PL234825B1

PL234825B1 - Sposób otrzymywania 7-O-β-D-glukopiranozylo-3’,4’,5- trihydroksyflawanonu

Info

Publication number: PL234825B1
Application number: PL422142A
Authority: PL
Inventors: Sandra Sordon; Jarosław Popłoński; Tomasz Tronina; Ewa Huszcza
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2017-07-07
Publication date: 2020-04-30
Also published as: PL422142A1

Abstract

Zgłoszenie dotyczy sposobu otrzymywania 7-O-ß-D-glukopiranozylo-3',4',5-trihydroksyflawanonu, o wzorze 2, na drodze transformacji mikrobiologicznej, przy użyciu systemu enzymatycznego grzybów z gatunku Absidia coerulea. Jako substrat stosuje się 3',4',5,7-tetrahydroksyflawanon o wzorze 1. Przedmiotem zgłoszenia jest także sam związek będący przedmiotem wynalazku, który jest biologicznie czynny i może mieć zastosowanie w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania 7-0-^-D-glukopiranozylo-3',4',5-trihydroksyflawanonu o wzorze 2 przedstawionym na rysunku.

Związek ten jest biologicznie czynny, posiada m.in. aktywność przeciwutleniającą [H. Yao, Z.X. Liao, Q. Wu, G.Q. Lei, Z.J. Liu, D.F. Chen, J.K. Chen, T.S. Zhou: „Antioxidative flavanone glycosides from the branches and leaves of Viscum coloratumi, Chem. Pharm. Bull. 2006, 54, 133-135; Q. Hu, D. D. Zhang, L. Wang, H. Lou, D. Ren: „Eriodictyol-7-0-glucoside, a novel Nrf2 activator, confers protection against cisplatin-induced toxicity”, Food and Chemical Toxicology, 2012, 50, 1927-1932] i może mieć zastosowanie w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym.

W literaturze znany jest 7-0-^-D-glukopiranozylo-3’,4’,5-trihydroksyflawanon naturalnie występujący np. w jemiole [H. Yao, Z.X. Liao, Q. Wu, G.Q. Lei, Z.J. Liu, D.F. Chen, J.K. Chen, T.S. Zhou: „Antioxidative flavanone glycosides from the branches and leaves of Viscum coloratumi”, Chem. Pharm. Bull. 2006, 54, 133-135] i pszczelniku [Q. Hu, D. D. Zhang, L. Wang, H. Lou, D. Ren: „Eriodictyol-7-O-glucoside, a novel Nrf2 activator, confers protection against cisplatin-induced toxicity, Food and Chemical Toxicology, 2012, 50, 1927-1932].

Znana jest metoda otrzymywania 7-0-^-D-glukopiranozylo-3’,4’,5-trihydroksyflawanonu na drodze transformacji mikrobiologicznej 3',4',5,7-tetrahydroksyflawanonu w kulturze Escherichia coli ze sklonowanym genem roślinnej glukozylotransferazy pochodzącej z rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) [J.H, Kim, B.G. Kim, Y. Park, J.H. Ko, C.E. Lim, Y. Lim, J.H. Ahn: „Characterization of flavonoid 7-0-glucosyltransferase from Arabidopsis thaliana, Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006, 70, 1471-1477].

Nie jest znana natomiast metoda otrzymywania tego związku na drodze transformacji mikrobiologicznej przy użyciu systemu enzymatycznego Absidia coerulea.

Szczep Absidia coerulea AM 93 zdeponowany jest w kolekcji mikroorganizmów Katedry Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu (ul. C.K. Norwida 25, 50-375 Wrocław).

Znane są procesy biotransformacji przy udziale grzybów strzępkowych z gatunku Absidia coerulea. Opisano m. in. jego zdolność do glikozylacji związków flawonoidowych. W wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w żywych komórkach kultury Absidia coerulea otrzymano szereg związków. Z opisu patentowego PL 223 441 znana jest metoda otrzymywania 4'-O-3-D-glukopiranozylo-4,2'-dihydroksy-6'-metoksy-3'-prenylo-a,3-dihydrochalkonu, z opisu PL 226315 znany jest sposób otrzymywania 2'-O-3-D-glukopiranozylo-1,2,a,3-tetrahydroksantohumolu C, z PL 223446 - 4'-O-3-D-glukopiranozyloksantohumolu C, opis PL 222175 ujawnia otrzymywanie 4'-O-3-D-glukopiranozylo-3-[1'-hydroksyizopropylo]-4,2'-dihydroksy-6'-metoksy-3'-prenylo-a,3-dihydrochalkonu, opis PL 222731 wskazuje na otrzymywanie mieszaniny 7-O-3-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4'-metoksyizoflawonu i 5-O-3-D-glukopiranozylo-7-hydroksy-4'-metoksyizoflawonu, natomiast PL 210084 opisuje otrzymywanie 4'-O-3-D-glukozylo-2',4-dihydroksy-6'-metoksy-3'-prenylochalkonu.

Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania 7-0-^-D-glukopiranozylo-3',4',5-trihydroksyflawanonu, polegający na tym, że substrat, którym jest 3',4',5,7-tetrahydroksyflawanon, poddaje się transformacji mikrobiologicznej, w wyniku czego otrzymuje się 7-0-^-D-glukopiranozylo-3',4',5-trihydroksyflawanon. Grzyby strzępkowe z gatunku Absidia coerulea namnaża się w płynnym podłożu mikrobiologicznym, przy ciągłym mieszaniu reagentów, w temperaturze 12-40°C. Następnie do narośniętej hodowli dodaje się substrat i dalej prowadzi proces, aż do całkowitego zużycia substratu. Po zakończeniu transformacji roztwór transformacyjny ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą, oddziela frakcję organiczną, osusza bezwodnym siarczanem magnezu, odparowuje rozpuszczalnik i tak otrzymany surowy produkt oczyszcza się za pomocą technik chromatograficznych.

Korzystnie także jest, gdy transformację prowadzi się szczepem Absidia coerulea AM 93.

Korzystnie jest, gdy reakcję prowadzi się w temperaturze 26°C.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w żywych komórkach kultury Absidia coerulea następuje reakcja glukozylacji substratu.

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie, w łagodnych warunkach 7-0-^-D-glukopiranozylo3',4',5-trihydroksyflawanonu, jako głównego produktu reakcji w kulturze Absidia coerulea. Wydajność reakcji osiąga poziom ponad 29%.

Wynalazek jest bliżej objaśniony w przykładzie wykonania.

PL 234 825 B1

P r z y k ł a d 1. Do kolby o pojemności 300 cm³, w której znajduje się 100 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 3 g glukozy i 1 g aminobaku na 1 dm³ wody destylowanej, wprowadza się grzyby strzępkowe Absidia coerulea AM 93. Po 6 dniach wzrostu drobnoustrojów w temperaturze 26°C i przy ciągłym wstrząsaniu, dodaje się 15 mg 3',4',5,7-tetrahydroksyflawanonu, o wzorze 1, rozpuszczonego w 1,5 cm³dimetylosulfotlenku. Transformację prowadzi się przy ciągłym wstrząsaniu przez 10 dób. Po tym czasie hodowlę zakwasza się 1-molowym kwasem chlorowodorowym do pH 4,5. Następnie, uzyskany roztwór transformacyjny ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Uzyskuje się 14 mg surowego ekstraktu, który oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaninę chloroform : metanol w stosunku objętościowym 7:1. Po oczyszczeniu otrzymuje się 7 mg 7-O-^-D-glukopiranozylo-3',4',5-trihydroksyflawanonu, o wzorze 2 z wydajnością 29,9%.

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi:

1H NMR (600 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 2,72 (1H, dd, J=3,0; 16,9 Hz, H-3aeq), 2,73 (1H, dd, J=3,0; 16,9 Hz, H-3beq), 3,14 (1H, m, H-4), 3,20 (1H, m, H-2), 3,25 (1H, m, H-3), 3,37 (1H, m, H-5), 3,26 (1H, m, H-3), 3,44 (1H, m, Ha-6''), 3,65 (1H, m, Hb-6), 4,95 (1H, d, J=7,7 Hz, H-1a), 4,98 (1 H, d, J=7,7, H-1''b), 5,42 (1H, dd, J=3,0; 12,4 Hz, H-2a), 5,43 (1H, dd, J=3,0; 12,4 Hz, H-2b), 6,12 (1H, m, H-6), 6,14 (1H, m, H-8), 6,88 (1H, m, H-2'), 6,72 (2H, m, H-5'a, H-6'a), 6,75 (2H, m, H-5'b, H-6'b), ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-de) δ (ppm): 42,21 (C-3), 60,57 (C-6), 69,51 (C-4), 73,05 (C-2), 76,34 (C-3”), 77,09 (C-5''a), 77,12 (C-5''b), 78,77 (C-2a), 78,81 (C-2b), 95,43 (C-8), 96,45 (C-6), 99,49 (C-1''a), 99,61 (C-1''b), 103,29 (C-10), 114,63 (C-2'), 115,51 (C-5'), 118,04 (C-6'), 129,10 (C-1'), 145,41 (C-3' lub C-4'), 146,05 (C-3' lub C-4'), 162,75 (C-9a), 162,80 (C-9b), 165,22 (C-5a), 165,31 (C-5b), 166,04 (C-7), 197,27 (C-4).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania 7-O-^-D-glukopiranozylo-3',4',5-trihydroksyflawanonu na drodze mikrobiologicznej transformacji substratu, znamienny tym, że grzyby z gatunku Absidia coerulea namnaża się w płynnym podłożu mikrobiologicznym, charakterystycznym dla grzybów, przy ciągłym mieszaniu reagentów, w temperaturze od 12 do 40°C, po czym po upływie od 3 do 7 dni, do narośniętej hodowli dodaje się substrat, którym jest 3',4',5,7-tetrahydroksyflawanon o wzorze 1 i dalej prowadzi się proces, aż do całkowitego zużycia substratu, po czym po zakończeniu transformacji roztwór transformacyjny ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą, oddziela frakcję organiczną, odwadnia, odparowuje rozpuszczalnik i tak otrzymany surowy produkt oczyszcza się za pomocą technik chromatograficznych, w wyniku czego otrzymuje się czysty produkt, którym jest 7-O-^-D-glukopiranozylo-3',4',5-trihydroksyflawanon o wzorze 2.
2. Sposób według, zastrz. 1, znamienny tym, że grzybem z gatunku Absidia coerulea jest szczep Absidia coerulea AM93.
3. Sposób według, zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 26°C.