PT1476438E - Oxa- e tiadiazóis e a sua utilização como inibidores de metaloproteinase - Google Patents

Description

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**Λ BE A presente invenção diz respeito a derivados de ácido hidroxâmico e carboxilico terapeuticamente activos, a procedimentos para a sua preparação, a composições farmacológicas que os contêm e a utilização desses compostos na medicina. Em particular, os compostos são inibidores de metaloproteinases da matriz.

Antecedentes da Invenção

As metaloproteinases da matriz (MMP) são uma família de endopeptidases contendo zinco que são capazes de clivar grandes biomoléculas, como os colagénios, os proteoglicanos e gelatinas. 0 desequilíbrio entre MMP activas e inibidores endógenos conduz a uma disrupção excessiva dos tecidos. Os três grupos principais de MMP são as colagenases, as gelatinases e as estromelisinas. As colagenases incluem colagenase de fibroblasto * colagenase de neutrófilo (MMP-8) e colagenase 3 (MMP-13). As gelatinases incluem a gelatinase de 72 kDa (gelatinase A; MMP-2) e a gelatinase de 92 kDa (gelatinase B; MMP-9). As estromelisinas incluem a estromelisina 1 (MMP-3), a estromelisina 2 (MMP-10) e a matrilisina (MMP-7). Contudo, existem MMP que não se enquadram exactamente nos grupos anteriores, por exemplo, a metaloelastase (MMP-12), a MMP de tipo membrana (MT-MMP ou MMP-14) e a estromelisina 3 (MMP-11). A expressão excessiva e a activação de MMP têm sido associadas a uma larga variedade de doenças, como o cancro, a artrite reumatóide, a osteoartrite, os distúrbios inflamatórios crónicos, como a asma, a bronquite e o enfisema; os distúrbios cardiovasculares, como a ateroesclerose, a ulceração da córnea, as doenças dentárias como a gengivite e a doença periodontal; alterações neurológicos, como a esclerose múltipla e a restenose. A MMP-12 é, por exemplo, necessária para o desenvolvimento de enfisema induzido por fumo de cigarros em ratinhos [Science, 277, 2002 (1997)]. A inibição de MMP é portanto uma estratégia de tratamento desses estados. Contudo, existem indícios de que a inibição não selectiva da actividade de metaloproteinases da matriz pode afectar o processo fisiológico normal, conduzindo a efeitos secundários que limitam a dosagem. Pensa-se que a inibição selectiva de MMP-12 e/ou MMP-9 é uma estratégia particularmente relevante para intervenção em caso de estados inflamatórios.

As MMP podem hidrolisar o percursor ligado a membrana da citocina pró-inflamatória, o factor de necrose tumoral alfa (TNF-a). Esta clivagem origina TNF-a maduro solúvel e os inibidores de MMP podem bloquear a produção de TNF-a quer in vivo quer in vitro. Esta acção farmacológica é um provável contribuinte para a acção anti-inflamatória desta classe de compostos.

Para um estudo recente sobre a inibição da MMP como a reflectida na literatura de patentes, ver Doherty et al., Therapeutic Developments in Matrix Metalloproteinase

Inhibition; Expert Opinions on Therapeutic Patents, 2002, 12, 665-707. A WO 95 23790, em particular, descreve N-hidroxi-N'- (imidazolilmetil)-succinamidas substituídas como inibidores de metaloproteinases da matriz (MMP).

Chen et ai. (Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 6, No. 13, 9) descrevem inibidores de MMP contendo resíduos de imidazolilo ou benzimidazolilo. A WO 96 33176 descreve inibidores de MMP contendo uma variedade de resíduos de azolilo, incluindo resíduos de imidazolilo, tiazolilo e exazolilo. A US 2001/021718 descreve inibidores de MMP contendo resíduos de oxazolilo ou oxadiazolilo.

Descrição Breve da Invenção A presente invenção proporciona uma classe de compostos que são inibidores de MMP. A classe inclui compostos que são inibidores selectivos de MMP-12 em relação as colagenases e estromelisinas. Além disso, os compostos da invenção podem mostrar actividade selectiva para com a MMP-9. Os compostos da invenção são, portanto, indicados para o tratamento de doenças mediadas primariamente pela MMP-9 e/ou a MMP-12, em especial estados inflamatórios como a esclerose múltipla e a fibrose.

Descrição Pormenorizada da Invenção

De acordo com a presente invenção, é descrita a fórmula de composto (IA ou (IB)) :

em que W representa H0(C=0)-, H0NH(C=0)- ou H(C=0)N(OH)-- X representa -0- ou -S-;

Ri representa hidrogénio; -OH ou -SH; flúor ou cloro; -CF3; alquilo -0. · ; alcóxi (C:;-"C:íò ; alcenilo ξCm·-··Ci;.í ; fenilo ou fenilo substituído; fenilalquilo (Ci-Cô) ou fenilalquilosubstituído; fenilalcenilo (C2-Ce) ou heterociclilo de fenilalcenilo (C2-Ce) substituído ou heterociclilo substituído; heterociclilalquilo (Οχ-Οε) ou heterociclilalquilo (Ci-Ce) substituído; um grupo BSOnA- em que néO, lou2eBé hidrogénio ou um alquilo Í.Ci~C*í, fenilo, fenilo substituído, heterociclilo, heterociclilo substituído, acilo (Ci — Ce), grupo fenacilo ou fenacilo substituído, e A representa alquileno {Cr*C*} ; -NH2, alquilamino ou dialquilamino ; aminoalquilo , alquilamino (C1-C6) alquilo , dialquilamino ÍC;í'"'Cí1 alquilo , hidroxialquilo (Ci —

Ce) , mercaptoalquilo ou carboxialquilo íC;rvfô;::5 em que os grupos de amino, hidróxi, mercapto ou carboxilo são opcionalmente protegidos ou o grupo de carboxilo amidado; ou um anel cicloalquilo, cicloalcenilo ou heterocíclico não aromático contendo até 3 heteroátomos, podendo qualquer um dos quais ser (i) substituído por um ou mais substituintes seleccionados de entre alquilo Ci-m;* alcenilo halo, ciano (-CN), -CO2H, -CO2R, - CONH2, -C0NHR, -C0N(R)2, -OH, -0R, oxo-, -SH, -SR, -NHCOR, e -MOOal em que R é alquilo (1:-¾ ou benzilo e/ou (ii) fundidos a um anel cicloalquilo ou heterocíclico. R2 representa um grupo Rio- (X) n“ (ALK)m- em que

Rio representa hidrogénio, ou um alquilo £·*€*·* alcenilo Qí-lb;,: alcinilo Qí-C·-;.,: cicloalquilo, arilo, ou um grupo heterociclilo, qualquer um dos quais podendo ser não substituído ou substituído por alquilo ·> alcóxi 5Cr-'€::i}, hidróxi, mercapto, alquiltio , amino, halo (incluindo fluoro, cloro, bromo e iodo), trifluorometilo, ciano, nitro, oxo, -COOH, -CONH2, ou em que W' e Ra são independentemente um grupo alquilo (Ci-Cb) e ALK representa um radical divalente linear ou ramificado alquileno alcenileno C2-C6 ou alcinileno e podem ser interrompidos por uma ou mais ligações não adjacentes -NH-, -0- ou -S-, X representa -NH-, 0-, S-, -NRC ou -NC0Rc em que Rc é um grupo alquilo ç€;;“C;í>1 e m e n são independentemente 0 ou 1; R3 representa a cadeia lateral de um aminoácido alfa natural ou não natural; R4 representa alquilo C;.··Ca, alcenilo C,--Ct:í alcinilo 0·; ···:":<; f perfluoroalquilo ClCt, cicloalquilo, cicloalquil(alquilo Ci-Ce)-, cicloalcenilo, cicloalcenil(alquilo Ci-Cg)-, fenilo, fenil (alquilo Ci-Cg)-, naftilo, heterociclilo não arilo, heterociclil(alquilo - não arilo, heteroarilo; ou heteroaril (alquilo - opcionalmente substituído, e hidratos e solvatos de sais derivados farmacologicamente aceitáveis.

Tal como se utiliza aqui, a expressão «alquilo indica um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada que tem entre 1 a 6 átomos de carbono, incluindo por exemplo metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, n-pentilo e n-hexilo.

Tal como se utiliza aqui, a expressão «radical de alquileno íCv-Clb divalente» indica uma cadeia de hidrocarboneto saturado que tem entre 1 a 6 átomos de carbono e duas valências insatisfeitas.

Tal como se utiliza aqui, a expressão «alcenilo C1-C6» indica um grupo alcenilo de cadeia linear ou ramificada que tem entre 2 a 6 átomos de carbono com pelo menos uma ligação dupla de estereoquimica E ou Z conforme o caso. A expressão inclui, por exemplo, vinilo, alilo, 1- e 2-butenilo e 2-metil-2-propenilo.

Tal como se utiliza aqui, a expressão «radical de alcenileno divalente» indica uma cadeia de hidrocarboneto que tem entre 2 a 6 átomos de carbono, pelo menos uma ligação dupla e duas valências insatisfeitas.

Tal como se utiliza aqui, a expressão «alcinilo Cs-Cg» indica grupos de hidrocarboneto de cadeia linear ou cadeia ramificada que têm entre 2 a 6 átomos de carbono e ainda uma ligação tripla. Esta expressão incluiria, por exemplo, etinilo, 1-propinilo, 1- e 2-butinilo, 2-metil-2-propinilo, 2-pentinilo, 3-pentinilo, 4-pentinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 4-hexinilo e 5-hexinilo.

Tal como se utiliza aqui, a expressão «radical de alcinileno divalente» indica uma cadeia de hidrocarboneto que tem entre 2 e 6 átomos de carbono, pelo menos uma ligação tripla e duas valências insatisfeitas.

Tal como se utiliza aqui, o termo «cicloalquilo» indica um grupo aliciclico saturado que tem entre 3 a 8 átomos de carbono e inclui, por exemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo e ciclooctilo.

Tal como se utiliza aqui, o termo «cicloalcenilo» indica um grupo aliciclico insaturado que tem entre 3 a 8 átomos de carbono e inclui, exemplo, ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo e ciclooctenilo. No caso de anéis de cicloalcenilo de entre 5 a 8 átomos de carbono, o anel poderá conter mais do que uma ligação dupla.

Tal como se utiliza aqui, o termo «arilo» indica um grupo aromático carbociclico mono-, bi- ou tri-ciclico, e grupos consistindo de dois grupos aromáticos carbociclicos monociclicos covalentemente ligados. Exemplos destes grupos são o fenilo, bifenilo e naftilo.

Tal como se utiliza aqui, o termo inqualifiçado «heterociclilo» ou «heterocíclico» inclui «heteroarilo» tal como se define abaixo, e indica em particular um anel heterocíclico aromático ou não aromático de 5 a 8 membros, contendo um ou mais heteroátomos seleccionados de entre S, N e O, e opcionalmente fundidos a um benzilo ou um segundo anel heterocíclico e o termo inclui, por exemplo, anéis de pirrolilo, furilo, tienilo, piperidinilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, tiazepinilo, pirazolilo, piridinilo, pirrolidinilo, pirimidinilo, morfolinilo, piperazinilo, indolilo e benzimidazolilo.

Tal como se utiliza aqui, o termo «heteroarilo» indica um anel aromático de entre 5 a 6 membros contendo um ou mais heteroátomos, e opcionalmente fundido a um anel benzilo ou piridilo; e a grupos que consistem de dois anéis aromáticos covalentemente ligados de 5 ou 6 membros contendo, cada um, um ou mais heteroátomos; e grupos que consistem de um grupo aromático carbociclico monociclico covalentemente ligado a anéis aromáticos de 5 ou 6 membros, contendo um ou mais heteroátomos. Exemplos destes grupos incluem tienilo, furilo, pirrolilo, imidazolilo, benzimidazolilo, tiazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, *.]w tiadiazolil-4-il)fenilo e 5-isoxazol-3-iltienilo.

Tal como se utiliza aqui, o termo inqualifiçado «carbociclilo» ou «carbociclico» indica um anel de 5 a 8 membros cujos átomos do anel são todos de carbono. A menos que seja indicado o contrário no contexto em que ocorra, o termo «substituído» como aplicado aqui a qualquer grupo significa substituído com até quatro substituintes, podendo cada um dos quais ser independentemente alquilo (Ci— Ce), fenilo, benzilo, alcóxi (Ci-C6), fenóxi, hidróxi, mercapto, alquiltio , amino halo (incluindo fluoro, cloro, bromo e iodo), trifluorometilo, ciano, nitro, oxo, - COOH, -CONH2, f "Ί\·ΓίΗ , HSiHGOR"··./vn:·: , ,· ~í;ís ou "GGKIvBf em que RA e RB são independentemente um grupo alquilo > No caso em que «substituído» indique substituído por benzilo, o anel fenilo derivado pode ele próprio ser substituído com qualquer um dos anteriores, excepto fenilo ou benzilo.

Tal como se utiliza aqui, a expressão «cadeira lateral de um aminoácido alfa natural» e «cadeia lateral de um aminoácido alfa não natural» indicam respectivamente o grupo Rx num aminoácido natural e não natural da fórmula C^^CODI',

Exemplos de cadeias laterais de aminoácidos alfa naturais incluem os de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, cistina, ácido glutâmico, histidina, 5-hidroxilisina, 4-hidroxiprolina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina, ácido a-aminoadípico, ácido a-amino-n-butírico, 3,4-dihidroxifenilalanina, homosserina, a-metilserina, ornitina, ácido pipecólico e tiroxina.

Em cadeias laterais de aminoácido alfa natural que contenham substituintes funcionais, por exemplo, grupos amino, carboxilo, hidróxi, mercapto, guanidilo, imidazolilo, ou indolilo como na arginina, lisina, ácido glutâmico, ácido aspártico, triptofano, histidina, serina, treonina, tirosina e cisteína, esses substituintes funcionais podem ser opcionalmente protegidos.

Da mesma forma, nas cadeias laterais de aminoácidos alfa não naturais que contenham substituintes funcionais, por exemplo, grupos amino, carboxilo, hidróxi, mercapto, guanidilo, imidazolilo, ou indolilo, esses substituintes funcionais podem ser opcionalmente protegidos. 0 termo «protegido», quando utilizado em relação a um substituinte funcional numa cadeia lateral de um aminoácido alfa natural ou não natural, indica um derivado desse substituinte que é substancialmente não funcional. 0 por demais conhecido livro de T. W. Greene e P. G. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, segunda edição, Wiley, Nova Iorque, 1991, desenvolve o assunto. Por exemplo, os grupos carboxilo podem ser esterifiçados (por exemplo, como um éster de alquilo C1-C6) , os grupos de amino podem ser convertidos em amidas (por exemplo, como uma amida de alquilo NHCOCi-Cb) ou carbamatos (por exemplo, como um alquilo NHC(=0)0C:í“Cí ou carbamato NHC (=0) OCIfePh), grupos hidroxilo podem ser convertidos em éteres (por exemplo, um éter alquílico OOr-Ci ou um éter 0 (alquilo Ci-Cõ) fenílico ou ésteres (por exemplo, um éster de alquilo OC (-0) Cu~C>) e grupos de tiol podem ser convertidos em tioéteres (por exemplo, um tioéter de tert-butilo ou de benzilo) ou tioésteres (por exemplo, um tioéster de alquilo SC(=0)Ci-C6) -

Existem pelo menos dois potenciais ou reais centros quirais nos compostos de acordo com a invenção devido a presença de átomos de carbono assimétricos. A presença de vários átomos de carbono assimétricos dá origem a alguns diastereoisómeros com estereoquímica R ou S em cada centro quiral. A invenção inclui todos esses diastereoisómeros e misturas derivadas. Actualmente, a configuração estereoquímica preferida do átomo de carbono que transporta o grupo R2 é R; o do átomo de carbono que transporta o grupo Ri (quando assimétrico) é R; e o do átomo de carbono que transporta o grupo R3 (quando assimétrico) é S. 0 grupo Β··:

Ri pode ser, por exemplo, hidrogénio, hidróxi, metilo, metóxi, trifluorometilo, etilo, n-propilo, alilfenilpropilo, ciclopropilmetilo, fenilprop-2-enilo, tienilsulfanilmetilo, tienilsulfinilmetilo, ou tienilsulfonilmetilo, ou alquilo Ci-C-u por exemplo, metilo, n-propilo ou n-butilo de etilo, substituído por um ftalimido, 1,2-dimetil-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidin-4-ilo, 3-metil-2,5-dioxo-l-imidazolidinilo, 3,4,4-trimetil-2,5-dioxo-l-imidazolidinilo, 2-metil-3,5-dioxo-l,2,4-oxadiazol-4-ilo, 3-metil-2,4,5-trioxo-l-imidazolidinilo, 2,5-dioxo-3-fenil-l-imidazolidinilo, 2-oxo-l-pirrolidinilo, 2,5-dioxo-l-pirrolidinilo ou 2,6-dioxopiperidinilo, 5,5-dimetil-2,4-dioxo-3-oxazolidinilo, hexahidro-1,3-dioxopirazol[l, 2, a] [1.? 2,4]-triazol-2-ilo, ou um grupo naftalimido (isto é, 1,3-dihidro-l,3-dioxo-2H-benz [f ] isoindol-2-ilo) , 1,3-dihidro-l-oxo-2H-benz[f]isoindol-2-ilo, 1,3-dihidro-l,3-dioxo-2H-pirrolo[3,4-b]quinolin-2-ilo, ou 2,3-dihidro-l,3-dioxo-1 H-benz[d,e]isoquinolin-2-ilo; ou ciclohexilo, ciclooctilo, cicloheptilo, ciclopentilo, ciclobutilo, ciclopropilo, tetrahidropiranilo ou morfolinilo.

Actualmente, os grupos Ri preferidos incluem hidrogénio, hidróxi, metóxi, ciclopentilo, n-propilo e alilo. Destes, o hidrogénio, hidróxi, metóxi e alilo são presentemente preferidos. 0 grupo 1¾ R2 pode ser, por exemplo, alquilo Ci-Ci2, alcenilo C3-C6 ou alcinilo cicloalquil(alquilo fenil (alquilo Ci-Cô) -/ fenil (alcenilo - ou fenil(alcinilo Cvr-CtJ - opcionalmente substituído no anel fenilo; heteroaril (alquilo Ci-Cê)-, heteroaril (alcenilo - ou heteroaril (alcinilo Clr-llq - opcionalmente substituído no anel heteroarilo; 4-fenilfenil(alquilo Ci-Ce)-, 4-fenilfenil(alcenilo C3-Cr)-, 4-fenilfenil (alcinilo C^-Cr)-, 4-heteroarilfenil(alquilo Ci-Ce)-, 4-heteroarilfenil(alcenilo C3-C6)-, 4-heteroarilfenil(alcinilo C3-C6)-, opcionalmente substituído no anel fenilo ou heteroarilo terminal; fenoxi(alquilo - ou heteroariloxi(alquilo opcionalmente substituído no anel de heteroarilo ou fenilo;

Exemplos específicos desses grupos incluem o metilo, etilo, n- ou iso-propilo, n-, iso- ou tert-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-nonilo, n-decilo, prop-2-in-l-ilo, ciclohexiletilo, ciclopentilmetilo, 3-fenilprop-2-in-l-ilo, 3-(2-clorofenil)prop-2-in-l-ilo, benzilfenilpropilo, 4-clorofenilpropilo, 4-metilfenilpropilo, 4- metoxifenilpropilo, fenoxibutilo, 3-(4-piridilfenil)propilo, 3-(4-(4-piridil)fenil)prop-2-in-l-ilo, 3-(4-fenilfenil)propilo, 3-(4-fenil)fenil)prop-2-in-l-ilo e 3-[ (4-clorofenil)fenil]propilo.

Os grupos R2 actualmente preferidos incluem benzilo, n- butilo, iso-butilo, n-hexilo, etoxifenilpropilo, preferencialmente 4-etoxifenilpropilo e ciclopentilmetilo. Deste, o isobutilo e etoxifenilpropilo, e em particular o 4-etoxifenilpropilo são presentemente preferidos. 0 grupo R3 R3 pode ser, por exemplo, alquilo 10-(¾ fenilo, 2, 3- ou 4-piridilo, 2- ou 3-tienilo, 2-, 3- ou 4-hidroxifenilo, 2-, 3- ou 4-metoxifenilo, 2-, 3- ou 4-piridilmetilo, benzilo, 2-, 3- ou 4-hidroxibenzilo, 2-, 3- ou 4- benziloxibenzilo, 2-, 3- ou 4-alcoxibenzilo C-f-Cj ou benziloxi(alquilo j ; ou o grupo caracterizador de um a-aminoácido natural em que qualquer grupo funcional possa ser protegido, qualquer grupo amino possa ser acilado e qualquer grupo carboxilo presente possa ser amidado; ou um grupo - [iy.k jem que Alk é um grupo alquilo (Cl ' C.q ou alcenilo (€b~£S:i opcionalmente interrompido por um ou mais átomos -0-, ou -S- ou grupos -N(R7)- [em que R7 é um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo ], n é 0 ou 1, e Re Θ um grupo cicloalquilo ou cicloalcenilo opcionalmente substituído; ou um grupo benzilo substituído num anel de fenilo por um grupo da fórmula -OCH2COR8 em que R8 é hidroxilo, amino, alcóxi (C1-C6), fenilalcóxi (Ci-C6) , alquilamino (Ci-Ce), dialquilamino (C1-C6), fenilalquilamino (Ci-Ce), o resíduo de um aminoácido ou halóide ácido, éster ou amido derivado, sendo o referido resíduo ligado via uma ligação de amida, sendo o aminoácido seleccionado de entre glicina, a ou | alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, serina, treonina, císteina, metionina, asparagina, glutamina, lisina, histidina, arginina, ácido glutâmico e ácido aspártico; ou um grupo heterociclico de alquilo , sendo ou não substituído ou mono- ou di-substituído no anel heterociclico com halo, nitro, carbóxi, alcóxi , ciano, alcanoilo {Cp*C«5 , trifluorometilalquilo 3 hidróxi, formilo, amino, alquilamino ÍOpvCíí3 , dialquilamino {Ci^Ciú 9 mercapto, alquiltio , hidroxialquilo , mercaptoalquilo ou alquilfenilmetilo (Cr"C5::3 ; ou um grupo -CRaRbRc em que: cada um dos R, Rb e R, é independentemente hidrogénio, alquilo , alcenilo í€s“Cíá , alcinilo (<' ;·”('>: 5, fenilalquilo (Ci-Cg), cicloalquilo íCp·--0¾¾ z ou R, é hidrogénio e R, e Rb são independentemente fenilo ou heteroarilo como piridilo; ou R, é hidrogénio, alquilo ÍOp-fc}, alcenilo , alcinilo |Co-vCíh, fenilalquilo fÇhnRf > cicloalquilo (C3-C8); e R, e Rb e o átomo de carbono ao qual estão ligados formam um cicloalquilo de 3 a 8 membros ou um anel heterociclico de 5 ou 6 membros; ou R, Rb e R, e o átomo de carbono ao qual estão ligados formam um anel tricíclico (por exemplo, adamantilo); ou R, e Rb são cada um independentemente alquilo 5 alcenilo , alcinilo , fenilalquilo (Ci-Cô) , ou um grupo como definido para R, abaixo que não hidrogénio, ou R, e Rb e o átomo de carbono ao qual estão ligados formam um anel cicloalquilo ou heterociclico, e R, é hidrogénio, -OH, -SH, halogénio, -CN, -C02H, perfluoroalquilo (C1-C4) , -CH2OH, -0¾ alquilo , -0 íCg.^Cíò alquilo, -0 (Q:alcenilo, - S CC'í-"Cí;5 alquilo, -S0 alquilo, -S02 ííuKhj alquilo, -S ÇCv:-v-Cí;S alcenilo, -S0 alcenilo, -S02 (C2- Cè) alcenilo ou um grupo -Q-W em que Q representa uma ligação ou -0-, -S-, -S0- ou -S02- e W representa um grupo fenilo, fenilalquilo, cicloalquilo íC.jrC*1, cicloalquilalquilo , ciclooalcenilo íCh-v-Cs), cicloalcenilalquilo , heteroarilo ou heteroarilalquilo, grupo W que pode ser opcionalmente substituído F<>r um ou mais substituintes independentemente seleccionados de entre hidroxilo, halogénio, -CN, -C02H, -C02 alquilo, -C0NH2, CONH alquilo, -CONH alquilo) 2, -CHO, -CH20H, perfluoroalquilo (C1-C4) , -0 C€r"C%| alquilo, -S (Ci— Οβ) alquilo, -S0 alquilo, -SC^ alquilo, -N02, -NH2, -NH alquilo, -N ( (Ci-Cô) alquilo) 2, -NHCO (Ci~ Cç) alquilo, alquilo (€&»<&), alcenilo CC^-Cí:) , alcinilo , cicloalquilo 3 cicloalcenilo (\V'CK), fenilo ou benzilo.

Os exemplos de grupos R3 particulares incluem benzilo, fenilo, ciclohexilmetilo, piridin-3-ilmetilo, tert-butoximetilo, iso-propilo, iso-butilo, sec-butilo, tert-butilo, 1-benziltio-l-metiletilo, 1-metiltio-l-metiletilo, e 1-mercapto-l-metiletilo.

Os grupos R3 presentemente preferidos incluem fenilo, benzilo, tert-butoximetilo, iso-propilo, tert-butilo e iso-butilo. Destes, tert-butilo e benzilo são presentemente mais preferidos. 0 grupo R4 R4 pode ser, por exemplo, alquilo como metilo, etilo, n- ou iso-propilo, pro-2-ilo, e tert-butilo, cicloalquilo (C3-C6) como ciclopropilo ou ciclopentilo; fenilo; fenil (alquilo Ci-Ce) como benzilo; heteroarilo(alquilo como tienilmetilo; heterociclico monociclico como morfolino; ou heteroarilo monociclico como tienilo ou furanilo. Qualquer um dos anteriores pode ser opcionalmente substituído, por exemplo, por metilo, trifluorometilo, hidróxi, mercapto, amino ou carbóxi.

Como já se referiu anteriormente, os presentes compostos são úteis na medicina humana ou veterinária, dado que são activos enquanto inibidores de MMP. De acordo com outro aspecto, esta invenção diz respeito a: (i) um composto que é um membro do grupo definido acima, para utilização na medicina humana ou veterinária, em particular na gestão (pelo que se quer dizer tratamento ou profilaxia) de doenças ou estados mediados por MMP; e (ii) a utilização de um composto que é membro do grupo definido acima na preparação de um agente para a gestão (pelo que se quer dizer tratamento ou profilaxia) de doenças e estados mediados por MMP.

As doenças e os estados mediados por MMP incluem aqueles que envolvem o catabolismo tecidular como a reabsorção óssea, doenças inflamatórias, estados dermatológicos e crescimento ou invasão tumoral por metástases secundárias, em particular a artrite reumatóide, osteoartrite, periodontite, gengivite, ulceração da córnea, distúrbios neuroinflamatórios, incluindo os que envolvem a degradação da mielina, por exemplo, esclerose múltipla, restenose, enfisema, bronquite e asma.

Num outro aspecto da invenção, proporciona-se uma composição farmacológica ou veterinária que compreenda um composto que é membro do grupo definido anteriormente com um excipiente ou transportador farmacologicamente ou veterinariamente aceitável.

Deve subentender-se que o nível de dose específico para qualquer doente em particular dependerá de uma variedade de factores, incluindo a actividade do composto específico empregue, a idade, o peso corporal, o estado geral de saúde, o sexo, a dieta, a altura de administração, a via de administração, a velocidade de excreção, a combinação de fármacos e a gravidade da doença que está a ser tratada. Os níveis de dose óptimos e a frequência da dosagem serão determinados por um ensaio clínico.

Os compostos com os quais a invenção esteja relacionada podem ser preparados para administração por qualquer via consistente com as suas propriedades farmacocinéticas. As composições administráveis oralmente poderão estar sob a forma de comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, pastilhas, preparações líquidas ou em gel, como soluções ou suspensões orais, tópicas ou parentéricas esterilizadas. Os comprimidos e cápsulas para administração oral poderão estar sob a forma de doses unitárias, e poderão conter excipientes convencionais como agentes aglomerantes, por exemplo, xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto ou polivinilpirrolidona; materiais de enchimento, por exemplo, lactose, açúcar, amido de milho, fosfato de cálcio, sorbitol ou glicina; lubrificante de comprimidos, por exemplo estearato de magnésio, talco, polietilenoglicol ou sílica; desintegrantes, por exemplo, amido de batata, ou agentes humidificantes aceitáveis como o sulfato de laurilo de sódio. Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com os métodos bem conhecidos na prática farmacológica habitual. As preparações líquidas orais poderão estar na forma de, por exemplo, suspensões, soluções, emulsões, xaropes ou elixires aquosos ou oleosos, ou poderão apresentar-se sob a forma de um produto seco para reconstituição com água ou outro meio conveniente antes do uso. Estas preparações líquidas poderão conter aditivos convencionais como agentes de suspensão, por exemplo, sorbitol, xarope, metilcelulose, xarope de glucose, gorduras comestíveis de gelatina hidrogenadas; agentes emulsionantes, por exemplo, lecitina, monooleato de sorbitano, ou acácia; veículos não aquosos (que poderão incluir óleos comestíveis), por exemplo, óleo de amêndoas, óleo de coco fraccionado, ésteres oleosos como glicerina, propilenoglicol, ou álcool etílico; conservantes, por exemplo, p-hidroxibenzoato de metilo ou de propilo ou ácido sórbico, e se desejado agentes corantes ou aromatizantes convencionais.

Para aplicação tópica na pele, o fármaco poderá ter a forma de creme, loção ou unguento. As formulações de creme ou unguento que poderão ser utilizadas para o fármaco são formulações convencionais bem conhecidas na técnica, por exemplo, como as descritas nos manuais farmacológicos como a British Pharmacopoeia.

Para aplicação tópica nos olhos, o fármaco poderá ter a forma de solução ou suspensão num excipiente aquoso ou não aquoso esterilizado adequado. Poderão incluir-se aditivos, por exemplo, tampões como um metabissulfito de sódio ou edetato dissódico; conservantes, incluindo agentes bactericidas e fungicidas como acetato ou nitrato mercúrico de fenilo, cloreto de benzalcónio ou clorohexidina, e agentes espessantes como hipromelose. 0 ingrediente activo poderá ser administrado parentericamente ou dissolvido num meio estéril. Dependendo do excipiente e da concentração utilizados, o fármaco poderá ser ou suspenso ou dissolvido no excipiente. Adjuvantes como um anestésico local, agentes conservantes e de tampão podem ser vantajosamente dissolvidos no excipiente.

Os compostos de acordo com a presente invenção em que W é um grupo de ácido hidroxâmico H0NH(C=0)- poderão ser preparados a partir de compostos correspondentes da invenção, em que W é um grupo carboxilo -COOH ou dos derivados de ácido hidroxâmico protegidos correspondentes. Esse processo, que constitui outro aspecto da invenção, compreende originar um ácido da fórmula geral (IIA) ou (IIB)

ou um seu derivado activado para reagir com hidroxilamina, hidroxilamina O-protegida, ou uma hidroxilamina N,0-diprotegida, ou um sal derivado, sendo X, R;R2, R3 e R4 como definidos na fórmula geral (IA) ou (IB), a excepção de que quaisquer substituintes em , R2, R3 e R4, são potencialmente reactivos com hidroxilamina, hidroxilamina 0-protegida, ou uma hidroxilamina N,O-diprotegida ou os seus sais poderão eles próprios estar protegidos dessa reacção, depois remover quaisquer grupos protectores do grupo de ácido hidroxâmico resultante e de quaisquer substituintes protegidos em F·;., ^2, R3 e R4. A conversão de (IIA) ou (IIB) num derivado activado como o pentafluorofenilo, hidroxissuccinilo, ou éster de hidroxibenzotriazolilo poderá ser efectuada pela reacção com um álcool apropriado na presença de um agente desidratante como a diciclohexildicarbodiimida (OOCI* N,N-dimetilaminopropil-N-etilcarbodiimida (EDC), ou 2-etoxi-l-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina (EEDQ).

Os grupos protectores como os referidos acima são bem conhecidos per se, por exemplo, a partir das técnicas da química de péptidos. Os grupos de amino são frequentemente passíveis de ser protegidos P;3~ grupos de benziloxicarbonilo, t-butoxicarbonilo ou acetilo, ou na forma de um grupo ftalimido. Os grupos hidróxi são frequentemente passíveis de ser protegidos como éteres prontamente cliváveis como o éter de t-butilo ou benzilo, ou ésteres prontamente cliváveis como o acetato. Os grupos de carbóxi são frequentemente passíveis de ser protegidos como ésteres prontamente cliváveis, como o éster de t-butilo ou benzilo.

Os exemplos de hidroxilaminas O-protegidas para utilização no método (a) acima incluem O-benzilhidroxilamina, 0-4-metoxibenzilhidroxilamina, O-trimetilsililhidroxilamina, e O-tert-butixucarbonilhidroxilamina.

Os exemplos de hidroxilaminas 0,N-diprotegidas para utilização no método {&) acima incluem N,0-bis(benzil)hidroxilamina, N,0-bis(4-metoxibenzil)hidroxilamina, N-tert-butoxicarbonil-O-tert-butildimetilsililhidroxilamina, N-tert-butoxicarbonil-O-tetrahidropiranilhidroxilamina, e N,0-bis(tert-butoxicarbonil)hidroxilamina.

Os compostos da invenção em que W é um grupo N-formilhidroxilamino H(C=0)NH(OH)- poderão ser preparados por N-formilação do composto 0-protegido correspondente em que W é -NH(OH), e posterior remoção do grupo 0-protegido.

Os compostos de acordo com a presente invenção em que W é um grupo de ácido carboxílico -C00H, isto é, compostos da fórmula (IIA) ou (IIB) acima apresentada, poderão ser preparados por um processo que compreende: união de um ácido da fórmula (III) ou um seu derivado activado

com uma amina da fórmula (IVA) ou (IVB)

mi em que X, R2, R3 e R4 são como definido na fórmula geral (IA) e (IB) excepto pelo facto de qualquer dos substituintes em Ri, R2, B3 e R4 que são potencialmente reactivos na reacção de união poderem eles próprios ser protegidos dessa reacção, e Rn representar um grupo protector hidróxi, e subsequentemente remover o grupo protector Rn e quaisquer grupos protectores de Ri, R2, R3 e R4.

Os derivados activos dos ácidos (III) incluem ésteres activados como o éster pentafluorofenilo, anidridos ou halóides ácidos, por exemplo, cloretos. Os grupos hidróxi convenientes poderão protectores de seleccionados de entre aqueles conhecidos na técnica. ser

Os compostos da fórmula (IVA) e (IVB) poderão ser preparados por métodos análogos aos métodos gerais para a formação de anel de oxadiazol ilustrada nos Esquemas 1 e 2 nos Exemplos 1 e 2 abaixo.

Os exemplos preparatórios seguintes descrevem a preparação dos compostos úteis de acordo com a invenção.

Foram utilizadas as seguintes abreviaturas nos exemplos: DCM - Diclorometano DMF - N,N-Dimetilformamida HOBT - 1-Hidroxibenzotriazol

Pfp - Pentafluorofenol WSCDI - Hidrocloreto de N-(3-dimetilaminopropil)-N-- etilcarbodiimida HC1 - Ácido clorídrico THF - Tetrahidrofurano TFA - Ácido trifluoroacético P(0-Tol)3 - Tri-O-tolilfosfina

AcOEt - Acetato de etilo CH3CN - Acetonitrilo

Exemplo 1 Ácido 3R- [li Ι''4ί??©11Ιχ'1Ι·" (5-fenil- [lí: |:í 4 ] oxadiazol-3-il) -pfxgtigçifbgrtòil; ··-b 11ç;<i- Á-os·r.11 ---00011,01 .ui;: txdolog

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Esquema 1.

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Reagentes e condições. A. HOBT, WSC, NH3, DMF; B. POCL3, piridina; C. Aq.NH20H, etanol, 70°C; D. RC0C1, DMAP, piridina, DMF, 100°C; E. HBr/ácido acético; F. Succinato quiral, DMF; G. NH2OH aq., metanol; H. Pfp, WSC, DMF; I. 1M de HC1, THF. O Exemplo 1 foi preparado como se esquematiza no Esquema 1, utilizando os procedimentos descritos abaixo.

Passo A. Éster benzilico de ácido (lS-carbamoil-2,2-dimetil-propil)-carbâmico

Dissolveu-se N-benzoloxicarbonil-L-tert-butilglicina (50 g, 189 mmol) em DMF (500 ml) e arrefeceu-se num banho de água gelada antes de se adicionar HOBT (28,05 g, 208 mmol) e WSCDI (39,8 g, 208 mmol). A reacção foi agitada a 0°C durante 1 hora antes da adição de 0,880 de solução de amónia (21 ml, 377 mmol). A reacção foi deixada a aquecer a temperatura ambiente e agitada durante 18 horas. Removeu-se a DMF sob pressão reduzida e o resíduo foi dividido entre acetato de etilo e 1 M de HC1. A camada orgânica foi separada e lavada com 1 M de HC1, uma solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada e salmoura antes de secar com sulfato de magnésio, filtração e concentração sob pressão reduzida para originar éster benzilico de ácido (1 S-carbamolil-2,2-dimetilpropil)-carbâmico sob a forma de um sólido branco (44,1 g, 89%). 1H-NMR; delta teKI;} , 7,32 (5H, m) , 6,05 (1H, bs), 5,71 (1H, bs), 5,60 (1H, d, J = 6,5 Hz), 5,08 (2H, s), 4,01 (1 H, d, J = 6,5 Hz) e 1,00 (9H, s). LRMS; ião positivo 265 (M+H), 287 (M+Na).

Passo B. Éster benzílico de ácido (lS-ciano-2,2-dimetil-propil)-carbâmico

Dissolveu-se éster benzílico de ácido (lS-carbamolil-2,2-dimetil-propil)-carbâmico (44,1 g, 167 mmol) em piridina anidra (203 ml, 2,5 mmol) sob uma atmosfera inerte e arrefeceu-se num banho de água gelada. Adicionou-se lentamente oxicloreto de fósforo (21,8 ml, 234 mmol) durante 15 minutos e deixou-se a reacção a agitar no banho de água gelada durante 2 horas antes de aquecer até temperatura ambiente e se agitar durante 12 horas. A mistura de reacção foi tratada com água gelada (400 ml) e extraída com acetato de etilo (2 x 300 ml) . A camada orgânica foi separada e lavada com 1 M de HC1, uma solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada e salmoura antes de secar sobre o sulfato de magnésio, filtração e concentração sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna de sílica gel utilizando acetato de etilo/hexano como eluente conduz ao isolamento do produto desejado sob a forma de um óleo laranja (36,72 g, 89%). 1H-NMR; delta fCiKls} * 7,42 (5H, m), 5,28 (2H, m) , 4,55 (2H, d, J = 6,5 Hz) e 1,11 (9H, s). LRMS; ião positivo 269 (M+Na), 247,2 (M+H).

Passo C. Éster benzílico de ácido [1S-(N-hid:ro>d carbhvídíàidoil) -t, -carb&dco

Dissolveu-se éster benzílico de ácido (lS-ciano-2,2-dimetil-propil)-carbâmico (37,60 g, 153 mmol) em etanol (300 ml) e tratou-se gota a gota com hidroxilamina aquosa a 50% (51 ml, 764 mmol). A reacção foi aquecida em refluxo e agitada durante 3 horas. A reacção foi depois arrefecida e concentrada sob pressão reduzida para originar o produto desejado sob a forma de uma espuma/goma branca (41,5 g, 97%) . 1H-NMR; delta (CDCI3) , 7,32 (5H, m) , 6,21 (1H, bs), 5,95 (1H, bs), 5,81 (1H, d, J = 6,4 Hz), 5,08 (2H, m), 4,79 (1H, bs), 4,05 (1H, d, J = 6,5 Hz) e 0,95 (9H, s). LRMS; ião positivo 279,8 (M+H).

Passo D. Éster benzílico de ácido [2,2-dirnetil-lS- (5-fenil-n..f 2,4] oxadiazol-3-il)-propil] -carbâmico

Dissolveu-se éster benzilico de ácido [1S —(N— i ·· clKPii 1 -prtpi; ] ·· cl rbic·:·:··:; (0,21 g, 0,75 mmol) em DMF (5 ml) e tratou-se com piridina (0,1 ml, 1,28 mmol), cloreto de benzoil (0,13 ml, 1,1 mmol) e DMAP (catalítico). A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 4 horas antes de a aquecer até 100 °C e agitando durante 16 horas. A reacção foi novamente arrefecida até temperatura ambiente e concentrada sob pressão reduzida. A reacção foi diluída com acetato de etilo e lavada com 1 M de HC1, uma solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada e salmoura antes de secar sobre sulfato de magnésio, filtração e concentração sob pressão reduzida. O produto desejado foi isolado sob a forma de um óleo laranja (O,22 g, 18%). 1H-NMR; delta (CDC13) , 8,12 (2H, m) , 7,55 (3H, m) , 7,32 (5H, m), 5,55 (1H, d, J = 6,4 Hz), 5,12 (2H, m), 4,95 (1H, d, J = 6,5 Hz) e 1,10 (9H, s) . LRMS; ião positivo 366,2 (M+H), 388,2 (M+Na).

Passo E. 2,2-dimetil-lS-(5-fenil-ÍI, 2,4] oxadiazol-3-il)-propilamina

Tratou-se éster benzílico de ácido [2,2-dimetil-lS-(5-fenil-[l.t 2,4] oxadiazol-3-il)-propil]-carbâmico (0,2 g, 0,5 mmol) com 48% de ácido hidrobrómico em ácido acético (10 ml) . A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. A reacção foi concentrada sob pressão reduzida e dividida entre acetato de etilo e 1 M de Na2C03. A camada orgânica foi ainda lavada com 1 M de Na2CC>3 e salmoura antes de secar sobre sulfato de magnésio, filtração e concentração sob pressão reduzida. O produto foi isolado sob a forma de um óleo amarelo (0,13 g, 98%) . LRMS; ião positivo 232 (M+H).

Passo F. [2,2-dimetil-lS-(5-fenil-[l# 2,4]oxadiazol-3-il)-propil]-amida de ácido 2R-(2,2-dimetil-5-oxo-[1,3]dioxotan-4S-il)-4-metil-pentanóico

Dissolveu-se 2,2-dimetil-lS-(5-fenil-[I,2,4]oxadiazol-3-il)-propilamina (0,13 g, 0,6 mmol) em DMF (5 ml) e arrefeceu-se num banho de água gelada antes da adição de éster de pentafluorofenilo de ácido 2R-(2,2-dimetil-5S-oxo-[X*3]dioxolan-4-il)-4-metil-pentanóico (0,22 g, 0,6 mmol). A reacção foi deixada a aquecer até temperatura ambiente e agitada durante 15 horas. A DMF foi removida sob pressão reduzida e a reacção diluída com acetato de etilo e lavada com 1 M de HCl, uma solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada e salmoura antes de secar sobre sulfato de magnésio, filtração e concentração sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna de sílica gel utilizando acetato de etilo e hexano (1:1) conduziu ao isolamento do produto desejado sob a forma de um sólido branco (0,16 g, 64% ) 1H-NMR; delta (CDC13) , 8,12 (2H, m), 7,55 (3H, m), 6, 65 (1H, d, J = 6,4 Hz), 5,25 (1H, d, J = 6, 5 Hz) , 4,55 (1 H, d, J = 5,9 Hz), 2,75 (1H, m) , 1,64 (3H, s), 1,55 (3H, s) , U 04 (UU s) e 0,88 (6H, m). LRMS; ião positivo 444 (M+H).

Passo G. Ácido 3R-[2,2-dimetil-lS-(5-fenil-[1,2,4]oxadiazol- ,5 -í1 ; -plOU \

Dissolveu-se [2,2-dimetil-lS-(5-fenil-(I*2,4]oxadiazol-3-il)-propil]-amida de ácido 2R-(2,2-dimetil-5S-oxo-í 1 ^ 3] dioxolan 4 il) 4 me til pentanóico (0,05 g, 0,11 iranol) em metanol (2 ml) e tratou-se com 50% de hidroxilamina aquosa (0,04 ml, 0,5 mmol). A reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 2 horas antes de evaporação sob pressão reduzida. 0 produto de reacção foi separado por cromatografia de fase reversa preparativa para originar o produto desejado sob a forma de um sólido branco (0,02 g, 44%) . 'H-NMR; delta (CH3OD) , 8,13 (2H, m), 7,65 (1H, m), 7,58 (2H, m), 5,14 (1H, s), 4,01 (1H, d, J = 7,1 Hz), 2,94 (1H, m) , 1,60 (1H, m), 1,45 (1H, m), 1,16 (1H, m), 1,07 (9H, s), 0,89 (3H, d, J = 6,5 Hz) e 0,86 (3H, d, J = 6,6 Hz). delta (CH3OD), 177,1, 176,3, 172, 0, 171, 6, 134, 6, 130,8, 129,4, 125,7, 73,7, 55,8, 49,6, 39,7, 36,2, 27,4, 27,2, 24,2 e 22,5. LRMS; ião positivo 419 (M+H); ião negativo 417 (M-H).

Passo H. Éster de pentafluorofenilo de ácido 2R-(2,2-dihiítil - t-c-xo-1 Ui) diôxsl ún-ii-i I} - 4-Skít i X·-

Dissolveu-se ácido !

il)-4-metil-pentanóico (preparado de acordo com a WO 94/02447) (30 g, 130 mmol) em acetato de etilo (300 ml) e

tratou-se com pentafluorofenol (28,8 g, 156 mmol) e WSCDI (30 g, 156 mmol). A reacção foi aquecida até refluxo durante 2 horas e depois deixada a agitar a temperatura ambiente durante 12 horas. A mistura de reacção foi lavada com 1 M de e salmoura antes de secar sobre sulfato de magnésio, filtração e concentração sob pressão reduzida. O produto foi recristalizado a partir de acetato de etilo/hexano para originar o produto desejado sob a forma de um único diastereoisómero (21,2 g, 42%). 1H-NMR; delta (CDC13) , 4,55 (1 H, d, J = 6,7 Hz), 3,31 (1H, m) , 1,85 (3H, bm) , 1,65 (3H, s), 1,58 (3H, s), 1,05 (3H, d, J = 6,5 Hz) e 0,99 (3H, d, J = 6,5 Hz).

Foi também preparado o diastereoisómero ácido 3R-[2,2-dimetil-lS-(5-fenil-[If 2,4]oxadiazol-3-il)-propilcarbamoil]-2R-hidroxi-5-metil-hexanohidroxâmico

M+H = 420,0, M+Na = 441,5, M-H = 417,5. O ácido carboxilico correspondente foi preparado como apresentado no Esquema 1 e o procedimento abaixo.

Passo I. Ácido 3R- [IS- (5-furan-2-il-[l.í 2,4] oxadiazol-3-il)- 2,2 --ÁissiST: i i -ptc-pi ipatbsst / $ ·· h idr Od i - ! ·· ddt 11 ·· buM·;.: n Co d

Dissolveu-se [2,2-dimetil-lS-(5-furan-2-il-[1,2,4]oxadiazol-3-il)-propil]-amida de ácido 2R-(2,2-dimetil-5S-oxo-[ 1 i. 3]dioxolan—4—i 1)—4—metil-pentanóico (0,05 g, 0,12 mmol) em tetrahidrofurano (5 ml) e arrefecida até 4°C durante a adição de 1 M de ácido clorídrico (5 ml) . A solução foi deixada a aquecer a temperatura ambiente e agitada durante 18 horas. O grosso do solvente foi removido sob pressão reduzida antes de secar sob vácuo elevado para dar origem a uma espuma branca (0,045 g, ca. quant.). 1H-NMR; delta (CH3OD) , 7,88 (1H, r S) , 7,45 (1H, d, J = = 3,6 Hz) , 6,74 (1H, m) , 5,15 (1H , s) , 4, 18 (2H, d, J = 6,4 Hz) , 2, 91 (1H, m), 1, 65 (1H, m), 1,50 H m) , 1, r 31 (1H, m), 1,06 (9H, s), 0,88 (3H, d, J = 6,4 Hz) e 0,82 (3H , d, J = = 6,5

Hz) . LRMS; ião negativo 392,2 (M-H).

Exemplo 2 Ácido 3R- [2,2-dimetil-lS- (3-fenil- [.!> 2,4]oxadiazol-5-il)- proiuli ; 'i ; -2i-hiuc·:i 1 -h'*x.í;r;s::hidroxasiuu

Esquema 2. \

1 Passo A

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Reagentes e condiçoes. A. HOBT, WSCD1, DMF; B. Tolueno, 100 °C; C. NH7OH aq., etanol, 70 X/ D. TFA, DCM; E. HOBT, WSCD1, DMF; F. NH20H aq., metanol. 0 Exemplo 2 foi preparado como apresentado no Esquema 2, utilizando os procedimentos descritos abaixo.

Passo A. Éster de benzotriazol-l-ilo de ácido 2S-tert-butoxicarbonilamino-3,3-dimetil-butírico

Arrefeceu-se uma solução de N-tert-butoxicarbonil-L-tert-butilglicina (5 g, 21,6 mmol) em acetato de etilo (80 ml) num banho de água gelada. Adicionaram-se HOBT (3,22 g, 23,8 mmol) e WSCDI (4,56 g, 23,8 mmol) e a reacção foi deixada a agitar a temperatura ambiente durante 12 horas. A mistura de reacção foi lavada com 1 M de Na?C03 e salmoura, antes de secar sobre sulfato de magnésio, filtração e concentração para originar uma espuma branca (5,74 g, 76%) . 1H-NMR; delta (CDC13) , 8,05 (1H, m), 7,65 (2H, m), 7,41 (1H, m), 5,10 (1H, d, J = 6,7 Hz), 4,45 (1H, d, J = 6,5 Hz), 1,55 (9H, s) e 1,21 (9H, s). LRMS; ião positivo 349 (M+H).

Passo B. Éster tert-butilico de ácido [2,2-dimetil-lS-(3-fenil-(j i2,4]oxadiazol-5-il)-propil]-carbâmico

Dissolveu-se éster de benzotriazol-l-ilo de ácido 25-tert-butoxicarbonilamino-3,3-dimetil-butírico (3,71 g, 10,7 mmol) em tolueno (80 ml) e tratou-se com N-hidroxi-benzamidina (2,9 g, 21,3 mmol). A mistura de reacção foi agitada a 110 °C durante 18 horas. A solução foi concentrada sob pressão reduzida e dividida entre acetato de etilo e 1 M de Na2C03. A camada orgânica foi ainda lavada com 1 M de Na2C03 e salmoura antes de secar sobre sulfato de magnésio, filtração e concentração sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna de silica gel utilizando acetato de etilo e hexano (1:4) conduziu ao isolamento do produto desejado (2,58 g, 73%) . Ή-NMR; delta (CDC13) , 8,10 (2H, m) , 7,50 (3H, m), 5,30 (1 H, bd), 4,95 (1H, d, J = 6,5 Hz), 1,44 (9H, s) e 1,03 (9H, s) . LRMS; ião positivo 354,2 (M+Na).

Passo C. N-hidroxi-benzamidina

Dissolveu-se benzonitrilo (5 g, 48 mmol) em etanol (100 ml) e tratou-se com hidroxilamina aquosa a 50% (16 ml, 242 mmol). A reacção foi aquecida até refluxo durante 3 horas antes de ser concentrada sob pressão reduzida para originar uma espuma transparente (4,5 g, 68%). LRMS; ião positivo 137 (M+H).

Passo D. 2,2-Dimetil-lS-(3-fenil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)- propilamina

Dissolveu-se éster tert-butilo de ácido [2,2-dimetil-lS-(3-fenil- [ I.( 2,4] oxadiazol-5-il)-propil] -carbâmico (1 g, 3,0 mmol) em DCM (5 ml) e tratou-se com TFA (5 ml) . A reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. A reacção foi concentrada sob pressão reduzida e dividida entre acetato de etilo e 1 M de Na2C03. A camada orgânica foi ainda lavada com 1 M de Na2C03 e salmoura antes de secar sobre sulfato de magnésio, filtração e concentração sob pressão reduzida para originar o produto desejado (0,65 g, 93%) . 'H-NMR; delta (CH3OD) , 8,10 (2H, m) , 7,55 (3H, m) , 4,81 (1H, s) e 1,19 (9H, s). LRMS; ião positivo 232 (M+H).

Passo E . [2,2-dimetil-lS-(3-fenil-[1,2,4]oxadiazol-5-il)-propil]-amida de ácido 2R-(2,2-dimetil-5-oxo-[1,3]dioxolan-4S-il)-4-metil-pentanóico

Dissolveu-se ácido in- {2, [ ·, lidlcDíclíRj-iS·· il)-4-metil-pentanóico (0,27 g, 1,17 mmol) em DMF (5 ml) e arrefeceu-se num banho de água gelada antes de adicionar HBOT (0,17 g, 1,29 mmol) e WSCDI (0,25 g, 1,29 mmol). A reacção foi agitada a 0°C durante 1 hora antes da adição de 2,2-dimetil-lS-(3-fenil-(1* 2,4]oxadiazol-5-il)-propilamina (0,3 g, 1,29 mmol). A reacção foi deixada a aquecer até temperatura ambiente e agitada durante 18 horas. A DMF foi removida sob pressão reduzida e o resíduo dividido entre acetato de etilo e 1 M de HC1. A camada orgânica foi separada e lavada com 1 M de HC1, uma separação de bicarbonato de sódio aquosa saturada e salmoura antes de secar sobre sulfato de magnésio, filtração e concentração sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna de sílica gel utilizando acetato de etilo e hexano (1:4) conduziu ao isolamento do produto desejado (0,26 g, 46%). 1H-NMR; delta (££€!$, 8,10 (2H, m), 7,50 (3H, m), 6,80 (1H, d, J = 9,3 Hz), 5,24 (1H, d, J = 9,3 Hz), 4,55 (1H, d, J = 5,1 Hz), 2,81 (1H, m), 1,63 (3H, s), 1,55 (3H, s), 0,92 (3H, d, J = 6,1 Hz) e 0,89 (3H, d, J = 6,2 Hz). LRMS; ião positivo 444 (M+H).

Passo F. Ácido 3R-[2,2-dimetil-lS-(3-fenil-[1,2,4]oxadiazol-5--11 } j -d 1-Ilidi62'I ··

Dissolveu-se [2,2-dimetil-lS- (3-fenil- ;1,.: 2,4] oxadiazol-5-il)-propil]-amida de ácido 2R-(2,2-dimetil-5-oxo-[X>3]dioxolan-4S-il)-4-metil-pentanóico (0,26 g, 0,6 mmol) em metanol (5 ml) e tratou-se com hidroxilamina aquosa a 50% (0,2 ml, 2,95 mmol) . A reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 3 horas antes de concentração sob pressão reduzida. O produto foi recristalizado a partir de acetato de etilo/hexano para originar o produto desejado (0,11 g, 41%) . 1H-NMR; delta (CH3OD) , 8,06 (2H, m) , 7,53 (3H, m), 5,21 (1H, s), 4,01 (1H, d, J = 7,5 Hz), 2,99 (1H, m) , 1,60 (1H, m) , 1,50 (1H, m), 1,15 (1H, m), 1,10 (9H, s) , 0,92 (3H, d, J = 6,6 Hz) e 0,81 (3H, d, J = 6,5 Hz). •·δϋΗ»Κ.ϊ delta (CH3OD), 180,3, 176,7, 172, 0, 169, 7, 132,9, 130,5, 128,8, 128,4, 73,7, 57,1, 49,5, 39,5, 36,5, 27,3, 24,3 e 22,5. LRMS; ião positivo 419 (M+H); ião negativo 417 (M-l).

Exemplo 3: 2R-[3-(4-Etoxi-fenil)-propil]-Nl-[IS-(5-tiofen-2-il)-n.f 2,4] oxadiazol-3-il) 2,2-dimetil-propil]-3S,N4-dihidróxi- succinamida

Esquema 3. .^CO^S passo C ss A S^COjiPr passo B jÇ j j HO^-CO^r O X f C02iPr EtO

Reagentes e condiçoes. A. LiHMDS, AlIBr, THF, -78°C até temperatura ambiente; B. 4-OEt-fenilBr, P(o-Tol)3, Pd(0Ac)2, NEt3, CH3CN; C. 10% Pd/C, H2, MeOH; D. LiOH, MeOH, H20; E. CuCl2, dimetoxiacetona, acetona; F. pentafluorofenol, WSC, HOAt, CH2CI2; G. Amina (como pormenorizado no Passo E, Esquema ΊΛ, DMF; H. NH20H aq., iPrOH. O Exemplo 3 foi preparado como apresentado no Esquema 1 utilizando procedimentos descritos abaixo.

Passo A: Éster de diisopropilo de ácido 2R-alil-3S-hidroxi-sucínico

Adicionou-se LiHMDS (200 ml, 0,2 mol, 2,1 eq.) gota a gota a uma solução fria (-78 "C) de éster de diisopropilo de ácido 2S-hidroxi-sucínico (19,70 ml, 95 mmol) em THF (35 ml). A mistura de reacção foi agitada a -78 "C durante duas horas e depois a -30 "C durante 30 minutos. A mistura de reacção foi depois arrefecida até -78 "C e adicionou-se brometo de alilo (12,36 ml, 0,14 mol, 1,5 eq.) gota a gota. A mistura de reacção foi deixada a aquecer até temperatura ambiente durante a noite. Foi colocada numa solução saturada de (200 ml) . A extracção com AcOEt (3 x 200 ml) seguida de uma lavagem com água (50 ml) e com salmoura (50 ml) produziu um óleo amarelo depois da remoção dos solventes sob vácuo. A purificação por cromatografia flash originou éster de diisopropilo de ácido 2R-alil-3S-hidroxi-sucinico sob a forma de um óleo incolor (7,76 g, de = 80%, 40% rendimento). 1H-NMR; delta (CDC13) , 5, 77-5,88 (1H, m) , 4,98-5,21 (4H, m) , 4,22 (1H, brs), 3,18 (1H, bs), 2,87-2,94 (1H, m), 2,56-2,65 (1H, m), 2,40-2,48 (1H, m) , 1,29 (6H, d, J = 6,3 Hz) e 1,22 (6H, d, J = 6,3 Hz) . LRMS: ião positivo 281 (M+Na).

Passo B: Éster de diisopropilo de ácido 2R-[3-(4-etoxi-fenil)-alil]-3S-hidroxi-sucínico A uma solução de éster de diisopropilo de ácido 2R-alil-3S-hidroxi-sucínico (4,79 g, 18,5 mmol), 4-bromofenetol (3,19 ml, 22,2 mmol, 1,2 eq.) e NEt3 (6,22 ml, 44,6 mmol, 2,4 eq.) em CH3CN (40 ml), adicionou-se uma suspensão sonicada (durante 2 minutos) de PfdKtdlJ:; (0,57 g, 2,22 mmol, 0,1 eq.) e IdiOte!;; (209 mg, 5%) em CH3CN (5 ml). A reacção foi aquecida até refluxo durante 2 horas. Removeu-se o CH3CN sob vácuo. 0 produto bruto foi extraído com AcOEt (3 x 200 ml), lavado com água (50 ml) e salmoura (50 ml) . A purificação por cromatografia flash originou o desejado éster de diisopropilo de ácido 2R-[3-(4-etoxi-fenil)-alil]-3S-hidroxi-sucínico (5,92 g, 84% rendimento). 1H-NMR; delta (CDCI3) , 7,28 (2H, d, J = 8,8Hz), 6,83 (2H, d, J = 8,8 Hz), 6,46 (1H, d, J = 15,7 Hz), 6,02-6,12 (1H, m), 4,98-5,13 (2H, m), 4,26 (1H, dd, J = 7,1, 3,0 Hz), 4,02 (2H, q, J = 7,0 Hz), 3,23 (1H, d, J = 7,1 Hz), 2,92-2,97 (1H, m) , 2, 68-2,79 (1H, m), 2,49-2,62 (1H, m), 1,41 (3H, t, J = 7,0 Hz) e 1,19-1,30 (12H, m) . LRMS: ião positivo 400 (M+Na).

Passo C: Éster de diisopropilo de ácido 2R-[3-(4-etoxi-fenil)-propil]-3S-hidroxi-sucínico

Adicionou-se Pd/C 10% (13 mg) a uma solução de éster de diisopropilo de ácido 2R-[3-(4-etoxi-fenil)-alil]-3S-hidroxi-sucínico (129 mg, 0,34 mmol) em MeOH (10 ml) sob uma atmosfera inerte. Borbulhou-se H? através da suspensão resultante durante 30 minutos. A mistura de reacção foi depois agitada sob uma atmosfera de H2 durante 16 horas. Filtrou-se o Pd/C e removeu-se o solvente sob pressão reduzida para originar éster de diisopropilo de ácido 2R-[3-(4-etoxi-fenil)-propil]-3S-hidroxi-sucínico (115 mg, 88% rendimento). 1H-NMR; delta (CDC13) , 7,08 (2H, d, J = 8,6 Hz), 6,81 (2H, d, J = 8,6 Hz), 4,97-5,14 (2H, m) , 4,20 (1 H, dd, J = 7,3, 3,5 Hz), 4,01 (2H, q, J = 7,0 Hz), 3,18 (1 H, d, J = 7,3

Hz), 2,77-2,83 (1H, m) , 2,55-2, 62 (2H, m) , 1,45-1,94 (4H, m), 1,40 (3H, t, J = 7,0 Hz) e 1,12-1,30 (12H, m). LRMS: ião positivo 402,0 (M+Na).

Passo D: Ácido 2R-[3-(4-etoxi-fenil)-propil]-3S-hidroxi-sucínico

Adicionou-se NaOH (1,66 g, 41,5 mmol, 5,5 eq.) a uma solução de éster de diisopropilo de ácido 2R-[3-(4-etoxi-fenil)-propil]-3S-hidroxi-sucínico (4,78 g, 12,6 mmol) em THF/água 3 120 ml) . A mistura de reacção foi depois agitada durante 16 horas a temperatura ambiente. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida e acidificada até um pH de 3 por adição de HC1 IN. 0 diácido de hidróxi foi extraído com AcOEt. A camada orgânica foi seca sobre MiSSCt e o solvente removido sob pressão reduzida para originar o desejado ácido 2R-[3-(4-etoxi-fenil)-propil]-3S-hidroxi-sucínico (3,66 g, 85% rendimento). 1H-NMR; delta (CH3OD) , 7,07 (2H, d, J = 8,6 Hz), 6,79 (2H, d, J = 8,6 Hz), 4,23 (1H, d, J = 5,8 Hz), 3,98 (2H, q, J = 7,0 Hz), 2,76-2,81 (1H, m) , 2,53-2,59 (2H, m) , 1,55-1,72 (4H, m), 1,35 (3H, t, J = 7,0 Hz). LRMS: ião positivo 319 (M+Na); ião negativo 295 (M-H). Á-. * ··> >

Passo E: Acido si,· 2-"dl?! (4-etoxi-fenil)-pentanóico

Adicionou-se dimetoxipropano (2,58 ml, 21 mmol, 1,7 eq.) e cloreto de cobre (165 mg, 1,2 mmol, 0,1 eq.) a uma solução de ácido 21- [3- } -propil) -iS-lilrtzl-áRtinicô (3,66 g, 12,3 mmol) em acetona (50 ml) sob uma atmosfera inerte. A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 16 horas. O solvente foi depois removido sob vácuo para originar ácido 2R-(2,2-dimetil-5-oxo- PU 3]dioxolan-4S-il)-5-(4-etoxi-fenil)-pentanóico (4,03 g, 97% rendimento). Ή-NMR, delta (CDC13) , 7,08 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6,82 (2H, d, J = 8,5 Hz), 4,48 (1H, d, J = 4,8 Hz), 4,01 (2H, q, J = 7.0 Hz), 2,91-2,98 (1H, m) , 2,54-2,64 (3H, m) , 1,23-2,20 (4H, m), 1,58 (3H, s), 1,53 (3H, s) e 1,40 (3H, t, J = 7,0

Hz) . LRMS: ião positivo 359 (M+Na); ião negativo 335 (M-H).

Passo F. Éster pentafluorofenilo de ácido 2R-(2,2-dimetil-5-oxo- [1., 3] dioxolan-4S-il) -5- (4-etoxi-fenil) -pentanóico

Adicionou-se WSC (2,54 g, 13,2 mmol, 1,1 eq.) a uma solução fria (0°C) de ácido 2R- (2,2-dimetil-5-oxo- ; 1 .> 3] dioxolan-4S-il)-5-(4-etoxi-fenil)-pentanóico (4,03 g, 12 mmol) e pentafluorofenol (2,43 g, 13,2 mmol, 1,1 eq.) em CIIjCÍí (50 ml) . A mistura de reacção foi deixada a aquecer a temperatura ambiente durante a noite. Removeu-se o 0.¾¾.½ sob vácuo e a mistura de reacção bruta resultante foi dissolvida em AcOEt (200 ml) . A camada orgânica foi lavada com água (50 ml), NaHC03 sat. (20 ml) e finalmente com salmoura (20 ml) . 0 solvente foi removido sob pressão para originar um óleo que foi purificado por cromatografia flash para originar o éster de pentafluorofenilo de ácido 2R-(2,2-dimetil-5-οχο-(1,3]dioxolan-4S-il)-5-(4-etoxifenil)-pentanóico pretendido (3,94 g, 65% rendimento). 'H-NMR; delta (CDC13) , 7,09 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,83 (2H, d, J = 8,4 Hz), 4,56 (1H, d, J = 6,0 Hz), 4,01 (2H, q, J = 7.0 Hz), 3,20-3,28 (1H, m), 2,64 (2H, t, J - 7,6 Hz), 1,98-2,08 (2H, m), 1,70-1,88 (2H, m), 1,62 (3H, s), 1,57 (3H, s) e 1,40 (3H, t, J = 7,0 Hz).

Passo G. 2R-[3-(4-Etoxi-fenil)-propil]-N,-[IS-(5-tiofen-2-il)-[1; 2,4]oxadiazol-3-il)-2,2-dimetil-propil]-[I* 3]dioxolan-4S-ona

Adicionou-se 2,2-dimetil-lS-(5-tiofen-2-il)- [l.í 2,4] oxadiazol-3-il)-propilamina (100 mg, 0,42 mmol, 1,4 eq.) a uma solução de éster de pentafluorofenilo de ácido 2R- (2,2-dimetil-5-oxo- [1.* 3] dioxolan-4S-il) -5- (4-etoxifenil)-pentanóico (150 mg, 0,30 mmol) em Ci&CXh (10 ml) . A mistura de reacção foi agitada durante 16 horas e o solvente foi removido sob vácuo. O produto bruto foi absorvido em AcOEt (70 ml) e lavado com água (10 ml), e depois com MágSSs (10 ml) e finalmente com salmoura (10 ml). O solvente foi seco com e removido sob pressão reduzida para originar a 2R-[3-(4-Etoxi-fenil)-propil]-Nl-[IS-(5-tiofen-2-il)-l.l.í 2,4] oxadiazol-3-il)-2,2-dimetil-propil]- [X, 3] dioxolan-4S-ona pretendida (82 mg, 33% produto bruto). 1H-NMR; delta (CDC13) , 7,88 (1 H, m), 7,62 (1 H, m) , 7,20 (1 H, m), 6,95 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,71 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,55 (1H, d, J = 9,7 Hz), 5,19 (1H, d, J = 9,7 Hz), 4,56 (1H, d, J = 6,4 Hz), 3,95 (2H, q, J = 7,0 Hz), 2,64 (3H, bm), 1,84 (2H, m), 1,70 (2H, m), 1,62 (3H, s), 1,54 (3H, s), I, 38 (3H, t, J = 6,9 Hz) e 1,02 (9H, s). LRMS: ião positivo 556,0 (M+H).

Passo H. 2R-[3-(4-Etoxi-fenil)propil]-Nl-[IS-(5-tiofen-2-il)-[X*2,4]oxadiazol-3-il)-2,2-dimetil-propil]-3S,N4-dihidroxi-succinamida

Adicionou-se uma solução aquosa de hidroxilamina (50%, 48 μΐ, 0,7 mmol, 5 eq.) a uma solução de 2R-[3-(4-Etoxi-fenil)-propil]-Nl-[IS-(5-tiofen-2-il)-[If 2,4]oxadiazol-3-il)-2,2- dimetilpropil]-[I*3]dioxolan-4S-ona (82 mg, 0,15 itimol) em i-PrOH (5 ml) . A mistura de reacção foi deixada a agitar a temperatura ambiente durante 16 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para originar um óleo que foi purificado por cromatografia de fase reversa preparativa para originar o produto pretendido (25,3 mg, 32%). 'H-NMR; delta (CH3OD) , 'H-NMR; delta (CSjQfD) * 7,86 (2H, m) , 7,25 (1H, dd, J = 3,8 Hz), 6,83 (2H, d, J = 8,6 Hz), 6,54 (2H, d, J = 8,6 Hz), 5,14 (1H, s), 4,03 (1H, d, J = 7,6 Hz), 3,87 (2H, q, J = 6,95 Hz), 2,88 (1H, m), 2,45 (2H, bm), 1,53 (4H, bm), 1,33 (3H, t, J = 7,0 Hz) e 1,06 (9H, s). LRMS: ião positivo 553,2 (M+Na); ião negativo 529,2 (M-H)

Os compostos dos Exemplos 4 a 17 foram preparados de acordo com o método do Exemplo 1, por síntese paralela, utilizando o cloreto ácido apropriado no Passo D. Os produtos foram purificados por HPLC preparativa.

Exemplo 4 Ácido 2S-hidroxi-3R-[IS-(5-isopropil-[1,2,4]oxadiazol-3-il)-

m

OH LRMS; ião positivo 407 (M+Na); ião negativo 383 (M-H)

Exemplo 5 Ácido 2S-hidroxi-3R-[1S —(5-furan-2-il-[1,2,4]oxadiazol-3

LRMS; ião positivo 431 (M+Na), ião negativo 407 (M-H). Exemplo 6 Ácido ™LLdi'Ox.X": .í.S'" ”CSC J.Dpíiíxi Ϊ.3. .í.e&SiΠ (13,4 ] oxadi&iol~-3~l lj -2;(, 2-di«lil-p-ropi Ica.sbÃ-m&i.l ] -5-« hexanohidroxâmico

LRMS; ião positivo 425 (M+H), ião negativo 423 (M-H).

Exemplo 7 Ácido 2 iiiáraxl vol; 22' v ; 3 E.~ 115 -d a ~t i-sp-ss -2- i lais t i I - .1--.11 } -d'.,, 1 ] hexanohidroxâmico

LRMS; ião positivo 461 (M+Na), ião negativo 437 (M-H). Exemplo 8 Ácido 2S-Hidroxi-3R-[IS-(5-etil-[1,2,4]oxadiazol-3-il)-2, 2- diBdtil-propi

LRMS; ião positivo 393 (M+Na), ião positivo 369 (M-H).

Exemplo 9

ião negativo 409 (M-H). LRMS; ião positivo 411 (M+H),

Exemplo 10

Acido 2S-hidroxi-3R-[IS-(5-benzil-[l,2,4]oxadiazol-3-il)- i I -ptõpi ica.rbHS:idl.i ] - bdSdtl 1

LRMS; ião positivo 433 (M+H), ião negativo 431 (M-H).

Exemplo 11 Ácido 2S-hidroxi-3R-[IS-(5-isobutil-[1,2,4]oxadiazol-3-il) - 2,

LRMS; ião positivo 421 (M+Na), ião negativo 397 (M-H).

Exemplo 12 Ácido 2S-hidroxi-3R-[IS-(5-tertbutil-[1,2,4]oxadiazol-3-il)-

LRMS; ião positivo 421 (M+Na), ião negativo 397 (M-H).

Exemplo 13 Ácido 2S-hidroxi-3R-[1S —(5-tiofen-2-il-[l, 2,4]oxadiazol-3-

LRMS; ião positivo 425 (M+H), ião negativo 423 (M-H).

Foi também preparado o diastereoisómero ácido 2R-hidroxi-3R-[ 1S — (5-tiofen-2-il-[-].* 2,4] oxadiazol-3-il) -2,2-dimetil-propilcarbamoil]-5-metil-hexanohidroxâmico

M+H = 425,1, M+Na = 447,1, M-H = 423,0.

Exemplo 14

Acido 2S-hidroxi-3R-[IS-(5-(2,2-dimetil-propil)- i 1 , .2 ·, 4 ] o xoi a x a 1 -- 3 - i. I f hexanohidroxâmico didxti i-pxapil xfcaxial 1 ] -xH:as

LRMS; ião positivo 435 (M+Na), ião negativo 411 (M-H).

Exemplo 15 Ácido 2S-hidroxi-3R-[IS-(5-p-tolil-[l,2,4]oxadiazol-3-il)

LRMS; ião positivo 433 (M+H), ião negativo 431 (M-H).

Exemplo 16

:pi 1 -- [ 1 r 1 >. 4 J a vadi axal --3-isetil---fea:sap-Dhidr<y.:€âmiPP Ácido /1 -1 -3 i; o :<·'. - 31 ·· [1S-- 1.15 ~5?

LRMS; ião positivo 405 (M+Na), ião negativo 381 (M-H).

Exemplo 17 Ácido 2S-hidroxi-3R-[IS-(5-metil-[1,2,4]oxadiazol-3-il)-2,2-

1H-NMR; delta SOfeC©)* 8,26 (1H, d, J = 9,4 Hz), 5,02 (1H, d, J = 9,5 Hz), 4,02 (1H, d, J = 6,4 Hz), 2,89 (1H, m), 2,57 (3H, s), 1,61 (1 H, m) , 1,44 (1H, m) , 1,22 (1H, m) , 1,00 (9H, s) delta (CH3OD) , 178,6, 176, 1, 171, 9, 170, 7, 73,5, 55,6, 49,5, 39,9, 36,2, 27,6, 26,6, 24,2, 22,7 e 12,4. LRMS; ião positivo 379 (M+Na), ião negativo 355 (M-H).

Os compostos dos Exemplos 18 a 19 foram preparados de acordo com o método do Exemplo 2, utilizando o nitrilo apropriado do Passo C e/ou o resíduo de aminoácido apropriado do Passo A:

Exemplo 18 Ácido 2S-hidroxi-3R-[IS-(3-isopropil-[1^2,4]oxadiazol-3-il)-

1H-NMR; delta (CH3OD) , 5,12 (1H, s), 3,98 (1H, d, J = 7,5 Hz), 3,06 (1H, m), 2,92 (1H, m) , 1,61 (1H, m) , 1,43 UJ.f m) , 1,31 (6H, d, J = 6,9 Hz), 1,14 (1H, m) , 1,03 (9H, s), 0,89 (3H, d, J = 6,7 Hz), 0,81 (3H, d, J = 6,8 Hz). 13C-NMR; delta (CH3OD) , 179,7, 176, 6, 176,5, 172,0, 73, 7, 56, 9, 49,2, 39,5, 36,5, 28,3, 27,3, 24,5, 22,3, 21,2 e 21,1, LRMS; ião positivo 385 (M+H), ião negativo 383 (M-H).

Exemplo 19

^-NMR; delta CCá/ÁH 8,05 (2H, m) , 7,52 (3H, m) , 5,14 (1 H, d, J = 7,2 Hz), 4,00 (1H, d, J = 7,7 Hz), 2,91 (1 H, m), 2,36 (1 H, m), 1,63 (1 H, m), 1,54 (1 H, m) , 1,16 (1 H, m) , I, 09 (3H, d, J = 6,8 Hz), 1,00 (3H, d, J = 6,8 Hz), 0,95 (3H, d, J = 6,3 Hz), 0,84 (3H, d, J = 6,3 Hz). delta (CH3OD), 181, 0, 176, 8, 172,0, 169, 9, 132,9, 130,5, 128,7, 128,4, 73,7, 54,3, 49,6, 39,5, 33,3, 27,2, 24,4, 22,5, 19,8 e 19,4. LRMS; ião positivo 427 (M+Na), ião negativo 403 (M-H).

Os compostos dos Exemplos 20 a 23 foram preparados de acordo com o método do Exemplo 2, utilizando o nitrilo apropriado do Passo C e/ou o residuo de aminoácido apropriado do Passo A. A sintese do succinato quiral apropriado do Passo E está descrita em pormenor na WO 94/21625.

Exemplo 20 Ácido ••ull 1···Á-íieti 1 -3/1- -1::-:- i3 ·“£«;: vi .;.··· í !>: 2,4] oxadiazol-5-il)-etilcarbamoil] -hexanohidroxâmico

1H-NMR; i delta íciy 9,13 (1H, d, J = = 8, 26 Hz) , 8, 05 (2H, m) , 7,55 (3H, m) , 7,25 (5H, m) , 5,66 (1H, m) , 5,45 (1H, m) , 4, 90 (2H, m), 4,50 (1H, s) 3,51 (1H, dd, J = 13 ,92, 4,84 Hz), 3,17 (1H, dd, J = 13,92, 10 ,90 Hz) , 2, ,50 (1H, m) , 2,0 (2H, m) , 1,50 (3H, m) , 1,0 (3H, d, J = 6,5 Hz) , 0, 96 (3H, d, J = 6, 6 Hz) . 13C-NMR; delta íCr v:‘ ^S Ν··· .! í- 181,0, 177,0, 172 ,7, 138, o, 136,5, 133, 130 , 8, 130,6, 130, 5, 130,1, 128,7, 128,7, 117, 7, 48,4 , 48 ,3, 42 ,1, 39,5, 36,2, 27 ,1, 24, 9 e 22, 0 . Exemplo 21 [!> 2,4]oxadiazol-5-il)-etilcarbamoil]-hexanohidroxâmico

1H-NMR; delta (DMSO), 10,28 (1H , S) , 8,64 (1H, d, J = 6,2 Hz), 8,64 (1H, br s) , 7,25 (5H, m) , 5 ,45 (2H, m) , 4 ,51 (1H, m), 4,30 (2H, m) , 3,15 (1H, m), 2,85 (2H, m), 2, 20 (1H, dt, J = 10,6, 3,12 Hz) , i, 70 (2H, m) , 1,25 (6H, d, J = 6 ,91 Hz) , 0,70 (1H, m) , 0,52 (3H , d, J = 6 ,4 Hz) , 0,48 (3H, d, J = = 6,4

Hz) . "Ç-^MT-í; delta (MEOD), 179, 0, 175, 6, 175,5, 171,3, 136, 6, 135,0, 129,2, 128,6, 127,3, 116,4, 48,7, 46,9, 40,6, 38,1, 34,8, 26,9, 25,6, 23,5, 20,7 e 19,9.

Exemplo 22

Acido í d-PMti 1™ ΐ1,2,4]oxadiazol-5-il)-etilcarbamoil]-hexanohidroxâmico

1H-NMR; delta (CH3OD) , 8,98 (1H, d, J = 8,41 Hz), 7,27 (5H, m) , 5 ,51 (2H, m) , 4,85 (2H, m) , 3, ,41 (1H, dd, J = O i—1 O LO Hz) , 3,14 (1 H, dd, J = 14,0, 10, 97 Hz), 2, 47 (1H( , dt, J = O \—1 \—1 3,25 Hz), 2,16 (3H, s), 2,00 (1H, dt, J = 11 ,40, 3,30 Hz) , 1,80 (1H, m), 1,15 (1H, : m) , 0,98 (3H, d, k J = 6, 6 Hz) , 0, 92 (3H, d, J = 6,6 Hz) • 13C-NMR; delta d;dÁ;0'Pi í 172, 62, 168,27, 133, 59, 132 ,07, 126,34, 125,66, 124,28, 113,36 , 45 o OÁ T-1 , 43 ,95 37 r —, ' r 61, LO \—1 LO cn , 31 ,75, 22 ,72, 20, 44, 17 ,59 e 7,36.

Exemplo 23 Ácido 2S-alil-3R-[2,2-dimetil-lS-(3-metil-:;,2,4]oxadiazol-5-il)-propilcarbamoil]-5-metil-hexanohidroxâmico ΊΗ-ΝΜϊΙ; delta ÍÁBM f 8, ,81 (1H, d, J = 8,59 Hz), 7, 65 (1H, m) , 5,70 d H, m) , 5, 15 (1H, d, J = 8,62 Hz), 4,95 (2H, m) , 2,60 (1H , dt, J = 11 ,10 , 3, 16 Hz), 2,39 (3H, s), 1,38 (1H, dt, J = 13,10 , 3, 33 Hz) , 1, t 31 (1H, m) , 0,98 (1H, m), 0, 98 (9H, s), 0, 86 (3H, d, J = 6, 6 Hz), 0 ,84 (3H, d, J = = 6,6 Hz) . 0 composto do Exemplo 24 foi preparado de acordo com o método do Exemplo 2. A síntese do succinato quiral apropriado do Passo E está descrita em pormenor na WO 95/19956.

Exemplo 24 Ácido 3R- [2,2-dimetil-lS-(3-fenil-[1,2,4]oxadiazol-5-il) -propilcarbamoil]-5-metil-hexanohidroxâmico

LRMS; ião positivo 403,5 (M+H), ião negativo 401,3 (M-H). O composto do Exemplo 25 foi preparado de acordo com o Exemplo 2, utilizando o nitrilo apropriado no Passo C e/ou o resíduo de aminoácido apropriado no Passo A. A síntese do succinato quiral apropriado no Passo E está descrita em pormenor na WO 97/02239.

Exemplo 25 Ácido coaí - ϊ·'··*ίνηΐ [ IS···( í-^eíl!·· | I t Zt 41 ò&ádtasid il)-2-fenil-etilcarbamoil]-hexanohidroxâmico

1H-NMR; delta íClijODi, 7,14 (5H, m) , 5,34 (1H, m) , 3,38 (1 H, d, J = 9,68 Hz), 3,20 (2H, m) , 3,02 (3H, s), 2,65 (1H, m), 2,22 (3H, s), 1,35 (2H, m), 0,90 (1H, m), 0,73 (3H, d, j = 6,55 Hz) e 0,70 (3H, d, J = 6,57 Hz).

Os compostos dos Exemplos 26 e 27 foram preparados de acordo com o método do Exemplo 2. A síntese do succinato quiral apropriado no Passo E está descrita em pormenor na WO 92/13831, utilizando métodos análogos aqueles descritos na WO 95/32944.

Exemplo 26 Ácido 3R-[2,2-dimetil-lS-(3-fenil-[1>2,4]oxadiazol-5-il)-propilcarbamoil]-heptadecanóico

1H-NMR; delta íCIÍ;íOD)> 8,05 (2H, m) , 7,49 (3H, m) , 5,22 s), 2,93 (1H, m), 2,65 (1H, dd, J = 9,8, 16,7 Hz), 2,38 (1H, dd, J = 4,6, 16,6 Hz), 1,52 (1H, m) , 1,43 (1H, m) , 1,26 (24H, m), 1,10 (9H, s) e 0,89 (3H, m). LRMS; ião positivo 528,4 (M+H).

Exemplo 27 Ácido 3R-[2,2-dimetil-lS-(3-fenil-[X#2,4]oxadiazol-5-il)-propilcarbamoil]-nonadecanóico

LRMS; ião positivo 556,2 (M+H). 0 composto do Exemplo 28 foi preparado de acordo com 0 método do Exemplo 1. A síntese do succinato quiral apropriado no Passo H está descrita em pormenor na WO 92/13831, utilizando métodos análogos aqueles descritos na WO 95/32944.

Exemplo 28

Acido v··· ϊ-^Β'Β·"iBf [1., 2,4] oxadiazol-3-il)-propilcarbamoil] -hexanóico

1H-NMR; delta {ÇIsOBI, 8,07 (2H, m), 7,61 (3H, m), 6,93 (4H, m), 5,15 (1 H, s), 2,94 (1H, m), 2,5 (4H, m), 1,5 (4H, m) e 1,07 (9H, s) . delta (CtROD), 178,0, 177, 1, 142,6, 134,6, 132,7, 131,0, 130,8, 129,5, 129,4, 125,7, 55,7, 43,8, 39,0, 36,3, 36,1, 34,1, 30,3 e 27,4. LRMS; ião positivo 506,2 (M+Na), ião negativo 482,4 (M-H).

Também foi preparado o diastereoisómero ácido 6-(4-cloro-fenil)-3R- [2 t(5-fenil- [1*2,4] oxadiazol-3-il)-propilcarbamoil]-hexanóico

M+H = 485, M+Na = 507,2, M-H = 482,6.

Os compostos dos Exemplos 29 e 30 foram preparados de acordo com o método do Exemplo 1.

Exemplo 29 Ácido 33- [2* tC'v-tÍbfvb'vÁ"\lX vd'l,·. 3* 4

XH-NMR; delta (CH3OD), 7,95 (1 H, m) , 7,87 d, j = 5,0 Hz), 7,28 (1H, m) , 5,15 (1H, s) , 4, 18 (2H, d, j = 6, 4 Hz) , 2,94 (1H, m) , 1 , 68 (1H, m) , 1, 48 (1H , m), 1, 31 fld. m), 1,0b (9H, s) , 00 00 o (3H, d, J = 6, 4 Hz) e 0,82 (3H, d, J = = 6,5 Hz) . LRMS; ião negativo 408,2 (M -H) Exemplo 30 Ácido 3R- [1S — (5 -furan-2- il- [1, 2, 4]oxadiazol- -3-il)-2, .2- 11“ arba aaôll 1 '·> --V. R, dr OKI™

1H-NMR; delta (CH3OD), 7,88 (1H, s), 7.45 (1H, 3,6Hz) , 6,74 (1H, m) , 5,15 (1H, s), 4,18 (2H, d,

d, J

J J = 6, 4

Hz), 2,91 (1H, m) , 1,65 (1H, m) , 1,50 (1H, m) , 1,31 Γ1Η, m) , 1,06 (9H, s), 0,88 (3H, d, J = 6,4 Hz) e 0,82 (3H, d, J = 6,5 Hz). LRMS; ião negativo 392,2 (M-H).

Os compostos dos Exemplos 31 e 32 foram preparados de acordo com o método do Exemplo 2. A sintese do succinato quiral apropriado no Passo E está descrita em pormenor na WO 94/02446, utilizando o brometo de cinamilo apropriado ou iodeto de ciclopentilmetilo ao invés de iodeto de metalilo como descrito na supracitada patente.

Exemplo 31

Is-" [2:, 2'“âÍA;M:Ml -S ξ S-1-íd xl- 4 j ! “ptopl i] ·· :X& :f X: :V.'H ~ : Í'" l.p : : i. "Ai. X i. í " X: X\': :ΧΧΧ:·’;:..;;;ΧΧ

1H-NMR; delta íCB:j01íh· 7,95 (2H, d, J = 7,2 Hz), 7,53 i lli* m) , 7,48 (2H, m) , 7,09 (2H, d, J = 6,4 Hz), 6,91 (3H, m) , 6,31 (1H, d, J = 15,8 Hz), 6,04 (1H, m) , 5,26 ílib s) , 4,14 (1H, d, J = 7,6 Hz), 3,02 (1H, m) , 2,46 (1H, m) , 2,37 Qib m) e 1,07 (9H, s). 13C-NMR; delta (CH3OD) , 179, 8, 175, 9, 172,0, 169, 6, 138,8, 134,0, 132,8, 130,4, 129,7, 128,9, 128,4, 128,4, 127,3, 73,2, 56,5, 51,3, 36,8 e 34,0. LRMS; ião positivo 501,2 (M+Na), Ião negativo 477,4 (M-H).

Exemplo 32 2 E- g ig Igpgg ti· -l;gg t i i - 3SM 2 ~á 21 idr 0¾ i " «1, - í ! -2 - p ~ 1 s opt 0fò i 1 -1,-1,< 2 jggadiaggl-g·'-!!:?.S-diSiètil-pro-p.il j -gggcdagssfda.

1H-NMR; delta (CH3OD) , 5,13 (1H, s), 3,99 (1H, d, J = 7,7

Hz), 3,06 (1H, m), 2,87 (1H, m), 1,83 (1H, m), 1,72 (1H, m), 1, 63-1,39 (6H, bm), 1,31 (6H, d, J = 6,9 Hz), 1,27 (1H, m) , 1,03 (9H, s) e 1,02 (2H, m) . 13C-NMR; delta CoBsOD:?, 179,6, 176, 6, 176,5, 172,0, 73,2, 56,8, 50,8, 39,6, 36,7, 36,5, 34,7, 33,6, 28,3, 27,2, 26,5 e 21,2. LRMS; ião positivo 411,2 (M+H), ião negativo 409,6 (M-H).

Os compostos dos Exemplos 33 a 35 foram preparados de acordo com o método do Exemplo 3, utilizando o brometo de arilo apropriado no Passo B.

Exemplo 33 B“ P, Igsrsset Xl-tíi til) 'SiDsplIi “Bi" dP .1 sst X3 * 13 ^ t 1 v 1 ss .« 2 “· .1X“ [ .1 j 11 ] oss ú .1 a t ο 1. “ 3 “ X ! 3idxssi“ S oCCÍdâmdd

(1H, m) , (3H, 1H-NMR; delta dodOIÍ} « 8,38 (1H, d, J = 9,4 Hz), 7,86 s), 7,75 (3H, bs), 7,4 (1H, d, J = 3,5 Hz), 6,7 (1H, 5,12 (1H, d, J = 9,4 Hz), 4,26 (1H, d, J = 4,D Bs?* 2,8 bm), 1,8 (4H, bm) e 1,0 (9H, s). LRMS; ião positivo 623,2 (M+H), ião negativo 621,0 (M-H) Exemplo 34 ,N„- 2R-[3-(3,5-bis-trifluorometil-fenil)-propil]-Ni- [ 1S — (5-furan-2-il-[lf2,4]oxadiazol-3-il)-2,2-dimetil-propil]-3S dihidroxi-succinamida

iH-NMR; delta (CH3OD) , 8,38 (1H, d, J = 9,4 Hz), 7,86 (1H, s), 7,75 (3H, bs), 7,4 (1H, d, J = 3,5 Hz), 6,7 (1H, m) , 5,12 (1H, d, J = 9,4 Hz), 4,26 (1H, d, J = 4,0 Hz), 2,8 (3H, bm), 1,8 (4H, bm) e 1,0 (9H, s). LRMS; ião positivo 629,4 (M+Na), ião negativo 605,4 (M-H). Exemplo 35 2R-[3-(4-etoxi-fenil)-propil]-Νχ-[IS-(5-furan-2-il- | l.í 2,4] oxadiazol-3-il)-2,2-dimetil-propil] -3S,N4-dihidroxi- succinamida

iH-NMR; delta (CH3OD), 7,86 (2H, m), 7,25 (1H, dd, J = 3,8Hz), 6,83 (2H, d, J = 8,6 Hz), 6,54 (2H, d, J = 8,6 Hz) , 5,14 (1Η, s), 4,03 (1H, d, J = 7,6 Hz), 3,87 (2H, q, J = 6,96, 14,0 Hz), 2,88 (1H, m), 2,45 (2H, bm), 1,53 (4H, bm), 1,33 (3H, t, J = 7,0 Hz) e 1,06 (9H, s). LRMS; ião positivo 515,2 (M+H), ião negativo 513,2 (M-H). O composto do Exemplo 36 foi preparado de acordo com o método do Exemplo 2. A síntese do succinato quiral apropriado no Passo E está descrito em pormenor na WO 01/10834.

Exemplo 36 3-Ciclopentil-N-[2,2-dimetil-lS-(3-fenil-[1,2,4]oxadiazol-5-il) -propil] -2R- [ (formil-hidroxi-amino)-metil] -propionamida

ΧΗ- -NMR ; delta (f mmy* < 3,26 (03 H, s) , 8,05 (2H, d, J = 6,9 Hz ), 7 ,84 (0,7H, - s), 7, 52 (3H, m), 5, 20 (1 H , m) , 3 ,75 (1H, m) , 3, 63 (0,3H, dd, J = = 13, 9, 5,5 Hz ), 3,43 (0, 7H, dd, J = 14 ,2, 4,6 Hz), 3,18 (0 ,7H, m) , 3, 00 (0,3H, m), 1,92 (1 H, m) , 1, 47 (8H, m) , 1,10 (3H, s), 1, 08 (6H, s) e 0, 98 (2H, m) . tí delta (CH30D) , 179, 9, 176 ,9, 176,6, 169,3, , 163,8, 159,2, 132,5, 130,0, 129,6, 128,9, 128,3, 127,9, 56,8, 56,7, 53,9, 50,3, 44,8, 44,6, 39,1, 38,9, 37,9, 37,7, 35,9, 35,8, 34,1, 33,4, 33,3, 26,9, 26,1 e 25,9. LRMS; ião positivo 451 (M+Na), ião 427 (M-H). O composto do Exemplo 37 foi preparado de acordo com o Exemplo 1. A sintese do succinato quiral apropriado no Passo E está descrita em pormenor na WO 01/10834.

Exemplo 37 3-Ciclopentil-N-[2,2-dimetil-lS-(5-fenil-p.,2,4]oxadiazol-3-il)-propil]-2R-[(formil-hidroxi-amino)-metil]propionamida

NMR; delta y 8, 49 (0 ,6H, d, J = r-' 00 Hz), 8, 37 (0, 4H , d , o 8,1 Hz 8, 28 (0 ,4H, s), r 8, 14 (2H , m), 7, .85 (0, 6H , s ), 7,65 ( 1H, m) f 7,59 (2H, m), 4, 81 (1H, r s), 3, 79 (1H, m), 3, . 63 (0, r 4H , m; ) , 3,43 (0, 6H, m) , 3 ,13 (0,6H, m) , 2, 97 (0, 4H, m) , i ,55 (9H, m) , 1 .,08 (3H , s) r 1,07 (6H, s) e 1,04 (2H , m ) 13C, -NMR; delta -í 17 6,6, 171, 6, 164, 2, 159 ,7, 134, ,6, 132,8 , 130,í 3, 130, 3, 129 ,4 , 125, 7, < 59,5, , 56 ,0, . 54, 3, 50 ,8, 45, 4, 45 ,3, 40 ,6, 39, 5, 38,3, 38,2, 35, 9, 34, 5, 33,8, 33, 7, 32, 0, 27 ,5, 26, , 4 e 26 ,3. LRMS; ião positivo 429 (M+H).

Resultados Biolóaicos A. Ensaios de Inibição Enzimática

Os compostos da invenção foram testados para determinar as suas actividades como inibidores de MMP9 e MMP12.

Protocolo de Ensaio de MMP9

Os compostos foram testados quanto a sua actividade inibitória contra a gelatinase (MMP9) de 92kDa num ensaio utilizando um substrato de péptido marcado com cumarina ((7-«[ t jí I c tmii κ .1c- 4 “ % I $ d c a ti. 1 «f to™ 1¾¾ -011. -ia? u- (3 -13 :í 4 -dinitrofenil]-L-2,3-diaminopropionil-Ala-Arg-NH2 (McaPLGLDpaAR) (Knight et al., FEBS Lett., 1992, 263-266).

As soluções-mãe foram constituídas da seguinte maneira:

Tampão de ensaio: 100 mM de Tris-HCl a pH 7,6 contendo 100 mM de NaCl, lOmM de CaCl2 e 0,05% de Brij 35.

Substrato: 0,4 mM de McaPLGLDpaAR (de Bachem) (0,437 mg/ml) solução-mãe 100% de DMSO (armazenado a -20 °C). Diluir para 8 μΜ no tampão de ensaio.

Enzima: Gelatinase humana recombinante de 92kDa (MMP-9; ΑΡΜΑ (acetato mercúrico de 4-aminofenilo)-activado se necessário) convenientemente diluída no tampão de ensaio.

Os compostos de teste foram preparados inicialmente como uma solução de composto de 10 mM em DMSO a 100%, diluídos para 1 mM em DMSO a 100%, e depois diluídos em série três vezes em DMSO a 100% ao longo das colunas 1 a 10 de uma placa de microtitulação de 96 poços. Intervalo de concentração de ensaio: 100 μΜ (coluna 1) a 5,1 nM (coluna 10). O ensaio foi levado a cabo num volume total de 100 μΐ por poço em placas de microtitulação de 96 poços. Adicionou-se enzima activada (20 μΐ) aos poços e depois 20 μΐ de tampão de ensaio. Foram depois adicionadas concentrações apropriadas dos compostos de teste dissolvidos em 10 μΐ de DMSO e depois 50 μΐ de McaPLGLDpaAR (8 μΜ, preparados por diluição do DMSO-mãe no tampão de ensaio). Para casa ensaio, foram analisadas em duplicado dez concentrações do composto de teste. Os poços de controlo não têm nenhuma enzima ou composto de teste. As reacções foram incubadas a 37 °C durante 2 horas. A fluorescência a 405 nM foi medida imediatamente com um fluorómetro SLT Fluostar (SLT Labinstruments GmbH, Grodig, Áustria), utilizando uma excitação de 320 nM, sem parar a reacção. O efeito do composto de teste foi determinado a partir da curva de dose-resposta gerada pelas 10 concentrações duplicadas do inibidor. A l€*s (a concentração do composto necessária para originar uma redução de 50% na actividade enzimática) foi obtida preenchendo os dados da equação, Y = a + ((b - a) / (1 + ) . (Y - inibição alcançada para uma dose em particular; X = a dose em nM; a = y minimo ou zero % de inibição; b = y máximo ou 100% de inibição; c = d = declive.) O resultado foi arredondado até um número significativo.

Protocolo de Ensaio MMP12

Os compostos foram testados quanto a sua actividade inibitória contra a metaloelastase (MMP12) num ensaio utilizando um substrato de péptido marcado com cumarina, {Ί- l2rA~ dinitrofenil]-L-2,3-diaminopropionil)-Ala-Arg-NH2 (McaPLGLDpaAR) (Knight et al., FEBS Lett., 1992; 263-266). 0 protocolo para este ensaio foi o descrito para o ensaio de MMP9 anterior.

Protocolo de Ensaio MMP1

Os compostos foram testados quanto a sua actividade inibitória contra a colagenase (MMP1) num ensaio utilizando um substrato de péptido marcadi com cumarina, (7-m4:::hoxic;uo.àrir;··· 1} tiI-Ps o·· v - U:u··. 5 3- [ B f *·· dinitrofenil]-L-2,3-diaminopropionil)-Ala-Arg-NH2 (McaPLGLDpaAR) (Knight et al., FEBS Lett., 1992; 263-266). O protocolo para este ensaio foi o descrito para o anterior ensaio de MMP9.

Resultados:

Chave dos dados biológicos

Intervalo 74

Número do Exemplo MMP9 IC50 (nM) MMP12 IC50 (nM) MMP1 IC50 (nM) 1 B A B 2 B A B 3 A A D 4 B A B 5 B A B 6 C A B 7 C B C 8 B A B 9 C A B 10 C A C 11 C A C 12 B A B 13 B A B 14 C A C 15 B A B 16 B A B 17 C A B 18 B A B 19 B A B 20 A A B 21 A A B 22 Não testado Não testado A 23 A A B 24 C A C 25 B A B 26 D D Não testado 27 D D Não testado 28 Não testado D Não testado 29 C B C

Estes resultados mostram que, em geral, os compostos testados foram activos como inibidores de MMP12, com certos exemplos que mostram a inibição selectiva quer na MMP-9 quer na MMP-12 em relação a MMP-1. B. Modelo de fibrose hepática induzida por CCI4 0 tetracloreto de carbono (021·*) induz fibrose hepática quando administrada intraperitonealmente (Bulbena 0., Culat, J., Bravo, M.L., Inflammation, Out. 1997; 21 (5):475-88). Os compostos da invenção podem ser avaliados quando a sua capacidade de evitar a formação de tecido fibrótico induzida por CCI4.

Animais

Ratos macho Sprague-Dawley, com 7 semanas de idade, peso de aproximadamente 300 g de Charles River/Iffa-Crédo,

St. Germain/l-Arbresle, França.

Os ratos foram aclimatados durante 5 dias antes de começar as experiências, em quartos com ar condicionado, dois animais por jaula. Temperatura: 22 °C I 2. Humidade relativa: 55% I 10. Luz: ciclo de 12 horas (0 7h0 0 até 19h00) . Gaiola: gaiola Makrolon® 42,5 x 26, 6 x 15 cada uma equipada com uma tampa de grades paralelas de aço inoxidável. 0 estudo envolveu os seguintes grupos, de oito animais cada, como se indica abaixo.

Grupo 1: Os animais de simulação receberam o excipiente de CCI4 (i.p.) e, uma vez por dia, o excipiente da substância de teste (s.c.) ;

Grupo 2: 0 grupo de controlo positivo recebeu CCI4 (i.p.), e, uma vez por dia, o excipiente da substância de teste (s.c.);

Grupo 3: 0 grupo experimental recebeu CCI4 (i.p.) e, uma vez por dia, 2 mg/kg s.c. do composto do Exemplo 13.

Grupo 4: 0 grupo experimental recebeu CCI4 (i.p.) e, uma vez por dia, 10 mg/kg s.c. do composto do Exemplo 13.

Grupo 5: O grupo experimental recebeu CCI4 (i.p.) e, uma vez por dia, 20 mg/kg s.c. do composto do Exemplo 13.

Os ratos foram marcados nas caudas. As marcas foram verificas e renovadas, quando necessário, depois de cada injecção de CCI.5.

Procedimento

Administrou-se CCI4 (Prolabo) em azeite a cada três dias, durante três semanas, por injecção intraperitoneal (0,25 ml de OOií/kg de peso corporal, diluído em óleo 1:1 volrvol para um volume total de 0,5 ml/kg). Os animais foram pesados diariamente. Se o peso corporal diminuísse mais de 10% do peso inicial, o animal era excluído do estudo.

Os excipientes e o composto foram utilizados da seguinte maneira: • 0 CCI4 foi administrado em azeite (Prolabo) a uma diluição de 1:1; • 0 composto do Exemplo 13 foi suspenso em Tween-80 a 0,25% e carboximetilcelulose a 0,25% em NaCl a 0,9% esterilizado. A solução foi mantida a 4 °C durante a experiência e utilizada diariamente para preparar as suspensões. 0 composto do Exemplo 13 foi administrado diariamente por injecção subcutânea com um volume de administração de 5 ml/kg. Os Grupos 1 e 2 foram administrados s.c. com 5 ml/kg de excipiente. Utilizaram-se soluções preparadas de fresco em cada dia da experiência. As administrações foram levadas a cabo a mesma hora todos os dias. 0 tratamento dos grupos deste estudo foi iniciado para cada animal ao mesmo tempo da primeira administração de CCI4 e foi continuado durante 21 dias consecutivos. A última administração da substância de teste ou excipiente foi feita um dia antes do sacrifício dos animais.

Resultados A morte foi registada em 16 animais. Os dados e a causa suposta estão apresentados na Tabela 1. Níveis de enzima no soro

Os animais foram mortos 21 dias depois da primeira administração de CCI4 por inalação de isofurano. 0 sangue foi retirado individualmente na altura do sacrificio, isto é, um dia depois da última administração da substância de teste ou excipiente. 0 sangue foi centrifugado a 4 °C. 0 plasma foi cuidadosamente recolhido e dividido em três fracções. Mediram-se os niveis plasmáticas de aspartato aminotransferase (AST) e de alanina aminotransferase (ALT) para determinar necrose hepática. Os niveis aumentados de AST e ALT estão relacionados com a disfunção hepática. Os niveis médios de AST e ALT para animais de controlo e os tratados com o composto do Exemplo 13 em três dosagens diferentes estão apresentados na Figura 1 (eixo Y representa as unidades de actividade enzimática por litro de sangue, IU/L). 0 tratamento subcutâneo com o composto do Exemplo 13 diminui claramente os niveis de AST e ALT comparado com animais tratados com excipiente. Isto demonstra que o composto do Exemplo 13 tem um efeito protector no figado.

Avaliação histológica da fibrose hepática A fibrose hepática foi determinada medindo a área de fibrose no figado utilizando a microtomia. Os resultados são apresentados como a percentagem da área que estava fibrótica. O figado foi removido, os três lobos foram dissecados e retiraram-se amostras que foram ou fixadas em 10% de formaldeído ou congeladas a -80 °C.

As secções de fígado foram embebidas em blocos de parafina. Fizeram-se os cortes histológicos e corou-se com vermelho Sirius. A quantificação da fibrose no fígado foi levada a cabo num mínimo de três secções tiradas de diferentes localizações no fígado. A análise quantitativa foi levada a cabo utilizando um analisador de imagem (imstar) e o software Morphostar.

Calcularam-se as percentagens médias de área de fibrose nos fígados dos animais nos diferentes grupos, e os resultados são os apresentados na Figura 2. B. Recrutamento peritoneal de lin£ócitos induzido por IL2 A administração de IL2 intraperitonealmente causa a migração de linfócitos para a cavidade intraperitoneal. Isto Θ um modelo para a migração que ocorre durante a inflamação.

Os compostos da invenção inibem o recrutamento de linfócitos induzido por IL2.

Protocolo

Injectaram-se intraperitonealmente ratinhos C3H/HEN (Elevage Janvier, França) com IL2 (Serono Pharmaceutical Research Institute, 20 pg/kg, em soro fisiológico).

Os compostos da invenção foram suspensos em carboximetilcelulose (CMC) a 0,5%/tween-20 a 0,25% e foram administrados por via s.c. ou p.o. (10 ml/kg) 15 minutos antes da administração de IL2.

Vinte e quatro horas depois da administração de IL2, recolheram-se glóbulos brancas peritoneais por 3 lavagens sucessivas da cavidade peritoneal com 5 ml de soro fisológico tamponado com fosfato (PBS)-l mM de EDTA (+4 °C). A suspensão foi centrifugada (1700 G x 10 minutos a +4 °C). O pellet resultante foi suspenso em 1 ml de PBS-1 mM de EDTA.

Os linfócitos foram identificados e contados utilizando um contador Beckman/Coulter.

Design Experimental

Os animais foram divididos em 5 grupos (6 ratinhos por grupo):

Grupo 1: (base de referência) recebeu CMC a 0,5%/tween-20 a 0,25% (excipiente do composto da invenção) e soro fisiológico (excipiente de IL2);

Grupo 2: (controlo IL2) recebeu CMC a 0,5%/tween-20 a 0,25% e injecção de IL2;

Grupo 3: Grupo experimental (Composto da invenção Dose 1) que recebeu um composto da invenção e injecção de IL2;

Grupo 4: Grupo experimental (Composto da invenção Dose 2) que recebeu um composto da invenção e injecção de IL2;

Grupo 5: Grupo experimental (Composto da invenção Dose 3) que recebeu um composto da invenção e injecção de IL2;

Grupo 6: Grupo de referência que recebeu o composto de referência dexametasona e injecção de IL2. Cálculo A inibição de recrutamento de linfócitos foi calculada como se segue: % inibição = 1 - (LvX - Lvlí x 100% (Ly2 - Lyl)

Em que Lyl = Número de linfócitos no Grupo 1 (Ε3/μ1), Ly2 = Número de linfócitos no Grupo 2 (Ε3/μ1), LyX = Número de linfócitos no Grupo X (3-5) (Ε3/μ1). A dose do composto da invenção necessária para inibir o recrutamento de linfócitos em 5 0% foi calculada utilizando um ajustamento de curva. Os resultados estão apresentados na Tabela 1.

Tabela 1: liDs-a para inibição do recrutamento peritoneal de linfócitos induzido por IL2 por compostos da invenção

Exemplo Intervalo de dosagem ou dosagens (mg/kg) Via IDso (ng/kg) dexametasona 0,1-1 Subcutânea 0,05 Exemplo 13 0,03, 0,3, 3, 30 Subcutânea 0,1 Exemplo 13 0,3, 3, 30 Oral 1 Exemplo 5 0,3, 1, 3, 10, 30 Subcutânea 1

Lisboa, 13/07/2007

Claims (1)

1. BSIVIMSIÒèÇÔES 1. Um composto da fórmula (IA ou IB))

   em que W representa H0(c=0)-, H0NH(C=0)- ou H(C=0)N(OH)- ; X representa -0- ou -S-; Ri representa hidrogénio; -OH ou -SH; fluoro ou cloro; -CF3; alquilo (Clc-Ct) ; alcóxi ; alcenilo ) ; fenilo ou fenilo substituído; fenilalquilo (Ci-Cê) ou fenilalquiloíCi^Cíú substituído; fenilalcenilo (C2-C6) ou heterociclilo de fenilalcenilo (Ci^Cy substituído ou heterociclilo substituído; heterociclilalquilo (Ci-Cg) ou heterociclilalquilo (CH-Crí substituído; um grupo BSOnA- em que néO, lou2eBé hidrogénio ou um alquilo íGiwC^} .>· fenilo, fenilo substituído, heterociclilo, heterociclilo substituído, acilo i grupo fenacilo ou fenacilo substituído, e A representa alquileno í£: ; ou dialquilamino alquilamino(CV'Míí alquilo , -NH2, alquilamino ( aminoalquilo , dialquilamino(C'í,“Cs,5 alquilo (Cr^Cvé , hidroxialquilo (Cr"C;::·) 5 mercaptoalquilo ÍCiKqd ou carboxialquilo íCjKÃ?) em que os grupos amino, hidróxi, mercapto ou carboxilo são opcionalmente protegidos ou o grupo carboxilo amidado; ou um anel cicloalquilo, cicloalcenilo ou heterocíclico não aromático contendo até 3 heteroátomos, podendo qualquer um dos quais ser (i) substituído por um ou mais substituintes seleccionados de entre alquilo alcenilo Cí-Clu halo, ciano (-CN) , -C02H, -C02R, -C0NH2, -CONHR, -C0N(R)2, -OH, -0R, oxo-, -SH, -SR, -NHCOR, e -NHC02R, em que R é alquilo Clou benzilo e/ou (ii) fundidos a um anel cicloalquilo ou heterocíclico; R2 representa um grupo Rio- (X) n-(ALK) m- em que Rio representa hidrogénio, ou alquilo Cx-C», alcenilo Cr-Cs, alcinilo Cg-δ'»* cicloalquilo, arilo, ou um grupo heterociclilo, qualquer um dos quais podendo ser não substituído ou substituído por alquilo * alcóxi (Ci~ Ci2), hidróxi, mercapto, alquiltio , amino, halo (incluindo fluoro, cloro, bromo e iodo), trifluorometilo, ciano, nitro, oxo, -COOH, -C0NH2, - -8¾¾% ou em que RA e RB são independentemente um grupo alquilo (C; -0) e ALK representa um radical divalente linear ou ramificado alquileno C· -Cs* alcenileno C2-C6 ou alcinileno Cv-Ccí e podem ser interrompidos por uma ou mais ligações não adjacentes -NH-, -0- ou -S-,