PL222731B1

PL222731B1 - Sposób otrzymywania 7-O-ß-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4'-metoksyizoflawonu i 5-O-ß-D-glukopiranozylo-7-hydroksy-4'-metoksyizoflawonu

Info

Publication number: PL222731B1
Application number: PL407699A
Authority: PL
Inventors: Sandra Sordon; Jarosław Popłoński; Ewa Huszcza
Original assignee: Univ Przyrodniczy We Wrocławiu
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2014-03-28
Publication date: 2016-08-31
Also published as: PL407699A1

Description

(11) 222731 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 407699 (51) Int.Cl.

C12P 19/60 (2006.01) C07H 17/07 (2006.01) C12R 1/65 (2006.01)

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 28.03.2014

Sposób otrzymywania 7-O-B-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4'-metoksyizoflawonu i 5-O-B-D-glukopiranozylo-7-hydroksy-4'-metoksyizoflawonu

	(73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 16.02.2015 BUP 04/15	(72) Twórca(y) wynalazku:
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	SANDRA SORDON, Komprachcice, PL JAROSŁAW POPŁOŃSKI, Szklarska Poręba, PL EWA HUSZCZA, Wrocław, PL
31.08.2016 WUP 08/16	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Olszewska

PL 222 731 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób otrzymywania mieszaniny 7-O-j6-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4’-metoksyizoflawonu o wzorze 2 i 5-O-j6-D-glukopiranozylo-7-hydroksy-4’-metoksyizoflawonu o wzorze 3, przedstawionych na rysunku.

Wynalazek może mieć zastosowanie w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym, zwłaszcza do otrzymywania składnika preparatów przeciwnowotworowych.

W literaturze znany jest 7-O-j6-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4’-metoksyizoflawon naturalnie występujący w koniczynie łąkowej [Xian-guo He, Long-ze Lin, Li-zhi Lian: Analysis of flavonoids from red clover by liquid chromatography-elektrospray mass spektrometry, Journal of Chromatography A, 1996, 755, 127-132] i ciecierzycy [Shuhui Zhao, Linping Hang, Peng Gao, Zhiyu Shao: Isolation and characterisation of the isoflavones from sprouted chickpea seeds, Food Chemistry, 2009, 114, 869-873; P. C. Stevenson, N. C. Veitch, The distribution of isoflavonoids in Cicer, Phytochemistry, 1998, 48, 995-1001].

Znana jest metoda otrzymywania 7-O-j6-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4’-metoksyizoflawonu na drodze syntezy chemicznej przebiegającej z wydajnością 52% [P. Lewis, S. Kaltia, K. Wahala; The phase transfer catalysed synthesis of isoflavone-O-glucosides, Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1, 1998, 2481-2484].

W literaturze nie jest znany 5-O-j6-D-glukopiranozylo-7-hydroksy-4’-metoksyizoflawon oraz sposób otrzymywania tego związku w mieszaninie z 7-O-j6-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4’-metoksyizoflawonem.

Budowa chemiczna otrzymanych składników mieszaniny wskazuje na ich aktywność biologiczną oraz ich potencjalne zastosowanie w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym.

Substrat 5,7-dihydroksy-4’-metoksyizoflawon o wzorze 1, z którego na drodze mikrobiologicznej transformacji pozyskuje się mieszaninę 7-O-j6-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4’-metoksyizoflawonu i 5-O-j6-D-glukopiranozylo-7-hydroksy-4’-metoksyizoflawonu posiada aktywność przeciwnowotworową, przeciwzapalną i przeciwcukrzycową [R. Harini, M. Ezhumalai, K. V. Pugalendi: Antihyperglycemic effect of biochanin A, a soy isoflavone, on streptozotocin- diabetic rats, European Journal of Pharmacology, 2012, 89-94].

Otrzymane składniki mieszaniny posiadają podobne właściwości, zaś poprzez reakcję glikozylacji na drodze której powstały, są lepiej biodostępne, dzięki czemu zwiększa się ich użyteczność.

7-O-j6-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4’-metoksyizoflawon, będący glikozydem 4’,5,7-trihydroksyizoflawonu, o budowie chemicznej bardzo zbliżonej do produktów będących przedmiotem wynalazku, wykazuje podobne właściwości biologiczne jak 4’,5,7-trihydroksyizoflawon. Jednakże jego biodostępność jest zdecydowanie większa w stosunku do 4’,5,7-trihydroksyizoflawonu. Udowodniono, że 7-O-β-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4’-metoksyizoflawon jest bardziej przyswajalny po podaniu doustnym niż 4’,5,7-trihydroksyizoflawon [Suk Hyung Kwon, Myung Joo Kang, Jin Seo Huh, Kyung Wook Ha, Jeong Rai Lee, Sang Kil Lee, Bong Sang Lee, In Hee Han, Min Suk Lee, Min Won Lee, Jaehwi Lee,Young Wook Choi: Comparison of oral bioavailability of genistein and genistin in rats, International Journal of Pharmaceutics, 2007,148-154].

Istotą nowego sposobu jest to, że na drodze reakcji mikrobiologicznej transformacji substratu, którym jest 5,7-dihydroksy-4’-metoksyizoflawon o wzorze 1, jednocześnie otrzymuje się w mieszaninie znany 7-O-j6-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4’-metoksyizoflawon i nowy 5-O-j6-D-glukopiranozylo-7-hydroksy-4’-metoksyizoflawon, w taki sposób, że grzyby z gatunku Absidia coerulea, namnaża się w płynnym podłożu mikrobiologicznym, charakterystycznym dla grzybów, przy ciągłym mieszaniu reagentów, w temperaturze 12-40°C. Następnie, po upływie od 3 do 7 dni, do narośniętej hodowli dodaje się substrat i dalej prowadzi się proces, aż do całkowitego zużycia substratu. Po zakończeniu tran sformacji roztwór transformacyjny ekstrahuje się rozpuszczalnikami organicznymi niemieszającymi się z wodą, oddziela frakcję organiczną, osusza bezwodnym siarczanem magnezu, odparowuje rozpus zczalnik i tak otrzymany surowy produkt oczyszcza się za pomocą technik chromatograficznych.

Korzystnie jest, gdy proces namnażania drobnoustroju prowadzi się w temperaturze 26°C.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w żywych komórkach kultury Absidia coerulea, następuje reakcja glikozylacji w substracie.

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie, w łagodnych warunkach mieszaniny 7-O-j6-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4’-metoksyizoflawonu i 5-O-jS-D-glukopiranozylo-7-hydroksy-4’-metoksyizoflawonu o wzorach odpowiednio 2 i 3, jako głównych produktów reakcji w kulturze Absidia coerulea.

PL 222 731 B1

Wydajność reakcji dla 5-0-j6-D-glukopiranozylo-7-hydroksy-4’-metoksyizoflawonu wynosi 23,18%, zaś dla 7-0-j6-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4’-metoksyizoflawonu 4,64%.

Wynalazek jest bliżej objaśniony w przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d 1. Do kolby o pojemności 300 cm , w której znajduje się 100 cm sterylnej pożyw₃ ki zawierającej 3 g glukozy i 1 g aminobaku na 1 dm wody destylowanej, wprowadza się grzyby Absidia coerulea AM93. Po 4 dniach wzrostu drobnoustrojów w temperaturze 26°C i przy ciągłym wstrząsa₃ niu, dodaje się 18,33 mg 5,7-dihydroksy-4’-metoksyizoflawonu, o wzorze 1, rozpuszczonego w 0,5 cm dimetylosulfotlenku. Transformację prowadzi się przy ciągłym wstrząsaniu przez 6 dób. Następnie, uzyskany roztwór transformacyjny ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymuje się 44 mg surowego produktu, który oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaninę chloroform:metanol w stosunku objętościowym 9:1.

Po oczyszczeniu otrzymuje się 26,33 mg mieszaniny 7-0-j6-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4’-metoksyizoflawonu i 5-0-j6-D-glukopiranozylo-7-hydroksy-4’-metoksyizoflawonu, o wzorach odpowiednio 2 i 3, z wydajnością 4,64% dla 7-0-j6-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4’-metoksyizoflawonu i 23,18% dla 5-0-j6-D-glukopiranozylo-7-hydroksy-4’-metoksyizoflawonu.

Uzyskane produkty charakteryzują się następującymi danymi spektralnymi:

7-0-j6-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4’-metoksyizoflawon:

¹H NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 3,44-3,48 (1H, m, H-4”), 3,47-3,51 (1H, m, H-2”), 3,71-3,74 (1H, m, Ha-6”), 3,83 (3H, s, H-OCH3), 3,90-3,93 (1H, m, H-6”), 5,05 (1 H, m, H-1”), 6,51 (1H, d, J=2,2 Hz, H-6), 6,70 (1H, d, J=2,2 Hz, H-8), 6,98 (2H, pd, J=8,7 Hz, H-2'), 7,48 (2H, pd, J=8,7 Hz, H-1').

¹³C NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 55,75 (C-OMe), 62,40 (C-6”), 71,20 (C-4”), 74,70 (C-2”), 77,82 (C-3”), 78,37 (C5”), 95,90 (C-8), 101,15 (C-6), 101,63 (C-1”), 108,01 (C-10), 114,91 (C-3', C-5'), 124,33 (C-1'), 124,76 (C-3), 131,34 (C-2', C-6'), 155,49 (C-2), 159,23 (C-9), 161,30 (C-4'), 163,54 (C-5), 164,79 (C-7), 182,39 (C-4).

Nowy 5-0-j6-D-glukopiranozylo-7-hydroksy-4'-metoksyizoflawon:

¹H NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 3,44-3,40 (1H, m, H-4”), 3,60-3,68 (1H, m, H-2”), 3,74-3,77 (1H, m, Ha-6”), 3,82 (3H, s, H-OCH3), 3,93-3,96 (1H, m, H-6”), 4,86 (1H, m, H-1”), 6,58 (1H, d, J=2,2 Hz, H-8), 6,83 (1H, d, J=2,2 Hz, H-6), 6,95 (2H, pd, J=8,7 Hz, H-2'), 7,42 (2H, pd, J=8,7 Hz, H-1').

¹³C NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 55,73 (C-OMe), 62,54 (C-6”), 71,21 (C-4”), 74,70 (C-2”), 77,29 (C-3”), 78,60 (C5”), 98,89 (C-8), 104,47 (C-6), 104,90 (C-1”), 110,27 (C-10), 114,70 (C-3', C-5'), 125,45 (C-1'), 126,73 (C-3), 131,59 (C-2', C-6'), 153,31 (C-2), 160,88 (C-9), 161,09 (C-4'), 160,64 (C-5), 164,67 (C-7), 178,06 (C-4).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania 7-0-j6-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4'-metoksyizoflawonu i 5-0-β-ϋglukopiranozylo-7-hydroksy-4'-metoksyizoflawonu, znamienny tym, że na drodze reakcji mikrobiologicznej transformacji substratu, którym jest 5,7-dihydroksy-4'-metoksyizoflawon o wzorze 1, jednocześnie otrzymuje się w mieszaninie 7-0-e-D-glukopiranozylo-5-hydroksy-4'-metoksyizoflawon o wzorze 2 i nowy 5-0-e-D-glukopiranozylo-7-hydroksy-4'-metoksyizoflawon o wzorze 3, w taki sposób, że grzyby z gatunku Absidia coerulea, namnaża się w płynnym podłożu mikrobiologicznym, charakterystycznym dla grzybów, przy ciągłym mieszaniu reagentów, w temperaturze 12-40°C, po czym po upływie od 3 do 7 dni, do narośniętej hodowli dodaje się substrat i dalej prowadzi się proces, aż do całkowitego zużycia substratu, po czym po zakończeniu transformacji roztwór transformacyjny ekstr ahuje się rozpuszczalnikami organicznymi niemieszającymi się z wodą, oddziela frakcję organiczną, odwadnia się znanymi metodami, odparowuje rozpuszczalnik i tak otrzymany surowy produkt oczyszcza się za pomocą technik chromatograficznych, w wyniku czego otrzymuje się mieszaninę dwóch flawonów.
2. Sposób według, zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 26°C.