações extra-articulares incluem nódulos reumatóides, vasculite reumatóide, inflamações pleuro-pulmonares, esclerose, síndroma de sicca, síndroma de Felty (esplenomegalia e neutropenia), osteoporose e perda de peso (Katz (1985), Am. J. Med., 79:24 e Krane e Simon (1986), Advances in Rheumatology, 5

Synderman (ed.), 70 (2):263-284). As manifestações clínicas resultam num elevado grau de morbilidade resultando em alterações da vida diária do doente. Infelizmente, apesar de esforços de investigação consideráveis não existe cura para AR.

Os tratamentos estabelecidos para AR estão desenhados para inibir ou vias de inflamação finais comuns ou mediadores imunológicos. Ambas as abordagens são inespecíficas e por isso, estão associadas a graves efeitos secundários. Os corticoesteróides têm múltiplos efeitos no sistema imunológico e em outros tecidos. A sua utilização terapêutica é dificultada pela muito elevada incidência de efeitos secundários ao nível do músculo esquelético, metabólico, neurológico e do tecido conjuntivo bem como imunossupressão que pode levar a infecções que podem ameaçar a vida. Por esta razão, os corticoesteróides são normalmente evitados até que todas as outras formas de tratamento tenham falhado Para uma visão geral, ver R.

Millon et al., "Long-Term Study of Management of rheumatoid arthritis", Lancet 1:812 (1984).

Medicamentos citotóxicos e antimetabólicos, como metotrexato, azatioprine e ciclofosfamida afectam inespecificamente todas as células rapidamente proliferativas e por isso estão associadas a toxicidade a nível da medula óssea e a toxicidade gastrointestinal, bem como um aumento da incidência de malignidade. Adicionalmente, foi publicado que o tratamento de AR com metotrexato induz danos hepáticos e doenças pulmonares, que podem ser fatais. Ver J.A. Engelbrecht et al., "Methotrexate Pneumonitis After Low-Dose Therapy for

Rheumatoid Arthritis" Arthritis and Rheumatism 26:1275 6 (1983) e G. W. Cannon et al., "Acute Lung Disease Associated with Low-dose pulse methotrexate therapy in patients with Rheumatoid arthritis", Arthritis and Rheumatism 26:1269 (1983). A maioria dos medicamentos anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) actualmente usados são desenhados para inibirem não especificamente a sintese das prostaglandinas. AINEs actualmente usados modificam ou diminuem - mas não até à sua ausência total - a resposta inflamatória. 0 ΑΙΝΕ mais usado permanece o ácido acetil-salicílico. A toxicidade do ácido acetil-salicilico assume várias formas, incluindo reacções de hipersensibilidade, surdez, toxicidade gastrointestinal e renal. Para uma visão geral ver Simon and Mills, "Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs", N. Eng. J. Med. 302:1179 (1980).

Compostos de ouro e penicilaminas têm sido usadas também para o tratamento de AR. Ambos são associados com uma elevada toxicidade ao nivel da medula óssea, toxicidade renal e mucocutânea. O tratamento com ouro, em particular está associado a nefropatias, W. Katz et ai., "Proteinuria in Gold-treated Rheumatoid Arthritis", Ann. Int. Med. 101:176 (1984), penicilaminas, apesar de ter uma eficácia questionável, é tóxica mesmo a doses relativamente reduzidas. Ver W. F. Kean et ai., "The Toxicity Pattern of D-Penicillamine Therapy", Arthritis and Rheumatism 23:158 (1980). Estes problemas levaram ao quase abandono destes medicamentos enquanto terapêutica para AR.

Outras terapêuticas estabelecidas são ciclosporinas e anticorpos anti-TNF-α. Contudo, toxicidade renal séria e imunossupressão não especifica limitam significativamente a 7 utilidade da ciclosporina. Devido ao seu papel ubíquo em muitas funções celulares, a terapêutica anti-TNF pode não ser uma estratégia terapêutica segura para AR. 0 desenvolvimento de doença semelhante a lupus já foi notificado em vários casos. Contudo, dados de eficácia clínica mostram resultados promissores com a abordagem anti-TNF.

Assim, terapêuticas para AR estão associadas com elevada incidência de efeitos secundários sérios. Adicionalmente, apesar de alguns medicamentos poderem oferecer alívios sintomatológicos, em muitos casos, não modificam significativamente a progressão da destruição das articulações. 0 que é necessário é uma abordagem terapêutica eficaz com reduzida toxicidade de forma a que o tratamento seja melhor tolerado e mais apropriado ao tratamento de AR. A presente invenção contempla uma nova classe de medicamentos anti-AR, nomeadamente compostos que produzem uma redução das manifestações clínicas e sintomas da doença. espasmos musculares

Esclerose múltipla (EM) é uma doença do sistema nervoso central que afecta o cérebro e a espinal medula. Estima-se que afecte 2,5 milhões de pessoas, mundialmente e é a maior doença neurológica adquirida nos jovens adultos. Com a destruição das bainhas de mielina protectoras, os impulsos nervosos são interrompidos levando a uma variedade de sintomas neurológicos. Manifestações comuns e sintomas de EM incluem fadiga, mudanças psicológicas e cognitivas, fraqueza ou paralisia de membros, entorpecimento, problemas de visão, dificuldades de fala, 8 dificuldades de equilíbrio quando caminhado ou em pé, disfunção intestinal e da bexiga, e disfunção sexual. Aproximadamente metade das pessoas com esta doença têm ciclos de EM com recaidas-recuperações, nos quais existem ataques imprevisíveis onde os sintomas clínicos pioram (exacerbação) os quais são separados por período de remissão onde os sintomas estabilizam ou diminuem. A outra metade tem EM crónica progressiva sem períodos de remissão.

Actualmente não existes curas para EM. Estão disponíveis muitos medicamentos para aliviar os sintomas em situações de EM progressiva. Por exemplo, são usados corticoesteróides para reduzir a inflamação no tecido nervoso e encurtar a duração dos ressurgimentos; relaxantes musculares como tizanidina (Zanaflex) e baclofeno (Lioresal) são tratamentos orais para os espasmos musculares; medicamentos anti-depressivos como fluoxetine (Prozac), o medicamento antiviral amantadine (Symmetrel) ou o medicamento para a narcolepsia chamado modafinil (Provigil) são usados para reduzir a fadiga.

Alguns outros medicamentos estão disponíveis para EM que não estão directamente relacionados com a gestão da sintomatologia mas podem funcionar alterando o decurso da doença. Estes medicamentos incluem interferão beta (Betaferon, Avonxe, Rebif) e acetao glatiramérico (Copaxone). Estes medicamentos podem causar impacto na frequência e gravidade das recaídas, e no número de lesões, detectadas por ressonância magnética. Alguns medicamentos parecem ter como efeito o abrandamento da progressão da incapacidade. A patente U.D. No. 4 617 319 revela um método de tratamento de esclerose múltipla usando 1,4-dihidroxi-5,8-bis[[(2-hidroxietilamino)etilo]amino]antraquinona, a 9 qual é também conhecida pelo nome genérico de mitoxantrona (Novantrone).

Nenhuma destas terapêuticas existentes mostrou ser satisfatória devido à sua limitada eficácia e/ou significativa toxicidade. Adicionalmente, em muitas destas terapêuticas é necessária a administração frequente e algumas terapêuticas são muito caras. Assim, existe claramente uma necessidade de novos e eficazes métodos de tratamento de EM.

Os compostos da presente invenção podem ser formulados para administração oral, parentérica (e.g. intravenosa, intramuscular ou subcutânea), dérmica, bucal, intranasal, sublingual ou rectal ou pode ser formulada para administração por inalação ou insuflação. Adicionalmente, os compostos de acordo com a presente invenção podem também ser formulados para libertação continua.

Estado da arte 0 estado de arte mais próximo são os compostos descritos na Patente Europeia EP 238459 e a correspondente patente US 4 990 510 e os usos dos referidos compostos descritos em EP799038 e EP 1 261 344 e as correspondentes patentes US 6 248 742, US 6 465 466 e US 6 333 327. Dos compostos publicados nas referidas patentes e.g. O composto 2,3-dimetilo-6- (N, IV-dimetilaminoetilo) -6i7-indolo [2,3 — b]quinoxalina (B220) mostrou ser um promissor composto candidato ao tratamento de AR e EM em testes comuns, viz. modelo da artrite induzida pelo colagénio e o modelo de encefalomielite experimental autoimune respectivamente. Contudo os compostos de acordo com a presente invenção têm um efeito surpreendentemente superior contra AR e EM, em 10 comparação com B220.

Os novos compostos de acordo com a presente invenção podem ser preparados usando os seguintes protocolos gerais:

Os aniões de indolo [2,3-b] quinoxalinas de fórmula (a) gerados a partir do tratamento com uma base adequada, tal como hidra de sódio (NaH), butóxido-t de potássio ou hidróxido de potássio num sistema de duas fases:

H são alquilados por alquilonitrilos α-halogenados ou ésters de alquilo α-halogenados, e.g. cloroacetonitrilo e bromoacetato metilico ou etilo, na qual 6-cianometilindolo[2,3-b]quinoxalinas de fórmula (b)

e indolo[2,3-b]quinoxalina-6-yl-ácido acético (c: R7=H) ou os seus sais derivados (e.g. Na) e alquilo indolo[2,3-b]quinoxalina-6-yl-acetatos de fórmula (c) 11

onde R7 é um metilo ou etilo, obtidos respectivamente. As amidas primárias, indolo [2,3-£>] quinoxalinas-6-yl-acetamidas de fórmula (II)

m são subsequentemente formados por hidrólise acidica dos compostos de fórmula (b) num ácido forte como o ácido sulfúrico. As amidas secundárias de fórmula (III)

(ΙΠ) são preparadas pela condensação de ésteres de alquilo de fórmula (c) com um excesso da amina apropriada com ou sem solvente.

Exemplos

Nas experiências seguintes as medidas foram executadas por meio dos seguintes aparelhos e condições. 12

Espectros NMR foram registados em soluções DMS0-d6 à temperatura ambiente e usando o sinal de DMS0-d6 (‘‘"Η: õ= 2,50 ppm; 13C: δ= 39,5) como referência interna num espectrómetro Bruker DPX 300 (300MHz) . Valores de δ são dados em ppm. Pontos de melting foram medidos num aparelho Buchi Melting Point B-545 e não se encontram corrigidos. Os solventes usados são de qualidade analítica e foram usados como recebidos.

Um derivado de indolo[2,3-b]quinoxalina de fórmula (a) (1 eq.) é adicionado proporcionalmente a uma mistura viscosa de NaH (1,1 eq.) em N,N-dimetilacetamida (DMA), N,N-dimetilformamida (DMF) ou DMSO (5mL, 1 mmol de composto a) a 30°C sob uma atmosfera inerte (Ar ou N2) e agitado durante 30 min. Cloroacetonitrilo (1,1 eq) é adicionado numa porção. A mistura de reacção resultante é agitada durante 20h à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi finalmente despejada em água, filtrada, lavada com água e seca para originar um composto de fórmula (b).

Quando R1 é cloro na fórmula (a) é obtido o composto de fórmula (b) seguinte, i.e. o produto 9-cloro-2,3-dimetilo-6-cianometilo-6H-indolo[2,3-b]quinoxalina. Rendimento: 98%; Tf: 286-288°C; 1H-NMR δ: 8,36 (d, 1H) , 8,04 (s, 1H), 7,99-9,94 (m, 2H) , 7,86 (dd, 1H) , 5,75 (s, 2H) , 2,53 (s, 6H) .

Os novos compostos de acordo com a presente invenção os quais são amidas primárias de fórmula (II) 13 13

Rz O nh2 09

R8 R

podem ser preparados de acordo com o procedimento seguinte: Um composto de fórmula b é dissolvido em H2SO4 (conc., 10 mL /lg b) e a solução resultante é seguidamente vertida em água gelada e agitada durante 5 min. O sólido assim formado é recolhido e lavado com água. O sólido seco é tratado com CH2CI2 quente, filtrado e lavado com CH2CI2 adicional e seco para originar um composto de fórmula (II).

Os compostos seguintes foram preparados desta maneira:

Composto A 2,3-dimetilindolo[2,3-b]quinoxalina-6-yl-acetamida (R1=H, R2=CH3, X=CO, y=nh2)

Rendimento = 72%; 1H-NMR δ: 8, 38 (d, 1H) , 8,16 (s, 1H) , 8, 05 (s, 1H), . 7,70 (m, 2H) , 7, 59 (d, 1H) , 7,40 (t, 1H) , 7,16 (s, 1H), 5, 08 (s, 2H), 2, , 50 (s , 6H) r

Composto B 9-cloro-2,3-dimetilo-indolo[2,3-b]quinoxalina-6-yl-acetamida (R1=C1, R2=CH3, X=CO, y=nh2)

Rendimento = 66%; 1H-NMR δ: 8,29 (s, 1H) , 7,99 (s, 1H) , 7,90 (s, 1H) , 7, 65-7,50 (m, 3H) , 7,07 (bs, 1H) , 5,06 (s, 2H), 2,48 (s, 6H);

Composto C 2,3-dimetilindolo-9-fluoro-indolo[2,3-b]quinoxalina-6-yl- 14 acetamida (R1; =F, r2=ch3, x=co , Y: =nh2) Rendiment o = 32% ; Tf: 316-3 19° C; 2H-NMR δ: 8 ,11 (dd, 1H) , 8,01 (s, 1H) , 7 ,86 (s, 1H) , 7 ',70 (s, 1H) , 7,65-7,55 (m, 2H), 7,29 (s, 1H) 1 , 5,05 (s, 2H) , 2,50 (s , 6H) , As novas amidas secundárias de fórmula (III) de acordo com a presente invenção

podem ser preparadas pelo método seguinte:

Um derivado de indolo [2,3-b] quinoxalina de fórmula a (1 equivalente) é adicionado em várias vezes a uma mistura viscosa de NaH (1,1 equivalentes) em DMA, DMF ou DMSO (5 mL /1 mmol) a 30°C sob uma atmosfera inerte (Ar ou N2) e agitado durante 30 min. Bromoacetato de alquilo (1,1 equivalentes) é adicionado de uma única vez. A mistura de reacção resultante é agitada durante 20h à temperatura ambiente. A mistura de reacção é então vertida em água, filtrada, lavada com água e seca para originar um produto de fórmula (c).

Quando é usado metilbromoacetato como o bromoacetato de alquilo e R1 é 9-fluoro e R2 é metilo, o produto seguinte de fórmula (c) é obtido:

Metil-2,3-dimetilo-9-fluoro-indolo[2,3-b]quinoxalina-6-yl-acetato Rendimento: 74%; Tf: 257-259°C; 1H-NMR δ: 8,16 (dd, 1H) , 8,05 (s, 1H) , 7,91 (s, 1H) , 7,82 (dd, 1H) , 7,62 (dt, 1H), 5,41 (s, 2H), 3,65 (s, 3H), 2,50 (s, 6H). 15

As amidas secundárias de fórmula (III) são assim obtidas através do procedimento seguinte:

Um composto de fórmula (c) é adicionado a uma amina apropriada (10 mL/0,5g c) durante o refluxo e a mistura é no final sujeita a refluxo durante 4-15 min. A mistura de reacção é arrefecida até à temperatura ambiente, altura em que é adicionada água. O sólido assim formado é filtrado e lavado com água, seco e tratado com etanol quente e filtrado, e novamente lavado com etanol e seco para originar um produto de fórmula (III) .

Os seguintes compostos foram preparados desta maneira: Composto D 2,3-dimetilo-6- (AT, iV-dimetilaminoetilamino-2-oxoetilo) -6A-indolo[2,3-b]quinoxalina (R1=H, R2=CH3, X=CO, Y=NH-CH2- CH2-R3; R3=NR5R6; R5=R6=CH3)

Rendimento: 63%; 1H-NMR δ: 8,33 (d, 1H), 8,27 (t, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,70 (t, 1H), 7,58 (d, 1H) , 7,39 (t, 1H), 5,09 (s, 2H), 3,17 (q,2H), 2,49 (s, 6H) , 2,32 (t, 2H) , 2,14 (s, 6H);

Composto E 9-cloro-2,3-dimetilo-6- (AT, AT-dimetilaminoetilamino-2-oxoetilo)-6H-indolo[2,3-b]quinoxalina (R1=C1, R2=CH3, X=CO, Y=NH-CH2-CH2-R3; R3=NR5R6; R5=R6=CH3)

Rendimento: 58%; 1H-NMR δ: 8,29 (d, 1H), 8,23 (t, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,82 (s, 1H) , 7,71 (t, 1H) , 7,61 (d, 1H) , 5,09 (s, 2H), 3,16 (q,2H), 2,47 (s, 6H), 2,28 (t, 2H), 2,12 (s, 6H);

Composto F 9-cloro-2,3-dimetilo-6-(dimetilaminoetilamino-2-oxoetilo)-6ií-indolo [2,3-b] quinoxalina (R1=C1, R2=CH3, Y=NH-CH2-CH2-NH2) 16

Rendimento: 71%; H-NMR δ: 8,32 (d, 1H), 8,27 (t, 1H), 8,01 (s, 1H) , 7,85 (s, 1H) , 7,73 (dd, 1H) , 7,66 (d, 1H) , 5,11 (s, 1H), 3,17 (s,2H), 3,07 (q, 2H), 2,57 (t, 2H), 2,49 (s, 6H) ;

Composto G 2.3- dimetilo-6-(N, lV-dimetilaminoetilamino-2-oxoetilo)-9- fluoro-6Tí-indolo [2,3-£>] quinoxalina (R1=F, R2=CH3, X=CO, Y=NH-CH2-CH2-R3; R3=NR5R6; R5=R6=CH3)

Rendimento: 51%; Tf= 241-242°C; 1H-NMR δ: 8,10-8,00 (m, 3H) , 7,84 (s, 1H) , 7,59-7,53 (m, 2H) , 5,09 (s, 2H) , 3,19 (q, 2H) , 2,94 (s, 1H) , 2,79 (s, 1H) , 2,50 (s, 6H) , 2,31 (t, 2H), 2,14 (s, 6H);

Composto H 2.3- dimetilo-6-(anfnoetilamino-2-oxoetilo)-9-fluoro-6H- indolo [2,3—i?] quinoxalina (R1=F, R2=CH3, X=CO, Y=NH-CH2-CH2- NH2)

Rendimento: 88%; Tf: 269-271°C; 2H-NMR δ: 8,26 (t, 1H) , 8,13 (dd, 1H) , 8,04 (s, 1H) , 7,88 (s, 1H) , 7, 68-7,56 (m, 2H), 5,12 (s, 2H), 3,07 (q, 2H), 2,57 (t,2H), 2,50 (s, 6H).

As novas amidas secundárias de fórmula (IV)

nas quais R1, R2, R3, R5 e R6 e n são o definido na fórmula (I) podem ser também preparadas pelo método geral alternativo, 17 como ilustrado no exemplo seguinte:

Os derivados de indolo[2,3-b]quinoxalina correspondentes (fórmula a) (1 eq.) foram adicionados em várias vezes a uma mistura viscosa de NaH (3 eq.) em DMA ou DMSO ( %mL/ 1 mmol fórmula a) a 30°C sob uma atmosfera inerte (Ar ou N2) e agitada durante 30 min. 2-cloro-IV-(2- dimetilaminoetil)acetamida hidrocloreto (1,5 eq.) (Este reagente de alquilação foi preparado como descrito por Sanchez et al., J. Heterocycl Chem., 31: 297-304 (1994)) foi adicionado de uma única vez. A mistura de reacção resultante foi agitada durante 20h a 40°C e depois vertida em água, filtrada, lavada com água e seca. O sólido foi acidificado através do tratamento com ácido clorídrico e subsequentemente filtrado. O filtrado foi basifiçado através do tratamento com hidróxido de sódio e o sólido formado foi isolado por filtração, lavado com água e seco.

Composto J 2,3-dimetilo-6-(N, IV-dimetilaminoetilamino-2-oxoetilo)-9-fluoro-6 .ff-indolo[2,3-b]quinoxalina

Rendimento: 89%; Tf= 242-243°C. O novo ácido carboxilico de fórmula (V)

OH no qual R1 e R2 são como definidos na fórmula (I) pode ser preparado de acordo com o procedimento seguinte: 18

Procedimento geral 0 derivado apropriado de indolo [2,3-b] quinoxalina de fórmula (a) (1 eq.) foi adicionado em várias vezes a uma mistura viscosa de NaH (1,1 eq.) em DMA ou DMSO (5 mL/ 1 mmol a) a 30°C sob uma atmosfera inerte (Ar ou N2) e agitada durante 30 minutos, ponto no qual cloroacetato de sódio (1,1 eq) foi adicionado de uma única vez. A mistura de reacçao resultante é agitada durante 20h à temperatura ambiente e finalmente é vertida em água, acidificada com HC1, filtrada, lavada com água, seca e recristalizada (DMF).

Composto K 2.3- dimetilo-9-cloro-indolo [2,3-b] quinoxalina-6-yl ácido acético

Rendimento: 0,77g (45%); 1H-NMR δ: 13,29 (bs, 1H), 8,34 (s, 1H) , 8,03 (s, 1H) , 7,89 (s, 1H) , 7,83-7,75 (m, 2H) , 5,26 (s, 2H), 2,50 (s, 6H); Tf: 331-332°C. O novo ácido carboxilico de fórmula (V) no qual R1 e R2 são como definidos na fórmula (I) pode também ser preparado por um método geral alternativo, como ilustrado no exemplo seguinte:

Metilo-2,3-dimetil-9-fluoro-indolo[2,3 —b]quinoxalina-6-yl acetato (l,65g) é agitado em etanol (30mL) com uma solução aquosa de NaOH (5%; 30mL) durante 24h. A mistura de reacção foi acidificada com uma solução aquosa de HC1 (1M) . O sólido assim formado foi filtrado, lavado com água e seco.

Composto L 2.3- dimetilo-9-fluoro-indolo[2,3-b]quinoxalina-6-yl-ácido 19 acético

Rendimento: 1,54g (97%) ; 1H-NMR δ: 14-13 (bs, 1H) , 8,06 (dd, 1H), 7, 93 (s, 1H) , 7,80 (s, 1H) , 7,75 (dd, 1H) , 7,56 (m, 1H), 5,21 (s, 2H), 2,43 (s, 6H)/ Tf: 317-318°C.

Os compostos de acordo com a presente invenção foram testados de acordo com os seguintes modelos para avaliação do seu efeito contra artrite reumatóide e contra esclerose múltipla.

Artrite induzida por colagénio (AIC) em ratinhos é normalmente usada como um modelo experimental para artrite reumatóide (AR) em humanos. AIC é mediada por autoanticorpos que se ligam a uma região particular do colagénio de tipo II, como CB11 (um fragmento originado por digestão de colagénio de tipo II com CNBr). AIC mediada por anticorpos pode ser induzida pela injecção intravenosa de uma combinação de 4 anticorpos monoclonais diferentes (Arthrogen-CIA® mAb) gerados por linhas celulares murinas de B-hibridoma da Arthrogen-CIA®.

Três dos anticorpos monoclonais reconhecem epítopos autoantigénicos num fragmento de 84 resíduos de aminoácidos, LyC2 (o mais pequeno fragmento artritogénico de colagénio de tipo II) de CB11 e o quarto anticorpo monoclonal reage com com LyCI (Fig.l). Importantemente, todos os quartos anticorpos monoclonais reconhecem os epitoposo conservados partilhados entre várias espécies de colagénio de tipo II e reagem inespecificamente com colagénio de tipo II, homólogo e heterólogo. 20 É usado um cocktail de quatro anticorpos monoclonais. Estes anticorpos monoclonais artritogénicos sozinhos ou em combinação com lipopolissacárido bacteriano podem induzir artrite grave após poucos dias em vez de semanas (modelo AIC clássico) . É feita referência à Fig. 1. 1.Vantagens do modelo de artrite induzida por anticorpo

Artrite desenvolve-se nos ratinhos 24 a 48h depois da injecção intravenosa dos anticorpos monoclonais artritogénicos ou após a injecção com lipopolissacárido (LPS) após uma dose de anticorpos monoclonais subartritogénica. Em ambos os casos, a artrite persiste por pelo menos 2-3 semanas ou mais e leva a anquilose.

Artrite é induzida não só em ratinhos DBA/1 e B10.RIII susceptiveis a AIC, mas também em alguns ratinhos resistentes a AIC, como Balb/c.

Este modelo é o ideal para pesquisas de agentes terapêuticos anti-inflamatórios.

Este modelo é ideal para o estudo de mediadores inflamatórios como citocinas, quimiocinas e metaloproteinases e outros factores, como por exemplo o papel da flora bacteriana e dos seus sub-produtos no despoletar e exacerbar da artrite.

Comparação entre o modelo AIC autêntico e o modelo de artrite induzida por LPS e anticorpos monoclonais. (A) Um cocktail de quatro anticorpos monoclonais contra 21 colagénio de tipo II (2 mg) é injectado intravenosamente no dia 0 e seguido por uma injecção intraperitoneal de LPS (50yg) no dia 3. Ao 4o dia desenvolver-se-à artrite, atingindo-se o pico no dia 7-8. Os efeitos terapêuticos dos compostos de teste são determinados ao dia 7. A formação de osteoblastos e a degradação óssea são mais significativas ao dia 14 e dia 21 (dados não mostrados). (B) Artrite autenticamente induzida por colagénio. É feita referência à Fig. 2.

Medição de artrite. Foi medida em mm a espessura da pata traseira, esquerda e direita de cada animal (9 animais por cada grupo) nos dias do estudo 0 (valor de referência), 7, 9 e 11, usando um Mitutoyo, Electronic Digital Caliper. Foi encontrado que a espessura da pata traseira dos animais após administração do composto H, composto E e dexametasona (controlo positivo) é muito significativamente inferios quando comparada com veiculo (óleo de milho). Dexametasona é uma cortisona que suprime a inflamação e a resposta imunitária normal, e é usada sistemicamente e localmente para o tratamento de doenças inflamatórias. Os doentes foram tratados por razões de segurança durante curtos periodos de cortisonas para conseguir controlar a inflamação no período entre o início de DMARD ou a combinação de DMARD e o provável tempo de resposta.

Dia 0 Dia 7 Dia 9 Dia 11 Óleo de milho 2,2 3,3 3,3 3,2 B-220 2,2 3,1 3, 0 2,8 Composto C 2,2 3,1 3, 0 2,8 Composto H 2,2 2,5 2,5 2,5 Composto E 2,2 2,3 2,3 2,3 Dexametasona 2,2 2,3 2,3 2,3 22 É feita referência à Fig. 3.

Nota: As curvas do composto E e Dexametasona (Dexa) e as curvas para B 220 e composto C, estão respectivamente sobrepostas.

Fig. 3. Média por grupos dos valores (mm) de espessura da pata traseira medidos durante todo o período de 11-dias de observação nos ratinhos com artrite induzida por mAb/LPS seguindo uma administração subcutânea repetitiva diária de análogos de B-220, dexametasona (controlo positivo) ou óleo de milho (controlo negativo).

Estudos usando um modelo de ratinho para esclerose múltipla (EM), encefalomielite experimental autoimune (EEA) (Alvord, E. C., et al., Prog. Clin. Biol. Res. 146:1-8 (1984/ Swanborg, R. H., Clin. Immunol. Immunopathol. 77:4-13 (1995); Martin, R. And McFarland, H.F., Crit. Rev. Clin. Lab. Sciences 32:121-182 (1995)) têm sido úteis na caracterização da resposta imunológica numa doença semelhante a EM. EEA pode ser induzida em várias estirpes de ratinhos por injecção subcutânea (s.c.) de proteínas mielínicas como a proteína mielínica báscia (MBP) ou proteínas proteolípidicas (PLP) na presença do adjuvante de Freund. Estudos de trasnferência adoptiva neste modelo de EEA demonstraram que as células T CD4+ de ratinho imunizados com MBP ou PLP podem transferir a doença para ratinhos susceptíveis (naive) sugerindo que EEA é uma doença mediada por células T.

Os resultados apresentados foram gerados no modelo EEA como descrito seguidamente: o modelo consiste num período de sensibilização, induzido por uma única injecção subcutânea 23 de PLP emulsionado em adjuvante completo de Freund (CFA) no dia 0 do estudo, seguido por imunoestimulação suplementar intraperitoneal com toxina pertússica no dia 0 e 48hrs após. Os items em teste foram administrados por uma dose única diária repetida durante periodos de tratamento de 10 dias sucessivos (dias 0-9) . Contudo, a cada dois dias copaxone foi administrado, a partir do dia 0 e até ao dia 18, i.e. 10 administrações, cf. Fig. 5. Todos os animais (10 em cada grupo) foram examinados em busca de sinais de qualquer resposta neurológica e sintomas anteriores à indução de EEA (dia 0) e a partir dai diariamente durante um período de observação de 21 dias. Reacções EEA foram registadas e anotadas de acordo com a escala clássica de 0-5 em ordem ascendente de gravidade (nota 0, normal, nota 5 moribundo e/ou morte). É feita referência à Fig. 4.

Fig. 4. Média por grupos de registos de EEA clínico observado durante o período de 21 dias de observação. É feita referência à Fig. 5.

Fig. 5. Média por grupos de registos de EEA clínico observado durante o período de 21 dias de observação.

Lisboa, 25 de Maio de 2010

Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1 - Um composto de fórmula (I)

onde R1 é um hidrogénio ou representa um ou mais substituintes iguais ou diferentes, nas posições 7 a 10, escolhidos de um grupo de halogenetos, alquilos lineares ou ramificados com 1 a 4 átomos de carbono, alquilóxidos lineares ou ramificados com 1 a 4 átomos de carbono, hidróxido, trifluorometilo, triclorometilo, trifluorometóxido. R2 representa substituintes alquilo Ci-C4 iguais ou diferentes X é CO Y é OH, NH2, ou NH- (CH2) n-R1 onde R1 representa um radical alquilo linear ou ramificado com 1 a 4 átomos de carbono, OH, NH2, NHR2 ou NR5R6, onde R2, R5 e R6 são independentemente radicais alquilo lineares ou ramificados, com 1 a 4 átomos de carbono, ou cicloalquilos C5 a C7 e onde é um número inteiro de 2 a 4, e sais farmacologicamente aceites destes compostos.

2 - Composto de acordo com a reivindicação 1 onde Y é OH ou NH2 e R1 é um átomo de halogeneto. 1 - Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde R1 2 é um átomo de cloro ou flúor. 2

4 - Composto de acordo com a reivindicação 1 onde Y é NH-CH2-CH2-R3 onde R3 é NH2 ou N(CH3)2.

5 - Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 onde R2 é um metilo nas posições 2 e 3.

6 - Um composto de acordo com a reivindicação 1, escolhido de entre: 2.3- dimetilindolo [2,3-£>] quinoxalina-6-yl-acetamida 9-cloro-2,3-diinoetilo-indolo[2,3-b]quinoxalina-6-yl- acetamida 2.3- dimetilo-9-fluoro-indolo[2,3-b]quinoxalina-6-yl-acetamida 2.3- dimetilo-6- (N, iV-dimetilaminoetilamino-2-oxoetilo) -6 ff-indo lo [2,3-£>] quinoxalina 9-cloro-2,3-dimetilo - 6- (IV, IV-dimetilaminoetilamino-2-oxoetilo) -6 H- indo lo [2,3-£>] quinoxalina 9-cloro-2,3-dimetilo-6-(aminoetilamino-2-oxoetilo)-6H-indolo[2,3-b]quinoxalina 2.3- dimetilo-6-(N, IV-dimetilaminoetilamino-2-oxoetilo)-9-fluoro-6fí-indolo [2,3-b] quinoxalina 2.3- dimetilo-6-(aminoetilamino-2-oxoetilo) -9-fluoro-6fí-indolo [2,3—Jb] quinoxalina 2.3- dimetilo-9-cloro-indolo[2,3-b]quinoxalina-6-yl-ácido acético; e 2.3- dimetilo-9-fluoro-indolo[2,3-b]quinoxalina-6-yl-ácido acético, ou uma forma salina farmaceuticamente aceitável destes compostos. 7-0 composto de acordo com a reivindicação 6, o qual é 9-cloro-2,3-dimetilo-6-(N, IV-dimetilaminoetilamino-2-oxoetilo)-6H-indolo [2,3-£>] quinoxalina ou uma forma salina 3 dele derivada farmaceuticamente aceitável.

8 - Um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7 para ser usado como medicamento.

9 - Uma composição farmacêutica que contenha um composto de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 7, juntamente com solventes, excipientes e adjuvantes adicionais.

10 - Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 usado na prevenção e/ou o tratamento de doenças auto-imunes.

11 - Um composto de acordo com a reivindicação 10 usado para a prevenção e/ou o tratamento de artrite reumatóide.

12 - Um composto de acordo com a reivindicação 10 usado para a prevenção e/ou o tratamento de esclerose múltipla.

13 - Um processo de preparação de compostos de fórmula geral (I) onde R1, R2, R3, R4, R5, R6, X e Y são definidos como na reivindicação 1, onde aniões de fórmula (a)

M são alquilados por alquilonitrilos α-halogenados ou ésters de alquilo α-halogenados respectivamente, nos quais 6-cianometiloindolo-[2,3-b]quinoxalinas de fórmula (b) 4

e indolo[2,3-b]quinoxalina-6-yl-ácido acético(c; R7= H) ou sais seus derivados (e.g. Na) e alquiloacetatos de indolo-[2,3—jb] quinoxalinas de fórmula (c)

de fórmula (b) que i.e. indolo[2,3- (II) na qual R7 é metilo ou etilo, respectivamente são obtidos de compostos originam as amidas primárias, b]quinoxalina-6-yl-acetamidas de fórmula

por hidrólise acidica num ácido forte, como ácido sulfúrico e compostos de fórmula (c) originam as amidas secundárias (III) 5 5

r* m por condensação de ésteres de alquilo de fórmula (c) com um excesso da amina apropriada, na presença ou ausência de um solvente.

14 - Um processo para a preparação de compostos de fórmula geral (IV) R2

onde R1, R2, 1, na qual reagidos com R3, R5 e R6 e n são definidos na reivindicação aniões de um composto de fórmula (a) são um agente de alquilação de fórmula (VI) Hb!

«e (CHaJn-H m) na qual Hal é um átomo de halogeneto e o sólido assim obtido é acidificado, filtrado e o filtrado resultante é basificado, o que origina um composto de fórmula (IV). 15 Uso de um composto de acordo com uma das 6 reivindicações 1 a 7 para o fabrico de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de doenças auto-imunes. Lisboa, 25 de Maio de 2010 1/5 Ο cu .-} &* φ Ό Q G ό» t3V m r—t Ο C3 Ν σ> m ο m 00 Ο ο τ~ 00 Ο 00 00 Ο 00 ο CM 111,1 00 ο φ 00 ο

00 Xiocalisação d® ®pitopos artritogéniocs no coXagonio d® Tipo XX reconhecidos por anticorpos xnonoclonais artritogéniods da Ar throgea-CIA 2/5 o y.....i O a> m fCí ÍM f=3 o o 4_i O Cd rcS " v,1,1,t £3 Cd m y*1* 4=™# /M* a> O f * o o 'ΪΤ» 'rd o o I * «o O -*—> O y* «3 O «-1 o a> --i <o irtS o **ts o o a> θ' 5*··-| o> o» o o cd S*~t fcr* _t TO a* a> c> -*-> * | <XS X -i—* O - 1—· t| | m o í-l <l> rí 30 a# S~* 5—1 c_> e-« ”X3 1—t ^ 1—1 5—1 E—· +

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Fig. 5 Média por grupo do registo clinico de BEA. observado durante o periodode 21 dias de observação-