PT1745791E - Tratamento de afeções cartilagíneas/ósseas com sais de estrôncio hidrossolúveis - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO "TRATAMENTO DE AFEÇÕES CARTILAGÍNEAS/ÓSSEAS COM SAIS DE ESTRÔNCIO HIDROSSOLÚVEIS"

Campo da invenção A presente invenção diz respeito a compostos e composições farmacêuticas para uso no tratamento e profilaxia da osteoporose.

Antecedentes da invenção A osteoporose é a forma mais comum de doença metabólica óssea no ser humano. É uma patologia que afeta um elevado número de pessoas em todo o mundo e, dado se esperar um aumento dramático da população idosa na maior parte dos paises e nas próximas décadas, a sua prevalência e impacto também aumentarão. A doença caracteriza-se, do ponto de vista patológico, por uma diminuição absoluta da quantidade de massa óssea e da qualidade estrutural dos ossos e, do ponto de vista clinico, por um aumento do risco de fracturas. De facto, a osteoporose é a causa subjacente mais significativa de fraturas nas mulheres idosas ou de meia idade avançada.

De um modo geral, existem dois tipos de osteoporose: a primária e a secundária. A osteoporose secundária é consequência de um processo ou agente de doença identificável. Contudo, aproximadamente 90% de todos os casos desta doença são de osteoporose idiopática primária. Este tipo de osteoporose primária inclui a forma pós-menopáusica, a osteoporose senil (que afeta a maioria dos 2 indivíduos entre os 70 e os 80 anos de idade) e a osteoporose idiopática que afeta homens e mulheres de meia idade, assim como mais novos.

Acredita-se que o mecanismo de perda óssea na osteoporose envolve um desequilíbrio no processo de renovação óssea. A renovação óssea ocorre ao longo da vida, renovando o esqueleto e mantendo a robustez dos ossos. Esta renovação é mediada por células especializadas do tecido ósseo, chamadas "osteoclastos" e "osteoblastos". Os osteoclastos (células que dissolvem ou reabsorvem o tecido ósseo) são responsáveis pela reabsorção de uma parte do tecido ósseo dentro da matriz óssea, durante o processo de reabsorção, durante a reabsorção óssea. Após a reabsorção, segue-se o aparecimento dos osteoblastos (células formadoras de tecido ósseo) que por sua vez, enchem a porção reabsorvida com tecido novo. A formação dos dois tipos celulares assim como a sua atividade nos ossos estão estreitamente ligadas e bem reguladas, de modo a manter o equilíbrio esquelético e a integridade estrutural dos ossos. Contudo, nas pessoas com osteoporose há o desenvolvimento de um desequilíbrio no processo de renovação, que resulta na perda de tecido ósseo a uma velocidade superior à da sua reposição. O fator de risco individual mais importante de osteoporose é a deficiência em estrogénios que ocorre naturalmente na menopausa. O declínio na produção endógena de estrogénios leva a um aumento da atividade metabólica do tecido ósseo, no qual o aumento da reabsorção óssea osteoclástica ultrapassa o aumento mais modesto da ossificação, com a consequente perda efetiva de massa óssea. O número efetivo 3 de pessoas afetadas por esta patologia irá aumentar a uma velocidade superior à das taxas normais de crescimento da população, pois o envelhecimento das populações está a aumentar desproporcionalmente o seu escalão etário superior, enquanto a idade para o aparecimento da menopausa se mantém constante. Nas últimas décadas também houve um avanço substancial da capacidade de prever e monitorizar a osteoporose, à medida que os métodos de medição da densidade mineral óssea (DMO) melhoraram e novos marcadores bioquímicos específicos para a reabsorção e ossificação também foram desenvolvidos e disponibilizados para uso na prática clínica de rotina. Novos agentes farmacêuticos para o tratamento e/ou prevenção da osteoporose têm igualmente vindo a ser desenvolvidos. A maioria destes tratamentos baseiam-se na substituição dos estrogénios endógenos perdidos, quer sob a forma de terapia de substituição hormonal (TSH) quer sob a forma de moduladores seletivos dos receptores dos estrogénios (SERM) ou então pertencem à classe dos compostos designados por bifosfonatos. Os SERM, e em especial a TSH, estão associados a efeitos secundários significativos como, por exemplo, um risco aumentado de cancro e de doença cardiovascular, enquanto os bifosfonatos, para além de um potente efeito antirreabsorção, também diminuem a ossificação numa extensão similar, o que implica a perda do seu efeito terapêutico após poucos anos de tratamento. Por conseguinte, há necessidade de agentes que sejam eficazes no tratamento e/ou profilaxia da osteoporose. SOBERA L A ET AL: STRONTIUM RANELATE TREATMENT AND PREVENTION OF OSTEOPOROSIS BONE RESORPTION INHIBITOR BONE FORMATION STIMULANT" DRUGS OF THE FUTURE, PROUS SCIENCE, ES, vol. 28, n° 4, 1 de abril de 2003 (1/4/2003), páginas 4 328-335, divulgam o uso de um sal de estrôncio solúvel de um ácido orgânico (ranelato de estrôncio, um aminoácido sintético substituído por tiofeno que não ocorre naturalmente) para o tratamento da osteoporose. Nos estudos discutidos no referido documento, o ranelato de estrôncio foi administrado um vez ao dia, ver tabela I, 1000 mg por via oral, uma vez ao dia. 0 referido documento descreve ainda que o ranelato de estrôncio tem boa biodisponibilidade. O referido documento é, portanto o mais próximo do técnica anterior.

Descrição da invenção

Estudos anteriores demonstraram que vários compostos de estrôncio modulam a perda óssea na osteoporose, quando presentes em niveis superiores aos necessários para a fisiologia celular normal. Acredita-se que este efeito se deva a uma estimulação causada pelo estrôncio na diferenciação celular pré-osteoblástica e migração e também a uma inibição direta ou mediada pela matriz da atividade dos osteoclastos (Reginster, JY, Curr pharm Des 2002:8 (21):1907-16). Ou seja, o estrôncio tanto funciona como agente de antirreabsorção como como agente anabólico. São conhecidos vários sais de estrôncio da técnica anterior como, por exemplo, o ranelato de estrôncio (sal de diestrôncio do ácido 2-[N,N-di(carboximetil)amino]-3-ciano-4-carboximetiltiofeno-5-carboxílico), descrito no documento EP-B 0 415 850. Não é provável que a parte ranelato do composto de estrôncio, derivado do ácido ranélico, tenha por si mesmo, qualquer efeito terapêutico nas afeções cartilagineas ou ósseas. Outros sais de estrôncio conhecidos incluem, por exemplo, o tartarato de estrôncio, o fosfato de estrôncio, o carbonato de estrôncio, o nitrato 5 de estrôncio, o sulfato de estrôncio e o cloreto de estrôncio.

As formas naturais dos sais de estrôncio, tais como os carbonatos e os sulfatos, têm uma solubilidade em água muito baixa (0,15 g/L ou inferior, à temperatura ambiente). Em contraste, os outros sais de estrôncio, tais como o cloreto, hidróxido, nitrato, óxido e acetato de estrôncio, têm valores de solubilidade em água muito elevados, na ordem dos 225 - 800 g/L. Neste aspecto, os sais de estrôncio são muito semelhantes aos sais correspondentes de magnésio e de cálcio.

Foram descritos sais orgânicos de estrôncio mas a literatura cientifica sobre este tipo de compostos limita-se a um número muito restrito de substâncias. Mais uma vez, nestes casos, as propriedades físico-quimicas foram descritas como sendo muito semelhantes às dos sais correspondentes de magnésio, cálcio e bário. Os ácidos carboxilicos podem formar sais cristalinos estáveis com metais alcalino terrosos divalentes, como o estrôncio, e os ácidos dicarboxilicos têm um interesse especial pois podem ter um efeito quelante parcial. Esta complexação poderá ser importante nos sistemas biológicos, nos quais os metais alcalino terrosos, em particular o cálcio e o magnésio, têm relevantes papéis fisiológicos. Por esse motivo, os iões de metais divalentes podem existir numa forma complexada no meio aquoso dos sistemas biológicos, em vez de existirem numa forma iónica livre e não ligada. As constantes de complexação com metais alcalino terrosos em solução aquosa são mais elevadas para os aminoácidos do que para os ácidos hidroxicarboxilicos e ácidos não carboxilicos relacionados, o que sugere que o grupo amino poderá ter um papel na 6 formação dos complexos. De um modo geral, as diferenças entre as constantes de associação para os vários ligandos tornam-se cada vez mais pequenas à medida que o raio do metal aumenta e deste modo a estabilidade dos complexos de estrôncio com um ácido dicarboxilico é menor do que a estabilidade de um complexo semelhante com cálcio e magnésio.

Este facto é muito importante para uma aplicação farmacêutica dos sais de estrôncio pois significa que os sais de estrôncio de aminoácidos dicarboxilicos poderão ser particularmente úteis. Descobrimos que estes sais como, por exemplo, o glutamato de estrôncio e o aspartato de estrôncio são mais solúveis que outros sais dicarboxilicos de estrôncio de tamanho molecular semelhante. Em soluções aquosas puras destes sais, o estrôncio existe numa forma parcialmente complexada. No entanto, quando administrado a animal, tal como um mamifero como, por exemplo, o rato, o cão, o macaco ou ser humano, o estrôncio iónico e o estrôncio complexado com o anião do ácido carboxilico serão absorvidos através do lúmen intestinal, tanto por um mecanismo de transporte passivo como por um ativo. Neste caso, o estrôncio será desalojado dos complexos por cálcio e magnésio que estejam disponíveis, dado estes últimos formarem complexos mais estáveis com os aminoácidos ionizados. Parece que para os átomos de metais pesados do grupo II, como é o caso do estrôncio, o grupo amino, tanto do aspartato como do glutamato, é muito menos relevante para a complexação do metal, provavelmente devido a uma quelação desfavorável de metais grandes em anéis de cinco ou seis membros. Por conseguinte, os sais de estrôncio de aminoácidos dianiónicos, como o aspartato de estrôncio e o glutamato de estrôncio podem ser especialmente apropriados 7 para intervenções profilácticas e/ou terapêuticas nas doenças ósseas, visto que os aminoácidos poderem atuar de modo a ligarem-se/complexarem-se preferencialmente com cálcio livre que esteja disponível e assim promover tanto a absorção intestinal do cálcio iónico como a sua ação fisiológica, em particular o seu papel na regulação do turnover ósseo. 0 sal de estrôncio conhecido que é hidrossolúvel tem uma solubilidade em água de pelo menos cerca de 225-800 g/L e os outros sais de estrôncio conhecidos têm solubilidades que são muito baixas (inferiores a 0,1 g/L, à temperatura ambiente).

Consequentemente, a presente invenção refere-se a um sal de estrôncio para uso no tratamento e/ou profilaxia da osteoporose, em que o sal de estrôncio é selecionado do grupo que consiste em succinato de estrôncio, aspartato de estrôncio na forma L e/ou D, glutamato de estrôncio na forma L e/ou D, piruvato de estrôncio, maleato de estrôncio, α-cetoglutarato de estrôncio, como reivindicado. A presente invenção refere-se a sais de estrôncio e composições farmacêuticas que os contêm para uso no tratamento e/ou profilaxia da osteoporose num mamífero.

Para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença e/ou afeções cartilagíneas e/ou ósseas que resultam numa desregulação do metabolismo da cartilagem e/ou osso num mamífero, tal como, por exemplo, a osteoporose, os presentes inventores constataram que o uso de um sal de 8 estrôncio tem valor profilático e/ou terapêutico podem obter um ou mais dos seguintes efeitos benéficos: i) biodisponibilidade melhorada do estrôncio; ii) absorção melhorada do estrôncio; iii) redução dos efeitos secundários; iv) ajuste flexível da dosagem do estrôncio, de modo a adaptar a prevenção e/ou tratamento de uma fase específica da doença; v) possível redução da dose diária; vi) possível redução do número das diferentes composições farmacêuticas que um paciente tem que tomar, para obter um efeito terapêutico.

Os sais de estrôncio adequados para uso de acordo com a invenção ou para uso em mistura com um sal de estrôncio de acordo com a invenção são encontrados na lista a seguir. No entanto, são objetos da presente invenção apenas aqueles sais que têm uma solubilidade em água de pelo menos cerca de 1 g/L e no máximo de cerca de 100 g/L. Estes sais de estrôncio são os sais de aminoácidos glutamato de estrôncio e aspartato de estrôncio; piruvato de estrôncio, alfa-cetoglutarato de estrôncio, maleato de estrôncio e succinato de estrôncio. O sal orgânico para preparar os sais de estrôncio podem ser selecionados do grupo que consiste em ácido maleico, ácido pirúvico, ácido L e D-aspártico, ácido L e D-glutâmico, ácido alfa-cetoglutárico e ácido succínico. O sal de estrôncio para uso de acordo com a invenção é hidrossolúvel, com um valor de solubilidade em água de pelo menos 1 g/L tal como, por exemplo, pelo menos 5 g/L, pelo 9 menos 10 g/L, pelo menos 20 g/L, pelo menos 30 g/L, pelo menos 40 g/L, pelo menos 50 g/L, pelo menos 60 g/L, pelo menos 70 g/L, pelo menos 80 g/L, pelo menos 90 g/L ou 100 g/L, medido à temperatura ambiente, isto é, a uma temperatura de 20-25 °C.

Exemplos específicos de sais de estrôncio para uso de acordo com a invenção são succinato de estrôncio, aspartato de estrôncio tanto na forma D como L, glutamato de estrôncio tanto na forma D como L, piruvato de estrôncio, maleato de estrôncio e misturas destes. O L-glutamato de estrôncio (hexa-hidratado) foi anteriormente preparado fazendo reagir o hidróxido de estrôncio com o ácido L-glutâmico sob refluxo durante 3 horas com um subsequente resfriamento e cristalização lenta durante um período de 2 semanas. Os cristais foram submetidos a cristalografia de raios X a fim de elucidar a estrutura do cristal (favor ver: H. Schmidbaur, I. Bach, L. Wilkinson & G. Muller (1989), Chem Ber. 122; 1433-1438). As investigações estavam relacionadas a uma forma cristalina dos sais de estrôncio com as propriedades descritas nas figuras 1 e 2 e nas tabelas 2 e 3.

Distâncias

Sr - 01 2,724 (2) Sr - 02 2,665 (2) Sr - 01' 2,642 (2) Sr - 02' 2,651 (2) Sr - 03' 2,677 (2) Sr - 04' 2,658 (2 Sr - 05 2,658 (2) Sr - 06 2,798 (2) Sr - 07 2,640(2) 01 - Cl 1,268 (3) 02 - Cl 1,258 (3) Cl - C2 1,521 (3) C2 - N 1,469(3) C2 - C3 1,526(3) C3 - C4 1,524 (4) C4 - C5 1,513 (4) C5 - 03 1,264(3) C5 - 04 1,264 (3) 10 Ângulos

Ol - Sr - 01' 115,4 (1) 01 - Sr - 02 48,4 (1) 01 - Sr - 02' 67,8(1) 01 -Sr - 03' 75,4 (1) 01 - Sr - 04' 120,8(1) 01 - Sr - 05 74,8 (1) 01 - Sr - 06 105,7(1) 01 - Sr - 07 146,5(1) 02 - Sr - 01' 68,8(1) 02 -Sr - 02' 115,3(1) 02 - Sr - 03' 79,3(1) 02 -Sr - 04' 122,1(1) 02 - Sr - 05 98,4 (1) 02 - Sr - 06 76,8 (1) 02 - Sr - 07 154,8 (1) 02' -Sr - 01' 153,8(1) Csl O - Sr - 03' 75,5(1) 02' -Sr - 04' 78,9 (1) Csl o - Sr - 05 70,9 (1) 02' - Sr - 06 138,1 (1) 02 - Sr - 07 86,7 (1) 03' -Sr - 01' 80,4 (1) 00 o - Sr - 04' 48,8 (1) 03' - Sr - 05 141,3(1) 00 o - Sr - 06 145,3(1) 03' - Sr - 07 120,2 (1) 04 - Sr - 01' 77,7 (1) 04' - Sr - 05 137,2(1) 04' - Sr - 06 130,7 (1) 04' - Sr - 07 72,0 (1) 01' - Sr - 05 135,2 (1) 01' - Sr - 06 67,7 (1) 01' - Sr - 07 97,1(1) 07 - Sr - 05 76,5 (1) 07 - Sr - 06 78,5(1) 06 - Sr - 05 67,6(1) 01 - Cl - 02 122,1 (2) 01 - Cl - C2 119,7 (3) 02 - Cl - C2 118,2 (3) Cl - C2 - N 114,5(2) N - C2 - C3 111,1(2) Cl - C2 - C3 109,9 (2) C2 - C3 - C4 114,5(2) C3 - C4 - C5 114,1(3) C4 - C5 - 03 119,7 (2) C4 - C5 - 04 118,7 (2) 03 - C5 - 04 121,5(2)

Tabela 2: Distâncias [Â] e ângulos [°] para L-glutamato de estrôncio hexa-hidratado como descrito por Schmidbaur et ai., 1989. Para numeração atómica favor ver a figura 1. Para a preparação de operações de simetria 01' foi derivado de 01 pela operação: 0,5 + X, 0,5 - X, -Z; 02' foi derivado de 02 pelas operações X - 0,5, 0,5 - Y, -Z; e 03' e 04' foram derivados de 03 e 04 respectivamente pela operação X, Y-l, Z. Os parênteses indicam as unidades estimadas do último número significativo. Átomo X/A Y/B Z/C c CD Sr 0,9078 0,1999 0,0562 0,016 11 01 0,7595 0,3566 -0,0465 0,023 02 1,0591 0,3655 -0,0393 0,022 Cl 0,9123 0,4069 -0,0655 0,017 C2 0,9206 0,5254 -0,1202 0,019 N 0,7562 0,5338 -0,1612 0,031 C3 0,9679 0,6810 -0,0913 0,024 C4 0,8471 0,7306 -0,0342 0,033 C5 0,8953 0,8849 -0,0059 0,021 03 0,9030 0,9998 -0,0434 0,024 04 0,9172 0,8970 0,0557 0,026 05 0,7071 0,4172 0,1114 0,029 06 1,0006 0,4051 0,1232 0,030 07 0,8664 0,1049 0,1788 0,034 08 0,3894 -0,1997 0,2655 0,042 09 0,9133 -0,3339 0,1451 0,033 010 0,7665 -0,1770 0,2495 0,047 Tabela 3: Coordenadas atómicas fracionais e parâmetros térmicos isotrópicos equivalentes para L -glutamato de estrôncio hexa-hidratado como descrito por Schmidbaur et al., 1989. Ueq = (Ui*U2*U3) , onde Ui, U2 e U3 são os valores intrínsecos da matriz Uj±. Para nomenclatura atómica favor referir à figura 1.

Como fica evidente a partir dos dados divulgados nas figuras 1 e 2 e nas tabelas 2 e 3, o sal de glutamato de estrôncio na forma hexa-hidratada descrita por Schmidbaur et al., é um cristal de forma ortorrômbica que pertence ao grupo espacial P2i2i2i. 0 tamanho das células é definido pelas seguintes dimensões (dadas em Â): a 3,355, b 8,772, c 20,283, com um volumes celular unitário de 1308,6 A . A solubilidade do glutamato de estrôncio isolado (hexa-hidratado) com as propriedades como descrito (Schmidbaur, I. Bach, L. Wilkinson & G. Muller (1989), Chem Ber. 122; 1433-1438), foi relatada como 0,25 g/L a 20 °C. 12 0 L-aspartato de estrôncio foi também preparado anteriormente fazendo reagir o ácido L-aspártico com o hidróxido de sódio. A reação foi realizada durante 3 horas sob refluxo e a mistura de reação resultante foi deixada a arrefecer durante três dias para iniciar a formação de cristal. Os cristais de L-aspartato de estrôncio resultantes foram submetidos a cristalografia de raios X a fim de elucidar a estrutura do cristal (favor ver H. Schmidbaur, P. Mikulcik & G. Muller (1990), Chem Ber. 123; 1599-1602). As investigações revelaram que o sal de L-aspartato de estrôncio isolado foi formado na forma tri-hidratada com as propriedades descritas nas figuras 2 nas tabelas 4 e 5.

Distâncias

Sr - 01 2,713 (4) Sr - 03" 2,666 (6) Sr - 04" 2,799 (7) Sr - 05 2,568 (8) Sr - 0/ 2, 627 (3) 02 - Cl 1,254 (7) C2 - C3 1,510 (9) 03 - C4 1,29(1) 01 - Sr - 02 48,0 (1) 02 - Sr - 03' 88,5 (2) 04" - Sr - 03' 65,4 (2) 06 - Sr - 03' 140,5 (2) 03' - Sr - 07 73,3 (2) 02 - Sr - 03" 152,6 (2) 03" - Sr - 05 97,1 (2) 03" - Sr - 07 80,8(1) 02 - Sr - 04" 141,9 (2) 04" - Sr - 06 107,6 (2) 01 - Sr - 04'" 83,3 (2) 03 - Sr - 04'" 152,7 (2) 04" - Sr - 04'" 115,2(2) 06 - Sr - 04'" 66,6 (2) Ângulos

Sr - 02 2,707 (5) Sr - 03" 2,635 (8) Sr - O 2,580 (7) Sr - 06 2,683 (7) 01 - Cl 1,258 (7) Cl - C2 1,540 (8) C3 - C4 1,522 (7) 04 - C4 1,23 (1) 06 - Sr 01 - - Sr - - 03' 00 d^ 2 (2) O 00 - SR - 03' 112 ,4 (2) 05 - - Sr - - 03' 70, 3 (2) co O - Sr - - 04' " 152 ,7 (2) 01- - Sr- 03" 146 ,9(2) co o - Sr - 04" d^ 00 1 (D co O - Sr - 06 00 0 (2) 01 - - Sr - - 04" 144 ,2 (2) 04" - Sr - 05 C\] 6 (2) 04" - Sr - 07 76, 6 (2) 02 - Sr - 04' " 100 ,8(2) CO O - Sr - - 04' " 69, 0 (2) 05 - Sr - 04' " 137 ,0 (2) 07 - Sr - 04' " 00 o 3 (2) Sr 13 01 - Sr - 06 107,9 (2) 02 - Sr - 06 74,6(2) 05 - Sr - 06 70,7 (1) 01 - Sr - 07 76,9(1) 01 - Sr - 05 115,7(2) 02 - Sr - 05 72,7(2) 02 - Sr - 07 123,7 (1) 05 - Sr - 07 139,5 (2) 06 - Sr - 07 145,5(2) 01 - Cl - 02 122,5 (5) 01 - Cl - C2 118,2 (5) 02 - Cl - C2 119,1(5) N - C2 - Cl 116,3(5) N - C2 - C3 111,4 (6) Cl - C2 - C3 109,9 (5) C - C3 - C4 115,2 (6) 03 - C4 - 04 123,8(5) 03 - C4 - C3 117 (1) 04 - C4 - C3 119(1)

Tabela 3: Distâncias [Â] e ângulos [°] para L-aspartato de estrôncio tri-hidratado como descrito por Schmidbaur et al., 1990. Para numeração atómica favor ver a figura 3. Os parênteses indicam as unidades estimadas do último número significativo. Átomo X/A y/B z/c U (eq.) Sr 0,2512 0,12345 0,01532 0,022 01 0,247 -0,1101 -0,1041 0,046 02 0,1997 -0,1361 0,0783 0,039 03 0,3983 -0,6359 0,0410 0,049 04 0,0957 -0,6194 0,0327 0,040 05 0,0536 0,1264 0,1947 0,059 06 0,4661 0,0865 0,1965 0,033 07 0,238 0,2068 -0,1951 0,039 N 0,230 -0,3876 -0,1511 0,037 Cl 0,2138 -0,1831 -0,0196 0,038 C2 0,1785 -0,3343 -0,0395 0,036 C3 0,263 -0,4160 0,0549 0,046 C4 1,1116 -0,5682 0,0416 0,034 Tabela 4: Coordenadas atómicas fracionais e parâmetros térmicos isotrópicos equivalentes para L -glutamato de estrôncio hexa-hidratado como descrito por Schmidbaur et al., 1990. Ueq = (Ui*U2*U3) , onde Ui, U2 e U3 são os valores intrínsecos da matriz Uji. Para nomenclatura atómica favor referir à figura 3. 14

Como fica evidente a partir dos dados divulgados na figura 3 e nas tabelas 3 e 4, o sal de glutamato de estrôncio na forma hexa-hidratada descrita por Schmidbaur et al., é um cristal de forma ortorrômbica que pertence ao grupo espacial P2i2i2i. 0 tamanho das células é definido pelas seguintes dimensões (dadas em Â) : a 7,304, b 9,914, c 11,837, com um volumes celular unitário de 857,1 Â3. A solubilidade do sal de glutamato de estrôncio tri-hidratado isolado não foi relatada (Schmidbaur, P. Mikulcik & G. Miiller (1990), Chem Ber. 123; 1599-1602). Síntese dos sais de estrôncio

Esta seção sobre síntese não faz parte da invenção.

Os sais orgânicos de estrôncio e aniões do ácido carboxílico podem ser sintetizados por diversas vias. O método convencional de preparação destes sais orgânicos de estrôncio é recorrendo à reação entre um ácido orgânico e o hidróxido de estrôncio, em solução aquosa. Esta reação de neutralização entre, por exemplo, o ácido fumárico e o hidróxido de estrôncio segue o seguinte esquema:

Sf2*(aq}+ 20«- (ag)+ HOQCCHCmOOH&®-+ SriQOCCHCHCOO)iaq^2M>Q$ A suspensão de fumarato de estrôncio dissolvido é em seguida induzida a precipitar através da sublimação da água e subsequente concentração do sal. Os cristais vão formar-se lentamente e precipitar na solução.

Outro método alternativo é utilizar o sal de sódio ou de potássio do anião do ácido carboxílico apropriado e o 15 cloreto de estrôncio. Como todos os sais orgânicos de estrôncio serão menos solúveis que o altamente solúvel sal de cloreto, o sal orgânico de estrôncio vai precipitar nestas condições, com formação de NaCl e excesso de SrCl2 em solução. A equação seguinte exemplifica esta reação, recorrendo à reação entre o SrCl2 e o fumarato de sódio.

15 C^N2042-U

Sfi*(aq) + 2Cl· (ag)+ 2Na+ (aq) CCHCHCOO)(aq}*Cfi£ujfiNa*ia(fi

Os inventores também constataram que diferentes sais de estrôncios requerem diferentes vias de síntese e, para alguns deles, identificamos sínteses e procedimentos de fabrico otimizados. Foi descoberto que a síntese de sais de estrôncio dos aminoácidos dicarboxílicos, aspartato e glutamato (tanto na forma D como na L) , é muito difícil quando se seguem as vias de reação convencionais, resultando geralmente em baixo rendimento e grau de pureza do sal cristalino obtido. De modo a facilitar a produção em larga escala de sais puros de estrôncio e de aminoácidos dicarboxilicos, destinados ao uso farmacêutico, de acordo com esta invenção, os seus inventores estudaram várias vias de síntese destes sais de estrôncio, em particular. Deste modo, foi com surpresa que se constatou que é preferível que a síntese de glutamato de estrôncio hexa-hidratado, bem definido e puro seja executada com a forma de ácido livre do glutamato e com hidróxido de estrôncio o que requer temperaturas elevadas, superiores a 80 °C ou de preferência 100 °C ou 120 °C ou mesmo preferivelmente superiores a 130 °C. Para além disso, constatamos que a adição de pequenos volumes de álcool pode acelerar a formação de cristais a partir dos sais orgânicos de estrôncio dissolvidos em água. Os inventores descobriram igualmente que a síntese de L- 16 glutamato de estrôncio a partir do ácido L-glutâmico e do SrCÍ2 resulta numa forma cristalina hexa-hidratada, distinta da forma anteriormente descrita de L-glutamato de estrôncio hexa-hidratado.

Exemplos destes procedimentos de sintese de sais orgânicos de estrôncio com relevância para uso no tratamento e/ou profilaxia da osteoporose num mamífero são fornecidos nos exemplos inclusos neste documento.

Um método de preparação de sais de estrôncio, incluindo o glutamato de estrôncio, é aqui descrito.

Como já foi mencionado anteriormente, acredita-se que o estrôncio tem um efeito sobre as afeções cartilagíneas e/ou ósseas e/ou outras afeções e, por conseguinte, o seu sal poderá ser usado na preparação de uma composição farmacêutica destinada ao tratamento e/ou profilaxia de uma afeção cartilagínea e/ou óssea incluindo a osteoporose, tal como reivindicado. A composição farmacêutica pode ainda incluir um ou mais excipientes fisiologicamente aceitáveis.

Para uso no tratamento e/ou profilaxia de uma doença cartilagínea e/ou óssea, tal como reivindicado, e/ou afeções que resultam numa desregulação do metabolismo cartilagíneo e/ou ósseo num mamífero, a possibilidade de administração de diferentes quantidades de estrôncio na forma de um dos sais reivindicados e, se relevante, o alfa-cetoglutarato ou um aminoácido como por exemplo o ácido glutâmico e/ou ácido aspártico, respectivamente pode ser desejada. A quantidade de estrôncio (e, se relevante, por exemplo, alfa-cetoglutarato ou um aminoácido) numa composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser 17 ajustada pela adição de uma quantidade adicional de estrôncio sob a forma de um composto que contém estrôncio (e/ou, se relevante, uma quantidade adicional de alfa-cetoglutarato ou um aminoácido) da composição. Os compostos que contêm estrôncio são selecionados dos sais reivindicados.

Como foi mencionado anteriormente, os compostos e composições da presente invenção podem ser usados para o tratamento e profilaxia de várias patologias. Desse modo, é também divulgado um método para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença cartilaginea e/ou óssea e/ou patologias que resultam numa desregulação do metabolismo cartilagineo e/ou ósseo num mamífero, tal como as doenças acima mencionadas. 0 indivíduo pode ser um mamífero como, por exemplo, um ser humano ou um animal doméstico como por exemplo, um gato, um cão, um cavalo, uma vaca ou uma ovelha. A invenção também proporciona um método para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença cartilaginea e/ou óssea e/ou patologias que resultam numa desregulação do metabolismo cartilagineo e/ou ósseo num mamífero, tal como as doenças acima mencionadas, o método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade do sal de estrôncio de acordo com a invenção. A dose diária pode ser de pelo menos 0,01 g, como, por exemplo, pelo menos cerca de 0,025 g, pelo menos cerca de 0,050 g, pelo menos cerca de 0,075 g, pelo menos cerca de 0,1 g, pelo menos cerca de 0,2 g, pelo menos cerca de 0,3 g, pelo menos cerca de 0,4 g ou pelo menos cerca de 0,5 g 18 ou de cerca de 0,01 g a cerca de 2 g, como, por exemplo, de cerca de 0,1 g a cerca de 2 g, de cerca de 0,3 g a cerca de 2 g ou de cerca de 0,3 g a cerca de 1 g. A invenção, além do mais, refere-se a compostos para uso como reivindicado num método em que a administração pode ser feita uma ou mais vezes ao dia, como seja, de 1 a 5 tomas diárias. A invenção também se refere a compostos para uso como reivindicado em que a administração pode ser feita uma ou mais vezes por semana, como seja, de 1 a 3 tomas semanais.

Sais e composições de estrôncio/alfa-cetoglutarato O tecido ósseo consiste numa matriz orgânica que compreende predominantemente colagénio tipo I, e uma fase inorgânica que compreende fosfato de cálcio e carbonato de cálcio. A sequência de aminoácidos do colagénio tipo I é excecionalmente regular com quase cada terceiro residuo sendo glicina. A prolina também se encontra presente num grau muito maior em colagénio do que na maior parte de outras proteínas. Além disso, a sequência glicina - prolina - 4-hidroxiprolina repete-se frequentemente. Supõem-se que o alfa-cetoglutarato (AKG) seja um agente de aumento da densidade mineral óssea e de aumento da resistência óssea para o tratamento da osteoporose e outras doenças ósseas, uma vez que o alfa-cetoglutarato é um precursor do glutamato, que pode ser convertido em prolina, um importante componente do colagénio. O alfa-cetoglutarato também participa da conversão da prolina em 4-hidroxiprolina. Os resíduos de prolina no colagénio podem ser hidroxilados em C-4 por prolil hidroxilase para formar 19 4-hidroxiprolina. Para estes processo são necessários alfa-cetoglutarato, oxigénio molecular e ascorbato.

Para além disso, o alfa-cetoglutarato é um intermediário muito importante no ciclo do ácido cítrico. No ciclo do ácido cítrico a acetil CoA é completamente oxidada em C02 por meio de interconversões de vários ácidos carboxílicos, incluindo o AKG. Isto resulta na redução de NAD e FAD em NADH e FADH2, cujo poder de redução é então utilizado indiretamente na síntese de ATP.

Para uso no tratamento e/ou profilaxia de uma doença cartilagínea e/ou óssea e/ou patologias que resultam numa desregulação do metabolismo cartilagíneo e/ou ósseo num mamífero, tal como, por exemplo, um ser humano do sexo masculino ou feminino adulto, adolescente ou criança, tal como por exemplo, a osteoporose, os presentes inventores constataram que o uso de um composto que contém estrôncio juntamente com um composto que contém alfa-cetoglutarato tem valor profilático e/ou terapêutico, em que um ou mais dos seguintes efeitos benéficos podem ser obtidos: vii) biodisponibilidade melhorada do estrôncio e/ou alfa-cetoglutarato, viii) absorção melhorada do estrôncio e/ou alface toglutarat o, ix) redução dos efeitos secundários; X) ajuste flexível da dosagem do estrôncio e alfa-cetoglutarato, de modo a adaptar a prevenção e/ou tratamento de uma fase específica da doença; xi) aditivo e possível efeito sinérgico do estrôncio e alfa-cetoglutarato, 20 xii) possível redução da dose diária; xiii) possível redução do número das diferentes composições farmacêuticas que um paciente tem que tomar, para obter um efeito terapêutico.

Desse modo, acredita-se que o estrôncio, administrado juntamente com o alfa-cetoglutarato proporciona uma prevenção e/ou tratamento mais eficaz do que o estrôncio e o alfa-cetoglutarato administrados individualmente. Isto implica que doses menores de estrôncio e o alfa-cetoglutarato podem ser utilizadas quando administrados juntos, em comparação com a administração individual dos dois compostos. A dose diária de alfa-cetoglutarato necessária para o tratamento e/ou profilaxia de algumas das patologias acima mencionadas pode ser bastante grande, isto é, o indivíduo em necessidade de tratamento terá de tomar grandes quantidades de alfa-cetoglutarato de cada vez, ou a frequência da toma das doses pode ser elevada, ambos sendo de grande inconveniência para o indivíduo. A possibilidade de utilizar doses mais pequenas de estrôncio e alfa-cetoglutarato seria muito mais conveniente para o indivíduo em necessidade de tratamento. É descrito um sal de estrôncio do ácido alfa-cetoglutárico com a seguinte fórmula I: "OOC-CH2-CH2-C (=0) -COO' SR2+ (I) que pode ser sob a forma de hidrato, anidro, solvato, polimorfa, amorfa, cristalina, microcristalina ou polimérica. 0 sal da fórmula acima mencionada é composto de duas 21 substâncias ativas, isto é, um agente de reabsorção óssea e um agente anabólico ósseo sob a forma de estrôncio, e depois uma outra quantidade de um agente de aumento da densidade mineral óssea, agente de aumento da resistência óssea e qualidade óssea sob a forma de alfa-cetoglutarato. Em comparação com outros sais de estrôncio conhecidos anteriormente, tais como, por exemplo, o ranelato de estrôncio ou o cloreto de estrôncio, em que apenas o ião estrôncio tem um efeito terapêutico e/ou profilático sobre as doenças ósseas e/ou cartilagineas, ambos os componentes no novo sal são componentes ativos que têm um efeito terapêutico e/ou profilático.

Pela utilização do sal em formulações farmacêuticas, pode ser possivel reduzir o tamanho das formulações, embora seja administrada a mesma dose de estrôncio e alfa-cetoglutarato que nas formulações que compreendem o estrôncio e o alfa-cetoglutarato como sais separados, juntamente com os seus respectivos contra-iões.

Além disso, como descrito acima, a combinação de estrôncio e alfa-cetoglutarato no sal pode ter os efeitos aditivos ou sinérgicos sobre o tecido ósseo e/ou cartilagineo. Além disso, o novo sal tem propriedades adequadas no que diz respeito a propriedades fisico-quimicas tais como, por exemplo, a hidrossolubilidade; e tem propriedades técnicas adequadas para processar o novo sal em composições farmacêuticas. A invenção também proporciona um método para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença óssea e/ou cartilaginea, tal como as doenças mencionadas acima, o método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma 22 quantidade do sal de alfa-cetoglutarato de estrôncio de acordo com a invenção.

No método anterior, em que o alfa-cetoglutarato de estrôncio é administrado, o sal pode ser administrado numa dose que corresponde a cerca de 0,1 a cerca de 17 g por dia calculado como sal anidro. Mais especificamente, o sal pode ser administrado numa dose que corresponde a cerca de 0,2 a cerca de 15 g por dia, tal como, por exemplo, de cerca de 0,4 a cerca de 13 g por dia, de cerca de 0,6 a cerca de 12 g por dia ou de cerca de 0,7 a cerca de 11,5 g por dia, calculado como sal anidro.

Composições de glutamato de estrôncio

Com acima mencionado o alfa-cetoglutarato pode ser convertido no aminoácido glutamato, que é um precursor da glutamina, arginina e prolina, esta última sendo um importante componente do colagénio. Desse modo, o aminoácido glutamato é também considerado um agente importante no tratamento de doença óssea e/ou cartilagínea, e acredita-se que a administração de estrôncio e glutamato juntos sob a forma de um sal de glutamato de estrôncio tem um valor profilático e/ou terapêutico em que podem ser obtidos um ou mais dos efeitos benéficos acima mencionados em relação ao estrôncio e o alfa-cetoglutarato. Além disso, o glutamato pode afetar diretamente receptores específicos de glutamato presentes nos osteoclastos de reabsorção, e desse modo afetam a atividade metabólica e a ação de reabsorção óssea destas células.

Desse modo, é também divulgado o uso de um sal de glutamato de estrôncio de fórmula II: 23 COOC-C (NH3+) H-CH2-CH2-COO") 2 SR2+ (II) como um medicamento bem como um método para preparação do glutamato de estrôncio. A invenção também se refere a métodos específicos de produção do sal de estrôncio da invenção que envolve a sintese a temperaturas superiores a 100 °C. É também divulgado o uso do glutamato de estrôncio para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença óssea e/ou cartilaginea e/ou que resulta numa desregulação do metabolismo cartilagineo e/ou ósseo num mamífero, tal como, por exemplo, um ser humano do sexo masculino ou feminino adulto, adolescente ou criança, tal como aqui descrito anteriormente. A invenção também proporciona um método para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença óssea e/ou cartilaginea, tal como por exemplo, um ser humano do sexo masculino ou feminino adulto, adolescente ou criança, tal como as doenças acima mencionadas, o método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade do sal de glutamato de estrôncio de acordo com a invenção.

No método anterior, em que o glutamato de estrôncio é administrado, o sal pode ser administrado numa dose que corresponde de cerca de 0,2 a cerca de 28 g por dia calculado como sal anidro. Mais especificamente, o sal pode ser administrado numa dose que corresponde a cerca de 0,3 a cerca de 25 g por dia tal como, por exemplo, de cerca de 0,7 a cerca de 20 g por dia, de cerca de 1 a cerca de 17 g 24 por dia ou de cerca de 1,2 a cerca de 16 g ou de cerca de 2 a cerca de 6 g por dia calculado como sal anidro.

Como mencionado acima, a dose diária de estrôncio pode ser de pelo menos cerca de 0,01 g, tal como, por exemplo, pelo menos cerca de 0,025 g, pelo menos cerca de 0,050 g, pelo menos cerca de 0,075 g, pelo menos cerca de 0,1 g, pelo menos cerca de 0,2 g, pelo menos cerca de 0,3 g, pelo menos cerca de 0,4 g ou pelo menos cerca de 0,5 g ou de cerca de 0,01 a cerca de 2 g tal como, por exemplo, de cerca de 0,1 g a cerca de 2 g, de cerca de 0,3 a cerca de 2 g ou de cerca de 0,3 a cerca de 1 g.

Composições de aspartato de estrôncio O aspartato é uma aminoácido estruturalmente relacionado como o glutamato, que também pode formar sais farmaceuticamente relevantes em complexo com estrôncio. Uma vez que todos os aminoácidos, exceto o aspartato de glicina existem numa forma L, que é a forma fisiologicamente relevante usada em todos os sistemas biológicos e o enantiómero de "imagem espelho" indicado como D-aspartato. O D-aspartato pode afetar, direta ou indiretamente, o metabolismo ósseo e/ou cartilagineo por meio de ligação ao receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA), que foi encontrado em osteoclastos metabolicamente ativos e também pode estar presente em condrócitos de cartilagem articular. Desse modo, a presente invenção também se refere a um sal de aspartato de estrôncio (sob a forma D ou L ou uma misturas dos mesmos) de fórmula (III) rooc-c (NH3+) H-COCf) 2 (III)

Sr2+ 25 como um medicamento, tal como agora reivindicado. É também divulgado um método para a preparação de aspartato de estrôncio. A invenção também se refere a métodos específicos de produção do sal de estrôncio da invenção que envolve a síntese a temperaturas superiores a 100 °C. É também divulgado o uso do aspartato de estrôncio para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou profilaxia de uma doença óssea e/ou cartilagínea num mamífero, tal como, por exemplo, um ser humano do sexo masculino ou feminino adulto, adolescente ou uma criança, tal como, por exemplo, do sexo masculino e feminino. A composição farmacêutica pode ainda compreender um ou mais excipientes fisiologicamente aceitáveis.

Composições farmacêuticas

As composições farmacêuticas usadas nesta invenção normalmente incluem os componentes específicos, um ou mais excipientes fisiologicamente aceitáveis, isto é, uma substância ou veículo terapeuticamente inerte. O veículo poderá assumir variadíssimas formas, dependendo da dosagem pretendida e da via de administração.

Os excipientes farmacologicamente aceitáveis podem ser, por exemplo, espessantes, ligantes, desintegrantes, diluentes, deslizantes, solventes, emulsificadores, suspensores, estabilizadores, intensificadores, aromatizantes, corantes, reguladores de pH, agentes retardantes, agentes humidificadores, agentes tensioativos, conservantes, antioxidantes, etc. Podem ser encontrados mais detalhes em livros farmacêuticos como, por exemplo, Ciência 26

Farmacêutica de Remington (Remington's Pharmaceutical Science) ou Manual de Excipientes Farmacêuticos (Pharmaceutical Excipient Handbook).

No texto anterior são dados exemplos específicos das quantidades de produtos administradas. Contudo, subentende-se que a quantidade de cada composto que é na prática administrada será determinada pelo médico, tendo em conta as circunstâncias consideradas relevantes, incluindo a afeção que se quer tratar, a escolha dos compostos a administrar, a idade, o peso e a resposta individual de cada paciente, a gravidade dos seus sintomas e via de administração escolhida. Embora os presentes compostos sejam administrados de preferência pela via oral, podem também ser administrados por outra via considerada adequada. A composição farmacêutica incluindo um composto de acordo com a invenção pode apresentar-se na forma sólida, semissólida ou liquida. A composição sólida pode apresentar-se sob a forma de comprimidos como, por exemplo, comprimidos convencionais, efervescentes, revestidos, de derreter ou sublinguais, pastilhas, pós, grânulos, granulados, material em partículas, dispersões sólidas ou soluções sólidas.

Num caso especifico da invenção, a composição farmacêutica pode apresentar-se sob a forma de comprimido. 0 comprimido pode ser coberto com um revestimento que permite a libertação de pelo menos parte do sal para a zona proximal do intestino delgado como, por exemplo, o duodeno e/ou o jejuno proximal, como pelo menos 50% p/p, pelo menos 60% 27 p/p, pelo menos 65% p/p, pelo menos 70% p/p, pelo menos 80% p/p ou pelo menos 90% p/p da quantidade total de sal contido no comprimido. O comprimido pode ter uma forma que torne a sua deglutição fácil e cómoda para o paciente. O comprimido pode assim ser, por exemplo, arredondado ou em forma de bastonete, sem arestas agudas. Além disso, o comprimido pode ser concebido de modo a poder ser dividido em duas ou mais partes.

Uma forma semissólida da composição pode ser uma pasta, um gel ou um hidrogel. A forma liquida da composição pode ser uma solução, uma emulsão incluindo as nanoemulsões, uma suspensão, uma dispersão, uma composição lipossómica, um pulverizador, uma mistura, um xarope ou um elixir.

Outras formas de dosagem adequadas da composição farmacêutica, de acordo com a invenção, podem incluir cápsulas, saquetas, trociscos, dispositivos, etc. As composições farmacêuticas podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos dos técnicos especializados em formulação farmacêutica.

Outros aspectos da invenção

Outras formas de realização da invenção surgem das reivindicações anexas. Os detalhes e particularidades descritos anteriormente e relativos aos compostos e composições de acordo com a invenção aplicam-se, com as convenientes alterações de pormenor, aos outros aspectos da invenção. 28

Legendas das figuras

Figura 1: Estrutura molecular do L-glutamato de estrôncio (6*H20) na forma cristalina como divulgado por Schmidbaur et al., 1989. 0 cristal é apresentado com átomos representados como elipsoides (definidos ao nivel de 50% de probabilidade de acordo com o programa ORTEP (Oak Ridge Thermal Ellipsoid Plot Program)). A complexação por Sr2+ por três aminoácidos adicionais simetricamente relacionados é indicada apenas pelos átomos de carboxi oxigénio de coordenação 01, 02, e 03/04.

Figura 2: Estrutura da camada estendida de L-glutamato de estrôncio (6*H20) na forma cristalina como divulgado por Schmidbaur et al. , 1989. Os átomos de estrôncio são mostrados em cinza e as moléculas de água intersticiais em preto.

Figura 3: Estrutura molecular do L-glutamato de estrôncio (6*H20) na forma cristalina como divulgado por Schmidbaur et al., 1990. 0 cristal é mostrado com átomos representados com raios arbitrários. A complexação por Sr2+ por quatro aminoácidos adicionais simetricamente relacionados é indicada apenas pelos átomos de carboxi oxigénio de coordenação 03'/03" e 04"/04'".

Figura 4: Difractogramas da análise de raios X de dois sais de estrôncio. 0 difractograma do alto mostra o glutamato de estrôncio hexa-hidratado, como sintetizado por hidróxido de estrôncio e ácido L-glutâmico a alta temperatura mas usando as condições de reação descritas no exemplo 2. 29

Figura 5: Difractograma de raios X de cristais de glutamato de estrôncio hexa-hidratado preparado segundo o método descrito no exemplo 7.

Figura 6 de referência: Difractograma de raios X de cristais de malonato de estrôncio preparado segundo o método descrito no exemplo 7. 0 sal de malonato de estrôncio não tinha sido anteriormente caracterizado e inclui uma nova estrutura cristalográfica, mas é evidente a partir da sua linha de base estável e espaçamento bem definido dos picos de difração, que a forma cristalina do sal de malonato é homogénea e pura.

Figura 7: Resultados da otimização das experiências para a sintese do glutamato de estrôncio, resumidos na tabela 9. A influência no rendimento da síntese do glutamato de estrôncio, foi investigada fazendo variar quatro parâmetros. (Rendimentos superiores a 100% indicam secagem incompleta).

Figura 8: Gráficos das concentrações de estrôncio sérico medidas em ratos a quem foi administrada uma dose única de estrôncio, tal como indicado na parte superior de cada painel. Os pontos representam a média e o desvio padrão de cada medição. As pré-doses representam amostras correspondentes colhidas em animais tratados apenas com o veículo.

Figura 9: Modelagem da teoria (linha sólida) para dados experimentas (diamantes) de estrôncio com barras de erro sobrepostas. A teoria encaixa-se perfeitamente nos dados e as áreas sob as curvas /AUC) são calculadas pelo modelo. O teor de estrôncio sempre atinge o pico depois de 60 minutos 30 mas o segundo pico definido pela taxa de metabolismo varia entre os sais. Nos presentes exemplo, o Sr-a-cetoglutarato é rapidamente metabolizado ao passo que o Sr-glutamato permanece mais tempo no soro.

Exemplos

Exemplo 1 - Exemplo de referência Método geral de preparação de sais cristalinos de estrôncio por precipitação a partir de cloreto de estrôncio dissolvido e de sais de sódio dissolvidos dos aniões carboxilicos adequados.

Num gobelé de vidro de 100 mL, dissolveram-se 5 g de sal sódico do ácido carboxilico num pequeno volume de água ligeiramente aquecida a uma temperatura não superior a 30-50 °C. 0 volume final foi de 25-50 mL. Noutro gobelé dissolveram-se 10 g de SrCl2 (SrCl2 hexa-hidratado, Sigma-Aldrich 43,966-5) em 100 mL de água. Esta segunda solução foi decantada lentamente para a primeira solução do sal sódico dissolvido. A transferência continuou até se observar o inicio de turvação, resultando num volume total de 50-100 mL. Deixou-se a solução em repouso à temperatura ambiente (22-24 °C) durante vários dias até a precipitação de quantidades significativas de sal orgânico de estrôncio cristalizado. A reação que se segue é exemplificada pela reação entre os iões de estrôncio e o fumarato de sódio (equações da reação (a) e (b) ) : 31 N30QCCHCHC00Na(s}+l·Í20iJ)-^~00CCl·ÍCHC00H{aq}+2N3^{sq)+0l·fiaq} (a) -OOCCHCHCOOfiaq}+Sr2^ (aq}-» Sri/X)CCttCHCaO)(®q)+ H*(aq) fb)

De modo a acelerar a cristalização, descobrimos que a adição de pequenos volumes de etanol, como seja de 5 - 10 % vol/vol a 50 - 60 % vol/vol, induz uma aceleração siqnificativa da precipitação do sal de estrôncio pretendido. A adição de etanol é de especial importância na sintese de sais de estrôncio com uma solubilidade que exceda os 2 g/L à temperatura ambiente (22-24 °C) e que, desse modo, proporciona um beneficio substancial para a sintese de sais de estrôncio de L-aspartato, L-glutamato e lactato. De modo a obter o produto necessário, dentro de um curto espaço de tempo, era essencial obter uma cristalização ou turvação iniciais, logo a partir da primeira fase.

Após a precipitação, a solução foi filtrada com um funil de Buchner e um quitasato e os cristais foram lavados com pequenos volumes de etanol. Os cristais de alguns dos sais eram muito solúveis, de modo que para melhorar o rendimento em cristais, a solução foi deixada em repouso durante mais tempo, pelo menos durante 30 a 60 minutos. A cristalização repetida teve como resultado rendimentos de aproximadamente 50%. Os sais de estrôncio de L-aspartato e de lactato eram muito solúveis, com solubilidades em água excedendo os 25 g/L, à temperatura ambiente.

Os sais de lactato e de L-glutamato de estrôncio foram precipitados a partir de soluções com excesso de cloreto de estrôncio e foram obtidos cristais grandes do sal de lactato por evaporação lenta do solvente. 32

Exemplo 2 - Exemplo de referência Método geral para a preparação de sais cristalinos por neutralização de ácidos carboxilicos com hidróxido de estrôncio.

Uma pequena quantidade do ácido orgânico adequado (0,75 - 3 g, ver tabela seguinte) foi dissolvida em água por aquecimento a temperaturas entre 30 °C a 50 °C. Em seguida, o hidróxido de estrôncio (Sigma Aldrich, Sr(OH)2*8H20, PM 265,71, CAS no. 1311-10-0, aprox. 10 g/L) foi adicionado lentamente. 0 passo seguinte foi a adição de uma barra magnética e iniciou-se a agitação e aquecimento suave (isto é, a 30 - 50 °C) da suspensão. Após algum tempo, a solução clarifica e todos os materiais sólidos se dissolvem. Mantém-se o aquecimento e após três horas de incubação, a solução é filtrada, enquanto quente, num funil de Buchner. Pequeníssimas quantidades de impurezas ficam retidas no filtro.

Em seguida, deixou-se o filtrado arrefecer à temperatura ambiente, de um dia para o outro, o que resultou no crescimento de pó fino de cristais do sal de estrôncio pretendido. Purificações adicionais dos sais pode ser efetuada através de sucessivas recristalizações (tabela 6).

Sal de estrôncio de (ácido livre usado): Sr (OH) 2 *8H20 Ácido livre Quan tidade obtida Recupe ração* Temperatura de fusão Solubi lidade Estrutura dos cristais Fumarato1 2,044 g 1,140 g 0, 999 g 99% >380 °C Sim Não a- cetoglutarato2 2,017 g 1, 441 g 0, 828 g 72% >380 °C Sim Não Succinato 2,098 g 1,177 g 0, 958 g 92% 230 °C Sim Sim L-Ascorbato3 2,094 g 1, 805 g 2, 005 g 15% >380 °C Sim Não 33 L-Glutamato 2,017 g 1,453 g 0,175 g 15% >380 °C Sim Sim Citrato 2,057 g 1,918 g 1,123 g 48% >380 °C Sim Sim D-Aspartato 2,190 g 1,316 g 0,167 g 14% >380 °C Não Não Tartarato 2,070 g 1,502 g 2,005 g 129% >380 °C Sim Sim

Tabela 6: Quantidades do reagente inicial usado para a síntese de sal orgânico de estrôncio e percentagens de recuperação da síntese de oito sais orgânicos de estrôncio específicos seguindo a via geral de reação entre as formas de ácido livre do anião e o hidróxido de estrôncio.

Notas *) Recuperação calculada em % do teor de estrôncio, sob a forma de Sr(OH)2 *8H20. 1) 0 ácido fumárico é insolúvel em água e adiciona-se etanol à suspensão até se obter a completa solubilização. A síntese continua com este material. 2) Os sais de estrôncio e alfa-cetoglutarato têm um aspecto ligeiramente acastanhado e uma % temperatura de fusão. 3) Para além das quantidades indicadas de hidróxido de estrôncio e L-ascorbato, são adicionados mais 4,087 g de SrCl2*6H20 dissolvidos em água à mistura de reação.

Exemplo 3

Determinações da solubilidade dos sais orgânicos de estrôncio Síntese dos sais de estrôncio A grande maioria dos sais de estrôncio poderiam ser obtidos através da reação entre o sal sódico do ácido orgânico e o cloreto de estrôncio, de acordo com o método geral de 34 síntese descrito no exemplo A. No entanto, citrato de estrôncio, tartarato de estrôncio, succinato de estrôncio e α-cetoglutarato de estrôncio usados nos estudos de solubilidade foram obtidos por síntese a partir das formas de ácido livre do ácido carboxílico e do hidróxido de estrôncio, tal como é descrito no exemplo 2. 0 glutamato de estrôncio foi obtido, como descrito no exemplo 4, através de uma temperatura de incubação de 100 °C e usando cloreto de estrôncio e ácido L-glutâmico para a sua síntese, de modo a obter cristais hexa-hidratados puros e homogéneos de glutamato de estrôncio. Como descrito no exemplo 4, o sal de glutamato de estrôncio obtido por este método é diferente de uma forma de L-glutamato de estrôncio cristalino anteriormente descrita. Os estudos detalhados de solubilidade foram efetuados com os sais de estrôncio listados na tabela 7:

Sal de estrôncio PM % Sr Sr-ranelato (17H20) 1 639, 6 27,4 SrCl2 (1 6H20) 1 266, 6 32,9 Sr-fumarato (16H20) 1 309, 7 28,3 Sr-L-glutamato (16H20) 340,7 25, 7 Sr-a-cetoglutarato (16H20) 339, 7 25, 8 Sr-aspartato (13H20) 272,7 32,1 Sr-succinato (16H20) 311,7 28,1 Sr-ascorbato (16H20) 1 545, 8 16,1 Sr-maleato (16H20) 309, 7 28,3 Sr-malonato (11H20) 1 207,7 42,2 Sr-piruvato (16H20) 369, 7 23,7 Sr-tartarato (16H20) 1 343, 7 25, 5 Sr-citrato (16H20) 1 749, 1 35,1 1

Compostos de referência

Tabela 2: Resumo dos sais de estrôncio usados nos estudos de solubilidade. PM refere-se ao peso molecular da forma cristalina homogénea do sal mais as moléculas de água 35 indicadas e a % Sr refere-se à percentagem molar de estrôncio existente nesta forma cristalina.

Foi medida a solubilidade em água dos sais orgânicos de estrôncio e ácido carboxilico. A solubilidade destes sais foi igualmente medida em função da temperatura. Este estudo foi executado incubando as soluções saturadas dos sais em incubadoras de temperatura controlada. Para além disso, a solubilidade dos sais foi estudada tanto em água destilada pura como em soluções tamponadas de carbonato de amónio 0,05 M, com pH fisiológico de 7,5.

As soluções tamponadas foram imersas num banho-maria com temperatura controlada, à temperatura ambiente (22 - 24 °C) , a 30 °C ou a 40 °C. Os tubos de ensaio foram agitados e as soluções colocadas numa incubadora com temperatura constante durante 24 horas. De modo a eliminar a influência na determinação da solubilidade de quaisquer vestígios de cloreto de estrôncio, todo o precipitado foi recolhido no fundo dos tubos de ensaio e os sobrenadantes foram cuidadosamente retirados e substituídos por soluções frescas. Após a substituição das soluções, os tubos de ensaio foram novamente agitados e deixados em repouso por mais 24 horas. As porções de sal de estrôncio dissolvidas foram recolhidas destas soluções, em volumes de 1 mL, à temperatura especificada. As soluções foram diluídas a um volume final de 50 mL, antes de serem analisadas por Espectroscopia de Absorção Atómica (EAA) com atomização por chama. Antes de efetuar subsequentes séries de amostragem, as soluções foram equilibradas durante 24 horas na temperatura seguinte do estudo. 36

Análise do estrôncio por Espectroscopia de Absorção Atómica (EAA) com atomização por chama

Foram usados dois métodos para a quantificação do estrôncio nas soluções: Espectroscopia de Absorção Atómica (EAA) com atomização por chama e um método mais sensivel, a espectrometria de massa com atomização em plasma acoplado indutivamente (Inductively-coupled-plasma-mass spectrometry - ICP-MS). Para a maioria dos estudos, a EAA com atomização por chama tinha sensibilidade suficiente.

Alguns dos sais de estrôncio muito solúveis sofreram uma diluição maior antes de serem analisados por EAA com atomização por chama. As medições foram efetuadas num aparelho Perkin-Elmer 2100 equipado com uma lâmpada de hidrogénio para correção do ruido de fundo (background signal). O estrôncio foi medido usando um monocromador com fenda de 0,2 nm, comprimento de onda de 4 60,8 nm com uma energia de 58 e uma corrente eléctrica de 8 mA.

Influência da temperatura e do pH na solubilidade do sal orgânico de estrôncio

Para a maioria dos sais orgânicos de estrôncio listados na tabela 2, alterações da temperatura no intervalo dos 20 -40 °C apenas tiveram uma pequena influência na solubilidade (tabela 3) . Contudo, para o composto de referência, L-glutamato de estrôncio, observou-se uma influência

significativa da temperatura na sua solubilidade, no intervalo compreendido entre os 20 °C e os 40 °C. A solubilidade deste sal mais que triplicou no intervalo estudado, em contraste com a maioria dos outros sais. Foi observado que a solubilidade em condições fisiológicas (37 37 °C) é relevante para a utilização farmacêutica das substâncias e, assim sendo, o surpreendente aumento da solubilidade do glutamato de estrôncio com temperaturas mais elevadas pode ter um grande potencial no que diz respeito às implicações terapêuticas. A solubilidade dos sais de estrôncio numa solução tamponada de carbonato de amónio com pH 7,5 foi em geral mais elevada do que a determinada em água pura (tabela 8) . Contudo, detectaram-se algumas exceções notáveis como maleato de estrôncio, que apresentou diminuição da sua solubilidade na solução tamponada. Por esta razão, foi considerado mais relevante comparar a solubilidade dos sais de estrôncio em água, apresentando-se os valores obtidos na tabela 8.

Solubilidade relativa

Os valores da solubilidade em água dos sais orgânicos de estrôncio, à temperatura ambiente e a 40 °C, estão listados na tabela 8. Os sais de estrôncio de L-aspartato e de lactato apresentaram solubilidades superiores a 50 g/L, impedindo a sua determinação exata com os procedimentos experimentais aqui utilizados.

Os resultados correspondem a observações efetuadas durante as experiências de síntese nas quais o citrato, o fumarato e o tartarato precipitaram instantaneamente quando sintetizados segundo os métodos de produção descritos nos exemplos 1 e 2. Este facto é indicador da fraca solubilidade destes sais de estrôncio, tal como é evidente pela constatação da sua menor solubilidade por comparação com a dos outros sais de estrôncio, tanto a 22 °C como a 40 °C. 38 0 sal de glutamato demonstrou uma solubilidade superior à dos outros sais, especialmente a 40 °C. Durante a sua síntese, foi necessário adicionar álcool à solução para iniciar o crescimento dos cristais, o que é indicador de uma solubilidade em água relativamente alta. Os outros sais de estrôncio estudados apenas precipitaram após a evaporação do solvente, durante alguns dias e à temperatura ambiente, não sendo necessária a adição de álcool para iniciar a formação de cristais e a sua precipitação.

Sal de estrôncio Solubilidade à temperatura ambiente (22 - 24 °C) (mg/L) Solubilidade a 40 °C (rrg/L) Anião Em água pH 7,5 Em água pH 7,5 Málonato1 + 1474 2816 1441 2127 L-glutamato2 3 2111 3022 7093 7195 L-aspartato1 4200 7900 Piruvato2 2204 1946 1929 1829 α-cetoglutarato3 3 1316 2252 3534 3809 Fumarato1 + 571 1215 444 977 Maleato2 3002 1680 2527 1457 Tartarato1 + 883 1831 1028 1400 Ranelato4 + 760 890 1450 1970 Succinato1 1137 926 1116 2233 Citrato2 + 107 388 147 430

Tabela 8. Solubilidade relativa em soluções aquosas tamponadas com pH 7,5, a 40 °C e à temperatura ambiente (22 - 24 °C) , dos sais de estrôncio estudados, determinada por EAA com atomização por chama. 1 Ácido dicarboxílico 2 Ácido tricarboxílico 3 Ácido monocarboxílico 4 Ácido tetracarboxílico 39 + Compostos de referência Exemplo 4

Preparação de glutamato de estrôncio hexa-hidratado por síntese a 100 °C

Foi preparada inicialmente uma suspensão de ácido glutâmico (de cor branca) por adição de 100 mL de água de qualidade Millipore a 14,703 g (0,1 moles) de ácido L-glutâmico sólido (Sigma Aldrich, C5N9NO4, MW 187.14 g/mole, CAS no. 142-47, lot. no. 426560/1, filling code 43003336) num gobelé de 250 mL. A esta suspensão foram adicionados 26,66 g (0,1 moles) de SrCl2 sólido (SrC12 hexa-hidratado, Sigma Aldrich 43.966-5 MW 266.6). Em seguida, colocou-se uma barra magnética e iniciou-se a agitação e aquecimento até ao ponto de ebulição da suspensão. A suspensão final também era de cor branca e a agitação permaneceu constante através da manutenção de uma rotação média do dispositivo de agitação. De modo a evitar a entrada de dióxido de carbono na solução, o gobelé foi tapado com um vidro.

Após alguns minutos de ebulição e agitação, a solução clarificou e todos os sólidos se dissolveram. A ebulição foi mantida e adicionou-se água sempre que necessário, para repor a água perdida por ebulição. Após três horas de ebulição, a solução foi filtrada, ainda fervente, num funil de Buchner. Pequeníssimas quantidades de impurezas ficaram retidas no filtro. Em seguida, deixou-se o filtrado arrefecer até à temperatura ambiente, o que resultou no crescimento de pó fino de cristais de glutamato de estrôncio hexa-hidratado. A precipitação do produto final progrediu no filtrado em uma hora. O produto foi filtrado e 40 seco a 110 °C num forno, durante meia hora, seguido de secagem de 12 horas, num exsicador com silica-gel laranja. Antes de serem analisados por cristalografia de raios X e por EAA com atomização por chama, os sais foram reduzidos a pó fino num almofariz. A análise cristalográfica de raios X (figura 4) revelou que o glutamato de estrôncio sintetizado era diferente do L-glutamato de estrôncio hexa-hidratado anteriormente descrito apresentado nas figuras 1 e 2 e nas tabelas 2 e 3.

Este sal e o difractograma resultante correspondem ao sal de L-glutamato de estrôncio hexa-hidratado previamente descrito (H. Schmidbaur, I. Bach, L. Wilkinson & G. Muller (1989), Chem Ber. 122; 1433-1438) e adicionalmente detalhado nas figuras 1 e 2 e nas tabelas 2 e 3. O traço inferior mostra um sal de L-glutamato de estrôncio hexa-hidratado sintetizado a partir de cloreto de estrôncio e ácido L-glutâmico como divulgado no presente exemplo. O rendimento total em glutamato de estrôncio hexa-hidratado foi de aproximadamente 92% antes da recristalização e a maioria das impurezas consistia em vestigios dos reagentes e de carbonato de estrôncio. Este rendimento é significativamente superior ao rendimento obtido por sintese em condições convencionais onde apenas se obteve 15% (favor ver exemplo 2). Desse modo, o método de sintese a alta temperatura, como divulgado nesta patente, proporciona um ganho significativo em rendimento e uma redução no tempo de sintese, ao mesmo tempo que resulta num sal de glutamato de estrôncio de pureza mais elevada. Além disso, o glutamato de estrôncio obtido por meio deste procedimento de sintese era diferente do sal de glutamato 41 de estrôncio hexa-hidratado anteriormente descrito (H. Schmidbaur, I. Bach, L. Wilkinson & G. Muller (1989), Chem Ber. 122; 1433-1438) . Foi relatado que o glutamato de estrôncio hexa-hidratado descrito anteriormente na literatura cientifica por Schmidbaur et ai., tinha solubilidade muito baixa (0,023 g/L), ao passo que o sal de glutamato de estrôncio preparado pelo método divulgado no presente exemplo tinha uma solubilidade superior a 2 g/L. Este último parâmetro é muito importante para uma potencial utilização médica do sal de estrôncio tal como descrito na presente invenção.

Melhorias adicionais da síntese podem incluir a desgaseificação com azoto ou árgon da água e de todas as soluções aquosas, o que previne o contacto com o dióxido de carbono que eventualmente poderia levar à formação de impurezas de carbonato de estrôncio. Daí resulta que um técnico especializado facilmente adaptará o procedimento de modo a poder trabalhar numa atmosfera de gás inerte.

Exemplo 5

Preparação de aspartato de estrôncio tri-hidratado por sintese a 100 °C

Foi preparada inicialmente uma suspensão de ácido aspártico (de cor branca) por adição de 100 mL de água de qualidade Millipore a 13,311 g (0,1 moles) de ácido L-aspártico sólido (Fluka, C5H9NO4, MW 133,11 g/mole, CAS no. 56-84-8, lot. no. 432866/1, filling codo 52603495) num gobelé de 250 mL. A esta suspensão foram adicionados 26,571 g (0,1 moles) de hidróxido de estrôncio sólido (Sigma Aldrich, Sr (OH) 2*8H20, MW 265, 71, CAS no. 1311-10-0). Em seguida, 42 colocou-se uma barra magnética e iniciou-se a agitação e aquecimento até ao ponto de ebulição da suspensão. A suspensão final também era de cor branca e a agitação permaneceu constante através da manutenção de uma rotação média do dispositivo de agitação. De modo a evitar a entrada de dióxido de carbono na solução, o gobelé foi tapado com um vidro.

Após alguns minutos de ebulição e agitação, a solução clarificou e todos os sólidos se dissolveram. A ebulição foi mantida e adicionou-se água sempre que necessário, para repor a água perdida por ebulição. Após três horas de ebulição, a solução foi filtrada, ainda fervente, num funil de Buchner. Pequeníssimas quantidades de impurezas ficaram retidas no filtro. Em seguida, deixou-se o filtrado arrefecer até à temperatura ambiente, o que resultou no crescimento de pó fino de cristais de aspartato de estrôncio tri-hidratado. A precipitação do produto final progrediu no filtrado em uma hora. 0 produto foi filtrado e seco a 110 °C num forno, durante meia hora, seguido de secagem de 12 horas, num exsicador com silica-gel laranja. Antes de serem analisados por cristalografia de raios X e por EAA com atomização por chama, os sais foram reduzidos a pó fino num almofariz. O rendimento total de aspartato de estrôncio tri-hidratado foi de aproximadamente 98% antes da recristalização e a maioria das impurezas consistia em vestígios dos reagentes e de carbonato de estrôncio. Este rendimento é significativamente superior ao rendimento obtido por síntese em condições convencionais onde apenas se obteve 14% (favor ver exemplo 2). Desse modo, o método de síntese a alta temperatura, como divulgado nesta patente, 43 proporciona um ganho significativo em rendimento e uma redução no tempo de sintese, ao mesmo tempo que resulta num sal de aspartato de estrôncio de pureza mais elevada. 0 produto foi inequivocamente identificado como sendo aspartato de estrôncio tri-hidratado por cristalografia de raios X e por comparação dos dados obtidos com resultados da Base de Dados Cristalográficos de Cambridge (Cambridge Crystallographic Database) e informação de H. Schmidbaur, P. Mikulcik & G. Muller (1990), Chem Ber. 123; 1599-1602 como aqui representado na figura 3 na tabela 4 e 5.

Melhorias adicionais da sintese podem incluir a desgaseificação com azoto ou árgon da água e de todas as soluções aquosas, o que previne o contacto com o dióxido de carbono que eventualmente poderia levar à formação de impurezas de carbonato de estrôncio. Dai resulta que um técnico especializado facilmente adaptará o procedimento de modo a poder trabalhar numa atmosfera de gás inerte.

Exemplo 6 - Exemplo de referência

Preparação de malonato de estrôncio mono-hidratado por sintese a 100 °C

Foi preparada inicialmente uma suspensão de ácido malónico (de cor branca) por adição de 100 mL de água de qualidade Millipore a 10,406 g (0,1 moles) de ácido malónico sólido (Fluka, MW 104,06 g/mole, CAS no. 141-82-2, lot. no. 449503/1, filling code 44903076) num gobelé de 250 mL. Adicionaram-se à suspensão 26,571 g (0,1 moles) de hidróxido de estrôncio sólido (Sigma Aldrich, Sr (OH)2*8H20, MW 265.71, CAS no. 1311-10-0). Em seguida, colocou-se uma barra magnética e iniciou-se a agitação e aquecimento até 44 ao ponto de ebulição da suspensão. A suspensão final também era de cor branca e a agitação permaneceu constante através da manutenção de uma rotação média do dispositivo de agitação. De modo a evitar a entrada de dióxido de carbono na solução, o gobelé foi tapado com um vidro.

Após alguns minutos de ebulição e agitação, a solução clarificou e todos os sólidos se dissolveram. A ebulição foi mantida e adicionou-se água sempre que necessário, para repor a perdida por evaporação. Após três horas de ebulição, a solução foi filtrada, ainda fervente, num funil de Buchner. Pequeníssimas quantidades de impurezas ficaram retidas no filtro. De seguida, deixou-se o filtrado arrefecer até à temperatura ambiente, o que resultou no crescimento de pó fino de cristais de malonato de estrôncio. A precipitação do produto final progrediu rapidamente durante a filtração e a maior parte do produto ficou retida no filtro (não aquecido) . Apenas em raros momentos é que a precipitação progrediu no filtrado. 0 produto foi filtrado e seco a 110°C num forno, durante meia hora, seguido de outra secagem de 12 horas, num exsicador com sílica-gel laranja. Antes de serem analisados por cristalografia de raios X e por EAA com atomização por chama, os sais foram reduzidos a pó fino num almofariz. 0 rendimento total em malonato de estrôncio foi de aproximadamente 98% antes da recristalização e a maioria das impurezas consistia em vestígios dos reagentes e de carbonato de estrôncio. 0 produto foi inequivocamente identificado como sendo malonato de estrôncio por cristalografia de raios X e por comparação dos dados obtidos com resultados da Base de Dados Cristalográficos de Cambridge (Cambridge Crystallographic Database). 45

Melhorias adicionais da síntese podem incluir a desgaseificação com azoto ou árgon da água e de todas as soluções aquosas, o que previne o contacto com o dióxido de carbono que eventualmente poderia levar à formação de impurezas de carbonato de estrôncio. Daí resulta que um técnico especializado facilmente adaptará o procedimento de modo a poder trabalhar numa atmosfera de gás inerte.

Exemplo 7

Métodos de preparação de sais de estrôncio hidrossolúveis a partir de ácidos carboxilicos usando temperaturas superiores a 100 °C

Em conformidade com os métodos desenvolvidos anteriormente e descritos nos exemplos 2 - 6, a síntese em larga escala de sais de estrôncio de ácidos orgânicos dicarboxílicos, em especial, de sais de estrôncio de aminoácidos pode ser difícil (ou seja, > 1 kg) devido aos baixos rendimentos e às dificuldades na separação dos produtos da reação dos contaminantes. Os sais de carbonato de estrôncio são um problema especial pois formam-se como impurezas, quando a reação decorre na presença de ar atmosférico com níveis normais de dióxido de carbono. Descrevemos nos exemplos 4 -6 que o rendimento total do produto, quando os sais de ácidos dicarboxílicos são produzidos a partir do ácido livre do anião e do hidróxido de estrôncio, está dependente da temperatura e da duração da síntese. De modo a que a reação seja completa, a mistura do aminoácido adequado e do hidróxido de estrôncio necessita de ebulição em água durante três horas, dando assim tempo bastante ao estrôncio presente na mistura de reação para reagir com o dióxido de 46 carbono atmosférico. Neste exemplo, divulgamos métodos para melhorar ainda mais a sintese, proporcionando condições de reação otimizadas, nas quais a temperatura é aumentada acima dos 100 °C num recipiente fechado e onde os tempos de reação são significativamente reduzidos. 0 exemplo presente fornece dados representativos da otimização das condições de sintese do glutamato de estrôncio, numa autoclave. O glutamato de estrôncio é usado como exemplo mas as otimizações descritas no exemplo são também aplicáveis à sintese de outros sais de estrôncio, onde as condições exatas de reação podem ser otimizadas tal como descrito neste exemplo. As temperaturas de reação devem ser mantidas abaixo do ponto de fusão ou abaixo da temperatura de decomposição do componente anião orgânico do sal de estrôncio pretendido. Como exemplo, o ácido malónico decompõe-se a 132-134 °C e por isso a sintese de malonato de estrôncio tem que ser efetuada a temperaturas inferiores a 132 °C. 0 L-glutamato de estrôncio foi usado como composto de estrôncio modelo nas experiências de otimização. A pureza do produto foi monitorizada através da comparação com dados cristalográficos e pela medição do teor de estrôncio. Idealmente, o teor de estrôncio do L-glutamato de estrôncio hexa-hidratado, que é o produto obtido nestas experiências, é de 25,7% Dai resulta que outros sais solúveis de estrôncio possam ser preparados por métodos semelhantes, com elevado rendimento e grau de pureza. 47

Parte Experimental

Preparação das soluções: Foi preparada uma suspensão de ácido glutâmico (de cor branca) por adição de 100 mL de água Millipore a 14,703 g (0,1 moles) de ácido L-glutâmico sólido (Sigma Aldrich, C5H9NO4, MW 187.14 g/mole, CAS no. 142-47-2, lot. no. 426560/1, filling code 43003336) num gobelé de 250 mL. A esta suspensão foram adicionados 22,257 g, 26, 571 g ou 31,885 g (0,08 moles, 0,1 moles ou 0,12 moles) de hidróxido de estrôncio sólido (Sigma Aldrich, Sr(OH) 2*8H20, MW 265.71, CAS no. 1311-10-0).

Experiências de otimização

Após preparação dos sais, foram efetuadas nove experiências de otimização de acordo com as condições da tabela 9.

Experi ência n.° Temperatura da auto-clave (°C) Duração da síntese (min.) Razão base- ácido Volume total (mL) Pressão da autoclave (bar) Rendimento % % Sr (EAA) 1 125 15 0,8 50 1,55 94 25 2 124 30 1 75 1 112 22 3 124 60 1,2 100 1,6 121 21 4 127 15 0,8 100 1,2 118 22 5 132 30 1 50 1,55 120 25 6 132 60 1,2 75 1,6 50 22 7 134 15 0,8 75 1,65 108 24 8 134 30 1 100 1,65 76 14 9 132 60 1,2 50 1,65 82 24

Tabela 9. Parâmetros e principais resultados do procedimento de otimização da síntese de glutamato de estrôncio. A pressão foi monitorizada mas não foi utilizada no processo de otimização. O teor de estrôncio (% Sr) foi determinado por EAA com atomização por chama mas não foi 48 utilizado como parâmetro de qualidade. 0 rendimento (%) foi aplicado como sendo o parâmetro de qualidade.

Procedimento 1. A quantidade de ácido calculada foi pesada e transferida para um frasco de rolha azul autoclavável e adicionou-se água Millipore. 0 frasco foi fechado e agitado de modo a obter uma suspensão de grão fino. 2 A quantidade calculada de hidróxido de estrôncio octa-hidratado foi pesada e adicionada à solução de ácido do ponto 1 e o frasco foi agitado vigorosamente no vortex até todos os fragmentos grosseiros de material se transformarem em pó fino. 3 0 frasco foi colocado na autoclave e a temperatura regulada. Enquanto esteve na autoclave não foi efetuada mais nenhuma agitação. 4 Quando a t = 100 °C, a válvula da autoclave foi fechada e iniciou-se a contagem do tempo. 5 Durante a autoclavagem foram monitorizadas a temperatura efetiva e a pressão efetiva. 6 No fim da autoclavagem e logo que possível, procedeu-se à libertação do vapor, respeitando sempre as medidas de segurança. 7 Ao atingir aproximadamente os 110 °C abriu-se a autoclave e a solução foi retirada. Novamente, o frasco foi agitado de modo a obter uma mistura muito homogénea. 8 Após a autoclavagem, a solução foi imediatamente filtrada a quente num funil de Bíichner, deixando apenas vestígios de carbonato no filtro. O produto precipitou da solução durante o arrefecimento até à temperatura ambiente. 49 9 Após a precipitação, o produto foi filtrado e seco num forno durante meia hora, a 110 °C. Em seguida, sofreu nova secagem num exsicador com silica-gel laranja. Finalmente, o produto foi reduzido a pó fino num almofariz. 10. O produto foi pesado após a trituração e foi calculado o rendimento total.

Preparação de malonato de estrôncio (Referência)

De modo a confirmar a aplicabilidade do método divulgado de sintese a alta temperatura a outros sais de estrôncio que não apenas o L-glutamato de estrôncio, preparou-se malonato de estrôncio. Basicamente aplicaram-se as mesmas condições de reação estabelecidas para a preparação do L-glutamato de estrôncio. Foi preparada uma suspensão de ácido malónico (de cor branca) por adição de 100 mL de água Millipore a 10,41 g (0,1 moles) de ácido malónico sólido (Fluka 63290, PM 104,1) num gobelé de 250 mL. Adicionaram-se à suspensão 22,257 g, 26, 571 g ou 31,885 g (0,08 moles, 0,1 moles ou 0,12 moles) de hidróxido de estrôncio sólido (Sigma

Aldrich, Sr(OH)2*8H20, MW 265.71, CAS no. 1311-10-0). O procedimento de reação descrito anteriormente foi seguido e a temperatura mantida abaixo dos 130 °C de modo a evitar a decomposição do ácido malónico, enquanto se mantinha o tempo de reação nos 15 minutos.

Teor de estrôncio (% Sr)

Foi dissolvida uma amostra de 0,2 g em 100 mL de HNO3 0,1M preparado com água Millipore. Esta solução foi novamente diluida por um fator 500, usando uma solução de KCl a 1%, e determinou-se o conteúdo de estrôncio por EAA com 50 atomização por chama. As medições foram efetuadas num aparelho Perkin-Elmer 2100 equipado com uma lâmpada de hidrogénio para correção do ruido de fundo (background signal). O estrôncio foi medido usando um monocromador com fenda de 0,2 nm, comprimento de onda de 4 60,8 nm com uma energia de 58 e uma corrente eléctrica de 8 mA.

Cristalografia de raios X

Foi efetuada uma segunda verificação da pureza por cristalografia de raios X por pó, utilizando um difractómetro Huber G67 0 . A figura 5 ilustra um difractograma caracteristico do glutamato de estrôncio . Na figura 6 apresenta- se um difractograma de raios X do malonato de estrôncio obtido pelo método de sintese a alta temperatura descrito neste exemplo. O pico duplo no lado do ângulo baixo do pico de intensidade máxima, observado tanto na figura 5 como na 6, é um artefacto do aparelho.

Resultados e discussão

Na tabela 9, constata-se que algumas das condições de sintese resultaram em rendimentos relativamente baixos e em glutamato de estrôncio com baixo grau de pureza como é evidenciado pela % molar do estrôncio no produto da reação. O produto da experiência n° 8 foi obtido com um rendimento relativamente baixo e não continha os esperados 25,7% de estrôncio, o que foi também confirmado pela análise de raios X. Apesar deste valor extremo (outlier) , na generalidade, o resultado das experiências de otimização está próximo das produções esperadas. Uma reação incompleta fornece um produto com teor de estrôncio demasiado baixo, enquanto a formação de carbonato de estrôncio durante a 51 síntese origina um teor de estrôncio demasiado alto. As condições empregues nas experiências 1 e 5 forneceram um conteúdo de estrôncio mais de acordo com o valor esperado. De salientar, que embora o produto da experiência n° 6 tenha sido obtido com baixo rendimento, continha uma quantidade de estrôncio que correspondia ao valor esperado.

Através do estudo da influência dos parâmetros individuais no rendimento total (tabela 9 e fig. 7), torna-se clara a importância da temperatura, do tempo de autoclavagem e da razão base-ácido para a síntese, enquanto o volume total tem um papel menor. 0 rendimento superior a 100% observado sob as condições experimentais 2, 3, 4, 5 e 7 deriva de uma secagem incompleta, mas este efeito é quase totalmente eliminado quando se levam em consideração os valores médios, como é o caso da figura 7. Desse modo, o rendimento máximo foi obtido usando uma temperatura elevada (133 °C) , curto tempo de autoclavagem (15 minutos) e um excesso de hidróxido de estrôncio. Por essa razão, a temperatura é mais importante do que o tempo mas é de importância comparável à da razão base-ácido. Contudo, deve-se ter muito cuidado para não exceder a temperatura de decomposição durante a síntese de outros sais de estrôncio a qual é, por exemplo, para o malonato de 132-134 °C. A 10a experiência de controlo da otimização foi executada para confirmar o rendimento máximo deste tipo de experiências.

Foi ainda executada uma experiência adicional para validar a aplicabilidade do método de síntese a alta temperatura para a preparação de outros sais orgânicos de estrôncio, para além do L-glutamato de estrôncio. Escolheu-se o malonato de estrôncio uma vez que se pode considerar este sal como sendo especialmente difícil de preparar sob 52 condições de alta temperatura, devido à baixa temperatura de dissociação do anião do ácido malónico. No entanto, como se ilustra na figura 6, obteve-se facilmente malonato de estrôncio cristalino, puro e bem definido. A estrutura dos cristais do composto ainda não foi completamente definida, dado ser uma estrutura nova nunca antes descrita, mas os dados mostram que o método de alta temperatura é passivel de ser aplicado a muitos outros sais orgânicos de estrôncio.

Melhorias adicionais da sintese incluem a introdução de atmosferas inertes no ambiente de sintese, assim como a desgaseificação de todas as soluções com azoto ou árgon gasosos, para diminuir a formação de carbonato de estrôncio.

Conclusão

As experiências de otimização demonstram que é possível sintetizar o glutamato de estrôncio, com elevados rendimentos através do aumento da temperatura até valores superiores aos 100 °C e através de um curto intervalo de tempo (15 minutos) na autoclave. Do mesmo modo, um excesso de 20% de hidróxido de estrôncio também melhora o rendimento total, sem comprometer a pureza do sal de estrôncio sintetizado. Deve ser usado no processo de secagem, um exsicante um pouco mais forte do que a sílica-gel laranja, de modo a obter um produto completamente seco. Exemplos de agentes exsicantes mais potentes são o ácido sulfúrico concentrado ou o óxido de cálcio mas também a liofilização convencional ou outros métodos mecânicos podem ser aplicados a este procedimento. 53

Exemplo 8

Propriedades farmacocinéticas dos sais dicarboxilicos de estrôncio 0 objetivo desta experiência era avaliar a biodisponibilidade dos sais dicarboxilicos de estrôncio, por comparação com o cloreto e o ranelato de estrôncio. A biodisponibilidade foi avaliada através da determinação sérica do estrôncio, a intervalos regulares durante um periodo de 24 horas e calculando a AUC (área sob a curva). A experiência foi levada a cabo usando ratos fêmeas SPF Wistar, estirpe HanTacrWH (GALAS), fornecidos pela Taconic M&B A/S, Ejby, DK-4623 Lille Skensved, Dinamarca. No inicio do periodo de aclimatização, os ratos tinham cerca de 9 semanas de idade e um peso aproximado de 200-250 g. Os animais foram alojados numa sala com ar filtrado, temperatura de 21 °C ± 3 °C, humidade relativa de 55% ± 15% e um sistema de ventilação que fornecia 10 mudanças de ar por hora. A sala estava iluminada de modo a providenciar ciclos de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Os ratos foram alimentados com ração completa granulada para roedores "Altromin 1314" (Chr. Petersen A/S, DK-4100 Ringsted, Dinamarca). Os ratos tinham acesso ilimitado a garrafas com água potável com qualidade para uso doméstico, acidificada com ácido cloridrico com pH 2,5, de modo a evitar o crescimento microbiano.

Os ratos foram distribuidos aleatoriamente em sete grupos de 9 animais cada e tratados do modo indicado na tabela seguinte. Os grupos, níveis das doses e números dos animais estão listados na tabela 10: 54

Dose1 (mg /kg) Grupo Sal de estrôncio EM % Sr Equivalente da Dose1 (Quantidades em mg) N.° do Animais Veículo Controlo Veículo (0,5 % CMC) 1-9 500 B Sr-ranelato (*7H20) + 639,6 27,4 500 = 137 mg Sr44 10-18 416 C SrCl2 (*6H20) 266,6 32,9 137 mg Sr^ = 416 19-27 533 D Sr-glutamato (*6H20) + 340,7 25,7 137 mg Sr^ = 533 28-36 427 E Sr-aspartato (*3H20) 272,7 32,1 137 mg Sr44 = 427 37-45 484 F Sr-malonato (*6H20) 309,7 28,3 137 mg Sr44 = 484 46-54 325 G Sr-malonato (*1H20) + 207,7 42,2 137 mg Sr44 = 325 55-63

Tabela 10: Os 7 grupos de tratamento do estudo farmacocinético. As doses administradas ao grupo estão listadas na primeira coluna e o tipo de sal, PM e conteúdo de Sr estão listados nas colunas do meio. + Compostos de referência 1 As doses foram ajustadas de modo a fornecerem uma dose equimolar de estrôncio sob a forma de 500 mg/kg de ranelato de estrôncio (hepta-hidratado) (grupo B). A substância-teste (sal de estrôncio) foi administrada de uma única vez por sonda esofágica, de acordo com os dados mais recentes sobre o peso do animal. O grupo de controlo foi tratado apenas com o veículo (0,5% carboximetilcelulose, CMC). O veículo foi preparado com água desionizada para todos os grupos de tratamento, incluindo os controlos. As substâncias-teste (sais de estrôncio) foram solubilizadas/suspendidas num volume 55 correspondente a 5 mL/kg de peso corporal. De modo a conservar os compostos em suspensão, as formulações foram mantidas num agitador magnético, antes e depois do tratamento.

Amostras de sangue para o estudo de toxicocinética

No dia do tratamento (Dia 1), foram colhidas amostras de sangue a todos os animais. As amostras sanguineas foram colhidas em 3 animais de cada grupo, nos seguintes intervalos de tempo: pré-tratamento e 30 minutos, 1, 1,5, 2, 4, 8 e 24 horas pós-tratamento, de modo que a três animais de cada grupo foram colhidas amostras às 0, 1,5 e 6 horas, a 3 outros ratos às 0,5, 2 e 8 horas e aos restantes às 1, 4 e 24 horas.

Em cada colheita foram retirados aproximadamente 0,5 - 0,6 mL de sangue do plexo venoso orbital, para tubos sem anticoagulante, para obtenção de soro. O sangue foi mantido à temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos, até ser centrifugado (10 min., 1270 G, +20 °C) . O soro obtido foi transferido para criotubos Nunc (Nunc, Dinamarca) e congelado a -18 °C para posterior análise do conteúdo de estrôncio por espectroscopia de absorção atómica (EAA) com atomização em forno de grafite.

Espectroscopia de absorção atómica (EAA) com atomização em forno de grafite

Foi adicionado HC1 concentrado às amostras séricas de modo a obter uma concentração final de HC1 a 0,2% e as amostras foram em seguida analisadas num aparelho Perkin-Elmer 2100, equipado com uma lâmpada de hidrogénio para correção do 56 ruído de fundo. 0 estrôncio foi medido usando um monocromador com fenda de 0,2 nm, comprimento de onda de 460,8 nm com uma energia de 58 e uma corrente eléctrica de 8 mA.

Resultados do estudo farmacocinético da absorção do sal de estrôncio

Na figura 8, a concentração sérica medida nos seis grupos tratados com sais de estrôncio é representada em função do tempo decorrido após a administração dos compostos. É evidente que a administração dos sais de estrôncio resulta num aumento rápido e extremamente significativo da concentração sérica do estrôncio. Quando se comparam as propriedades farmacocinéticas de diferentes sais, é evidente que tanto o cloreto de estrôncio que é altamente solúvel como o relativamente pouco solúvel ranelato de estrôncio (ver exemplo 3) , são rapidamente absorvidos, atingindo uma concentração sérica máxima após cerca de 2 horas.

Os ácidos dicarboxilicos com solubilidades superiores e, em especial, o sal de estrôncio dos aminoácidos L-aspartato e L-glutamato atingem a concentração sérica máxima com uma taxa cinética mais lenta e após cerca de 8 horas. Além disso, a concentração sérica de estrôncio, no intervalo de tempo das 0 - 8 horas após a administração da substância- teste, parece mais estável, pelo menos para alguns dos ácidos dicarboxilicos, como os sais de estrôncio de aspartato e de malonato. Este padrão de dois picos distintos de concentração sérica máxima é igualmente evidente no grupo tratado com malonato de estrôncio.

Provavelmente indica que o ião estrôncio é absorvido por 57 dois mecanismos distintos de absorção e que os sais de estrôncio muito solúveis, de acordo com a presente invenção, podem ter um especial potencial para a exploração da natureza bifásica do mecanismo de absorção do estrôncio e assim provarem ter um beneficio global evidente sob a forma de uma biodisponibilidade superior do referido elemento.

Quando se efetuaram os cálculos AUC, a forma geral das curvas, como é evidenciado pelos valores médios na fig. 8, era mais bem descrita esboçando as curvas de resposta/farmacocinética num modelo matemático especialmente concebido para o efeito. Na fase inicial, assume-se que o estrôncio não é metabolizado mas simplesmente transferido do estômago/trato superior digestivo do rato para as células epiteliais através de um mecanismo de transporte ativo. Ainda sem ser metabolizado, o ião estrôncio é transferido do estômago/trato superior digestivo, onde é simultaneamente libertado nos vasos sanguíneos. Apenas durante a sua circulação nos vasos é que o estrôncio é disperso e metabolizado pelos tecidos corporais. Esta descrição credível mas simplificada inclui um mecanismo de absorção do estrôncio iónico em duas fases, após a sua administração por via oral, identificado pelos dois picos da Fig. 9 em t = 60 minutos e em t = 360 minutos. Após a administração da dose de estrôncio aos ratos, observou-se um tempo de absorção característico aos 12 minutos. 0 teor sérico máximo de estrôncio foi observado após cerca de 30 minutos. O tempo característico de 12 minutos é interpretado como sendo a duração da absorção dos iões estrôncio pelo mecanismo de transporte ativo, do lúmen intestinal e sua secreção para a circulação. 0 início da transferência do estrôncio entre o estômago e os vasos 58 sanguíneos é quase instantâneo, enquanto a transferência entre os intestinos e os vasos sanguíneos ocorre numa fase posterior que depende do tipo de sal sob investigação. 0 malonato, em particular, exibe um pico na absorção versus tempo entre os intestinos e os vasos sanguíneos, aos 360 minutos, com se ilustrado na fig. 8. Assim, a duração do metabolismo do malonato é muito longa por comparação com a dos outros sais. Para todos os sais, no entanto, os níveis de estrôncio estabilizam aproximadamente após 1750 minutos (29 horas) e aproximam-se do nível natural correspondente à fase pré-dose.

Os cálculos do modelo (não apresentados) foram aplicados à determinação das áreas sob as curvas que se ilustra na tabela 11. Os desvios padrão dos valores AUC correspondem à incerteza geral das medições da fig. 8 e a sua magnitude não permite uma distinção significativa entre os sais. Os valores AUC dos sais são muito mais elevados que os valores AUC das amostras pré-dose. ANIÃO DO SAL-Sr AUC mg/L min. DESV. PADRÃO mg/L min. a-cetoglutarato 9000 1600 Aspartato 7000 1700 Cloreto + 7300 2000 Glutamato 10100 3100 Malonato + 15000 8500 Pré-dose 168 67 Média 6800 5400

Tabela 11. Determinação das áreas sob as curvas (AUC) de acordo com os cálculos do modelo.

Estes efeitos da absorção retardada do estrôncio e dos valores séricos num nível mantido durante longos períodos 59 de tempo, observados com sais de estrôncio com aniões dicarboxilicos orgânicos, podem melhorar as propriedades farmacológicas dos compostos. A obtenção retardada da Cmax pode ser uma vantagem para o uso do composto de estrôncio no tratamento de doenças e afeções do metabolismo ósseo. Nestes casos é muitas vezes vantajoso administrar o composto à hora de dormir, pois vai permitir que ele aja durante a noite, que é quando a reabsorção óssea ocorre à velocidade máxima. Além disso, a administração antes da hora de dormir, minimiza a potencial interferência do cálcio da dieta normal, caso a preparação farmacêutica do sal de estrôncio fosse tomada depois da última refeição. Este facto contrasta com a administração durante o dia, quando o conteúdo normal de cálcio das refeições teria o potencial para interferir e reduzir a absorção do estrôncio. 0 aumento gradual da concentração sérica do estrôncio, ao longo das 4-8 horas após a administração do composto, adequar-se-ia bem com a administração noturna e parece apropriada para maximizar o efeito terapêutico do composto de estrôncio no metabolismo ósseo.

Lisboa, 16 de Julho de 2013

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Sal de estrôncio, ou uma composição farmacêutica que contém um sal de estrôncio para uso no tratamento e/ou profilaxia da osteoporose num mamífero, em que o sal de estrôncio tem uma solubilidade em água à temperatura ambiente na gama de 1 g/L a 100 g/L e é selecionado do grupo que consiste em succinato de estrôncio, aspartato de estrôncio na forma L e/ou D, glutamato de estrôncio na forma L e/ou D, piruvato de estrôncio, maleato de estrôncio e misturas destes, ou em que o referido sal de estrôncio é α-cetoglutarato de estrôncio.

2. Sal de estrôncio, ou uma composição farmacêutica que contém um sal de estrôncio para uso de acordo com a reivindicação 1, em que a composição farmacêutica se destina a ser administrada por via oral ou parentérica.

3. Sal de estrôncio, ou uma composição farmacêutica que contém um sal de estrôncio para uso de acordo com a reivindicação 2, em que a composição farmacêutica se apresenta na forma de comprimidos, cápsulas, saquetas, pós, pastilhas, grânulos, granulados, misturas, xaropes, soluções, suspensões ou emulsões para administração oral.

4. Sal de estrôncio, ou uma composição farmacêutica que contém um sal de estrôncio para uso de acordo com a reivindicação 2, em que a composição farmacêutica se apresenta sob a forma de solução, suspensão ou emulsão para injeção intravenosa, intramuscular, intra-articular ou subcutânea. 2

5. Sal de estrôncio, ou uma composição farmacêutica que contém um sal de estrôncio para uso de acordo com a reivindicação 2, em que a composição farmacêutica se apresenta sob a forma de pasta de dentes ou colutório destinado à aplicação nos dentes ou na mucosa oral.

6. Sal de estrôncio, ou uma composição farmacêutica que contém um sal de estrôncio para uso de acordo com qualquer das reivindicações 1-5, em que a composição farmacêutica proporciona uma dose diária de estrôncio iónico de pelo menos cerca de 0,01 g, como, por exemplo, pelo menos cerca de 0,025 g, pelo menos cerca de 0,050 g, pelo menos cerca de 0,075 g, pelo menos cerca de 0,1 g, pelo menos cerca de 0,2 g, pelo menos cerca de 0,3 g, pelo menos cerca de 0,4 g ou pelo menos cerca de 0,5 g ou de cerca de 0,01 g a cerca de 2 g, como, por exemplo, de cerca de 0,1 g a cerca de 2 g, de cerca de 0,3 g a cerca de 2 g ou de cerca de 0,3 g a cerca de 1 g.

7. Sal de estrôncio, ou uma composição farmacêutica que contém um sal de estrôncio para uso de acordo com qualquer das reivindicações 1-6, em que a composição farmacêutica destina-se a ser administrada uma ou mais vezes ao dia.

8. Sal de estrôncio, ou uma composição farmacêutica que contém um sal de estrôncio para uso de acordo com a reivindicação 7, em que a administração ocorre de 2 a 5 vezes ao dia.

9. Sal de estrôncio, ou uma composição farmacêutica que contém um sal de estrôncio para uso de acordo com 3 qualquer das reivindicações 1-8, em que a administração ocorre à hora de dormir. Lisboa, 16 de Julho de 2013