PT100755B - Processo para purificar a pentostatina - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A pentostatina é o composto (R)-3-(2-deoxy-B-D-erythro-pentofuranosil)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo [4,5-d]-[l,3]diazepin-8-ol que possui a estrutura:
H OH
I
OH
Este composto é um poderoso inibidor da adenosina desaminase e é util como agente anti-leucémico. A patente Norte Americana n<? 3923785, publicada em 2 de Dezembro de 1975 descreve a produção de pentostatina por fermentação de uma estirpe Streptomyces antibioticus que se encontra depositada com a referência NRRL 3238. A patetente Norte Americana nQ. 3923785 descreve também o isolamento e a purificação de pentostatina a partir de caldo de fermentação. A presente invenção proporciona um procedimento no tavelmente aperfeiçoado para isolar e para purificar a pentosta tina. A presente invenção utiliza uma combinação de resinas de permuta de iões e de Sepabeads 207 para a qual se demonstrou que permite aumentar bastante a quantidade de composto puro recuperado a partir do caldo de fermentação. Sem este processo de recuperação aperfeiçoado a comercialização da pentostatina seria impraticável devido aos elevados custos de produção do composto na sua forma pura.
SUMÃRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona um processo novo para isolar a pentostatina. Mais particularmente a presente invenção proporciona um processo para isolar a pentostatina por via cromatogrãfica a partir de um concentrado impuro, o qual consiste em aplicar esse concentrado a uma resina de per muta de aniões borato fortemente alcalina seguindo-se depois aplicações a um leito activado de Sepabeaeds SP207 ou de um seu equivalente e posterior recolha das fracções que contêm a pentostatina.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
Tal como especificado antes, o processo de fermentação para a produção de pentostatina encontra-se descrito na patente Norte Americana nQ. 3923785 cujo conteúdo se incorpora aqui por referência.
concentrado de fermentação impuro é obtido retendo a pentostatina de um caldo de cultura sobre uma resina dle permuta de catiões forte seguindo-se a eluição com hi
drõxido de amónio e posterior concentração do produto de eluição atê um volume de aproximadamente 1/200 do volume do caldo inicial. Este concentrado, que contêm diversos contaminantes co nhecidos incluindo o isómero S (0 epimero C-8) da pentostatina, a coformicina, 2’-desoxiguanosina, a vidarabina e a citosiné. é depois processado em três fases: 1) um passo de precipitação para remoção das impurezas mais grosseiras, 2) cromatografia utilizando uma resina de permuta de aniões fortemente alcalina sob a forma de borato e posterior aplicação a Sepabeads SP207 ou a um seu equivalente e 3) cristalização. Em particular faz-se observar que a fase cromatográfica ê a essência da presente invenção. Descobriu-se que a utilização de uma resina de permuta de aniões fortemente alcalina em combinação com Sepabeads (marca comercial de Mitsubishi) SP207 proporciona elevados rendimentos de produção de um produto puro nunca antes conseguidos.
As resinas de permuta de aniões úteis no processo da presente invenção contêm uma funcionalidade de amónio quaternário e são resinas de permuta de aniões fortemente alcalinas. Existem muitas dessas resinas comercialmente dis poníveis. Como exemplos típicos refere-se as séries Purolite A-425 (marca comercial da Purolite) e Dowex (marca comercial da Dow Chemical Company) de resinas de permuta de aniões fortemente alcalinas que podem ser utilizadas e que incorporam uma estrutura polimérica de estireno-divinilbenzeno (S-DVB) e uma cadeia secundária de trimetil-amõnio ou de dimetil-etanol-amõnio tal como genericamente representado a seguir:
| S-DVB ~ resina | |
| polimérica |
+ ch2n(ch3)3 ch2n(ch3)3
X x'
S-DVB resina polimérica
4* “ CH2N(CH3)2 ch2ch2oh +
= CH2N(CH3)2
CH2CH2OH
As resinas de permuta de aniões indicadas antes encontram-se co
mercialmente disponíveis sob as designações Dowez-lXl, Dowex-1X2, Dowex-lX4, etc., e normalmente são fornecidas na forma de cloreto em que o símbolo X representa Cl” ou sob a forma de hi drôxido em que o símbolo x” representa OH-.
Também é possível utilizar a série Amberlite comercialmente disponível (marca comercial de Rohm and Haas Company) de resinas de permuta de aniões contendo uma funcionalidade de amónio quaternário. Essas resinas são de dois ti pos diferentes sendo uma delas do tipo gel e sendo a outra do tipo macroreticular, mas ambas são fortemente alcalinas. As publicações literárias descrevem a série Amberlite de resinas como possuidoras de grupos amónio quaternário acoplados a uma estrutura de tipo estirénico ou acrílico.
Existem muitas outras resinas comercial, raente disponíveis que são equivalentes às que foram descritas antes e que podem ser fácilmente identificadas por um especialista na matéria como úteis para o processo reivindicado na pre sente invenção.
De um modo geral o anião (X~) existente na resina de permuta de aniões fortemente alcalina comercialmen te disponível é o anião cloreto. Esta resina pode ser convertida na sua forma borato para utilização na presente invenção por tratamento com uia sal borato tal como o tetraborato de potássio. Para se realizar esta modificação a resina comercialmente dispo nível pode ser colocada numa coluna através da qual se efectua a percolação de vários volumes de um leito de uma solução aquosa de tetraborato de potássio após o que ê possível remover qualquer excesso de borato fazendo passar vários volumes de água desionizada através da coluna. Após a sua utilização a resina pode ser regenerada por lavagem com ácido clorídrico diluí do seguindo-se a lavagem com água desionizada e a lavagem com uma solução de tetraborato de potássio.
componente Diaion Sepabeads (marca comercial da Mitsubishi) SP207 utilizado no processo reivindicado na presente invenção é considerado pela literatura comercial como pertencente ao tipo estireno-divinilbenzeno dos grupos de resinas. 0 componente Sepabeads SP207 possui alguma afinidade para os compostos aromáticos. Esse produto ê geralmen
- 4 te representado do modo seguinte:
- CH - CH2era que o substituinte X representa o átomo de bromo.
exemplo seguinte ilustra o processo da presente invenção incluindo a preparação do concentrado inicial, precipitação e as fases finais de purificação cromatogrãfica e cristalização. Em todos os passos de isolamento e purifi cação a seguir descritos, o decurso de cada operaçnão é verificado através do ensaio de diversas fracções recolhidas para determinação do seu teor em pentostatina por cromatografia em líquido de elevada pressão utilizando o sistema:
Coluna: 250 z 4,6 mm Phenomenex, Ultremex 5 C-8.
Fase movei: 2,5 partes de metanol
2,5 partes de acetonitrilo.
95,0 partes de uma solução aquosa 0,05 M de (NIí.)
| HPO^ ajustada para o fórico. | |
| Débito: | 1,0 ml por minuto. |
| DEtecção: | a 270 nm (utiliza-se |
| da pureza do produto | |
| Tempo de | 10,7 minutos. |
| retenção: |
valor de pH 7,4 com ácido foso valor de 282 nm para medição de pentostatina final).
Cs especialistas na matéria sabem que na prática de procedimentos crcmatogrãficos analíticos os parâ metros especificados antes podem ser modificados de acordo com a natureza e com as condições «a coluna utilizadas.
'Jo exeraplo seguinte utilizou-se Purolite A425 que é um gel aniónico fortemente alcalino e é equivalen te ao coiaponente Dowex 1X2, por exemplo, com uma itialha de cali-
bre 100. A resina foi adquirida sob a forma de cloreto e conver tida na sua forma borato conforme se descreve a seguir
Carregou-se a resina Purolite A425 (cio reto) numa coluna e converteu-se na forma borato por percolação de 15-16 volumes de um leito de uma solução de aproximadamente 0,71«. Ê bastante conveniente dissolver o tetraborato de potássio em água desionizada quente (60 cc) e depois deixar arrefecer a solução resultante ate à temperatura ambiente. 0 ex cesso de borato ê lavado e retieado da colunei utilizando-se água desionizada (7-10 volumes de leito) até que o leitor do teor de sólidos dissolvidos indique uiaa leitura 0,00 parei o pro duto de eluição. A coluna ê depois novamente lavada com água de sionizada para remoção das impurezas finas e fica pronta para utilização.
No exemplo seguinte o termo volume de leito refere-se ao volume aparente de resina na coluna depois de se ter carregado uma suspensão de nova resina em água e deixando sedimentar durante cerca de 1 hora. Todas as referências subsequentes se referem a este volume. A Purolite A425 foi fornecida sob a forma cloreto? a conversão na forma borato seguida cie lavagem e posterior limpeza com sedimentação final durante 1 hora origina um acréscimo do volume de leito de cerca de 20%.
EXEMPLO
Procedeu-se à preparação de lotes de produção de caldos de fermentação de Streptomyces antibioticus NRRL 3238 contendo pentostatina de acordo com o procedimento des crito na patente Norte Americana ns. 3923789 publicada de 2 de Dezembro de 1975. Segundo uma experiência típica ajusta-se para
8,5 o valor do pH de uma quantidade de 50 000 L de caldo de fer mentação armazenado ã temperatura de + 15s C ou a uma temperatu ra inferior a essa durante cerca de 20 horas e depois procede-se à filtração utilizando Celite 545. Ajusta-se pura 6,0 o valor do pH do filtrado arrefecido e faz-se passar através de uma + -* coluna contendo 5 000 L de Dowex 50X4 (NH^ ) que foram previamente condicionados com água fria (cerca de 15© C)· Depois lava -se a resina Dowex 50 com água e procede-se ã eluição com uma solução de hidróxido de amónio 0,1 M e & seguir com uma solução de hidróxido d® amónio 0,2 N. Durante este passo de eluição e nos subsequentes passos de isolamento e de purificação verifica -se o decurso da operação por cromatografia líquida de elevada pressão (CLEPl tal como descrito antes. Reúne-se os produtos de eluição com as soluções de hidróxido de amónio que contêm a maior quantidade de pentostatina e procede-se ã sua concentração no vácuo até ao volume de 250 L a uma temperatura inferior a 50® C.
PRECIPITAÇÃO
Agita-se uma aliquota de 50 L de concen trado escuro e viscoso referido antes conjuntamente com 500 L cie etanol de classe 3A e com 250 L de acetona e depois deixa-se em repouso durante cerca de 24 horas. Remoxze-se cuidadosamente a solução sobrenadante separando-a do resíduo negro e viscoso e filtra-se através de um filtro revestido com Celite 545 e depois procede-se ã concentração no vácuo até ao volume de 20 L a uma temperatura inferior a 28Q C.
CROMATOGRAFIA
Aplica-se o concentrado enegrecido refe rido antes (20 L) a uma coluna contendo 135 L de resina Purolifce A425 (borato) preparada conforme descrito antes. A passagem da carga através da coluna remove uma grande parte da côr que fica retida sobre a resina. Essa resina é depois submetida a eluição com 7 volumes de leito de água desionizada. Apõs uma primeira experiência com cerca de 1 volume de leito verifica-se que o valor do pH do produto dê; eluição aumenta abruptamente ob servando-se uma côr amarela. Cerca de 90¾ da pentostatina aplicada a resina ê eluida nos 3 volumes de leito seguintes. As fracções ricas em pentostatina são reunidas e aplicadas a uma coluna contendo 120 L· de Diaion Sepabeads SP297 préviamente lavados com uma solução aquosa de etanol seguindo-se depois uma lavagem completa com água. Depois de ter sido aplicada toda a carga de pentostatina procede-se à lavagem da resina Sepabead
com 3-4 volumes de leito de água desioniseda e depois efectua-se a eluição com uma mistura de etanol/ãgua (10:90 p/p). Após uma primeira experiência com 1 volume de leito, a pentostatina começa a emergir e fica pratica e completanente eluída nos seguintes 2,5-3,0 volumes d© leito. As fracções que contêm a quqn tidade principal de pentostatina são reunidas e concentradas no vácuo para proporcionar uma solução de pentostatina entre 12 e 13¾ p/p. Depois trata-se este concentrado com carvão (5¾ p/p em relação à pentostatina) e a seguir filtra-se através de Celite 545 seguindo-se nova filtração através de filtros menbrenosos de 0,45 iiticra e 0,22 micra.
CRISTALIZAÇÕES
Concentra-se o filtrado final no vácuo até se obter uma massa que contém 60% de pentostatina (p/p) à qual se adiciona 10 volumes de laetaiiol (tosando como base o teor calculado em água). Seguidamente agita-se a suspensão re□ultante ã temperatura de 0© C durante 2 horas e depois recolhe -se o produto sólido por filtração, lava-se com metanol e seca-se à temperatura de 50© C durante 24 horas. Ô análise por CLEP demonstrou que este produto © pentostatina contaminada com uma proporção de 1,1% do epímero C-8 da pentostatina. Procede-se à recristalizaçãõ deste material dissolvendo-o em 1,2 a 1,5 partes de água quente (82© C) seguindo-se a diluição com 10 volumes de metanol sob agitação. Depois deixa-se arrefecer a mistura resultante, esfria-se para a temperatura de 0S C durante 2 horas e depois filtra-se. Procede-se à lavagem do sólido recolhido utilizando metanol e seca-se â temperatura de 502 c no vã cuo para proporcionar uxaa quantidade de 648,5 g de pentostatina com uma pureza superior a 99,7%. Este produto final encontra-se isento de pirogênio e exibe espectros de ultravioletas, infra-vermelhos e de ressonância magnética nuclear (SJ3K) que são idênticos aos espectros da pentostatina indicados em Ana. N.Y. Acad. Sei. 284:21.29 (1977).
Claims (3)
1, caracterizado pelo facto de se diluir o concentrado com um solvente adequado ou com uma mistura de solventes adequada, fil trando depois e concentrando o filtrado que contêm a pentostati na.
Processo de acordo com a reivindicação
2, caracterizado pelo facto de o solvente ou a mistura de. solventes ser acetona e etanol.
Processo de acordo com a reivindicação
3, caracterizado pelo facto de a resina de permuta de aniões conter uma funcionalidade de amónio quaternário
- 5a -
Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de a resiiia de permuta de aniões ser Purolite A425 (cloreto) convertida num anião borato.
Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de as fracções de pentostatina reco lhidas serem ainda purificados por recristalização.
A requerente reivindica a prioridade do pedido norte-americano apresentado em 31 de Julho de 1991, sob ο N9. 738,715.
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