PT1725872E - Análise de vacinas sacarídicas sem interferência - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "ANÁLISE DE VACINAS SEM INTERFERÊNCIA"
CAMPO TÉCNICO A presente invenção enquadra-se no campo da análise e controlo de qualidade de vacinas que incluem sacáridos capsulares bacterianos e, em particular, aqueles em que os sacáridos são conjugados com um transportador.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os imunogénios que compreendem antigénios sacáridos capsulares conjugados a proteínas transportadoras são bem conhecidos na arte. A conjugação converte antigénios T-independentes em antigénios T-dependentes, aumentando assim a indução de memória e permitindo o desenvolvimento de protecção imunitária, e a vacina conjugada protótipo foi para o vírus Haemophilus influenzae tipo b (Hib) [e.g. ver capítulo 14 da ref. 1] . Desde o aparecimento da vacina contra Hib, foram desenvolvidas vacinas sacarídicas conjugadas para protecção contra Neisseria meningitidis (meningococcus) e contra Streptococcus pneumoniae (pneumococcus). Outros organismos contra os quais são de interesse as vacinas conjugadas são Streptococcus agalactiae (streptococcus do grupo B) [2],
Pseudomonas aeruginosa [3] e Staphylococcus aureus [4].
As vacinas conjugadas contra N.meningitidis serogrupo C foram aprovadas para uso humano e incluem Menjugate™ [5], Meningitec™ e NeisVac-C™. Foram relatadas misturas de conjugados de cada um dos serogrupos A, C, W135 e Y [e.g. 1 refs. 6-9], incluindo o produto Menactra™. Outras misturas de antigénios conjugados incluem: (i) misturas meningocócicas A/C [10,11]; (ii) o produto PrevNar™ [12] que contém sete conjugados pneumocócicos; (iii) conjugados meningocócicos e Hib mistos [13,14]; e (iv) conjugados meningocócicos, pneumocócicos e Hib combinados [15] .
Questões levantadas ao lidar com vacinas conjugadas incluem a estabilidade e a consistência entre lotes. Nas vacinas Hib, por exemplo, tem sido referida a despolimerização catalítica do sacárido [16], e os conjugados da cápsula dos meningococcus do serogrupo A são facilmente hidrolisadas [17] . A instabilidade dos conjugados conduz, indesejavelmente, a uma redução da dose efectiva do conjugado imunogénico com o tempo, à variação entre lotes e ao aumento dos níveis de produtos da sua decomposição não caracterizados. As referências 18 e 19 discutem questões relacionadas com os testes de estabilidade das vacinas conjugadas Hib. A análise quantitativa do glicoconjugado envolve tipicamente um primeiro passo de hidrólise do sacárido, baseando-se a análise nos monossacáridos libertados. Enquanto esta análise é relativamente simples para conjugados simples (e.g. métodos cromatográficos de permuta aniónica têm sido usados para analisar conjugados hidrolisados de Hib [20] e de meningococcus do serogrupo A [21]), a situação é mais complexa nas vacinas combinadas, particularmente quando unidades monossacarídicas são partilhadas por diferentes sacáridos. Por exemplo, no caso dos sacáridos capsulares meningocócicos dos serogrupos C, W135 e Y, todos eles contêm ácido siálico, de modo que qualquer método baseado na medição do ácido siálico libertado não conseguirá distinguir entre os três serogrupos. É um objectivo da invenção apresentar melhoramentos na análise quantitativa de sacáridos em vacinas conjugadas para 2 avaliar a estabilidade e integridade. Em particular, é um objectivo disponibilizar métodos que possam ser utilizados para medir conjugados individuais inseridos em vacinas meningocócicas conjugadas combinadas, disponibilizando assim melhoramentos no controlo de qualidade e consistência das vacinas.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A invenção baseia-se em métodos que permitem analisar sacáridos meningocócicos misturados de múltiplos serogrupos, mesmo que os sacáridos partilhem unidades monossacaridicas. A invenção disponibiliza, assim, um processo para analisar o conteúdo sacaridico de uma composição em que: (a) a composição compreende um sacárido capsular do serogrupo C de Neisseria meningitidis e um ou ambos de entre: (i) um sacárido capsular do serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; e/ou (ii) um sacárido capsular do serogrupo Y de Neisseria meningitidis; (b) o processo compreende um passo de análise do teor de ácido siálico na composição, e: (i) se a composição incluir um sacárido do serogrupo W135, um passo de análise do teor de galactose na composição; (ii) se a composição incluir um sacárido do serogrupo Y, um passo de análise do teor de glucose na composição; (c) se a composição incluir um sacárido do serogrupo W135, o teor de sacárido do serogrupo W135 na composição é determinado de acordo com os resultados da análise da galactose no passo (b); (d) se a composição incluir um sacárido do serogrupo Y, o teor de sacárido do serogrupo Y na composição é determinado de acordo com os resultados da análise da glucose no passo (b); 3 (e) o teor de sacárido do serogrupo C na composição é determinado por comparação dos resultados da análise do ácido siálico com: (i) se a composição incluir um sacárido do serogrupo W135 mas nenhum sacárido do serogrupo Y, os resultados da análise da galactose do passo (b); (ii) se a composição incluir um sacárido do serogrupo Y mas nenhum sacárido do serogrupo W135, os resultados da análise da glucose do passo (b) ; ou (iii) se a composição incluir sacáridos do serogrupo W135 e do serogrupo Y, os resultados combinados das análises de glucose e galactose do passo (b).
Portanto, para uma combinação de sacáridos dos serogrupos C, W135 e Y, a invenção analisa o teor de ácido siálico, glucose e galactose. Os resultados da glucose e galactose são utilizados para quantificar directamente os sacáridos dos serogrupos Y e W135, respectivamente, e o teor de glucose e galactose combinado é subtraído ao teor de ácido siálico para quantificar os sacáridos do serogrupo C. Os três serogrupos podem assim ser resolvidos, mesmo apesar de haver uma sobreposição dos monossacáridos. Os inventores descobriram que as análises dos três monossacáridos distintos podem ser realizados vantajosamente no mesmo material, sem interferência entre os monossacáridos e sem interferência de outros materiais sacarídicos na composição (e.g. estabilizadores da liofilização). 0 método pode ser utilizado para analisar o teor de sacáridos livres e total em vacinas conjugadas e simplifica o controlo de qualidade de vacinas que contêm sacáridos capsulares de múltiplos serogrupos.
Foi descrito um método para analisar misturas de aldose, hexosamina e ácido siálico sem interferência [22], mas este baseia-se em tratamentos enzimáticos e derivação química. Em comparação, o processo da invenção não requer passos desse 4 tipo, sendo por isso mais rápido e mais fácil de realizar. Além disso, a situação tratada na referência 22 não sofre do problema inerente de ter de resolver diferentes sacáridos que partilham unidades monossacaridicas comuns. A invenção também disponibiliza um dispositivo informático adaptado para realizar um processo da invenção. Em particular, a invenção disponibiliza um programa informático para analisar o teor de sacáridos de uma composição conforme acima definida, compreendendo um modulo de programação para: (a) receber dados sobre o teor de ácido siálico e o teor de glucose e/ou galactose de uma amostra; e (b) calcular, com base nesses dados, o teor de sacáridos capsulares do serogrupo C e do serogrupo W135 e/ou Y. A invenção também disponibiliza um produto de programa informático que compreende um meio de armazenamento legível por um computador que contém o programa informático da invenção.
Os sacáridos capsulares dos serogrupos C, W135 e Y
Os métodos da invenção destinam-se a analisar misturas de sacáridos capsulares meningocócicos. As misturas incluem os sacáridos capsulares do (i) serogrupo C e (ii) um dos ou ambos os serogrupos W135 e Y, i.e. C+W135, C+Y ou C+W135+Y. Também podem estar presentes outros sacáridos. 0 sacárido capsular do serogrupo C é um homopolímero de ácido siálico (ácido N-acetil neuramínico ou 'NeuNAc') com uma orientação (a2^9). A maioria das estirpes do serogrupo C apresentam grupos O-acetilo no C-7 e/ou C-8 dos resíduos ácido siálico, mas cerca de 15% dos isolados clínicos não apresentam esses grupos O-acetilo [23,24]. A acetilação não parece afectar a eficácia da protecção (e.g. ao contrário do produto Menjugate™, o produto NeisVac-C™ utiliza um sacárido des-O-acetilado, mas ambas as vacinas são eficazes). A estrutura do 5 sacárido é mostrada na figura 13 escreve-se do seguinte modo: —9)-Neu p NAc 7/80Ac-(a2- 0 sacárido do serogrupo W135 é um polímero de unidades dissacarídicas de ácido siálico-galactose. Tal como o sacárido do serogrupo C, apresenta uma O-acetilação variável, mas nas posições 7 e 9 do ácido siálico [25] . A estrutura é mostrada na figura 14 escreve-se do seguinte modo: —4)-D-
Neup5Ac (7/90Ac) -a- (2-6) -D-Gal-a- (ΙΟ sacárido do serogrupo Y é semelhante ao sacárido do serogrupo W135, excepto no facto de a unidade dissacarídica repetida incluir glucose em vez de galactose (ver figura 16) . Tal como o sacárido do serogrupo W135, apresenta uma 0-acetilação variável nas posições 7 e 9 do ácido siálico [25] . A estrutura do serogrupo Y é mostrada na figura 15 escreve-se do seguinte modo: —4)-D-Neup5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Glc-a-(1—
Numa composição que inclui sacáridos capsulares dos serogrupos C, W135 e Y existem, portanto, três monómeros constituintes diferentes (glucose, galactose e ácido siálico), e estes três monómeros estão presentes numa mistura pós-hidrólise. A quantidade de monómeros de glucose numa mistura deste tipo está directamente correlacionada com a quantidade de sacárido do serogrupo Y na composição original e a quantidade de monómeros de galactose está directamente correlacionada com a quantidade de sacárido W135. Para o serogrupo C, porém, a situação é mais complexa: o ácido siálico é o único monómero disponível para quantificar o sacárido do serogrupo C, mas qualquer medição da quantidade de ácido siálico na mistura incluirá monómeros derivados dos sacáridos dos serogrupos W135 e Y. A invenção contorna a complexidade desta análise medindo o teor de cada componente galactose, glucose e ácido siálico na mistura (separadamente e/ou em simultâneo) e, em seguida: (a) utilizando o teor de 6 galactose para quantificar o teor do serogrupo W135 pré-hidrólise; (b) utilizando o teor de glucose para quantificar o teor do serogrupo Y pré-hidrólise; (c) utilizando a diferença entre o teor de ácido siálico e o teor de glucose e galactose combinado para quantificar o teor de serogrupo C pré-hidrólise i.e. a quantidade molar do serogrupo C é calculada de acordo com a quantidade molar de ácido siálico menos a quantidade molar de (glucose + galactose) . A subtracção do teor molar de glucose e galactose do teor molar de ácido siálico corrige a interferência dos serogrupos W135 e Y, sobrando apenas o ácido siálico do serogrupo C. A invenção pode ser usada para analisar sacáridos capsulares de diversos comprimentos. Por exemplo, Menjugate™ e Meningitec™ incluem fragmentos com tamanhos seleccionados (oligossacáridos) dos polissacáridos do serogrupo C completos, ao passo que NeisVac-C™ utiliza polissacáridos completos. A invenção pode ser usada com oligossacáridos e/ou com polissacáridos completos. Os oligossacáridos têm um grau de polimerização (DP) menor do que o encontrado nos polissacáridos capsulares nativos presentes nas bactérias e podem ter um DP médio <30 e.g. entre 10 e 25. O DP pode ser convenientemente medido por cromatografia de permuta iónica ou por ensaios colorimétricos [26] .
Análise do teor de monossacáridos O processo da invenção envolve um passo de análise do teor de ácido siálico, de galactose (caso esteja presente o serogrupo W135) e de glucose (caso esteja presente o serogrupo Y) . Se estiver a ser realizado um processo para monitorizar a presença de unidades monossacaridicas numa composição (e.g. simplesmente para monitorizar monossacáridos residuais de uma fase anterior da produção ou para monitorizar uma possível 7 libertação hidrolítica de monómeros de um conjugado), este pode ser realizado directamente na composição. Tipicamente, porém, o processo será utilizado para medir o teor de sacárido total numa composição, de modo que a composição será hidrolisada com libertação dos monossacáridos antes da análise ser efectuada. Por isso, o processo da invenção incluirá tipicamente um passo de tratamento da composição para levar a cabo a despolimerização dos sacáridos capsulares, para obtenção dos respectivos monossacáridos constituintes. A análise do teor de ácido siálico e do teor de galactose e/ou glucose pode então ser realizada na mistura despolimerizada com os monossacáridos libertados.
As condições de despolimerização dos sacáridos capsulares nos respectivos monossacáridos constituintes são conhecidas na arte. Por exemplo, o sacárido do serogrupo C pode ser hidrolisado para análise de sacárido total por tratamento com uma solução 100 mM HC1 a 80°C durante 2 horas [27] . A hidrólise ácida com ácido trifluoroacético (TFA) pode ser utilizada para hidrolisar todos os serogrupos C, W135 e Y, sendo preferível uma temperatura de incubação ligeiramente inferior para o serogrupo C a fim de evitar a degradação do ácido siálico (90°C em vez de 100°C). Um tratamento típico com TFA implica a adição de TFA para uma concentração final de 2 M, seguida de aquecimento a 90-100°C durante 90 minutos. Após a despolimerização, os hidrolisados sacarídicos podem ser secos, por ex. por secagem a vácuo.
Após a despolimerização, a composição conterá monossacáridos misturados derivados dos serogrupos C e W135 e/ou Y. As quantidades destes monossacáridos na mistura estão directamente correlacionados com as quantidades de sacáridos na composição original pré-hidrólise, de modo que é possível determinar as quantidades de sacáridos de partida conforme 8 acima descrito. As quantidades podem ser determinadas em termos de número (e.g. moles) de moléculas, massas, proporções ou concentrações. É habitual trabalhar-se em moles, uma vez que o ácido siálico tem uma massa molecular diferente da glucose/galactose, mas qualquer uma destas medidas pode ser usada e convertida para avaliar o teor de sacárido das misturas. Para a medição quantitativa, os resultados analíticos podem ser comparados com um padrão, com um teor conhecido para um sacárido específico. A mistura despolimerizada é, de preferência, completamente hidrolisada em monossacáridos. Os inventores descobriram que por vezes ocorre uma hidrólise incompleta, dando misturas nas quais estão presentes fragmentos dissacarídicos (i.e. Gal-NeuNAc para MenW135 e Glc-NeuNAc para MenY) . Contudo, os monossacáridos são libertados com a proporção teórica correcta, e os dissacáridos não interferem coma análise do monossacárido, pelo que a sua presença não causa dificuldades. 0 progresso da despolimerização (e.g. para verificar a hidrólise total em monossacáridos em vez de hidrólise parcial em oligossacáridos) pode ser verificado medindo o grau de polimerização (DP) numa mistura, recorrendo a técnicas conhecidas, como RMN, espectrometria de massa, etc.
Os métodos de quantificação dos monossacáridos glucose, galactose e ácido siálico são bem conhecidos na arte. Os métodos podem ser directos ou indirectos (e.g. podem implicar a derivação dos monossacáridos seguida de uma análise correlacionada com o teor original de monossacáridos) . Os métodos podem envolver a separação dos dois/três monossacáridos distintos, seguida de análise separada, e nesse caso a medição efectiva do teor de monossacárido pode ser igual em cada caso, surgindo a especificidade a partir da 9 separação. Contudo, é preferível utilizar métodos que possam analisar os sacáridos na presença uns dos outros, de modo a que não seja necessário separá-los uns dos outros antes da análise. Adicionalmente, podem ser utilizados métodos para sacáridos conjugados nos quais, após a desconjugação, o transportador e o sacárido não precisam de ser separados. Um método preferido é a cromatografia aniónica, em particular a cromatografia de permuta aniónica de alto desempenho (HPAEC), geralmente com detecção amperométrica com impulsos (PAD) [28,29]. Estão disponíveis sistemas HPAEC-PAD da Dionex™ Corporation (Sunnyvale, CA) e.g. o sistema BioLC™, que usa uma coluna PAI [substrato de poliestireno com 2% de reticulação com divinilbenzeno com 10 pm de diâmetro, aglomerado com látex funcionalizado com amónia quaternária em MicroBead de 500 nm (5% de reticulação)] ou PAIO [substrato de etilvinilbenzeno com 55% de reticulação com divinilbenzeno com 10 pm de diâmetro, aglomerado com ião amónio quaternário bifuncional em MicroBead de 460 nm (5% de reticulação)]. Estes sistemas conseguem analisar quantitativamente sacáridos individuais nas misturas sem necessidade de derivação ou separação pré-análise. Para a análise dos sacáridos pode ser desejável filtrar outros compostos antes da aplicação na coluna, e a Dionex™ produz armadilhas e filtros pré-coluna para esse fim, por ex. uma armadilha de amina para remover aminoácidos, uma armadilha de borato, etc.
Um método alternativo para quantificar os monossacáridos glucose, galactose e ácido siálico na mistura despolimerizada é a ressonância magnética nuclear (RMN). Contudo, os métodos cromatográficos da invenção são preferidos devido à facilidade de utilização e elevada sensibilidade.
Uma vez determinado o teor de ácido siálico e de glucose e/ou galactose, é simples comparar as quantidades molares de 10 cada monossacárido na mistura, e assim calcular a quantidade de sacáridos capsulares na composição original. 0 processo da invenção é tipicamente destrutivo. Por isso, em vez de se realizar o processo numa composição completa, é mais típico colher uma amostra de uma composição de interesse e, em seguida, realizar a análise na amostra.
Conjugados A invenção é útil para analisar o teor de sacáridos em vacinas e, em particular, para vacinas que incluem um sacárido conjugado. A conjugação covalente é usada para aumentar o poder imunogénico dos sacáridos, convertendo os de antigénios T-independentes em antigénios T-dependentes, e permitindo assim a indução de memória imunológica. A conjugação é particularmente útil em vacinas pediátricas e é uma técnica bem conhecida [e.g. revista nas refs. 30 a 39]. Os sacáridos podem ser ligados directamente aos transportadores [40, 41], mas geralmente é utilizado um linker ou espaçador e.g. ácido adípico, β-propionamido [42], nitrofenil-etilamina [43], haletos de haloacilo [44], ligações glicosídicas [45], ácido 6-aminocapróico [46], ADH [47], radicais C4 a C12 [48], etc.
Proteínas transportadoras típicas em conjugados são toxinas ou toxóides bacterianos, tais como o toxóide da difteria ou o toxóide do tétano. O derivado da toxina da difteria CRM197 [49-51] é a proteína transportadora nas vacinas Menjugate™ e Meningitec™, e o toxóide do tétano é usado na NeisVac™. O toxóide da difteria é usado como transportador na Menactra™. Outras proteínas transportadoras conhecidas incluem a proteína da membrana exterior de N.meningitidis [52], peptídeos de síntese [53,54], proteínas de choque térmico [55,56], proteínas de pertussis [57,58], citocinas [59], linfocinas [59], hormonas [59], factores de crescimento [59], 11 proteínas artificiais compreendendo múltiplos epítopos de células T CD4+ humanas de diversos antigénios derivados de patogénios [60], a proteína D de H.influenzae [61,62], a proteína de superfície pneumocócica PspA [63], proteínas reguladoras da absorção de ferro [64], a toxina A ou B de C.difficile [65], etc. As composições podem utilizar mais de uma proteína transportadora, por ex. para reduzir o risco de supressão do transportador, e uma única proteína transportadora pode transportar mais de um antigénio sacarídico [66] . Os conjugados apresentam, geralmente, uma proporção sacárido:proteína (p/p) entre 1:5 (i.e. excesso de proteína) e 5:1 (i.e. excesso de sacárido). As composições podem incluir proteína transportadora livre em adição aos conjugados [67] .
Em geral, as composições que incluem sacáridos conjugados podem ser analisadas com recurso à invenção de duas maneiras. Primeiro, pode-se medir a concentração total de sacárido para cada serogrupo na composição por ex. antes da libertação de uma vacina (para fins de conformidade regulatória ou controlo de qualidade), ou para verificar concentrações depois de os conjugados serem misturados. Segundo, pode-se medir o sacárido não conjugado na composição, por ex. para verificar se a conjugação é incompleta ou para seguir a hidrólise do conjugado através da monitorização do aumento do sacárido livre ao longo do tempo. Ao realizar ambos os tipos de análise, a proporção de sacárido livre relativamente ao sacárido total pode ser determinada para cada serogrupo, o que pode ser utilizado para fins de conformidade regulatória ou de controlo de qualidade. De um modo geral, é desejável garantir que uma vacina inclui <25% (por ex. <20%, <15%, <10% etc.) de cada sacárido na forma livre. Níveis elevados de sacáridos livres significam uma dose imunogénica menor do conjugado. 12
Assim, a invenção disponibiliza um método para analisar uma composição, em que: (a) a composição compreende um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo C de Neisseria meningitidis e um ou ambos de entre: (i) um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; e/ou (ii) um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo Y de Neisseria meningitidis; (b) a composição pode compreender os sacáridos capsulares na forma não conjugada; (c) o teor de qualquer sacárido capsular não conjugado é determinado por um processo da invenção, conforme acima descrito; (d) o teor dos sacáridos capsulares conjugados é determinado por um processo da invenção, conforme acima descrito; e, opcionalmente: (e) a proporção de sacárido conjugado:não conjugado é calculada para um ou mais dos sacáridos capsulares.
Os passos (c) e (d) podem ser executados por qualquer ordem ou simultaneamente. A invenção também disponibiliza um método para libertar uma vacina para ser utilizada por médicos, compreendendo os seguintes passos: (a) fabricar uma vacina contendo um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo C de Neisseria meningitidis e um ou ambos de entre: (i) um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; e/ou (ii) um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo Y de Neisseria meningitidis; (b) analisar a quantidade de sacárido conjugado e/ou não conjugado na vacina para cada um dos sacáridos capsulares referidos; e, se os resultados do passo (b) indicarem um teor de sacárido aceitável para uso 13 clínico, (c) libertar a vacina para ser utilizada pelos médicos. 0 passo (b) pode envolver a avaliação da concentração mínima de sacárido (e.g. entre 1-20 yg de sacárido total por serogrupo), avaliação da proporção de sacárido não conjugado:conjugado (e.g. é20% por peso de sacárido não conjugado, de preferência ^10% ou 15%), etc. O passo (b) pode ser realizado numa vacina embalada ou numa vacina a granel, antes de ser embalada.
Para avaliar os sacáridos conjugados e não conjugados em separado, é preciso separá-los. O sacárido livre (ou seja, não conjugado) numa composição aquosa pode ser separado do sacárido conjugado de diversas maneiras. A reacção de conjugação altera diversos parâmetros químicos e físicos do sacárido, e essas diferenças podem ser exploradas para a separação. Por exemplo, é possível utilizar a separação por tamanhos para separar o sacárido livre do conjugado, uma vez que o material conjugado tem uma massa superior devido à proteína transportadora. A ultrafiltração é um método de separação por tamanhos preferido, e o sacárido livre consegue passar através de uma membrana de ultrafiltração com um cut-off apropriado (e.g. 30kDa para um transportador CRM197), enquanto o conjugado é retido. Um método alternativo consiste em utilizar extracção em fase sólida com (SPE), uma coluna ou membrana que retém o conjugado mas deixa o sacárido livre ser eluído. O método SPE tende a ser mais rápido e mais consistente, mas a separação por tamanhos tem uma aplicação mais universal. Uma outra alternativa, caso os conjugados tenham sido adsorvidos sobre um adjuvante, a centrifugação irá separar o conjugado adsorvido (pellet) do sacárido livre (sobrenadante) que é dessorvido após a hidrólise.
Assim, o sacárido livre pode ser separado do sacárido total e pode ser analisado separadamente, permitindo desse 14 modo uma determinação da quantidade de material não conjugado numa composição. Comparar a quantidade livre com a quantidade total é mais fácil do que analisar separadamente as duas amostras após a separação, em particular se o material conjugado tiver sido retido sobre um suporte durante a separação.
Outros componentes sacáridos capsulares A invenção permite analisar composições que compreendem sacáridos capsulares dos serogrupos C e W135 e/ou Y de N.meningitidis. Também pode ser usada para analisar composições que incluem outros sacáridos capsulares, por ex. um sacárido capsular do serogrupo A de N.meningitidis, um sacárido capsular de H.influenzae b, etc. 0 sacárido capsular do meningococo do serogrupo A é um homopolímero de N-acetil-D-mannosamina-l-fosfato com ligação (al->6), com O-acetilação parcial nas posições C3 e C4 (figura 17). Os grupos acetilo podem ser substituídos por grupos protectores para prevenir a hidrólise [17], e os sacáridos assim modificados ainda são sacáridos do serogrupo A de acordo com o significado que lhes é dado na presente invenção. As condições de despolimerização do sacárido capsular do serogrupo A são conhecidas [21] e.g. hidrólise por TFA a 100°C, conforme descrito acima para outros serogrupos. Um método alternativo envolve Dowex 50 H+ seguido de aquecimento durante 1 hora a 100°C [68] . Os monómeros de fosfato de manosamina libertados podem ser analisados em paralelo com a glucose, galactose e ácido siálico, por ex. por HPAEC-PAD [21] . O sacárido capsular de Hib é um polímero de ribose, ribitol e fosfato. O sacárido é conhecido como ' PRP' (poli-3-β-D-ribose-(1,1)-D-ribitol-5-fosfato) e é mostrado na figura 15 18. Os métodos de despolimerização do PRP em monossacáridos para análise por HPAEC-PAD ou RMN 31P são conhecidos, e.g. por incubação durante a noite com NaOH à temperatura ambiente [20] . A ribose e o ribitol libertados podem ser analisados em paralelo com a glucose, galactose e ácido siálico. O polissacárido capsular do serogrupo C é um homopolimero de ácidos siálicos com ligação a2->9 (também conhecido como acido colominico). É preferível que uma composição analisada pelo método da invenção não inclua qualquer outro homopolimero do ácido siálico, e.g. o sacárido capsular de meningococcus do serogrupo B (ácidos siálicos com ligação a2—8) ou o sacárido capsular de E.coli K12 (com ligações a2^8 e a2^9) . De um modo mais geral, se as composições a serem analisadas contiverem um sacárido capsular que inclua um monómero glucose, galactose ou ácido siálico, então é preferível que esse sacárido capsular inclua também mais um monómero ou monómeros que seja/sejam exclusivos (dentro da mistura) desse sacárido, a fim de facilitar a análise mista. Mesmo quando monómeros são partilhados entre sacáridos, a presença de um monómero exclusivo permite analisar diferentes sacáridos em paralelo, usando os mesmos princípios que os descritos para resolver os serogrupos C, W135 e Y de meningococcus.
Componentes sacáridos não capsulares
Enquanto a invenção assenta na análise dos monossacáridos de uma mistura derivada de uma composição a ser analisada, é preferível que a composição não inclua o monossacárido na forma livre (excepto os sacáridos de base derivados da hidrólise dos sacáridos capsulares) . Por exemplo, a inclusão de ácido siálico livre numa composição a ser analisada poderia resultar na sobreavaliação do teor do serogrupo C. O mesmo princípio aplica-se caso sejam incluídos dissacáridos etc., 16 que são depois hidrolisados, por ex. a presença de sacarose (glucose + frutose), ou de maltose ou trealose (ambos di-glucose) pode resultar na sobrestimação do teor do serogrupo Y, e a presença de lactose (glucose + galactose) pode resultar numa sobrestimação de W135 e Y (e uma subestimação do serogrupo C).
Contudo, estes sacáridos são frequentemente utilizados na formulação de vacinas (por ex. como estabilizadores [69,70]), e existem duas formas gerais para minimizar ou evitar estes problemas de interferência. Primeiro, é possível medir os níveis iniciais destes componentes e depois subtraí-los dos níveis medidos na mistura despolimerizada. Segundo, estes componentes podem ser removidos da composição antes da análise, por ex. por filtração ou diálise. Pode utilizar-se membranas de ultrafiltração para remover componentes de baixo peso molecular, e.g. uma membrana 1K para remover a sacarose (PM: 360). A presença de monossacáridos que não se encontrem também nos sacáridos capsulares a serem analisados normalmente não conduz a problemas de interferência. Por exemplo, uma vacina pode incluir polióis como estabilizador de liofilização [71], mas a HPAEC-AED consegue distinguir entre um monossacárido simples e o monossacárido poliólico correspondente, por ex. entre os monossacáridos manose (encontrada na cápsula de Aerobacter aerogenes [72]) e manitol (um estabilizador), e entre a ribose e o ribitol [73] .
Análise de componentes não sacarídicos
Além de analisar o teor de sacáridos numa composição, o processo pode incluir a análise de outros componentes ou propriedades, e.g. osmolalidade, pH, grau de polimerização de sacáridos individuais ou conjugados, o teor de proteínas 17 (especialmente de proteínas transportadoras), o teor de alumínio, o teor de detergente, o teor de conservantes, etc. A invenção disponibiliza um método para preparar uma composição de vacina, que compreende um passo de analisar uma composição de acordo com a invenção, incluindo um passo de medição do pH, seguido de um passo de ajuste do pH da composição a um valor desejado e.g. entre 6 e 8, ou cerca de 7 . A invenção disponibiliza um método para embalar uma vacina, incluindo os seguintes passos: (a) fabricar uma vacina a granel contendo um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo C de Neisseria meningitidis e um ou ambos de entre: (i) um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; e/ou (ii) um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo Y de Neisseria meningitidis; (b) analisar a quantidade de sacárido conjugado e/ou não conjugado na vacina a granel para cada um dos sacáridos capsulares referidos; (c) opcionalmente, analisar o pH e/ou outras propriedades da vacina a granel; e, se os resultados dos passos (b) e (c) indicarem que a vacina a granel é aceitável para utilização clínica, (d) preparar e embalar a vacina para uso humano a partir da vacina a granel. 0 passo (c) pode envolver (ver acima) a avaliação da concentração mínima de sacárido, a avaliação da proporção de sacárido não conj ugado:conj ugado, etc. 0 passo (d) pode envolver 0 embalamento em doses unitárias ou em doses múltiplas, e.g. em frascos ou seringas. Uma dose humana típica para injecção tem um volume de 0,5 ml. O passo (c) e/ou (d) pode ser precedido da mistura da vacina a granel com um ou mais outros antigénios, e.g. com - um antigénio sacárido capsular do serogrupo A de N.meningitidis. 18 - um antigénio proteína do serogrupo B de N.meningitidis - preparações de microvesículas do serogrupo B de N.meningitidis [74], 'OMVs nativas' [75], bolhas ou vesículas de membrana externa [e.g. refs. 76 a 81 etc.]. - um antigénio sacárido de Haemophilus influenzae tipo b - um antigénio de Streptococcus pneumoníae, tal como os antigénios sacáridos conjugados polivalentes [e.g. refs. 82 a 84] . - um antigénio do vírus da hepatite A, tal como o vírus inactivado [e.g. 85, 86]. - um antigénio do vírus da hepatite B, tal como os antigénios de superfície e/ou do nucleocapsídeo (core) [e.g. 86, 87]. - um antigénio de Bordetella pertussis, tal como uma holotoxina pertussis (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) de B.pertussis, opcionalmente também em combinação com pertactina e/ou aglutinogénios 2 e 3 [e.g. refs. 88 e 89]. Podem ser utilizados antigénios celulares de pertussis. - um antigénio da difteria, tal como um toxóide da difteria [e.g. capítulo 13 da ref. 1] e.g. o mutante CRM197 [e.g. 90]. - um antigénio do tétano, tal como um toxóide do tétano [e.g. capítulo 27 da ref. 1]. - antigénio(s) da poliomielite [e.g. 91, 92], tal como o IPV.
Estes antigénios podem ser adsorvidos sobre um adjuvante de sais de alumínio (e.g. um hidróxido ou um fosfato).
Quaisquer outros antigénios sacáridos são, de preferência, incluídos como conjugados.
Consistência entre lotes
Para fabricar vacinas para uso em humanos, os sacáridos conjugados devem ser sujeitos a um controlo de qualidade antes da sua conjugação (e.g. o sacárido e a proteína 19 transportadora) , após a conjugação, após a formulação e após a mistura. Métodos da técnica anterior baseados na análise de monossacáridos não podem ser utilizados para distinguir sacáridos capsulares dos serogrupos meningocócicos C, W135 e Y depois de estes terem sido misturados, devido à interferência causada pela existência de múltiplas fontes de ácido siálico. Com a invenção, contudo, a análise de monossacáridos pode ser usada para analisar conjugados misturados. Além disso, os processos da invenção são fiáveis e consistentes, permitindo por isso comparações válidas entre diferentes lotes de conjugados misturados, o que não era possivel com métodos da técnica anterior. Diferentes lotes de vacinas conjugadas misturadas podem assim ser preparados, analisados, e os lotes mais consistentes seleccionados para libertação e utilização, ao passo que os lotes aberrantes podem ser rejeitados. A invenção disponibiliza um processo para quantificar sacáridos de serogrupos individuais presentes numa mistura de sacáridos capsulares de pelo menos dois serogrupos meningocócicos diferentes, em que: (a) os diferentes serogrupos compreendem o serogrupo C e um ou ambos: (i) serogrupo W135 e/ou (ii) serogrupo Y; (b) o processo compreende um passo de despolimerização dos sacáridos capsulares na mistura, para se obter uma mistura despolimerizada; e (c) os diferentes serogrupos são quantificados por comparação da composição de monossacáridos da mistura despolimerizada.
A invenção também disponibiliza n lotes de uma vacina, em que: (a) cada um dos n lotes da vacina compreende: Um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo C de Neisseria meningitidis e um ou ambos de entre: (i) um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; e/ou (ii) um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo Y 20 de Neisseria meningitidis; (b) a concentração do conjugado do sacárido do serogrupo C no primeiro lote é Ci; (c) a concentração do conjugado do sacárido do serogrupo C no segundo lote é C2; se aplicável, (d) a concentração do conjugado do sacárido do serogrupo W135 no primeiro lote é Wi; se aplicável, (e) a concentração do conjugado do sacárido do serogrupo W135 no segundo lote é W2; se aplicável, (f) a concentração do conjugado do sacárido do serogrupo Y no primeiro lote é Yi; se aplicável, (g) a concentração do conjugado do sacárido do serogrupo Y no segundo lote é Y2; (h) as proporções Ci/C2, Wi/W2 e Y2/Y2 encontram-se, cada uma, entre 0,90 e 1,10, e, de preferência, cada uma encontra-se entre 0,95 e 1,05; e (i) o valor de n é 2 ou mais (e.g. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais).
As proporções especificadas em (h) podem ser baseadas numa única amostra de cada lote comparado, mas tipicamente serão baseadas em valores médios (e.g. médias) de múltiplas amostras de cada lote. Assim, cada um dos n lotes pode ser sujeito a amostragens múltiplas, e cada amostra pode ser sujeita a múltiplas medições de Ci, C2, W2, W2, Yi e Y2, sendo então calculadas as médias para cada lote, e as médias utilizadas para calcular as proporções necessárias.
Cada lote de vacina terá sido preparado separadamente. Por exemplo, dois lotes diferentes podem ser feitos por misturas separadas dos mesmos conjugados individuais a granel ou por mistura de conjugados individuais a granel que tenham sido preparados separadamente. Diferentes amostras da mesma mistura a granel não constituem diferentes lotes, uma vez que essas amostras não estão sujeitas às variações entre lotes que resultam de diferenças originadas durante a preparação das misturas de diferentes conjugados.
Em adição às caracteristicas (a) a (i) acima 21 especificadas, os n lotes podem ainda ser caracterizados por: (j) a concentração do sacárido não conjugado do serogrupo C no primeiro lote é C3; (k) a concentração do sacárido não conjugado do serogrupo C no segundo lote é C4; se aplicável, (1) a concentração do sacárido não conjugado do serogrupo W135 no primeiro lote é W3; se aplicável, (m) a concentração do sacárido não conjugado do serogrupo W135 no segundo lote é W4; se aplicável, (n) a concentração do sacárido não conjugado do serogrupo Y no primeiro lote é Y3; se aplicável, (o) a concentração do sacárido não conjugado do serogrupo Y no segundo lote é Y4; (p) as proporções C3/C4, W3/W4 e Y3/Y4 encontram-se, cada uma, entre 0,90 e 1,10, e de preferência entre 0,95 e 1,05. Os lotes também podem ser caracterizados por: (q) as proporções C3/Ci, C4/C2, W3/W4, W4/W2, Y3/Y4 e Y4/Y2 encontram-se, cada uma, abaixo de 0,20 (e.g. <0,15, <0,10, <0,05, <0,02, 0) .
Geral O termo "compreendendo" abrange os significados "incluindo" bem como "consistindo", e.g. uma composição que "compreende" X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, e.g. X + Y. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", e.g. uma composição que está "substancialmente isenta" de Y pode estar completamente isenta de Y. Quando necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção. O termo "cerca de" em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x+10%.
Será levado em consideração que os anéis dos açúcares podem existir sob as formas aberta e fechada e que, enquanto no presente documento são mostradas as fórmulas estruturais 22 das formas fechadas, as formas abertas são igualmente abrangidas pela invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
As figuras 1 e 2 mostram a análise HPAEC-PAD de um conjugado meningocócico do serogrupo A liofilizado com um estabilizador manitol. Análises semelhantes de material em que a sacarose foi usada como estabilizador são mostradas nas figuras 3 e 4.
As figuras 5 e 6 mostram análises semelhantes para um conjugado do serogrupo Y que ainda não foi liofilizado, e as figuras 7 e 8 mostram a mesma análise para um conjugado do serogrupo W135.
As figuras 9 a 12 mostram as análises de HPAEC-PAD de conjugados dos serogrupos C, W135 e Y misturados.
As figuras 13 a 15 mostram fórmulas estruturais dos sacáridos capsulares dos serogrupos meningocócicos C (13), W135 (14), e Y (15) . A figura 16 mostra a diferença entre os serogrupos W135 e Y. A figura 17 mostra uma fórmula estrutural do sacárido capsular de meningococcus do serogrupo A. A figura 18 mostra uma fórmula estrutural do sacárido capsular de H.influenzae tipo b. A figura 19 mostra a alteração do sacárido livre (%) ao longo de seis pontos temporais em conjugados combinados dos serogrupos C (♦), W135 () e Y (A).
MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO
Produção de conjugados e métodos cromatográficos
Preparou-se antigénios sacáridos capsulares dos serogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis e estes 23 foram conjugados com CRM197, conforme descrito na referência 7.
Os quatro conjugados foram combinados numa composição aquosa "MenACWY".
Em ciclos de trabalho separados, o conjugado do serogrupo A foi liofilizado na presença de sacarose ou manitol, e foi preparada uma mistura dos conjugados dos serogrupos C, W135 e Y ("MenCWY"). A análise do teor de sacáridos foi realizada num sistema cromatográfico HPAEC-PAD Dionex™ de acordo com as instruções do fabricante. 0 instrumento tinha uma bomba de gradiente (GP4 0 ou GP50), um detector amperométrico com impulsos (ED40 ou ED50) e um sistema de amostragem automático (autosampler) (AS3500 ou AS50). Os sacáridos foram detectados pela medição da corrente eléctrica gerada pela respectiva oxidação à superfície de um eléctrodo de trabalho de ouro (com um eléctrodo de referência de Ag/AgCl). Foi aplicada uma forma de onda de triplo potencial com os seguintes parâmetros: EI = 0,05 V; tl = 400 ms; E2 = 0,75 V; t2 = 200 ms; E3 = -0,15 V; t3 = 400 ms) . A integração ocorreu no intervalo de 200 a 400 ms durante a aplicação de El. Os dados cromatográficos foram integrados e processados com o software de redução de dados PeakNet 6.4.
Serogrupo A A formulação liofilizada com manitol do sacárido do serogrupo A foi testada por HPAEC-PAD depois de armazenada a 4°C durante 3 meses. As composições contendo os conjugados foram separadas dos sacáridos livres com recurso a uma coluna de extracção em fase sólida (SPE) C4. A solução contendo sacárido livre foi sujeita a hidrólise ácida com TFA a 100°C durante 2 horas. A mistura foi então aplicada numa coluna CarboPac PAI Dionex™ com um filtro pré-coluna PAI, gradiente de eluição e detecção PAD, para a detecção de manosamina-6- 24 fosfato. Os resultados são apresentados na Figura 1. A mesma análise foi realizada, mas sem separação SPE, para o sacárido livre. Os resultados desta análise são apresentados na Figura 2. A comparação das figuras 1 e 2, tomando em consideração que a análise da Figura 1 usou uma diluição de 1:2 e a análise da Figura 2 usou uma diluição de 1:5, mostra que o pico de manosamina-6-fosfato é muito mais baixo na Figura 1, o que indica um baixo nível de sacárido livre na composição. A análise quantitativa indica 10,7pg de sacárido total por frasco, com 3,7% livre. 0 material liofilizado com sacarose foi analisado do mesmo modo, após reconstituição com 600μ1 de água por frasco, seguindo-se a combinação das amostras até 2-3ml por análise. Antes da passagem pela coluna SPE C4, porém, a composição foi sujeita a ultrafiltração com uma membrana 1K (lavagem com 2ml de água, carga de 2ml de solução da amostra, 3 ciclos de lavagem com 2ml de água cada, recuperação do material retido e ajuste do volume até lml, diluição 1:1 até uma concentração final de NaCl de 0,9% para carregar na coluna SPE). A figura 3 mostra uma quantidade de sacárido livre na composição negligível, mas um pico grande correspondendo ao material conjugado (Figura 4) .
Serogrupos W135 e Y
Antes da combinação com outros conjugados, analisou-se o conjugado do serogrupo Y a granel. O conjugado foi separado do sacárido livre usando uma membrana de ultrafiltração de 30kDa. O material a analisar foi hidrolisado com TFA a 100°C, seguindo-se a análise quantitativa da glucose no dispositivo Dionex™ com uma coluna CarboPac PAI, pré-coluna AminoTrap, eluição isocrática e passo de regeneração, e detecção PAD, de acordo com as instruções do fabricante. Não foi necessário 25 remover o transportador CRM197 antes de aplicar o hidrolisado na coluna. 0 material não conjugado era detectável (Figura 5) mas menos abundante que a glucose total (Figura 6). Tomando em consideração as diferentes diluições, a análise destas Figuras dão uma fracção de sacárido livre de 1,8%. 0 material a granel do serogrupo W135 foi tratado e analisado do mesmo modo, mas com detecção de galactose em vez de glucose (Figuras 7 e 8) . Tomando em consideração as diferentes diluições, a análise destas Figuras dão uma fracção de sacárido livre de 6%.
Conjugados combinados
Os conjugados dos serogrupos A, C, W135 e Y foram combinados com um adjuvante de fosfato de alumínio, conforme descrito na referência 7. Uma combinação de conjugados MenCWY que esteve armazenada durante 2 semanas a 4°C foi usada para reconstituir o conjugado MenA liofilizado, e seguiu-se a análise 48 horas mais tarde, com centrifugação para separar o adjuvante dos conjugados. Os conjugados combinados foram separados dos sacáridos livres através de dois ciclos de ultrafiltração com uma membrana de 30kDa. 0 segundo ciclo diminuiu a contaminação com glicoconjugado que se observou por vezes passar juntamente com o permeado do primeiro ciclo. Os sacáridos foram analisados antes e depois da ultrafiltração por hidrólise ácida com TFA a 90°C/100°C, seguida de duas análises por HPAEC-PAD separadas usando uma coluna CarboPac PAI Dionex™.
Para a análise do serogrupo C, a coluna tinha uma pré-coluna CarboPac PAI e usou uma eluição com gradiente por passos. Correu-se a coluna num modo em que a glucose e a galactose não são resolvidas, uma vez que é mais rápido deste modo. Os resultados são apresentados nas Figuras 9 e 10. Para os serogrupos W135 e Y, a coluna tinha uma pré-coluna 26
AminoTrap e usou eluição isocrática e regeneração, que resolve a glucose e a galactose. Os resultados são apresentados nas Figuras 11 e 12.
Para calcular as quantidades de cada sacárido diferente, a quantidade de ácido siálico na análise da Figura 9/10 é corrigida relativamente a interferência por subtracção da quantidade combinada de glucose e galactose. Este valor fornece a concentração de MenC. As quantidades de galactose e glucose na análise da Figura 11/12 são então usadas para quantificar os serogrupos W135 e Y. As quantidades combinadas de glucose e galactose da Figura 11/12 podem não corresponder à quantidade obtida na Figura 9/10 devido a hidrólise incompleta, conforme descrito acima, mas discrepâncias dessas não afectam a análise global. As quantidades foram calculadas por comparação com padrões contendo quantidades conhecidas de glucose, galactose e ácido siálico.
Uma análise duplicada tipica de sacárido de MenC total e livre num conjugado deu os seguintes resultados:
Amostra Glc+Gal (nmol/ml) Total SA (nmol/ml) Diferença (nmol/ml) Diluição MenC (pg/ml) Média MenC Livre Total 9,26 8,72 14,93 14,46 5, 67 5, 74 10 x 17,5 17,8 17, 6 < 5% Livre 2,45 2,53 2,35 2,33 0,10 0,20 2 x < 1,0 < 1,0 < 1,0 t i.e. concentração do sacárido do serogrupo C.
Apesar da inexistência de um sacárido exclusivo para quantificar o sacárido do serogrupo C, a invenção permite, por isso, a análise quantitativa deste material numa base de sacáridos dos serogrupos W135 e Y.
Uma análise semelhante das Figuras 9 e 11 revela a quantidade de cada sacárido livre na composição MenACWY e permite expressar o sacárido livre como uma percentagem de 27 sacárido total na composição. Esta análise foi realizada a diversos pontos temporais ao longo de um período de 1 ano para uma combinação MenCWY formulada para conter 10yg/dose (i.e. 20yg/ml) de cada sacárido. Os resultados foram:
Tempo (semanas) 0 2 4 13 34 52 Média DP CV c Total (yg/ml) 18,3 20,3 22, 6 23,6 21,3 20, 5 21,1 1,86 8,8 Livre (%) 5, 0 5,0 5, 0 5, 0 5,2 5, 0 - - - w Total (yg/ml) 21,0 20,3 20,1 21,7 20,2 21, 9 20, 9 0,79 3,8 Livre (%) 10,7 11,2 10,1 8, 8 9,8 9,9 - - - Y Total (qg/ml) 19,5 17,3 17,0 18,7 19,1 22,4 19,0 1,94 10,2 Livre (%) 5, 6 6,7 5,3 6,3 5,3 10,8 - — - DP = Desvio Padrão CV = coeficiente de variação i.e. (DP/média) x 100% A variação na % de sacárido ao longo dos seis pontos temporais é apresentada na figura 19.
Numa segunda série de experiências, as vacinas foram formuladas a meia dose (5yg de cada sacárido por dose) e um quarto de dose (2,5yg) relativamente ao trabalho anterior. O processo da invenção foi utilizado para resolver os diferentes sacáridos dentro da combinação, e os resultados foram: 28
Time (moníhs) Ô 1 3 Mean SD cv £ C Total (jtig/mi) 8.0 9.1 8.2 8.43 0.59 7.0% a . o Free (%) <10.0 <10.0 <50.0 — — — W w Total (μ§/ιη1) 9.4 9.8 8.9 9,37 0.45 4.8% O 5 Free (%) <10.6 11.5 '<D O e—' V — — — to> a, V) Y Total fug/ml) 10.5 12.3 11.2 11,33 0.91 8.0% Free {%) <10.6 <10.6 <10,6 — — Time (months) 0 1 3 Mean SB I cv " y*e s Et]} a, »Λ C Total (itg/m 1) 4.1 43 5.5 4,63 0.76 | 163% Free {%) <20.0 <20.0 <20,0 — — — Q É*S o ; 5 fc£ W Total (ttg/ml) 4.7 4.4 5.2 4.77 Ô.40 $.5% Free {%) <21.2 <21.2 <21.2 — — — a «Λ V Total (μο/ηιί) 5.8 6,2 6.5 6.37 0.35 5.7% A Free {%) <21.2 <21.2 <21.2 — —
Lisboa, 1 de Fevereiro de 2011 29
Claims (5)
- REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para analisar o conteúdo sacarídico de uma composição, caracterizado por: (a) a composição compreender um sacárido capsular do serogrupo C de Neisseria meningitidis e um ou ambos de entre: (i) um sacárido capsular do serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; e/ou (ii) um sacárido capsular do serogrupo Y de Neisseria meningitidis; (b) o processo compreender um passo de análise do teor de ácido siálico na composição, e: (i) se a composição incluir um sacárido do serogrupo W135, um passo de análise do teor de galactose na composição; (ii) se a composição incluir um sacárido do serogrupo Y, um passo de análise do teor de glucose na composição; (c) se a composição incluir um sacárido do serogrupo W135, o teor de sacárido do serogrupo W135 na composição é determinado de acordo com os resultados da análise da galactose no passo (b); (d) se a composição incluir um sacárido do serogrupo Y, o teor de sacárido do serogrupo Y na composição é determinado de acordo com os resultados da análise da glucose no passo (b); (e) o teor de sacárido do serogrupo C na composição ser é determinado por comparação dos resultados da análise do ácido siálico com: (i) se a composição incluir um sacárido do serogrupo W135 mas nenhum sacárido do serogrupo Y, os resultados da análise da galactose do passo (b); (ii) se a composição incluir um sacárido do serogrupo Y mas nenhum sacárido do serogrupo W135, os resultados da análise da glucose do passo (b); ou (iii) se a composição incluir sacáridos do serogrupo W135 e do serogrupo Y, os resultados combinados das análises de glucose e galactose do passo (b). 1 2. 0 processo, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizado por a composição compreender sacáridos capsulares de todos os três serogrupos C, W135 e Y de Neisseria meningitidis. 3. 0 processo, de acordo com a reivindicação N°.2, caracterizado por a composição compreender um ou mais de outros sacáridos capsulares. 4. 0 processo, de acordo com a reivindicação N°.3, caracterizado por um ou mais de outros sacáridos capsulares ser/serem seleccionados de entre o grupo constituído por: um sacárido capsular do serogrupo A de N.meningitidis; e um sacárido capsular de Haemophilus influenzae b. 5. 0 processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por incluir um passo de tratamento da composição para levar a cabo a despolimerização dos sacáridos capsulares, para obtenção dos respectivos monossacáridos constituintes. 6. 0 processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o teor de ácido siálico, o teor de glucose e/ou o teor de galactose serem medidos por cromatografia de permuta aniónica de elevado rendimento, opcionalmente com detecção amperométrica com impulsos. 7. 0 processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por também incluir um ou vários passos em que um ou mais dos seguintes componentes ou propriedades é/são analisados: osmolalidade, pH, grau de polimerização dos sacáridos ou conjugados individuais, teor de proteínas, teor de alumínio, teor de detergente e teor de conservantes. 8. 0 processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os sacáridos 2 capsulares derivarem de um conjugado sacárido-proteina. 9. 0 processo, de acordo com a reivindicação N°.8, caracterizado por a proteína do conjugado ser uma toxina ou toxóide bacteriano.
- 10. O processo, de acordo com a reivindicação N°.9, caracterizado por a toxina ou toxóide ser seleccionada de entre o grupo constituído por: toxóide de difteria; toxóide de tétano; CRM197 derivada da toxina da difteria; e proteína D de H.influenzae.
- 11. Um processo para analisar uma composição, caracterizado por : (a) a composição compreender um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo C de Neisseria meningitidis e um ou ambos de entre: (i) um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; e/ou (ii) um conjugado de um sacárido capsular do serogrupo Y de Neisseria meningitidis; (b) a composição poder compreender os sacáridos capsulares na forma não conjugada; (c) o teor de qualquer sacárido capsular não conjugado ser determinado pelo processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.l a N°.7; (d) o teor dos sacáridos capsulares conjugados ser determinado pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.l a N°.7, e, opcionalmente, (e) a proporção de sacárido conjugado:não conjugado ser calculada para um ou mais dos sacáridos capsulares.
- 12. Um dispositivo informático, caracterizado por ser adaptado para realizar o processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.l a N°.ll.
- 13. Um programa informático para analisar o teor de sacáridos de uma composição, de acordo com a reivindicação 3 N°.l, caracterizado por compreender um módulo do programa para: (a) receber dados sobre o teor de ácido siálico e o teor de glucose e/ou galactose de uma amostra; e (b) calcular, com base nesses dados, o teor de sacáridos capsulares do serogrupo C e do serogrupo W135 e/ou Y. Lisboa, 1 de Fevereiro de 2011 4 1/8 FIGURA 140,0 20,0 -2,0 30,0 10,020,0 2/8 FIGURA 3FIGURA 4 10,0 r I I r,5 1 5,0 2,5 0,0 "i È to" S/A* f \ -2,0 0,0 τ τ t-t 10,0 *f f * W1*1*^* mtn 20,0 3/8 FIÚURA51 οο ι------——..................................4/8 FIGURA? 60,0 40.0 20.0 0,0 ?0,0 60,0 60,0 40.0 30.0 20.0FIGURAS10,0 0,0 -10,0 35,0 T 20,0 0,0 -5,0· 5/8 FIGURA 9 30,0 1 25,0 15,0 10,0 5,0«> ao fj o -lõ © % < A j.v 5,0 15,0 τ—— msn20,0 10,0 FIGURA 106/8 FtGURA 11FIGURA 127/8 FIGURA 13Ο" ,ΟΚ H0Híe'7~^T^rv'cr'íi ¢¢0 HieOGHW·-^/ f fi. * -π. -cocm, fij ' / w·:· L H-jCOGHNHOOÇ . ' j .^oh RO í 1' HsCOCHfJ“· FIGURA 14FIGURA 16glucose galacíose 8/8FIGURA 19
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