JPH06509355A - ペントスタチンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ベントスタチンの精製方法 発明の背景 ベントスタチンは下記構造 を有する（Ｒ）−３−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロベントフラノシル）　 −３，６，７，８−テトラヒドロイミダゾ［４，５−ｄ］　−（１，３）ジアゼ ピン−８−オールである。それは強力なアデノシンデアミナーゼ阻害剤であり、 抗白血病剤として有用である。１９７５年１２月２日発行の米国特許第３．９２ ３．７８５号明細書には、ＮＲＲＬ　３２３８として寄託されているストレブト ミセスアンチビオチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕ ｓ）菌株の発酵によるベントスタチンの生産が記載されている。また、この米国 特許第３．９２３．７８５号明細書には発酵培養液からのベントスタチンの単離 および精製も記載されている。

本発明はベントスタチンの単離および精製における顕著に改良された方法を提供 する。本発明は発酵ブロスから回収される純粋化合物の量を著しく増加させるこ とが分かっている、イオン交換樹脂とセパビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）２０７ との組合せを使用する。この改良された回収方法を用いない場合には、ベントス タチンの商品化は精製形態での該化合物の生産コストが高いために実用的ではな い。

発明の要旨 本発明はベントスタチンを単離するための新規方法を提供する。

さらに詳しく云えば、本発明は、粗濃縮物からベントスタチンをクロマトグラフ ィー法で単離する方法を提供する。その方法は濃縮物を強塩基性ボレート陰イオ ン交換樹脂に適用し、次に５ｅｐａｂｅａｄｓ２０７の活性ベッドまたはその同 等物に適用し、そしてベントスタチン含有フラクションを集めることからなる。

発明の詳細な説明 前述のようにベントスタチン生産の発酵法は米国特許第３、９２３．７８５号明 細書に記載されており、該特許は参照により本発明に組込まれる。

粗発酵濃縮物は、発酵培養液からのベントスタチンを強陽イオン交換樹脂上に保 持し次に水酸化アンモニウムで溶出しそしてその溶出物を始発培養液量の約１／ ２００の量に濃縮することにより得られる。

次いで、いくつかの知られている汚染物例えばベントスタチンの“Ｓ”異性体（ Ｃ−８エピマー）、コホルマイシン、２′−デオキシグアノシン、ビダラビンお よびシトシンを含有するこの濃縮物を３段階：１）総不純物を除去するための沈 殿工程、２）ボレート形態の強塩基性陰イオン交換樹脂次に５ｅｐａｂｅａｄｓ 　ＳＰ　２０７またはその同等物を用いるクロマトグラフィーおよび３）結晶化 で処理する。特に、本発明の特徴はクロマトグラフィーの段階にある。本発明に よれば、５ｅｐａｂｅａｄｓ（三菱化成工業株式会社製）　ＳＰ　２０７と組合 せて強塩基性陰イオン交換樹脂を使用すると、従来得られなかったような高収量 の純粋な生成物が得られることが見出された。

本発明方法で有用な陰イオン交換樹脂は第４アンモニウム官能基を有していて、 強塩基性の陰イオン交換樹脂である。商業的に入手しうるこのような樹脂は多数 ある。代表的にはプロライト（Ｐｕｒｏｌ　ｉ　ｔｅ）＾−４２５（Ｐｕｒｏｌ ｉｔｅ社製）およびダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）（ＤｏｔＣｈｅ園１ｃａ１社製 ）系の強塩基性陰イオン交換樹脂がある。これらの樹脂は使用可能であり、一般 には下記 のように示されるスチレン−ジビニルベンゼン（Ｓ−ＤＶＢ）ポリマーバックボ ーンおよびトリメチルアンモニウムまたはジメチルエタノールアンモニウム側鎖 を有する。

上述の陰イオン交換樹脂はＤｏｗｅｘ　−ＩＸｌｌＤｏｗｅｘ　−ＩＸ２、Ｄｏ ｗｅｘ−ＩＫ４等として商業的に入手可能であり、通常はＸ−がＣ１−であるク ロリド形態またはＸ−が０■−であるヒドロキシド形態で供給される。

また第４アンモニウム官能基を含有する、商業的に入手可能なアンバーライト（ Ｒｏｔｕ＊　ａｎｄ　Ｈａｓｓ社製）系の陰イオン交換樹脂を使用してもよい。

これらの樹脂は２種の相異なる種類からなっていて、−方はゲル型そして他方は 巨大網状型でありかつ両者とも強塩基性である。文献にはスチレンまたはアクリ ル型のバックボーンに結合された第４アンモニウム基を有するアンバーライト系 の樹脂が記載されている。

前述した樹脂と等価であり、当業者ならば本発明方法で有用であるとして容易に 認識されるその他の多くの商業的に入手可能な樹脂が存在する。

一般に、商業的に入手可能な強塩基性陰イオン交換樹脂中の陰イオン（Ｘ−）は クロリドである。この樹脂は四ホウ酸カリウムのようなホウ酸塩での処理により 本発明で使用可能なボレート形態に変換されつる。この変換を行うには商業的に 入手可能な樹脂をカラムに入れ、数ベッド容量の四ホウ酸カリウム水溶液をその カラムに通して濾過しその後数容量の脱イオン水を該カラムに通すことによって いずれもの過剰のボレートを除去することができる。使用後、該樹脂は希塩酸次 に脱イオン水次に四ホウ酸カリウム溶液で洗浄することによって再生させること ができる。

本発明方法で使用されるＤｉａｉｏｎ　５ｅｐａｂｅａｄｓ　（三菱社製）　Ｓ Ｐ　２０７は商業文献中に、スチレン−ジビニルベンゼン型の樹脂グループであ ると記述されている。５ｅｐａｂｅａｄｓ　ＳＰ　２０７は芳香族化合物に対し てアフィニティーを有している。この製品は一般には下記のように表される。

以下に初期濃縮物の調製、沈殿段階並びに最終の浄化（ｃｌｅａｎ−ｕｐ）クロ マトグラフィー処理段階および結晶化段階を包含する本発明方法を例によって説 明する。下記の単離および精製の各工程の全てについて、各操作の進行はベント スタチン含量をめるために集められたい（つかのフラクションを下記の系：カラ ム：　２５０Ｘ４．６ｍｍ　Ｐｈｅｎｏｓｅｎｅｘ、　Ｕｌｔｒｅｍｅｘ　５　 Ｃ−ｇカラム移動相：２．５部のメタノール ２．５部のアセトニトリル ９５．０部の０．０５Ｍ（ＮＨ４）ＪＰＯ４水溶液（リン酸でｐＨ１７，４に調 整されている） 流速：１．０＠Ｌ／分 検　出：　２７０ｎ■（最終のベントスタチン生成物の純度を測定するためには ２８２ｎ−が用いられている） 保持時間：１０．７分 を用いた高圧液体クロマトグラフィーによって検定することによりモニターする 。

分析用クロマトグラフィー法で当業者に知られているように、前記の各パラメー ターは使用するカラムの性質および状態によって変更することができる。

以下の例ではＰｕｒｏｌ　ｉ　ｔｅ＾４２５樹脂が用いられているが、それは強 塩基性陰イオンゲルであって、例えばメツシュサイズが１００であるＤｏｖｅｘ 　ＩＸ２と同等物である。この樹脂はクロリド形態で購入され、下記のようにし てボレート形態に変換される。

Ｐｏｒｏ１ｉｔｅ＾４２５（クロリド）樹脂はカラムに充填され、１５〜■６ベ ツド容量の約０．７Ｍ　ＫＪ４０ｉ溶液の濾過によりボレート形態に変換される 。四ホウ酸カリウムを温（６０℃）脱イオン水中に溶解し次いで得られた溶液を 室温に冷却するのが最も好都合である。過剰のボレートは、全溶解固形物のメー ターが溶出物について０．００となるまで脱イオン水（７〜１０ベツド容量）を 用いてカラムから洗い落とす。次にこのカラムを脱イオン水で逆洗浄して微細物 を除去し、使用に供する。

以下の鋼中、“ベッド容量（ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ）“の表現は水中に懸濁した 新樹脂の懸濁液を充填し、沈降のために約１時間放置した後のカラム中に存在す る樹脂の見かけ上の容量を意味する。この後の言及は全てこの容量を意味する。

Ｉ’ｏｒｏｌｉｔｅ＾４２５はクロリド形態で供給されるが、ボレート形態への 変換それに続（すすぎおよびバックフラッシングそして最終的には１時間の沈降 によってベッド容量が約２０％増加する。

例 １９７５年１２月２日発行の米国特許第３．９２３．７８９号明細書に記載の方 法に従って、ベントスタチンを含有するストレブトミセスアンチビオクスＮＲＲ Ｌ　３２３８の発酵培養液の生産ロットを調製する。代表的な実験においては発 酵培養液５０，０ＯＯＬをｐｉｇ、　５に調整し、＋１５℃もしくは＋１５℃以 下で約２０時間貯蔵し次いでセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）　５４５を用いて濾過す る。冷濾液をｐＨ６，０に調整し、あらかじめ冷（約１５℃）水で調製しておい た５、　００ＯＬのＤｏｗｅｘ　５０Ｘ４（ＮＨ４つを含有するカラムに通す。

次いでこのＤｏｖｅｘ　５０樹脂を水洗しそして０．１Ｍ水酸化アンモニウム次 に０．２Ｍ水酸化アンモニウムで溶離する。この溶離工程およびその後の単離お よび精製の各工程中、操作の進行は前記のＨＰＬＣによりモニターする。主要量 のベントスタチンを含有する水酸化アンモニウム溶離液をプールし、真空中５０ ℃より低い温度で２５ＯＬに濃縮する。

沈殿 前記の黒ずんだ粘稠性濃縮物の５ＯＬアリコートを３Ａエタノール５００Ｌおよ びアセトン２５０Ｌとともに撹拌し次いで約２４時間放置する。上澄み液を黒ず んだタール状の残留物から慎重に除去し、Ｃｅ１ｉｔｅ　５４５コーテイングの フィルターで濾過し次いで２８℃より低い温度で真空中において２０Ｌに濃縮す る。

クロマトグラフィー 前記の黒色濃縮物（２０Ｌ）を前述のようにして調製したＰｕｒｏｌｉｔｅＡ４ ２５（ボレート）　１３５Ｌを含有するカラムに適用する。充填物をカラムに通 して、樹脂上に保持されている多量の色を除去する。次に樹脂を７ベツド容量の 脱イオン水で溶離する。約１ベツド容量の初留の後に溶出物のｐｎは急に上昇し 、黄色が観察される。樹脂に適用したベントスタチンの約９０％が次の３ベツド 容量中に溶出される。ベントスタチン富化のフラクションをプールし、あらかじ めエタノール水溶液で洗浄したＤｉａｉｏｎ　５ｅｐａｂｅａｄｓ　１２０Ｌを 含有するカラムに適用し次いで完全に水洗する。ベントスタチン仕込みの全ての 適用後に５ｅｐａｂｅａｄ樹脂を３〜４ベツド容量の脱イオン水で洗浄し次いで エタノール−水（１０：　９０　ｗ／ｖ）で溶離する。１ベツド容量の初留の後 にベントスタチン仕込現し始め、次の２．５〜３．０ベツド容量で本質的には完 全に溶離される。主要量のベントスタチンを含有するフラクションをプールし、 真空中で濃縮して１２〜１３％Ｗ／Ｗのベントスタチン溶液が得られる。この濃 縮物を木炭（ベントスタチンを基準にして５％Ｗ／Ｗ）で処理し次いでＣｅ１ｉ ｔｅ　５４５で濾過し次に０．４５μおよび０．２２μの各膜フィルターで濾過 する。

結晶化 最終濾液を真空中で濃縮して６０％ベントスタチン（ｗ／ｗ）含有スラリーを得 、それにｌＯ容量（水含量の計算値に基づいて）のメタノールを加える。得られ た懸濁液を０℃で２時間撹拌し、固形生成物を濾過により集め、メタノールで洗 浄し次いで５０℃で２４時間乾燥する。

ＩＴＰＬＣ分析はこの生成物がベントスタチンのＣ−８エピマー１．１％の不純 物を含有するベントスタチンであることを示した。この物質を、１．２〜１．５ 部の熱（８２℃）水中に溶解し次に撹拌下１０容量のメタノールで希釈すること によって再結晶する。得られた混合物をそのまま放置して冷却させ、０℃で２時 間冷却し次いで濾過する。集めた固形物をメタノールで洗浄し、５０℃で真空乾 燥して９９．７％より大きな純度を有するベントスタチン６４８．５　ｇが得ら れる。この最終生成物は発熱物質を含まず、そしてＡｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、２８４　：　２ｌ−２９（１９７７）に報告されている、相当す るベントスタチンスペクトルに一致する紫外、赤外およびＮＭＲの各スペクトル を示す。

国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ショーウォーター、ハワード・ダニエル・ホリス アメリカ合衆国ミシガン州　４８１０３．アンアーバー、ランプ　ライタードラ イブ３５７８（７２）発明者　エドマンズ、コリン・ラースイギリス国グウエン ト、アバーガベニー。

ロウアーカースル　ストリート２１

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．粗濃縮物を強塩基性ボレート陰イオン交換樹脂に適用し次にＳｅｐａｂｅａ ｄｓＳＰ２０７の活性ベッドまたはその同等物に適用しそしてベントスタチン含 有フラクションを集めることからなる、クロマトグラフィー手法での粗濃縮物か らのベントスタチンの単離方法。
2. ２．粗濃縮物を適当な溶媒または溶媒混合物で希釈し、濾過し次にベントスタチ ン含有濾液を濃縮する請求項１記載の方法。
3. ３．溶媒または溶媒混合物がアセトンおよびエタノールである請求項２記載の方 法。
4. ４．陰イオン交換樹脂が第４アンモニウム官能基を有する請求項３記載の方法。
5. ５．陰イオン交換樹脂がボレート陰イオンに変換されたＰｕｒｏｌｉｔｅＡ４２ ５（クロリド）である請求項４記載の方法。
6. ６．集められたベントスタチンフラクションを再結晶によりさらに精製する請求 項５記載の方法。