SE529777C2 - Nya föreningar och användning därav - Google Patents

Description

529 777 2 hållande basisk rest såsom NH2, NHR4 eller NR5R6, vari R4, R5 0011 Rö Chem' ende är lägre alkyl eller cykloalkyl och n år ett heltal från 1 till 4 och R3 beteck- nar våte, lägre alkyl/cykloalkyl-grupp med icke mer än 4 kolatomer, och de fy- siologiskt godtagbara additionsprodukterna av föreningarna med syror och ha- logenaddukter, lämpligen addukter med jod, jodmonoklorid eller jodmonobro- mid.

Det är dock uppenbart att det fortfarande föreligger ett påtrångande behov av nya läkemedel med antiviral aktivitet, i syrmerhet mot herpesvirus såsom HMCV, och ett syfte med föreliggande uppfinning år att tillhandahålla föreningar som uppfyller detta behov.

SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Enligt en första aspekt tillhandahåller uppfinningen en ny typ av förening enligt formeln (I) Vall Rl är vald bland H, F, cl, Br, CF3, cl-cö-alkoxi och OH; 122 ar vald bland H oob cl-cö-aikyi; n är 1-12; m år 0 eller 1; och Y är vald bland eng, NR3, (NR3R4)+x-, o ooh s; 529 777 3 R3 een 124 år oberoende veide biand H eeh c1-c4-auq1; och X' år vald bland farmaceutiskt godtagbara anjoner.

Enligt en annan aspekt tillhandahålles en metod för framställning av en förening enligt formeln (I), genom att en förening med formeln (Il) RZ 2 N-cH, I Hac bringas att reagera med en förening med formeln (III) L(CH2)n(Y)m(CH2)nL (III) vari RI, R2, Y, m och n är såsom ovan definierats med avseende på formeln (I); och L är en låmnande grupp; i ett lösningsmedel eller blandning av lösningsmedel.

Enligt en ytterligare aspekt tillhandahåller uppfinningen en fannaceutisk komposi- tion innefattande en förening med formeln (I) tillsammans med minst ett farmaceu- tiskt godtagbart hjälpåmne.

Ytterligare aspekter enligt uppfinningen såväl som utföringsformer därav är såsom definieras i patentkraven.

DETALJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN I en utföringsform av föreliggande uppfinning är Rl i formeln (I) vald bland H, F, Cl, Br, CF3, OCH3 och OH.

Vidare, i en utföringsform av uppfinningen är R2 i formeln (I) vald bland H och CH3.

Motjonen X" i formeln (I) kan vara vilken som helst lämplig farmaceutiskt godtagbar anjon, såsom Cl', Br", metansulfonat, toluensulfonat, acetat, citrat och maleat. 529 777 4 Indexet n iformeln (I) kan väljas från vilket som helst värde mellan l och 12, såsom 2- 10, eller 4-10, t.ex. 4-8; eller 1-6, t.ex. l-3.

Föreningen med formeln (II), som används vid framställningen av föreningen enligt uppfinningen, kan i sig framställas såsom allmänt lårs ut i EP O 238 459 såväl som i US-patentet 4,990,5lO, vilka patent båda införlivas håri genom referens.

Föreningen med formeln (III), dvs. L(CH2)n(Y)m(CH2)nL, kan syntetiseras med me- toder som âr välkända för fackrnannen på området, eller kan inköpas från kemi- kalieleverantörer.

Den lånmande gruppen L i formeln (III) kan lämpligen väljas bland t.ex. Cl, Br, me- tansulfonyl och toluensulfonyl, fastän fackmannen kommer att inse att även andra lâmnande grupper kan ses som möjliga.

Lösningsmedelssystemet som används bör vara ett vari reaktionskomponenterna är lösliga vid de valda reaktionsbetingelsema och bör lämpligen vara sådana att de gfnnar den reaktion som leder till den önskade produkten. T.ex. kan ett polärt aprotiskt eller protiskt lösningsmedel väljas, såsom acetonitril, THF, metanol, eta- nol, isopropanol, etylacetat och metylacetat. Det ligger väl inom fackmannens för- måga att välja ett sådant lösningsmedelssystem såväl som lämpliga reaktionsbe- tingelser.

De nya föreningarna enligt uppfinningen är användbara som antivirala medel och enligt en uppfinningsaspekt tillhandahålles således en antiviral fannaceutisk kom- position innefattande en förening med formeln (I) och minst ett farmaceutiskt god- tagbart hjälpänme. De farmaceutiskt godtagbara hj ålpämnena kan vara t.ex. vehik- lar, adjuvans, bärare eller spädningsmedel, såsom är välkända för fackrnannen på området och såsom beskrives t.ex. i Remington: The Science and Practice of Phar- macy, 21:e utgåvan., Mack Printing Company, Easton, Pennsylvania (2005). Det anses vidare möjligt att den farmaceutiska kompositionen enligt uppfinningen, för- utom en förening med formehi (I), också kan innehålla andra terapeutiskt aktiva substanser, t.ex. andra antivirala medel.

Den farmaceutiska kompositionen enligt uppfinningen kan administreras parente- ralt eller oralt och kan användas i en lokal eller systemisk antiviral behandling av ett ryggradsdjur i behov av en sådan behandling, t.ex. en fågel eller ett däggdjur, såsom en människa eller ett djur, såsom ett husdjur eller ett tamdjur. Det anses som möjligt att en farmaceutisk komposition enligt uppfinningen kan administreras tillsammans med andra, kompatibla läkemedel, såsom ett armat antiviralt läkeme- del vid multidrogterapi. 529 777 Nedan illustreras uppfinningen ytterligare genom exempel som dock ej bör ses som begränsande för uppfinningen, vars omfång definieras av patentkraven.

EXEMPEL Framställning av uppfinningsfóreninga: NMR-spektra registrerades i DMSO-dö-lösriingar vid rumstemPefatl-ïf med använd' ning av signalen från DMso-dö GH; s = 2,50 ppm; 130; a = 39,5) som inre stan- dard, på en Bruker DPX SOO-spektrometer (300 MHz). Värden för 5 anges i ppm.

Lösningsmedlen var av analytisk kvalitet och användes som de var vid erhållandet.

EXEMPEL 1 Syntes av alkylendimerer Allmänt förfarande (10 mmol-skala) B-220 (formel II, RI = H, RQ = CH3, eller derivat därav), dihalogenalkan och aceto- nitril upphettades (vid återlopp eller vid 70°C) i 15 h. Det på så sätt framställda fas- ta materialet isolerades genom filtrering, tvâttades med acetonitril och torkades. 1a)R1=I-I,R2=CH3,n=3,m=0 Utbyte: 70%; lH-NMR ö: 8,34 (d, lH), 7,94 (m, 2H), 7,77 (m, 2H), 7,43 (t, lH), 4,93 (br. s, 2H), 3,86 (br. s, 2H), 3,54 (br. s, 2H), 3,27 (s, 6H), 2,39 (s, 6H), 1,77 (br. s, 2H), 1,28 (br. s, 2H). 1b)R1=H,R2=CH3,n=5,m=0 Utbyte: 49 %; lH-NMR ö: 8,35 (d, lH), 8,00 (s, lH), 7,92 (d, lH), 7,80 (m, 2H), 7,45 (t, lH), 4,91 (t, 2H), 3,85 (t, 2H), 3,49 (m, 2H), 3,24 (s, 6H), 2,48 (s, 3H), 2,45 (s, 3H), 1,69 (m, 2H), 1,17 (s, 61-1). 1c)R1 = 9-Br, R? = CH3, n = 3, m = O Utbyte: 73 %; lH-NMR ö: 8,39 (s, lH), 8,08-7,81 (m, 3H), 7,73 (s, lH), 5,16 (bI- S, 2H), 3,69 (br. s, 2H), 3,43 (br. s, 2H), 3,25 (s, 6H), 2,39 (s, 3H), 2,37 (s, 3H), 1,88 (br. s, 2H), 1,32 (br. s, 2H).

EXEMPEL 2 Syntes av eterdimerer Allmänt förfarande (10 mmol-slrala) B-220 (eller derivat därav), dihalogenalkan och acetonitril upphettades vid återlopp i 20 h. Det på så sätt framställda fasta materialet isolerades genom filtrering, tvät- tades med acetonitríl och torkades. 529 777 2s)R1=11,R2=c113,n=2,Y=o,m= 1 Utbyte; 53 %; IH-NMR s; 3,22 (d, 111), 7,34 (s, 111), 7,72 (m, 211), 7,59 (s, 111), 7,47 (d, 111), 7,33 (t, 1H), 7,03 (d, 1H), 4,35 (t, 211), 4,09 (br. s, 211), 3,93 (m, 411), 3,29 (s, 611), 2,35 (s, 311), 2,26 (s, 311), 2,24 (s, 311). zh) 121 = 9-51, 112 = C113, n =2, Y = o, m = 1 Utbyte; 91 %; IH-NMR ö; 3,02 (d, 111), 7,77-7,66 (m, 311), 7,49 (s, 111), 7,45 (d, 211), 7,07 (d, 211), 4,73 (t, 211), 4,11 (br. s, 211), 3,95-3,90 (m, 411), 3,27 (s, 611), 2,31 (s, 311), 2,25 (s, 311), 2,13 (s, 311).

Biologiskt test Test av antiviral aktivitet mot humant cytomegalovirus såsom beskrivs nedan ut- fördes på en förening enligt uppfinningen, dvs. föreningen la enligt EXEMPEL 1.

Referensföreningen som betecknas B-220 är 2,3-dimety1-6-(N,N-dimetylaminoetyl)- 6H-indo1o(2,3-b)kinoxalin, som beskrivs i det europeiska patentet EP O 238 459.

Test av hämmande efiekter på virusinfektion För att bedöma huruvida att ta vírala strukturproteiner som måltavla skulle vara lika effektivt som att ta viral translcription som måltavla utarbetades en modifierad plackassay, vari ett av de nya antivirala medlen jämfördes med redan allmänt er- kända antivirala medel som hämmar antingen HCMV:s transkription [GCV (Cyme- vene, Roche] och PFA (Foscavir, AstraZenecaH eller infektion [IVIg {IVIG CP, Biotest Pharma), en antikropp].

I ett O dpi-försök (days post infection; dagar efter infektion) tillsattes de antivirala medlen och TB40 / E samtidigt, varigenom det visas hur väl medlen hämmar infek- tionen. Resultaten av detta försök erhölls genom att mängden infekterade celler i de behandlade brunnarna jämfördes med dem i de positiva kontrollproven, varigenom den infektionshämning som uppnåddes med medlen ifråga beräknades.

Den håmmande effekten av de testade substanserna visas i Tabell l , som procent- andelen hämning av infektionen. Dessa data är resultaten från plackassayer med användning av stam AD 169 och TB40 av HCMV-infekterade humana lungfibroblas- ter. 529 777 7 Tabell 1. Hämmande effekt av testade substanser som % infektionshämníng Substans Hämmande effekt (%) la 100 lVIg (referens) 100 B-220 (referens) 20 Leflunomid (referens) 25-50 Foscavir (referens) 20-50 Ganciclovir (referens) 20-30 Testresultaten visar att uppfmningsföreningarna har utmärkt härnmande effekt på virusinfektion.

Test av hämning av HCMV-nybildning och -frisättning Infekterade humana lungñbroblastceller (HL-celler) behandlades med det antivirala medlet B-22O och med andra referenssubstanser, såsom visas i Tabell 2, samt med uppñnningsföreningen la för bedömning av efiekten av uppfirmingsföreningarna på HCMV-infektion, nybildning och frisâttning.

De antivirala medlen tillsattes 3 eller 5 dagar efter infektion (dpi) i dessa försök och lämnades kvar i odlingen tills 7dpi. Därefter överfördes supernatanten och krossade celler till nya cellodlingar över natten och färgades sedan för IE-expression. Resulta- ten visar hur väl substanserna hämmar den virala nybildningen och frisättningen.

Närmare bestämt, vid 3dpi nybildas merparten av de virala kapsiderna i kärnan under det att vid Sdpi erhåller de huvudsakligen sitt tegument i cytoplasman och vissa har påbörjat bildandet av sekundärt hölje.

I Tabell 2 visas den håmmande effekten av de antivirala substanserna med an- vändning av det modifierade plackassaysystemet. Flera substanser visade lOO % håmning av IE-expressionen, uppmätt genom IE-färgnirig, och ingen kapsidbildning observerades i kärnan hos merparten av de behandlade cellerna, såsom observera- des genom elektronmikroskopisk undersökning. Uppfinningsföreningen betecknad la visade ytterst goda resultat som måtte sig med de resultat som erhölls med Gan- ciclovir. / 529 777 8 Tabell 2. Hämmande effekt av antivirala substanser Substans Hämning 3dpi (%) Hämning Sdpi (%) la 95- 100 85-95 B-220 (referens) 65-85 65-80 Leflonumide (referens) 65-80 80-90 Foscavir (referens) 85- 100 65-85 Ganciclovir (referens) 100 80-95 Verkningsmekanism Utan önskan om att bindas till någon teori avseende uppfinningsföreningarnas verkningsmekanism, noteras det att den testade uppfinningsföreningen la visar mycket tydlig hämning av IE-expression. Dessutom visar elektronmikroskopiska data på en försämring av virusnybildningen. Bildanalystekniken som används för att identifiera och kvantifiera stabila intermediära partiklar av HCMV visade verkli- gen att tegumentproteinets bindning till den virala kapsiden försämrats. Tillsam- mans visar dessa data på en hög potential för användningen av uppfinningsföre- ningarna vid antiviral terapi. Genom att använda uppfinningsföreningarna i kombi- nation med minst ett annat antiviralt aktivt medel, såsom i en multidrogterapi, för- väntas också en synergstisk efiekt och risken för förvärvad lâkemedelsresistens kan minskas eller undvikas.

Toxicitet Uppfinningsföreningarna visade inte någon toxicitet vid test med propidiumjodid- färgning av cellkulturer av infekterade och oinfekterade humana lungfibroblaster.

En koncentration av förening la som var 10 gånger den som användes i försöken visade ingen toxicitet inom tidsramen 0-7dpi. De koncentrationer av föreningar som användes i de virala försöken var på pM-nivån. Cellulâr toxicitet för B-220 har påvi- sats för koncentrationer över 100 uM.

Material och metoder Cellkultur De humana lungfibroblasterna, HL-celler (MRC-5), som användes i dessa försök, inkuberades vid 37°C och 5 % C02 i en lösning av MEM med Earle's och L- glutamin (från GIBCO) vartill 10 % fetalt kalvserum (FCS) och 1 % penicillin och streptomycin (PeSt) satts.

Når försöket startade hölls HL-cellerna i en Falcon cellkulturflaska om 175 cmz.

Trypsin och EDTA användes för att lösgöra cellerna från cellkulturflaskan när de 529 777 9 överfördes till 48-brunns-multibrunnar (Becton Dickinson) för infektion och inku- bation med de antivirala medlen.

Cellema inkuberades tills 50 % konfluens uppnåtts under samma betingelser som ovan och användes upp till den 26:e passagen.

Infektion av celler med I-ICMV HL-cellerna infekterades med HCMV, virusstammen TB 40/ E [ett endotelanpassat kliniskt isolat URl8l4) som vänligen tillhandahålls av Prof. G. J ahn] vid en infek- tionsmultiplicitet (MOI) av 0,02 och inkuberades tills 3 eller 5 dagar efter infektion (dpi) vid 37°C oc 5 % C02 i samma media som ovan. Vissa celler (för Odpi-försöket) exponerades samtidigt för de antivirala medlen (se nedan). De negativa kontrollpro- verna lämnades oínfekterade.

Exponering av cellerna fór hämmare och antivirala medel Det befintliga mediumet (i försöken vid 3 och Sdpi) byttes och nytt medium tillsat- tes, med hâmmare och antivirala medel vid olika koncentrationen Detta ordes dock samtidigt med infektionen i Odpi-försöket och fick inkubera tills ldpi. Det me- dium som innehöll IVIg inkuberades i en ümme med viruset på is innan det sattes till cellerna.

Modifierad plackassay I 3- och S-dpi-försöken överfördes MRC-S-cellernas supernatant till oinfekterade celler för bestämning av mängden utsöndrat virus. De återstående cellerna gavs nytt medium och krossades med glaskulor genom att multibrunnarna skakades på en IKA-Vibrax-VXR vid 300 skakningar per minut i 10 minuter. Därefter överfördes cellresterna till oinfekterade celler för utvärdering av mängden infektiösa intracellu- lära viruspartiklar.

Efter det att virusparfiklarna fått infektera de nya cellernai cirka en timme byttes mediumet, så att cellresterna därigenom tvâttades bort. I Odpi-försöken fixerades cellerna omedelbart ldpi (i enlighet med det förfarande som förklaras nedan).

Positiva kontrollprover (obehandlade infekterade celler) och negativa kontrollprover (obehandlade oinfekterade celler) behandlades vardera som ovan.

Immunfluorescensfärgníng av cellerna De nya HL-cellerna (i 3- och Sdpi-försöken) fixerades följande dag med 3 % para- formaldehyd (PFA) i 15 minuter vid rumstemperatur (RT). För att göra cellerna per- meabla användes 0,3 % TritonX i fosfatbuffertsaltlösning (PBS) under 15 minuters inkubation vid RT varefter bakgrunden blockerades med bakgrundsblockeringsme- 529 777 10 del från DAKO i 20 minuter vid RT, med en mängd som var precis tillräckligt stor för att täcka hela ytan. Därefter inkuberades samtliga multibrunnar med primära antikroppar (mus), utspådda till 1:lO0, mot omedelbart tidigt antigen (IEA, Antige- ne) i 45 minuter vid 8°C. Därefter inkuberades cellerna med sekundära antikrop- par, kanin-antimus FITC (Dako Cytomation), utspådda till 1:lO0, i 45 minuter vid 8°C, och färgades samtidigt med DAPI (Sigma), med spädningen 12250. DAPI ål' 611 kemisk substans som färgar cellemas kärna..

De positiva resp. negativa kontrollprovema, av båda celltyperna, behandlades om ovan.

Konfokal rniln-oskopísk analys Cellema analyserades med fluorescensmikroskopi med användning av en Nikon Eclipse TE 2000-U. Den cellmängd som uttrycker IEA, i två olika delar av brunnen, räknades med blotta ögat och jämfördes med den totala mängden celler (som påvi- sas med DAPI), i samma delar. Dessa värden användes för att uppskatta procent- andelen infekterade celler i varje brunn varur den grad av hämning som uppnåddes med de olika substanserna beräknades. Denna metod för beräkning av procentan- delen infekterade celler i två delar av en brunn och applicering därav till hela brun- nen valdes eftersom den totala mängden celler i en brunn skulle vara omöjlig att beräkna manuellt.

Claims (16)

529 777 H PATENTKRAV

1. l. Förening med formeln (I) R2 2 N R ragg? Hae/N* x- (I) (,CH2)n "m (ICHân H ca X. N F" o" N vari 121 är vaid bland H, F, c1, Br, crfs, cl-cö-aikom och oH; 122 år vald biand H och cl-cö-aikyi; n är 1-12; m år 0 eller l; och Y är vaid biand cH2, NR3, (NR3R4PX3 o och s; R3 och R4 är oberoende valda bland H och C1-C4-alky1; och X' är vald bland farmaceutiskt godtagbara anj oner.

2. Förening enligt patentkravet 1, vari RI är vald bland H, F, Cl, Br, CF3, OCH3 och OH.

3. Förening enligt patentkravet 1 eller 2, vari RQ är vald bland H och CH3.

4. Förening enligt något av patentkraven 1-3, vari X' år vald bland C1', Br] metansulfonat, toluensulfonat, acetat, citrat och maleat.

5. Förening enligt något av patentkraven 1-4, vari m är 0.

6. Förening enligt något av patentkraven 1-4, van' m år 1. 529 777 12

7. Förening enligt patentkravet 6, vari Y är O.

8. Förening enligt något av patentkraven 1-7, vari n år 4-10.

9. Förening enligt något av patentkraven 1-7, vari n är 1-3.

10. Förfarande för framställning av en förening enligt något av patentkraven 1-9, genom att en förening med formeln (II) RZ /N-CH, Hac bringas att reagera med en förening med formeln (III) L[CH2)n(Y)m(CH2)nL (III) vari Rl, R2, Y, m och n är såsom defmierats i något av patentkraven l-9; och L är en lämnande grupp; i ett lösningsmedel eller en blandning av lösningsmedel.

11. ll. Förfarandet enligt patentkravet l0, vari den lämnande gruppen är vald bland Cl, Br, metansulfonyl och toluensulfonyl.

12. Förening enligt något av patentkraven l-9 för användning som ett läkemedel.

13. Farmaceutisk komposition innefattande en förening enligt något av patentkraven l-9 och ett farmaceutiskt godtagbart hjälpåmne.

14. Farmaceutisk komposition enligt patentkravet 13, för användning som ett antiviralt läkemedel.

15. Farmaceutisk komposition enligt patentlaavet 14, för användning som ett läkemedel mot herpesvirus. 529 777 13

16. Farmaceutisk komposition enligt patentkravet 15, vari herpesviruset är humant cytomegalovirus.