CN104159889B - 介导刺猬蛋白信号通路的新化合物、其标记的形式和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有下式(I)的新化合物；其作为药物的用途，特别是用于治疗与刺猬蛋白信号通路的超活化相关的肿瘤、用于治疗神经退行性疾病、用于治疗与脑发育有关的疾病(前脑无裂畸形)、用于干细胞监测、用于治疗脑血管意外和心血管意外、用于治疗涉及少突胶质细胞的疾病和涉及神经鞘细胞的疾病、用于应用其在体外调节人或动物干细胞更新和用于治疗糖尿病。本发明还涉及包含至少一种具有式(I)的化合物的药物组合物。本发明还涉及用于放射性标记具有式(I)的化合物的方法、标记的化合物以及所述化合物作为研究工具的用途。最后，本发明还涉及用于筛选和/或鉴定平滑受体(Smo)结合位点的配体、用于鉴定平滑受体的激动剂和拮抗剂的方法以及用于鉴定细胞的方法。

Description

介导刺猬蛋白信号通路的新化合物、其标记的形式和应用
本发明涉及新的式(I)化合物；其作为药物的用途，特别是用于治疗与刺猬蛋白信号通路(Hedgehog protein signalling pathway)的超活化相关的肿瘤、用于治疗神经退行性类型病症、用于治疗与脑发育相关的疾病(前脑无裂畸形(holoprosencephaly))、用于控制干细胞、用于治疗脑血管意外以及用于治疗心血管意外、以及用于治疗少突胶质细胞(oligodendrocytes)和许旺细胞(Schwann cells)的疾病、用于应用其在体外调节人或动物干细胞的更新以及用于治疗糖尿病。本发明还涉及药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的至少一种式(I)化合物。放射性标记式(I)化合物的方法、标记的化合物以及其作为研究工具的用途也构成本发明的一部分。最后，本发明还涉及筛选和/或鉴定平滑受体(Smoothened receptor)的Smo结合位点的配体、鉴定平滑受体的激动剂和拮抗剂的方法以及鉴定表达平滑受体的细胞如肿瘤细胞的方法。
刺猬信号传导分子(Hh)是分泌的自体溶解蛋白(autoproteolytic protein)，其激活刺猬蛋白信号通路，刺猬蛋白信号通路是在诸多组织的形态发生(特别是内胚层和胚轴的形成、脑以及毛囊的发育)过程中以及在细胞增殖的过程中起根本作用的信号通路，且被认为参与成体中的组织维持和修复(Ingham et al.,Genes Dev.,2001,15,3059-3087；Marti et al.,Trends Neurosci.,2002,25,89-96；Weschler et al.,Annu.Rev.Neurosci.,2001,24,385-428)。
最初在果蝇(Drosophila)中证实的刺猬蛋白和相关的转导通路在脊椎动物和无脊椎动物中是保守的。Hh的一个同源物存在于果蝇中，而Hh的三个同源物：索尼克(Sonic，Shh)、印第安(Indian，Ihh)和沙漠(Desert，Dhh)存在于哺乳动物中。在这三个同源物中，Shh由于在发育过程中显示出扩展的表达谱而受到最多的研究。Shh参与神经管的腹部化(ventralization)，指定沿着腹侧中线的几种神经元类型(脊髓的运动神经元、多巴胺能神经元和胆碱能神经元)的早期表型，并诱导少突胶质细胞前体细胞从腹侧脊髓开始生成。而且，Shh诱导GABA能(GABAergic)和多巴胺能神经元的存活，确定含血清素的前体细胞的未来方向，并阻止由毒素MPP引起的多巴胺能神经元的死亡。最后，其诱导出生后早期小脑中的颗粒细胞前体增殖。至于刺猬家族的其它成员，它们分别参与骨组织的发育(Ihh)、睾丸和周围神经的发育(Dhh)。而且用Shh得到的结果也适用于Dhh和Ihh。
以前体形式经过一系列翻译后修饰合成Shh，在该翻译后修饰期间蛋白质被存在于其C-端部分的酶活力裂解。这种自体溶解产生C-端片段(ShhC)和表示活性片段的N-端片段(ShhN)。在该反应期间，也观察到胆固醇分子在ShhN的C-端部分中的加成，这促使ShhN锚固至膜。最后，乙酰转移酶允许棕榈酸酯分子在N-末端附近的半胱氨酸残基上加成。这些事件产生生物活性Shh蛋白。该蛋白的分泌取决于派遣蛋白(Dispatched，Disp)，该蛋白的两种同种型Disp1和2存在于哺乳动物中(Heretsch et al.,2010,Bioorg.Med.Chem.Lett.18:6613-6624)。
可溶性ShhN片段经由含有两种跨膜蛋白的复合物传递其作用，这两种跨膜蛋白为：碎片蛋白(Patched，Ptc)，一种具有12个跨膜域的蛋白质，其具有转运蛋白类型的结构；和平滑蛋白(Smoothened，Smo)，一种与偶联至蛋白G的受体(RCPG)的超家族的成员同源的具有7个跨膜域的蛋白质。在哺乳动物中，存在碎片蛋白的第二种形式：Ptc2。
在不存在其配体Shh的情况下，Ptc抑制Smo。然后诱导细胞内级联，该细胞内级联涉及许多因子，包括蛋白质融合蛋白的抑制因子(SuFu)和PKA蛋白。SuFu是Shh信号通路的负调节剂，其可与Gli家族的三种转录因子结合并调节它们的激活。而且，Sufu的缺失导致该通路的激活。然后Gli家族的转录因子被磷酸化、泛素化，然后被蛋白酶体裂解成它们的负性形式(GliR)，GliR渗入到核中，并使转录失活。当Shh与Ptc结合时，后者对Smo施加的抑制随着Gli转录因子(GliA)的活性形式的核转位和靶基因如ptc和gli1的转录激活而出现。
蛋白质刺猬相互作用蛋白(Hedgehog interacting protein，Hip)能够以与蛋白质Ptc相当的亲和力结合Shh(Traiffort et al.,J.Neurochem.,2010,113:576-590)。Hip被认为是该通路的负调节剂，因为通过结合Shh，其减少了可用于通过Ptc激活信号通路的配体的量。Cdo和Boc属于具有III型免疫球蛋白和纤连蛋白基序的细胞表面蛋白家族。这些蛋白质通过促进配体Shh向Ptc的提呈、通过增加靶细胞附近的形态发生素的量以及可能通过影响Gli蛋白的活性而正调节Shh信号通路(Heretsch et al.,2010,Bioorg.Med.Chem.Lett18:6613-24:Scales and de Sauvage,2009,TrendsPharmacol.Sci.30:303-312)。
已广泛地研究了刺猬蛋白信号通路在胚胎发育过程中的调节作用：Hh已与正常组织的维持和修复过程相关，与增殖和分化的时空调节相关，因而允许组织发育以达到它们正确的尺寸以及适当的细胞类型和适度的血管化和神经分布。特别是其参与了中枢神经系统的发育(Dessaud et al.,2008,Development,135:2489-503)。Hh信号传导功能的本质作用通过人胎儿中该信号通路的缺陷的明显后果来证明，如采用Shh突变体观察到的前脑无裂畸形(Traiffort et al.,J.Biol.Chem.,2004,279:42889-42997)。
最近，Shh通路在成人脑中被鉴定出来，在成人脑中氨基末端活性形式的分子在成熟神经系统的很多区域中被表达，表明该通路的新作用。实际上，其明显参与神经发生微环境(neurogenic niches)的建立和维持，并调节成人脑中神经前体或神经胶质前体的增殖(Traiffort et al.,2010,J.Neurochem.,113:576-590)。Shh信号通路的调整因而代表了开发神经退行性疾病的治疗方法的挑战。多项研究已表明了通过Shh蛋白自身激活Shh信号通路对减轻患有帕金森氏病(Parkinson's disease)的大鼠的行为障碍(Tsuboi et al.,2002,Exp.Neurol.173:95-104)或者对患有多发性硬化症的大鼠的神经元的再髓鞘形成(Mastronardi et al.2004,J.Immunol.172:6418-26)的积极作用。而且，已表明通过Smo激动剂激活Shh信号通路使得神经前体细胞在成年大鼠的神经发生区域的水平上的增殖的增加(Machold et al.,2003,Neuron.,39:937-950)。然而，Smo激动剂仍保持极少的数量且对其的表征仍不充分。
Shh信号通路的功能障碍还与许多癌症相关。实际上，使Ptc失活的突变与Gorlin综合征或基底细胞痣综合征(basal cell nevus syndrome)相关，该综合征是一种常染色体显性疾病，其特征在于颅面和脑畸形，但特别在于多种肿瘤的高发病率，更具体地说是皮肤水平上的基底细胞癌和小脑水平上的成神经管细胞瘤(medulloblastomas)的高发病率。在中枢神经系统的原发性神经外胚瘤、主要是成神经管细胞瘤(30％的病例)中也观察到人基因Ptc和Smo的突变，而且在散发形式的基底细胞癌中也观察到(对于Ptc和Smo，病例分别为40％和20％)。而且，Shh的突变还与基底细胞癌相关。其它类型的肿瘤与刺猬信号通路的缺陷也相关，且这些肿瘤的定位与胚胎发育过程中通路的组成成分的表达位点紧密相关(Scales and de Sauvage,2009,Trends in Pharmacol.Sci.,30:303-312)。作为非限制性实例可以提及：与Ptc的突变相关的乳腺癌和脑膜瘤(meningiomas)；与Gli的突变相关的成胶质细胞瘤(glioblastomas)；胃肠癌，特别是胃和结肠的原发性癌；前列腺癌和膀胱癌；卵巢的纤维瘤(fibromas)和皮样囊肿(dermoid cysts)；横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcomas)、小细胞肺癌(small cell lung cancers)、口腔鳞状细胞癌(squamous cell oralcarcinomas)。
由于刺猬蛋白信号通路在众多生理和病理过程中的关键性作用，该通路的组成成分如平滑蛋白(Smo1和Smo2)、卷曲(Frizzled)蛋白(Fz1至Fz10)、碎片蛋白(Ptc1和Ptc2)；派遣蛋白(Disp1和Disp2)以及Hip蛋白代表用于开发能够在体外和/或体内在胚胎或成体中调节(激活或抑制)该通路并因而正或负调节发育[增殖、分化、迁移、存活(细胞凋亡)]和/或调节分化细胞和干细胞的活性的新分子的靶点。
已证明这样的分子可用于治疗与刺猬通路的超活化相关的肿瘤(Scales and deSauvage,2009,Trends in Pharmacol.Sci.,30:303-312)。这样的分子因而可能用于治疗多种肿瘤，如神经组织肿瘤(成神经管细胞瘤、原发性神经外胚层肿瘤(primaryneuroectodermal tumors)、成胶质细胞瘤、脑膜瘤和少突神经胶质瘤(oligodendrogliomas))、皮肤肿瘤(基底细胞癌(basal cell carcinomas)、毛发上皮瘤(trichoepitheliomas)))、肌肉和骨组织的肿瘤(横纹肌肉瘤、骨肉瘤(osteosarcomas)、黑素瘤(melanomas))和其它组织(肾、膀胱、前列腺、肺、胃、胰腺、乳房、肝)的肿瘤。
这样的分子也可用于治疗需要阻断刺猬通路的神经退行性类型的病症(帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病(Huntington's chorea)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、运动神经元病(motor neuron disease))以及其中阻断刺猬信号通路可能是有益的疾病，如糖尿病(diabetes)。
这样的分子也可用于众多急性、亚急性或慢性的遗传性或获得性病症(涉及与刺猬通路的异常调节(deregulation)相关连的组织功能障碍)的药物或外科治疗(整形或重建外科、组织或器官的移植)，用于诱导组织的形成、再生、修复和/或活性增加，所述组织如神经组织[中枢神经系统(脑)和周围神经系统(感觉神经元、运动神经元、交感神经元)]、骨、软骨、睾丸、肝、脾、肠、胰脏、肾、平滑肌和骨骼肌、心、肺、皮肤和毛发、粘膜、血细胞和免疫系统细胞。作为这些病症的非限制性实例，可以特别提及神经病(neuropathies)和相关的神经肌肉疾病、糖尿病、脱发(alopecia)、烧伤(burns)、溃疡(ulcerations)(皮肤和粘膜)和精子发生(spermatogenesis)障碍。
已鉴定了多种能够调节刺猬通路的活性的分子。
首先，刺猬蛋白和衍生的多肽(片段、变体等)，特别是刺猬蛋白的激动剂和拮抗剂(国际申请PCT WO01/98344，申请人为BIOGEN)；由于它们的尺寸，这些蛋白质和衍生的多肽不能穿过血脑屏障并因而不能全身性给药，特别是对于治疗与刺猬蛋白信号通路的超活化相关联的脑肿瘤。而且，这样的分子具有低稳定性，并难以生产和纯化。相反，存在抑制Shh配体、robotnikinin和5E1单克隆抗体的作用的分子。
Hh信号通路也可以进一步在下游被调节。例如，可以调节Ptc对Smo的抑制作用。其被他汀类增加以及被羟固醇类降低的机理尚未被准确了解(Heretsch et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,2010,18:6613-6624)。还已知天然产物(酸浆苦素F(PhysalinF))或合成产物(GANT58、GANT61、HPI-1)可抑制Gli转录因子与核内DNA的结合。
然而，大多数研究集中于在平滑受体水平上起作用的调节剂的发现：
-抑制或激活Hh信号通路的杂环有机分子(SAG和衍生物)：国际申请PCT WO01/74344，申请人为CURIS；Chen et al.,PNAS,2002,99,14071-14076，
-purmorphamine，一种激活Hh信号通路的小分子：Wu et al.,Chemistry&Biology,2004,1229-1238，
-含氮杂环分子：国际申请PCT WO01/19800、WO01/26644和WO02/30421，申请人为CURIS；Kamenetsky et al.,J.Biol.,2002,1,1-19，
-来源于藜芦属(Veratrum spp.)(介芬胺、环巴胺和3-葡萄糖基-11-去氧芥芬胺(cycloposine))和来源于茄属(Solanum spp.)(茄啶)的16、17或18位被胺或胺衍生物取代的植物类固醇，和胆固醇：US专利6,432,970和国际申请PCT WO99/52534和WO01/27135，申请人为JOHNS HOPKINS UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE；US专利6,291,516；国际申请PCTWO00/41545，申请人为ONTOGENY INC.；国际申请PCT WO02/30462，申请人为CURIS；Taipaleet al.,Nature,2000,406,1005-1009；Berman et al.,Science,2002,297,1559-1561。然而，证明了10μM以上的环巴胺浓度经证明对细胞具有细胞毒性(Borzillo et al.,Curr.Top Med.Chem.,2005,5(2),147-157)。而且，环巴胺对肿瘤生长的体内效应已被质疑，因为它们可能与肿瘤自身以外的活性相关联(Yauch et al.,2008,Nature,455:406-410)。环巴胺的衍生物(IPI-926)目前正处于临床II期(Mahindroo et al.,J.Med.Chem.,2009,52,3829；Tremblay et al.,J.Med.Chem.,2009,52:14,4400-4418)，
-米非司酮(mifepristone)(17β-羟基11β-(4-二甲基氨基苯基)17α-(丙-1-炔基)雌甾-4,9-二烯-3-酮)，也被称为RU-486或RU-38486(法国专利FR2850022，申请人为CNRS)，已证明了其对刺猬蛋白信号通路活性的抑制性活性，
-具有类似于SAG(氯苯并噻吩型合成激活化合物)(CAS编号：364590-63-6)的结构的分子SANT74和SANT75，已知其也是有效控制激活因子Smo的构象的稳定抑制剂(Yang etal.,The Journal of Biological Chemistry,published April14,2009)。
最近，已描述了其它抑制刺猬信号通路的化合物(Peukert and Miller-Moslin,2010,ChemMedChem5:500-512；Low and De Sauvage,2010,J.Clin.Oncol.；Ng andCurran,2011,Nature Review Cancer)：
-基于双酰胺(国际申请PCT WO2007/059157，申请人为GENENTECH INC.和CURISINC.)以及基于吡啶基(国际申请PCT WO2006/028958，申请人为GENENTECH INC.和CURISINC.；US专利2009/0281089，申请人为GENENTECH INC.)的抑制剂。一种基于吡啶基的化合物GDC-0449(临床II期)已表明其在患有成神经管细胞瘤转移瘤(medulloblastomametastases)的患者中的有效性。然而，患者逐渐发展出对该分子的耐受性。Smo的天冬氨酸(D473H)出现突变。这干扰了化合物与Smo结合的能力并抑制了该通路。在用该化合物治疗的患有成神经管细胞瘤的小鼠模型中鉴定到相同氨基酸的突变(Yauch et al.,2009,Science326:572-574)。
-Novartis公司开发的抑制剂。例如，LDE225(临床II期)已被测试用于治疗小鼠模型的成神经管细胞瘤并且诱导这些肿瘤消退。然而，在治疗过程中观察到耐受性。一项研究揭示了几种耐药机理，包括Gli2的染色体扩增，以及更罕见的，导致肿瘤生长的再激活的Smo受体的点突变。还鉴定了磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号传导的正调节(Buonamici etal.,2010,Sci.Transl.Med.,51-70)。
-Bristol-Myers Squibb Inc.开发的抑制剂，如BMS-833923(XL-139)。
-Pfizer Products,Inc.公司开发的抑制剂(WO2008/075196和US2009/0005416)。PF-04449913目前正处于临床II期。
-MERCK公司所描述的抑制剂(Dessole et al.,2009,Bioorg.&Med.Chem.Lett.19:4191-4195)。
-Novartis的化合物LEQ506和Millennium公司的化合物TAK-441也刚进入临床I期。
-基于酰基-脲、酰基-硫脲和酰基-胍的抑制剂也作为刺猬通路的调节剂受到保护(WO2009/130422和WO2011/010013，申请人为CNRS)。后者与其它现有的分子相比具有易于制备的优势。而且，酰基-胍衍生物是水溶性的。
本发明人现设定的目的为提供新的化合物，所述化合物是刺猬蛋白信号通路的调节剂(刺激剂或抑制剂)，该化合物更好地响应于实际需要，特别是它们易于合成并且可潜在地用于人类治疗。
该目的通过下文所述的且构成本发明的第一目的的式(I)化合物来实现，这些化合物是迄今为止所鉴定的平滑受体的最强效的拮抗剂(比目前处于临床阶段的化合物更强效5至30倍)。这些分子还表现出比分子GDC-0449和LDE225大10至30倍的亲和力，而且后者的出现是为了对抗某些患者中出现的耐药性(耐药性尤其与平滑受体上突变的出现相关)。而且，本发明的分子具有易于制备的优势，根据与本领域技术人员已知的常规方法相似的合成方法，通常经过三步或四步，由可得的原材料开始易于获得酰基-脲、酰基-硫脲和胍化合物。胍官能团作为碱是可成盐的，其具有生产在水介质中具有良好溶解性的化合物的优势。使用本领域技术人员熟知的简单的化学反应，非常方便地获得所有的式(I)化合物。
本发明涉及具有下式(I)的化合物：
其中：
-R1、R2和R3可以相同或不同，彼此独立地表示氢或卤素原子、羟基基团、烷基、全氟烷基、烷氧基、烷硫基或腈基团，并且所述烷基、全氟烷基、烷氧基和烷硫基基团可以包含1至6个碳原子，
-X表示O、S或NH，并且优选地，X是NH，
-R4和R7可以相同或不同，彼此独立地表示氢或卤素原子或烷基基团，
-R5表示选自以下的被至少一个R6基团取代的基团之一：
R6表示卤素原子或烷基、烷氧基、氨基烷基、硫代烷基或羟基基团，并且所述烷基、烷氧基、氨基烷基和硫代烷基基团包含1至6个碳原子。
在本发明的意义上，术语具有以下含义：
-烷基：直链或支链的饱和的脂肪族烃基团，具有1至6个原子，优选具有1至2个碳原子。术语“支链”表示直链烷基链携带至少一个低级烷基基团如甲基或乙基。术语“低级”烷基基团表示具有1或2个碳原子的烷基；术语“高级烷基”表示具有3至6个碳原子的直链或支链烷基基团。作为烷基基团，可以提及例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基和正戊基基团。
-卤素原子：表示溴、氯、碘或氟原子；指定溴、氯和氟是优选的；
-全氟烷基：表示如上文所定义的烷基基团，其中所有的氢原子被氟原子替换。在全氟烷基基团中，三氟甲基和全氟乙基是优选的；
-烷氧基：表示O-烷基基团，其中烷基基团可以具有如上所述的相同的含义。作为烷氧基基团的实例，可特别提及甲氧基、乙氧基，正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基和戊氧基基团；
-烷硫基：表示烷基-S基团，其中烷基基团可以具有如上所述的相同的含义。作为烷硫基基团的实例，可特别提及甲硫基、乙硫基、异丙硫基、丁硫基和戊硫基基团；
-氨基烷基：表示烷基-N基团，其中烷基基团可以具有如上所述的相同的含义。作为氨基烷基基团的实例，可特别提及氨基甲基、氨基乙基、异丙基氨基、丁基氨基和戊基氨基基团。
根据本发明的优选实施方式，式(I)化合物选自其中R1、R2和R3表示烷氧基基团优选甲氧基基团的那些化合物。
根据另一优选的实施方式，R4和R7表示氢或氯原子、甲基、乙基或异丙基基团。
根据另一有利的实施方式，R6表示卤素原子或者烷氧基或氨基烷基基团，并且所述烷氧基或氨基烷基基团可以包含1至6个碳原子。更优选地，R6表示氯或氟原子、甲氧基或二甲基氨基基团。
作为式(I)化合物，可特别提及：
-N-(N-(3-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺盐酸盐，其具有下式：
(化合物7a)；
-N-(N-(3-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺盐酸盐，其具有下式：
(化合物7b)；
-3,4,5-三甲氧基-N-(N-(4-甲基-3-(4-(3-苯基丙基)苯甲酰氨基)苯基)脒基)苯甲酰胺盐酸盐，其具有下式：
(化合物7c)；
-3,4,5-三甲氧基-N-(N-(4-甲基-3-(4-苯乙基苯甲酰氨基)苯基)脒基)苯甲酰胺盐酸盐，其具有下式：
(化合物7d)；
-(E)-N-(N-(3-(4-肉桂基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺盐酸盐，其具有下式：
(化合物7e)；
-N-(N-(3-(4-苄基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺盐酸盐，其具有下式：
(化合物7f)；
-N-(N-(3-(4-苄基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺盐酸盐，其具有下式：
(化合物7g)；
-N-(N-(3-(4-(苄氧基)苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺盐酸盐，其具有下式：
(化合物7h)。
本发明的式(I)化合物可以容易地通过与本领域技术人员已知的常规方法相似的合成方法一般经过三步或四步制备而成。
首先，根据上述方案1制备中心片段，片段(VI)。
方案1
关键是在含水介质中在氨腈上缩合苯甲酰氯(II)以便获得酰基-氨腈(III)，其进而与苯胺(A)缩合得到胍(IV)。
然后在碱性介质中用Boc残基保护胍的碱性官能团以得到硝基化合物(V)，然后通过氢化还原成胺以得到中间体苯胺(VI)。
下面的反应方案2示出了在其式(I)中具有R1＝R2＝R3＝MeO基团的化合物的制备。
如文献(J.Med.Chem,2001,44,3175；Chem.Eur.J.2010,16,5848；Org.Lett.2007,9,4571；Org.Biomol.Chem.2008,6,3005；Adv.Cat.Synth.2008,350,2065；J.Org.Chem.2001,66,2874；J.Med.Chem.2010,53,5770)中所述制备酸的氯化物(1a-h)。
然后使中间体(VI)与各种酸的氯化物(1a-h)(最经常为商购的)缩合得到最经常为盐(盐酸盐)形式的期望的化合物(方案2)。
方案2
本发明的式(I)化合物具有负调节(抑制作用)或正调节(激活作用)刺猬蛋白信号通路的性质，并因而能够作为活性成分用于制备意图用于治疗与刺猬蛋白信号通路的超活化或不足相关的病症的药物组合物。
因此，本发明还涉及式(I)化合物作为医药品的应用，特别是式(I)化合物作为用于治疗与刺猬蛋白信号通路相关的肿瘤的医药品的应用。
更具体地说，本发明还涉及式(I)化合物：
-其作为医药品，意图用于治疗与刺猬蛋白信号通路的超活化相关的肿瘤；所述肿瘤特别是指神经组织肿瘤(成神经管细胞瘤、原发性神经外胚层肿瘤(neuroectodermalprimary tumors)、成胶质细胞瘤、脑膜瘤和少突神经胶质瘤)、皮肤肿瘤(基底细胞癌、毛发上皮瘤)、肌肉和骨组织的肿瘤(横纹肌肉瘤、骨肉瘤)或其它组织(肾、膀胱、前列腺、肺、胃、胰腺)的肿瘤，
-其作为医药品，用于治疗神经退行性类型的病症如帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化或运动神经元病，
-其作为医药品用于治疗与脑发育相关的疾病(前脑无裂畸形)、用于治疗脑血管意外和用于治疗心血管意外、以及用于治疗少突胶质细胞和许旺细胞的疾病，
-其用于体外控制和调节人或动物干细胞的更新，
-其作为医药品，用于治疗其中调节刺猬信号通路是有益的其它病症例如糖尿病。
待用的剂量根据待治疗的病症、给药途径和频率、以及待治疗的物种(人或动物)的性质和重量而变化；例如，成人通过口服途径的剂量可以在每天10mg至2g之间变化。
本发明进一步涉及药物组合物，其特征在于其包含作为活性成分的至少一种如上文所定义的式(I)化合物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
在本发明的药物组合物中，式(I)的一种或多种化合物的用量优选为使得待施用的单位剂量在约10mg和2g之间。
本领域技术人员会选择一种或多种与药物组合物的施用途径相关的药学上可接受的赋形剂。当然，在这种情况下本领域技术人员会确保所用的一种或多种赋形剂与本发明的组合物的固有特性相容。
而且，医药品或药物组合物的形式(例如，溶液、混悬液、乳剂、片剂、胶囊剂、栓剂等)会取决于所选的施用途径。
因此，在本发明的意义上，医药品或药物组合物可以通过任何适合的途径施用，例如通过口服、肛门、局部、全身、静脉内、肌内或粘膜途径施用；或者使用贴剂施用；或者以封装在脂质体、微颗粒、微胶囊等中或者固定在脂质体、微颗粒、微胶囊等上的形式施用。
作为适合通过口服途径施用的赋形剂的非限制性实例，可以特别提及滑石，乳糖，淀粉及其衍生物，纤维素及其衍生物，聚乙二醇，丙烯酸的聚合物，明胶，硬脂酸镁，动物性、植物性或合成脂肪，石蜡衍生物，二醇类，稳定剂，防腐剂，抗氧化剂，润湿剂，抗凝结剂，分散剂，乳化剂，矫味剂(taste correctants)，渗透剂，增溶剂等。
用于配制和施用医药品和药物组合物的技术是本文中所考虑的技术领域中公知的，并且本领域技术人员可特别参考著作Remington's Pharmaceutical Sciences(第21版)。
本发明的式(I)化合物经证明作为用于发现这些信号通路的新调节因子和用于检测不同形式的平滑受体或相关受体以及鉴定能够调节这些不同形式的分子的工具是非常有用的。
本发明因此还涉及至少一种标记的式(I)化合物作为研究工具的用途，该用途特别是用于鉴定能够与平滑受体或相关受体例如通过结合至Smo1结合位点或Smo2结合位点而相互作用的分子。
事实上，发明人相当意外地发现，在式(I)化合物的结构片段的一端上引入标记物可以产生在许多生物鉴定中表现出特征性的亚纳摩尔浓度亲和力的放射性配体。
根据现有技术的常规方法通过引入放射性同位素如3H、11C、14C、32P、35S、125I、99mTc、18F、64Cu、76Br、124I、13N、15O或123I可使式(I)化合物的标记为放射性的。式(I)化合物的标记也可以由通过本领域技术人员已知的方法在所述化合物上固定荧光团组成；常规上可使用作为待检测的放射性原子的官能团的放射性成像器或者通过测量荧光来检测标记。
信号通路的几种放射性配体在文献中已有记载，但使用的仍很少。例如，用氚3H或碘125I标记的放射性配体，如3H SAG(Rominger et al.,JPET,2009,995-1005)、3H-Hh-Ag1.5(Borzillo and Lippa.,Curr.Top Med.Chem.,2005,5(2),147-57)、[3H]GDC-0449(Dijkgraaf et al.,2011,Cancer Res.435-444)或AP-环巴胺[3H]-环巴胺(Chen et al.,Genes Dev.,2002,16:2743-2748)：
研究了一系列的类似物，其目的是获得用氚标记的物质，以进行特异性结合和/或放射自显影术的实验，以更深入地分析刺猬蛋白信号通路的受体(更特别是平滑受体)的调节因子的作用机理。实际上，以前在现有技术中描述的标记的化合物是不易获得的；它们需要大量的合成步骤。而且，在上文所述的放射性配体中，仅AP-环巴胺[3H]-环巴胺是可商购获得的。而且，其表现出低亲和力(Kd为约10nM)(Rominger et al.,JPET,2009,995-1005)，这与本发明的化合物相反(化合物(7d)的Kd＝0.3nM)。
更具体地说，标记形式的式(I)化合物可以用于：
-检测与刺猬蛋白信号通路的超活化相关的肿瘤，
-筛选和/或鉴定刺猬蛋白信号通路的受体的特异性结合位点的配体，所述受体如平滑受体或相关受体如卷曲受体(Frizzled receptors)(卷曲受体1至10)，或者碎片受体(Patched receptor)(碎片受体1和碎片受体2)、派遣蛋白受体(Dispatched receptor)(派遣蛋白1和派遣蛋白2)、或Hip受体，其中所述刺猬蛋白信号通路的受体可以被天然表达或可以在原代细胞、细胞系或者健康或病变组织中被稳定地或瞬时地转染(质粒基因转移)或感染(通过使用病毒)，
-筛选和/或鉴定为刺猬蛋白信号通路的受体的拮抗剂(抗癌分子)或者为作用于干细胞的刺猬蛋白信号通路的受体的激动剂的新分子，
-在自动射线照相术中分析刺猬蛋白信号通路在原代细胞、细胞系或健康或病变组织中的功能，
-研究刺猬蛋白信号通路的受体在原代细胞、细胞系或健康或病变组织中的药理调节。
本发明的另一目的涉及放射性标记如上文所定义的式(I)化合物的方法，该方法包括在氚3H气氛下氚化式(I)化合物的步骤，并且当式(I)化合物被不具有烯属双键的基团R5取代时，所述方法包括卤化的初始步骤。
因此，本发明的另一目的涉及可通过上文所述的放射性标记方法获得的式(I)化合物，其中至少一个氢原子被氚原子3H替换。用氚3H放射性标记的这些式(I)化合物可以用作研究工具以及用于上文列举的各种用途。
用于筛选刺猬通路的调节物的多种方法是已知的：
-使用原代系或培养物的细胞响应的方法：细胞分化(C3H10T1/2)、细胞增殖(原代小脑颗粒细胞)；
-使用与作用于靶向受体的跨膜域的荧光化合物[(氟硼二吡咯环巴胺(bodipycyclopamine，BC)]竞争的方法(US2007/0218775)；
-使用所涉及的途径的报道基因的方法(Taipale et al.,2000,Nature,406,1005-1009)；
-通过在存在或不存在测试化合物的情况下测量Ptc-Hh相互作用来检测Hh活性的试验(US2005/0282231)；
-使用缺少Sufu的细胞和报告子来鉴定作用于Smo下游的Hh途径的抑制剂的试验(WO2006/080894)。
本发明还涉及筛选和/或鉴定平滑受体的Smo结合位点(Smo1或Smo2)的配体的方法，该方法包括以下步骤：
a)使平滑受体与至少一种式(I)化合物相接触以获得复合物[Smo-式(I)化合物]；
b)使平滑受体、所述式(I)化合物和测试分子相接触；
c)通过对步骤b)中回收的平滑受体与复合物[Smo-式(I)化合物]进行比较来检测所述平滑受体和所述测试分子之间的相互作用；以及
d)选择对其测量了与平滑受体的相互作用的所述测试分子。
步骤a)可以采用表达平滑受体的细胞或者采用包含功能性平滑受体的膜的提取物进行；它们特别可以是可通过Rivoyre等人(FEBS Letters579,2005,1529-1533)所述的方法获得的携带有功能性人平滑受体的酵母菌的膜的提取物。
当采用表达平滑受体的细胞进行步骤a)时，所述受体的表达是组成性的(该受体天然地被该细胞表达)，或者其是由细胞的转化导致的，从而使其表达或过表达相同物种或不同物种的平滑受体。该平滑受体还可以携带突变，所述突变赋予该受体不同于野生型受体的生物化学或药理学性质。
任意式(I)化合物均可用于实施本发明的方法；然而，其可由本领域技术人员特别是与其对平滑受体的亲和力相关地进行选择。
步骤a)可在液相中或在适合的固体支持物上实施；本领域技术人员会根据例如平滑受体是以膜提取物的形式使用还是以纯化蛋白质的形式使用来选择和改造这些实施方式。
当步骤a)在液相中实施时，可根据以下步骤实施液相筛选方法：
a)使平滑受体与至少一种式(I)化合物相接触以获得复合物[Smo-式(I)化合物]；
b)使平滑受体、所述式(I)化合物和测试分子相接触；
c)回收任选地与一个或多个测试分子和/或与所述式(I)化合物键合的所述平滑受体；
d)通过对步骤c)中回收的平滑受体和复合物[Smo-式(I)化合物]进行比较来检测所述平滑受体和所述测试分子之间的相互作用；以及
e)选择测量到相互作用的所述测试分子。
步骤a)可以采用包含平滑受体的膜提取物来实施，然后将该膜提取物与式(I)化合物和测试分子一起孵育；然后将混合物离心；将离心后获得的沉淀物重悬浮于缓冲液中，然后再次离心以消除非特异性相互作用。然后根据式(I)化合物的标记通过测量荧光或通过测量放射性来分析测试分子在平滑受体上的固定：
-根据液相筛选方法的一种变型，预先标记所述式(I)化合物。通过对步骤c)中回收的平滑受体的标记(通过放射性或荧光)和复合物[Smo-式(I)化合物]的标记进行比较来进行步骤d)的检测平滑受体和一个或多个测试分子之间的相互作用；所选择的分子是步骤c)中回收的平滑受体的标记弱于复合物[Smo-式(I)化合物]的标记的那些分子；
-根据液相筛选方法的另一种变型，通过色谱法比较复合物[Smo-式(I)化合物]的位置与步骤c)中回收的平滑受体的位置来检测相互作用；如果位置相同，那么在平滑受体和测试分子之间没有相互作用。相反，位置差异表明存在相互作用，那么就有必要证实测试分子和平滑受体之间的相互作用确实是发生在Smo结合位点上。
本发明的筛选方法的步骤a)可以可选地在适合的固体支持物上实施。
固体支持物特别地意为由包含生物学物种(如酶、抗体、肽、微生物、生物组织、脂质、核酸等)的膜构成的生物传感器，允许与测试分子和用于将生物信号(如配体在蛋白质受体上的固定)转换成可测量的物理信号(例如电化学(安培计的、电位计的、电导计的)、光学(光)、压电或量热信号)的转换物质结合。在该情况中，固定在膜上的生物学物种是平滑受体；在平行进行的两个实验中，使固体支持物上的平滑受体与式(I)化合物相接触以及与所述式(I)化合物和测试分子的混合物相接触，且比较这些实验中的各个实验中获得的信号；选择诱导信号改变的分子。
作为实例，固体支持物是用于通过等离子体共振检测结合的生物传感器，其使用允许通过生物传感器表面上的质量变化来可视化和表征蛋白质及其配体之间的相互作用(亲和力、缔合和解离常数)。该质量变化通过生物传感器表面上的等离子体共振角的变化来测量，并且不需要标记或荧光配体。
当用包含平滑受体的膜提取物进行在固体支持物上筛选的方法时，这些提取物可以通过注射固定在亲脂性生物传感器上。当使用亲脂性生物传感器时，膜提取物固定于通过共价键键合于葡萄聚糖的亲脂性基团，允许监测膜受体和配体之间的相互作用(M.R.Pourshafie et al.,J.Microbiol.Meth.,2004,58,313-320；A.Wikstrom,Anal.Biochem.,2007,362,98-107)。
因此，根据本发明的一种变型，用于通过等离子体共振检测结合的生物传感器是亲脂性生物传感器，例如来自Biacore(GE Healthcare)的“传感器芯片L1”疏水性生物传感器，通过注射将含有平滑受体的膜制剂固定于其上。
当采用纯化的平滑受体进行固体支持物上的筛选方法时，所述受体也可以固定在生物传感器上，允许表面等离子体共振测量，表面等离子体共振测量由以下组成：当配体固定于界面(界面上固定有受体)时，检测界面的指数变化。
根据另一变型，固体支持物上的筛选方法还使得可以鉴定不与Smo结合位点结合的平滑受体的配体；这些配体的激活或抑制可以通过下文所述的方法表征。
本发明还涉及鉴定平滑受体的激动剂的方法，该方法除了对于配体鉴定方法所描述的步骤之外还包括使所鉴定的配体与在平滑受体被激活之后显示细胞响应的细胞相接触以及选择能够诱导所述细胞的所述细胞响应的激动剂分子。
在激活平滑受体之后显示细胞响应的细胞选自原代细胞系或培养物：响应于可由碱性磷酸酶的活性测量的细胞分化对平滑受体的激活的间充质细胞(例如，C3H10T1/2)；响应于细胞增殖对平滑受体的激活的原代小脑颗粒细胞；成体脑的干细胞或神经祖细胞或在发育过程中或在成体中存在于组织中的祖细胞，对于这些细胞，细胞响应可以例如由基因(如编码Gli家族的转录因子的那些基因)的诱导组成，或者对于碎片蛋白或Hip，细胞响应由被刺猬通路激活的基因的诱导组成。
本发明还涉及鉴定是否为平滑受体的拮抗剂的分子的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将平滑受体激活后能显示细胞响应的细胞与至少一种式(I)化合物一起培养以诱导所述细胞响应；
b)使步骤a)结束时获得的细胞与测试分子相接触；
c)选择诱导所述细胞的所述细胞响应的抑制的分子。
我们期望测试其对平滑受体的拮抗剂活性的分子可以特别是通过根据本发明的配体鉴定方法中的任一种所鉴定的与平滑受体的Smo结合位点结合的配体。
本发明进一步涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，其包含至少功能性平滑受体和至少一种式(I)化合物。所述功能性平滑受体或者以膜提取物的形式存在或者存在于平滑受体激活能后显示出细胞响应的细胞中。
平滑受体和式(I)化合物之间的结合实验也可用于表征和鉴定：
-以Smo结合位点为活性的构象来表达平滑受体的新细胞类型；
-参与分化的受体，例如与平滑受体相关的受体。
本发明因而涉及一种鉴定表达平滑受体的细胞(如肿瘤细胞)的方法：
a)使待测细胞与标记的式(I)化合物相接触；
b)清洗细胞以除去未与待测细胞的任何受体结合的所述标记的式(I)化合物；
c)检测标记的细胞。
化合物也可用于鉴定和表征参与细胞分化、增殖、细胞死亡、迁移、细胞存活或者允许细胞获得其尚未获得的性质或状态的新受体或新受体形式。
除了前述提供的内容之外，本发明还包含根据下文给出的描述将变得明显的其它提供的内容，所述描述参考本发明的式(I)化合物的合成、表征和评价的实施例，其标记，以及随附的附图，其中：图1示出了化合物(7d)和参比化合物在多种细胞试验中的活性以及对氟硼二吡咯-环巴胺(BC)与Smo受体的结合的活性。图1A和图1B示出了化合物对C3H10T1/2细胞的分化的活性(图1A)和对大鼠小脑的PCG的增殖的活性(图1B)。在SAG(0.1μM，图1A和0.01μM，图1B)的存在下，采用所研究的分子的递增浓度生成抑制曲线。数值被表示为SAG所诱导的最大响应的百分比。图1C示出不同化合物对氟硼二吡咯-环巴胺(BC)的结合的抑制。将HEK-hSmo细胞与BC(5nM)单独(对照)或在递增浓度的所研究的分子的存在下一起孵育。通过荧光显微镜检查法使BC的结合可视化，并且在量化之后获得剂量-响应曲线。数值被表示为BC的特异性结合的百分比。数据对应于代表2-4个独立实验的实验获得的值(平均值±SEM)，
-图2示出化合物3H-(7d)与表达人平滑受体的HEK-hSmo细胞的膜的缔合的动力学，
-图3示出平衡时化合物3H-(7d)与在HEK-hSmo细胞中表达的Smo受体的结合的饱和曲线。图3A：在37℃下将HEK-hSmo细胞的膜(2μg的蛋白质)与递增浓度的化合物3H-(7d)在终体积为0.4ml的HEPES0.2％BSA缓冲液中一起孵育3小时。在1μM GDC-0449的存在下评价非特异性结合。特异性结合的分析给出Kd值为0.3±0.1nM和Bmax值为1086±91cpm。数据为三次测定的平均值±SEM(代表性实验，n＝3)。图3B：化合物3H-(7d)的特异性结合的Scatchard分析，
-图4示出化合物3H-(7d)与在HEK-hSmo细胞中表达的人平滑受体的结合的抑制。在37℃下将HEK-hSmo细胞的膜(2μg的蛋白质)与0.35nM化合物3H-(7d)单独地或在递增浓度的GDC-0449(A)、化合物(7d)、MRT-83、LDE225和环巴胺(B)的存在下在终体积为0.4ml的HEPES缓冲液(0.2％BSA)中孵育3小时。数据为三次测定的平均值±SEM(代表性实验，n＝2-3)并表示化合物3H-(7d)的总结合(A)或者在1μM GDC-0449的存在下测定的化合物3H-(7d)的特异性结合百分比(B)，
-图5示出SAG和purmorphamine对化合物3H-(7d)与在HEK-hSmo细胞中表达的人平滑受体的结合的抑制。在37℃下将HEK-hSmo细胞的膜(2μg的蛋白质)与0.35nM化合物3H-(7d)单独地或在递增浓度的SAG或purmorphamine的存在下在终体积为0.4ml的HEPES缓冲液(0.2％BSA)中孵育3小时。数据为三次测定的平均值±SEM(代表性实验，n＝2-3)，并表示在1μM GDC-0449的存在下测定的化合物3H-(7d)的特异性结合的百分比。
实施例1：合成和表征本发明的各化合物的方案
反应在惰性气体(氮气)气氛下采用Schlenk技术(标准)进行。溶剂通过标准方法干燥并在使用前在氮气下蒸馏。所有试剂均可商购获得且无需预先纯化即可使用。
在以参考号1100销售的LC/MSD色谱仪上记录质谱(ESI+)。在AC200仪器上在200MHz(1H)下或者在AC400仪器上在400MHz(1H)下记录核磁共振(NMR)光谱。
A/式IV化合物的制备
3,4,5-三甲氧基-N-(N-(4-甲基-3-硝基苯基)脒基)苯甲酰胺(3)的制备
将氨腈(2)(1.12g，4.77mmol)以及盐酸盐形式的4-甲基-3-硝基苯胺(A1)[1.08g，5.72mmol，通过将1eq.HCl(2M，在Et2O中)添加到苯胺在MeOH(10mL)中的溶液，接着真空浓缩得到粉末而制备]在甲苯(50mL)中的溶液在搅拌下加热回流6小时。形成固体。添加Et2O(50mL)以促进沉淀。滤出固体并在真空下干燥；然后将固体溶于NaHCO3在H2O中的饱和水溶液(30mL)中。将水溶液用Et2O(2x50mL)萃取。有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并浓缩得到硝基-胍(3)(1.22g，66％)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)d＝7.80(brs,1H),7.34-7.27(m,5H),3.90(s,9H)。
MW＝388，C18H20N4O6[ES/MS]m/z389[M+1]+
B/式V化合物的制备
(4-甲基-3-硝基苯基氨基)(3,4,5-三甲氧基苯甲酰氨基)亚甲基氨基甲酸叔丁基 酯(4)的制备
在室温下将Boc2O(1.77g，8.13mmol)在THF(10mL)中的溶液和作为催化剂的DMAP(97mg，1mmol)滴加到碱形式的胍(3)(3.16g，8.13mmol)在THF(90mL)中的溶液中。搅拌1小时后，起始化合物已被消耗。真空下蒸发溶剂，并将残余物通过柱色谱法纯化，用EtOAc/Hept混合物：3/7洗脱。获得油形式的Boc-胍(4)(2.3g，58％)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)d＝7.27(s,1H),7.09-7.04(m,3H),6.59(m,2H),3.82(s,3H),3.70(s,6H),2.17(s,4H),1.39(s,9H)。
MW＝488，C23H28N4O8[ES/MS]m/z489[M+1]+
C/式VI化合物的制备
(3-氨基-4-甲基苯基氨基)(3,4,5-三甲氧基苯甲酰氨基)亚甲基氨基甲酸叔丁基 酯(5)
在瓶中，在H2下以50psi将Boc硝基-胍(4)(1.22g，2.5mmol)在MeOH(80mL)中和Pd/C10％(100mg)的混合物搅拌10小时。起始物质消失；滤出催化剂，并将溶剂在真空下蒸发。将残余物通过柱色谱法纯化，用Hept/EtOAc混合物：7/3洗脱，得到标题化合物，为黄色油(5)(840mg，73％)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)d＝7.27(s,1H),7.09-7.04(m,3H),6.59(m,2H),3.82(s,3H),3.70(s,6H),2.17(s,3H),1.39(s,9H)。
MW＝458，C23H30N4O6[ES/MS]m/z459[M+1]+
D/各种式(6)和式(7)化合物的制备
D-1)(3-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基氨基)(3,4,5-三甲氧基苯甲酰氨 基)亚甲基氨基甲酸叔丁基酯(6a)的制备
在0℃下将酰氯(1a)(73mg，0.3mmol)在CH2Cl2(3mL)中的溶液滴加到Boc胍(5)(137mg，0.3mmol)和三乙胺(0.1mL，0.66mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液中。将反应混合物搅拌过夜。添加水(15mL)和CH2Cl2(10mL)。将有机相用盐水洗涤，干燥并真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用Hept/EtOAc混合物：3/2洗脱。获得标题化合物，为白色固体形式(6a)(142mg，70％，Mp96℃)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)d＝10.47(brs,1H),9.33(brs,1H),8.01-7.82(m,8H),7.55-7.53(m,3H),7.29-7.10(m,3H),3.82(s,3H),3.71(s,6H),2.41(s,3H),1.44(s,9H)。
D-2)N-(N-(3-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯 甲酰胺盐酸盐(7a)的制备
将Boc-胍(6a)(85mg，0.127mmol)在AcOH(1mL)和浓HCl(0.5mL)的混合物中的溶液搅拌过夜。将反应混合物在真空下浓缩，收集在Et2O中，并再次浓缩，得到白色固体(7a)(72m，94％，Mp138℃)。
1H-NMR(MeOH,d4,400MHz)d＝8.16(d,J＝8Hz,2H),7.93(d,J＝8Hz,2H),7.85-7.34(m,9H),3.97(m,6H),3.89(s,3H),2.43(s,3H)。
MW＝566，C32H30N4O6[ES/MS]m/z567[M+1]+
D-3)(3-(9H-芴-2-甲酰氨基)-4-甲基苯基氨基)(3,4,5-三甲氧基苯甲酰氨基)亚 甲基氨基甲酸叔丁基酯(6b)的制备
将酰氯(1b)(82mg，0.3mmol)在CH2Cl2(3mL)中的溶液滴加到Boc-胍(5)(137mg，0.3mmol)和三乙胺(0.05mL，0.36mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液中。将混合物搅拌过夜，然后添加水(5mL)和CH2Cl2(10mL)。将有机相用盐水处理，干燥并真空浓缩。将油状残余物通过柱色谱法纯化，用Hept/Et2O混合物：3/2洗脱，得到标题化合物(6b)(109mg，56％)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)d＝10.47(bs,1H),9.37(m,1H),8.07-7.02(m,13H),3.99(s,2H),3.81(s,3H),3.71(s,6H),2.41(s,3H),1.43(s,9H)
D-4)N-(2-甲基-5-(3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)胍基)苯基)-9H-芴-2-甲酰胺 盐酸盐(7b)的制备
将化合物Boc(6b)(100mg，0.154mmol)溶于AcOH(1.1mL)和浓HCl(0.55mL)的混合物中。将混合物在室温下搅拌4小时。将溶剂在真空下蒸发，并将固体残余物收集在Et2O中，然后过滤，回收得到白色固体(7b)(72mg，80％，Mp241℃)。
1H-NMR(DMSO,d6,400MHz)d＝12.24(brs,1H),11.53(brs,1H),10.2(s,1H),9.42(brs,1H),8.95(brs,1H),8.23-7.40(m,12H),4.05(s,2H),3.91(s,6H),3.78(s,3H),2.35(s,3H)。
MW＝550，C32H30N4O5[ES/MS]m/z551[M+1]+
D-5)(4-甲基-3-(4-(3-苯基丙基)苯甲酰氨基)苯基氨基)(3,4,5-三甲氧基苯甲 酰氨基)亚甲基氨基甲酸叔丁基酯(6c)的制备
将酰氯(1c)(73mg，0.3mmol)在CH2Cl2(3mL)中的溶液在室温下添加到Boc-胍(5)(137mg，0.3mmol)和三乙胺(0.1mL，0.66mmol)在CH2Cl2(10ml)中的溶液中。使反应混合物过夜。添加水(8mL)和CH2Cl2(10mL)。用饱和NaCl溶液洗涤有机相。然后将有机相干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上纯化，用EtOAc/Hept混合物：2/3洗脱，得到标题化合物，为白色固体形式(6c)(132mg，65％)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)d＝10.47(brs,1H),9.37(brs,1H),8.02-7.01(m,18H),3.81(s,3H),3.69(s,6H)2.72-2.64(m,4H),2.05-1.92(m,2H),1.42(s,9H)。
D-6)3,4,5-三甲氧基-N-(N-(4-甲基-3-(4-(3-苯基丙基)苯甲酰氨基)苯基)脒 基)苯甲酰胺盐酸盐(7c)的制备
将化合物Boc(6c)(116mg，0.17mmol)在AcOH(1.5mL)和浓HCl(0.75mL)的混合物中的溶液在室温下搅拌4小时。然后将溶剂蒸发并将残余物收集在Et2O中，回收得到标题化合物，为白色固体(80mg，82％，Mp132℃)。
MW＝580，C34H36N4O5[ES/MS]m/z581[M+1]+
D-7)(4-甲基-3-(4-苯乙基苯甲酰氨基)苯基氨基)(3,4,5-三甲氧基苯甲酰氨基) 亚甲基氨基甲酸叔丁基酯(6d)的制备
在室温下将酰氯(1d)(80mg，0.33mmol)的溶液添加到作为碱使用的Boc-胍(5)(137mg，0.3mmol)和三乙胺(0.06mL，0.45mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液中。将溶液搅拌过夜，并且添加CH2Cl2(10mL)，以及H2O(10mL)。将有机相用盐水洗涤，干燥并真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用EtOAc/Hept：2/3洗脱，得到标题化合物(6d)，为固体形式(150mg，75％，Mp161℃)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)d＝10.47(brs,1H),9.37(brs,1H),8.02-7.68(m,4H),7.29-7.01(m,11H),3.81(s,3H),3.68(s,6H),3.01-2.96(m,4H),2.37(s,3H)1.42(s,9H)。
MW＝666，C38H42N4O7[ES/MS]m/z667[M+1]+
D-8)3,4,5-三甲氧基-N-(N-(4-甲基-3-(4-苯乙基苯甲酰氨基)苯基)脒基)苯甲 酰胺盐酸盐(7d)的制备
将加合物Boc(6d)(120mg，0.18mmol)在AcOH(1.3mL)和浓HCl(0.66mL)的混合物中的溶液在室温下搅拌4小时。将溶剂在真空下蒸发，并将残余物收集在Et2O(10mL)中，并过滤，得到白色粉末(7d)(101mg，93％，Mp186℃)。
1H-NMR(MeOH,d4,300MHz)d＝7.90(d,2H J＝8Hz),7.52-7.16(m,12H),3.95(s,6H),3.87(s,3H),3.03-2.99(m,4H),2.38(s,3H)。
MW＝566，C33H34N4O5[ES/MS]m/z567[M+1]+
D-9)(3-(4-肉桂基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基氨基)(3,4,5-三甲氧基苯甲酰氨基) 亚甲基氨基甲酸叔丁基酯(6e)的制备
在室温下将酰氯(1e)(73mg，0.3mmol)在CH2Cl2(3mL)中的溶液添加到Boc-胍(5)(137mg，0.3mmol)和三乙胺(0.1mL，0.66mmol)在CH2Cl2(10ml)中的溶液中。使反应混合物过夜。添加水(8mL)和CH2Cl2(10mL)。用饱和NaCl溶液洗涤有机相。然后将有机相干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上纯化，用EtOAc/Hept混合物：1/4洗脱，得到标题化合物，为白色固体形式(6e)(142mg，70％)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)d＝10.47(brs,1H),9.36(brs,1H),8.02-7.01(m,17H),6.51-6.32(m,2H),3.81(s,3H),3.69(s,6H),3.62(m,2H),2.36(s,3H),1.42(s,9H)。
D-10)(E)-N-(N-(3-(4-肉桂基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基 苯甲酰胺盐酸盐(7e)的制备
将化合物Boc(6e)(122mg，0.15mmol)在AcOH(1.5mL)和浓HCl(0.75mL)的混合物中的溶液在室温下搅拌4小时。然后将溶剂蒸发，并将残余物收集在Et2O中。回收标题化合物，为白色固体形式(7e)(101mg，91％，Mp127℃)。
1H-NMR(MeOD,d4,400MHz)d＝7.98-7.94(m,2H),7.52-7.28(m,12H),6.49-6.43(m,2H),3.95(S,6H),3.65(s,3H),3.66-3.64(m,2H),2.38(s,3H)。
MW＝578，C34H34N4O5[ES/MS]m/z579[M+1]+
D-11)(4-甲基-3-(4-苯乙烯基苯甲酰氨基)苯基氨基)(3,4,5-三甲氧基苯甲酰氨 基)亚甲基氨基甲酸叔丁基酯(6f)的制备
将酰氯(1f)在CH2Cl2(3mL)中的溶液添加到Boc胍(5)(137mg，0.3mmol)和三乙胺(0.1mL，0.66mmol)在CH2Cl2(10mL)中的溶液中，然后使反应混合物反应过夜。然后添加水(10mL)和CH2Cl2(15mL)。倾倒出有机相，并用NaCl溶液(饱和，在H2O中)洗涤，干燥，蒸发并通过硅胶柱色谱法纯化，用EtOAc/Hept混合物：3/7洗脱，得到标题化合物，为白色固体形式(6f)(130mg，65％，Mp166℃)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)d＝10.47(brs,1H),9.35(brs,1H),8.02-7.09(m,17H),3.81(s,3H),3.71(s,6H),2.39(s,3H),1.43(s,9H)。
D-12)N-(N-(3-(4-苄基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰 胺盐酸盐(7f)的制备
将化合物Boc(6f)(120mg，0.18mmol)在AcOH(3mL)和浓HCl(1.5mL)中的溶液在室温下搅拌2小时。然后将溶剂蒸发，并将残余物收集在Et2O中，获得白色固体(70mg，70％，Mp221℃)。
1H-NMR(MeOD,d4,300MHz)d＝8.02-7.29(m,16H),3.94(s,6H),3.87(s,3H),2.40(s,3H)。
MW＝564，C35H32N4O5[ES/MS]m/z565[M+1]+
D-13)(3-(4-苄基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基氨基)(3,4,5-三甲氧基苯甲酰氨基) 亚甲基氨基甲酸叔丁基酯(6g)的制备
在室温下将酰氯(1g)(73mg，0.3mmol)在CH2Cl2(3mL)中的溶液添加到Boc-胍(5)(137mg，0.3mmol)和三乙胺(0.1mL，0.66mmol)在CH2Cl2(10ml)中的溶液中。使混合物反应过夜。然后添加水(8mL)和CH2Cl2(10mL)。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤，然后干燥并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上纯化，用EtOAc/Hept混合物：1/8洗脱。获得白色固体形式的标题化合物(6g)(144mg，71％，Mp105℃)。
1H-NMR(CDCl3,300MHz)d＝10.47(brs,1H),9.35(brs,1H),8.01-7.07(m,16H),4.06(s,2H),3.80(s,3H),3.68(s,6H),2.31(s,3H)。
D-14)N-(N-(3-(4-苄基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰 胺盐酸盐(7g)的制备
在室温下将化合物Boc(7e)(103mg，0.15mmol)在AcOH(1.5mL)和浓HCl(0.75mL)的混合物中的溶液搅拌4小时。然后将溶剂蒸发并将残余物收集在Et2O中。回收标题化合物，为白色固体形式(7g)(85mg，90％，Mp112℃)。
1H-NMR(MeOD,d4,400MHz)d＝7.95(d,J＝8Hz,1H),7.53-7.23(m,12H),4.09(s,2H),3.36(s,6H),3.86(s,3H),2.39(s,3H)。
MW＝552，C32H32N4O5[ES/MS]m/z553[M+1]+
D-15)(3-(4-(苄氧基)苯甲酰氨基)-4-甲基苯基氨基)(3,4,5-三甲氧基苯甲酰氨 基)亚甲基氨基甲酸叔丁基酯(6h)的制备
在室温下将酰氯(1h)(73mg，0.3mmol)在CH2Cl2(3mL)中的溶液添加到Boc-胍(5)(137mg，0.3mmol)和三乙胺(0.1mL，0.66mmol)在CH2Cl2(10ml)中的溶液中。使混合物反应过夜。然后添加水(8mL)和CH2Cl2(10mL)。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤，然后干燥，并真空浓缩。将残余物在硅胶柱上纯化，用EtOAc/Hept混合物：1/4洗脱。获得白色固体形式的标题化合物(6h)(103mg，68％，Mp94℃)。
D-16)N-(N-(3-(4-(苄氧基)苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯 甲酰胺盐酸盐(7h)的制备
将化合物Boc(6h)(116mg，0.18mmol)在AcOH(1.5mL)和浓HCl(0.75mL)的混合物中的溶液在室温下搅拌4小时。然后将溶剂蒸发，并将残余物收集在Et2O中。回收白色固体形式的标题化合物(7h)(80mg，82％，Mp192℃)。
1H-NMR(MeOH,d6,300MHz)d＝8.02-7.99(m.2H),7.54-7.16(m,11H),5.23(s,2H),3.97(s,6H),3.88(s,3H),2.39(s,3H)。
MW＝568，C32H32N4O6[ES/MS]m/z569[M+1]+
E/式(I)化合物的放射性标记
E-1)将化合物(7f)氢化成化合物(7d)
将盐酸盐形式的化合物(7f)(5mg，0.08mmol)在MeOH中的溶液和Pd/C(10％)在氢气(气球)下搅拌4小时。然后将混合物过滤，并真空浓缩，得到盐酸盐形式的化合物(7d)。
MW＝566，C33H34N4O5[ES/MS]m/z567[M+1]+和565[M-1]+
E-2)将化合物(7f)氚化成 3 H-(7d)
在5-mL球形烧瓶中，将化合物(7f)(2.5mg，0.04mmol)溶于MeOH(1mL)中，并将溶液冷却(液氮)。将催化剂(Pd/C10％)分散在表面上。一旦在烧瓶中形成真空，就引入氚气直到压力达到30psi。将反应混合物搅拌3小时。滤出催化剂，并在真空下与MeOH一起蒸发多余的氚。无需纯化直接获得产物(7d)。
化合物[3H]-(7d)的特征：
-纯度：>98％(HPLC)
-比活性：38.1Ci/mmol(1.41TBq/mmol)
-浓度：1.0mCi/ml(37MBq/ml)
色谱数据：
-HPLC柱：Macherey+Nagel Nucleodur Gravit)'C8,(5flm),4.6x150mm
-流动相：A：水0.05％TFA；B：MeCN0.05％TFA
-梯度：0min30％B；10min95％B；14min95％B；14min95％B；14.5min30％
-流速：1.0ml/min
-样品：1.30mCi/ml，在甲醇中(48.1MBq/ml)
-进样量：5.0μl(6.5μCi，240KBq)
-UV检测：254nm
-温度：30℃
-放射性检测器：Berthold LB513
-混合物：Zinsser Quicksz int Flow302
-流速：2.0mL/min
-保留时间：7.17min(UV)；7.30min(放射性检测器)(两个保留时间之间的差值是由于2个检测器是串联安装的)。
实施例2：式(I)化合物对刺猬蛋白信号通路及其在平滑受体上的固定的调节作用 的展示
在体外通过分析多能成纤维细胞C3H10T1/2细胞系在通过合成激活剂SAG激活这些细胞的刺猬蛋白信号通路之后的分化来测定本发明的式(I)化合物对该通路的抑制作用。根据小脑颗粒细胞的原代培养物的生长对化合物X的活性也进行评价。如Chen et al.,Genes Dev.,2002,16,2743所述，通过与氟硼二吡咯-环巴胺(body-cyclopamine)竞争还测定了该最后提及的化合物结合小鼠平滑受体的能力，所述氟硼二吡咯-环巴胺是一种衍生自环巴胺的与受体的跨膜域结合的荧光化合物。
1-材料和方法
式(I)化合物在C3H10T1/2细胞上对刺猬通路的抑制：
将式(I)的测试化合物溶解于二甲亚砜中直到浓度为10mM，然后在使用前一直储存于-20℃的温度下。
将C3H10T1/2多能成纤维细胞系(ATCC)在ATCC所建议的条件下培养。根据Chen etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2002,99,14071和Frank-Kamenetsky et al.,J.Biol.,2002,1,10所述的方法使用0.1μM SAG激活这些细胞。
采用SAG的激活导致细胞系的分化并使其表达碱性磷酸酶(AP)。因而有可能经由测量碱性磷酸酶(AP)活性来测量刺猬蛋白信号通路的活性。
在添加浓度为1nM至30μM的测试化合物前24小时以及在0.1μM SAG的存在下，使用含有10％胎牛血清的DMEM(杜尔贝克改良的伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium))作为培养基，将C3H10T1/2细胞以5×103细胞/孔的密度接种于96孔板中。以一式四份进行试验。然后将板在37℃的温度、5％CO2气氛下孵育5至6天。然后将细胞在冷磷酸盐缓冲液(“磷酸盐缓冲血清”：PBS)中洗涤，然后在4℃下通过超声法在50μL含0.9％NaCl和0.2％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的溶液中裂解。
为了比较，在与用于测试本发明的各种式(I)化合物相同的条件下对刺猬蛋白信号通路的其它已知抑制剂的活性进行测试：
-环巴胺，如Incardona et al.,Development,1998,125,3553所述，其对应于下式：
-如上所述的MRT-83，以及
-LDE225，如Pan and Dorsch；ACS Med.Chem.Lett.,2010,1:130-134所述，其对应于下式：
然后根据Pepinsky等人(J.Biol.Chem.,1998,273,14037)所述的方法测量碱性磷酸酶(AP)在所获得的裂解产物中的活性。添加100μL反应缓冲液(200mM Tris-HCl；pH10.5；0.4M2-氨基-2-甲基丙醇和8mM MgCl2)以及50μL底物(4mM对硝基苯基磷酸二钠)之后，将裂解产物在37℃下孵育30-60min，然后在415nm波长下读取光密度。
式(I)化合物对小脑颗粒细胞的前体细胞的增殖的活性：
从出生8天(P8)的大鼠(IFFA-CREDO，法国)的小脑中分离颗粒细胞前体细胞(GCP)。取出小脑，切成小块，置于Krebs-Ringer缓冲液(120mM NaCl，5mM KCl，1mM KH2PO4，25mM NaHCO3，15mM葡萄糖，0.04mM酚红)中，并在室温下在由添加有250mg/ml胰蛋白酶(Sigma，法国)的Krebs-Ringer组成的解离缓冲液中孵育15分钟。通过添加等体积的含250mg/ml胰蛋白酶抑制剂和80mg/ml DNase(Sigma，法国)的Krebs-Ringer缓冲液使酶解离停止。将组织以100g离心10秒，然后将获得的沉淀物重悬浮并使用直径渐减的巴斯德吸管(Pasteur pipettes)研磨以获得分离细胞的悬浮液。将该悬浮液以200g离心5分钟，并将获得的沉淀物重悬浮于补充有1mM丙酮酸酯、2mM L-谷酰胺、盘尼西林/链霉素和1％增补剂N2、60mg/ml N-乙酰基半胱氨酸和100mg/ml牛血清白蛋白(BSA，Sigma，法国)的神经细胞基础培养基(Neurobasal medium)中。
将获得的小脑GCP以2×105细胞/孔的密度转移到预先用聚-D-赖氨酸处理的96孔板中。立即在存在或不存在其它测试物情况下加入SAG。培养结束前12小时，添加氚化胸腺嘧啶(3H-胸腺嘧啶)。抽吸细胞并使用自动化细胞收集器(Brandel,USA)在玻璃纤维过滤器(GF/C)上回收细胞。在液体闪烁计数器(Wallac,USA)中，在闪烁剂的存在下量化细胞所包含的放射量。
式(I)化合物与氟硼二吡咯-环巴胺(BC)的竞争：
使用用人Smo受体(human smo receptor)稳固转染的HEK293系细胞。根据Roudautet al.,Mol.Pharmacol.79:453-460,2011所述的方法进行实验。通过使用简化PCI6.2软件(Hamamatsu Corporation)拍摄和量化的荧光的降低(参考照片上存在的核的表面积)来测量式(I)化合物对氟硼二吡咯-环巴胺(BC)的结合的抑制。
氚化化合物 3 H-(7d)的放射性结合的试验：
在富含平滑受体的膜上进行结合试验。使用HEK-hSmo系细胞来制备这些膜。将细胞在冰冷的PBS中洗涤和回收。在4℃下以100g离心7分钟之后，将沉淀物收集在其10倍体积的冰冷的缓冲液A(50mM HEPES，pH7.4，1mM EDTA)中(每ml缓冲液添加有10μl蛋白酶抑制剂的混合物(PEAK，Sigma))，然后使用Polytron研磨机将其匀浆。在4℃下以500g离心30分钟后(这使得有可能从细胞中除去核)，在4℃下以48000g将上清液再次离心45min。将沉淀物收集在2ml添加有PEAK的缓冲液A中，然后使用玻璃圆锥形研磨机将悬浮液匀浆，并使其通过23G针。最后，将等分溶液置于Eppendorf管中并储存于-80℃。通过Lowry方法使用用于制备标准范围的BSA测定制备物中总蛋白质的浓度。该浓度为10.9mg/ml。
将膜重悬浮于含有0.2％BSA的缓冲液(50mM HEPES和3mM MgCl2)中。在聚丙烯试管中进行3H-(7d)结合试验。在37℃下，将膜(2μg蛋白质)与3H-(7d)在存在或不存在冷测试化合物的情况下一起以400μl的最终体积孵育3小时。通过将试管浸泡在冰水中接着通过预先用0.3％聚乙烯亚胺处理过的玻璃纤维过滤膜(GF/C)快速过滤(Brandel)来停止孵育，该快速过滤能够减少3H-(7d)与过滤膜的非特异性结合。在液体闪烁计数器中在3ml闪烁剂的存在下测量过滤器上保留的放射性。将特异性结合定义为能被1μM如Romer et al.,CancerCell,2004,6,229所述的且对应于下式的GDC-0449抑制的结合：
2-式(I)化合物的生物活性的结果
式(I)化合物在C3H10T1/2细胞上对刺猬通路的抑制：
对式(I)化合物、参比化合物环巴胺、LDE225和MRT-83获得的结果在下表1中示出。对于每种化合物，评价了在用0.1μM的SAG诱导后可抑制50％碱性磷酸酶(AP)活性的浓度(IC50)。对化合物(7d)和参比化合物获得的抑制曲线在图1A中示出。
表1：化合物对C3H10T1/2细胞的分化的活性
*：参比化合物不构成本发明的部分
还对化合物(7d)的活性与化合物MRT-10以及与各种硫脲化合物(下面的化合物20至27)进行比较。结果总结在表2中。
20:R5＝R7＝OMe，R6＝H； 24：2-OMe，R5＝R7＝H，R6＝OMe.
21：R5＝R7＝OMe，R6＝OEt； 25:R5＝R6＝R7＝OEt；
22：R5＝R6＝OEt，R7＝OMe； 26：R5-R6＝-OCH2CH2O-，R7＝H；
23：R7＝OMe，R5·R6＝-OCH2O-； 27:R5＝R6＝OMe，R7＝H
表2：化合物(7d)、MRT-10和硫脲化合物对C3H10T1/2细胞的分化的活性比较。
平均值±SEM：n≥3
测定所选的分子对于SAG诱导的大鼠小脑的颗粒细胞前体细胞的增殖的亲和力：
小脑PCG响应于Shh信号通路的激活而增殖，该响应可以被Smo拮抗剂抑制(Rohatgi et al.,2009,Proc.Natl.Acad.Sci.USA106:3196-201)。因而我们通过测量增殖过程期间氚化胸腺嘧啶(新合成的DNA标记物)的引入来分析化合物(7d)抑制大鼠小脑PCG在原代培养物中增殖的能力。递增浓度的SAG导致氚化胸腺嘧啶的引入在基线上方呈剂量依赖性增加。化合物(7d)显示对SAG(0.01μM)诱导的PCG的增殖为完全拮抗剂的性质，IC50为0.45nM(图1B)。LDE225、化合物MRT-83和环巴胺也阻断这种增殖，但亲和力较弱，它们的IC50分别为3、6和103nM(表3)。
测定所选的分子对于氟硼二吡咯-环巴胺(BC)对平滑受体的结合的亲和力：
为了研究化合物(7d)与Smo的结合的性质，我们分析了该分子是否可以与氟硼二吡咯-环巴胺(BC)(b)的结合相竞争，BC在这些跨膜域水平与Smo相互作用。在存在或不存在不同浓度的化合物(7d)、MRT-83、LDE225和环巴胺的情况下将细胞与BC(5nM)一起孵育2小时。在孵育结束时，将细胞固定并用DAPI染色，DAPI是一种对DNA具有高亲和力的荧光分子，在荧光显微镜检查法中可以使细胞核呈蓝色而被可视化。检测的4种分子以剂量依赖性方式阻断BC与稳定地表达人Smo受体的HEK-hSmo细胞的结合。观察到化合物(7d)和MRT-83的亲和力相似且亲和力高(图1C)。所有这些数据表明化合物(7d)是人和小鼠Smo受体的强效拮抗剂(表1)。
表3：化合物(7d)、MRT-83、LDE225、GDC-0449和环巴胺的活性的比较
通过测量在Shh-Light2细胞中由ShhN(4nM)诱导的Gli-荧光素酶报告子的活性(1)、与SAG(0.1μM)诱导的C3H10T1/2细胞的分化相关的碱性磷酸酶(AP)的活性(2)、引入3H-胸腺嘧啶之后SAG(0.01μM)诱导的大鼠小脑的PCG的增殖活性(3)以及氟硼二吡咯-环巴胺(BC)与HEK-hSmo细胞中表达的人Smo受体的结合(4)来测定IC50值(根据图1的曲线)。
进行的所有实验突出显示了式(I)化合物在体外调节Shh通路的能力。它们的活性可以通过在氟硼二吡咯-环巴胺(BC)的竞争性位点上与平滑蛋白结合来解释。
3-放射性配体3H-(7d)的结合特性的结果
放射性配体 3 H-(7d)与人平滑受体的缔合动力学：
化合物(7d)是Hh信号通路的非常强效的拮抗剂，这激励我们合成该分子的氚化形式：化合物3H-(7d)。我们通过研究化合物3H-(7d)与HEK293细胞膜(稳定表达人Smo受体(HEK-hSmo))的匀浆结合的缔合动力学开始表征这种放射性配体的性质。在25℃和37℃下，在固定浓度的放射性配体(0.35nM)和固定量的受体(2μg的蛋白质)的存在下检测化合物3H-(7d)的缔合5小时。在该实验中，问题在于测定特异性结合化合物3H-(7d)达到平衡状态所花费的时间。在25℃下，在孵育5小时后，尚未达到平衡。在37℃下，在孵育3小时后达到平衡并且在孵育5小时后仍保持平衡(图2)。孵育超过5分钟后，化合物3H-(7d)的非特异性结合(在0.1μM GDC0449的存在下定义的)低(总结合的0.4％)并且在整个实验中保持稳定。
在25℃(蓝色)或37℃(粉红色)下将HEK-hSmo细胞的膜(2μg的蛋白质)与0.35nM3H-(7d)在终体积为0.4ml的HEPES缓冲液(0.2％BSA)中孵育5h。在1μM GDC-0449(一种参比Smo拮抗剂)的存在下评价非特异性结合。通过GraphPad Prism对特异性结合的分析给出半数缔合时间在37℃下为33min以及在25℃下为71min。数据为三次测定的平均值±SEM(代表性实验，n＝2)。
化合物 3 H-(7d)与人平滑受体的结合的饱和度的实验：
然后通过研究化合物3H-(7d)与HEK-hSmo系细胞膜中表达的Smo受体结合的饱和度来表征化合物3H-(7d)的性质。问题在于在固定量的受体(2μg的蛋白质)的存在下在递增浓度的放射性配体的孵育过程中，测量平衡时的特异性结合。化合物3H-(7d)与在HEK-hSmo细胞膜中表达的Smo受体的特异性结合的饱和度(使用1μM GDC-0449定义)在图3A中示出。对该曲线的分析表明通过Scatchard表示法可视化的单结合位点具有高亲和力：Kd＝0.3±0.1nM和Bmax＝1086±91cpm(图3B)。
为了确保化合物3H-(7d)与Smo受体的结合确实是特异性的，我们还进行了HEK293细胞的膜(采用未转染编码人Smo受体的cDNA)的饱和度实验。GDC-0449(1μM)对化合物3H-(7d)与这些膜的结合没有影响。因此，化合物3H-(7d)与HEK-hSmo细胞膜的结合对于Smo受体确实是特异性的。
化合物 3 H-(7d)与人平滑受体的结合的药理学分析：
在Smo的拮抗剂和激动剂的存在下分析化合物3H-(7d)与HEK-hSmo系的细胞膜表达的Smo受体结合的药理学特征。在该实验中，冷配体与放射性配体竞争性地结合该受体，并且可以基于从抑制曲线中推导出来的IC50值分析每种冷配体对该受体的亲和力(Ki)。冷化合物(7d)对于抑制化合物3H-(7d)与Smo的结合是最强效的(IC50＝1.5nM)。化合物LDE225、GDC-0449和MRT-83的IC50值分别为4nM、12nM和11nM。浓度为1μM的GDC-0449完全抑制化合物3H-(7d)的特异性结合。对于每个实验，在1μMGDC-0449的存在下定义非特异性结合。环巴胺和化合物Cur61414也能够抑制化合物3H-(7d)的结合，但亲和力低得多，特别是Cur61414，仅具有微摩尔浓度量级的IC50值(图4)。对于激动剂，SAG显示出纳摩尔浓度量级的亲和力(IC50＝5nM)，而purmorphamine是无活性的(IC50>1000)(图5)。对于这些化合物计算的Ki值在表3中示出。
表4：参比分子相对于化合物3H-(7d)与人平滑受体的结合的亲和力
通过测量化合物3H-(7d)与在HEK-hSmo系细胞中表达的人Smo受体的结合来测定IC50值和Ki值。数据为2-3次代表性实验的平均值±SEM。

Claims (28)

1.一种化合物，其特征在于其对应于下式(I)：
其中：
-R1、R2和R3可以相同或不同，彼此独立地表示氢或卤素原子、羟基基团、烷基、全氟烷基、烷氧基、烷硫基或腈基，
-X表示O、S或NH，
-R4和R7可以相同或不同，彼此独立地表示氢或卤素原子或烷基，
-R5表示选自以下的被至少一个R6基团取代的基团之一：
R6表示卤素原子或烷基、烷氧基、氨基烷基、硫代烷基或羟基，
其中：
所述烷基为直链或支链的饱和的脂肪族烃基团，具有1至6个碳原子；
所述全氟烷基为如上文所定义的烷基基团，其中所有的氢原子被氟原子替换；
所述烷氧基为O-烷基基团，其中烷基基团如上文所定义；
所述烷硫基和硫代烷基为烷基-S基团，其中烷基基团如上文所定义；
所述氨基烷基为烷基-N基团，其中烷基基团如上文所定义。
2.如权利要求1所述的式(I)化合物，其特征在于R1、R2和R3表示烷氧基基团。
3.如权利要求2所述的式(I)化合物，其中所述烷氧基基团是甲氧基基团。
4.如权利要求1或权利要求2所述的式(I)化合物，其特征在于X是NH。
5.如权利要求1或权利要求2所述的式(I)化合物，其特征在于R4和R7表示氢或氯原子、甲基、乙基或异丙基。
6.如权利要求1或权利要求2所述的式(I)化合物，其特征在于R6表示卤素原子或者烷氧基或氨基烷基。
7.如权利要求1或权利要求2所述的式(I)化合物，其特征在于所述化合物选自：
-N-(N-(3-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺盐酸盐，其具有下式：
-N-(N-(3-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺盐酸盐，其具有下式：
-3,4,5-三甲氧基-N-(N-(4-甲基-3-(4-(3-苯基丙基)苯甲酰氨基)苯基)脒基)苯甲酰胺，其具有下式：
-3,4,5-三甲氧基-N-(N-(4-甲基-3-(4-苯乙基苯甲酰氨基)苯基)脒基)苯甲酰胺，其具有下式：
-(E)-N-(N-(3-(4-肉桂基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺盐酸盐，其具有下式：
-N-(N-(3-(4-苄基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺盐酸盐，其具有下式：
-N-(N-(3-(4-苄基苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺，其具有下式：
-N-(N-(3-(4-(苄氧基)苯甲酰氨基)-4-甲基苯基)脒基)-3,4,5-三甲氧基苯甲酰胺，其具有下式：
8.权利要求1至7中的一项所述的式(I)化合物用于制备药物的用途，其中所述药物：
用于治疗与刺猬蛋白信号通路的超活化相关的肿瘤；
用于治疗帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化或运动神经元病；
用于治疗与脑发育相关的疾病；
用于治疗脑血管意外和心血管意外；或者
用于治疗糖尿病。
9.如权利要求8所述的式(I)化合物的用途，其特征在于所述与刺猬蛋白信号通路的超活化相关的肿瘤是神经组织肿瘤、皮肤肿瘤、肌肉和骨组织的肿瘤或其它组织的肿瘤。
10.如权利要求9所述的式(I)化合物的用途，其中神经组织肿瘤是成神经管细胞瘤、原发性神经外胚层肿瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤或少突神经胶质瘤。
11.如权利要求9所述的式(I)化合物的用途，其中皮肤肿瘤是基底细胞癌或毛发上皮癌。
12.如权利要求9所述的式(I)化合物的用途，其中肌肉和骨组织的肿瘤是横纹肌肉瘤或骨肉瘤。
13.如权利要求9所述的式(I)化合物的用途，其中其它组织的肿瘤是肾、膀胱、前列腺、肺、胃或胰腺的肿瘤。
14.如权利要求8所述的式(I)化合物的用途，其中所述药物用于治疗帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化或运动神经元病。
15.如权利要求8所述的式(I)化合物的用途，其中所述药物用于治疗与脑发育相关的疾病，用于治疗脑血管意外和心血管意外。
16.如权利要求15所述的式(I)化合物的用途，其中所述与脑发育相关的疾病是前脑无裂畸形。
17.权利要求1至7中的一项所述的式(I)化合物用于体外调节人或动物干细胞的更新的用途。
18.如权利要求8所述的式(I)化合物的用途，其中所述药物用于治疗糖尿病。
19.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物包含作为活性成分的至少一种如权利要求1至7中的一项所述的式(I)化合物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
20.标记的式(I)化合物作为研究工具的用途，尤其用于鉴定能够与平滑受体或相关受体相互作用的分子。
21.一种放射性标记权利要求1至7中的一项所述的式(I)化合物的方法，其特征在于所述方法包括在氚3H气氛下氚化式(I)化合物的步骤，当所述式(I)化合物被不具有烯属双键的R5基团取代时，所述方法包括卤化的初始步骤。
22.如权利要求1至7中的一项所述的式(I)化合物，其特征在于其至少一个氢原子被氚原子3H替换，并且其可根据权利要求21的方法获得。
23.一种筛选和/或鉴定平滑受体的Smo结合位点的配体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)使平滑受体与至少一种式(I)化合物相接触以获得复合物[Smo-式(I)化合物]；
b)使平滑受体、所述式(I)化合物和测试分子相接触；
c)通过对步骤b)中回收的平滑受体与复合物[Smo-式(I)化合物]进行比较来检测所述平滑受体和所述测试分子之间的相互作用；以及
d)选择测量到与平滑受体具有相互作用的所述测试分子。
24.如权利要求23所述的筛选和/或鉴定的方法，其特征在于步骤a)在液相中进行，以及所述方法包括以下步骤：
a)使平滑受体与至少一种式(I)化合物相接触以获得复合物[Smo-式(I)化合物]；
b)使平滑受体、所述式(I)化合物和测试分子相接触；
c)回收任选地与一个或多个测试分子和/或与所述式(I)化合物键合的所述平滑受体；
d)通过对步骤c)中回收的平滑受体与复合物[Smo-式(I)化合物]进行比较来检测所述平滑受体和所述测试分子之间的相互作用；以及
e)选择测量到相互作用的所述测试分子。
25.一种鉴定平滑受体的激动剂的方法，其特征在于所述方法包括权利要求23或24的方法之一的步骤，以及以下额外的步骤：
-使鉴定的配体与平滑受体激活之后能显示细胞响应的细胞相接触，以及
-选择能够诱导所述细胞的所述细胞响应的激动剂分子。
26.一种鉴定为平滑受体的拮抗剂的分子的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)将平滑受体激活后能显示细胞响应的细胞与至少一种式(I)化合物一起培养以便诱导所述细胞响应；
b)使步骤a)结束时获得的细胞与测试分子相接触；
c)选择诱导所述细胞的所述细胞响应的抑制的分子。
27.一种鉴定表达平滑受体的细胞的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)使待测细胞与标记的式(I)化合物相接触；
b)清洗细胞以除去未与待测细胞的任何受体相结合的所述标记的式(I)化合物；
c)检测标记的细胞。
28.一种试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含至少一种功能性平滑受体和至少一种权利要求1至7中的一项所述的式(I)化合物。
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