KR20140070620A - 헤지호그 단백질 신호 전달경로를 조절하는 신규한 화합물, 이의 뚜렷한 형태, 및 적용 - Google Patents

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엘렌느 포레
헤르미네 로도
루씰 오흐
앵겔 쉔펠데르
모리지오 타데이
앙드레 망
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쌍뜨르 나시오날 드 라 르셰르쉬 시앙띠피끄
유니베르시떼 드 스트라스부르
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Abstract

본 발명은 화학식 1을 갖는 신규한 화합물과, 특히 헤지호그 단백질(hedgehog protein) 신호 전달경로의 과활성과 함께 연관되는 종양의 치료를 위한, 신경병성의(neurodegenerative) 질병의 치료를 위한, 지적 개발 (완전전뇌증)과 관련이 있는 질병의 치료를 위한, 줄기세포의 관찰(monitoring)을 위한, 뇌혈관 장애 및 심장 혈관의 장애를 치료하기 위한, 희돌기교세포를 포함하는 질병 및 뉴로신경섬유초세포(neurolemmocytes)를 포함하는 질병을 치료하기 위한, 인간 또는 동물의 줄기세포 개선 조절(modulating)을 위한 생체 외(in vitro)에의 적용을 위한, 및 당뇨병의 치료를 위한 그것의 약으로서의 용도와 관련성이 있다. 본 발명은 또한 최소 한개의 화학식 1을 갖는 화합물을 포함하는 약학적 조성물과 관련성이 있다. 본 발명은 또한 화학식 1을 갖는 화합물을 방사-마킹(radio-marking)하는 방법, 마크된 화합물(marked compound), 및 상기 화합물을 조사 도구(research tools)로서 사용하는 방법과 관련성이 있다. 마지막으로, 본 발명은 또한 Smo 수용체(Smoothened receptor)(Smoothened receptor, Smo) 결합 위치에서 리간드의 스크리닝(screening) 및/또는 동정하는 방법, Smo 수용체(Smoothened receptor)의 증진제 및 길항제를 동정하는 방법, 및 세포를 확인하는 방법과 관련성이 있다.

Description

헤지호그 단백질 신호 전달경로를 조절하는 신규한 화합물, 이의 뚜렷한 형태, 및 적용{Novel compounds modulating the hedgehog protein signalling pathway, marked forms thereof and applications}
본 발명은 화학식 1의 신규한 화합물과 관련이 있으며, 그것의 용도는 치료, 뚜렷이 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 과 활성과 관련되는 종양을 치료하기 위한, 신경병성의 유형(neurodegenerative type)의 장애를 치료하기 위한, 지적 개발(cerebral development) (완전전뇌증, holoprosencephaly)과 연결되는 질병의 치료를 위한, 줄기 세포의 제어를 위한, 희돌기교세포(oligodendrocytes) 및 슈반 세포(schwann cells)의 질병뿐 아니라, 뇌혈관 장애(cerebrovascular accident) 및 심장 혈관의 장애(cardiovascular accident)를 치료하기 위한 것이고, 당뇨병의 치료를 위한 것 일뿐 아니라, 인간 또는 동물의 줄기 세포의 개선을 조절(modulating)하기 위한 그것의 생체 외(in vitro)에의 적용을 위한 것이다. 본 발명은 또한 유효 성분으로서, 적어도 하나의 화학식 1의 화합물을 포함하는 약학적 조성물과 관련된다. 화학식 1의 화합물의 방사성표지화(radiolabeling) 방법, 표지된 화합물 및 이의 조사 도구(research tools)로서의 용도 또한 본 발명의 부분의 형태이다. 마지막으로, 본 발명은 또한 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 Smo 결합 위치의 리간드를 스크리닝(screening) 및/또는 동정(identifying)하는 방법, Smo 수용체(Smoothened receptor)의 증진제 및 길항제를 동정하는 방법 및 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 발현하는 종양 세포와 같은 세포를 동정하는 방법과 관련이 있다.
헤지호그 신호 분자 (Hh)는 수많은 조직의 형태 형성, 특히 세포 증식에서 뿐 아니라, 내배엽(endoderm) 및 배축(embryonic axis)의 형성, 뇌 및 모낭(hair follicles)의 발달에 핵심적인 역할을 하는 신호 전달경로인 헤지호그 단백질 신호 전달경로를 활성화시키는 분비 자가단백질분해성 단백질(secreted autoproteolytic protein)이고, 성인의 조직 유지 및 복구에 포함되는 것으로 간주된다(Ingham et al., Genes Dev.,2001, 15, 3059-3087; Marti et al., Trends Neurosci., 2002, 25, 89-96; Weschler et al., Annu. Rev. Neurosci., 2001, 24, 385-428).
헤지호그 단백질 및 초파리에서 처음으로 증명된 관련된, 형질 도입 경로는 척추동물 및 무척추동물에서 보존되었다(conserved in). Hh의 단일 동족체(single homolog)는 초파리에 존재하는 반면, 세 개의 Hh 동족체 : Sonic (Shh), Indian (Ihh) 및 Desert (Dhh)는 포유 동물에 존재한다. 이들의 세 개의 동족체들 중에서, Shh는 이의 성장 동안 확장된 발현 프로파일(profile) 때문에 가장 많은 연구를 받았다. 신경관의 복측화(ventralization)에 참여하는 Shh는 복측 정중선(ventral midline) (척수의 운동 뉴런, 도파민작동성의 또는 콜린성의 뉴런)을 따른 몇몇 신경세포 유형의 조기 표현형으로 명시하고, 및 복측 척수(ventral spinal cord)로부터 시작되는 희돌기교세포 전구물의 형성을 유도한다. 더욱이, Shh는 세로토닌 작동성의 전구물 및 독소 MPP에 의하여 유발되는 도파민작동성의 뉴런의 죽음을 예방하는 미래를 지향하는 GABAergic 및 도파민작동성의 뉴런의 생존을 유도한다. 마지막으로, 그것은 이른 출생 후의 소뇌에서 과립세포 프리커서(granule cell precursors)의 증식을 유도한다. 헤지호그 집단의 다른 멤버(members)에 있어서, 그것들은 골 조직(Ihh), 고환(testes) 및 말초 신경 (Dhh)의 발달에 독립적으로 참여한다. 더욱이, Shh와 함께 얻어진 결과들은 Dhh 및 Ihh에 또한 적용된다.
Shh는 C-말단의 단백질에 존재하는 효소 활성으로 인한 단백질 절단 동안 번역후변형(post-translational modification)의 일련을 겪는 전구물 형태로 합성된다. 이 자가단백질분해(autoproteolysis)는 활성 조각을 대표하는 C-말단 조각 (ShhC) 및 N-말단 조각 (ShhN)을 발생시킨다. 이러한 반응 도중에, ShhN의 C-말단 부분에 콜레스테롤 분자의 첨가가 관찰되며, 이는 세포막에 ShhN의 앵커리지(anchorage)를 촉진한다. 마지막으로, 아세틸전달효소는 N-말단 끝과 가까운 시스테인 잔기에 팔미트산염 분자의 첨가를 허용한다. 이러한 사건은 생물학적인 활성 Shh 단백질을 생산한다. 단백질의 분비물은 포유류에 존재하는, 두 가지 동형 단백질인 Disp 1 및 2의, 단백질 디스패치(Disp)에 의존한다(Heretsch et al., 2010, Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 : 6613-6624).
용해성이 있는 ShhN 조각은 이것의 활동을 두 개의 막관통단백질 : 패치(Patched, Ptc), 12 막관통영역과 함께 운반체 타입의 구조를 가짐, 및 Smo(Smoothened), 단백질 G로 연결된 수용체(Receptors coupled to proteins G, RCPG)의 상과(superfamily)의 멤버에 상응하는 7 막관통영역을 가짐, 을 포함하는 복합물을 통하여 전송한다. 포유류에서는, 패치의 두 번째 형태가 있다 : Ptc2.
그것의 리간드 Shh가 부재일 때, Ptc는 Smo를 억제한다. 퓨즈의 단백질 억제(SuFu) 및 단백질 PKA를 포함하는 꽤 많은 요소들을 포함하는 세포 내 캐스캐이드(intracellular cascade)가 그때 유도된다. SuFu는 Shh 신호 전달경로의 음성 조정 물질이며, 그것은 Gli 집단의 세 개의 전사 인자에 결합할 수 있고, 및 그들의 활동을 규제한다. 더욱이, Sufu의 삭제는 전달경로의 활동을 야기한다. Gli 집단의 전사 인자는 그 다음에 인산화되고, 유비퀴티닐레이티드(ubiquitinylated)되고, 그 다음에 단백질분해효소복합체에 의하여 그들의 음성 형태 (GliR)로 쪼개지고, GliR은 세포핵을 뚫고 들어가고, 전사가 비활성된다. Shh가 Ptc에 결합할 때, Smo에 후자의 작용인 억제는 Gli 전사 인자 (GliA) 및 ptc 및 gli1과 같은 타겟 유전자의 전사 활성의 활성 형태의 핵 내 이동과 함께 증가한다.
단백질 헤지호그 상호작용 단백질 (Hip)은 단백질 Ptc와 비교가능한 친화성과 함께 Shh에 결합할 수 있다(Traiffort et al., J. Neurochem., 2010, 113 : 576-590). Hip은 Ptc를 경유하는 신호 전달경로의 활동을 위하여 이용 가능한 리간드의 양을 감소시키는 Shh에의 결합 때문에 전달경로의 음성 조절기(modulators)로서 간주된다. 세포 표면 단백질의 집단에 속하는 Cdo 및 Boc는 면역 글로불린 항체(immunoglobulin) 및 유형 III의 파이브로넥틴 모티브(fibronectin motifs)를 소유한다. 이러한 단백질은 타겟 세포의 부근에 모르포겐의 양을 증가시키거나, 및 아마(possibly) Gli 단백질의 활성을 발생시켜, 리간드 Shh를 Ptc에 제출(presentation)하는 것을 촉진하는 것으로 Shh 신호 전달경로를 긍정적으로 규제한다(Heretsch et al., 2010, Bioorg. Med. Chem. Lett 18 : 6613-24 : Scales and de Sauvage, 2009, Trends Pharmacol. Sci. 30 : 303-312).
배자 발생(embryonic development)동안 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 조절 역할은 광범위하게 연구되어 왔다 : Hh는 증식 및 분화의 시공간적 조절과 함께, 정상조직의 유지 및 복구 과정과 함께 관련되어 왔으며, 따라서 적절한 세포 유형 및 혈관 신생(vascularization) 및 신경분포의 적절한 정도와 함께 그들의 알맞은 크기에 도달하기 위한 조직 발달을 허용한다. 그것은 뚜렷이 중추 신경계의 발달에 연류된다(Dessaud et al., 2008, Development, 135: 2489-530). Shh의 돌연변이와 함께 관찰된 완전전뇌증(holoprosencephaly)과 같은, 인간 태아에서의 이 신호 전달경로 결함의 극적 결과에 의하여 Hh 신호 기능의 중요한 역할이 증명되었다(Traiffort et al., J. Boil. Chem., 2004, 279 : 42889-42997).
더욱 최근에 Shh 전달경로가 성인의 신경 시스템의 아주 많은 부분에서 발현되는 분자의 아미노-말단 활성 형태인 성인 뇌에서 확인되어, 이 전달경로를 위한 새로운 역할이 제안되었다. 사실, 그것은 뚜렷이 신경성의 틈새(neurogenic niches)의 설립 및 유지에 참여하고, 및 성인 뇌에서 신경의(neural) 또는 신경교(glial)의 전구물의 증식을 규제한다(Traiffort et al., 2010, J. Neurochem., 113 : 576-590). Shh 신호 전달경로의 조절(modulating)은 따라서 신경병성의 질병을 위한 치료의 발전을 위한 도전을 나타낸다. 연구들은 이미 파긴슨병(Parkinson's disease)을 가진 쥐에서 행동장애의 감소(Tsuboi et al., 2002, Exp. Neurol. 173: 95-104) 또는 다발성 경화증을 가진 쥐 뉴런의 레미리니제이션(remyelinization)(Mastronardi et al., 2004, J. Immunol. 172 : 6418-26)으로부터 Shh 단백질 그 자신으로 인한 Shh 신호 전달경로의 활성화의 긍정적인 영향을 증명하였다. 더욱이, 그것은 성인 쥐의 신경생성 부분의 정도에서 신경전구(neural precursors)의 증식 증가를 허용하는 Smo 증진제에 의한 Shh 신호 전달경로의 활성화를 보였다(Machold et al., 2003, Neuron., 39 : 937-950). 그러나, Smo 증진제는 그 숫자에서 소수만 남아있으며 여전히 저조하게 특징지어져있다.
Shh 신호 전달경로의 기능장애는 또한 많은 암과 함께 관련되어 있다. 사실, 비활성 Ptc의 돌연변이는 골린 증후군(Gorlin syndrome) 또는 대뇌 기형(cerebral malformations) 및 두개 및 안면의(craniofacial)에 의하여 특징지어지는 상염색체 우성 질환, 하지만 특히, 다양한 종양, 더욱더 특히, 피부 정도에서의 기저세포암(basal cell carcinomas) 및 소뇌 정도에서의 수아세포종의 높은 발생율에 의한 기저세포모반증후군(basal cell nevus symdrome)과 관련되어 있다. 인간 유전자 Ptc 및 Smo의 조절(modulating)은 주로 수모세포종(30% of cases), 하지만 또한 기저세포함의 일부 산발형(독립적으로 40% 및 20% of cases for Ptc 및 Smo)인 중추 신경계의 일차 신경외배엽 종양에서 또한 관찰된다. 더욱이, Shh의 조절(modulating)은 또한 기저 세포암과 함께 관련된다. 종양의 다른 유형은 헤지호그 신호 전달경로의 결합과 함께 또한 관련이 있으며, 이러한 종양의 국한은 배자 발생(embryonic development) 동안 전달경로 요소의 발현 위치와 밀접하게 상관이 있다(Scales and de Sauvage, 2009, Trends in Pharmacol. Sci., 30 : 303-312). 우리는 아마 비제한적 예시로 언급하였다 : 유방암 및 Ptc의 조절(modulating)과 함께 관련되는 수막종, Gli의 조절(modulating)과 함께 관련되는 교아세포종, 뚜렷이 복부의 일차 암인 위장암 및 결장(colon), 전립선의 및 방광의 암, 섬유종 및 난소의 유피포낭, 횡문근육종(rhabdomyosarcomas), 소세포폐암, 편평 상피 세포 암종 세포(squamous cell oral carcinomas).
많은 생리학상의 및 병리학의 과정에서 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 중요한 역할 때문에, 단백질 Smoothened (Smo 1 및 Smo 2), Frizzled (Fz 1 to Fz 10), 패치(Ptc 1 및 Ptc 2), 단백질 디스패치(Disp 1 및 Disp 2) 또는 또한 단백질 Hip와 같은 이러한 전달경로의 요소는 이러한 전달경로의 조절(modulating)(활성화 또는 억제)이 가능한 새로운 분자의 개발을 위한 타겟을 나타내고, 따라서, 긍정적 또는 부정적인 개발[증식, 분화, 이동, 생존(세포소멸)] 및/또는 분화된 세포의 및 줄기 세포의 활성, 배아(embryo) 또는 성인에서 생체 외(in vitro) 및/또는 인비보(in vivo)를 규제한다.
몇몇 분자가 헤지호그 전달경로의 과활성과 함께 관련된 종양의 치료에 유용하다는 것이 증명되었다(Scales and de Sauvage, 2009, Trends in Pharmacol. Sci., 30 : 303-312). 몇몇 분자는 아마 따라서 신경 종양 조직(수아세포종, 일차 신경외배엽 종양, 교아세포종, 수막종 및 올리고덴드로글리오마스), 피부 종양(기저 세포암, 모낭상피종), 근육의 종양 및 골 조직(횡문근육종, 골육종, 흑색종) 및 다른 조직의 종양(신장, 방광, 전립선, 폐, 위, 췌장, 유방, 간)과 같은 다양한 종양의 치료에 사용될 수 있다.
이러한 분자는 또한 헤지호그 전달경로의 블로킹(blocking)을 요구하는 신경병성 유형의 질병(파킨슨질환, 헌팅턴 무도병, 알츠하이머질환, 다발성 경화증, 운동 뉴런증) 및 당뇨병과 같이 헤지호그 신호 전달경로의 블로킹이 아마 유리한 질병의 치료에 유용하다.
이러한 분자는 또한 형성(formation), 재생(regeneration), 복구(repair) 및/또는 신경 조직 [중추신경계 (뇌) 및 말초신경계 (감각, 운동, 교감신경세포)], 뼈, 연공, 고환, 간, 비장, 창자, 췌장, 신장, 스무스(smooth) 및 골격근, 심장, 폐, 피부 및 머리, 점막, 혈구 및 면역체계의 세포와 같은 조직의 활성 증가를 유도하기 위한 수많은 급성의(acute), 아급성의(subacute) 또는 만성적인 유전학의 또는 후천적 장애들의 - 헤지호그 전달경로의 규제완화와 함께 연결되는 조직 기능장애를 포함하는 - 의학 또는 외과 치료(성형 또는 재건 수술, 조직의 또는 장기의 접목묘(grafts))에 유용하다. 이러한 질병들의 비제한적인 예시들로서, 우리는 아마 뚜렷이 신경장애 및 호흡부전관리(neuromuscular diseases), 당뇨병, 독두병, 화상, 궤양(피부 및 점막) 및 정자 형성의 장애를 언급하였다.
헤지호그 전달경로의 활성을 조절(modulating) 가능한 다양한 분자들이 확인되었다.
첫째로, 헤지호그 단백질 및 유래된 폴리펩타이드(derived polypeptides) (조각, 변종 등.), 헤지호그 단백질의 뚜렷이 증진제 및 길항제(International Application PCT WO 01/98344 in the name of BIOGEN); 그들의 크기 때문에, 이러한 단백질 및 유래된 폴리펩타이드는 혈액 뇌관문을 통과하지 못하고, 따라서 뚜렷이 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 과활성과 함께 연결되는 뇌 종양을 치료하기 위하여 조직적으로 투여될 수 없다. 더욱이, 이러한 분자는 낮은 안정성을 가지고, 생산 및 정제하기 어렵다. 반대로, 분자들은 Shh 리간드, 로봇니키닌(robotnikinin) 및 5E1 단일 클론의 항체의 억제 활성을 가진다.
Hh 신호 전달경로는 또한 더 하류의(further downstream) 조절(modulating)이 가능하다. 예를 들면, Smo에서 Ptc의 억제 영향이 조절(modulating)될 수 있다. 그것은 스타틴(statins)에 의하여 증가 될 수 있고, 아직 적절히 알려지지 않은 메커니즘에 의한 옥시스테롤(oxysterols)에 의하여 감소 될 수 있다(Heretsch et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2010, 18 : 6613-6624). 천연물 (Physalin F) 또는 합성물 (GANT58, GANT61, HPI-1)은 또한 세포핵 내 DNA에 Gli 전사 인자의 결합을 억제하는 것으로 알려져 있다.
그러나, 거의 대부분의 연구는 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 수준에서 활동하는 조절기(modulators)의 발견에 초점이 맞춰져 있다:
- Hh 신호 전달경로를 억제 또는 활성화(SAG 및 파생물)하는 헤테로고리 유기 분자 : International Application PCT WO 01/74344 in the name of CURIS; Chen et al., PNAS, 2002, 99, 14071-14076,
- 퍼모프아민, Hh 신호 전달경로를 활성화하는 작은 분자 : Wu et al., Chemistry & Biology, 2004, 1229-1238,
- 질소-함유 헤테로고리 분자 : International Applications PCT WO 01.19800, WO 01/26644 및 WO 02.30421 in the name of CURIS; Kamenetsky et al., J. Biol., 2002, 1, 1-19,
- Veratrum spp. (jervine, cyclopamine 및 cycloposine) 및 Solanum spp. (solanidine)으로부터 얻은 플랜트 스테로이드(plant steroids), 16, 17 및 18번 자리에 아민 또는 아민 유도체, 및 콜레스테롤로 치환됨 : US Patent 6,432,970 and International Applications PCT WO 99/52534 and WO 01.27135 in the name of JOHNS HOPKINS UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE; US Patent 6,291,516; International Application PCT WO 00/41545 in the name of ONTOGENY INC.; International Application PCT WO 02/30462 in the name of CURIS; Taipale et al., Nature, 2000, 406, 1005-1009; Berman et al., Science, 2002, 297, 1559-1561. 그러나, 시클로파민(cyclopamine)의 농도가 10 μM 이상일 때 세포에 대하여 세포독성을 나타낸다는 것이 증명되었다(Borzillo et al., Curr. Top Med. Chem., 2005, 5(2), 147-157). 더욱이, 종양의 성장에서 시클로파민의 인 비보(in vivo) 영향이 종양 그 자체 이외의 활성과 함께 연관되는 것으로서 의심을 받기 시작했다(Yauch et al., 2008, Nature, 455 : 406-410). 시클로파민의 유도체는 현재 단계 임상적(clinical phase) II에 있다(Mahindroo et al., J. Med. Chem, 2009, 52, 3829; Tremblay et al., J. Med. Chem., 2009, 52 : 14, 4400-4418),
- 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 활성에 억제 활성을 갖는, 또한 RU-486 또는 RU-38486 (French patent FR 2 850 022 in the name of the CNRS)라 불리는, 미페프리스톤(mifepristone) (17β-히드록시 11β-(4-디메틸아미노 페닐) 17α-(프로프-1-이닐)에스트라-4,9-디엔-3-온)이 증명되었다,
- 클로로벤조싸이오펜 유형(CAS No.: 364590-63-6)의 합성 활성 화합물인 SAG와 비슷한 구조를 갖는 SANT74 및 SANT75 분자들은 또한 활성제 Smo의 형태를 효과적으로 조절하기 위한 안정된 억제제로 알려져 있다(Yang et al., The Journal of Biological Chemistry, published April 14, 2009).
Figure pct00001
더욱 최근에, 헤지호그 신호 전달경로를 억제하는 다른 화합물들이 또한 발견되었다(Peukert and Miller-Moslin, 2010, ChemMedChem 5 : 500-512; Low and De Sauvage, 2010, J. Clin. Oncol,; Ng and Curran, 2011, Nature Review Cancer):
- 비스아마이드(International Application PCT WO 2007/059157 in the name of GENENTECH INC. and CURIS INC.) 및 피리딜(International Application PCT WO 2006/028958 in the name of GENENTECH INC. and CURIS INC; US Patent 2009/0281089 in the name of GENENTECH INC.)에 근거한 억제제들. 피리딜-근거 화합물들 중 하나인, GDC-0449(단계 임상 II)는 수모 세포종을 가진 환자에게 효능을 나타냈다. 그러나, 환자는 점차 그 분자에 대하여 저항성이 발달하였다. Smo의 아스파르트산(D473H)의 변화가 발생하였다. 이는 Smo에 결합하는 화합물의 능력이 방해받으며, 이러한 전달경로를 억제한다. 동일한 아미노산의 변화는, 이 화합물과 함께 처리된 수모 세포종을 가진 쥐 모델에서 발견되었다(Yauch et al., 2009, Science 326 : 572-574).
- 노바르티스 회사(company novartis)에 의하여 개발된 억제제들. 예를 들면, LDE225(단계 임상 II)는 수모 세포종을 가진 쥐 모델에서 치료를 위한 실험을 수행하였으며, 이러한 종양의 퇴행을 유도하였다. 그러나, 치료 과정동안 저항성이 발견되었다. 연구는 Gli2의 염색체 확장을 포함하는 저항성의 몇 가지 메커니즘 및 더욱 드물게, 종양 성장의 재활성화로 이어지는 Smo 수용체의 점 돌연변이를 드러냈다. 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol) 3-키나아제 (PI3K) 신호의 긍정적인 규제가 또한 확인되었다(Buonamici et al., 2010, Sci. Tran니. Med., 51-70).
- BMS-833923 (XL-139)와 같은, Bristol-Myers Squibb inc.에 의하여 개발된 억제제들.
- Pfizer Products, Inc. 회사에 의하여 개발된 억제제들(WO 2008/075196 및US 2009/0005416). PF-04449913은 현재 단계 임상 II이다.
- MERCK 회사에 의하여 개발된 억제제들(Dessole et al., 2009, Bioorg. & Med. Chem. Lett. 19 : 4191-4195).
- 노바르티스에 의한 화합물 LEQ506 및 Millennium 회사에 의한 TAK-441은 또한 단지 단계 임상 I에 들어가 있다.
- 아실-유레아(acyl-ureas), -싸이오유레아(-thioureas), 및 -구아니딘에 근거한 억제제들은 헤지호그 전달경로의 조절기로서 또한 보호받고 있다(WO 2009/130422 and WO 2011/010013 in the name of the CNRS). 후자는 다른 존재하는 분자들과 함께 비교하여 준비하는데 더 용이한 이점을 갖는다. 더욱이, 아실-구아니딘 유도체는 수용성이다.
본 발명자들은 이제 실용적인 필요성에 잘 보답하고, 뚜렷이 합성하기 간단하고 인간 치료에 잠재적으로 이용가능한, 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 조절기(자극제 또는 억제제)인 신규한 화합물을 제공하는데 스스로 초점을 맞추었다.
이 목적은 하기 서술된 화학식 1의 화합물에 의하여 성취되고, 본 발명의 첫번째 목표로 여겨지는, 이러한 화합물들은 지금까지 확인된 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 가장 강력한 길항제이다(현재 단계 임상에 있는 화합물들보다 5 내지 30배 더욱 강력하다). 이러한 분자들은 또한 GDC-0449 및 LDE225 분자들보다 10 내지 30배 더욱 큰 친화성을 나타내고, 더욱이 후자는 어떤 환자들에게 저항성이 나타나는 것을 직면하였다(저항성은 특히 Smo 수용체(Smoothened receptor)에서 돌연변이의 발생과 함께 연결된다). 더욱이, 본 발명의 분자들은 아실-유레아, -싸이오유레아 및 구아니딘 화합물들이 쉽게 원자재(raw materials)로부터 시작하여 쉽게 접근이 가능하며, 해당 분야에서 통상의 기술자에 의하여 일반적으로 알려진 방법과 유사한 합성 방법에 따라, 일반적으로 3 또는 4 단계로 준비하는데 용이한 이점을 가진다. 구아니딘 기능은, 염기로서, 염화될 수 있고(salifiable), 수성 용매에서 좋은 용해성을 갖는 화합물을 생산하는데 이점이 있다. 화학식 1의 모든 화합물들은 해당 분야에서 통상의 기술자에 의하여 잘 알려진, 아주 일반적인 간단한 화학 반응을 사용하여 얻어진다.
본 발명은 하기 화학식 1의 화합물과 관련이 있다:
[화학식 1]
Figure pct00002
상기 화학식 1에서,
R1, R2 및 R3는 동일하거나 또는 상이하고, 서로 독립적으로 수소, 또는 할로겐 원자, 히드록시 라디칼, 알킬, 퍼플루오로알킬(perfluoroalkyl), 알콕시, 알킬싸이오, 또는 나이트릴기이고, 상기 알킬, 퍼플루오로알킬, 알콕시 및 알킬싸이오기는 1 내지 6개의 탄소 원자로 구성될 수 있고,
X는 O, S 또는 NH이고, 바람직하게 X는 NH이고,
R4 및 R7은 동일하거나 또는 상이하고, 서로 독립적으로 수소, 또는 할로겐 원자, 또는 알킬기이고;
R5는 하기 군으로부터 선택되는 하나이고:
Figure pct00003
,
Figure pct00004
,
Figure pct00005
,
Figure pct00006
Figure pct00007
,
Figure pct00008
,
Figure pct00009
,
Figure pct00010
적어도 하나의 라디칼이 치환된 R6는 할로겐 원자 또는 알킬, 알콕시, 아미노알킬, 싸이오알킬 또는 히드록시기이고, 상기 알킬, 알콕시, 아미노알킬 및 싸이오알킬기는 1 내지 6개의 탄소 원자로 구성될 수 있다.
본 발명에서, 용어들은 하기 의미들을 갖는다:
- 알킬 : 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖고, 바람직하게는 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄의 포화 지방족 탄화수소기이다. "측쇄" 용어는 적어도 하나의 메틸 또는 에틸과 같은 낮은 알킬기가 직쇄 알킬사슬에 의하여 이송(carried by)될 수 있는 것을 의미한다. "낮은" 용어는 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는 알킬을 의미한다; "높은 알킬" 용어는 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄의 알킬기를 의미한다. 알킬기로서, 우리는 아마도 예를 들면 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, t-부틸 및 n-펜틸기를 언급한다.
- 할로겐 원자 : 브롬, 염소, 요오드 또는 플루오르 원자를 의미한다; 브롬, 염소 및 플루오르 표시(designations)가 바람직하다;
- 퍼플루오로알킬 : 상기 정의된 알킬기의 모든 수소 원자가 플루오로 원자로 대체된 것을 의미한다. 퍼플루오로알킬기 중에서, 트리플루오로메틸 및 퍼플루오로에틸기가 바람직하다;
- 알콕시 : 상술한 바와 동일한 의미를 가질 수 있는 알킬기가 O-알킬기인 것을 의미한다. 알콕시기의 예시로서, 우리는 아마도 뚜렷이 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시 및 펜톡시기를 언급한다;
- 알킬싸이오 : 상술한 바와 동일한 의미를 가질 수 있는 알킬기가 알킬-S기인 것을 의미한다. 알킬싸이오기의 예시로서, 우리는 아마도 뚜렷이 메틸싸이오, 에틸싸이오, 이소프로필싸이오, 부틸싸이오 및 펜틸싸이오기를 언급한다;
- 아미노알킬 : 상술한 바와 동일한 의미를 가질 수 있는 알킬기가 알킬-N기인 것을 의미한다. 아미노알킬기의 예시로서, 우리는 아마도 뚜렷이 아미노메틸, 아미노에틸, 이소프로필아미노, 부틸아미노 및 펜틸아미노기를 언급한다;
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 화학식 1의 화합물은 R1, R2 및 R3가 알콕시 라디칼을 나타내고, 바람직하게는 메톡시 라디칼을 나타내는 것으로부터 선택된다.
다른 바람직한 일실시예에 있어서, R4 및 R7은 수소 또는 염소 원자, 메틸, 에틸 또는 이소프로필기를 나타낸다.
다른 유리한 일실시예에 있어서, R6는 할로겐 원자 또는 알콕시 또는 아미노알킬기를 나타내고, 상기 알콕시 또는 아미노알킬기는 1 내지 6개의 탄소 원자로 구성될 수 있다. 더욱 바람직하게, R6는 염소 또는 플루오르 원자, 메톡시 또는 디메틸아미노 라디칼을 나타낸다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물이다:
- 하기 화학식의 N-(N-(3-(4-벤조일벤즈아미도)-4-메틸페닐)카바미미도일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드 하이드로클로라이드:
Figure pct00011

- 하기 화학식의 N-(N-(3-(4-벤조일벤즈아미도)-4-메틸페닐)카바미미도일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드 하이드로클로라이드:
Figure pct00012

- 하기 화학식의 3,4,5-트리메톡시-N-(N-(4-메틸-3-(4-(3-페닐프로필)벤즈아미도)페닐)카바미미도일)벤즈아마이드:
Figure pct00013

- 하기 화학식의 3,4,5-트리메톡시-N-(N-(4-메틸-3-(4-페네틸벤즈아미도)페닐)카바미미도일)벤즈아마이드:
Figure pct00014

- 하기 화학식의 (E)-N-(N-(3-(4-신나밀벤즈아미도)-4-메틸페닐)카바미미도일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드 하이드로클로라이드:
Figure pct00015

- 하기 화학식의 N-(N-(3-(4-벤질벤즈아미도)-4-메틸페닐)카바미미도일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드 하이드로클로라이드:
Figure pct00016

- 하기 화학식의 N-(N-(3-(4-벤질벤즈아미도)-4-메틸페닐)카바미미도일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드:
Figure pct00017

- 하기 화학식의 N-(N-(3-(4-(벤질옥시)벤즈아미도)-4-메틸페닐)카바미미도일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드:
Figure pct00018
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 해당 분야에서 통상의 기술자에 의하여 알려진 기본적인 방법과 비슷한 합성 방법에 의한, 일반적으로 3 또는 4 단계로 쉽게 준비될 수 있다.
첫째 중심 조각(central fragment)으로, 조각 (Ⅵ)은, 상기 스킴 1(Scheme 1)에 따라 준비될 수 있다.
Figure pct00019

스킴 1( Scheme 1)
벤조일 클로라이드(Ⅱ)를 수성용매에 용해된 시안아미드에 농축하는 것은, 아실-시안아미드(Ⅲ)를 가지기 위한 문제이며, 결국 아닐린(A)과 농축하여 구아니딘(Ⅳ)을 가진다.
구아니딘의 기본 기(basic function)는 나이트로 화합물(Ⅴ)을 가지기 위하여 염기 용매 분위기에서 Boc 잔기(residue)로 보호된 후, 수소첨가(hydrogenation)에 의하여 아민으로 환원되어 중간체 아닐린(Ⅵ)을 가진다.
하기 반응 스킴 2(Scheme 2)는 그들의 화학식 (I)에서 그룹 R1=R2=R3를 소유하는 화합물의 준비과정을 나타낸다.
산 염화물(chlorides of acid) (1a-h)의 준비는 (J. Med. Chem, 2001, 44, 3175; Chem. Eur. J. 2010, 16, 5848; Org. Lett. 2007, 9, 4571; Org. Biomol. Chem. 2008, 6, 3005; Adv. Cat. Synth. 2008, 350, 2065; J. Org. Chem. 2001, 66, 2874; J. Med. Chem. 2010, 53, 5770)의 문헌에서 서술한 대로 준비하였다.
그다음에, 중간체(Ⅵ)는 상업적으로 가장 흔한, 다양한 산 염화물 (1a-h)과 함께 농축하여 기대되는 화합물을 가장 흔한 염(염산염) 형태로 주었다(스킴 2).
Figure pct00020
Figure pct00021

스킴 2( Scheme 2)
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 헤지호그 단백질(hedgehog protein) 신호 전달경로의 부정적 (억제 효과) 또는 긍정적 (활성 효과) 조절(modulating)의 특성을 가지며, 따라서 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 과활성 또는 결함과 관련되는 장애를 치료하기 위하여 의도되는 약학적 조성물을 준비할 때, 유효성분(active principle)으로써 사용될 수 있다.
따라서, 이번 발명은 또한 화학식 1의 화합물이 의약품으로써, 그것에 적용과 관련이 있으며, 특히 화학식 1의 화합물이 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 과활성과 관련되는 종양의 치료를 위한 의약품으로써, 그것에 적용과 관련이 있다.
상술하면(more particularly), 이번 발명은 또한 화학식 1의 화합물과 관련이 있다:
- 헤지호그(Hedgehog) 단백질 신호 전달경로의 과활성과 관련되는 종양의 치료를 위한 의약품으로서; 이러한 종양은 신경조직종양(수모세포종, 신경일차종양, 교아(세포)종, 수막종 및 핍돌기신경교종), 피부종양(기저세포암, 모낭상피종), 근육 및 골조직 종양(횡문근육종, 골육종) 또는 그 외의 조직 종양(신장, 방광, 전립샘, 폐, 위, 췌장)이고,
- 파킨슨질환, 헌팅턴무도병, 알츠하이머질환, 다발성 경화증, 또는 운동 뉴런 질환과 같은 신경퇴행성 유형 장애를 치료하기 위한 의약품으로서,
- 뇌신경발달(전전뇌증)과 관련된 질환, 희소돌기 아교세포(oligodendrocytes) 및 시반세포(schwann cells)의 질환뿐만 아니라, 뇌손상(cerebrovascular accident) 및 뇌졸중(cardiovascular accidents)의 치료를 위한 의약품으로서,
- 생체 외(in vitro)에서 인간 또는 동물 줄기세포의 재생(renewal) 조절(modulating)에 적용하기 위한,
- 헤지호그 신호 전달경로에서의 다른 장애들, 예를 들면 당뇨병, 을 치료하기 위한 의약품으로서, 유용할 수 있다.
사용되는 약량학(posology)은 치료될 종(인간 또는 동물)의 체질 및 무게 뿐 아니라, 치료될 장애, 투여의 경로 및 빈도수에 의존하여 다양할 것이다; 그것은 예를 들면, 경구투여일 때 성인기준으로 하루당 10 mg 내지 2g로 다양할 수 있다.
본 발명은 유효성분으로서, 적어도 하나의 상기 정의된 화학식 1로 표시되는 화합물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 것과 관련이 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물 중에서, 화학식 1의 화합물 또는 화합물들은 투여될 약 10 mg 내지 2g 사이의 1회 복용으로 허용되는 양으로 바람직하게 사용된다.
통상의 기술자가 약학적 조성물의 투여 경로와 관련하여 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 첨가제를 선택할 것이다. 사용될 첨가제 또는 첨가제들은 본 발명에 따른 성분의 본질적 특성과 함께 일치할 수 있으며, 그러한 경우에는 물론, 통상의 기술자가 확실히 할 것이다.
더욱이, 의약품 또는 약학적 조성물의 형태(예를 들면, 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 캡슈울 제, 좌약, 등.)는 투여의 선택된 경로에 의존할 것이다.
따라서, 본 발명의 의미에서, 의약품 또는 약학적 조성물은 어느 적합한 경로에 의하여 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 항문, 국소, 전신, 정맥 내, 근육 내, 또는 점막 경로, 또는 다른 사용하는 패치, 또는 다른 캡슐화(encapsulated in), 또는 고정화된(immobilized on), 리포솜(liposomes), 극미립자(microparticle), 마이크로캡슐(microcapsule), 및 기타 같은 종류의 형태가 있다.
적절한 첨가제 투여의 비제한적인 예시들로서, 경구 경로, 탈크(talc), 젖당(lactose), 탄수화물(starch) 및 그것의 유도체, 셀룰로오스 및 그것의 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 아크릴산의 고분자, 젤라틴, 스테아린산 마그네슘, 동물, 야채 또는 합성 지방(synthetic fats), 파라핀(paraffin) 유도체, 글리콜, 스테빌라이저(stabilizers), 방부제(preservatives), 산화 방지제(antioxidants), 습윤제(wetting agent), 항 응고제(anti-agglomerating agent), 분산제(dispersants), 유화제(emulsifiers), 맛 교정제(taste correctants), 침투제(penetrating agent), 가용화제(solubilizing agent), 등을 우리는 아마 뚜렷이 언급할 수 있다.
의약품 및 약학적 조성물의 제조 및 투여를 위한 기술은 여기서 고려된 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 해당 분야에서의 통상의 기술자가 Remington's Pharmaceutical Sciences(21st edition)을 참고하여 뚜렷이 작업을 할 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 이러한 신호 전달경로의 새로운 조절기(modulators)를 발견하기 위한, 및 Smo 수용체(Smoothened receptor) 또는 관련된 수용체들의 다른 형태를 탐지하기 위한, 및 이런 다양한 형태 조절(modulating)이 가능한 분자를 알아내는 도구로서 둘 다 극히 유용한 것으로 증명하였다.
본 발명은 따라서 또한 Smo 수용체(Smoothened receptor) 또는 이와 관련된 수용체와의 상호작용이 가능한 분자, 예를 들면, Smo1 결합 위치 또는 Smo2 결합 위치에 결합하는 것에 의한 것을 뚜렷이 동정하기 위한 조사 도구(research tools)로서 표지된 화학식 1의 화합물을 적어도 하나 사용하는 것과 관련이 있다.
사실, 발명자들은 화학식 1의 화합물의 구조적 단편의 하나의 끝에 마커(marker)를 도입하는 것이 많은 생물학적 검정(bioassays)에서 서브나노몰(subnanomolar)의 친화성 특징을 나타내는 방사리간드로 유도될 수 있음을 상당히 뜻밖에 알아내었다.
화학식 1의 화합물의 표지는 이전 분야의 전통적인 방법에 따라 3H, 11C, 14C, 32P, 35S, 125I, 99 mTc, 18F, 64Cu, 76Br, 124I, 13N, 15O 또는 123I와 같은 방사활성 동위원소의 혼입에 의하여 방사활성이 될 수 있다. 화학식 1의 화합물의 표지는 또한 해당분야에서 통상의 기술자에 의하여 알려진 방법에 의하여 상기 화합물에 형광단(fluorophore)의 고정으로 이루어질 수 있다; 표지는 탐지될 방사활성 원자의 기능으로서 선택되는 방사-이미저(radio-imagers)의 관례적인(conventionally) 사용, 또는 형광을 측정하여 탐지될 수 있다.
신호 전달경로의 몇몇 방사리간드는 문헌에 서술되어 있지만, 여전히 조금 사용된다. 예를 들면, 삼중 수소(tritium) 3H 또는 요오드 125I와 함께 표지된 방사리간드는 3H SAG(Rominger et al., JPET, 2009, 995-1005), 3H-Hh-Ag1.5(Borzillo and Lippa, Curr. Top Med. Chem., 2005, 5(2), 147-57), [3H]GDC-0449(Dijkgraaf et al., 2001, Cancer Res. 435-444) 또는 AP-시클로파민 [3H]-시클로파민(Chen et al., Genes Dev., 2002, 16: 2743-2748)과 같다:
Figure pct00022

헤지호그 단백질 신호 전달경로의 수용체의 조절기(modulator)의 활동 메커니즘의 더 깊은 분석을 위한 특정 결합 및/또는 방사능 사진 촬영, 및 더욱 특히 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 실험을 실시하기 위한 삼중 수소(tritium)로 표지된 물질(substance)을 얻기 위한 목적과 함께, 유사한 시리즈가 연구되었다. 사실, 선행기술에서 이전에 서술한 표지된 화합물들은 쉽게 이용할 수 없다; 그것들은 많은 합성 단계를 필요로 한다. 더욱이, 상기 서술된 방사리간드들 중에서, 오직 AP-시클로파민 [3H]-시클로파민만이 상업적으로 이용 가능하다. 더욱이, 그것은 본 발명의 화합물(화합물 (7d)에 대한 Kd = 0.3 nM)과는 반대로 낮은 친화성(Kd는 약 10 nM)(Rominger et al., JPET, 2009, 995-1005)을 보인다.
더욱 특히, 표지된 형태의 화학식 1의 화합물이 사용될 수 있다:
- 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 과활성과 함께 연관되는 종양의 탐지를 위해,
- Smo 수용체(Smoothened receptor) 또는 프리즐드 수용체들(frizzled receptors)(Frizzled 1 to 10)과 같은 관련 수용체들, 또는 그 밖의 패치(patched)(패치 1 및 패치 2), 디스패치(dispatched)(디스패치 1 및 디스패치 2) 또는 힙 수용체들(Hip receptors)과 같은, 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 수용체의 특정 결합 위치의 리간드를 스크리닝(screening) 및/또는 동정(identifying)하기 위해, 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 상기 수용체들은 자연히 발현될 수 있고, 또는 일차 배양(primary cells), 세포 라인 또는 건강 또는 병적 조직에서 안전하게 또는 일시적으로 감염된(transfected)(플라스미스 유전자 도입) 또는 오염(infected)(바이러스들을 사용함에 따른)될 수 있다.
- 줄기 세포에 작용하는 헤지호그 단백질 신호 전달경로(항암 분자)의 수용체의 길항제 또는 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 수용체의 증진제인 새로운 분자들을 스크리닝 및/또는 동정하기 위해,
- 일차 배양(primary cells), 세포 라인 또는 건강 또는 병적 조직에서 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 기능을 분석하기 위한 방사능 사진촬영,
- 일차 배양(primary cells), 세포 라인 또는 건강 또는 병적 조직에서 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 수용체의 약리 조절(pharmacological regulation)을 연구하기 위해.
본 발명의 다른 목적은 트리튬(tritium) 3H 분위기에서 상기 정의된 화학식 1로 표시되는 화합물을 삼중 수소화(tritiating)하는 단계를 포함하고, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 에틸레닉 이중결합(ethylenic double bond)을 갖지 않는 R5 군이 치환되었을 경우, 화학식 1로 표시되는 화합물을 할로겐화하는 준비단계를 포함하는 상기 화학식 1의 화합물을 방사성표지화(radiolabeling) 하는 방법과 관련이 있다.
따라서, 이번 발명의 추가적인 목적은 상기 서술된 방사성표지화(radiolabeling) 방법에 의하여 얻을 수 있는, 적어도 어느 하나의 원자가 트리튬 원자 3H로 대체되어 있는 화학식 1의 화합물과 관련이 있다. 트리튬 3H와 함께 방사표지된 이들의 화학식 1의 화합물들은 조사 도구(research tools)로서, 상기 열거된 다양한 용도를 위해 사용될 수 있다.
헤지호그 전달경로의 조절기(modulator)를 스크리닝(screening)하는 다양한 방법들이 알려져 있다:
- 일차 라인(primary lines) 또는 배지(cultures)의 세포의 반응을 사용하는 방법 : 세포 분화(cellular differentiation)(C3H10T1/2), 세포 증식(cellular proliferation)(일차 소뇌 과립 세포들);
- 타겟 수용체 [(bodipycyclopamine (BC)] (US 2007/0218775)의 막관통영역(transmembrane domain)에 작용하는 형광성의 화합물과 함께 경쟁을 사용하는 방법;
- 포함된 전달경로의 리포터 유전자(reporter gene)를 사용하는 방법 (Taipale et al., 2000, Nature, 406, 1005-1009);
- 시험 화합물의 존재 또는 부재에서 Ptc-Hh 상호작용을 측정함에 의해 Hh 활성을 검출하는 시험(US 2005/0282231);
- Smo의 하류(downstream)에 작용하는 Hh 전달경로의 억제제들을 확인하기 위하여 Sufu에 결함이 있는 세포 및 리포터를 사용하는 시험(WO 2006/080894);
이번 발명은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 Smo 결합 위치(Smo1 또는 Smo2)의 리간드를 스크리닝 및/또는 동정하는 방법과 관련이 있다:
a) 복합물 [Smo-화학식 1의 화합물]을 얻기 위하여, Smo 수용체(Smoothened receptor) 및 적어도 하나의 화학식 1로 표시되는 화합물의 접촉을 야기하는 단계;
b) 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 시험 분자(test molecule)를 Smo 수용체(Smoothened receptor)와 접촉을 야기하는 단계;
c) 복합물 [Smo-화학식 1의 화합물]과 단계 b)에서 회복된 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 비교함으로써, 상기 Smo 수용체(Smoothened receptor) 및 상기 시험 분자(test molecule) 사이의 상호작용을 검출하는 단계; 및
d) Smo 수용체(Smoothened receptor)와 상호작용이 측정된 상기 시험 분자(test molecule)를 선택하는 단계.
단계 a)는 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 발현하는 세포들과 함께 또는 기능성 Smo 수용체(functional Smoothened receptor)를 구성하는 세포막을 추출하는것과 함께 수행될 수 있다; 그것들은 Rivoyre et al. (FEBS Letters 579, 2005, 1529-1533)에 서술되어 있는 방법에 의하여 얻을 수 있는 기능성 Smo 인간 수용체(functional Smoothened human receptor)를 함유한(bearing) 효모균의 세포막을 뚜렷이 추출할 수 있다.
Smo 수용체(Smoothened receptor)를 발현하는 세포들과 함께 단계 a)를 실행할 때, 상기 수용체의 발현은 구성요소(세포로부터 자연히 발현된 수용체), 또는 같은 종 또는 다른 종의 Smo 수용체(Smoothened receptor) 발현 또는 과발현을 위한 세포의 형질전환이 원인이다. 이러한 Smo 수용체(Smoothened receptor)는 야생-타입 수용체(wild-type receptor)보다 다른 생화학의 또는 약물학의 특성을 부여하는 변화를 또한 실행할 수 있다.
어느 화학식 1의 화합물은 본 발명에 따른 방법을 실행하기 위하여 사용될 수 있다; 그러나, 그것은 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 위한 그것의 친화성과 관련되어 해당 분야에서 통상의 기술자에 의하여 뚜렷이 선택될 수 있다.
단계 a)는 액체 상에서 또는 적절한 고체 지지체(suitable solid support)에서 실행될 수 있다; 해당 분야에서 통상의 기술자가 선택할 것이고, 및 이러한 구현(embodiments), 예를 들면, Smo 수용체(Smoothened receptor)를 세포막 추출물의 형태로 사용하든지 또는 정제된 단백질(purified protein)의 형태로 사용하든지에 따른 것을 맞출 것이다.
상기 단계 a)를 용액 상(liquid phase)에서 수행할 때, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 용액-상에서의 리간드를 스크리닝(screening) 하는 방법은 하기 단계들에 따라 실행될 수 있다:
a) 복합물 [Smo-화학식 1의 화합물]을 얻기 위하여, Smo 수용체(Smoothened receptor) 및 적어도 하나의 화학식 1로 표시되는 화합물의 접촉을 야기하는 단계;
b) 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 시험 분자(test molecule)를 Smo 수용체(Smoothened receptor)와 접촉을 야기하는 단계;
c) 하나 이상의 시험 분자(test molecule) 및/또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 선택적으로 결합한 상기 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 회복하는 단계;
d) 단계 c)에서 회복된 Smo 수용체(Smoothened receptor)와 복합물 [Smo-화학식 1의 화합물]을 비교함으로써 상기 Smo 수용체(Smoothened receptor) 및 상기 시험 분자 사이의 상호작용을 검출하는 단계; 및
e) 상호작용이 측정된 상기 시험 분자(test molecule)를 선택하는 단계.
단계 a)는 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 구성하는 세포막 추출물과 함께 실행될 수 있다, 화학식 1의 화합물과 시험 분자들을 함께 배양한 후; 혼합액을 원심분리한 후; 원심분리한 후 얻어진 펠렛(pellet)을 버퍼 내에서 재현탁(resuspended)시키고; 비특정 상호작용을 제거하기 위해 원심분리를 한다. Smo 수용체(Smoothened receptor)에 시험 분자의 고정(fixation)은 형광 발광의 측정을 통해, 또는 화학식 1의 화합물의 표지에 의존하는 방사 활성의 측정을 통해 분석되었다:
- 용액-상 스크리닝(screening) 방법의 한가지 변형(variant)에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 사전에 표지되었다. Smo 수용체(Smoothened receptor) 및 하나 또는 그 이상의 시험분자 사이의 상호작용을 검출하는 단계 d)는 단계 c)에서 회복된 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 표지화(방사활성 또는 형광 발광에 의한)와 복합물 [화학식 1의 Smo-화합물]을 비교함에 따라 실행되었다; 선택된 분자들은 단계 c)에서 회복된 Smo 수용체(Smoothened receptor)들의 표지화가 복합물 [화학식 1의 Smo-화합물]보다 약하다;
- 용액-상 스크리닝(screening) 방법의 또 다른 변형(variant)에 따르면, 복합물 [화학식 1의 Smo-화합물]과 단계 c)에서 회복된 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 위치를 비교함에 의한 크로마토그래피에 의하여 상호작용이 탐지되었다; 만약 위치가 동일하다면 Smo 수용체(Smoothened receptor) 및 시험 분자 사이에 상호작용이 없는 것이다. 반대로, 위치상에 차이는 상호작용이 있다는 것을 나타내며, 이는 Smo 결합 위치에서 시험 분자와 Smo 수용체(Smoothened receptor) 사이에 상호작용이 실제로 일어났다는 것을 확신할 필요가 있다.
본 발명에 따른 스크리닝(screening) 방법의 단계 a)는 대신에 적절한 고체 지지체에서 실행될 수 있다.
고체 지지체는 특히 효소, 항체, 펩티드, 미생물, 생물학적 조직, 지질, 핵산 등과 같은 생물학적 종을 구성하는 세포막으로 이루어진 바이오센서를 의미하고, 이는 시험분자에 결합하는 것을 허용하고, 단백질 수용체에 리간드를 고정하여 물리적 신호, 예를 들면, 전기 화학(전류 측정, 전위차, 전기 전도성), 광학(빛), 압전기 또는 열량을 측정하는 것과 같은 생물학적 신호를 변형하기 위한 변환기(transducer)이다. 이 경우에는, 세포막에 고정된 생물학적 종은 Smo 수용체(Smoothened receptor)이다; 동시에(in parallel) 실시된 두 개의 실험에서, 고체 지지체에 있는 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 화학식 1의 화합물 및 상기 화학식 1의 화합물과 시험 분자의 혼합물에 가져와 접촉시키고, 이들의 실험에서 얻어진 각각의 신호들이 비교되었다; 신호 조절(modulating)을 유도한 분자들이 선택되었다.
한 예를 들면, 고체 지지체는 바이오센서의 표면에서 질량을 변화시킴에 따른 단백질 및 그의 리간드 사이의 상호작용의 시각화 및 특성(친화성, 관련성 및 해리상수)이 가능하게끔 소용이 있는 플라스몬 공명(plasmon resonance)에 의한 결합을 탐지하기 위한 바이오센서이다. 이러한 질량의 변화는 바이오센서의 표면에서 플라스몬 공명 각도의 변화로 측정되었으며, 표지 또는 형광 리간드를 필요로 하지 않는다.
고체 지지체에서의 스크리닝(screening) 방법이 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 구성하는 세포막의 추출물과 함께 실행될 때, 이러한 추출물은 지방 친화성의 바이오센서에 주사를 함으로서 고정될 수 있다. 지방 친화성의 바이오센서가 사용될 때, 세포막 추출물이 세포막 수용체와 리간드 사이의 상호작용을 모니터링할 수 있게끔 허용하는 덱스트란(dextran)에 공유 결합에 의한 결합으로 지방 친화성 기들에 고정된다(M.R. Pourshafie et al., J. Microbiol. Meth., 2004, 58, 313-320; A. Wikstrom, Anal. Biochem., 2007, 362, 98-107).
따라서, 본 발명의 한가지 변형(variant)에 따르면, 플라스몬 공명에 따른 결합을 탐지하기 위한 바이오센서는 Smo 수용체(Smoothened receptor)가 주사에 의하여 고정되는 것을 포함하는 세포막의 준비과정을 거친, Biacore (GE Healthcare)으로부터의 소수성 바이오센서인 "sensorchip L1"과 같은 지방 친화성의 바이오센서이다.
정제된 Smo 수용체(Smoothened receptor)와 함께 고체 지지체에서의 스크리닝(screening) 방법이 실행될 때, 리간드가 그곳에 고정될 때, 수용체가 고정된 인터페이스(interface)의 지표의 변화를 검출하는 것을 포함하는 표면 플라스몬 공명의 측정이 가능하게끔 상기 수용체는 또한 바이오센서에 고정될 수 있다.
- 또 다른 변형(variant)에 따르면, 고체 지지체에서의 스크리닝(screening) 방법은 또한 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 리간드가 Smo 결합 위치에 결합하지 않는다는 것을 확인하는 것이 가능하게끔 만들어 준다; 이러한 리간드들의 활성 또는 억제 활동은 하기 나타낸 방법들에 의하여 특징지어질 수 있다.
본 발명은 또한 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 증진제를 확인하는 방법과 관련이 있으며, 이 방법은 리간드의 확인 방법이 서술된 단계들뿐 아니라, Smo 수용체(Smoothened receptor)의 활동에 따른 세포반응을 내보이는 세포와 함께 확인된 리간드를 가져와 접촉시키고, 상기 세포의 상기 세포반응을 유도할 수 있는 증진제 분자들을 선택하는 추가적인 단계들로 구성된다.
Smo 수용체(Smoothened receptor)의 활동에 따른 세포반응을 내보이는 세포들은 일차 라인(Primary line) 또는 배양(culture)으로부터 선택된다: 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)의 활성에 의하여 측정할 수 있는 세포 분화에 의하여 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 활동에 반응을 보이는 간충직세포(mesenchymal cell)(예를 들면, C3H10T1/2); 세포 증식에 의한 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 활동에 반응을 보이는 일차 소뇌 과립 세포(Primary cerebellar granule cell); 성인 뇌의 줄기 세포 또는 신경전구세포(neural progenitor) 또는 성장 중 또는 성인의 조직 내에 존재하는 다른 간세포(progenitor cell). 상기 세포반응은, 예를 들면, 글리 집단(Gli family), 또는 다른 패치(Patch) 또는 힙(Hip), 헤지호그 전달경로에 의하여 활성화된 유전자들의 전사인자를 위한 유전자들의 코딩(coding)과 같은 유전자 유도로 구성될 수 있다.@
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 Smo 수용체(Smoothened receptor)에 길항제(antagonist)인 분자를 동정하는 방법과 관련이 있다:
a) Smo 수용체(Smoothened receptor)의 활성화에 따른 세포반응을 나타내는 세포를, 상기 세포반응을 유도하기 위한 적어도 하나의 화학식 1로 표시되는 화합물과 함께 배양하는 단계;
b) 단계 a)의 마지막에 얻은 세포와 시험 분자(test molecule)의 접촉을 야기하는 단계;
c) 상기 세포의 상기 세포 반응 억제를 유도하는 분자를 선택하는 단계.
우리가 시험하기를 희망하는 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 길항제 활성을 갖는 분자는 뚜렷이, 본 발명에 따른 리간드 확인을 위한 상기 방법들 중 어느 하나의 것으로 확인된 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 Smo 결합 위치에 결합하는 리간드가 될 수 있다.
본 발명은 더욱이 최소 하나의 화학식 1의 화합물 및 최소 하나의 기능성 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 포함하는 본 발명에 따른 방법들을 실행하기 위한 키트(kit)와 관련이 있다. 기능성 Smo 수용체(Smoothened receptor)는 세포막 추출물의 형태로 존재하거나, 또는 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 활동에 따른 세포반응을 내보이는 세포 내 존재한다.
Smo 수용체(Smoothened receptor) 및 화학식 1의 화합물 사이의 결합 실험은 또한 특징화(characterizing) 및 동정을 위하여 사용될 수 있다:
- Smo 결합 위치가 활성인 형태에서 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 발현하는 새로운 세포 타입;
- Smo 수용체(Smoothened receptor)와 관련있는 수용체들과 같은, 차별과 관련되는 수용체들.
본 발명은 따라서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 발현(expressing)하는, 종양 세포(tumor cells)와 같은 세포를 동정하는 방법과 관련이 있다:
a) 표지된 화학식 1로 표시되는 화합물과 테스트할 세포의 접촉을 야기하는 단계;
b) 테스트할 세포의 어떠한 수용체에도 결합하지 않은 상기 표지된 화학식 1로 표시되는 화합물을 제거하기 위하여 상기 세포를 세척하는 단계;
c) 표지된 세포를 검출하는 단계.
화합물들은 또한 동정 및 새로운 수용체들을 특징화 또는 세포가 아직 얻지 못한 특성(proporty) 또는 상태를 획득하게끔 하는 세포분화, 세포증식, 세포 죽음, 이동(migration), 세포의 생존 또는 다른 것을 포함하는 새로운 형태의 수용체들의 구실을 할 수 있다.
앞서 언급한 제공(provisions) 이외에, 본 발명은 하기에 주어진 서술로부터 명확해질 다른 제공들을 더욱 포함한다. 상기 다른 제공들은 하기 부가된 도면들 뿐 아니라, 실시예의 합성, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 특징(characterization) 및 평가(evaluation), 및 그것의 표지화를 언급한다: 도. 1은 다양한 세포 시험 및 Smo 수용체에 대한 bodipy-시클로파민 (BC)의 결합에서 화합물 (7d) 및 기준 화합물의 활성을 설명한다. 도. 1A 및 1B는 C3H10T1/2 세포의 분화에서(도. 1A) 화합물의 활성을, 및 쥐 소뇌의 PCGs의 증식에서(도. 1B) 화합물의 활성을 나타낸다. 억제 커프는 SAG(0.1 μM, 도. 1A 및 0.01 μM, 도. 1B)에서 연구된 분자들의 농도를 증가시킴으로써 만들어졌다. 결과값들은 SAG로부터 유도된 최대 반응으로부터 퍼센테이지로서 표현되었다. 도. 1C는 다른 화합물들에 의한 bodipy-시클로파민 (BC)의 결합 억제를 설명한다. HEK-hSmo 세포는 오직 BC (5 nM)와 함께 배양하거나 또는 조사중의 분자들의 농도를 증가시키며 함께 배양하였다. BC의 결합은 형광 현미 기술(fluorescence microscopy)에 의하여 그려졌으며, 화합물들의 용량-반응 커브(dose-response curve)는 정량(quantification) 후에 얻어졌다. 결과값들은 BC의 특정결합의 퍼센테이지로서 표현되었다. 결과값들 (평균 결과값 ± SEM)과 일치하는 데이터는 2-4번의 독립적인 실험들의 실험 대표(experiment representative)로부터 얻어졌다,
- 도. 2는 인간 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 발현하는 HEK-hSmo 세포의 세포막의 화합물 3H-(7d)의 거동(kinetics)을 나타낸다,
- 도. 3은 평형에서 HEK-hSmo 세포에서 발현되는 Smo 수용체에 대하여 화합물 3H-(7d)의 결합의 포화 커브를 나타낸다. 도. 3A : HEK-hSmo 세포 (단백질 2μg)의 세포막을 3시간 동안 37℃에서 화합물 3H-(7d)의 농도를 증가시키면서 HEPES 0.2% BSA 버퍼의 최종 부피 0.4 ml에서 배양하였다. 비특정 결합은 1 μM의 GDC-0449의 존재 분위기에서 평가되었다. 특정 결합의 분석은 0.3 ± 0.1 nM의 Kd값 및 1086 ± 91 cpm의 Bmax값을 나타내었다. 데이터는 3중의 평균 결과값 ± SEM이다(대표 실험, n = 3). 그림. 3B : 화합물 3H-(7d)의 특정 결합의 스캐차드 분석(Scatchard analysis),
- 도. 4는 HEK-hSmo 세포에서 발현된 인간 Smo 수용체(Smoothened receptor)에 대하여 화합물 3H-(7d) 결합의 억제를 설명한다. HEK-hSmo 세포 (2μg의 단백질)의 세포막은 0.35 nM의 화합물 (7d)을 단독으로 또는 GDC-0449 (A), 화합물 (7d), MRT-83, LDE225 및 시클로파민 (B)의 농도를 증가시키면서 HEPES 버퍼 (0.2% BSA)의 최종 부피 0.4 ml에서, 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. 데이터는 삼중의 평균 중간값 ± SEM이고(대표 실험, n = 2-3), 1 μM의 GDC-0449 (B)의 존재 분위기에서 결정되는 화합물 3H-(7d) (A)의 전체 결합 또는 화합물 3H-(7d)의 퍼센테이지 특정 결합을 나타낸다,
- 도. 5는 SAG 및 퍼모프아민(purmorphamine)에 의한 HEK-hSmo 세포에서 발현되는 인간 Smo 수용체(Smoothened receptor)에 대한 화합물 3H-(7d)의 결합 억제를 설명한다. HEK-hSmo 세포 (2 μg의 단백질)의 세포막은 3시간 동안 37℃에서 0.35 nM의 화합물 (7d)을 단독으로 또는 SAG 또는 퍼모프아민(purmorphamine)의 농도를 증가시키면서 HEPES 버퍼 (0.2% BSA)의 최종 부피 0.4 ml에서 배양하였다. 데이터는 삼중의 평균 중간값 ± SEM이고(대표 실험, n = 2-3), 1 μM의 GDC-0449의 존재 분위기에서 결정되는 화합물 3H-(7d)의 퍼센테이지 특정 결합을 나타낸다.
EXAMPLE 1 : 본 발명에 따른 다양한 화합물들의 합성 및 정의를 위한 프로토콜
반응은 슈랭크 기술(표준)을 사용한 불활성 기체(inert gas)의 환경 내에서 수행하였다. 용매는 표준 방법을 통해 건조하였으며, 질소 내에서 증류하였다. 모든 시료는 상업적으로 얻었으며, 예비의 정화과정 없이 사용하였다.
질량 분광분석법(ESI+)은 reference Agilent®에서 판매하는 LC/MSD 분광계에서 기록하였다. 핵자기공명(NMR) 스펙트라는 200 MHz(1H) Bruker® AC200 기기 또는 400 MHz(1H) Bruker® AC400 기기에서 기록하였다.
A/ 화학식 Ⅳ로 표시되는 화합물의 제조
3,4,5- 트리메톡시 -N-(N-(4- 메틸 -3- 나이트로페닐 ) 카바미미도일 ) 벤즈아마이드 (3)의 제조
Figure pct00023
톨루엔 (50 mL)에 용해된 시아노아마이드 (2)(1.12 g, 4.77 mmol) 및 하이드로클로라이드 형태의 4-메틸-3-나이트로아닐린 (A1) [1.08 g, 5.72 mmol, 1당량의 HCl(Et2O 내 2M)을 MeOH(10 mL) 내 아닐린에 첨가하고, 진공 내에서 농축하여 파우더 형태로 얻음] 용액을 교반하여 6시간 동안 환류 가열하였다. 침전물을 유도하기 위하여 고체 형태인 Et2O (50 mL)를 첨가하였다. 고체를 필터하고, 진공 내에서 건조하였다; 그 후, 고체를 물 (30 mL) 내 NaHCO3의 포화 수용액에 용해시켰다. 수용액은 Et2O(2 x 50 mL)로 추출하였다. 유기층은 브라인으로 세척하고, Na2SO4로 건조한 후, 농축하여 나이트로-구아니딘(nitro-guanidine) (3)(1.22g, 66%)을 얻었다.
Figure pct00024

B/ 화학식 Ⅴ로 표시되는 화합물의 제조
tert -부틸 (4- 메틸 -3- 나이트로페닐아미노 ) (3,4,5- 트리메톡시벤즈아미도 ) 메틸렌카바메이트 ( 4)의 제조
Figure pct00025
상온에서 THF (10 mL)에 용해된 Boc2O (1.77g, 8.13 mmol) 용액과 DMAP (97 mg, 1 mmol)을 촉매로서, THF (90 mL)에 용해된 염기 형태의 구아니딘 용액 (3)(3.16 g, 8.13 mmol)에 방울 단위로 첨가한 후, 1시간 동안 교반하고, 반응물질을 소모시켰다. 용매는 진공 내 처리하였으며, 잔여물은 용리액 EtOAc/Hept 교반물 : 3/7을 사용한 칼럼 크로마토그래피를 통해 정화하였다. Boc-구아니딘을 오일 형태 (4)(2.3 g, 58 %)로 얻었다.
Figure pct00026

C / 화학식 Ⅵ 으로 표시되는 화합물의 제조
tert -부틸 (3-아미노-4- 메틸페닐아미노 ) (3,4,5- 트리메톡시펜즈아미도 ) 메틸 렌카바메이트( 5)의 제조
Figure pct00027
반응용기 내에 들어있는 MeOH (80 mL)에 용해된 Boc 나이트로-구아니딘 (4)(1.22 g, 2.5 mmol)과 Pd/C 10% (100 mg)의 교반물을 H2 내 50 psi로 10시간 동안 교반하였다. 반응 물질이 소모된 후; 촉매를 필터하고, 용매는 진공 내에서 진공처리 하였다. 잔여물은 용리액 Hept/EtOAc 교반물 : 7/3을 사용한 칼럼 크로마토그래피를 통해 정화하여 목적생성물은 노란색 오일 형태 (5)(840 mg, 73%)로 얻었다.
Figure pct00028

D/ 화학식 (6) 및 (7)로 표시되는 다양한 화합물의 제조
D-1) tert -부틸 (3-(4- 벤조일벤즈아미도 )-4- 메틸페닐아미노 ) (3,4,5- 트리메 톡시벤즈아미도) 메틸렌카바메이트 (6a)의 제조
Figure pct00029
0℃에서 CH2Cl2 (3 mL)에 용해된 산 염화물 (1a)(73 mg, 0.3 mmol) 용액을 CH2Cl2 (10 mL)에 용해된 Boc 구아니딘 (5)(137 mg, 0.3 mmol) 및 트리에틸아민 (0.1 mL, 0.66 mmol) 용액에 방울 단위로 첨가한 후, 하룻밤 동안(overnight) 교반하였다. 물 (15 mL) 및 CH2Cl2 (10 mL)를 첨가하였다. 유기층은 브라인을 사용하여 세척한 후, 건조하고, 진공 내에서 농축하였다. 잔여물은 용리액 Hept/EtOAc 교반물 : 3/2를 사용한 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정화하였다. 목적생성물을 하얀색의 고체 형태 (6a)(142 mg, 70%, Mp 96℃)로 얻었다.
Figure pct00030

D-2) N-(N-(3-(4- 벤조일벤즈아미도 )-4- 메틸페닐 ) 카바미미도일 )-3,4,5- 트리메 톡시벤즈아마이드 하이드로클로라이드 (7a)의 제조
Figure pct00031
AcOH (1 mL)와 농축된 HCl (0.5 mL) 교반물에 용해된 Boc-구아니딘 (6a)(85 mg, 0.127 mmol) 용액을 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 반응 교반물을 진공 내에서 농축하고, Et2O를 가한 후, 다시 농축하여 목적화합물을 하얀색의 고체 형태 (7a)(72 m, 94 %, MP 138℃)로 얻었다.
Figure pct00032

D-3) tert -부틸 (3-(9H- 플루오렌 -2- 카복시아미도 )-4- 메틸페닐아미노 )(3,4,5-트리메톡시벤즈아미도) 메틸렌카바메이트 (6b)의 제조
Figure pct00033
CH2Cl2 (10 mL)에 용해된 Boc-구아니딘 (5)(137 mg, 0.3 mmpl) 및 트리에틸아민 (0.05 mL, 0.36 mmol)의 용액에 CH2Cl2 (3 mL)에 용해된 산 염화물 (1b)(82 mg, 0.3 mmol)을 방울 단위로 첨가하였다. 상기 교반물을 하룻밤 동안 교반한 후, 물 (5 mL)과 CH2Cl2 (10 mL)를 첨가하였다. 유기층은 브라인으로 세척하고, 건조한 후, 진공 내에서 농축하였다. 오일 형태의 잔여물은 용리액 Hept/Et2O 교반물 : 3/2을 사용한 칼럼 크로마토그래피를 통해 정화하여 목적 생성물 (6b)(109 mg, 56%)을 얻었다.
Figure pct00034

D-4) N-(2- 메틸 -5-(3-(3,4,5- 트리메톡시벤조일 ) 구아니디노 ) 페닐 )-9H- 플루오 렌-2- 카복시아마이드 하이드로클로라이드(7b)의 제조
Figure pct00035
Boc (6b)(100 mg, 0.154 mmol) 화합물을 AcOH(1.1 mL) 및 농축된 HCl(0.55 mL)의 교반물에 용해시킨 후, 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매는 진공 내에서 증발시켰고, 고체 잔여물에 Et2O를 가한 후, 필터하여 목적생성물은 흰색 고체 형태로 얻었다 (7b)(72 mg, 80%, Mp 241℃).
Figure pct00036

D-5) tert -부틸 (4- 메틸 -3-(4-(3- 페닐프로필 ) 벤즈아미도 ) 페닐아미노 )(3,4,5-트리메톡시벤즈아미도) 메틸렌카바메이트 )(6c)의 제조
Figure pct00037
CH2Cl2 (3 mL)에 용해된 산 염화물 (1c)(73 mg, 0.3 mmol) 용액을 상온에서CH2Cl2 (10 mL)에 용해된 Boc-구아니딘 (5)(137 mg, 0.3 mmol) 및 트리에틸아민 (0.1 mL, 0.66 mmol) 용액에 첨가한 후, 상기 반응 교반물을 하룻밤 동안 방치하였다. 물 (8 mL)와 CH2Cl2 (10 mL)를 첨가하였다. 유기층은 포화 NaCl 용액으로 세척하였다. 유기층을 건조하고, 진공 내에서 농축하였다. 잔여물은 용리액 EtOAc/Hept 교반물 : 2/3을 사용한 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정화하였다. 목적생성물을 흰색 고체 형태 (6c)(132 mg, 65%)로 얻었다.
Figure pct00038

D-6) 3,4,5- 트리메톡시 -N-(N-(4- 메틸 -3-(4-(3- 페닐프로필 ) 벤즈아미도 ) 페닐 )카바미미도일) 벤즈아마이드 하이드로클로라이드 (7c)의 제조
Figure pct00039
AcOH (1.5 mL) 및 농축된 HCl (0.75 mL) 교반물 내에 용해되어있는 Boc (6c)(116 mg, 0.17 mmol) 화합물 용액을 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔여물에 Et2O를 취하였다(taken up). 목적생성물을 흰색 고체 형태(80 mg, 82%, Mp 132℃)로 얻었다.
Figure pct00040

D-7 : tert -부틸 (4- 메틸 -3-(4- 페네틸벤즈아미도 ) 페닐아미노 )(3,4,5- 트리메 톡시벤즈아미도) 메틸렌카바메이트 (6d)의 제조
Figure pct00041
CH2Cl2 (3 mL)에 용해된 산 염화물 (1e)(73 mg, 0.3 mmol)을 상온에서 CH2Cl2 (10 mL)에 용해된 Boc-구아니딘 (5)(137 mg, 0.3 mmol) 및 트리에틸아민 (0.1 mL, 0.66 mmol) 용액에 첨가한 후, 하룻밤 동안 방치하였다. 물 (8 mL) 및 CH2Cl2 (10 mL)를 첨가하였다. 유기층을 포화 NaCl 용액으로 세척하였다. 유기층을 건조한 후, 진공 내에서 농축하였다. 잔여물은 용리액 EtOAc/Hept 교반물 : 1/4를 사용한 실리카 겔 칼럼을 통해 정화하였다. 목적생성물을 흰색 고체 형태 (6e)(142 mg, 70%)로 얻었다.
Figure pct00042

D-10) (E)-N-(N-(3-(4- 신나밀벤즈아미도 )-4- 메틸페닐 ) 카바미미도일 )-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드 하이드로클로라이드(7e)의 제조
Figure pct00043
AcOH (1.5 mL) 및 농축된 HCl (0.75 mL) 교반물에 용해된 Boc (6e)(122 mg, 0.15 mmol) 화합물 용액을 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔여물에 Et2O를 취하였다(taken up). 목적생성물을 흰색 고체 형태 (7e)(101 mg, 91%, Mp 127℃)로 얻었다.
Figure pct00044

D-11) tert -부틸 (4- 메틸 -3-(4- 스티릴벤즈아미도 ) 페닐아미노 )(3,4,5- 트리메 톡시벤즈아미도) 메틸렌카바메이트 (6f)의 제조
Figure pct00045
CH2Cl2 (3 mL)에 용해된 산 염화물 (1f) 용액을 CH2Cl2 (10 mL)에 용해된 Boc 구아니딘 (5)(137 mg, 0.3 mmol) 및 트리에틸아민 (0.1 mL, 0.66 mmol) 용액에 첨가한 후, 하룻밤 동안 방치하였다. 물 (10 mL) 및 CH2Cl2 (15mL)를 첨가하였다. 유기층은 디켄트(decanted)한 후, NaCl(H2O 내 포화) 용액을 사용하여 세척하고, 건조한 후, 증발시키고, 용리액 EtOAc/Hept 교반물 : 3/7을 사용한 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정화하여 목적생성물을 흰색 고체 형태 (6f)(130 mg, 65%, Mp 166℃)로 얻었다.
Figure pct00046

D-12) N-(N-(3-(4- 벤질벤즈아미도 )-4- 메틸페닐 ) 카바미미도일 )-3,4,5- 트리메 톡시벤즈아마이드 하이드로클로라이드(7f)의 제조
Figure pct00047
AcOH (3mL) 및 농축된 HCl (1.5 mL) 교반물에 용해된 Boc (6f)(120 mg, 0.18 mmol) 화합물 용액을 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔여물에 Et2O를 가하여 목적생성물 (70 mg, 70%, Mp 221℃)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
Figure pct00048

D-13) tert -부틸 (3-(4- 벤질벤즈아미도 )-4- 메틸페닐아미노 )(3,4,5- 트리메톡시벤즈아미도 ) 메틸렌카바메이트 (6g)의 제조
Figure pct00049
CH2Cl2 (3 mL)에 용해된 산 염화물 (1g)(73 mg, 0.3 mmol)을 상온에서 CH2Cl2 (10 mL)에 용해된 Boc-구아니딘 (5)(137 mg, 0.3 mmol) 및 트리에틸아민 (0.1 mL, 0.66 mmol) 용액에 첨가한 후, 하룻밤 동안 방치하였다. 물 (8 mL) 및 CH2Cl2 (10 mL)를 첨가하였다. 유기층은 포화 NaCl 용액을 사용하여 세척하고, 건조한 후, 진공 내에서 농축하였다. 잔여물은 용리액 EtOAc/Hept 교반물 : 1/8을 사용한 실리카 겔 칼럼을 사용하여 정화하였다. 목적생성물 (6g)(144mg, 71%, Mp 105℃)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
Figure pct00050

D-14) N-(N-(3-(4- 벤질벤즈아미도 )-4- 메틸페닐 ) 카바미미도일 )-3,4,5- 트리메톡시벤즈아마이드 하이드로클로라이드(7g)의 제조
Figure pct00051
AcOH (1.5 mL) 및 농축된 HCl (0.75 mL)의 교반물에 용해되어 있는 Boc (7e)(103 mg, 0.15 mmol) 화합물 용액을 4시간 동안 상온에서 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔여물에 Et2O를 취하였다(taken up). 목적생성물 (7g)(85 mg, 90%, Mp 112℃)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
Figure pct00052

D-15) tert -부틸 (3-(4-( 벤질옥시 ) 벤즈아미도 )-4- 메틸페닐아미노 )(3,4,5- 트리메톡시벤즈아미도 ) 메틸렌카바메이트 (6h)의 제조
Figure pct00053
상온에서 CH2Cl2 (3 mL)에 용해된 산 염화물 (1h)(73 mg, 0.3 mmol) 용액을 CH2Cl2 (10 mL)에 용해된 Boc-구아니딘 (5)(137 mg, 0.3 mmol) 및 트리에틸아민 (0.1 mL, 0.66 mmol) 용액에 첨가하였다. 상기 교반물을 하룻밤 동안 방치하였다. 물 (8 mL) 및 CH2Cl2 (10 mL)을 첨가하였다. 유기층은 포화 NaCl 용액을 사용하여 세척하고, 건조한 후, 진공 내에서 농축하였다. 잔여물은 용리액 EtOAc/Hept 교반물 : 1/4를 사용한 실리카 겔 칼럼을 사용하여 정화하였다. 목적생성물 (6h)(103 mg, 68%, Mp 94℃)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
D-16) N-(N-(3-(4-( 벤질옥시 ) 벤즈아미도 )-4- 메틸페닐 ) 카바미미도일 )-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드 하이드로클로라이드(7h)의 제조
Figure pct00054
AcOH (1.5 mL) 및 농축된 HCl (0.75 mL)의 교반물에 용해된 Boc (6h)(116 mg, 0.18 mmol) 화합물 용액을 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔여물에 Et2O를 취하였다(taken up). 목적생성물 (7h)(80 mg, 82%, Mp 192℃)을 흰색 고체 형태로 얻었다.
Figure pct00055

E/ 화학식 1의 화합물의 표지화( Radiolabeling )
E-1) 화합물 (7f)를 화합물 (7d)로의 수소화( Hydrogenation )
Figure pct00056
MeOH에 용해된 염화수소산 염 (5 mg, 0.08 mmol) 형태의 화합물 (7f) 및 Pd/C (10%) 용액을 수소 내 (balloon) 4시간 동안 교반하였다. 상기 교반물을 필터하고, 진공 내에서 농축하여 화합물 (7d)를 염화수소산 염 형태로 얻었다.
Figure pct00057

E-2) 화합물 (7f)를 화합물 3 H-(7d)로 삼중 수소화( Tritiation )
Figure pct00058
5-mL 벌룬 플라스크(balloon flask)에 들어있는 화합물 (7f)(2.5 mg, 0.05 mmol) 를 MeOH (1 mL)에 용해시키고, 냉각하였다(액체 질소). 촉매 (Pd/C 10%)를 표면에 분산시켰다. 플라스크 내 진공 환경이 만들어지면, 트리튬 가스(tritium gas)를 압력이 30 psi에 도달할 때까지 주입하였다. 상기 반응 교반물을 3시간 동안 교반하였다. 촉매를 필터하고, 과량의 트리튬은 진공 내에서 MeOH와 함께 진공처리하였다. 화합물 (7d)를 별도의 정화과정 없이 얻었다.
화합물 [3H]-(7d)의 특성( Characteristics ):
- 순도: > 98% (HPLC)
- 비방사능(Specific activity) : 38.1 Ci/mmol (1.41 TBq/mmol)
- 농도 : 1.0 mCi/ml (37 MBq/ml)
색층 분석 데이터( Chromatographic data ):
- HPLC 칼럼 : Macherey + Nagel Nucleodur Gravit)'C8, (5 flm), 4.6 x 150 mm
- 이동상 : A : 물 0.05% TFA; B : MeCN 0.05% TFA
- 변화도(gradient) : 0 min 30% B; 10 min 95% B; 14 min 95% B; 14 min 95% B; 14.5 min 30%
- 흐름(flow) : 1.0 ml/min
- 샘플 : 메탄올 내 1.30 mCi/ml (48.1 MBq/ml)
- 주입 : 5.0 ul (6.5 uCi, 240 KBq)
- UV 탐지 : 254 nm
- 온도 : 30℃
- 방사-탐지기(Radio-detector) : Berthold LB 513
- 칵테일(Cocktail) : Zinsser Quichsz int Flow 302
- 흐름(flow) : 2.0 mL/min
- 저장 시간(retention time) : 7.17 min (UV); 7.30 min (방사-탐지기)(두 저장시간의 차이는 두 개의 탐지기를 시리즈로 설치하였기 때문이다)
EXAMPLE 2 : 화학식 1의 화합물의 헤지호그 단백질( hedgehog protein)에서의 신호 전달경로 및 Smo 수용체( Smoothened receptor )에서의 고정( fixation )의 조절 효과( modulating effect ) 평가
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 헤지호그 단백질에서의 신호 전달경로 억제효과는 합성 활성화제:SAG를 사용하여 다능성의 섬유아세포인 C3H10T1/2 세포의 경로를 활성화시킨 후, 상기 세포 라인의 차이점을 분석하는 생체 외(in vitro) 실험에 의하여 확인하였다. 화합물 X의 활성 또한 소뇌과립세포(cerebellar granule cells) 초기배양의 성장으로부터 평가하였다. 마지막에 언급한 이 화합물의 쥐 Smo 수용체(Smoothened receptor)에 대한 결합 능력은, Chen et al., Genes Dev., 2002, 16, 2743.에서 서술한 대로 수용체의 막관통영역(transmembrane domains)에 결합하는 사이클로파민으로부터 유도된 형광성의 화합물인 신체-사이클로파민(body-cyclopamine)과 경쟁시킴으로서 평가하였다.
1- 물질( Material ) 및 방법
C3H10T1 /2 세포에서, 화학식 1의 화합물의 헤지호그 전달경로의 억제
화학식 1의 화합물을 디메틸설폭사이드에 농도가 10 mM이 될 때까지 용해한 후, 사용되기 전까지 -20℃의 온도에서 보관하였다.
C3H10T1/2 다능성 섬유아세포(ATCC) 라인은 ATCC에서 추천한 환경에서 배양하였다. 이러한 세포들은 Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 14071 및 Frank-Kamenetsky et al., J. Biol., 2002, 1, 10에서 서술한 방법대로 SAG 0.1 uM을 사용하여 활성화하였다.
SAG의 활성화는 세포 라인의 차이를 유발하고, 알칼리 인산염(AP)을 발현하게끔 허용한다. 따라서, 알칼리 인산염(AP)의 활성화를 경유하여 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 활성화를 측정하는 것이 가능하다.
C3H10T1/2 세포는 시험 화합물을 1 nM 내지 30 uM의 다양한 농도로 첨가하기 24시간 전에 96-웰 플레이트에 시드(seeded)하며, 0.1 uM의 SAG 존재 분위기에서, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)과 10% 태아 송아지혈청(fetal calf serum)을 배지로서 사용하였다. 시험은 4번 수행되었다. 이후, 플레이트는 5% CO2 환경에서 37℃의 온도로 5 내지 6일 동안 배양하였다. 이후, 세포는 차가운 인산염 버퍼("인산염 버퍼 혈청":PBS)로 세척한 후, 0.9%의 NaCl 및 0.2%의 Triton X-100을 포함하는 50 uL의 용액에 4℃에서 소니케이션(sonication)하여 용해하였다.
비교를 위하여, 헤지호그 단백질 신호 전달경로의 다른 알려진 억제제를 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 다양한 화합물을 시험하기 위하여 사용하였던 동일한 환경에서 시험하였다:
- Incardona et al., Development, 1998, 125, 3553에서 서술한, 하기 화학식에 해당하는 사이클로파민:
Figure pct00059
- 위에 서술한 MRT-83, 및
- Pan and Dorsch; ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1: 130-134에서 서술한, 하기 화학식에 해당하는 LDE225:
Figure pct00060
이와같이 얻은 용해물에서의 알칼리 인산염(AP) 활성 측정은 Pepinsky et al. (J. Biol. Chem., 1998, 273, 14037)에서 서술한 방법에 따라 수행하였다. 100 uL의 반응 버퍼(200 mM Tris-HCl; pH 10.5; 0.4 M의 2-아미노-2-메틸프로판올 및 8 mM의 MgCl2) 및 50 uL의 기질(Substrate)(4 mM의 p-나이트로페닐 다이소듐 포스페이트)를 첨가한 후, 용해물을 30-60분 동안 37℃에서 배양한 후, 흡광도를 415 nm 파장에서 읽었다.
소뇌과립세포( cerebellar granule cells ) 전구물질의 확산에서의 화학식 1의 화합물의 활성
생후 8일 (P8)된, 랫트(IFFA- CREDO, France)의 소뇌로부터 과립세포 프리커서(GCP)를 분리하였다. 소뇌를 취한 후, 작은 조각으로 자르고, Krebs-Ringer 버퍼(120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 15 mM 글루코스, 0.04 mM 페놀 레드)에 위치한 후, 250 mg/ml의 트립신 (Sigma, France)이 첨가된 Krebs-Ringer로 구성된 분리 버퍼(dissociation buffer)에 상온에서 15분 동안 배양하였다. 효소의 분리(Enzymatic dissociation)는 250 mg/ml의 트립신 억제제와 80 mg/ml의 DNase(Sigma, France)를 함유하는 Krebs-Ringer 버퍼를 동일한 양을 첨가하여 종결하였다. 조직은 100g으로 10초 동안 원심분리하고, 얻어진 펠렛(pellet)을 재부유(resuspended)한 후, 외경 축소용 Pasteur 피펫을 사용하여 분말화(triturated)하여 격리된 세포(isolated cell)의 현탁액(suspension)을 얻었다. 이 현탁액 200g을 5분 동안 원심분리하여 얻어진 펠렛(pellet)을 1mM의 피루빈산, 2mM의 L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 1%의 N2 보충물, 60 mg/ml의 N-아세틸시스테인 및 100 mg/ml의 소혈청알부민(bovine serum albumin)(BSA, Sigma, France)와 함께 Neurobasal 배지 첨가제에서 재부유(resuspended)하였다.
GCPs를 가진 소뇌를 사전에 폴리-D-라이신으로 처리된 96-웰 플레이트에 2.105 세포/웰의 밀도로 이동하였다. 다른 시험 화합물의 존재 또는 부재인 SAG를 즉시 첨가하였다. 배양이 종료되기 12시간 전에, 트리티에이티드 티아민(tritiated thymidine)(3H-thymidine)을 첨가하였다. 세포를 자동화 세포 콜렉터 (Brandel, USA)를 사용하는 유리 섬유 필터 (GF/C)에서 흡기(aspirated) 및 회수하였다. 세포에 의하여 포함된 방사능성 양을 액체 섬광 계수기 (Wallac, USA) 내 발광시료(scintillating agent)의 존재 분위기에서 나타내었다.
Bodipy - cyclopamine ( BC )과 화학식 1의 화합물의 경쟁:
인간 Smo 수용체로 안전하게 형질전환된 HEK293 라인의 세포를 사용하였다. 실험은 Roudaut et al., Mol. Pharmacol. 79: 453-460, 2011에서 서술한 프로토콜에 따라 실시하였다. 화학식 1의 화합물로 인한 Bodipy-cyclopamine(BC)의 결합 억제는 형광 사진(fluorescence photographed)의 감소로 측정하였고, PCI 6.2 소프트웨어 (Hamamatsu Corporation)를 사용하여 양을 나타내었으며, 그 다음에 사진에서 세포핵이 존재하는 표면 면적을 보았다.
트리티에이티드 화합물 3H-(7d)의 방사-결합( radio - binding ) 시험
결합 시험은 Smo 수용체(Smoothened receptor)로 농축한 세포막에서 실행하였다. 이들의 세포막을 준비하기 위하여 HEK-hSmo 라인의 세포를 사용하였다. 세포들을 냉각된 PBS 내에서 세척 및 회수하였다. 100g을 4℃에서 7분 동안 원심분리한 후, 버퍼 ml당 프로테아제억제인자(protease inhibitor)(PEAK, Sigma)의 칵테일(cocktail) 10 μl를 첨가한 냉각된 퍼버 A (50 mM HEPES, pH 7.4, 1mM EDTA)의 부피로 팰렛을 10번 취하고(taken up), 폴리트론 분쇄롤(Polytron grinding mill)을 사용하여 균질화 하였다. 세포로부터 세포핵을 제거하는 것이 가능하게끔 하기 위하여 500g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리 한 후, 상청액(supernatant)을 다시 48000g에서 45분 동안 4℃에서 원심분리 하였다. 팰렛을 PEAK가 첨가된 2 ml의 버퍼 A에서 취한 후(taken up), 현탁액을 유리 코니컬 분쇄롤(glass conical grinding mill)을 사용하여 균질화하고, 23 G 침(needle)을 통과하였다. 최종적으로, 부분 표본(aliquots)를 에펜돌프 튜브(eppendorf tube)에 위치시킨 후, -80℃에서 저장하였다. 준비한 모든 단백질의 농도는 표준 범위를 준비하기 위한 BSA를 사용한 Lowry's 방법에 의하여 결정하였다. 이 농도는 10.9 mg/ml이다.
세포막은 0.2%의 BSA를 함유하는 버퍼 (50 mM HEPES 및 3 mM MgCl2)에서 재부유하였다. 3H-(7d)의 결합 시험을 폴리프로필렌 튜브에서 실행하였다. 세포막 (2μg의 단백질)을 차가운 시험 화합물의 존재 또는 부재 내에서 3H-(7d)와 함께 최종 부피가 400μl가 되게끔 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. 튜브를 냉각된 물에 가라앉힘으로써 배양을 멈춘 후, 여과막에서 3H-(7d)의 비특이성의 결합(nonspecific binding)을 감소시킬 수 있게끔, 사전에 0.3%의 폴리에틸렌이민으로 처리한 유리 섬유 필터 막 (GF/C)를 통해 빠르게 필터(Brandel)하였다. 액체 섬광 계수기 내에 3ml의 발광시료(scintillating agent)의 존재 분위기에서 필터에 남은 방사능(radioactivity)을 측정하였다. 특이적 결합은 Romer et al., Cancer Cell, 2004, 6, 229에서 서술한 대로 1μM의 GDC-0449에 의하여 억제될 수 있는 결합으로 정의되며 하기 화학식에 해당한다:
Figure pct00061

2- 화학식 1의 화합물의 생물학적 활성 결과
C3H10T1 /2 세포에서 화학식 1의 화합물에 의한 헤지호그 ( Hedgehog ) 전달경로의 억제
화학식 1의 화합물 및 기준 화합물(reference compound) 사이클로파민(Cyclopamine), LDE225 및 MRT-83가 가진 결과값을 하기 표 1에 나타내었다. 각 화합물에 대하여, 알칼리성 인산가수 분해효소(alkaline phosphatase) (AP)의 활성을 50% 억제(IC50)할 수 있는 농도를 0.1 μM에서 SAG에 의하여 유도한 후 표시하였다. 화합물 (7d) 및 기준 화합물(reference compound)이 가진 억제 커브를 그림. 1A에 나타내었다.
표 1 : C3H10T1 /2 세포의 분화( defferentiation )에서 화합물의 활성
Figure pct00062
* : 기준 화합물(reference compound)은 발명의 일부를 이루지 않음
또한, 화합물 (7d)의 활성을 화합물 MRT-10 및 다양한 싸이오요소(thiourea) 화합물들 (하기 화합물들 20-27)과 비교하였다. 그 결과는 표 2에 요약하였다.
Figure pct00063

표 2 : C3H10T1 /2 세포의 분화( defferentiation )에서 화합물들 (7d), MRT -10 및 싸이오요소 ( thiourea ) 화합물들의 활성 비교
Figure pct00064

SAG 에 의하여 유도된 쥐 소뇌의 과립 세포 전구체( granule cell precursors )의 증식으로 선택되는 분자의 관련성 선택:
소뇌 PCGs는 Shh 신호 전달경로의 활성화에 반응하여 증식하며, 반응은 Smo 길항제 (Rohatgi et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 106: 3196-201)에 의하여 억제될 수 있다. 우리는 따라서 증식 과정 도중 합성되는 새로운 DNA의 마커(marker)인 트리티에이티드 티아민(tritiated thymidine)의 혼입(incorporation)을 측정함으로써 1차 배양 내에 쥐 소뇌의 PCGs의 증식을 억제하는 화합물 (7d)의 능력을 분석하였다. SAG의 농도 증가는 트리티에이티드 티아민(tritiated thymidine) 위에 기준치(above baseline)의 혼입(incorporation)에서 복용-의존 증가를 유발하였다. 화합물 (7d)는 SAG (0.01μM)에 의하여 유도된 PCGs의 증식에서, IC50가 0.45 nM로의 완벽한 길항제로서의 특성을 내보였다. LDE225, 화합물 MRT-83 및 사이클로파민(Cyclopamine) 또한 이러한 증식을 방해하였지만, 그러나 그들의 IC50가 각각 3, 6, 및 103 nM로 약한 관련성(affinity)을 보였다.
Smo 수용체(Smoothened receptor)에 대한 Bodipy - cyclopamine ( BC )의 결합으로 선택되는 분자의 관련성 선택:
Smo에 화합물 (7d)의 결합 특성을 연구하기 위하여, 우리는 이 분자가 이러한 막관통영역(transmembrane domain)의 수준에서 Smo와 상호작용 하는 Bodipy-cyclopamine(BC) (b)의 결합과 경쟁할 수 있는지 없는지를 분석하였다. 세포들은 2시간 동안 다른 농도의 화합물 (7d), MRT-83, LDE225 및 사이클로파민(Cyclopamine)의 존재 또는 부재에서, BC (5 nM)와 함께 배양하였다. 배양을 종료할 때, 세포들을 고정하고, DNA에 높은 친화성이 있는 형광 분자(fluorescent molecule)로, 형광 현미경(fluorescence microscopy)에서 세포핵을 파란색으로 가시화(visualize)가 가능하게끔 하는 DAPI를 가하였다(stained). 시험된 4개의 분자는, 복용-의존 방식으로, 안전하게 인간 Smo 수용체를 발현하는 HEK-hSmo 세포에 BC가 결합하는 것을 방해하였다. 화합물 (7d) 및 MRT-83의 친화성은 배우 비슷하며 높게 남은 것으로 관찰되었다(그림. 1C). 모든 이러한 데이터는 화합물 (7d)가 인간 및 쥐의 Smo 수용체에 대한 강력한 길항제임을 증명하였다(표 1).
표 3 : 화합물 (7d), MRT -83, LDE225 , GDC -0449 및 사이클로파민( Cyclopamine )의 활성 비교
Figure pct00065
IC50 값은 Shh-Light2 세포 (1) 내 ShhN (4 nM)에 의하여 유도된 Gli-luciferase 리포터의 활성, SAG (0.1 μM) (2)에 의하여 유도된 C3H10T1/2 세포의 분화와 관련되는 알칼리성 인산가수 분해효소(alkaline phosphatase) (AP)의 활성 , SAG (0.01 μM)에 뒤이은 3H-티아민(thymidine) (3)의 혼입(incorporation)에 의하여 유도되는 쥐 소뇌의 PCGs의 증식 활성, 및 Bodipy-cyclopamine(BC)가 HEK-hSmo 세포 (4)(그림. 1의 곡선에 따라)에서 발현되는 인간 Smo 수용체에의 결합을 측정함으로써 평가하였다.
모든 실험은 생체 외(in vitro)에서 Shh 전달경로의 조절을 위한 화학식 1의 화합물의 능력에 하이라이트를 두고 실행하였다. 그들의 활성은 Bodipy-cyclopamine(BC)의 경쟁 자리에서 Smo 단백질(Smoothened protein)에 결합으로부터 설명된다.
3- 방사리간드 ( radioligand ) 3 H-(7d)의 결합 특성 결과
인간 Smo 수용체(Smoothened receptor)와 함께 방사리간드 ( radioligand ) 3 H-(7d)의 동역학( Kinetics ) 관련성
화합물 (7d)는 Hh 신호 전달경로에 아주 강력한 길항제로, 이 분자의 트리티에이티드 형태(tritiated form)를 합성하도록 우리를 격려하였다 : 화합물 3H-(7d). 우리는 화합물 3H-(7d)과 인간 Smo 수용체 (HEK-hSmo)를 안전하게 발현하는 HEK293 세포의 세포막에서의 세포분쇄액(homogenate)의 동역학 관련성을 연구함으로써 이 방사리간드의 특성을 특징짓기 시작하였다. 화합물 3H-(7d)의 관련성을 방사활성 리간드 (0.35 nM)의 고정된 농도 및 수용체 (2μg의 단백질)의 고정된 양의 존재 하 25℃ 및 37℃에서 5시간 동안 스크리닝(screening)하였다. 이 실험에서, 화합물 3H-(7d)가 평형 상태에 도달하는, 특정 결합을 위하여 걸리는 시간을 결정하는 것이 궁금증이다. 25℃에서, 배양한 지 5시간 후, 평형에 도달하지 않았다. 37℃에서, 배양한 지 3시간 후에 평형에 도달하였으며, 평형은 배양 5시간 후까지 유지되었다(그림. 2). 배양 5분 후, 화합물 3H-(7d)의 비특정 결합(0.1 μM의 GDC0449의 존재로 정의)은 낮았으며(전체 결합의 0.4%), 실험 내내 안전하게 남아있었다.
HEK-hSmo 세포 (2μg의 단백질)의 세포막은 0.35 nM의 3H-(7d)와 함께 HEPES 버퍼 (0.2% BSA)의 최종 부피 0.4 ml에서 5시간 동안 25℃(파랑) 또는 37℃(분홍)에서 배양하였다. 비특정 결합을 기준 Smo 길항제인, 1μM의 GDC-0449의 존재 분위기에서 표시하였다. GraphPad Prism에 의한 특정 결합의 분석은 37℃에서 33분 및 25℃에서 71분의 반-관련성(half-association) 시간을 주었다. 데이터는 3중의(triplicates) 평균값±SEM이다(대표 실험, n=2).
인간 Smo 수용체(Smoothened receptor)에 화합물 3H-(7d)의 결합 포화 실험
3H-(7d) 화합물의 특성은 HEK-hSmo 라인 세포의 세포막에서 발현되는 Smo 수용체에 대한 결합 포화도를 연구함으로써 특징지어졌다. 고정된 양의 수용체 (2μg의 단백질)와 함께 방사활성 리간드의 농도를 증가시키며 배양하는 동안에 평형상태에서 특정 결합을 측정하는 것이 궁금증이다. 3H-(7d) 화합물이, 1μM의 GDC-0449이 사용되어 지도록 정의된, HEK-hSmo 세포의 세포막에서 발현되는 Smo 수용체에 대한 특정결합의 포화도는 그림. 3A에 설명되어져 있다. 커브의 분석은 단일 결합 위치에 높은 친화성을 가지는 것으로 나타났다: 스캐챠드 표현(Scatchard representation)에 의하여 Kd = 0.3 ± 0.1 nM 및 Bmax = 1086 ± 91 cpm로 그려졌다(그림. 3B).
화합물 3H-(7d)가 정말 Smo 수용체에 특정하게 결합하는지 확신하기 위하여, 인간 Smo 수용체를 위한 cDNA 코딩(coding)으로 감염되지 않은 HEK293 세포의 세포막과 함께 포화 실험을 실행하였다. GDC-0449 (1μM)는 화합물 3H-(7d)가 이러한 세포막에 결합하는데 아무런 영향이 없었다. 따라서, 화합물 3H-(7d)가 HEK-hSmo 세포의 세포막에 결합하는 것은 Smo 수용체에 정말 특정한 것이다.
화합물 3 H-(7d)의 인간 Smo 수용체(Smoothened receptor)에 대한 약학적 분석
화합물 3H-(7d)의 HEK-hSmo 라인 세포의 세포막에서 발현되는 Smo 수용체에 대한 약리학적 결합은 Smo의 길항제 또는 증진제의 존재 분위기에서 분석하였다. 이 실험에서, 수용체에 결합하기 위한, 방사활성 리간드와 함께 경쟁하는 차가운 리간드 및 수용체를 위한 각 차가운 리간드의 친화성(Ki)은 억제 커브로부터 추정된 IC50 값에 근거하여 분석하였다. 차가운 화합물 (7d)은 화합물 3H-(7d)가 Smo (IC50 = 1.5 nM)에 결합하는 것을 가장 강력하게 억제한다. 화합물 LDE225, GDC-0449 및 MRT-83이 갖는 IC50 값은 각각 4nM, 12nM 및 11nM이다. GDC-0449는 1μM의 농도에서 화합물 3H-(7d)의 특정 결합을 전적으로 억제하였다. 비특정 결합은 1μM의 GDC-0449 존재 분위기에서의 각 실험에서 정의되었다.
사이클로파민(Cyclopamine) 및 화합물 Cur61414는 또한 화합물 3H-(7d)의 결합 억제가 가능하다. 하지만, 매우 낮은 친화성을 가지며, 특히 Cur61414는 마이크로몰의 오더(micromolar order)인 IC50 값을 가진다(그림. 4). 증진제에 대하여, SAG는 나노몰의 오더(nanomolar order)인 친화성을 내보이는 반면, 퍼모프아민(purmorphamine)은 비활성이다(IC50 > 1000)(그림. 5). 화합물들에 대하여 계산된 Ki 값을 표 3에 기재하였다.
표 4 : 인간 Smo 수용체(Smoothened receptor)에 대하여 화합물 3 H-(7d)의 결합에 관한 기준 분자( reference molecule )의 친화성
Figure pct00066
IC50 및 Ki 값은 화합물 3H-(7d)가 HEK-hSmo 라인의 세포에서 발현되는 인간 Smo 수용체에 결합하는 것을 측정함으로써 평가하였다. 데이터는 2-3 대표 실험의 평균값±SEM이다.

Claims (24)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pct00067

    (상기 화학식 1에서,
    R1, R2 및 R3는 동일하거나 또는 상이하고, 서로 독립적으로 수소, 또는 할로겐 원자, 히드록시 라디칼, 알킬, 퍼플루오로알킬(perfluoroalkyl), 알콕시, 알킬싸이오, 또는 나이트릴기이고;
    X는 O, S 또는 NH이고;
    R4 및 R7은 동일하거나 또는 상이하고, 서로 독립적으로 수소, 또는 할로겐 원자, 또는 알킬기이고;
    R5는 하기 군으로부터 선택되는 하나이고:
    Figure pct00068
    ,
    Figure pct00069
    ,
    Figure pct00070
    ,
    Figure pct00071
    ,
    Figure pct00072
    ,
    Figure pct00073
    ,
    Figure pct00074
    ,
    Figure pct00075

    적어도 하나의 라디칼이 치환된 R6는 할로겐 원자 또는 알킬, 알콕시, 아미노알킬, 싸이오알킬 또는 히드록시기이다).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1, R2 및 R3는 알콕시 라디칼이고, 바람직하게는 메톡시 라디칼인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 X는 NH인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 R4 및 R7은 수소 또는 염소 원자, 메틸, 에틸 또는 이소프로필기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 R6는 할로겐 원자 또는 알콕시 또는 아미노알킬기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물:
    - 하기 화학식의 N-(N-(3-(4-벤조일벤즈아미도)-4-메틸페닐)카바미미도일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드 하이드로클로라이드:
    Figure pct00076


    - 하기 화학식의 N-(N-(3-(4-벤조일벤즈아미도)-4-메틸페닐)카바미미도일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드 하이드로클로라이드:
    Figure pct00077


    - 하기 화학식의 3,4,5-트리메톡시-N-(N-(4-메틸-3-(4-(3-페닐프로필)벤즈아미도)페닐)카바미미도일)벤즈아마이드:
    Figure pct00078


    - 하기 화학식의 3,4,5-트리메톡시-N-(N-(4-메틸-3-(4-페네틸벤즈아미도)페닐)카바미미도일)벤즈아마이드:
    Figure pct00079


    - 하기 화학식의 (E)-N-(N-(3-(4-신나밀벤즈아미도)-4-메틸페닐)카바미미도일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드 하이드로클로라이드:
    Figure pct00080


    - 하기 화학식의 N-(N-(3-(4-벤질벤즈아미도)-4-메틸페닐)카바미미도일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드 하이드로클로라이드:
    Figure pct00081


    - 하기 화학식의 N-(N-(3-(4-벤질벤즈아미도)-4-메틸페닐)카바미미도일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드:
    Figure pct00082


    - 하기 화학식의 N-(N-(3-(4-(벤질옥시)벤즈아미도)-4-메틸페닐)카바미미도일)-3,4,5-트리메톡시벤즈아마이드:
    Figure pct00083

  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    의약품으로서 적용하기 위한 화합물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 의약품으로서 적용하기 위한 화합물은 헤지호그(Hedgehog) 단백질 신호 전달경로의 과활성으로 인한 종양의 치료를 위한 화합물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 헤지호그(Hedgehog) 단백질 신호 전달경로의 과활성으로 인한 종양은 신경조직종양(수모세포종, 신경일차종양, 교아(세포)종, 수막종 및 핍돌기신경교종), 피부종양(기저세포암, 모낭상피종), 근육 및 골조직 종양(횡문근육종, 골육종) 또는 그 외의 조직 종양(신장, 방광, 전립샘, 폐, 위, 췌장)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 의약품으로서 적용하기 위한 화합물은 신경퇴행성 유형 장애의 치료를위한 화합물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 유형 장애는 파킨슨질환, 헌팅턴무도병, 알츠하이머질환, 다발성 경화증 또는 운동 뉴런 질환인 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 의약품으로서 적용하기 위한 화합물은 뇌신경발달(전전뇌증)과 관련된 질환, 희소돌기 아교세포(oligodendrocytes) 및 시반세포(schwann cells)의 질환뿐만 아니라, 뇌손상(cerebrovascular accident) 및 뇌졸중(cardiovascular accidents)의 치료를 위한 화합물.
  13. 제7항에 있어서,
    생체 외(in vitro)에서 인간 또는 동물 줄기세포의 재생(renewal) 조절(modulating)에 적용하기 위한 화합물.
  14. 제7항에 있어서,
    당뇨병의 치료를 위한 의약품으로 적용하기 위한 화합물.
  15. 유효성분으로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 화학식 1로 표시되는 화합물 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. Smo 수용체(Smoothened receptor) 또는 관련된 수용체와의 상호작용이 가능한 분자를 뚜렷이 동정하기 위한 조사 도구(research tools)로서 표지된 화학식 1의 화합물의 용도.
  17. 트리튬(tritium) 3H 분위기에서 화학식 1로 표시되는 화합물을 삼중 수소화(tritiating)하는 단계를 포함하고, 화학식 1로 표시되는 화합물에 에틸레닉 이중결합(ethylenic double bond)을 갖지 않는 R5 군이 치환되었을 경우, 화학식 1로 표시되는 화합물을 할로겐화하는 준비단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화학식 1로 표시되는 화합물을 방사성표지화(radiolabeling)하는 방법.

  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학식 1로 표시되는 화합물의 수소 원자들 중 적어도 어느 하나가 트리튬 원자 3H로 대체되고, 이것은 제17항의 방법에 따라 얻어질 수 있는 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 Smo 결합 위치(Smo binding site)의 리간드를 스크리닝 및/또는 동정하는 방법:
    a) 복합물 [Smo-화학식 1의 화합물]을 얻기 위하여, Smo 수용체(Smoothened receptor) 및 적어도 하나의 화학식 1로 표시되는 화합물의 접촉을 야기하는 단계;
    b) 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 시험 분자(test molecule)를 Smo 수용체(Smoothened receptor)와 접촉을 야기하는 단계;
    c) 복합물 [Smo-화학식 1의 화합물]과 단계 b)에서 회복된 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 비교함으로써, 상기 Smo 수용체(Smoothened receptor) 및 상기 시험 분자(test molecule) 사이의 상호작용을 검출하는 단계; 및
    d) Smo 수용체(Smoothened receptor)와 상호작용이 측정된 상기 시험 분자(test molecule)를 선택하는 단계.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 단계 a)는 용액 상(liquid phase)에서 수행되는 것과, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리간드를 스크리닝 및/또는 동정하는 방법:
    a) 복합물 [Smo-화학식 1의 화합물]을 얻기 위하여, Smo 수용체(Smoothened receptor) 및 적어도 하나의 화학식 1로 표시되는 화합물의 접촉을 야기하는 단계;
    b) 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 시험 분자(test molecule)를 Smo 수용체(Smoothened receptor)와 접촉을 야기하는 단계;
    c) 하나 이상의 시험 분자(test molecule) 및/또는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 선택적으로 결합한 상기 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 회복하는 단계;
    d) 단계 c)에서 회복된 Smo 수용체(Smoothened receptor)와 복합물 [Smo-화학식 1의 화합물]을 비교함으로써 상기 Smo 수용체(Smoothened receptor) 및 상기 시험 분자 사이의 상호작용을 검출하는 단계; 및
    e) 상호작용이 측정된 상기 시험 분자(test molecule)를 선택하는 단계.
  21. 제19항 또는 제20항 중, 하나의 방법과 하기의 추가적인 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 증진제(agonist)를 확인하는 방법:
    - 세포와 접촉하여 Smo 수용체(Smoothened receptor)의 활성화에 따른 세포반응을 나타내는 것이 확인된 리간드를 준비하는 단계; 및
    - 상기 세포의 상기 세포반응을 유도할 수 있는 증진제 분자(agonist molecule)를 선택하는 단계.
  22. 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 Smo 수용체(Smoothened receptor)에 길항제(antagonist)인 분자를 동정하는 방법:
    a) Smo 수용체(Smoothened receptor)의 활성화에 따른 세포반응을 나타내는 세포를, 상기 세포반응을 유도하기 위한 적어도 하나의 화학식 1로 표시되는 화합물과 함께 배양하는 단계;
    b) 단계 a)의 마지막에 얻은 세포와 시험 분자(test molecule)의 접촉을 야기하는 단계;
    c) 상기 세포의 상기 세포 반응 억제를 유도하는 분자를 선택하는 단계.
  23. 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 Smo 수용체(Smoothened receptor)를 발현(expressing)하는, 종양 세포(tumor cells)와 같은 세포를 동정하는 방법:
    a) 표지된 화학식 1로 표시되는 화합물과 테스트할 세포의 접촉을 야기하는 단계;
    b) 테스트할 세포의 어떠한 수용체에도 결합하지 않은 상기 표지된 화학식 1로 표시되는 화합물을 제거하기 위하여 상기 세포를 세척하는 단계;
    c) 표지된 세포를 검출하는 단계.
  24. 적어도 하나의 기능성 Smo 수용체(functional Smoothened receptor) 및 적어도 하나의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트(Kit).
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