CN105968096A - 一种n-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种n-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105968096A
CN105968096A CN201610305178.6A CN201610305178A CN105968096A CN 105968096 A CN105968096 A CN 105968096A CN 201610305178 A CN201610305178 A CN 201610305178A CN 105968096 A CN105968096 A CN 105968096A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
piperidine
substituted
phenyl
boc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610305178.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105968096B (zh
Inventor
刘新泳
李潇
展鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN201610305178.6A priority Critical patent/CN105968096B/zh
Publication of CN105968096A publication Critical patent/CN105968096A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105968096B publication Critical patent/CN105968096B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种如通式I所示的N‑取代哌啶胺‑4‑嘧啶类衍生物及其药学上可接受的盐、酯或前药，其制备方法以及含有一个或多个此类化合物的组合物在预防和治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染药物中的应用。

Description

一种N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种衍生物及其制备方法与应用，具体涉及N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物及其制备方法与应用，属于医药技术领域。
背景技术
获得性免疫缺陷综合征(艾滋病，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的危害人类生命健康的重大传染性疾病。现有抗艾滋病药物及高效抗逆转录病毒疗法(HAART)的应用虽然可以显著延缓病情，但存在易产生耐药性、服药量大、毒副反应严重以及治疗费用昂贵等诸多问题，因此研发新型抗艾滋病药物仍刻不容缓。底物非竞争性非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTIs)具有高效、低毒的优点，目前已成为HAART的重要组成部分。已经有5个该类药先后上市，即奈韦拉平(nevirapine)、地拉韦啶(delavirdine)、依法韦仑(efavirine)、依曲韦林(etravirine,TMC125)和利匹韦林(rilpivirine,TMC278)。但是随着该类药物的临床的普遍应用，耐药病毒株也迅速产生并蔓延，大大降低了其临床效价。因此，寻找结构新颖并能克服现有药物问题的抗艾滋病新药是目前抗艾滋病药物研究领域的重要课题。
DAPY类化合物(Diarylprimidines，二芳基嘧啶)是一类新型、高效抗耐药的HIV-1NNRTI。其中依曲韦林(TMC125，2008年上市)和利匹韦林(TMC278,2011年上市)作为新一代NNRTIs已在临床得到广泛的应用。它们对野生型和多种耐药病毒株(如K103N、Y181C、K103N/Y181C等)均具有相当强的抑制活性。但是，该类化合物水溶性极差、口服生物利用度低、过敏等副作用使其临床应用受到极大限制。因此，通过广泛的结构修饰以改善该类抑制剂的生物利用度对发现具有自主知识产权的新型抗HIV药物具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物或其药学上可接受的盐、酯或前药；本发明还提供上述化合物的制备方法以及活性筛选结果和应用。
本发明的技术方案如下：
一、N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物
本发明的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物或其药学上可接受的盐、酯或前药，具有如下通式I所示的结构：
其中，
R为CH3、CN、卤素或E-氰基丙稀基；
X为-NH-、-O-或-S-；
n等于0或1；
Ar为苯基或吡啶基；所述的苯基可被邻间对单取代或多取代，取代基选自卤素、NO2、CN、NH2、NHCH3、OH、COOH、CH2OH、CONH2、COOCH3、COOCH2CH3、OCH3、OCH2CH3、SO2NH2、SO2CH3、C≡CCH2CH2OH或C≡C-CH＝CH-CH2-OH。
根据本发明优选的，通式I化合物为下列结构的化合物之一：
二、N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物的制备方法
本发明以5-硝基-2,4-二氯嘧啶(1)为起始原料，与1-叔丁氧羰基(Boc)-4-胺基哌啶在三乙胺的碱性条件下缩合得到中间体化合物2；与不同取代的苯酚，苯硫酚或苯胺经过亲核取代反应得中间体化合物3，用三氟乙酸脱去Boc保护基得到中间体化合物4，再与取代的苯基或苄基反应得到中间体化合物5,将化合物5的硝基还原成氨基或与含炔取代基相连后再还原得到终产物I；
合成路线如下：
试剂和条件:(i)1-Boc-4-氨基哌啶,三乙胺,四氢呋喃,0℃；(ii)不同取代的苯酚,苯硫酚或苯胺,碳酸钾,N,N-二甲基甲酰胺,60℃；(iii)三氟乙酸,二氯甲烷；(iv)取代的卤苄或芳卤；(v)钯碳,氢气,乙醇；(vi)双三苯基磷二氯化钯,碘化亚铜,三乙胺,2-戊烯-4-炔-1-醇,二氯化锡二水合物。
其中R、n、X和Ar的定义同上通式I所述。
根据本发明优选的，一种N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物的制备方法，包括如下步骤：
以5-硝基-2,4-二氯嘧啶(1’)为起始原料，与1-叔丁氧羰基(Boc)-4-胺基哌啶在三乙胺的碱性条件下缩合得到中间体化合物2’；与不同三甲基苯酚或3,5-二甲基-4-羟基苯腈经过亲核取代反应得中间体化合物3’，用三氟乙酸脱去Boc保护基得到中间体化合物4’，再与取代的苯基或苄基反应得到中间体化合物5’,将化合物5’的硝基还原成氨基或与含炔取代基相连后再还原得到终产物I；
合成路线如下：
试剂和条件:(i)1-Boc-4-氨基哌啶,三乙胺,四氢呋喃,0℃；(ii)2,4,6-三甲基苯酚或4-羟基-3,5-二甲基苯甲腈,碳酸钾,N,N-二甲基甲酰胺,60℃；(iii)三氟乙酸,二氯甲烷；(iv)取代的卤苄；(v)钯碳,氢气,乙醇；(vi)双三苯基磷二氯化钯,碘化亚铜,三乙胺,2-戊烯-4-炔-1-醇,二氯化锡二水合物。
其中，R为CH3或CN；Ar为苯基或吡啶基；所述的苯基对位被单取代，取代基为CONH2、COOCH3、SO2CH3、C≡C-CH＝CH-CH2-OH。
具体的制备方法详见实施例1～8。
三、N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物类化合物的应用
本发明通式I的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物类化合物在抑制HIV复制的MT-4细胞试验中显示出显著的抗病毒活性和较高的选择性。因此，本发明还提供：
通式I的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物在制备抗HIV的药物中的应用。
一种抗HIV药物组合物，包含本发明所述化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
本发明化合物既可以其本身也可以其药学上可接受的盐或溶剂化物的形式使用。通式I化合物的药学上可接受的盐包括与药学上可接受的无机酸或有机酸或者无机碱或有机碱形成的常规盐。合适的酸加成盐的例子包括与盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、氢溴酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、扑酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基苯甲酸、氢碘酸、苹果酸、鞣酸等形成的盐。合适的碱加成盐的例子包括与钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N,N’-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖按和普鲁卡因等形成的盐。本文中涉及到本发明化合物时，包括通式I化合物及其药学上可接受的盐或溶剂化物。
根据本发明，本发明式I化合物可与常规药物载体或赋形剂组成药物组合物。该药物组合物可通过口服或非肠道途径给药。本发明的药物组合物可按本领域常规方法制备成各种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、溶液、悬浮液、颗粒剂或注射剂等，经口服或非肠道途径给药。
本发明在对二芳基嘧啶类化合物构效关系和分子模拟深入研究的基础上，按照生物电子等排药物设计原理，将TMC125中嘧啶环1位N用C代替并引入氨基以保持与HIV-1逆转录酶(RT)的氢键作用。在新构建的分子左翼引入高活性取代基的同时，应用优势药效团片段的组合，通过在分子的右翼引入N-取代苄基哌啶结构以增加与周围氨基酸的潜在氢键作用，进而提高与靶标的亲和力及抗病毒活性。活性结果表明，所有化合物均具有了突出的抗野生型HIV-1活性，且大部分化合物对多种HIV-1突变株(L100I、K103N、Y181C、Y188L、E138K)保持了纳摩尔的抑制活性，显著优于上市药物NVP和DLV，并与EFV处于同一水平，特别是针对个别严重的单突变病毒如K103N和Y181C。此外，本发明提供的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物对细胞的毒性较上市药物大大降低，特别是相对ETV，所涉及化合物的CC50值提高了5.2-53.3倍。且化合物I-1、I-3、I-6的选择指数不论是对野生型还是多种单或双突变型病毒株都远好于所有阳性对照药物。因此，本发明提供的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物具有显著的进步性，具有较大的开发价值，在此基础上进行新的结构修饰及深入研究有助于开发出新的抗HIV药物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。
实施例1：4-(4-(1-(4-(甲砜基)苄基)哌啶-4-胺基)-5-氨基嘧啶-2-基氧基)-3,5-二甲基苯甲腈(I-1)的制备
2,4-二氯-5-硝基嘧啶(1’)(0.50g,2.58mmol)称于圆底烧瓶中，15mL干燥的四氢呋喃溶解，冰浴搅拌下向其中滴加Boc-4-氨基哌啶(0.52g,2.58mmol)和三乙胺(0.287g,2.838mmol,0.39mL)的四氢呋喃混合溶液(15mL)。滴毕，转为室温继续反应10小时。反应完全后，过滤除掉生成的有机盐，滤液浓缩并柱层析纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1:4)，得黄色固体2’.产率:65.6％.mp：130-131℃.
上步制得中间体2’(0.10g,0.28mmol),4-氰基-2,6-二甲基苯酚(0.045g,0.308mmol)，碳酸钾(0.0425g,0.308mmol)共置于圆底烧瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺5mL，室温搅拌6小时。反应停止后减压蒸除大部分溶剂，向其中加水50mL，乙酸乙酯萃取(3×10mL)，有机相合并饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤浓缩并快速柱层析纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1:8)，得黄色固体3’。产率:60.7％.mp:129-130℃.
中间体3’(2.0g,4.2mmol)置于圆底烧瓶中，2mL干燥的二氯甲烷将其溶解，室温下缓慢滴加三氟乙酸2mL，滴毕反应液继续室温反应6小时。减压蒸除大部分溶剂和三氟乙酸，50mL二氯甲烷复溶，饱和碳酸氢钠溶液洗涤(3×30mL)，有机相无水硫酸镁干燥，加压过滤浓缩，得油状中间体4’.产率85.0％.ESI-MS:m/z 369.3(M+1),C18H20N6O3[368.16].
中间体4’(0.4g,1.09mmol)和碳酸钾(0.226g,1.57mmol)共置于圆底烧瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺10mL，室温搅拌下加入4-甲基磺酰基苄溴(0.299g,1.20mmol)，反应6小时后蒸除大部分溶剂，加入水50mL，二氯甲烷萃取(3×10mL)。有机相合并，饱和食盐水洗涤后无水硫酸镁干燥。过滤浓缩，柱层析纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1:1)。所得黄色固体乙酸乙酯/异丙醚重结晶得5’。产率46.5％.mp：153-154℃,ESI-MS:m/z 537.5(M+1),559.5(M+23).C26H28N6O5S[536.18].
中间体5’(0.1025g)，20％的钯碳(0.021g,质量分数的20％)共置于圆底烧瓶中，加入甲醇10mL，抽真空氢气置换3次，保持反应体系氢气过量，室温下搅拌24小时。反应停止后，硅藻土过滤掉钯碳，滤液浓缩。乙酸乙酯/石油醚重结晶得终产物I-1.产率76.5％.mp：153-154℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.90(d,2H,J＝8.00Hz,PhH),7.58-7.56(m,4H,benzonitrile-H,PhH),7.25(s,1H,pyrimidine-H),6.48(d,1H,J＝8.00Hz,NH),4.45(s,2H,NH2),3.57(s,2H,benzyl-H),3.21(s,3H,CH3),2.78(d,2H,J＝12.00Hz,piperidine-H),`2.04(s,6H,2×CH3),1.96-1.94(m,3H,piperidine-H),1.80(d,2H,J＝12.00Hz,piperidine-H),1.47(dd,2H,J1＝12.00Hz,J2＝8.00Hz,piperidine-H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,ppm)δ:156.61(C2-pyrimidine),155.27(C1-benzonitrile),154.31,139.91,136.89,133.26(2×C,benzonitrile),132.52(2×C,benzonitrile),129.84(2×C,Ph),127.42(2×C,Ph),124.00,119.38,107.45,65.38,61.82,52.57,48.35,44.07(2×C,piperidine),31.17(2×C,piperidine),16.30(2×C,CH3).ESI-MS:m/z 507.5(M+1).C26H30N6O3S[506.21].
实施例2：甲基4--((4-(5-氨基-2-(4-氰基-2,6-二甲基苯酚)嘧啶-4-基胺)哌啶-1-基)甲基)苯甲酸(I-2)的制备
I-2的制备方法同I-1,所不同的是使用甲基4-(溴甲基)苯甲酸(1.20mmol)代替4-甲基磺酰基苄溴。产率70.2％.mp：196-197℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.95(d,2H,J＝8.00Hz,PhH),7.58(s,2H,benzonitrile-H),7.47(d,2H,J＝8.00Hz,PhH),7.26(s,1H,pyrimidine-H),6.48(d,1H,J＝8.00Hz,NH),4.45(s,2H,NH2),3.85(s,3H,CH3),3.53(s,2H,benzyl-H),2.77(d,2H,J＝12.00Hz,piperidine-H),2.04(s,6H,2×CH3),1.99(s,1H,piperidine-H),1.94(t,2H,J＝12.00Hz,piperidine-H),1.79(d,2H,J＝8.00Hz,piperidine-H),1.46(dd,2H,J1＝12.00Hz,J2＝8.00Hz,piperidine-H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,ppm)δ:166.63(C＝O),156.61(C2-pyrimidine),155.27(C1-benzonitrile),154.31,144.93,136.89,133.26(2×C,benzonitrile),132.52(2×C,benzonitrile),129.35(2×C,Ph),129.60(2×C,Ph),128.76,123.99,119.36,107.46,62.12,52.57,52.49(2×C,piperidine),48.41,31.17(2×C,piperidine),16.30(2×C,CH3).ESI-MS:m/z 487.6(M+1),509.5(M+23).C27H30N6O3[486.24].
实施例3：4-((4-(5-氨基--2-(4-氰基-2,6-二甲基苯酚)嘧啶-基胺)哌啶-1-基)甲基)苯甲酸(I-3)的制备
I-3的制备方法同I-1,所不同的是使用甲基4-(溴甲基)苯甲酰胺(1.20mmol)代替4-甲基磺酰基苄溴。产率69.8％.mp：150-151℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.94(s,1H,NH2),7.85(d,2H,J＝8.00Hz,PhH),7.58(s,2H,PhH),7.38(d,2H,J＝8.00Hz,PhH),7.37(s,1H,NH2),7.25(s,1H,pyrimidine-H),6.51(d,1H,J＝8.00Hz,NH),4.47(s,2H,NH2),3.49(s,3H,benzyl-H,piperidine-H),2.77(s,2H,piperidine-H),2.04(s,6H,2×CH3),1.90(s,2H,piperidine-H),1.79(d,2H,J＝8.00Hz,piperidine-H),1.44(s,2H,piperidine-H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,ppm)δ:168.26(C＝O),156.60,155.27,154.30,136.85,133.48(2×C),133.27(2×C),132.53(2×C),128.95,127.92(2×C),124.02,123.95,119.37,107.46,62.31,52.55(2×C),48.43,31.72(2×C),16.31(2×C).ESI-MS:m/z 472.5(M+1),494.5(M+23).C26H29N7O2[471.24].
实施例4：N4-(1-(4-(甲砜基)苄基)哌啶-4-基)-2-(2,4,6-三甲苯氧基)嘧啶-4,5-二胺(I-4)的制备
I-4的制备方法同I-1,所不同的是使用2,4,6-二甲基苯酚(0.308mmol)代替4-氰基-2,6-二甲基苯酚。产率：40.0％.mp：148-149℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.90(d,2H,J＝8.00Hz,PhH),7.59(s,2H,PhH),7.23(s,1H,pyrimidine-H),6.82(s,2H,PhH),6.34(d,1H,NH),4.35(s,2H,NH2),3.57(s,2H,benzyl-H),3.21(s,3H,CH3),2.77(d,2H,J＝8.00Hz,piperidine-H),2.21(s,3H,CH3),1.99(s,1H,piperidine-H),1.95(s,8H,piperidine-H,2×CH3),1.83(d,2H,J＝8.00Hz,piperidine-H),1.47(dd,2H,J1＝20.00Hz,J2＝12.00Hz,piperidine-H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,ppm)δ:157.46(C2-pyrimidine),154.43(C1-benzonitrile),149.02,145.55,139.89,137.33,133.31(2×C,benzonitrile),130.46(2×C,benzonitrile),129.81(2×C,Ph),129.03(2×C,Ph),127.41,123.34,61.85,52.62(2×C,piperidine),48.16,44.08(2×C,piperidine),31.80,20.80,16.30(2×C,CH3).ESI-MS:m/z 496.5(M+1),498.5(M+3).C26H33N5O3S[495.23].
实施例5：甲基4-((4-(5-氨基--2-(2,4,6-三甲苯氧基)嘧啶-4-基胺)哌啶-1基)甲基)苯甲酸(I-5)的制备
I-5的制备方法同I-2,所不同的是使用2,4,6-二甲基苯酚(0.308mmol)代替4-氰基-2,6-二甲基苯酚。产率：67.1％.mp：223-224℃,1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.94(d,2H,J＝8.00Hz,PhH),7.46(d,2H,J＝8.00Hz,PhH),7.24(s,1H,pyrimidine-H),6.82(s,2H,PhH),6.34(d,1H,J＝8.00Hz,NH),4.34(s,2H,NH2),3.85(s,3H,CH3),3.58(s,2H,benzyl-H),3.53(s,1H,piperidine-H),2.76(d,2H,J＝12.00Hz,piperidine-H),2.12(s,3H,CH3),1.95(s,8H,piperidine-H,2×CH3),1.83(d,2H,J＝8.00Hz,piperidine-H),1.46(dd,2H,J1＝12.00Hz,J2＝8.00Hz,piperidine-H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,ppm)δ:166.63(C＝O),157.47(C2-pyrimidine),154.43(C1-benzonitrile),149.04,144.99,137.35,133.29,130.46(2×C),129.59(2×C),129.32(2×C),129.02(2×C),128.75,123.33,65.37,62.13,52.61,52.49,48.22,31.83(2×C,piperidine),20.78,16.60(2×C,CH3).ESI-MS:m/z 476.4(M+1).C27H33N5O3[475.26].
实施例6：甲基4-((4-(5-氨基--2-(2,4,6-三甲苯氧基)嘧啶-4-基胺)哌啶-1基)甲基)苯甲酰胺(I-6)的制备
I-6的制备方法同I-3,所不同的是使用2,4,6-二甲基苯酚(0.308mmol)代替4-氰基-2,6-二甲基苯酚。产率：70.1％.mp：170-171℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:7.94(s,1H,NH2),7.85(d,2H,J＝8.00Hz,PhH),7.38(d,2H,J＝8.00Hz,PhH),7.32(s,1H,NH2),7.23(s,1H,pyrimidine-H),6.82(s,2H,PhH),6.37(d,1H,J＝8.00Hz,NH),4.36(s,2H,NH2),3.58-3.50(b,3H,benzyl-H,piperidine-H),2.76(s,2H,piperidine-H),2.21(s,3H,CH3),1.95(s,8H,2×CH3,piperidine-H),1.82(d,2H,J＝8.00Hz,piperidine-H),1.44(d,2H,J＝12.00Hz,piperidine-H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,ppm)δ:168.25(C＝O),157.45(C2-pyrimidine),154.42,149.04,137.30,133.51,133.30,130.46(2×C),129.02(2×C),128.93(2×C),127.91(2×C),123.36,62.14(CH2),52.57(2×C,piperidine),48.23(CH,piperidine),31.17(2×C,piperidine),20.80(CH3),16.76(2×C,CH3).ESI-MS:m/z 461.5(M+1).C26H32N6O2[460.26].
实施例7：2-(2,4,6-三甲苯氧基)-N4-(1-(吡啶-4-基甲基)哌啶-4-基)嘧啶-4,5-二胺(I-7)的制备
I-7的制备方法同I-4,所不同的是使用3-(溴甲基)吡啶盐酸盐(1.20mmol)代替4-甲基磺酰基苄溴。产率：70.1％.mp：159-160℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:8.52(d,2H,J＝4.00Hz,pyridine-H),7.32(d,2H,J＝4.00Hz,pyridine-H),7.24(s,1H,pyrimidine-H),6.82(s,2H,Ph-H),6.35(d,1H,J＝8.00Hz,NH),4.45(s,2H,NH2),3.60(s,1H,piperidine-H),3.49(s,2H,benzyl-H),2.76(d,2H,J＝12.00Hz,piperidine-H),2.51(s,3H,CH3),1.98-1.95(b,8H,2×CH3,piperidine-H),1.83(d,2H,J＝12.00Hz,piperidine-H),1.48(dd,2H,J1＝24.00Hz,J2＝12.00Hz,piperidine-H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,ppm)δ:157.46(C2-pyrimidine),154.43,149.99(2×C),149.03,148.21,137.34,133.30,130.46(2×C),129.03(3×C),124.12(2×C),123.34,61.26,52.63(2×C,piperidine-C),48.16,31.80(piperidine-C),20.79(CH3),16.30(2×C,CH3).ESI-MS:m/z 419.5(M+1).C24H30N6O[418.25].
实施例8：(E)-4-(4-(1-(4-(5-羟苯基-3-戊烯基-1-炔基)苄基)哌啶-4-基胺)-5-氨基嘧啶-2-基氧基)-3,5-二甲基苯甲腈(I-8)的制备
中间体5’的制备方法如上所述,所不同的是使用3-(溴甲基)碘苯。中间体5’(0.1g,0.171mmol)，双(三苯基膦)二氯化钯(0.0072g,0.0102mmol)，碘化亚铜(0.0039g,0.020mmol)，共称于圆底烧瓶中，加入乙腈10mL后依次加入2-戊烯-4-炔-1-醇(0.0168g,0.205mmol,17.6μL)和三乙胺(24μL,0.171mmol)，氮气置换三次，65℃反应10小时。反应结束后，冷却至室温，减压蒸除溶剂，乙酸乙酯萃取(3×10mL)，有机相合并无水硫酸镁干燥，过滤浓缩。得到的粗品置于圆底烧瓶中，加入四氢呋喃3mL和乙醇6mL，搅拌下加入二氯化锡二水化物，氮气置换三次，70℃反应6小时。反应结束后，减压蒸除溶剂，甲醇复溶后加入碳酸氢钠，过滤，滤液柱层析纯化，乙酸乙酯/石油醚重结晶得终产物I-8.产率：23.1％.mp：152-154℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:11.20(s,1H,NH),8.35-8.24(br,1H,OH),7.69-7.63(m,4H,J＝4.00Hz,benzyl-H),7.56(s,1H,pyrimidine-H),7.52-7.48(m,2H,Ph-H),6.40(d,1H,J＝16.00Hz,-CH＝CH-),5.98(d,1H,J＝16.00Hz,-CH＝CH-),4.31(d,2H,J＝16.00Hz,NH2),4.08(s,2H,CH2-O),3.59(s,2H,CH2-N),3.27(s,2H,piperidine-H),3.07(s,1H,piperidine-H),2.76(s,2H,piperidine-H),2.09(s,6H,2×CH3),1.95-1.80(m,2H,piperidine-H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,ppm)δ:160.48(C2-pyrimidine),155.89,153.66,146.29,133.04(2×C),133.00(2×C),132.92,132.36(2×C),132.06(2×C),131.84,130.28,124.28,119.04,108.69,107.89,89.88,88.98,61.32(CH2),58.50(CH2),50.32(piperidine-C),47.61(piperidine-C),46.92(piperidine-C),27.90(2×C,piperidine-C),16.13(2×C,CH3).ESI-MS:m/z 509.4(M+1).C30H32N6O2[508.26].
实施例9：抗HIV活性实验(MT-4细胞模型)
具体实验方法参见①Pauwels R,et al.J.Virol.Methods.1988,20,309.②Pannecouque C,etal.Nat Protocols 2008,3,427.
术语解释：
MT-4细胞：人急性淋巴母细胞白血病细胞；
MTT分析法：MTT即为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。
DMSO：二甲基亚砜。
Nevirapine：抗艾滋病上市药物奈韦拉平。
Efavirenz：抗艾滋病上市药物依法韦仑。
Delavirdine：抗艾滋病上市药物地拉韦啶。
Etravirine：抗艾滋病上市药物依曲伟林。
测试原理
由于HIV感染的MT-4细胞在一定时间内(5-7天)会发生病变，因此向HIV感染的MT-4细胞悬浊液中加入适当浓度的待检测化合物溶液，经过一段时间(5-7天)的培养后，用MTT分析法测定MT-4细胞活力，得到保护50％细胞免于细胞病变的药物浓度(EC50)即可得出目标化合物的抗HIV的活性。同时得到目标化合物使50％未感染HIV的细胞发生病变的浓度(CC50)，计算出选择系数(selectivity index，SI＝CC50/EC50)。
MTT分析法原理：MTT即溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑氮,可与活的细胞内琥珀酸脱氢酶相结合，而不与死亡细胞发生反应。目前MTT法是一种快捷反映细胞活力的酶分析方法。
测试材料和方法
(1)HIV-1(IIIB)、HIV-2(ROD)毒株、HIV-1双突变(K103N/Y181C)耐药株RES056：由比利时Leuven大学Rega研究院微生物与免疫学研究所提供。
(2)MT-4细胞：由比利时Leuven大学Rega研究院微生物与免疫学研究所提供。
(3)MTT：购自美国Sigma公司。
(4)样品处理：样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，并用双蒸水作5倍稀释，各5个稀释度。
(5)阳性对照药：Nevirapine(NVP)、ETV、Efavirenz(EFV)、Delavirdine(DLV)。
(6)测试方法：样品稀释后加入到HIV感染MT-4细胞悬浊液中，经过一段时间后用MTT比色法测定细胞活力，于酶标仪中，在590nm下记录吸光度(A)值，计算出EC50、CC50以及SI。
(7)MTT染色法：加入样品培养一段时间后，再向每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，继续培养若干小时，弃染色液，并向每孔加入150μLDMSO，充分混合，于酶标仪中，在590nm下记录吸光度。
具体操作如下：将化合物用DMSO或水溶解后用磷酸盐缓冲液稀释，将3×105MT-4细胞与100μL不同浓度的化合物溶液在37℃共同预孵育1h。然后向该混合物中加入100μL适当浓度的病毒稀释液，将细胞于37℃孵育1h。洗涤三次后，将细胞再次分别悬浮于含有或不含化合物的培养基质中。接着将细胞在5％CO2环境中，于37℃下再孵育7天，并于感染后的第三天用含有或不含化合物的培养基质补充原培养液。每种培养条件都重复操作两次。对病毒的细胞病变作用每天都用反向光学显微镜监控。一般来讲，本实验中所用的病毒稀释液常常会在病毒感染后第五天发生细胞病变。药物抑制浓度以药物对病毒致细胞病变作用产生50％抑制作用而同时对细胞无直接毒性的浓度(EC50)表示。值得强调的是，当化合物水溶性较差，需要用DMSO才能溶解时，DMSO体积比浓度相对于水来讲，一般会低于10％(DMSO在MT-4细胞培养介质中最终浓度小于2％)。因为DMSO能影响测试化合物抗病毒活性，对含有相同浓度DMSO溶液的抗病毒活性对比空白实验也应该平行操作进行。另外，DMSO最终浓度(1/1000)远远低于影响HIV-1在MT-4细胞中复制所需浓度。
目标化合物的体外抗HIV-1(IIIB)及HIV-1临床常见双、单突变耐药株活性筛选数据由比利时Leuven大学Rega研究院微生物与免疫学研究所提供，所有的活性数据都经过至少两次独立、平行的实验测得，结果见表1，2，3。
表1化合物抗野生型HIV-1(IIIB)及双突变株(F227L/V106A,RES056)的细胞活性和毒性
a:半数有效浓度；b:野生型HIV-1毒株；c:双突变HIV-1毒株；d:半数致死浓度。
表2化合物抗多种单突变HIV-1病毒株(L100I,K103N,Y181C,Y188L,E138K)活性
a:同表1；e:化合物对野生型和突变型HIV-1抑制活性的降低倍数；f:单突变型HIV-1毒株。
表3化合物抗野生型HIV-1(IIIB)及多种单(L100I,K103N,Y181C,Y188L,E138K)或双(F227L/V106A,RES056)突变株的选择指数(SI)
c，d，e:同表1；g:治疗指数。
实施例10：抗逆转录酶活性测试实验
本实验采用色度法逆转录酶活性测定实验，所使用试剂盒Reverse Transcriptase Assay,colorimetric Version 13.0购自罗氏公司，阳性对照药物选用NVP，ETV。(参见①Hofman,A.D.&Banapour,B.&Levy,J.A.(1985)Virology 147,326–335.②Ukkonen,P.et al.(1988)Eur.J.Clin.Microbiol.&Infect.Dis.7,518–523.)
测试原理
色度法逆转录酶活性测定使用模板/引物聚合物poly(A)×oligo(dT)作为起始原料，并用地高辛和生物素标记的核苷酸代替用放射性同位素[3H]-或[32P]-标记的核苷酸，这些是此方法的优势之处。所合成出的DNA是测定逆转录酶活性的重要参数，检测和定量DNA使用了以下三明治式的ELISA测定方法：生物素标记的DNA能够与包被了抗生物素链霉菌素的微版模块(MP)的表面进行结合。在接下来的一步中，聚合了过氧化物酶的地高辛抗体需要结合到地高辛标记的DNA上。最终，加入过氧化物酶的底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，使它们在酶的催化作用下分解，产生带有明显颜色的产物。通过酶标仪测定载有样品的微板吸光度，此吸光度值与逆转录酶的活性呈现直接的关联，通过公式计算可得到化合物对逆转录酶的抑制浓度。
测试方法
(1)首先配置各种工作溶液，并将样品用适量DMSO溶解，并用裂解缓冲液稀释成5个浓度梯度。在各个不同的反应管中，将4–6ng重组HIV-1-RT用裂解缓冲液(20μL/well)稀释。同时，准备只有裂解缓冲液而没有RT的阴性对照组。然后每个反应罐加入20μl含有不同浓度所测试样品的缓冲溶液以及20μL反应物混合液，在37摄氏度下孵育一个小时。
(2)准备足够的微版模块，按照方向牢固地安装在框架内。将孵育好的样品(60μL)转移到微板的孔中，用薄膜覆盖好后第二次37摄氏度孵育一小时。
将溶液移除，每孔用洗液仔细地冲洗5遍，每遍用250μL，保留30秒。每孔加入200μL抗地高辛-过氧化物酶聚合物，将微板用薄膜覆盖好后第三次在37摄氏度下孵育一小时。
(3)将溶液移除，每孔用洗液仔细地冲洗5遍，每遍用250μL，保留30秒。每孔加入200μLABTS溶液，在15-25摄氏度下孵育，直到绿颜色出现并足够通过光度检测(一般为10-30分钟)。
(4)用酶标仪测定载有样品在波长405nm处的吸光度值，通过以下公式计算可得化合物对逆转录酶的抑制浓度。
抑制率％＝(阳性对照荧光强度-样品荧光强度)/(阳性对照荧光强度-背景荧光强度)×100％进行线性回归，将抑制率带入线性方程，求得的浓度C既是IC50，单位是(μg/mL)，再根据化合物分子量转化为μM，此实验选取了细胞活性突出的一个代表性化合物，以及阳性对照药奈韦拉平(NVP)和依曲韦林(ETV)，实验结果见表4。
表4代表化合物对HIV-1逆转录酶抑制活性
本发明对合成的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物进行了体外抗HIV病毒活性试验。结果表明几乎所有化合物均具有了突出的抗野生型HIV-1活性，且大部分化合物对多种HIV-1突变株(L100I、K103N、Y181C、Y188L、E138K)保持了纳摩尔的抑制活性，显著优于上市药物NVP和DLV，并与EFV处于同一水平，特别是针对个别严重的单突变病毒如K103N和Y181C本发明提供的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物较以上上市药物具有显著进步性，如化合物I-1、I-4、I-6、对Y181C突变株的抑制活性较野生株下降在2-3倍之间，好于第二代NNRTI ETV，其下降倍数为5.3。再如对于突变病毒株E138K抑制作用，化合物I-4、I-6、I-7也具有显著的优势，特别是I-4和I-6的抑制活性较野生株仅分别下降了1.7和1.8倍，相较之下ETV抑制活性则下降了4.4倍。而对于临床上最严重的双突变病毒株F227/V106A和K103N/Y181C，N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物也具有明显的抑制作用，活性在亚微摩尔到纳摩尔之间，普遍优于上市药物NVP、DLV和EFV。此外，本发明提供的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物对细胞的毒性较上市药物大大降低，特别是相对ETV，所涉及化合物的CC50值提高了5.2-53.3倍。且化合物I-1、I-3、I-6的选择指数不论是对野生型还是多种单或双突变型病毒株都远好于所有阳性对照药物，具有显著的进步性。
在对代表性化合物进行的体外抑制HIV-1逆转录酶活性试验中，I-1的逆转录酶抑制活性好于对照药NVP和ETV。鉴于以上显著的进步性和突出的技术效果，本发明提供的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物具有较大的开发价值，在此基础上进行新的结构修饰及深入研究有助于开发出新的抗HIV药物。

Claims (6)

1.N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物或其药学上可接受的盐、酯或前药，其特征在于，具有如下通式I所示的结构：
其中，
R为CH3、CN、卤素或E-氰基丙稀基；
X为-NH-、-O-或-S-；
n等于0或1；
Ar为苯基或吡啶基；所述的苯基可被邻间对单取代或多取代，取代基选自卤素、NO2、CN、NH2、NHCH3、OH、COOH、CH2OH、CONH2、COOCH3、COOCH2CH3、OCH3、OCH2CH3、SO2NH2、SO2CH3、C≡CCH2CH2OH或C≡C-CH＝CH-CH2-OH。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于为下列结构的化合物之一：
3.如权利要求1所述的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以5-硝基-2,4-二氯嘧啶(1)为起始原料，与1-叔丁氧羰基(Boc)-4-胺基哌啶在三乙胺的碱性条件下缩合得到中间体化合物2；与不同取代的苯酚，苯硫酚或苯胺经过亲核取代反应得中间体化合物3，用三氟乙酸脱去Boc保护基得到中间体化合物4，再与取代的苯基或苄基反应得到中间体化合物5,将化合物5的硝基还原成氨基或与含炔取代基相连后再还原得到终产物I；
合成路线如下：
试剂和条件:(i)1-Boc-4-氨基哌啶,三乙胺,四氢呋喃,0℃；(ii)2,4,6-三甲基苯酚或4-羟基-3,5-二甲基苯甲腈,碳酸钾,N,N-二甲基甲酰胺,60℃；(iii)三氟乙酸,二氯甲烷；(iv)取代的卤苄；(v)钯碳,氢气,乙醇；(vi)双三苯基磷二氯化钯,碘化亚铜,三乙胺,2-戊烯-4-炔-1-醇,二氯化锡二水合物；
其中，R为CH3或CN；Ar为苯基或吡啶基；所述的苯基对位被单取代，取代基为CONH2、COOCH3、SO2CH3、C≡C-CH＝CH-CH2-OH。
4.如权利要求2所述的N-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
以5-硝基-2,4-二氯嘧啶(1’)为起始原料，与1-叔丁氧羰基(Boc)-4-胺基哌啶在三乙胺的碱性条件下缩合得到中间体化合物2’；与不同三甲基苯酚或3,5-二甲基-4-羟基苯腈经过亲核取代反应得中间体化合物3’，用三氟乙酸脱去Boc保护基得到中间体化合物4’，再与取代的苯基或苄基反应得到中间体化合物5’,将化合物5’的硝基还原成氨基或与含炔取代基相连后再还原得到终产物I；
合成路线如下：
试剂和条件:(i)1-Boc-4-氨基哌啶,三乙胺,四氢呋喃,0℃；(ii)2,4,6-三甲基苯酚或4-羟基-3,5-二甲基苯甲腈,碳酸钾,N,N-二甲基甲酰胺,60℃；(iii)三氟乙酸,二氯甲烷；(iv)取代的卤苄；(v)钯碳,氢气,乙醇；(vi)双三苯基磷二氯化钯,碘化亚铜,三乙胺,2-戊烯-4-炔-1-醇,二氯化锡二水合物；
R为CH3或CN；Ar为苯基或吡啶基；苯基对位被单取代，取代基为CONH2、COOCH3、SO2CH3、C≡C-CH＝CH-CH2-OH。
5.一种抗HIV药物组合物，其特征在于，包含权利要求1或2所述化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
6.如权利要求1或2所述化合物在制备抗HIV的药物中的应用。
CN201610305178.6A 2016-05-10 2016-05-10 一种n-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物及其制备方法与应用 Active CN105968096B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610305178.6A CN105968096B (zh) 2016-05-10 2016-05-10 一种n-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610305178.6A CN105968096B (zh) 2016-05-10 2016-05-10 一种n-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105968096A true CN105968096A (zh) 2016-09-28
CN105968096B CN105968096B (zh) 2018-12-28

Family

ID=56992181

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610305178.6A Active CN105968096B (zh) 2016-05-10 2016-05-10 一种n-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105968096B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102285969A (zh) * 2011-06-28 2011-12-21 山东大学 N-1-取代哌啶-4-芳胺类衍生物及其制备方法与应用
CN102887887A (zh) * 2012-11-08 2013-01-23 山东大学 2-(1-取代哌啶-4-氨基)-6-(取代苯胺/苯酚)吡啶衍生物及其制备方法与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102285969A (zh) * 2011-06-28 2011-12-21 山东大学 N-1-取代哌啶-4-芳胺类衍生物及其制备方法与应用
CN102887887A (zh) * 2012-11-08 2013-01-23 山东大学 2-(1-取代哌啶-4-氨基)-6-(取代苯胺/苯酚)吡啶衍生物及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XUWANG CHEN ET AL.: "Design, synthesis, anti-HIV evaluation and molecular modeling of piperidine-linked amino-triazine derivatives as potent non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105968096B (zh) 2018-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104530078B (zh) 一种噻吩并[3,2‑d]嘧啶衍生物及其制备方法与应用
Vicini et al. Anti-HIV evaluation of benzo [d] isothiazole hydrazones
EP2351731B1 (en) A group of amino substituted benzoyl derivatives and their preparation and their use
Zeng et al. Hybrid diarylbenzopyrimidine non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors as promising new leads for improved anti-HIV-1 chemotherapy
CS413791A3 (en) Pyrrole-amidine antitumor preparations
Liu et al. Design, synthesis and anti-HIV evaluation of novel diarylnicotinamide derivatives (DANAs) targeting the entrance channel of the NNRTI binding pocket through structure-guided molecular hybridization
CN105175414B (zh) 咪唑[4,5‑b]吡啶巯乙酰胺类衍生物及其制备方法与应用
CN112028836B (zh) 一种含有六元氮杂环的二芳基嘧啶类衍生物及其制备方法与应用
CN106831605B (zh) 一种取代二芳基嘧啶类衍生物及其制备方法与应用
CN108218890A (zh) 一种五元非芳环并嘧啶类hiv-1逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用
Ferro et al. Searching for novel N1-substituted benzimidazol-2-ones as non-nucleoside HIV-1 RT inhibitors
CN104876860B (zh) 一种二芳基吡啶衍生物及其制备方法与应用
CN111217833B (zh) 噻吩并[2,3-d]嘧啶类HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用
CN108299255A (zh) 组蛋白去乙酰化酶8选择性抑制剂及其制备方法和应用
WO2011041655A1 (en) Quinazolin-4-amine derivatives; and methods of use
CN109369623B (zh) 一种取代1,2,3三氮唑类二芳基嘧啶衍生物及其制备方法与应用
CN103483272B (zh) 间二芳烃-多取代嘧啶类衍生物及其制备方法与应用
CN104016927B (zh) 嘧啶巯乙酰胺类衍生物及其制备方法与应用
CN105968096A (zh) 一种n-取代哌啶胺-4-嘧啶类衍生物及其制备方法与应用
CN108409734A (zh) 吡啶并嘧啶类hiv-1逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用
CN108586482A (zh) 一种含三氮唑环的二芳基嘧啶类hiv-1抑制剂及其制备方法和应用
Wang et al. Synthesis and in vitro anti-HIV evaluation of a new series of 6-arylmethyl-substituted S-DABOs as potential non-nucleoside HIV-1 reverse transcriptase inhibitors
CN108218896A (zh) 一种噻唑并嘧啶类hiv-1逆转录酶抑制剂及其制备方法和应用
CN108440500B (zh) 一种喹唑啉类hiv-1抑制剂及其制备方法和应用
JP6923112B2 (ja) フィロウイルスの細胞侵入阻害活性を有するビアリールスルフォンアミド誘導体

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant