PT1414310E - Método para a preparação de fracções ricas em gliadina e glutenina a partir do glúten num meio aquoso e na presença de um ácido - Google Patents

Description

ΡΕ1414310 1 DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA A PREPARAÇAO DE FRACÇOES RICAS EM GLIADINA E GLUTENINA A PARTIR DO GLÚTEN NUM MEIO AQUOSO E NA PRESENÇA DE UM ÁCIDO" 0 presente invento relaciona-se com um método melhorado para a preparação de fracções ricas em gliadina e glutenina a partir do glúten num meio aguoso e na presença de um ácido.

Na literatura científica e de patentes já foram descritos vários métodos para a separação de glúten do trigo em fracções ricas em gliadina e glutenina. Também o uso destas fracções já foi o assunto de um número de publicações científicas e patentes.

Numa escala laboratorial, foram estudadas muitas técnicas usando diferentes solventes e outras condições para separar as duas fracções. No livro "Protéines végétales" (1985), p.161-210, Popineau relatou uma revisão detalhada destas técnicas mas, na maior parte dos casos, estas técnicas não podem ser extrapoladas para uma escala industrial porque geralmente usam solventes que não são permitidos em preparações alimentares e incluem um passo tal como cromatografia preparativa a qual, embora adequada 2 ΡΕ1414310 para utilização farmacêutica, é muito cara para ser usada na indústria alimentar.

Dentre os solventes permitidos para usar na preparação de componentes alimentares, foram testadas misturas água-álcool e soluções de ácido acético numa escala laboratorial pela sua capacidade de separação de fracções de proteínas.

Na EP 685 164, é descrito um método de extracção pelo qual é usada uma solução aquosa de etanol tendo uma concentração de 30 a 70% em volume, uma solução aquosa de álcool isopropílico ou n-propanol tendo uma concentração de 10 a 20% em volume, ou uma solução aquosa de acetona tendo uma concentração de 20 a 50% em volume para preparar uma fracção tendo uma concentração de gliadina tão elevada como 80% ou mais. A extracção pode ser realizada por meio de uma solução aquosa ácida de etanol tendo uma concentração de 5 a 30% em volume e um pH de 3,5 a 5,5 também, para dar uma fracção de gliadina tendo uma concentração de 50% ou mais. Dentre os ácidos que podem ser usados pertencem os ácidos acético, cítrico, málico, láctico, adípico, fumárico, tartárico, glucónico, fosfórico e fítico.

Porque o uso de solventes inflamáveis requer algumas medidas de segurança adicionais, considera-se vantajoso ter um processo onde tais solventes não sejam necessários. 3 ΡΕ1414310

Tal processo está descrito em "Industries Alimentaires et Agricoles" (1974) por C. De Meester, em que soluções de ácido acético 0,01-0,1 M são usadas para extrair proteínas a partir de glúten de trigo vital. Após um periodo de extracção variando de 1 até 8 horas, os rendimentos finais são de 20-55%. A fracção solúvel, a que é rica em gliadina, foi recuperada por precipitação a pH neutro. Porque as gliadinas insolúveis são muito pegajosas, tal técnica não é muito adequada para aplicação industrial e o passo de precipitação da proteína deve ser evitado no processo de recuperação. Este método foi elaborado na escala laboratorial, mas não é praticável em escala industrial.

Um outro processo livre de solvente está descrito em WO 9710260. Esta aplicação descreve um método para fraccionar o glúten do trigo. De acordo com este método, o glúten do trigo é primeiro disperso num meio aquoso ácido a um primeiro pH ácido na presença de um agente redutor, para reduzir as pontes disulfureto na proteína do glúten. Depois o pH da dispersão é aumentado para um segundo nível acima do primeiro pH, causando a precipitação da glutenina enquanto a gliadina fica suspensa na dispersão e finalmente a glutenina e gliadina são separadas nas respectivas fracções.

Também a EP 992 193 refere-se a um método de extracção aquoso em que é usada uma solução aquosa de pH inferior ou igual a 4,5 e compreendendo 0,1 a 10% peso/volume de pelo menos um ácido orgânico. Dentre os ácidos que podem 4 ΡΕ1414310 ser seleccionados são mencionados: os ácidos cítrico, láctico, málico, acético, mas também ácido fosfórico e sais destes. Esta aplicação não fornece detalhes adicionais em como tal extracção aquosa é realizada. É descrito por Bérot et al., em "Intern. Journal of Food Science & Technology" (1994), p. 489-502, um processo numa escala piloto para fraccionar o glúten, usando soluções aquosas de ácido. De acordo com esta publicação, o glúten de trigo e uma solução diluída de ácido são misturadas num misturador de cisalhamento elevado durante dois minutos, e a agitação continuada durante 30 minutos. A proporção solvente aquoso para glúten variou entre 7:1 e 16:1 (v/p). A fracção rica em gliadina solúvel foi separada por meio de uma centrífuga decantadora horizontal Westfalia e o resíduo foi então novamente misturado com água ou com ácido diluído e submetido a um segundo passo de centrifugação. Isto resultou numa fracção rica em glutenina insolúvel e na fracção intermédia. As caracterís-ticas globais da fracção intermédia não estavam longe das do glúten de trigo.

Este processo, embora fornecendo uma fracção rica em gliadina, é menos atractivo porque a fracção intermédia é obtida como um produto secundário. Este produto secundário é considerado como uma desvantagem importante relativamente ao rendimento.

Também a montagem de processamento é bastante 5 ΡΕ1414310 complicada e merece ser simplificada, de preferência sem perda de propriedades funcionais do material fraccionado. À parte a natureza complicada do processo de Bérot, observou-se que a fracção intermédia não pode ser processada outra vez via mistura com glúten fresco. De facto, foi observado que circular outra vez este produto intermédio resultou na redução da pureza e qualidade das fracções. 0 objectivo do invento é o de fornecer um método para a preparação de fracções ricas em gliadina e glutenina a partir do glúten num meio aquoso na presença de um ácido, o qual não apresenta as desvantagens supramencionadas. 0 objectivo é atingido providenciando um método para a preparação de fracções ricas em gliadina e glutenina a partir do glúten num meio aquoso na presença de um ácido, em que o glúten é disperso de forma continua ou não em água até ter uma substância seca variando entre 5 e 30% p/v, pelo qual - o pH da dispersão é monitorizado entre 4,4 e 4,8, e - a mistura glúten-água é submetida a acções de cisalhamento, 6 ΡΕ1414310 e pelo qual a mistura glúten-água é submetida a acções de cisalhamento de modo a que o volume do sedimento da dispersão de glúten depois da fraccionação, como determinado no "teste de rotação", varie entre 15 e 35%, através do qual a dispersão, de forma continua ou não, pode ser fraccionada em fracções ricas em gliadina e glutenina, pelo qual é obtida uma fracção única rica em gliadina com uma proporção de gliadina/glutenina de pelo menos 2,5, e é obtida uma fracção única rica em glutenina com uma proporção de gliadina/glutenina menor do que 0,8.

Com mais preferência, num método de acordo com o invento o referido volume do sedimento varia entre 20 e 30%.

Num outro método preferido de acordo com o invento o referido sedimento compreende entre 48 e 58% da substância seca presente na dispersão de glúten.

Com mais preferência, num método de acordo com o invento, o referido sedimento compreende entre 50 e 55% da substância seca presente na dispersão de glúten.

Ainda num outro método preferido de acordo com o invento, o pH da dispersão é monitorizado entre 4,5 e 4,7.

De preferência, num método de acordo com o invento, o glúten pode ser disperso pela mistura de glúten com água, usando meios de mistura durante um período de 7 ΡΕ1414310 menos do que 60 minutos com uma velocidade entre 500 e 3000 rpm.

Com mais preferência, num método de acordo com o invento, a mistura é levada a cabo durante um período inferior a 30 minutos.

Num método preferido de acordo com o invento , a fraccionação da dispersão é levada a cabo por meio de centrifugação, e.g. por meio de uma centrífuga com centrifugação de auto-remoção automática ou por meio de centrífugas decantadores.

Num outro método preferido de acordo com o invento, a substância seca da dispersão varia entre 10 e 15% p/v.

Ainda num outro método preferido de acordo com o invento, é usado como ácido o ácido fosfórico. O invento será agora descrito mais em detalhe. O objectivo desta descrição detalhada é o de dar uma visão mais clara do invento e o de indicar vantagens adicionais e detalhes do invento. Além disso serão usados exemplos esclarecedores. Esta descrição detalhada e os exemplos esclarecedores não podem em nenhum sentido ser interpretados como uma restrição do campo de aplicação do invento ou dos direitos de patente como exigido nas reivindicações. ΡΕ1414310

Nesta descrição detalhada, será feita referência às figuras, as quais são:

Figura 1 é uma representação esquemática de um processo de fraccionação tipico de acordo com o invento;

Figura 2 é um esboço de um processo de extracção para separar gliadinas, gluteninas, albuminas e globulinas. A acidificação pode ser realizada por meio de um ácido orgânico ou inorgânico. Ácidos típicos que podem ser usados são, embora não sejam limitantes, e.g., ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, ácido málico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido clorídrico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico. É usado, de preferência, ácido fosfórico. 0 pH da dispersão é de preferência monitorizado entre 4,5 e 4,7, e com maior preferência cerca de 4,6. A concentração de glúten na dispersão varia entre 5-30% p/v, sendo preferidas concentrações entre 10 e 15% p/v. O glúten de trigo pode ser disperso misturando o glúten com água usando e.g. uma com uma misturadora de pás com facas, ou com outra configuração, rodando a 500-3000 rpm durante o tempo suficiente para obter uma dispersão que pode ser separada em fracções do invento. Tempos de mistura típicos são inferiores a 1 hora, de preferência inferiores a 30 minutos. 9 ΡΕ1414310 0 "input" mecânico e as condições de mistura devem ser seleccionadas de tal modo que a dispersão obtida possa ser separada numa fracção rica em gliadina na qual a proporção gliadina/glutenina de pelo menos 2,5 e uma fracção rica em glutenina apresentando uma proporção de gliadina/glutenina inferior a 0,8. Numa composição de glúten padrão as proporções gliadina/glutenina variam tipicamente entre 1 e 1,3. Estas diferentes classes de proteína do trigo são determinadas por meio do método analítico revelado a seguir.

Este método usa as diferentes características de solubilidade das classes de proteína do trigo em diferentes solventes para separar gliadinas, gluteninas, albuminas e globulinas. A distribuição de proteína em diferentes solventes é quantificada por análise Kjeldahl.

Equipamento: - tubos de centrífuga de polipropileno de 40 ml - centrífuga (capaz de rodar a 15 000 g) - balança analítica

- NaCl 0,5 M solução de SDS a 1,5% 10 ΡΕ1414310 - etanol a 95%

- câmara de incubação a 10°C - montagem Kjeldahl - comprimidos Kjeldahl Método (como se mostra na figura 2):

Todas as extracções são durante 30 minutos à temperatura ambiente.

- Pesar uma amostra num tubo de centrífuga de PP de ± 40 ml. Para farinha 2 g, para glúten 200 mg, para amostras do processo a quantidade correspondente a ± 150-160 mg de proteína. - Adicionar 20 ml de NaCl 0,5 M. Agitar durante

30 minutos à temperatura ambiente (TA) . Após extracção, centrifugar a 500 g durante 15 minutos à TA. Decantar cuidadosamente o sobrenadante num tubo de PP limpo. Adicionar outros 20 ml de NaCl 0,5 M ao resíduo (precipitado A) e repetir a extracção e centrifugação. Combinar este segundo sobrenadante com o primeiro e depois centrifugar a 15 000 g durante 15 minutos à TA. O sobrenadante contém as albuminas e globulinas.

Ao resíduo (precipitado B) são adicionados 6 ml 11 ΡΕ1414310 de solução 1,5% de SDS. A mistura é homogeneizada e combinada com o precipitado A. A extracção é durante 30 minutos à TA. 14 ml de etanol absoluto é então adicionado gota à gota e a mistura é agitada durante outros 30 minutos à TA. Após centrifugação à TA durante 15 minutos a 500 g, foi obtidos o precipitado e sobrenadante 3. Este procedimento completo é repetido no precipitado obtido, produzindo o precipitado C e o sobrenadante 4. - Os sobrenadantes 3 e 4 são combinados num copo pequeno e mantidos numa câmara de incubação a 10°C durante 60 minutos. Forma-se um precipitado fino e esta mistura é então deitada no tubo de centrífuga contendo o precipitado C. A mistura é imediatamente transferida para um tubo de centrífuga posta a girar a 15 000 g durante 15 minutos a 10°C. Isto produz um sobrenadante contendo gliadinas e um precipitado contendo gluteninas.

Determinação Kjeldahl:

As soluções contendo as albuminas/globulinas e gliadinas (± 40 ml) são transferidas de forma quantitativa para frascos de destruição (750 ml) . Um comprimido, 14 ml de ácido sulfúrico concentrado e 3 gotas de octanol (antiespuma) são adicionados e as amostras são destruídas. As amostras (cerca de 15 ml) são transferidas para tubos de Kjeldahl e o azoto é determinado pelo método de Kjeldahl padrão. 12 ΡΕ1414310 A fracçao de glutenina é liofilizada e o teor em azoto é determinado como nos produtos secos.

Os resultados são registados como a quantidade de proteína encontrada nas diferentes classes e expressos como uma percentagem da proteína recuperada.

Foi observado que as fracções ricas em gliadina e glutenina mencionados acima podem ser obtidas após centrifugação, quando o "input" de energia mecânica resulta em dispersões apresentando valores específicos de volume de sedimento como determinado por meio de um "teste de rotação". 0 "teste de rotação" usa uma centrífuga de laboratório padrão, e tubos de centrífuga de 15 ml, com a escala divida em 0,1 ml. Os tubos são então cheios com 10 ml de dispersão de glúten. Os tubos são centrifugados durante 10 minutos a 1800 g. O volume do sedimento, expresso em % de volume, é então determinado pelo proporção do sedimento em ml e o volume dos tubos de centrífuga em ml, multiplicada por 100.

As dispersões adequadas são então caracterizadas por um volume de sedimento variando entre 15 e 35%, de preferência, entre 20 e 30%. O sedimento compreende desse modo entre 48 e 58%, com mais preferência entre 50 e 55% de substância seca presente na dispersão de glúten. A 13 ΡΕ1414310 substância seca das dispersões pode variar entre 5 e 30% de substância seca, de preferência entre 10 e 15% da substância seca. Se a intensidade do cisalhamento e/ou tempo de mistura não estão adaptados, então não é possível obter fracções correspondendo aos valores acima. A separação da dispersão é realizada por meio de centrífuga, e.g. por meio de centrífugas de auto-remoção ou por meio de centrífugas decantadoras. O equipamento de centrifugação é usado em condições óptimas de separação.

Um processo de fraccionação típico de acordo com o invento é tipicamente realizado a uma temperatura varinado entre 10 e 40°C. De acordo com o esquema como se mostra na figura 1, o glúten de trigo seco é misturado com uma solução ácida num tanque de mistura, enquanto o pH é continuamente monitorizado por um "pH-estato". A dispersão de glúten assim obtida é então submetida a separação por centrífuga pela qual é obtida uma fracção rica em gliadina e uma rica em glutenina. A fracção rica em gliadina pode ser concentrada por meio de um passo de concentração por ultrafiltração, antes da secagem. A fracção rica em gliadina pode então ser seca usando qualquer método conhecido, sendo preferido a secagem por pulverização. O permeato pode ser posto a circular outra vez e usado no passo de mistura. A fracção rica em glutenina também é seca. 14 ΡΕ1414310

Exemplos :

Exemplo 1:

Preparação do lote: O glúten comercial de trigo seco é usado como material de partida. Numa vasilha contendo 225 1 de água da torneira e 450 g de ácido fosfórico (75%), foram adicionados 25 kg de glúten de trigo comercial com uma rosca (Katrion) via um tubo directamente no vórtex do dispersante agitado. O pH é constantemente monitorizado usando um "pH-estato", e mantido a pH=4,6. O glúten é disperso num período de 10 minutos e continua a misturar-se até se obter uma dispersão contendo entre 45 e 50% do material na fase dispersa. Isto corresponde a um valor de "teste de rotação" de 27%. A mistura é levada a cabo por meio de uma misturadora de cisalhamento elevado. A dispersão assim obtida é separada por meio de uma centrífuga decantadora (Westfalia CA 150) na qual foram ajustados os parâmetros para obter cerca de 45% da substância seca no sobrenadante do decantador. A fracção rica em gliadina foi então submetida a um passo de secagem por pulverização. Esta fracção tem um teor de proteína de 80%. O teor de gliadina é de 68% do 15 ΡΕ1414310 teor de proteína total, comparado com 45-48% para o glúten nativo. A proporção gliadina/glutenia foi de 3,1.

Na tabela 1, foi feita uma comparação da composição entre amostras de fracções de glúten obtidas por meio do método de Bérot (que são amostras que foram recebidas de Popineau e Bérot) e as amostras obtidas pelo processo de acordo com o invento. Todas as amostras foram analisadas por meio do método descrito acima. Método de acordo com Bérot Glúten Gliadina intermediário glutenina albumina/globulina 11,0-13,3 10,5 7,2 6,1 Gliadina 45,3-48,7 59,1 39, 1 31 Glutenina 37,0-45,4 30,4 53, 7 62,9 Proporção glia/glu 1,08-1,28 1,94 0,73 0,49 Método de acordo com Amylum glúten Gliadina ABe Glutenina ABe Gliadina Afr Glutenina AFr 11,0-13,3 10,4 8,8 10,4 6,9 45,3-48,7 67, 7 35,6 67,9 35,3 37,0-47,4 21,9 55,6 21,6 57, 7 1,08-1,28 3,1 0,64 3,13 0,61 ABe: amostras obtidas a partir de glúten de trigo feito em Amylum Bélgica. AFr: amostras obtidas a partir de glúten de trigo feito em Amylum França.

Tabela 1. Composição de amostras obtidas pelo método de acordo com Bérot e Amylum como determinado com o método descrito mencionado acima (teste a). Os valores são expressos como % da fracção de proteína total nas amostras. 16 ΡΕ1414310

Exemplo 2:

Preparação contínua:

Numa vasilha contendo 225 1 de água da torneira e 450 g de ácido fosfórico (75%), foram adicionados 25 kg de glúten de trigo comercial com uma rosca (Katrion) via um tubo directamente no vórtex do dispersante agitado. O pH é constantemente monitorizado usando um "pH-estato", e mantido a pH=4,6. O glúten é disperso num período de 10 minutos e continua a misturar-se até se obter uma dispersão tendo um valor de "teste de rotação" de 25%. O cisalhamento necessário é providenciado para atingir tal valor dentro de 20 minuts após o glúten ter sido disperso.

Depois água e glúten adicionais são constantemente adicionados no vórtex da dispersão agitada, enquanto o pH é constantemente monitorizado e mantido a pH=4,6, por adição de ácido fosfórico. A taxa de adição é de 20 kg para 0 glúten e de 200 1 para a água por hora. O que extravasa da vasilha é conduzido para uma vasilha amortecedora de 60 1 com agitação, a qual é utilizada para alimentar constan temente o decantador (Westfalia CA 150). As quantidades adicionadas correspondem às quantidades processadas via decantador (taxa de alimentação 20 1/h; 2500 rpm; dife rencial 10-15) . A fracção de gliadina assim obtida tem um teor de substância seca de 6% e é ainda processada por meio de um passo de ultraf iltração. A água do permeato é usada 17 ΡΕ1414310 para dispersar o glúten no primeiro tanque de agitação. 0 retentato, tendo um teor de substância seca de cerca de 10% é seco por meio de pulverização. A fracção rica em glutenina é neutralizada com carbonato de sódio a pH=7, lavada com água e depois seca num secador de anel.

Lisboa, 21 de Setembro de 2006

Claims (10)

1. ΡΕ1414310 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a preparação de fracções ricas em gliadina e glutenina a partir do glúten num meio aquoso e na presença de um ácido, caracterizado por o glúten ser disperso de forma continua ou não em água até ter uma substância seca variando entre 5 e 30% p/v, pelo qual - o pH da dispersão é monitorizado entre 4,4 e 4,8, e - a mistura de glúten-água é submetida a acções de cisalhamento, e pelo qual a mistura glúten-água é submetida a acções de cisalhamento de forma tal que o volume do sedimento da dispersão de glúten após fraccionação, como determinado pelo "teste de rotação", varie entre 15 e 35%, através do qual a dispersão pode ser fraccionada, de forma continua ou não, em fracções ricas em gliadina e glutenina, pelo qual é obtida uma fracção única rica em gliadina com uma proporção de gliadina/glutenina de pelo menos 2,5, e é obtida uma fracção única rica em glutenina com uma proporção de gliadina/glutenina inferior a 0,8.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido volume do sedimento variar entre 20 e 30%. 2 ΡΕ1414310
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por o referido sedimento compreender entre 48 e 58% da substância seca presente na dispersão de glúten.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o referido sedimento compreender entre 50 e 55% da substância seca presente na dispersão de glúten.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o pH da dispersão ser monitorizado entre 4,5 e 4,7.
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o glúten ser disperso por mistura do glúten com água, usando meios de mistura durante um período inferior a 60 minutos com uma velocidade entre 500 e 3000 rpm.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a mistura ser levada a cabo durante um período inferior a 30 minutos.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 7, caracterizado pela fraccionação da dispersão ser levada a cabo por meio de centrifugação, e.g. por meio de uma centrífuga com centrifugação de auto-remoção automática ou por meio de uma centrífuga decantadora. 3 ΡΕ1414310
9. 9. Método de acordo com uma das reivindicações 1 até 8, caracterizada por a substância seca da dispersão variar entre 10 e 15% p/v.
10. 10. Método de acordo com uma das reivindicações 1 até 9, caracterizado por ser usado o ácido fosfórico como ácido. Lisboa, 21 de Setembro de 2006