CN102735809B - 测定Hib结合疫苗中高分子结合物含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定Hib结合疫苗中高分子结合物含量的方法，它通过脱氧胆酸钠在酸性条件下形成胶团并吸附沉淀蛋白质的特性，使结合态多糖与游离态多糖分离，再通过50%乙醇水溶液溶解出低分子结合物，以实现对高分子结合物的分离测定。

Description

测定Hib结合疫苗中高分子结合物含量的方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种测定Hib结合疫苗中高分子结合物含量的方法。
背景技术
b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b, Hib)可引起严重的脑膜炎、肺炎、会厌炎、蜂窝组织炎及骨关节感染。世界卫生组织估计，每年Hib可引起300万5岁以下儿童患病，其中38.6万患者死亡，30％-40％的Hib脑膜炎患者有神经系统后遗症。现在，Hib结合疫苗已作为常规免疫，得到广泛的应用。
在Hib结合疫苗中，高分子结合物含量是一项重要质量控制指标，它与制品的免疫原性密切相关。Hib结合疫苗中高分子结合物的含量会明显影响大分子结合物的免疫原性。常用的高分子结合物含量检测方法为乙醇分步沉淀法，但是此法操作繁琐，对操作人员的要求高，检测时间较长，且对于高分子结合物浓度较高或较低的样品，检测误差大。
发明内容
本发明的目的即在于克服现有技术的不足，提供一种测定Hib结合疫苗中高分子结合物含量的方法，它通过脱氧胆酸钠在酸性条件下形成胶团并吸附沉淀蛋白质的特性，使结合态多糖与游离态多糖分离，再通过50%乙醇水溶液溶解出低分子结合物，以达到对高分子结合物的分离测定。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
测定Hib结合疫苗中高分子结合物含量的方法，它包括以下步骤：
A．取多糖含量为20～30μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，作为样品1；
B．取多糖含量为20～30μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，并配置1%脱氧胆酸钠溶液200μL，将两种溶液混合并冰浴30min，制备得到混合液；
C．向混合液中加入0.1mol/L盐酸溶液200μL，搅拌混合均匀后，于温度4℃转速6000~7000rpm条件下离心30min，收集上清液作为样品2；
D．取步骤C中所得沉淀，加入50%乙醇1.0mL放置1～2h，再加入50%乙醇2.0mL放置1～2h，于6℃转速7500~8500rpm条件下离心1h，取2.7mL上清液作为样品3；
E．取步骤D中所得沉淀，加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液0.5mL，放置1h，再加入1.5mL的水，作为样品4；
F．分别量取1.0mL样品1、1.0mL样品2、0.5mL样品3和0.5mL样品4各两份作为平行样，将样品矿化后以4μg/mL的磷对照品溶液为标准测定各样品中的磷含量；
G．计算样品的磷含量、实验的有效性以及待测Hib结合疫苗样品的高分子结合物含量，计算公式如下：
P1=(A1×3)/1.0
P2=(A2×3.4)/1.0
P3=(A3×3.0)/0.5
P4=(A4×2.3)/0.5-(P3×0.3)/3.0
试验有效性=P1/(P2+P3+P4) ×100%
高分子结合物含量=P4/(P2+P3+P4)×100%
其中，P1、P2、P3和P4分别表示样品1、样品2、样品3和样品4的磷含量(μg/mL)；A1、A2、A3和A4分别表示样品1、样品2、样品3和样品4矿化后的磷含量(μg)。
Hib结合疫苗由纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖通过己二酰肼与破伤风类毒素共价结合制成。
本发明的优点在于：具有很好的重复性和重现性，且操作简便，实验周期短，能够简单、快速、准确地检测Hib结合疫苗中高分子结合物的含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的保护范围不限于以下所述。
实施例1：
    测定Hib结合疫苗中高分子结合物含量的方法，它包括以下步骤：
A．取多糖含量为20μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，作为样品1；
B．取多糖含量为20μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，并配置1%脱氧胆酸钠溶液200μL，将两种溶液混合并冰浴30min，制备得到混合液；
C．向混合液中加入0.1mol/L盐酸溶液200μL，搅拌混合均匀后，于温度4℃转速6000rpm条件下离心30min，收集上清液作为样品2；
D．取步骤C中所得沉淀，加入50%乙醇1.0mL放置1h，再加入50%乙醇2.0mL放置1h，于6℃转速7500rpm条件下离心1h，取2.7mL上清液作为样品3；
E．取步骤D中所得沉淀，加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液0.5mL，放置1h，再加入1.5mL的水，作为样品4；
F．分别量取1.0mL样品1、1.0mL样品2、0.5mL样品3和0.5mL样品4各两份作为平行样，将样品矿化后以4μg/mL的磷对照品溶液为标准测定各样品中的磷含量，含量分别为A1=1.928μg，A2=0.019μg，A3=0.048μg，A4=1.238μg；
G．计算样品的磷含量、实验的有效性以及待测Hib结合疫苗样品的高分子结合物含量，计算公式如下：
P1=(A1×3)/1.0=5.784
P2=(A2×3.4)/1.0=0.065
P3=(A3×3.0)/0.5=0.288
P4=(A4×2.3)/0.5-(P3×0.3)/3.0=5.666
试验有效性=P1/(P2+P3+P4) ×100%=96.10%
高分子结合物含量=P4/(P2+P3+P4)×100%=94.14%
其中，P1、P2、P3和P4分别表示样品1、样品2、样品3和样品4的磷含量(μg/mL)。
Hib结合疫苗由纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖通过己二酰肼与破伤风类毒素共价结合制成。
实施例2：
测定Hib结合疫苗中高分子结合物含量的方法，它包括以下步骤：
A．取多糖含量为22μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，作为样品1；
B．取多糖含量为22μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，并配置1%脱氧胆酸钠溶液200μL，将两种溶液混合并冰浴30min，制备得到混合液；
C．向混合液中加入0.1mol/L盐酸溶液200μL，搅拌混合均匀后，于温度4℃转速6200rpm条件下离心30min，收集上清液作为样品2；
D．取步骤C中所得沉淀，加入50%乙醇1.0mL放置1.5h，再加入50%乙醇2.0mL放置1.5h，于6℃转速7700rpm条件下离心1h，取2.7mL上清液作为样品3；
E．取步骤D中所得沉淀，加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液0.5mL，放置1h，再加入1.5mL的水，作为样品4；
F．分别量取1.0mL样品1、1.0mL样品2、0.5mL样品3和0.5mL样品4各两份作为平行样，将样品矿化后以4μg/mL的磷对照品溶液为标准测定各样品中的磷含量，含量分别为A1=1.899μg，A2=0.010μg，A3=0.053μg，A4=1.144μg；
G．计算样品的磷含量、实验的有效性以及待测Hib结合疫苗样品的高分子结合物含量，计算公式如下：
P1=(A1×3)/1.0=5.697
P2=(A2×3.4)/1.0=0.034
P3=(A3×3.0)/0.5=0.318
P4=(A4×2.3)/0.5-(P3×0.3)/3.0=5.231
试验有效性=P1/(P2+P3+P4) ×100%=102.04%
高分子结合物含量=P4/(P2+P3+P4)×100%=93.70%
其中，P1、P2、P3和P4分别表示样品1、样品2、样品3和样品4的磷含量(μg/mL)。
Hib结合疫苗由纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖通过己二酰肼与破伤风类毒素共价结合制成。
实施例3：
测定Hib结合疫苗中高分子结合物含量的方法，它包括以下步骤：
A．取多糖含量为24μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，作为样品1；
B．取多糖含量为24μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，并配置1%脱氧胆酸钠溶液200μL，将两种溶液混合并冰浴30min，制备得到混合液；
C．向混合液中加入0.1mol/L盐酸溶液200μL，搅拌混合均匀后，于温度4℃转速6400rpm条件下离心30min，收集上清液作为样品2；
D．取步骤C中所得沉淀，加入50%乙醇1.0mL放置1.6h，再加入50%乙醇2.0mL放置1.6h，于6℃转速7900rpm条件下离心1h，取2.7mL上清液作为样品3；
E．取步骤D中所得沉淀，加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液0.5mL，放置1h，再加入1.5mL的水，作为样品4；
F．分别量取1.0mL样品1、1.0mL样品2、0.5mL样品3和0.5mL样品4各两份作为平行样，将样品矿化后以4μg/mL的磷对照品溶液为标准测定各样品中的磷含量，含量分别为A1=1.716μg，A2=0.029μg，A3=0.005μg，A4=1.130μg；
G．计算样品的磷含量、实验的有效性以及待测Hib结合疫苗样品的高分子结合物含量，计算公式如下：
P1=(A1×3)/1.0=5.148
P2=(A2×3.4)/1.0=0.099
P3=(A3×3.0)/0.5=0.030
P4=(A4×2.3)/0.5-(P3×0.3)/3.0=5.195
试验有效性=P1/(P2+P3+P4) ×100%=96.69%
高分子结合物含量=P4/(P2+P3+P4)×100%=97.58%
其中，P1、P2、P3和P4分别表示样品1、样品2、样品3和样品4的磷含量(μg/mL)。
Hib结合疫苗由纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖通过己二酰肼与破伤风类毒素共价结合制成。
实施例4：
测定Hib结合疫苗中高分子结合物含量的方法，它包括以下步骤：
A．取多糖含量为26μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，作为样品1；
B．取多糖含量为26μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，并配置1%脱氧胆酸钠溶液200μL，将两种溶液混合并冰浴30min，制备得到混合液；
C．向混合液中加入0.1mol/L盐酸溶液200μL，搅拌混合均匀后，于温度4℃转速6600rpm条件下离心30min，收集上清液作为样品2；
D．取步骤C中所得沉淀，加入50%乙醇1.0mL放置1.8h，再加入50%乙醇2.0mL放置1.8h，于6℃转速8200rpm条件下离心1h，取2.7mL上清液作为样品3；
E．取步骤D中所得沉淀，加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液0.5mL，放置1h，再加入1.5mL的水，作为样品4；
F．分别量取1.0mL样品1、1.0mL样品2、0.5mL样品3和0.5mL样品4各两份作为平行样，将样品矿化后以4μg/mL的磷对照品溶液为标准测定各样品中的磷含量，含量分别为A1=2.154μg，A2=0.005μg，A3=0.019μg，A4=1.341μg；
G．计算样品的磷含量、实验的有效性以及待测Hib结合疫苗样品的高分子结合物含量，计算公式如下：
P1=(A1×3)/1.0=6.462
P2=(A2×3.4)/1.0=0.017
P3=(A3×3.0)/0.5=0.114
P4=(A4×2.3)/0.5-(P3×0.3)/3.0=6.157
试验有效性=P1/(P2+P3+P4) ×100%=102.77%
高分子结合物含量=P4/(P2+P3+P4)×100%=97.92%
其中，P1、P2、P3和P4分别表示样品1、样品2、样品3和样品4的磷含量(μg/mL)。
Hib结合疫苗由纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖通过己二酰肼与破伤风类毒素共价结合制成。
实施例5：
测定Hib结合疫苗中高分子结合物含量的方法，它包括以下步骤：
A．取多糖含量为30μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，作为样品1；
B．取多糖含量为30μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，并配置1%脱氧胆酸钠溶液200μL，将两种溶液混合并冰浴30min，制备得到混合液；
C．向混合液中加入0.1mol/L盐酸溶液200μL，搅拌混合均匀后，于温度4℃转速7500rpm条件下离心30min，收集上清液作为样品2；
D．取步骤C中所得沉淀，加入50%乙醇1.0mL放置2h，再加入50%乙醇2.0mL放置2h，于6℃转速8500rpm条件下离心1h，取2.7mL上清液作为样品3；
E．取步骤D中所得沉淀，加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液0.5mL，放置1h，再加入1.5mL的水，作为样品4；
F．分别量取1.0mL样品1、1.0mL样品2、0.5mL样品3和0.5mL样品4各两份作为平行样，将样品矿化后以4μg/mL的磷对照品溶液为标准测定各样品中的磷含量，含量分别为A1=1.907μg，A2=0.027μg，A3=0.051μg，A4=1.214μg；
G．计算样品的磷含量、实验的有效性以及待测Hib结合疫苗样品的高分子结合物含量，计算公式如下：
P1=(A1×3)/1.0=5.721
P2=(A2×3.4)/1.0=0.092
P3=(A3×3.0)/0.5=0.306
P4=(A4×2.3)/0.5-(P3×0.3)/3.0=5.554
试验有效性=P1/(P2+P3+P4) ×100%=96.12%
高分子结合物含量=P4/(P2+P3+P4)×100%=93.31%
其中，P1、P2、P3和P4分别表示样品1、样品2、样品3和样品4的磷含量(μg/mL)。
Hib结合疫苗由纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖通过己二酰肼与破伤风类毒素共价结合制成。
通过以上实施例可以看出，试验有效性在95%～105%之间，可以认为本方法可以用于测定b型流感嗜血杆菌结合疫苗中高分子结合物含量。

Claims (1)

1.测定Hib结合疫苗中高分子结合物含量的方法，所述的Hib结合疫苗由纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖通过己二酰肼与破伤风类毒素共价结合制成，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
A．取多糖含量为20～30μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，作为样品1；
B．取多糖含量为20～30μg/mL的待测Hib结合疫苗样品3.0mL，并配置1%脱氧胆酸钠溶液200μL，将两种溶液混合并冰浴30min，制备得到混合液；
C．向混合液中加入0.1mol/L盐酸溶液200μL，搅拌混合均匀后，于温度4℃转速6000～7000rpm条件下离心30min，收集上清液作为样品2；
D．取步骤C中所得沉淀，加入50%乙醇1.0mL放置1～2h，再加入50%乙醇2.0mL放置1～2h，于6℃转速7500～8500rpm条件下离心1h，取2.7mL上清液作为样品3；
E．取步骤D中所得沉淀，加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液0.5mL，放置1h，再加入1.5mL的水，作为样品4；
F．分别量取1.0mL样品1、1.0mL样品2、0.5mL样品3和0.5mL样品4各两份作为平行样，将样品矿化后以4μg/mL的磷对照品溶液为标准测定各样品中的磷含量；
G．计算样品的磷含量、实验的有效性以及待测Hib结合疫苗样品的高分子结合物含量，计算公式如下：
P1=(A1×3)/1.0
P2=(A2×3.4)/1.0
P3=(A3×3.0)/0.5
P4=(A4×2.3)/0.5-(P3×0.3)/3.0
试验有效性=P1/(P2+P3+P4) ×100%
高分子结合物含量=P4/(P2+P3+P4)×100%
P1、P2、P3和P4分别表示样品1、样品2、样品3和样品4的磷含量，单位为μg/mL；A1、A2、A3和A4分别表示样品1、样品2、样品3和样品4矿化后的磷含量，单位为μg。
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