BE1014340A3

BE1014340A3 - Methode voor het bereiden van gliadine- en gluteninerijke fracties uit gluten in een waterig midden en in aanwezigheid van een zuur.

Info

Publication number: BE1014340A3
Application number: BE2001/0541A
Authority: BE
Inventors: Stefaan Roels
Original assignee: Amylum Europe Nv
Priority date: 2001-08-10
Filing date: 2001-08-10
Publication date: 2003-09-02
Also published as: DK1414310T3; ES2268079T3; RU2004106796A; US7385037B2; PL204548B1; PL367841A1; CA2456042C; DE60212974T2; UA76480C2; ATE332085T1; EP1414310B1; PT1414310E; EP1414310A1; JP4208712B2; WO2003013266A1; CN1541068A; CY1105289T1; AU2002331371B2; US20040198956A1; RU2297774C2

Abstract

De uitvinding betreft een methode voor het bereiden van gliadine- en glutinerijke fractie uit gluten in een waterig midden en in aanwezigheid van een zuur, waarbij de gluten al dan niet continu gedispergeerd worden in water tot een droge stof gehalte variërend tussen 5 en 30% waarbij de ph van de dispersie tussen 4,4 en 4,8 wordt gehouden, en het gluten-water mengsel onderworpen wordt aan afschuifkrachten, zodanig dat deze dispersie, al dan niet continu, gefractioneerd kan worden in gliadine- en glutinerijke fracties, waarbij één enkele gliadinerike fractie met een verhouding gliadine/glutenine van ten minste 2,5 wordt bekomen, en één enkele glutinerijke fractie met een verhouding gliadine/glutenine van minder dan 0,8 wordt bekomen.

Description

METHODE VOOR HET BEREIDEN VAN GLIADINE-EN GLUTENINERIJKE FRACTIES UIT GLUTEN IN EEN WATERIG MIDDEN
EN IN AANWEZIGHEID VAN EEN ZUUR De uitvinding betreft een verbeterde methode voor het bereiden van gliadine-en gluteninerijke fracties uit gluten in een waterig midden en in aanwezigheid van een zuur.

In de octrooi-en wetenschappelijke literatuur zijn reeds verschillende methodes beschreven voor het scheiden van tarwegluten in gliadine-en gluteninerijke fracties.

Ook het gebruik van deze fracties is reeds het onderwerp geweest van een aantal octrooi-en wetenschappelijke publicaties.

Op laboratoriumschaal werden in verschillende technieken verschillende solventen en andere condities getest om de twee fracties te scheiden. In het boek "Protéines végétales" (1985), p. 161-210, rapporteerde Popineau een gedetailleerde weergave van deze technieken, maar in de meeste gevallen konden deze technieken niet geëxtrapoleerd worden naar industriële schaal omdat meestal solventen worden gebruikt die niet toegelaten zijn in de voedselbereiding, en deze methodes houden een stap in zoals preparatoire chromatografie die, alhoewel deze methode geschikt is voor farmaceutisch gebruik, te duur is om toe te passen in de voedingsindustrie.

Onder de solventen die toegelaten worden voor de bereiding van voedingscomponenten werden op laboratoriumschaal water-alcohol mixen en azijnzuuroplossingen getest op hun geschiktheid om proteïnefracties te scheiden.

In EP 685 164 wordt een extractiemethode beschreven waarbij een waterige ethanoloplossing met een concentratie van 30 tot 70 volume %, een waterige isopropylalcohol-of n-propanoloplossing met een concentratie van 10 tot 20 volume%, of een waterige acetonoplossing met een concentratie van 20 tot 50 volume% wordt gebruikt om een fractie te bekomen met een gliadineconcentratie van 80 % of meer. De extractie kan uitgevoerd worden door middel van een waterige zure oplossing van ethanol met een concentratie van 5 tot 30 volume% en ook een pH van 3, 5 tot 5, 5, om een gliadinefractie te bekomen met een concentratie

van 50 % of meer. Onder de zuren die kunnen gebruikt worden behoren azijnzuur, citroenzuur, appelzuur, melkzuur, adipinezuur, fumaarzuur, wijnsteenzuur, gluconzuur, fosforzuur en fytisch zuur.

Omdat het gebruik van ontvlambare solventen enkele bijkomende veiligheidsmaatregelen vereist, wordt als voordelig aanzien om een methode te hebben waarbij zulke solventen niet nodig zijn.

Dergelijk methode wordt beschreven in "Industries Alimentaires et Agricoles" (1974) door C. de Meester waarbij 0, 01-0, 1 M azijnzure oplossingen worden gebruikt om proteïne uit natuurlijk tarwegluten te extrageren. Na een extractieperiode van 1 tot 8 uur wordt een finale opbrengst bereikt van 20 - 55 %. De oplosbare fractie, dus de gliadinerijke fractie, wordt gerecupereerd door precipitatie bij een neutrale pH. Omdat de onoplosbare gliadines zeer kleverig zijn, is dergelijke techniek niet zeer geschikt voor industriële toepasbaarheid en tijdens de recuperatie moet het protemeprecipitatiestadium vermeden worden. Deze methode wordt uitgevoerd op laboratoriumschaal, maar kan niet uitgevoerd worden op industriële schaal.

Een ander solventvrije methode wordt beschreven in WO 9 710 260. Deze toepassing beschrijft een methode voor het fractioneren van tarwegluten. Volgens deze methode worden tarwegluten eerst gedispergeerd in een waterig zuur medium met een eerste zure pH in aanwezigheid van een reducerende agent, om zo de disulfidebruggen in het glutenproteine te reduceren. Dan wordt de pH van de dispersie opgetrokken naar een tweede niveau boven genoemde eerste pH, waardoor de glutenine precipiteert terwijl de gliadine opgelost achterblijft in de dispersie, waarna de glutenine en de gliadine gescheiden worden in de respectievelijke fracties.

Ook EP 992 193 verwijst naar een waterige extractiemethode waarbij een waterige oplossing met een pH kleiner of gelijk aan 4, 5 en een gewicht/volume % van 0, 1 tot
10 % van ten minste een organisch zuur wordt gebruikt. Onder genoemd organisch zuur dat kan gebruikt worden behoren : citroenzuur, melkzuur, appelzuur, azijnzuur, maar ook fosforzuur, en zouten daarvan. Deze toepassing voorziet geen verdere details over hoe een waterige extractie wordt uitgevoerd.

Door Bérot et al. wordt in "Intern. Journal of Food Science & Technology" (1994), p. 489 - 502, een methode op pilootschaal omschreven voor het fractioneren van gluten, gebruik makend van zure waterige oplossingen. Volgens deze publicatie worden tarwegluten en een verdunde zure oplossing gedurende twee minuten gemixt in een mixer met hoge afschuifkrachten, en dan gedurende 30 minuten continu geroerd. De verhouding tussen het waterig solvent en de gluten varieert tussen 7 : 1 en 16 : 1 (vol. /gew.). De oplosbare gliadinerijke fractie wordt gescheiden door middel van een Westfalia horizontale centrifuge decantor en het residu wordt opnieuw gemixt met water of met een verdund zuur en onderworpen aan een tweede centrifugatiestap. Dit resulteert in een onoplosbare gluteninefractie en een intermediaire fractie.

De algemene karakteristieken van de intermediaire fractie liggen niet ver uit de buurt van deze van tarwegluten.

Deze methode is minder geschikt omdat de intermediaire fractie wordt bekomen als een bijproduct, alhoewel deze methode een gliadinerijke en een gluteninerijke fractie oplevert. Dit bijproduct wordt aanzien als een belangrijk nadeel met betrekking tot de opbrengst.

Ook de procesopstelling is redelijk ingewikkeld en moet vereenvoudigd worden, bij voorkeur zonder verlies van functionele eigenschappen van het gefractioneerd materiaal.

Naast de ingewikkelde aard van het Berot-proces wordt er opgemerkt dat de intermediaire fractie niet teruggewonnen kan worden via terugmixen met verse gluten. Er wordt inderdaad vastgesteld dat hergebruik van dit intermediair product resulteert in een vermindering van zuiverheid en kwaliteit van de fracties.

Het doel van de uitvinding is te voorzien in een methode voor het bereiden van gliadine-en gluteninerijke fracties uit gluten in een waterig midden en in aanwezigheid van een zuur, die bovenvermelde nadelen niet vertoont.

Dit doel wordt bereikt door te voorzien in een methode voor het bereiden van gliadine-en gluteninerijke fracties uit gluten in een waterig midden en in

aanwezigheid van een zuur, maar waarbij de gluten al dan niet continu gedispergeerd worden in water tot een droge stof gehalte variërend tussen 5 en 30 %, waarbij * de pH van de dispersie tussen 4, 4 en 4, 8 wordt gehouden, en 'het gluten-water mengsel onderworpen wordt aan afschuifkrachten, zodanig dat deze dispersie, al dan niet continu, gefractioneerd kan worden in gliadine-en gluteninerijke fracties, waarbij een enkele gliadinerijke fractie met een verhouding gliadine/glutenine van ten minste 2, 5 wordt bekomen, en een enkele gluteninerijke fractie met een verhouding gliadine/glutenine van minder dan 0, 8 wordt bekomen.

Verzuring kan uitgevoerd worden door middel van een organisch of anorganisch zuur. Typische zuren die kunnen gebruikt worden, alhoewel deze niet limiterend zijn, zijn bijv. azijnzuur, citroenzuur, melkzuur, bamsteenzuur, appelzuur, tartaarzuur, fumaarzuur, waterchloridezuur, zwavelzuur en fosforzuur. Bij voorkeur wordt fosforzuur gebruikt. De pH van de dispersie wordt bij voorkeur gevolgd bij waarden tussen 4, 5 en 4, 7 en meer bij voorkeur rond 4, 6.

De glutenconcentratie in de dispersie varieert tussen 5 - 30 gew. /vol. %, bij voorkeur concentraties tussen 10 en 15 gew. /vol. %. De tarwegluten kan gedispergeerd worden door het gluten te mixen met water, gebruikmakend van bijv. een mixblad met messen of een andere centrifugatie, roterend met een snelheid van 500 - 3000 rpm voor een tijd lang genoeg om een dispersie te bekomen die gescheiden kan worden in de fracties van de uitvinding. Typische mixtijden zijn minder dan een uur, bij voorkeur minder dan 30 minuten.

Mechanische input en mixcondities moeten op zo'n manier geselecteerd worden dat de bekomen dispersie gescheiden kan worden in een gliadinerijke fractie waarvan de verhouding gliadine/glutenine minder dan 0, 8 is. In een standaard glutencompositie, de verhouding gliadine/glutenine varieert typisch tussen 1 en 1, 3. Deze verschillende tarweproteineklassen worden bepaald door middel van een analytische methode zoals hierna beschreven.

Deze methode maakt gebruik van verschillende oplosbaarheidskarakteristieken van de tarweproteineklassen in verschillende solventen om gliadines, glutenines, albumines en globulines te scheiden. De verdeling van proteïne in verschillende solventen wordt gekwantificeerd door Kjeldahl analyse.

- Materiaal : polypropyleen centrifugetubes van 40 ml centrifuge (in staat om te roteren op 15000 g) een analytische balans '0, 5 M NaCl 1, 5 % SDS-oplossing . 95 % ethanol
EMI5.1
incubatiekamer op 10 CKjeldahl apparaat Kjeldahl tabletten
EMI5.2
Voor 300 ml tubes type CT (5 g K2S04 + 0, + 0, g Ti02) Voor 100 ml tubes type CTQ (1, g K2S04 + 0, g CuS04. + 0, g :Ti02) - Methode : De extractiemethode wordt voorgesteld in figuur 2. Alle extracties gebeuren gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.
EMI5.3

* Weeg een staal in een PP-centrifuge tube van 40 ml. Voor bloem 2000 g, voor gluten 200 mg, voor processtalen een hoeveelheid overeenkomstig met 150-
160 mg proteïne.

* Voeg 20 ml 0, 5 M NaCl toe. Roer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur (KT). Na extractie, centrifugeer gedurende 15 minuten op 500 g op KT.

Decanteer voorzichtig het supematans in een propere PP-tube. Voeg nog 20 ml
0, 5 M NaCl toe aan het residu (precipitaat A) en herhaal de extractie en de

centrifugatie. Combineer dit tweede supematans met het eerste en centriguur gedurende 15 min. op 15000 g op KT. Het supematans bevat de albumines en de globulines.

* Aan het residu (precipitaat B) wordt 6 ml 1, 5 % SDS-oplossing toegevoegd. Het mengsel wordt gehomogeniseerd en gecombineerd met precipitaat A. De extractie gebeurt gedurende 30 minuten op KT. Daarna wordt er 14 ml absolute ethanol druppelsgewijs toegevoegd en wordt het mengsel nog 30 minuten verder geroerd op KT. Na centrifugatie op KT gedurende 15 min. op 500 g wordt een precipitaat en supematans 3 bekomen. Deze volledige procedure wordt herhaald op het bekomen precipitaat, resulterend in precipitaat C en supematans 4.

* Supematans 3 en 4 worden samengevoegd in een kleine beker en in een incubatiekamer gehouden gedurende 60 min. op 10 C. Er vormt zieh een fijn precipitaat en dit mengsel wordt dan in de centrifugetube met precipitaat C overgebracht. Dit mengsel wordt onmiddellijk overgebracht naar de centrifuge en afgedraaid op 15000 g gedurende 15 min. op 10 C. Dit resulteert in een supematans dat de gliadines omvat en een precipitaat dat de glutenines omvat.

- Kjeldahl-bepaling : De oplossingen die de albumines/globulines en gliadines bevatten ( 40 ml) worden kwantitief overgebracht in vemietigingsflacons (750 ml). Een tablet, 14 ml geconcentreerd zwavelzuur en 3 druppels octanol (antischuim) worden toegevoegd en de stalen worden vernietigd gedurende 90 min (tot deze niet meer troebel zijn).

Het concentraat (ongeveer 15 ml) wordt dan overgebracht in een Kjeldahl tube en de stikstof wordt bepaald zoals beschreven in een standaard Kjeldahl methode.

De gluteninefractie wordt gevriesdroogd en de stikstofinhoud wordt bepaald zoals in droge producten.

De resultaten worden weergegeven als de hoeveelheid proteïne gevonden in de verschillende klassen en uitgedrukt als een percentage van de herwonnen proteïne.

Er is vastgesteld dat bovengenoemde gliadine-en gluteninerijke fracties bekomen kunnen worden na centrifugatie, wanneer de inbreng van mechanische energie resulteert in dispersies die specifieke sedimentvolume-waarden vertonen door middel van een"spintest".

Deze"spintest"gebruikt een standaard labocentrifuge, en centrifugetubes van 15 ml, met 0, 1 ml schaalverdeling. De tubes worden dan gevuld met 10 ml glutendispersie. De tubes worden gecentrifugeerd gedurende 10 minuten op 1800 g. Het volume van het sediment, uitgedrukt in volume %, wordt dan bepaald door de verhouding van het sediment in ml en het volume in de centrifugetube in ml, vermenigvuldigd met 100. Geschikte dispersies worden dan gekarakteriseerd door een sedimentvolume dat varieert tussen 15 en 35 %, bij voorkeur tussen 20 en 30 %. Het sediment omvat daarbij tussen 48 en 58 %, meer bij voorkeur tussen 50 en 55 %, van het droge stof gehalte aanwezig in de glutendispersie. Het droge stof gehalte van de dispersies kan variëren tussen 5 en 30 %, bij voorkeur tussen 10 en 15 %.

Als de intensiteit van de schuifkrachten en/of de mixtijd niet aangepast worden, dan is het niet mogelijk om fracties te bekomen overeenkomstig bovenvermelde waarden.

De scheiding van de dispersie wordt gerealiseerd met behulp van centrifugale middelen, bijv. door middel van centrifuge met automatische slibverwijdering of een decantorcentrifuge. De uitrusting van de centrifuge wordt daarbij gebruikt onder optimale scheidingscondities.

Een typisch fractionatieproces volgens de uitvinding wordt schematisch voorgesteld in figuur I. Volgens dit schema wordt droge tarwegluten gemixt met een zure oplossing in een mixtank, terwijl de pH continu wordt opgevolgd door een pH-staat.

De op deze manier verkregen glutendispersie wordt dan onderworpen aan een centrifugale scheiding waarbij een gliadinerijke en een gluteninerijke fractie worden verkregen. De gliadinerijke fractie kan dan vooraleer drogen geconcentreerd worden door middel van een ultrafiltratie concentratiestap. De gliadinerijke fractie kan dan gedroogd worden gebruik makend van elke gekende methode, bij voorkeur via sproeidrogen. Het permeaat kan hercirculeren en gebruikt worden in de mixstap. De gluteninerijke fractie wordt ook gedroogd.

EMI8.1

Voorbeelden * Voorbeeld Batchbereiding :Commerciële droge tarwegluten worden gebruikt als het startmateriaal. In een vat dat 225 1 kraantjeswater en 450 g fosforzuur (75 %) bevat wordt met een schroef (Katron) via een tube 25 kg commercieel tarwegluten direct toegevoegd in de vortex van het geroerde dispergeermiddel. De pH wordt constant gevolgd via een pH-staat en wordt op pH = 4, 6 gehouden. De gluten wordt gedispergeerd binnen een periode van 10 minuten en het mixen wordt verdergezet tot een dispersie wordt bekomen waarbij zieh tussen 45 en 50 % van het materiaal in de gedispergeerde fase bevindt.

Dit komt overeen met een "spintest"-waarde van 27 %.

Het mixen wordt uitgevoerd met behulp van een mixer werkende met hoge afschuifkrachten. De op deze manier bekomen dispersie wordt gescheiden door middel van een decantercentrifuge (Westfalia CA150) waarbij de instellingen aangepast worden om ongeveer 45 % van de droge stof in het supematans van de decanter te krijgen.

De gliadinerijke fractie wordt dan onderworpen aan een sproeidroogstap. Deze fractie heeft een proteine-inhoud van 80 %. De gliadine-inhoud is 68 % van de totale proteinehoeveelheid, vergeleken met 45 - 48 % voor natuurlijke gluten. De verhouding gliadine/glutenine is 3, 1.

In tabel l wordt de samenstelling van stalen van glutenfracties bekomen door middel van de methode volgens Bérot (stalen ontvangen van Popineau en Bérot) vergeleken met stalen verkregen via het proces van de uitvinding. Alle stalen werden geanalyseerd door middel van bovenbeschreven methode.

EMI9.1

Methode <SEP> volgens <SEP> Bérot
<tb> gliadine <SEP> intermediair <SEP> Glutenine
<tb> albumine/globuline <SEP> 10, <SEP> 5 <SEP> 7, <SEP> 2 <SEP> 6, <SEP> 1 <SEP>
<tb> gliadine <SEP> 59, <SEP> 1 <SEP> 39, <SEP> 1 <SEP> 31
<tb> glutenines <SEP> 30, <SEP> 4 <SEP> 53, <SEP> 7 <SEP> 62, <SEP> 9 <SEP>
<tb> verhouding <SEP> glia/glu <SEP> 1, <SEP> 94 <SEP> 0, <SEP> 73 <SEP> 0, <SEP> 49 <SEP>
<tb> Methode <SEP> volgens <SEP> Amylum
<tb> gluten <SEP> ABe <SEP> gliadine <SEP> ABe <SEP> glutenine <SEP> Afr <SEP> gliadine <SEP> AFr <SEP> glutenine
<tb> 11, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 13, <SEP> 3 <SEP> 10, <SEP> 4 <SEP> 8, <SEP> 8 <SEP> 10, <SEP> 4 <SEP> 6, <SEP> 9 <SEP>
<tb> 45, <SEP> 3-48, <SEP> 7 <SEP> 67, <SEP> 7 <SEP> 35, <SEP> 6 <SEP> 67, <SEP> 9 <SEP> 35, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 37, <SEP> 0-47, <SEP> 4 <SEP> 21, <SEP> 9 <SEP> 55, <SEP> 6 <SEP> 21, <SEP> 6 <SEP> 57, <SEP> 7 <SEP>
<tb> 1,

EMI9.2
ABe stalen verkregen uit tarwegluten gemaakt in Amylum België AFr stalen verkregen uit tarwegluten gemaakt in Amylum Frankrijk Tabel Samenstelling van stalen verkregen via de methode volgens Bérot en Amylum zoals bepaald met de hierboven beschreven methode (test a).

Waarden zijn uitgedrukt als % van de totale proteïnefractie in de stalen.

Voorbeeld 2 Continue bereiding In een vat dat 225 1 kraantjeswater en 450 g fosforzuur (75 %) bevat wordt met een schroef (Katron) via een tube 25 kg commercieel tarwegluten direct toegevoegd in de vortex van het geroerde dispergeermiddel. De pH wordt constant gevolgd via een pH-staat en wordt op pH = 4, gehouden. De gluten wordt gedispergeerd gedurende een periode van 10 minuten en continu gemixt tot een dispersie wordt bekomen met een"spintest"-waarde van 25 %. De nodige afschuifkracht wordt voorzien om zo'n waarde te bekomen binnen de 20 minuten nadat het gluten is gedispergeerd.

:Daarna worden constant additioneel water en gluten toegevoegd in de vortex van de geroerde dispersie terwijl de pH constant wordt opgevolgd en gehouden op pH = 4, 6 door het toevoegen van fosforzuur.

De toevoegingssnelheid is 20 kg gluten en 200 l water per uur. De overflow van het vat wordt geleid in een geroerd buffervat van 60 l, wat gebruikt wordt om constant de decanter (Westfalia CA150) te voeden. De toegevoegde hoeveelheden komen overeen met de hoeveelheden verwerkt via de decanter (voedingssnelheid 20 l/h ; 2500 rpm ; differentiaal 10 - 15). De op deze manier bekomen gliadinefractie heeft een droge stof gehalte van 6 % en wordt verder verwerkt door middel van een ultrafiltratiestap. Het permeaat water wordt gebruikt om gluten te dispergeren in de eerste roertank. Het retentaat, wat een droge stof gehalte heeft van ongeveer 10 %, wordt gedroogd door middel van sproeidrogen.

De gluteninerijke fractie wordt geneutraliseerd met natriumcarbonaat tot pH = 7, gewassen met water en dan gedroogd in een ringdroger.

Claims

CONCLUSIES 1. Methode voor het bereiden van gliadine-en gluteninerijke fracties uit gluten in een waterig midden en in aanwezigheid van een zuur, met het kenmerk dat de gluten al dan niet continu gedispergeerd worden in water tot een droge stof gehalte variërend tussen 5 en 30 %, waarbij * de pH van de dispersie tussen 4, 4 en 4, 8 wordt gehouden, en * het gluten-water mengsel onderworpen wordt aan afschuifkrachten, zodanig dat deze dispersie, al dan niet continu, gefractioneerd kan worden in gliadine-en gluteninerijke fracties, waarbij een enkele gliadinerijke fractie met een verhouding gliadine/glutenine van ten minste 2, 5 wordt bekomen, en een enkele gluteninerijke fractie met een verhouding gliadine/glutenine van minder dan 0, 8 wordt bekomen.
2. Methode volgens conclusie 1, met het kenmerk dat het gluten-water mengsel onderworpen wordt aan schuifkrachten, zodanig dat het sedimentvolume van de glutendispersie na fractionering, zoals bepaald door een"spintest", varieert tussen 15 en 35 %.
3. Methode volgens conclusie 2, met het kenmerk dat genoemd sedimentvolume varieert tussen 20 en 30 %.
4. Methode volgens conclusie l, met het kenmerk dat genoemd sediment tussen 48 en 58 % omvat van het droge stof gehalte aanwezig in de glutendispersie.
5. Methode volgens conclusie 4, met het kenmerk dat genoemd sediment tussen 50 en 55 % omvat van het droge stof gehalte aanwezig in de glutendispersie.
6. Methode volgens conclusie 1, met het kenmerk dat de pH van de dispersie tussen 4, 5 en 4, 7 wordt gehouden. <Desc/Clms Page number 12>
7. Methode volgens conclusie l, met het kenmerk dat de gluten gedispergeerd kan worden door het mixen van de gluten met water, gebruikmakend van mengmiddelen gedurende een periode van minder dan 60 minuten en met een snelheid tussen 500 en 3000 toeren per minuut.
8. Methode volgens conclusie 7, met het kenmerk dat gedurende een periode van minder dan 30 minuten gemixt wordt.
9. Methode volgens conclusie een van conclusies l tot en met 8, met het kenmerk dat de fractionatie van de dispersie gebeurt met behulp van centrifugale middelen, bijv. door middel van een centrifuge met automatische slibverwijdering of een decantorcentrifuge.
10. Methode volgens een van de conclusies 1 tot en met 9, met het kenmerk dat het droge stof gehalte van de dispersie varieert tussen 10 en 15 %.
11. Methode volgens een van de conclusies 1 tot en met 10, met het kenmerk dat als zuur fosforzuur wordt gebruikt.