Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych aminoglikozydów 2-dezoksystreptaminy o ogólnym wzorze 1, w którym R1 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla, R2 oznacza grupe aminowa lub hydroksylowa, jeden 5 z podstawników R3 i R4 oznacza atom wodoru, pod¬ czas gdy drugi oznacza grupe glikozylowa, przy czym gdy R3 oznacza grupe glikozylowa, wówczas jest to grupa o wzorze 2, a gdy R4 oznacza grupe glikozylowa, to jest to grupa o wzorze 3, a n ozna- i° cza liczbe 1, 2 albo 3, jak równiez sposób wytwa¬ rzania farmakologicznie dopuszczalnych soli addy¬ cyjnych tych zwiazków z kwasami.. Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku maja cenne wlasciwosci przeciwbakteryjne. 15 Liczne aminoglikozydy 2-dezoksystreptaminy wy¬ stepujace w przyrodzie maja trójpierscieniowa bu¬ dowe o wzorze 4, w którym pierscien A oznacza pierscien heksopiranozy majacy grupe aminowa w pozycji 2' i/lub 6', pierscien B oznacza grupe 20 2-dezoksytreptaminy, zas trzeci pierscien C jest po¬ laczony z pierscieniem B w pozycji 5 lub 6 za po¬ moca wiazania glikozydowego i stanowi grupe gli¬ kozylowa, zas w drugiej z tych pozycji znajduje sie grupa hydroksylowa. / 25 Nowe zwiazki bakteriobójcze wytwarzane spo¬ sobem wedlug wynala;zku sitanowia aminoglikozydy 2-dezoksystreptaminy z podstawnikiem |3-hydroksy- -co-aminoalkilowym przy grupie aminowej w pozy¬ cji 1 i grupa glikozylowa przylaczona w pozycji 5 30 lub 6 pierscienia B streptaminy. Te zwiazki sa sku¬ teczne przy zwalczaniu zakazen bakteriami gram- -dodatnimi lub gram-ujemnymi, równiez w prze¬ wodzie moczowym zwierzat i ludzi, przy czym sa one korzystniejsze niz znane aminoglikozydy 2-de¬ zoksystreptaminy z nie podstawiona grupa amino¬ wa w pozycji 1 pierscienia B, np. takie jak wyste¬ pujace w przyrodzie kanamycyny A i B, neomycy¬ ny i rybostamycyna.Okreslenie „rodnilk alkilowy o 1—4 atomach wegla" oznacza rodniki alkilowe majace lancuch prosty lub rozgaleziony. / Szczególna grupe zwiazków wytwarzanych spo¬ sobem wedlug wynalazku stanowia zwiazki o wzo¬ rze 1, w którym R1 oznacza atom wodoru, a n ozna¬ cza liczbe 1 lub 2. Korzystne wlasciwosci maja te zwiazki o wzorze 1, w którym R3 oznacza atom wodoru, a R4 oznacza grupe o wzorze 4, to jest pochodne kanamycyny A i B. Równiez cenne wla¬ sciwosci maja zwiazki zawierajace grupe p-hydro- ksy-co-aminoalkilowa przy atomie azotu w pozycji 1 majaca konfiguracje (S), a n oznacza liczbe 2 lub 3, zas R1 korzystnie oznacza atom wodoru lub rod¬ nik metylowy. Szczególnie cenne wlasciwosci maja zwiazki takie l-N-[(S)-4-amino-2-hydroksybutylo]- -kanamycyna A i l-N-[(S)-5-amino-2-hydroksypen- tylo]-kanamycyna A.Farmakologicznie dopuszczalnymi solami addy¬ cyjnymi zwiazków o wzorze 1 sa sole z kwasami majacymi farmakologicznie dopuszczalny anion, ta-99 933 kimi jak kwas solny, bromowodorowy, jodowodo- rowy, siarkowy, fosforowy, octowy, maleinowy, fu¬ marowy, szczawiowy, mlekowy, winowy, cytrynowy, glikonowy, sacharowy, p-toluenosulfonowy i we¬ glowy.Sposobem wedlug wynalazku zwiazki o wzorze 1, w którym wszystkie symbole maja wyzej podane znaczenie, wytwarza sie przez redukcje zwiazków o ogólnym wzorze 5, w którym R1, R2, R3, R4 i n maja wyzej podane znaczenie, a X oznacza grupe CH2 lub CO. Redukcje prowadzi sie w odpowiednim srodowisku tak aby spowodowac zredukowanie amidowego wiazania przy atomie azotu w pozycji 1 oraz zredukowac podstawnik X, jezeli oznacza on grupe CO.Przed rozpoczeciem procesu redukcji mozna ewentualnie przeprowadzac zwiazek wyjsciowy o wzorze 5 w jego sól addycyjna, co czyni go latwiej rozpuszczalnym w organicznych rozpuszczalnikach.Na przyklad, zwiazek o wzorze 5 rozpuszcza sie w nadmiarze bezwodnego kwasu trójfluorooctowego w temperaturze wynoszacej przewaznie od 0°C do temperatury pokojowej, po czym nadmiar kwasu usuwa sie odparowujac roztwór do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymana sól rozpusz¬ cza sie w bezwodnym, obojetnym rozpuszczalniku organicznym, np. takim jak czterowodorofuran lub dwumetoksyetan i traktuje srodkiem redukujacym, np. boroetanem, korzystnie dodawanym w postaci roztworu w czterowodorofuranie. Redukcje prowa¬ dzi sie zwykle stosujac nadmiar srodka redukuja¬ cego i w temperaturze od pokojowej do tempera¬ tury wrzenia mieszaniny, w zaleznosci od rodzaju skladników reakcji i rozpuszczalnika. Jezeli stosuje sie zwiazek o wzorze 5, w którym X oznacza grupe CO, to srodek redukujacy nalezy dodac w ilosci dostatecznej do zredukowania grupy amidowej i grupy karbonylowej. Jezeli redukcje prowadzi sie w czterowodorofuranie w temperaturze 50°C i sto¬ sujac nadmiar boroetanu, to reakcja ta dobiega konca w ciagu 24 godzin.Produkt wyosobnia sie korzystnie dodajac wody, w celu rozlozenia nie przereagowanego boroetanu i nastepnie odparowuje organiczny rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem. Wartosc pH pozo¬ stalego roztworu wodnego doprowadza sie do 5 i surowy produkt oczyszcza znanymi sposobami, np. metoda chromatografii.Liczne zwiazki o wzorze 5, w którym X oznacza grupe CH2, sa znanymi antybiotykami i np. N-l-(4- -amino-3-hydroksybutyrylo)-kanamycyna A, znana i'.-od' nazwa BB-K8, jest omówiona w opisie paten¬ towym Stanów Zjedn. Ameryki nr 3 781 268. Przy¬ klady innych zwiazków sa podane w opisach pa¬ tentowych Stanów Zjedn. Ameryki nr nr 3781268, 3541078 i 3860674 oraz w opisach patentowych RFN DOS nr nr 2350203 i 2322576. Pochodne l-N-(5-ami- no-2-hydroksywalerylo) oraz l-N-(3-amino-2-hydro- ksypropionylo)-kanamycyny A i B sa opisane w opisie patentowym Rep. Fed. Niemiec DOS nr 2408866 i w J. Antibioties (1974), 27, 851. Pochod¬ ne 6-N-alkilowe sa znane z opisu patentowego Rep.Fed. Niemiec DOS nr 2350169 i z J. Antibioties, (1975), 28, 483.Zwiazki o wzorze 5, w którym X oznacza grupe CO, mozna wytwarzac przez acylowanie grupy ami¬ nowej w pozycji 1 aminoglikozydów 2-dezoksystrep- taminy metodami analogicznymi do stosowanych przy wytwarzaniu zwiazków o wzorze 5, w którym X oznacza grupe CH2, ale stosujac jako srodek acylujacy zdolna do reakcji pochodna kwasu o wzo¬ rze HOOCCH(OH) (CH2)n-iCONH2 w którym n ma wyzej podane znaczenie.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wystepuja w róznych postaciach strukturalnych i wynalazek nie jest ograniczony do sposobu wy¬ twarzania jednej z tych postaci. Zwykle pierscienie A i B znajduja sie w postaci krzeselkowej i grupy R2, OR3 i OR4 oraz grupy aminowe i hydroksylowe sa umieszczone w tej samej plaszczyznie co piers¬ cienie A i B. Poza tym, wiazanie glikozydowe pomiedzy pierscieniem heksopiranozylowym A i pierscieniem 2-dezoksystreptaminy B jest zwykle wiazaniem a wzgledem poprzedniego, zwlaszcza w przypadku zwiazków o wzorze 5 pochodzacych z wystepujacych w przyrodzie aminoglikozydów 2-dezoksystreptaminy. Poza tym, grupa (3-hydroksy- -to-aminoalkilowa przy atomie azotu w pozycji 1 moze wystepowac w konfiguracji S lub R, albo tez, zwiazek moze stanowic mieszanine obu optycznych izomerów.Ocene zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, jako srodków przeciwbakteryjnych -prowadzono in vitro oznaczajac najnizsze stezenie inhibitujace (M.I.C.) badanego zwiazku w odpo¬ wiednim srodowisku, przy którym nie wystepuje wzrost okreslonego mikroorganizmu. W praktyce, plytki agarowe zawierajace badany zwiazek w okreslonym stezeniu zaszczepia sie w zwykly sposób komórkami badanego mikroorganizmu i poszczególne plytki poddaje hodowli w tempera¬ turze 37°C w ciagu 24 godzin. Nastepnie obserwuje sie rozwój lub brak rozwoju bakterii i notuje od¬ powiednie stezenie MIC. Jako mikroorganizmy 40 stosowano szczepy Escherichia soli, Klebsiella pneumoniae, Proiteus mlirabilis, Proteus viulgaris Pseudomanas aeruginosa i Staphyloconus aureus.Wyniki prób podano w tablicy w porównaniu ze znanymi pochodnymi kanamycyny. Oczywiscie, 45 przy porównywaniu wlasciwosci nowych zwiazków z wlasciwosciami zwiazków znanych nalezy uwz¬ gledniac budowe zwiazków, mianowicie, zwiazki z przykladów I i III jako pochodne kanamycyny A nalezy porównywac z kanamycyna A, zwiazek 50 z przykladu V z kanamycyna B i zwiazek z przy¬ kladu VI z 6'-N-metylokanamycyna A.Ocene bardziej aktywnych zwiazków o wzorze 1 in vivo przeprowadzono podajac te zwiazki pod¬ skórnie myszom narazonym na dzialanie szczepu 55 Escherichia coli. Badany zwiazek podawano w sze¬ regu dawkach grupom myszy i okreslano jego aktywnosc, oznaczajac stezenie zwiazku, przy któ¬ rym uzyskuje sie 50% ochrony przed zabójczym dzialaniem Escherichia coli w ciagu 72 godzin. Dla 60 zwiazku opisanego w przykladzie I wartosc ta wy¬ nosi 3,8 mg/kg.W medycynie ludzkiej zwiazki wytwarzane spo¬ sobem wedlug wynalazku korzystnie stosuje sie w mieszaninie z farmakologicznym nosnikiem, do- 65 branym z punktu widzenia sposobu podawania.99 933 Tablica Mikroorganizm poddawany badaniom 1 1 Escherichia coli Proteus mirabilis Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Kiebsiella/ Aerobacter N Staphylococcus aureus kanamy- cyna A 2 6 6 3 3 100 6 100 1,6 100 100 50 6 3 3 50 50 50 50 3 0,8 3 50 3 0,8 0,8 6 0,8 Najnizsze kanamy- cyna B 3 1,6 1,6 1,6 1,6 100 1,6 100 0,8 100 100 12 3,1 1,6 1,6 3,1 12 12 12 1,6 0,4 0,8 12 0,8 0,2 0,2 1,6 0,4 stezenie inhibitujace MIC w mikrogramach/litr 6'-N-mety- lo kana- , mycyna A 4 '12 12 12 12 100 12 100 6 100 100 12 12 12 6 100 100 100 100 100 100 12 6 6 100 6 3 6 12 3 zwiazek z przy¬ kladu I 3 3 1,6 1,6 3 3 3 0,8 3,1 3 50 3 1,6 3 0,8 0,8 0,8 0,8 1,6 1,6 1,6 1,6 0,8 1,6 1,6 ¦1,6 0,4 0,4 3,1 0,8 zwiazek z przy¬ kladu III • 6 3 1,6 ¦ 1,6 1,6 3 3 3 1,6 6 6 100 3 1,6 1,6 1,6 1,6 i 1,6 1,6 1,6 1,6 3 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 0,8 0,8 3 0,8 zwiazek z przy¬ kladu V 7 3 3 3 3 6 3 6 3 6 12 6 1,6 1,6 0,8 0,8 0,8 1,6 1,6 3 1,6 1,6 1,6 1,6 3 3 1,6 <0,2 3 3 zwiazek z przy¬ kladu VI 8 6 6 6 6 6 6 6 3 i 12 6 12 6 3 3 1,6 1,6 3 3 6 3 3 3 3 3 3 12 3 0,8 6 6 Na przyklad, srodki podawane doustnie maja po¬ stac tabletek zawierajacych, jako nosnik skrobie lub laktoze, a preparaty eliksirowe lub zawiesino¬ wa moga zawierac równiez substancje zapachowe i/lub barwniki. Srodki te moga tez byc podawane pozajelitowo, np. dozylnie, domiesniowo lub pod¬ skórnie. W tym celu stosuje sie korzystnie prepa¬ raty w postaci wyjalowionych roztworów wodnych, ewentualnie zawierajacych i inne skladniki, np. sole lub glikoze, w celu otrzymania roztworów izo- tonicznych.W medycynie ludzkiej dawka dzienna zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku jest po¬ dobna do dawek znanych przeciwbakteryjnych srodków aminoglikozydowych, mianowicie 0,1—50 mg/kg przy podawaniu pozajelitowym i 10—100 mg/kg przy podawaniu doustnym. Dawki te mozna dzielic na mniejsze. Tabletki lub kapsulki zawiera¬ ja 0,1^1 g substancji czynnej i mozna \je stosowac do 4 razy dziennie, zas jednostkowe dawki do poda¬ wania pozajelitowego zawieraja 10—500 mg sub¬ stancji czynnej.Przyklad I. 150 mg l-N-[(S)-4-amino-2-hy- droksybu:tyrylo]-kanamycyny A (preparat BB-K8 opisany w opisie patentowym Stanów Zjedn. Am. nr 3781268) rozpuszcza sie w 16 ml bezwodnego kwasu trójfluorooctowego w temperaturze 0°C i roztwór odparowuje do sucha w temperaturze 2Q°C pod silnie obnizonym cisnieniem w ciagu 15 minut, otrzymujac staly produkt o konsystencji szklistej. Pozostalosc te rozpuszcza sie w 5 ml bez¬ wodnego czterowodorofuranu i w atmosferze azotu dodaje porcjami 20 ml Im roztworu boroetanu w czterowodorofuranie. Otrzymany klarowny roz-99 933 8 twór utrzymuje sie w temperaturze 50°C w ciagu 3 godzin, pozostawia w temperaturze pokojowej na okres 16 godzin i ponownie ogrzewa w temperatu¬ rze 50 °C W ciagu 3 godzin.Nastepnie rozklada sie nadmiar boroetanu, do¬ dajac ostroznie kilka kropel wody i odparowuje organiczny rozpuszczalnik pod zmniejszonym cis¬ nieniem. Pozostalosc rozpuszcza sie w 10 ml wody i alkalizuje 0,ln wodnym roztworem wodorotlenku sodowego, po czym zakwasza do wartosci pH 5 za pomoca 2n kwasu solnego. Otrzymany roztwór chromatografuje sie. na kolumnie zawierajacej 50 ml zywicznego wymieniacza jonowego Amberlite CG-50 w postaci zawierajacej jon amonowy, elu- ujac kolejno destylowana woda, w celu usuniecia nieorganicznych substancji stalych, a nastepnie wodnym roztworem wodorotlenku amonowego, zwiekszajjac stopniowo jego stezenie od 0,ln do l,0n.Frakcje zawierajace produkt (badane za pomoca chromatografii cienkowarstwowej) laczy sie i od¬ parowuje pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymu¬ jac 75 mg (50% wydajnosci teoretycznej) 1-N-[(S)- -4-amino-2-hydroksybutylo]-kanamycyny A.Produkt badany metoda cienkowarstwowa elek- ktroforezy wykazuje wartosc Rf=0,6. Jako elektro¬ lit stosuje sie mieszanine równych czesci kwasu octowego i kwasu mrówkowego, majaca wartosc pH2 i na koncach plytki o dlugosci 20 cm, pokrytej krzemionka, przyklada sie róznice potencjalów 900 V na okres 45 minut. Nastepnie plytke suszy sie, zrasza roztworem podchlorynu III-rzed. butylu w cykloheksanie, ponownie suszy, chlodzi i rozwija za pomoca roztworu skrobi i jodku potasu. W tych warunkach produkt wyjsciowy BB-K8 ma wartosc Rf=l,0 i kanamycyna A ma wartosc Rf=0,9.Badanie widma produktu w podczerwieni po¬ twierdza zanik amidowego pasma absorpcyjnego, wystepujacego przy badaniu BB-K8 przy dlugosci fali 1635 om-1. Skrecalnosc optyczna produktu [ duktu wykazuje wyrazny pik P+l przy m/e 572.Próbke produktu przeprowadza sie w lotna po¬ chodna piecio-N-metylo-osmio-O-trójmetylosililowa dzialajac bezwodnikiem octowym w metanolu , w temperaturze pokojowej w ciagu 24 godzin i na¬ stepnie poddajac reakcji z mieszanina 2 : 1 szescio- metylodwusilazanu i trójmetylochlorosilazanu w temperaturze pokojowej w ciagu 24 godzin. Ciezar molowy znaleziony wynosi M+1357 i wzorowi C56H119N5Oi^Si8 odpowiada równiez M+1357.Analiza Wzór C22H^5N5012'21/2H.2COs Obliczono: 40, 5% C, 6,9% H, 9,6% N Znaleziono: 40, 1% C, 6,7% H, 9,6% N.Przyklad II. 100 mg butyrozyny w postaci wolnej zasady, to jest l-N-[(S)-4-amino-2-hydroksy- butyrylo]-rybostamycyny, rozpuszcza sie w 5 ml bezwodnego kwasu trójfluorooctowego w tempera¬ turze pokojowej i nadmiar kwasu usuwa przez od¬ parowanie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac sól z kwasem trójfluorooctowym o kon¬ systencji szklistej. Produkt ten rozpuszcza sie w 10 ml bezwodnego eteru dwumetylowego glikolu dwuetylowego, dodaje 10 ml Im roztworu boroe¬ tanu w czterowodorofuranie i otrzymany klarowny roztwór pozostawia na okres 18 godzin w tempera¬ turze pokojowej.Do otrzymanego roztworu dodaje sie dalsze 5 ml roztworu boroetanu i otrzymuje w temperaturze pokojowej w ciagu dalszych 24 godzin. Nadmiar boroetanu rozklada sie dodajac ostroznie kilka kro¬ pel wody i odparowuje organiczny rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 50°C.Pozostalosc alkalizuje sie kilkoma kroplami 2n wo¬ dorotlenku sodowego i zakwasza do wartosci pH 5 za pomoca 2n kwasu solnego. Produkt wyosobnia sie chromatografujac w sposób opisany w przy- kladzie I, frakcje zawierajace produkt laczy i od¬ parowuje pod zmniejszonym cisnieniem otrzymujac 1-N-[(S)-4-amino-2-hydroksybutylo]-rybostamycyne, której wartosc Rf okreslona metoda cienkowarst¬ wowej elektroforezy wynosi 0,5; podczas gdy war- tosc Rf ustalona w takich samych warunkach dla butyrozyny wynosi 1,0.Przyklad III. 0,35 g d-N-[(S)-5-amino-2-hy- droksywalerylo]-kanamycyny A przeprowadza sie w sól z kwasem trójfluorooctowym, redukuje i chromatografuje sposobem opisanym w przykla¬ dzie I, otrzymujac 0,12 g (35% wydajnosci teore¬ tycznej) l-N-[(S)-5-amino-2-hydroksypentylo]-kana¬ mycyny A. Wartosc Rf produktu ustalona metoda cienkowarstwowej elektroforezy wynosi 0,7, podczas gdy wartosc Rf produktu wyjsciowego wynosi 1,0.Przyklad IV. 0,15 g l-N-(3-amino-3-hydro- ksypropionylo)-kanamycyny A redukuje sie w spo¬ sób opisany w przykladzie I, otrzymujac 0,04 g (27% wydajnosci teoretycznej) l-N-(3-amino-2-hy- droksypropylo)-kanamycyny A. Wartosc Rf pro¬ duktu ustalona metoda cienkowarstwowej elektro¬ forezy wynosi 0,6 podczas gdy Rf produktu wyjs¬ ciowego wynosi 1,0. 40 Przyklad V. l-N-[(S)-4-amino-3-hydroksy- butyrylo]-kanamycyne B redukuje sie w sposób opisany w przykladzie 1, otrzymujac l-N-[(S)-4- -amino-2-hydroksybutylo]-kanamycyne B.Przyklad VI. 6'-N-metylo-l-N-[(S)-4-amino- 45 -2-hydroksybutyrylo]-kanamycyne A, otrzymana w sposób opisany przez H. Umezawa i in. J. Anti- biotics, 28, 483 (1975), redukuje sie w sposób opisany w przykladzie I, otrzymujac 6'-N-metylo-l-N-[(S)- -4-amino-3-hydroksybutylo]-kanamycyne A, której 50 wartosc Rf oznacza metode cienkowarstwowej elek¬ troforezy wynosi 0,7. Wartosc Rf produktu wyjs¬ ciowego okreslona w takich samych warunkach wynosi 1,0 a wartosc Rf kanamycyny A wynosi 1,03. 55 PL