SE527639C2 - Alkylsubstituerade indolokinoxaliner - Google Patents

Description

527 639 2 De nya alkylsubstituerade indolokinoxalinema enligt föreliggande uppfinning är användbara som läkemedel och i synnerhet för förhindrande och/eller behandling av autoirnmuna sjukdomar, t ex fór förhindrande och/eller behandling av reumatoid artrit (RA) och multipel skleros (MS). l denna beskrivning innebär termen halogen klor, fluor eller brom.

Termen lägre alkyl innebär raka eller grenade alkylgrupper med 1 till 4 kolatomer, såsom metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sek-butyl, tert-butyl, företrädesvis metyl eller etyl.

Termen alkoxi innebär raka eller grenade alkoxigrupper med l till 4 kolatomer, såsom metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi , isobutoxi, sek-butoxi, tert-butoxi.

Termen cykloalkyl innebär CS till Cy-cykloalkylgrupper, såsom cyklopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl.

En lämplig grupp av ßreningar är föreningar med forrneln (I), där båda R2 är metyl grupper.

En annan lämplig grupp av föreningar år föreningar med fonneln (I), där R] är en halogengrupp och båda Rz är metylgrupper.

En föredragen grupp av föreningar är föreningar med formeln (I), där RI är en klor- eller fluorgrupp.

En annan föredragen grupp av ßreningar är föreningar med fonneln (I), där Y är NRSRG, särskilt när Rs och Ró är lika eller olika lägre alkylgrupper.

Ett mål för uppfinningen avser också föreningarna med formeln (I) för användning som läkemedel.

Ett annat mål för uppfinningen är användningen av föreningarna med formeln (I) för förhindrande och/eller behandling av autoirnmuna sjukdomar, särskilt för förhindrande och behandling av reumatoid artrit (RA) och multipel skleros (MS). 527 639 3 Uppfinningen avser också förfaranden för framställning av de nya alkylsubstituerade indolokinoxalinerna.

BAKGRUND - Under vissa betingelser, innefattande vid vissa sjukdomstillstånd, identifierar en individs immunsystem sina egna beståndsdelar som ”icke-själv” och initierar ett immunsvar mot ”sjålv-material", vid tidpunkter, vilket medför mer skada eller obehag från en inkräktande mikrob eller ett främmande material, och ger upphov till allvarlig sjukdom hos en individ.

Autoimmun sjukdom blir följden när en individs immunsystem angriper hans eller hennes egna organ eller vävnader, vilket ger upphov till ett kliniskt tillstånd associerat med ßrstörelsen av denna vävnad, såsom exemplifieras av sjukdomar, såsom reurnatoid artrit (RA), insulinberoende diabetes mellitus, förvärvat immunbristsyndrom (”AIDS”), hemolytiska anemier, reumatisk feber, Alzheimers sjukdom, astma, ateroskleros, inflammatorisk tarmsjukdom, ischemisk skada, Parkinsons sjukdom, myasthenia gravis, anemi, skleroderma, Addisons sjukdom; septisk chock, psoriasis, tyreoidit, glomerulonefrit, autoimmun hepatit, multipel skleros (MS), systemisk lupus erythematosus (SLE) osv.

Blockering, neutralisation eller inhibition av immunsvaret, motverkande av följderna av irnmunaktiviteten eller avlägsnande av orsaken därav i dessa fall är därför önskvärd.

Det antas att reumatoid artrit härrör från presentation av ett relevant antigen till en immunogenetiskt mottaglig värd. Antigen, vilka potentiellt kan initiera ett immunsvar, vilket leder till reumatoid artrit, kan vara endogena eller exogena Möjliga endogena antigen innefattar kollagen, mukopolysackarider och reumatoida faktorer. Exogena antigen innefattar t ex mykoplasma, mykobakterier, spiroketer och virus. Biprodukter (t ex prostaglandiner och syreradikal er) från immunreaktionen inflammerar ledvätska och utlöser destruktiva ledßrândringar (t ex kollagenas). Reumatoid artrit (innefattande förstörelse av ledvävnad) kännetecknas av att den är följden av ett i huvudsak eellfórrnedlat autoimmunsvar och verkar fiämst bero på. inverkan av T-celler (se Sinlia et al., Science 248:l38O (1990)).

Det föreligger ett brett spektrum av sjukdomssvåriglietsgrad, men många patienter genomgår ett förlopp med intermittenta återfall och förbättringar med ett totalt mönster med sakta 527 639 4 fortskridande ledförstörelse och deforrnitet. De kliniska symtomen kan innefatta symmetrisk polyartrit hos perifera leder med smärta, ömhet, svullnad och förlust av funktion hos drabbade leder, stelhet på morgnarna och förlust av brosk, erosion av benmaterial och subluxation av leder efter ihållande inflarnmation. Extraartikulära symtom innefattar reumatoida noduler, reumatoid vaskulit, pleuropulmonala inflammationer, sklerit, siccasyndrom, Feltys syndrom (splenomegali och neutropeni), osteoporos och viktßrlust (Katz (1985), Am. J. Med., 79:24 och Krane och Simon (1986), Advances in Rheumafology, Synderrnan (utg.) 70(2):263-284).

De kliniska symtomen leder till en hög grad av sjuklighet, vilket leder till ett stört dagligt liv för patienten. Trots avsevärda forskningsinsatser firms tyvärr ingen bot för RA.

Etablerade behandlingar av RA är utformade för att inhibera antingen slutliga gemensamma ~ inflarrirnationsvägar eller immunologiska förmedlare. Båda teknikerna är ospecifika och är därför förknippade med svåra biverkningar. Kortikosteroider har multipla effekter på immunsystemet och andra vävnader. Användningen därav kompliceras av mycket hög förekomst av muskuloskeletala, metaboliska, neurologiska biverkningar samt biverkningar i bindväv, liksom immunsuppression, vilken kan leda till livshotande infektioner. Av denna anledning undviker man vanligen kortikosteroider tills alla andra former av behandling har misslyckats. Se allmänt R. Million et al., ”Long-Term Study of Management of rheumatoid Arthritis”, Lancet l:8l2 (1984).

Cytotoxiska och antimetabola läkemedel, såsom metotrexat, azatioprin och cyklofosfamid, påverkar ospecifikt alla snabbt delande celler och är därßr förknippade med benmärgs- och mag-tarmtoxicitet och ökad förekomst av malignitet. Metotrexatbehandling av RA har dessutom rapporterats inducera leverskada och lungsjukdom, vilken kan vara fatal. Se J . A.

Engelbrecht et al., ”Methotrexate Pneurnonitis After Low-Dose Therapy for Rheumatoid Arthritis”, Arthritis and Rheumatism 26:l275 (1983) och G. W. Cannon et al., “Acute Lung Disease Associated With Low-Dose Pulse Methotrexate Therapy In Patients With Rheumatoid Arthritis", Arthritis and Rheumatism 2611269 (1983).

Flertalet icke-steroida anti-inflammatoriska läkemedel (NSAID) som för närvarande används är utformade för att ospecifikt inhibera prostaglandinsyntes. NSAID som ßr närvarande används modifierar eller minskar, men hejdar inte, det inflammatoriska svaret. 527 639 5 Acetylsalicylsyra förblir det NSAID som ofiast används. Toxiciteten hos acetylsalicylsyra antar många former, innefattande överkänslighetsreaktioner, dövhet, mag-tarm- och njurtoxicitet. Se allmänt Simon och Mills, "Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs”, N. Eng. J.

Med. 30221179 (1980).

Childföreningar och penicillamin har också använts vid behandling av RA. De är båda förknippade med hög förekomst av benmärgs-, njurtoxicitet och mukokutan toxicitet.

Guldbehandling är i synnerhet förknippad med nefropati, W. Katz et al., ”Proteinuria in Gold- Treated Rheumatoid Arthritis”, Arm. Int. Med. 1011176 (1984), Penicillarnin, vilken är diskutabelt effektiv är toxisk även vid relativt små doser. Se W. F. Kean et al., “The Toxicity Pattern Of D-Penicillamine Therapy”, Arthritis and Rheumatism 23:] 58 (1980). Dessa problem har lett till att man nästa fullständigt övergett dessa läkemedel vid RA-terapi.

Andra etablerade terapier är cyklosporin och anti-THF-alfa-antikroppar. Svår njurtoxicitet och ospecifik immunsuppression begränsar emellertid avsevärt användbarheten av cyklosporin.

Pga den allmänt utbredda rollen därav vid många cellulära funktioner kan inte anti-TNF- terapi vara en säker terapeutisk strategi för RA. Utveckling av lupusliknande sjukdom har observerats i några fall. Kliniska effektivitetsdata visar emellertid lovande resultat med anti- TNF-tekniken.

Aktuella terapier för RA är sålunda associerade med hög förekomst av allvarliga biverkningar. Även om vissa läkemedel kan erbjuda symtomatisk lättnad i många fall modifierar de dessutom inte nämnvärt fortskridandet av ledförstörelse. Vad som behövs är en effektiv terapeutisk teknik med lägre toxicitet, så att behandlingen tolereras bättre, och vilken är lärnpligare för behandling av RA.

Föreliggande uppfimiing avser en ny klass av anti-RA-läkemedel, nämligen föreningar, vilka ger upphov till en minskning av de kliniska symtomen på sjukdomen.

Multipel skleros (MS) är en sjukdom i centrala nervsystemet, vilken påverkar hjärnan och ryggmärgen. Den drabbar uppskattningsvis 2,5 miljoner människor över hela världen och är den huvudsakliga förvärvade neurologiska sjukdomen hos unga vuxna. Med förstörelse av 527 639 6 den skyddande myelinskidan avbryts nervirnpulser, vilket leder till ett antal neurologiska symtom. Vanliga symtom på MS innefattar trötthet, psykologiska och kognitiva förändringar, svaghet eller paralys av extremiteter, domning, synproblem, talsvårigheter, muskelspasticitet, balanssvårigheter när man går eller står, tarm- och blåsdysfimktion samt sexuell dysfunktion.

Ca hälften av människorna med denna sjukdom har återkommande-förbättrade MS, varvid det föreligger oförutsägbara attacker, varvid de kliniska symtomen förvärras (exacerbation), vilka åtskilj s av perioder med förbättring, varvid symtomen stabiliseras eller minskar. Den andra halvan har kronisk fortskridande MS utan perioder med förbättring.

Det finns för närvarande ingen bot för MS: Många medicineringar finns tillgängliga för att lindra symtom vid fortskridande MS. Kortikosteroider används t ex för att minska inflammation i nerwävnad och förkortar varaktigheten av uppflarnmande; muskelavslappande medel, såsom tizanidin (Zanaflex) och baklofen (Lioresal) är orala behandlingar för muskelspasticitet; antidepressiv medicinering fluoxetin (Prozac); det antivirala läkernedlet amantadin (Symrnetrel) eller en medicinering för narkolepsi benämnd modafinil (Provigíl) används ßr att minska trötthet.

Ett fåtal andra läkemedel finns tillgängliga för MS, vilka inte direkt står i relation till symtomavklarande utan kan verka genom att ändra sjukdomens förlopp. Dessa läkemedel innefattar beta-interferoner (Betaferon, Avonex, Rebif) och glatirameracetat (Copaxone).

Dessa läkemedel kan ha inverkan på fi-ekvensen och svårighetsgraden hos återfall och antalet skador, såsom observeras på MRT-svepningar. Några av läkernedlen verkar ha en effekt genom att bromsa fortskridandet av invaliditet. US-A-4 617 319 beskriver ett förfarande för behandling av multipel skleros med användning av 1,4-dihydroxi-5,8-bis[[(2- hydroxietylamino)etyl]arnino]antralcinon, vilken också är känd med det generiska namnet rnitoxantron (Novantron).

Ingen av dessa befintli ga terapier har visat sig vara tillfredsställande pga begränsad effektivitet och/eller avsevärd toxicitet. Många av dessa terapier behöver dessutom administreras ofia, och några är mycket dyrbara Det föreligger sålunda klart ett behov av nya och effektiva ßrfaranden för behandling av MS. 527 639 Känd teknik Den närmast kända tekniken är föreningarna beskrivna i EP 23 8459 och motsvarande US- patent 4 990 510 samt användningsområdcna fór nänmda ñreningar beskrivna i EP 799038 och EP-A-1 261 344 och motsvarande US-A-6 248 742, US-A-6 465 466 och US-A- 6 333 327. Av föreningarna beskrivna i nämnda patentskrifier hart ex föreningen 2,3-dimetyl- 6-(N,N-diniety1arninoetyl)-6H-indolo(2,3-b)kinoxalin (B 220) visat sig vara en lovande förening för behandling av RA och MS vid gemensamma tester, nämligen den kollagenindncerade artrit- (CIA-)modellen resp. EAE-modellen. Föreningarna enligt föreliggande uppfinning har emellertid en oväntat förbättrad effekt mot RA och MS jämfört med B220.

De nya föreningarna enligt uppfinningen kan fiarnställas med följ ande allmänna förfaranden: Anjonerna av indolo[2,3-b]kjnoxa1iner med formeln (a) genererade genom behandling med en lämplig bas, såsom natriurriliydrid (N aH), kalium-t-butoxid eller kaliumhydroxid i ett tvåfassystem alkyleras med a-halogenerade alkylnitriler resp. ci-halogenerade alkylesnar, t ex kloracetonitril och metyl- resp. etylbromacetat, varvid 6-cyanometylindolo[2,3-b]kinoxaliner med formeln (b) 527 639 8 RZ N Rz (b) // N resp. indo1o(2,3-bflcinoxalin-ó-yl-ättiksyra (c; R7=H) eller dess salter (Lex. Na) och alkyl- indolo[2,3-b]kinoxalin-6-yl-acetater med formeln (c) R2 RZ o oR' vari R7 är metyl eller etyl, erhålles. De primära amidema, dvs. indolo[2,3-b]kinoxalin-6-yl-aeeta1:nider med formeln (II) R* R* o NH: bildas därefier genom sur hydrolys av föreningarna med formeln (b) i en stark syra, såsom svavelsyra. De sekundära amiderna med formeln (III) 527 639 N Ri- (Im oss Y fi-amställs genom kondensation av alkylestrarna med formeln (c) med ett överskott av den lämplig amínen med eller utan ett lösningsmedel.

Exempel I följande experiment genomfördes mäntningama medelst följande apparater och betingelser.

NMR-spektra registrerades i DMSO-d6-lösningar vid rumstemperatur och med användning av signalen från DMSO-d6(1H: ö = 2,50 ppm; BC: ö = 39,5) som intern standard, på en Bruket DPX 300 (300 MHz) spektrometer. ö-värden ges i ppm. Småltpunkter togs på en Büchi Melting Point B-545-apparat och är okorrigerade. Lösningsmedlen hade analytisk kvalitet och användes i befintligt skick.

Ett indo1o[2,3-b]kinoxalinderivat av formeln (a) (l ekv) sätts portionsvis till en uppslamning av NaH (1,1 ekv.) iNN-dimetylfonnarnid (DMA), NN-dimetylformamid (DMF) eller DMSO (5 ml/l mmol av förening a) vid 30°C under en inert atmosfär (Ar eller NZ) och rörs om under 30 min. Kloracetonitril (1,1 ekv.) tillsätts i en portion. Den resulterande reaktionsblandningen rörs om under 20 h vid rumstemperatur. Reaktionsblandningen hälldes slutligen ut på vatten, filtrerades, tvättades med vatten och torkades, vilket gav en förening med formeln (b). 527 639 10 När RI är klor i formeln (a) erhålls följande förening med formeln (b), nämligen produkten 9- klor-2,3-dimetyl-ó-cyanometyl-óH-indolo[2,3-b]kinoxalin.

Utbyte: 98%; smp: 286-288°C; lH-NMR ö: 8,36 (d, lH), 8,04 (s, lH), 7,99-9,94 (m, 2H), 7,86 (dd, IH), 5,75 (s, 2H), 2,53 (s, 6H).

De nya föreningarna enligt föreliggande uppfinning, vilka är primära amider med formeln (II) kan framställas enligt följande ßrfarande: En förening med formeln b löses i H2SO4 (konc., 10 mL/l g b) och hälls därefter ut på isvatten och rörs om under 5 min. Det sålunda bildade fasta ämnet uppsamlas och tvättas med vatten. Det torkade fasta ämnet behandlas med varm CHzClz, filtreras och tvättas med mer CH2Cl2 och torkas, vilket ger en förening med formeln (II).

Följande föreningar fiarnstålldes på detta sätt: FöreningA 2,3-dimefy1ind010[2,s-Inkinøxalm-s-yi-acerarnia (111=H, R2=cH3, x=co, Y=NH2) Utbyte: 72%; IH-NMR ö: 8,38 (d, lH), 8,16 (s, lH), 8,05 (s, lH), 7,70 (m, 2H), 7,59 (d, lH), 7,40 (t, IH), 7,16 (s, lH), 5,08 (s, 2H), 2,50 (s, 6H); 527 639 1 1 Förening B ø-kiof-zß.-dnne:y1ind010[2,s-b]kin<>xa1in-6-y1-aceta1nid (R1=C1, R2=CH3, X=C0, Y=NH2) Utbyte: 66%; lH-NMR ö: 8,29 (s, IH), 7,99 (s, IH), 7,90 (s, IH), 7,65-7,50 (m, 3H), 7,07 (bs, IH), 5,06 (s, 2H), 2,48 (s, 6H); Förening C 2,3-aimetyl-Q-fluofinamopß-b1kin0xa1in-6-y1-ace1mia (RI=F, n2=cn3, x=co, Y=NH2) Utbyte: 32%; smp: 316-319°C; IH-NMR ö: 8,11 (dd, IH), 8,01 (s, IH), 7,86 (s, IH), 7,70 (s, IH), 7,65-7,55 (m, 2H), 7,29 (s, IH), 5,05 (s, 2H), 2,50 (s, 6H).

De nya sekundära amiderna med formeln (III) enligt ßreliggande uppfinning kan fiarnställas med följande förfarande: Ett indolo[2,3-b]kinoxa1inderivat med formeln a (I ekv.) sätts portionsvis till en uppslamning av NaH (I,I ekv.) i DMA, DMF eller DMSO (5 ml/I mmol a) vid 30°C under en inert atmostïir (Ar eller Nz) och rörs om under 30 min. Alkylbromacetat (1,1 ekv.) tillsätts i en portion. Den resulterande reaktionsblandningen rörs om under 20 h vid rumstemperatur.

Reaktionsblandningen hålls sedan ut på vatten, filtreras, tvättas med vatten och torkas, vilket ger en produkt med formeln (c). 527 639 12 När metylbromacetat används som alkylbromaeetat och RI är 9-fluor och Rz är metyl erhålls följande produkt med formeln (c): MetyI-2,3-dimetyl-9-tluorindolo[2,3-b]kinoxalin-6-yl-acetat Utbyte: 74%; smp: 257-259°C; lH-NMR 5: 8,16 (dd, IH), 8,05 (s, IH), 7,91 (s, IH), 7,82 (dd, IH), 7,62 (dt, IH), 5,41 (s, 2H), 3,65 (s, 3H), 2,50 (s, 6H).

De sekundära amiderna med formeln (III) erhålls sedan medelst följande förfarande: En ßrening med formeln c sätts till den lämpliga aminen (10 mL/0,5 g e) under återloppskokning och återloppskokas slutligen under 4-15 min. Reaktionsblandningen får svalna till rumstemperatur, varefter vatten tillsätts. Det bildade fasta ämnet filtreras och tvättas med vatten, torkas och behandlas med varm etanol och filtreras och tvättas åter med etanol och torkas, vilket ger en produkt med formeln (lll).

Följande föreningar fi-amställdes på detta sätt: Förening D 2,3-dimetyl-ó-(MN-dimetylamínoetylamino-2-oxoetyl)-6H-indolo[2,3-b]kinoxalin (R1=H, 112=cH3,x=co,Y=NH-cH2-cH2-R3; R3=NR5R6; R5=R6=c1¶3) Utbyte: 63%; lH-NMR ö: 8,33 (d, IH), 8,27 (t, IH), 8,02 (s, IH), 7,85 (s, IH), 7,70 (t, IH), 7,58 (d, IH), 7,39 (t, IH), 5,09 (s, 2H), 3,17 (q, 2H), 2,49 (s, 6H), 2,32 (t, 2H), 2,14 (s, 6H); Förening E 9-kIor-2,3-dimetyl-6-(1V,N-dimetylaminoetylamino-2-oxoetyl)-6H-indolo[2,3-b]kinoxalin (R1=c1, n2=cn3, x=co, Y=NH-cH2-cH2-R3; R3=NR5R6; R5=R6=cH3) Utbyte; 58%; IH-Nrtan s; 8,29 (a, 1H), 8,23 (t, in), 7,98 (s, 1H), 7,82 (s, in), 7,71 (da, 1H), 7,61 (d, IH), 5,09 (S, 2H), 3,16 (q, 2H), 2,47 (s, 6H), 2,28 (t. 2H), 2,12 (s, 6H); 527 639 13 Förening F 9-kIor-2,3-dímetyl-ó-(anlinoetylarnino-Z-oxoetyD-ÖH-indolo[2,3-b]kínoxalin (R1=Cl, R2=cH3, x=co, Y=NH-cH2-cH2-NH2) Utbyte: 71%; lH-NMR ö: 8,32 (d, IH), 8,27 (t, IH), 8,01 (s, IH), 7,85 (s, IH), 7,73 (dd, IH), 7,66 (d, IH), 5,11 (s, IH), 3,17 (s, 2H), 3,07 (q, 2H), 2,57 (t, 2H), 2,49 (s, 6H); Förening G 2,3-dimety1-6-(JV',N-dimetylaminoetyIænino-Z-oxoetyh-Q-fluor-6H-indolo[2,3 -b]kinoxa1in (R1=1=,R2=c113, x=co, Y=NH-cH2-c1¶2-R3, R3=NR5R6, R5=R6=cH3) _ Utbyte; 51%; smp; 241-242°c; ln-Nm 8; 8,10-8,00 (m, sH), 1,84 (s, 111), 759-153 (m, 2H), 5,09 (s, 2H), 3,19 (q, 2H), 2,94 (s, 111), 2,79 (s, 1H), 2,50 (s, 611), 2,31 (1, 2H), 2,14 (s, 6H); _ 2,3-dimetyl-ó-(aminoetylamino-2-oxoety1)-9-fluor-6H-indolo[2,3-b]kinoxa.lin (R1=F, R2=cH3, x=co, Y=NH-cH2-c112-NH2) Utbyte; 88%; smp; 269-271°c; IH-mm s; 8,26 (t, 1H), 8,13(<1d, 1H), 8,04 (s, m), 7,88 (s, 1H), 7,68-7,56 (m, 2H), 5,12 (s, 2H), 3,07 (q,2H),2,57(1, 2H), 2,50 (s, 611).

De nya sekundära amíndema med formeln (IV) o Rs flNflcHms-NI (m Rs vari R', Rz, R3, RS och Rs och n är som definieras i formeln (I) 527 639 14 kan också framställas med följande allmänna altemativa förfarande som följande exempel belyser: Motsvarande indolo[2,3-b]kinoxalinderivat (formel a) (1 ekv.) sattes portionsvis till en uppslamning av NaH (3 ekv.) i DMA eller DMSO (5 mL/l mmol formel a) vid 30°C under en inert atmosfär (Ar or NZ) och omrördes under 30 min. 2-klor-N-(2- dirnetylaminoetybacetamidhydroklorid (1,5 ekv.) (detta alkyleringsreagens framställdes som beskrivs av Sanchez et al., J. Heterocycl. Chem., 31: 297-304 (1994)) tillsattes i en portion.

Den resulterande reaktionsblandningen rördes om under 20 h vid 40°C och hälldes sedan ut på vatten, filtrerades, tvättades med vatten och torkades. Det fasta ämnet surgjordes genom behandling med saltsyra och filtrerades därefter. Filtratet basifierades genom behandling med natriurnhydroxid, och det bildade fasta ämnet isolerades genom filtrering, tvättades med vatten och torkades.

Förening J 2,3-dimetyl-ó-(MN-dimetylaniinoetylamino-2-oxoetyl)-9-fluor-6H-indolo[2,3-b]kinoxalin Utbyte: 89%; smp: 242-243°C.

Den nya karboxylsyran med fom1eln (V) RZ OH vari RI and Rz är som definieras i formeln (I) kan framställas enligt följande förfarande: 527 639 15 Allmänt förfarande Det lämpliga indolo[2,3-b]kinoxalinderivatet med formeln (a) (I ekv.) sattes portionsvis till en uppslamning av NaH (1,1 ekv.) i DMA eller DMSO (5 mIJl mmol a) vid 30°C under en inert atmosfär (Ar eller NZ) och rördes om under 30 minuter, varefter natriumlcloracetat (1,1 ekv.) tillsattes i en portion. Den resulterande reaktionsblandningen rördes om under 20 h vid nmrstemperatur och hälldes slutligen ut på vatten, surgjordes med HCI, filtrerades, tvättades med vatten, torkades och omkristalliserades (DMF).

Förening K 2,3-dirnetyl-9-klorindolo[2,3-flkinoxalin-ó-ylättiksyra Utbyte: 0,77 g (45%); lH-NMR 8 13,29 (bs, IH), 8,34 (s, IH), 8,03 (s, IH), 7,89 (s, IH), 7,83-7,75 (m, 2H), 5,26 (s, 2H), 2,50 (s, 6H); smp: 331-332°C.

Den nya karboxylsyran med formeln (IV), vari RI och RZ är som definieras i formeln (I), kan också framställas med det allmänna alternativa förfarandet som följande exempel belyser: Metyl-2,3-dirnetyl-9-fluor-indolo[2,3-b]kinoxalin-6-ylacetat (1,65 g) omrördes i etanol (30 mL) med vattenlösning av NaOH (5%; 30 mL) under 24 h. Reaktionsblandningen surgjordes med vattenlösning av HCI (I M). Det sålunda bildade fasta ämnet filtrerades, tvättades med vatten och torkades.

Förening L 2,3-dimetyl-9-fluorindolo[2,3 -lflkinoxalin-ó-yl-ättiksyra Utbyte:1,54 g (97%); lH-NMR ö: 14-13 (bs, IH), 8,06 (dd, llD, 7,93 (s, IH), 7,80 (s, IH), 7,75 (dd, IH), 7,56 (m, IH), 5,21 (s, 2H), 2,43 (s, 6H); smp: 317-3l8°C.

Föreningarna enligt föreliggande uppfinning testades enligt följ ande modeller för utvärdering av effekten mot reumatoid artrit och mot multipel skleros.

Kollageninducerad artrit (CIA) i möss används i stor utsträckning som en experimentell modell fór reumatoid artrit (RA) i människor. CIA törrnedlas av autoantíkroppar, vilka binder 527 639 16 till en särskild region av typ II-kollagen, såsom CB11 (CNBr-spjälkat fi-agment av typ II- kollagen): Antikroppsiörrnedlad CIA kan induceras av iv injektion av en kombination av 4 olika monoklonala antikroppar (Arthrogen-CIA® mAb) genererade av Arthrogen-CIA® mus B- hybridomcellinjer.

Tre av mAb känner igen autoantigena epitoper ihopsatta i ett 84 aminosyror långt restfragrnent, LyC2 (det minsta artritogena fragmentet av typ H-kollagen) av CBI 1, och den fjärde mAb reagerar med LyCl (Fig. 1). Framför allt känner alla 4 mAb igen de bevarade epitoperna, vilka delas av olika sorter av typ II-kollagen och korsreagerar med homologt och heterologt typ H-kollagen.

En uppsättning av 4 monoklonala antikroppar används. Dessa artritogena mAb separat eller i kombination med bakteriell LPS kan inducera svår artrit inom dygn istället för veckor (klassisk CIA-modell).

'Pyp II-kollagen CBS C312 CB? 1 CBS CBI O CSS 689.7 » »rf 1 n 1 i 1 41 124 4oa ss: ass 101.'- Lyç1 LyC2_ LyCS (1341390) (SSH-B 1 å) (875-402) ca: 1 - Q :i Pio A: De Fig. l Lokalisering av artritogena epitoper på typ II-kollagen igenkänt av Arthrogen~CIA® artritogena mAb 527 639 17 LFördelar med den antikroppsinducerade artritmodellen 0 Artrit utvecklas hos möss inom 24-48 timmar efier en iv. injektion av artrítogena mAb separat eller efter en injektion av LPS efter en subartiitogen dos av mAb. I båda fallen består errrrr under miner 2-3 veeirer ener mer eeh leder rm errkyies. i 0 Aruit induceras inte bara i CIA-mottagliga DBA/l - och Bl 0.RIH-möss utan också i några CIA-resistenta möss, såsom Balb/c. 0 Denna modell är idealisk för undersökning av antiinflarmnatoriska terapeutiska medel.

Denna modell är idealisk for studium av inflanimatoriska förmedlare, såsom cytokiner, kemokiner och metalloproteiriaser och andra faktorer, såsom rollen hos bakterieflora och biproduktema därav vid utlösning och förvånande av artrit.

Jämförelse av autentisk CIA och mAb-LPS-inducerad artrit.

(A) En uppsättning av 4 monoklonala antikroppar mot typ II-kollagen (2 mg) injiceras intravenöst dag O följt av en intraperitoneal injektion av LPS (SO pg) dag 3. Artrit utvecklas dag 4 och når toppen därav dag 7-8. Den terapeutiska effekten av testföreningar bestäms dag 7. Osteoblastbildning och bennedbrytning blir mer framträdande dag 14 och 21 (ej visad).

(B) Autentisk kollageninducerad artrit.

. Kontroll Dexametliasone behandlad Enkel injektion (kontroll) Aktivering:- ifljektien (kontroll) Behandlar! teat- Dflëar mike: Artrítbedömning O N å» O) 00 O N Fig. 2 527 639 18 Uppmätriing av artrit. Tjocklek hos baktassen, vänster och höger hos varje djur (9 djur i varje grupp) mättes i mm vid studie dag 0 (baslinje), 7, 9 och 11 med användning av en Mitutoyo Electronic Digital Caliper. Tj ockleken hos baktassen i djur efter administrering av Förening H, Förening E och Dexamethasone (positiv kontroll) visade sig vara i hög grad signifikant lägre jämfört med vehikelkontroll (majsolj a). Dexarnethasone är ett kortison, vilket hämmar inflamrnation och normalt immunsvar och används systemiskt och lokalt för att behandla inflarrmatoriska störningar. Patienter behandlas av säkerhetsskäl med kortvariga förlopp med kortisoner för att föra inflarnrnationen under kontroll i fönstret mellan start av DMARD eller DMARD-kombination och den sannolika svarstiden.

Dag 0 Dag 7 Dag 9 Dag ll Majsolja 2,2 3,3 3,3 3,2 13-220 2,2 3,1 3,0 2,8 Fören. C 2,2 3,1 3,0 2,8 Fören. H 2,2 2,5 2,5 2,5 Fören. E 2,2 2,3 2,3 2,3 Dexamethasone 2,2 2,3 ' 2,3 2,3 3,4 ' f_- _- __ ï'_ % * s ___..i__. 3,2 / Ål? “Ü- Majsolja 3 f -n-B-zzo E ll/ så . o- Föreningc E 2,8 I ll* n t ' / ' FóremngH 2,6 f ~ - -o- Far-manga 24 // -"* - - - _ . --*---->---^ A-'Aïnexaj 2,2 ' . . .

Pig. 3 Das 0 osgv Dags Dag 11 Dagar i Anm. Kurvoma för förening E och Dexantethasone (Dexa) och kurvorna för B 220 resp. förening C överlappar varandra. 527 639 19 Fig. 3 Gruppmedelvärden (mm) av baktasstjocklek uppmätta genom hela den 11 dygn långa observationsperioden i mAb/LPS-inducerade artritiska möss efter en gång om dagen (dag 0-5) upprepad subkutan administrering av B-220-analoger. Dexamethasone (positiv kontroll) eller majsolja (negativ kontroll).

Studier med användning av en musmodell för MS, experimentell allergisk encefalomyelit (EAE) (Alvord, E.C. et al., Prog. Clin. Biol. Res. 146:l-8 (l984); Swanborg, R.H., Clin.

Immunol. Immunopathol. 77:4-13 (1995); Martin, R. och McFarland, l-LF., Crit. Rev. Clin.

Lab. Sciences 32: 121-182 (1995)), har varit användbar för att karakterisera immunsvaret vid en sjukdom liknande MS. EAE kan induceras i flera stammar av möss genom subkutan (s.c.) injektion av myelinproteiner, såsom myelingrundläggande protein (MBP) eller proteolipidproteiner (PLP) i närvaro av Freunds adjuvans. Adoptiva överßringsstudier vid EAE-modellen visade att CD4+ T-celler från möss immuniserade med MBP eller PLP kan övertöra sjukdom till naiva möss, vilket tyder på att EAE är en T-celltörmedlad sjukdom.

De presenterade resultaten genereras i EAE-modellen enligt följ ande: modellen består av en sensibiliscringsperiod, inducerad av den enkla subkutana (SC) injektionen av PLP emulgerad i fullständigt Freunds adjuvans (CFA) dag 0 av studien, följt av intraperitoneal kompletterande immunstimulering med Pertussistoxin och dag 0 och 48 timmar senare.

Testfóremålen admínistrerades med lx dagliga upprepade doseringssessioner genom hela 10 successiva behandlingsdygn (dag 0-9). Copaxone administrerades eniellertid vartannat dygn fiân dag 0 till dag 18, dvs 10 administreringar, jfi: Fig. 5. Alla djur (10 i varje grupp) undersöktes med avseende på tecken på eventuella neurologiska svar och symtom före EAE- induktion (dag 0) och därefter på daglig basis genom hela Zl-dygnsobservationsperioden.

EAE-reaktioner bedömdes och registrerades enligt en klassisk 0-5-skala i stigande svårighetsgrad (gradering 0, normal till gradering 5 döende och/eller död). 527 659 20 3,5 I 3 n I z.s /A/wq + MflJSOIJfl o -I- B-22D 20mglkg se + B-220 40mgIkg sc + B-220 60mgIkg sc NGÛÉIOGNÜOFÖF v-v-x-Pw-x-f-x-NN bflbbbbbßbßßflw ânâoàneuaflflflêâ 'UÜUGUUUÜ Fig. 4 Medelvärde av klinisk BAE-bedömning i gruppen observerat genom hela 21- dygnsobservationsperioden. -4- Majsolja, sc 3-5 + B-zzo eumg/kg, se -A- Copaxone 12,5mglkg, sc 3 -a- Fören. L 20 mglkg, se 2,5 -- Fören- G 20 mglkg, se 2 .. '1,5 94:20 å” 430 fr? å” å” eQ” Fig. 5 Medelvärde av klinisk BAE-bedömning i gruppen observerat genom hela 21- dygnsobservationsperioden.

Claims (12)

527 639 21 PATENTKRAV

1. l. Substituerad indololdnoxalin med formeln (I) N m X \ -< van RI år vâte eller representerar en eller flera lika eller olika substituenter i ställningarna 7 till 10 valda från gruppen halogen, lägre alkyl/alkoxi, hydroxi, trifluorrnetyl, triklormetyl, trifluormetoxi, R2 representerar lika eller olika C1-C4-alkylsubstituenter, X är CO eller CHZ, Y är oH, NH2, NH-(cHgn-Rß, vari 123 är lägre anryl, OH, NHZ, NHR4 euer NRSRÖ, vari R4, Rs och RÖ oberoende år lägre alkyl eller cykloalkyl och n år ett heltal från 2 till 4, med det förbehållet att när X är CH2, är Y OH eller Nl-I-(Cl-Ijn-OH, och farmakologiskt godtagbara salter därav.

2. Indolokinoxalin enligt patentkravet l, vari X år CO och Y år OH eller NH2 och RI är en halogenatom.

3. Indolokinoxalin enligt patentkravet 1 eller 2, van' RI är en klor- eller fluor-atom.

4. lndololdnoxalin enligt patentkravet 1, vari X är CO och Y år NH-CH2-CI-l2-R3, var: 123 är NHZ enar rucns),

5. lndolokinoxalin enligt något av patentlcraven 1-4, vari R2 är metyl i ställningarna 2 och 3. 527 639 I).

6. Förening med formeln (I) enligt något av patentkraven 1-5 för användning som ett läkemedel.

7. Farmaceutisk komposition som innehåller en förening med formeln (I) enligt något av patentkraven 1-5 tillsammans med valfria lösningsmedel, bärare och adjuvans.

8. Förening med formeln (I) enligt något av patentkraven l-6, för förhindrande och /eller behandling av autoimmuna sjukdomar.

9. Förening med formeln (I) enligt patentkravet 8, för förhindrande och /eller behandling av reumatoid artrit.

10. Förening med formeha (I) enligt patentkravet 8, för förhindrande och/ eller behandling av multipel skleros.

11. l 1. Förfarande för framställning av föreningar med den allmänna formeln (I), vari RI, R2, R3, R4, R5, RÖ, X och Y defiziieras som i patentlcravet 1, vari anjoner av en förening med formeln (a) NC) R* (a) rak-gyn H alkyleras med oc-halogenerade alkylnitriler resp. a-halogenerade alkylestrar, varvid 6-cyanometylindo1o[2,3- blldnoxaliner med formeln (b) 527 639 2.3 RZ N R” b) N// resp. indolo(2ß-bfldnoxalin-ö-yl-åttiksyra (c; R7=H) eller dess salter (t.ex. Na) och alkyl-indolo[2ß-blkinoxalin-ö-yl-acetater med formeln (c) RZ N R: O se oR' vari R7 år metyl eller etyl, erhålles, varefter föreningarna med formeln (b) ger de primära amidema, dvs. indolo[2,3- bßdnoxalin-G-yl-acetaxnider med formeln (II) R* R* N o NH: 527 659 24 genom sur hydrolys i en stark syr , såsom svavelsyra och föreningarna med formeln (c) ger sekundära amider med formeln (lll) RZ N Rz O Y genom kondensation av alkylestrarna med formeln (c) med ett överskott av den lämplig arninen med eller utan ett lösningsmedel.

12. Förfarande för framställning av föreningar med den allmärma formeln (IV) Rz Rz \ J R1_:_ / N N ° R* av) HN \(CH2)|\_N Re vari RI, R2, R3, RS och RÖ och n definieras på samma sätt som i patentkravet l, vari anjoner av en förening med formeln (a) reageras med ett alkyleringsreagens med formeln (VI) 527 639 25 H , N~(cH2)n-N\ Haf¶ Rß o (V1) vari Hal år en halogenatom, och den sålunda erhållna fasta substansen surgöres, filtreras och det resulterande ñltratet göres basiskt, vilket ger förening med formeln (IV).