PL220536B1

PL220536B1 - Związek aminoalkiloglukozaminidofosforanowy

Info

Publication number: PL220536B1
Application number: PL380950A
Authority: PL
Inventors: David A. Johnson
Original assignee: Corixa Corp
Priority date: 2003-01-06
Filing date: 2004-01-06
Publication date: 2015-11-30
Also published as: HK1083593A1; JP4838706B2; CN101863930A; RU2005125050A; ES2639812T3; HK1217104A1; PT1589934E; CN101080234A; WO2004062599A2; PL380950A1; EP1589934A4; DK1589934T3; KR20110120989A; AU2004204754A1; EP2940028B1; JP2007524570A; MXPA05007295A; RU2009140730A; EP2940028A1; AU2004204754B2

Abstract

Opisuje się i zastrzega związki, które są adiuwantami i immunoefektorami. Związki zwiększają wytwarzanie się i immunoefektorami. Związki zwiększają wytwarzanie się przeciwciał u immunoizowanych zwierząt oraz pobudzają wytwarzanie cytokin i aktywują makrofagi. Opisuje się także kompozycje i sposoby stosowania związków jako adiuwantów i immunoefektorów.

Description

Przedmiotem wynalazku jest związek aminoalkiloglukozaminidofosforanowy.

Receptory typu Toll (TLR) zostały związane z silną wrodzoną odpowiedzią immunologiczną i rozpoznają one różne składniki strukturalne, które są jedynymi dla czynników chorobotwórczych. Takie oddziaływanie wprowadza układ odpornościowy w stan aktywny z krótko- i długotrwałymi skutkami. Istnieje znaczne zainteresowanie opracowaniem agonistów i antagonistów TLR, ponieważ manipulacja farmakologiczna wrodzonymi odpowiedziami immunologicznymi może prowadzić do skuteczniejszych szczepionek i nowego terapeutycznego podejścia do chorób autoimmunologicznych, atopowych, złośliwych i zakaźnych. Pierwszym produktem mikrobiologicznym, który okazał się być agonistą receptora typu Toll, był LPS, składnik błony bakteryjnej specyficzny dla bakterii gramujemnych, który aktywuje receptor 4 typu Toll (TLR-4). Chociaż LPS jest silnym środkiem immunomodulatorowym, to jego zastosowanie medyczne jest ograniczone z powodu jego nadzwyczajnej toksyczności, włącznie z wywoływaniem zespołu ogólnoustrojowej reakcji zapalnej. Biologicznie czynne, endotoksyczne, substrukturalne ugrupowanie LPS jest lipidem A, fosforylowanym glukozaminodisacharydem wielokrotnie acylowanym kwasem tłuszczowym, który służy do zakotwiczenia całej struktury w zewnętrznej błonie bakterii gramujemnych. Toksyczne działania lipidu A można złagodzić drogą selektywnej chemicznej modyfikacji lipidu A z wytworzeniem monofosforylowanych związków lipidu A (środek immunostymulujący MPL™, Corixa Corporation, Seattle, WA). Opisano sposoby wytwarzania i stosowania immunostymulującego środka MPL™ i strukturalnie podobnych związków w adiuwancie szczepionkowym, jak również inne zastosowania (patrz na przykład amerykańskie opisy patentowe nr US 4,436,727, 4,877,611,4,866,034 i 4,912,094, 4,987,237, Johnson i inni, J Med Chem 42: 46404649 (1999), Ulrich i Myers, Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell i Newman, redaktorzy, Plenum: New York, 495-524, 1995). W szczególności, te i inne referencje wykazały, że środek immunostymulujący MPL™ i podobne związki wykazywały znaczącą aktywność jako środki wspomagające, gdy stosowano je w kompozycjach szczepionek z proteinowymi i węglowodanowymi antygenami do zwiększania odporności humoralnej i/lub z udziałem komórek na antygeny i oddziaływały z receptorami typu Toll.

Na podstawie doświadczenia ze środkiem immunostymulującym MPL™ i innymi składnikami bakteryjnej ściany komórkowej opracowano rodzinę nowych syntetycznych związków, fosforanów aminoalkiloglukozaminidowych (AGP). Związki AGP oddziałują także z TLR-4 jako agoniści i antagoniści. AGP obejmują związki zarówno acykliczne, jak i cykliczne (amerykańskie opisy patentowe nr US 6,113,918 i 6,303,347, zgłoszenie patentowe nr WO 98/50399 opublikowane 12 października 1998, WO 01/34617 opublikowane 17 maja 2001, WO 01/90129 opublikowane 29 listopada 2001 i WO 02/12258 opublikowane 14 lutego 2002). Wykazano, że podobnie jak środek immunostymulujący MPL™ te związki zachowują znaczne właściwości adiuwanta, gdy komponuje się je z antygenami w kompozycjach szczepionek, a ponadto wykazują podobne albo lepsze profile toksyczności w porównaniu ze środkiem immunostymulującym MPL™. AGP wykazują także śluzówkową aktywność adiuwanta i są skuteczne także przy braku antygenu, co czyni je interesującymi związkami w zastosowaniach profilaktycznych i/lub terapeutycznych.

Inna znacząca zaleta oferowana przez AGP w porównaniu ze środkiem immunostymulującym MPL™, itp., polega na tym, że AGP można łatwo wytwarzać na skalę przemysłową metodami syntetycznymi. Ponieważ wytwarza się je syntetycznie, to AGP są wolne od śladowych zanieczyszczeń biologicznych znajdywanych w MPL™. AGP jako takie mają przewagę nad MPL jako adiuwanty szczepionkowe w pewnych układach, takich jak protokoły immunizacji pediatrycznych, w których musi być zminimalizowana gorączkotwórczość adiuwanta. Przy tym jednak, ponieważ AGP syntezuje się drogą chemiczną, to mniejsza niż optymalna trwałość związku może prowadzić do nagromadzenia produktów rozkładu, co może dać w wyniku zmienną aktywność biologiczną i trwałość od partii do partii. Z punktu widzenia rozwoju procesów GMP przy wytwarzaniu materiałów do prób klinicznych na ludziach głównym wyzwaniem jest trwałość partii i zmienność trwałości od partii do partii. Dlatego pożądane są związki, które wykazują większą aktywność biologiczną w porównaniu ze środkiem immunostymulującym MPL™, itp., oddziałują z receptorami typu Toll i/lub są optymalne przy syntezie GPL na dużą skalę. Niniejszy wynalazek jest ukierunkowany na te potrzeby, a jeszcze bardziej na dostarczenie związków modyfikowanych pod kątem większej aktywności biologicznej, trwałości ze zwiększoną odpornością na rozkład enzymatyczny i chemiczny, i/lub lepszych profili bezpieczeństwa.

PL 220 536 B1

Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze:

w którym n oznacza 1 albo 5, a R6 oznacza COOH albo CH2OPO3H2.

Korzystnie n oznacza 1.

Korzystnie n oznacza 5.

Korzystnie R6 oznacza COOH.

Związki według przedmiotowego wynalazku są przedstawicielami rodziny aminoalkiloglukozaminido-4-fosforanów (AGP). Jak opisano poniżej, związki tu opisane mają zmienne modyfikacje długości łańcuchów sześcioacylowych (pierwotne i wtórne), modyfikacje strukturalne odgałęzienia alkilowego, obejmujące ugrupowanie fosforanowe, modyfikację strukturalną obejmującą pierwotny eterolipid w położeniu C-3 cukru oraz trzy wtórne eterolipidy i/lub 6-hydroksylową grupę blokującą.

Znane chemicznie jako ro-aminoalkilo-2-amino-2-dezoksy-4-fosfono-p-D-glukopiranozydy AGP są klasą syntetycznych mimetyków lipidu A, które są związane strukturalnie z głównym biologicznie czynnym składnikiem składnika w monofosforylowym lipidzie A. W AGP cukier redukujący zastąpiono jednostką aglikonu N-[(R)-3-n-alkanoiloksytetradekanoilo]aminoalkilu. Jak w przypadku innych disacharydowych pochodnych lipidu A, dla maksymalnej aktywności biologicznej AGP zawierają sześć kwasów tłuszczowych, przy czym inaczej niż w przypadku pochodnych disacharydowych AGP zawierają konformacyjnie elastyczną β-związaną jednostkę aglikonu, która umożliwia energetycznie uprzywilejowane ścisłe upakowanie łańcuchów sześciu kwasów tłuszczowych. Uważa się, że ścisłe upakowanie sześciu kwasów tłuszczowych w układzie heksagonalnym odgrywa zasadniczą rolę w biologicznej aktywności cząsteczek typu lipidu A (Seydel i inni, Immunobiol, 187 (3-5): 191-211, 1993).

Związki według niniejszego wynalazku uważa się za przedstawicieli rodziny AGP. Te związki zawierają modyfikacje długości sześciu łańcuchów acylowych (pierwotnych i wtórnych).

W jednym z najszerszych aspektów, opisano tu związek AGP o wzorze (I):

PL 220 536 B1 w którym X jest wybrany z grupy obejmującej O i S w położeniu aksjalnym albo ekwatorialnym, Y jest wybrany z grupy obejmującej O i NH, n, m, p i q oznaczają liczby całkowite od 0 do 6, R1, R2 i R3 są takie same lub różne i oznaczają reszty acylowe kwasów tłuszczowych zawierające od 1 do około 20 atomów węgla, przy czym jeden z R1, R2 albo R3 oznacza ewentualnie wodór, R4 i R5 są takie same lub różne i są wybrane z grupy obejmującej H i metyl, R6 i R7 są takie same lub różne i są wybrane z grupy obejmującej H, hydroksyl, alkoksyl, grupę fosfonową, fosfonooksy, sulfonową, sulfooksy, aminową, merkapto, cyjanową, nitrową, formylową i karboksylową oraz jej estry i amidy, R8 i R9 są takie same lub różne i są wybrane z grupy obejmującej grupę fosfonową i H, przy czym co najmniej jeden z R8 i R9 oznacza grupę fosfonową, R10, R11 i R12 są niezależnie wybrane spośród prostych, niepodstawionych, nasyconych grup alifatycznych zawierających od 1 do 10 atomów węgla, lub jego farmaceutycznie akceptowalną sól.

W zalecanych postaciach realizacji tego aspektu

- X i Y oznaczają korzystnie atom tlenu,

- R₁, R₂ i R₃ korzystnie są normalnymi grupami acylowymi, a zwłaszcza są niezależnie wybrane spośród prostych grup C6-C10-acylowych (w szczególności nasyconych grup acylowych),

- R10, R11 i R12 oznaczają korzystnie niepodstawione, nasycone grupy alifatyczne (tj. alkil) zawierające od 1 do 10, korzystnie od 3 do 9, a zwłaszcza od 3 do 7 atomów węgla, a zwłaszcza oznaczają identyczne niepodstawione, nasycone grupy alifatyczne zawierające od 3 do 7 atomów węgla.

Związki 1a, b i 2a, b oraz ich farmaceutycznie akceptowalne sole są przykładowymi przedstawicielami tego rodzaju związku (I).

Związki (I) przypominają zatem pewne znane AGP z tym wyjątkiem, że mają one krótsze łańcuchy pierwotnych kwasów tłuszczowych. Ustalono, że zmiana długości łańcucha wtórnych kwasów tłuszczowych ma wpływ na zdolność AGP stymulowania odporności, a w przypadku homologów wtórnych kwasów tłuszczowych - 3-D-MPL (Johnson i inni, J Med Chem, 42: 4640-4649, 1999). Niska endotoksyczność niektórych naturalnych wariantów lipidu A, takich jak lipid A z R. sphaeroides, została przypisana częściowo obecności w tych cząsteczkach krótszych (C10) pierwotnych kwasów tłuszczowych (Qureshi i inni, J Biol Chem, 266(10): 6532-6538, 1991). Podobnie niska toksyczność niektórych LPS z helikobakterii i pseudomonas może być spowodowana obecnością składników sześcioacylowych zawierających pierwotne kwasy tłuszczowe, które różnią się długością od kwasów znalezionych w toksycznym lipidzie A z salmonella (Moran i inni, J Bacteriol, 179(20): 6453-6463, 1997, Kulshin i inni, Eur J Biochem, 198(3): 697-704, 1991). Chociaż zależność pomiędzy długością pierwotnych łańcuchów acylowych zbadano w ograniczonym stopniu z syntetycznymi analogami podjednostek lipidu A zawierającymi trzy kwasy tłuszczowe (Hasegawa i inni, Biosci Biotech Biochem, 59(9): 1790-1792, 1995, oraz Ogawa i inni, Carbohydr Res, 220: 155-164, 1991) i czteroacylowymi disacharydowymi analogami lipidu IVa (Fukase i inni, Tetrahedron, 54: 4033-4050, 1998), to według naszej wiedzy nie przeprowadzono nigdy żadnych systematycznych badań ani z zasadowym sześcioacylowanym farmakoforem lipidu A ani ze mimetykiem lipidu A.

Do grupy opisanych tu związków należą także niektóre związki glicylowe i fosfonooksyetylowe (PE) (fosforany L-serynolu). Są to związki o powyższym wzorze (I), w którym R5 i R7 oznaczają wodór, n, m i q oznaczają 0, p oznacza 1, a R6 oznacza COOH, albo w którym p oznacza 2, a R6 oznacza

OPO3H2. Zatem mają one wzór ogólny (II):

PL 220 536 B1

w którym X jest wybrany z grupy obejmującej O i S w położeniu aksjalnym albo ekwatorialnym, Y jest wybrany z grupy obejmującej O i NH, n i m oznaczają 0, R1, R2 i R3 są takie same lub różne i oznaczają reszty acylowe kwasów tłuszczowych zawierające od 1 do około 20 atomów węgla, przy czym jeden z R1, R2 albo R3 oznacza ewentualnie wodór, R4 jest wybrany z grupy obejmującej H i metyl, p oznacza 1, a R6 oznacza COOH, albo p oznacza 2, a R6 oznacza OPO3H2, R8 i R9 są takie same lub różne i są wybrane z grupy obejmującej grupę fosfonową i H, przy czym co najmniej jeden z R8 i R9 oznacza grupę fosfonową, a R10, R11 i R12 są niezależnie wybrane spośród prostych, niepodstawionych, nasyconych grup alifatycznych zawierających od 1 do 10 atomów węgla, albo ich farmaceutycznie akceptowalna sól.

W zalecanych postaciach realizacji związków (II)

- X i Y oznaczają korzystnie atom tlenu,

- R₁, R₂ i R₃ oznaczają korzystnie normalne grupy acylowe, a zwłaszcza są niezależnie wybrane spośród prostych grup C6-C10-acylowych,

- grupy R10, R11 i R12 oznaczają korzystnie niepodstawione, nasycone grupy alifatyczne (tj. alkil) zawierające od 1 do 10, korzystnie od 3 do 9, a zwłaszcza od 3 do 7 atomów węgla, a zwłaszcza oznaczają identyczne, niepodstawione, nasycone grupy alifatyczne zawierające od 3 do 7 atomów węgla.

Przykładowymi przedstawicielami tego rodzaju związku (II) są związki 11a, b i 12a, b.

lla R₂=Ceacyl llb R_z=Cioacyl

12a R₂=Qacyi 12b R₂=Cio3Cyi

Związki 12a, 12b zawierają strukturalne modyfikacje gałęzi alkilowej zawierając ugrupowanie fosforanowe. Takie związki uważa się za potencjalnie bardziej trwałe niż inni przedstawiciele rodziny. Te związki mają przewagę nad klasami fosforanów serylo/serynolu AGP polegającą na tym, że nie zawierają centrum stereogenicznego w jednostce aglikonowej, to jest cechę, która może komplikować syntezę i prowadzić do trudności oddzielania zanieczyszczeń enancjomerycznych lub diastereoizomerycznych.

PL 220 536 B1

Innym rodzajem związku tu opisanego są pochodne kwasu (R)-3-alkiloksytetradekanowego. Te pochodne mają ten sam powyższy wzór ogólny (II) z tym wyjątkiem, że R1, R2 i R3 nie są grupami acylowymi, lecz są prostymi grupami alkilowymi, tworzącymi raczej grupy R1O-, R2O- i R3O- niż pochodne kwasów karboksylowych. W tego rodzaju związku R1, R2 i R3 są korzystnie grupami C6-C10-alkilowymi, które mogą być takie same lub różne, lecz najkorzystniej są identyczne.

Takie związki mają wzór ogólny (III):

w którym X jest wybrany z grupy obejmującej O i S w położeniu aksjalnym albo ekwatorialnym, Y jest wybrany z grupy obejmującej O i NH, n i m oznaczają 0, R1, R2 i R3 są takie same lub różne i oznaczają reszty acylowe kwasów tłuszczowych zawierające od 1 do około 20 atomów węgla, przy czym jeden z R1, R2 albo R3 oznacza ewentualnie wodór, R4 jest wybrany z grupy obejmującej H i metyl, p oznacza 1, a R6 oznacza COOH, albo p oznacza 2, a R6 oznacza OPO3H2, R8 i R9 są takie same lub różne i są wybrane z grupy obejmującej grupę fosfonową i H, przy czym co najmniej jeden z R8 i R9 oznacza grupę fosfonową, a R10, R11 i R12 są niezależnie wybrane spośród prostych, niepodstawionych, nasyconych grup alifatycznych zawierających od 1 do 11 atomów węgla, albo ich farmaceutycznie akceptowalna sól.

W zalecanych postaciach realizacji związków (III)

- X i Y oznaczają korzystnie atom tlenu,

- R₁, R₂ i R₃ najkorzystniej są niezależnie wybrane spośród niepodstawionych, prostych grup C6-C10-alkilowych,

- grupy R10, R11 i R12 oznaczają korzystnie niepodstawione, nasycone grupy alifatyczne (tj. alkil) zawierające od 1 do 11, korzystnie od 3 do 9, a zwłaszcza od 3 do 7 atomów węgla, a zwłaszcza oznaczają identyczne, niepodstawione, nasycone grupy alifatyczne zawierające od 3 do 7 atomów węgla.

Związki 18a, b są przykładowymi przedstawicielami tej grupy, zawierającymi pierwotny eterolipid w położeniu C-3 cukru oraz trzy wtórne eterolipidy

ifia n=i (Ce alkil)

186 n«5 (Cioilktfl R_1S=CH₂OPO3H₂ lub CO2H

PL 220 536 B1

Jeszcze inny rodzaj związku tu opisanego ma wzór (IV):

ORp

R,O

O

OR₃ (IV) w którym Y oznacza tlen, X jest wybrany z grupy obejmującej O i S w położeniu aksjalnym albo ekwatorialnym, n i m oznaczają 0, R₁, R₂ i R₃ są takie same lub różne i oznaczają reszty acylowe kwasów tłuszczowych zawierające od 1 do około 20 atomów węgla, przy czym jeden z R₁, R₂ albo R₃ oznacza ewentualnie wodór, R₄ jest wybrany z grupy obejmującej H i metyl, p oznacza 1, a R₆ oznacza COOH, albo p oznacza 2, a R₆ oznacza OPO₃H₂, R₈ i R₉ są takie same lub różne i są wybrane z grupy obejmującej grupę fosfonową i H, przy czym co najmniej jeden z R₈ i R₉ oznacza grupę fosfonową, a R₁₀, R11 i R12 są niezależnie wybrane spośród prostych niepodstawionych nasyconych grup alifatycznych zawierających od 1 do 10 atomów węgla, albo jego farmaceutycznie akceptowalna sól.

Te związki mają zatem dwa acylowane łańcuchy i jeden nieacylowany łańcuch eterowy.

W zalecanych postaciach realizacji związków (IV)

- X korzystnie oznacza O,

- R₁, R₂ i R₃ najkorzystniej są wybrane spośród niepodstawionych prostych grup C6-C10-alkilowych,

- grupy R₁₀, R₁₁ i R₁₂ oznaczają korzystnie niepodstawione, nasycone grupy alifatyczne (tj. alkil) zawierające od 1 do 10, korzystnie od 3 do 9, a zwłaszcza od 3 do 7 atomów węgla, a zwłaszcza oznaczają identyczne, niepodstawione, nasycone grupy alifatyczne zawierające od 3 do 7 atomów węgla.

Przykładowymi przedstawicielami tej klasy związków są związki 20a, b.

20a n-1 (C_S alkil! 20b n=>5 (Cio alkil)

Ri=CHiOPQsH2 lub COjH

PL 220 536 B1

Te związki mają cechy, które umożliwiają oporność na niekorzystny metabolizm i/lub hydrolizę wodną. Postuluje się, że selektywne usuwanie normalnych kwasów tłuszczowych w strukturalnie różnych cząsteczkach lipidu A przez ludzką acyloksyacylową hydrolazę (AOAH) w celu otrzymania antagonisty lipidu IV rozwinęło się jako mechanizm obronny mający na celu zmniejszenia toksyczności lipidu A (Erwin i Munford, J Biol Chem 265(27): 15444-16449, 1990). Jednakże, większa toksyczność 3-D-MPL naturalnego pochodzenia względem toksyczności głównego składnika heksaacylowego jest spowodowana prawdopodobnie obecnością mniej wysoko acylowanych składników o strukturach różniących się od struktury lipidu IVa (Ulrich i Myers, Monophosphoryl lipid A as an Adjuvant. Past experiences and new directions. W: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, red. Powell M.F., Newman M.J. Plenum Press, New York, 1995, str. 495-524, Johnson i inni, J Med Chem, 42: 4640-4 649, 1999). Zmienność strukturalna w 3-D-MPL i innych preparatach lipidu A wynika samoistnie z pokrewnego LPS oraz z rozszczepienia estrów w czasie procedur przy półsyntezie i wydzielaniu. W rzeczywistości podano, że łatwe hydrolityczne rozszczepienie związanych z estrem grup acylowych w czasie chemicznej syntezy przypuszczalnego lipidu A z R. capsulatus, silnego antagonisty wytwarzania TNF-α wywoływanego przez LPS, daje mniejsze ilości niepożądanych agonistycznych produktów ubocznych (Christ i inni, Science, 268: 80-83, 1995). Zatem chemiczna i/lub enzymatyczna nietrwałość może być piętą achillesową potencjalnego leku opartego na lipidzie A zawierającym nietrwałe wiązania estrowe. Chemiczna i metaboliczna nietrwałość związanych estrowo kwasów tłuszczowych obecnych zarówno w agoniście lipidu A, jak i w cząsteczkach antagonistycznych, została rozwiązana za pomocą hydrolitycznie trwałych analogów zawierających inne wiązania zamiast pierwotnych i/lub wtórnych, związanych estrowo kwasów tłuszczowych (Christ i inni, patrz wyżej, Lien i inni, J Biol Chem, 276(3): 1873-1880, 2001).

Inne związki z grupy tu opisanej mają 6-hydroksylową grupę blokującą. Te związki mają wzór (V):

w którym X jest wybrany z grupy obejmującej O i S w położeniu aksjalnym albo ekwatorialnym, Y jest wybrany z grupy obejmującej O i NH, n, m, p i q oznaczają liczby całkowite od 0 do 6, R₁, R₂ i R₃ są takie same lub różne i oznaczają reszty acylowe kwasów tłuszczowych, zawierające od 1 do około 20 atomów węgla, przy czym jeden z R₁, R₂ albo R₃ oznacza ewentualnie wodór, R₄ i R₅ są takie same lub różne i są wybrane z grupy obejmującej H i metyl, R₆ i R₇ są takie same lub różne i są wybrane z grupy obejmującej H, hydroksyl, alkoksyl, grupę fosfonową, fosfonooksy, sulfonową, sulfooksy, aminową, merkapto, cyjanową, nitrową, formylową i karboksylową oraz jej estry i amidy, R8 oznacza grupę fosfonową, PG oznacza grupę zabezpieczającą grupę hydroksylową, jak określono niżej, a R10, R11 i R₁₂ są niezależnie wybrane spośród prostych, niepodstawionych, nasyconych grup alifatycznych zawierających od 1 do 10 atomów węgla, albo ich farmaceutycznie akceptowalna sól.

Określenie „grupa zabezpieczająca” (przedstawiona tu jako „PG”) odnosi się do znacznej liczby grup stosowanych do zastępowania wodoru grupy hydroksylowej, tak aby blokować, zapobiegać albo zmniejszać reaktywność grupy. Przykłady grup zabezpieczających (i listę powszechnie stosowanych ich skrótów) można znaleźć u T.W. Greene i P.G. Futs „Protective Groups in Organic Chemistry” (Wiley), Beaucage i Iyer, Tetrahedron 48: 2223, i Harrison i inni, Compendium of Synthetic Organic MetPL 220 536 B1 hods, tomy 1-8 (Wiley). Do reprezentatywnych grup zabezpieczających grupy hydroksylowe należą te grupy, w których grupa hydroksylowa jest albo arylowana albo alkilowana, taka jak przy tworzeniu się eterów albo estrów, korzystając na przykład z metylu, acetylu, benzylu, trytylu, alkilu, tetrahydropiranylu, allilu i trójpodstawionych grup sililowych, albo w których grupa hydroksylowa jest zastępowana fluorem.

Wybór grupy zabezpieczającej dla danego związku, celu albo zestawu warunków mieści się w ramach umiejętności specjalisty w tej dziedzinie i dokonuje się go w taki sposób, aby zabezpieczyć, ogólnie albo selektywnie, daną grupę reaktywną w przeważających warunkach (obecność innych grup reaktywnych, pH, temperatura, itp.). Grupy zabezpieczające, które można stosować w przypadku związków tu opisanych, obejmują metyl, ftaloil, acetyl (Ac), benzyl (Bn), 2,2,2-trichloroetoksykarbonyl (Troc), t-butylodimetylosilil (TBS), t-butylodifenylosilil (TBDPS) i 2,2,2-trichloro-1,1-dimetyloetylochloroformyl (TCBOC). Jako grupę zabezpieczającą można również stosować atom fluoru. Jak wiadomo w tej dziedzinie, niektóre grupy zabezpieczające albo rodzaje grup zabezpieczających mogą być bardziej odpowiednie niż inne do stosowania ze szczególnym związkiem albo w danej sytuacji i przy opracowywaniu sposobów z udziałem związków z grupami reaktywnymi, takimi jak grupa hydroksylowa, wykorzystuje się te właściwości.

W zalecanych postaciach realizacji tych związków (V)

- X i Y oznaczają korzystnie atom tlenu,

Do przykładowych przedstawicieli tej grupy należą związki 25a, b, które mają eter metylowy, albo związki 26a, b, które mają grupę fluorową stosowaną w połączeniu z fosforanem serylu albo serynolu AGP.

Niezabezpieczona grupa hydroksylowa C6-cukru może prowadzić w czasie syntezy pochodnych lipidu A do niewielkich ilości zanieczyszczeń, które mogą być trudne do usunięcia (Christ, patrz wyżej). Te produkty uboczne tworzą się prawdopodobnie z początkowego tworzenia się 4,6-cyklicznego fosforanu, a następnie przegrupowania (Imoto i inni, Tetrahedron Lett. 29(28): 2227-2230, 1988).

Jak już tu omówiono, określenie „alifatyczny” jako takie albo jako część innego podstawnika oznacza, jeżeli, nie stwierdzono inaczej, prosty albo rozgałęziony łańcuch albo cykliczny rodnik węglowodorowy albo ich połączenia, który może być całkowicie nasycony, jedno- albo wielo-nienasycony i może obejmować dwu- i wielowartościowe rodniki i ma określoną liczbę atomów węgla (na przykład C1-C10 oznacza od jednego do dziesięciu atomów węgla). Przykłady nasyconych rodników węglowodorowych obejmują takie grupy jak metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, t-butyl, izobutyl, sec-butyl, cykloheksyl, cykloheksylo-metyl, cyklopropylometyl, homologi izomery na przykład n-pentylu, n-heptylu, n-oktylu, itp. Nienasycona grupa alifatyczna jest grupą, która ma jedno albo więcej wiązań podwójnych albo wiązań potrójnych. Przykłady nienasyconych grup alifatycznych obejmują winyl, 2-propenyl, krotyl, 2-izopentenyl, 2-(butadienyl), 2,4-pentadienyl, 3-(1,4-pentadienyl), etynyl, 1- i 3-propynyl, 3-butynyl oraz wyższe homologi i izomery. Grupa alifatyczna będzie zawierać typowo od 1 do

PL 220 536 B1 atomów węgla. „Niższa” grupa alifatyczna jest grupą alifatyczną o krótszym łańcuchu i ma na ogół osiem albo mniej atomów węgla.

Określenie „acyl” odnosi się do grupy pochodzącej z kwasu organicznego poprzez usunięcie grupy hydroksylowej. Przykłady grup acylowych obejmują acetyl, propionyl, dodekanoil, tetradekanoil, izobutyryl, itp. Zgodnie z tym rozumie się, że stosowane tu określenie „acyl” obejmuje grupę określoną inaczej jako -C(O)-alifatyczną, w której grupa alifatyczna jest korzystnie nasyconą grupą alifatyczną.

Rozumie się, że określenie „farmaceutycznie akceptowalne sole” obejmuje sole związków czynnych, które otrzymuje się ze stosunkowo nietoksycznymi kwasami lub zasadami w zależności od poszczególnych podstawników znajdujących się na opisanych tu związkach. Gdy związki według niniejszego wynalazku zawierają stosunkowo kwaśne grupy funkcyjne, to sole addycyjne z zasadami można otrzymywać drogą kontaktowania obojętnej postaci takich związków z dostateczną ilością pożądanej zasady albo w stanie czystym albo w odpowiednim obojętnym rozpuszczalniku. Przykłady farmaceutycznie akceptowalnych soli addycyjnych z zasadami obejmują sól sodową, potasową, wapniową, amonową, organiczną aminową lub magnezową, albo sól podobną. Gdy związki według niniejszego wynalazku zawierają stosunkowo zasadowe grupy funkcyjne, to sole addycyjne z kwasami można otrzymywać drogą kontaktowania obojętnej postaci takich związków z dostateczną ilością pożądanego kwasu, albo w postaci czystej albo w odpowiednim obojętnym rozpuszczalniku. Przykłady farmaceutycznie akceptowalnych soli addycyjnych z kwasami obejmują sole pochodzące z kwasów nieorganicznych, takich jak kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, azotowy, węglowy, monowodorowęglowy, fosforowy, monowodorofosforowy, diwodorofosforowy, siarkowy, monowodorosiarkowy, jodowodorowy albo fosforawy, itp., oraz sole pochodzące ze stosunkowo nietoksycznych kwasów organicznych, takich jak kwas octowy, propionowy, izomasłowy, maleinowy, malonowy, benzoesowy, bursztynowy, korkowy, fumarowy, mlekowy, migdałowy, ftalowy, benzenosulfonowy, p-tolilosulfonowy, cytrynowy, winowy, metanosulfonowy, itp. Należą do nich także sole aminokwasów, takie jak arginian, itp., i sole kwasów organicznych, takich jak kwas glukuronowy albo galakturonowy, itp. (patrz na przykład Berge, S.M. i inni „Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19, 1977). Niektóre specyficzne związki tu opisane zawierają zarówno zasadową, jak i kwasową grupę funkcyjną, które umożliwiają przemianę związków w sole addycyjne zarówno z zasadami, jak i kwasami.

Obojętne postacie związków można regenerować drogą kontaktowania soli z zasadą albo z kwasem i wydzielania związku macierzystego w konwencjonalny sposób. Postać macierzysta związku różni się od różnych postaci soli pewnymi właściwościami fizycznymi, takimi jak rozpuszczalność w rozpuszczalnikach polarnych, lecz w innym przypadku, dla celów niniejszego wynalazku, sole są równoważne postaci macierzystej związku.

Oprócz postaci soli opisanych tu związków opracowano związki, które występują w postaci proleku. Proleki opisanych tu związków są związkami, które łatwo ulegają zmianom chemicznym w warunkach fizjologicznych dając związki według niniejszego wynalazku. Ponadto pro-leki można przekształcać w związki według niniejszego wynalazku metodami chemicznymi albo biochemicznymi w środowisku ex vivo. Proleki można powoli przekształcać na przykład w związki według niniejszego wynalazku, gdy umieszcza się je w zbiorniczku plastra przezskórnego z odpowiednim enzymem albo odczynnikiem chemicznym.

Niektóre z opisanych tu związków mogą występować w postaciach niesolwatowanych oraz w postaciach solwatowanych, włącznie z postaciami uwodnionymi. Postacie solwatowane są na ogół równoważne postaciom niesolwatowanym. Niektóre związki mogą występować w wielokrotnych postaciach krystalicznych albo w postaci amorficznej. Do zastosowań branych pod uwagę w niniejszym wynalazku wszystkie postacie fizyczne są równoważne.

Niektóre związki tu opisane mają asymetryczne atomy węgla (centra optyczne) albo wiązania podwójne i wtedy mogą występować jako racematy, diastereoizomery, izomery geometryczne i poszczególne izomery.

Związki tu opisane mogą mieć także nienaturalne udziały izotopów atomów na jednym albo więcej atomów, które tworzą te związki. Związki mogą być na przykład znaczone promieniotwórczo izotopami promieniotwórczymi, takimi jak na przykład tryt (³H), jod-125 (¹²⁵I) albo węgiel-14 (¹⁴C).

Związki według niniejszego wynalazku można otrzymywać wszelkimi dostępnymi sposobami (patrz na przykład sekcja niżej), z których wiele zostało opisane. Sposoby otrzymywania niektórych związków użytecznych w niniejszym wynalazku są znane na przykład z amerykańskich opisów patentowych nr US 6,113,918, 6,303,347 oraz z PCT/US98/09385 (WO 98/50300 z dnia 12 października 1998). Jeszcze inne związki można otrzymywać sposobami przedstawionymi przez Johnsona i innych,

PL 220 536 B1

J. Med. Chem. 42: 4660-4649 (1999), Johnsona i innych, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2273-2278 (1999) i w PCT/US98/50399 (WO 98/50399 z dnia 12 listopada 1998). Przy wytwarzaniu tych związków stosuje się na ogół szeroko sposoby syntezy opisane w wyżej wymienionych referencjach albo inne sposoby syntezy znane w tej dziedzinie. Na przykład przy wytwarzaniu związków zawierających różne grupy acylowe i podstawniki specjalista w tej dziedzinie może ocenić, że opisane tu zbieżne sposoby można modyfikować stosując inne środki acylujące albo można je rozpoczynać z dostępnymi w handlu materiałami, które mają przyłączone odpowiednie grupy acylowe.

W kompozycjach do wywoływania albo zwiększania odpowiedzi immunologicznej związki według przedmiotowego wynalazku podaje się ciepłokrwistym zwierzętom, włącznie z ludźmi, z antygenem, takim jak antygen białkowy albo polipeptydowy, albo z polinukleotydem, który daje ekspresję antygenu białkowego albo polipeptydowego. Ilość antygenu podawanego w celu wywołania wymaganej odpowiedzi może być łatwo określona przez specjalistę w tej dziedzinie i będzie się ona zmieniać z rodzajem podawanego antygenu, drogą podawania i harmonogramem immunizacji.

Związki według niniejszego wynalazku można podawać także bez egzogennego antygenu w celu wywołania natychmiastowej ochrony poprzez efekt odporności niespecyficznej, jak opisano niżej (patrz Persing i inni, publikacja WIPO WO 01/90129 z dnia 29 listopada 2001). Związki, które mają zdolność pobudzania niespecyficznej odporności i/lub wywołania efektu adiuwanta, można stosować przy szybkim komponowaniu szczepionki. Podawanie związków według niniejszego wynalazku z antygenem prowadzi do nabytej odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej w ciągu trzech do czterech tygodni. Cotygodniowe podawanie takich związków, na przykład drogą donosową, w ciągu czterech tygodni powinno zapewnić szybką i trwałą ochronę drogą łączenia ochrony zapewnionej przez początkową wrodzoną odpowiedź immunologiczną, a następnie przez nabytą odpowiedź immunologiczną na interesujący antygen.

Związki według niniejszego wynalazku można oceniać przy użyciu różnorodnych formatów prób w celu zidentyfikowania i wybrania tych związków, które mają charakterystyki najlepiej nadające się do danego zastosowania wynalazku. Na przykład modele zwierzęce można stosować do identyfikowania i oceny profili wydzielania cytokin do układu krążenia po podaniu związku według niniejszego wynalazku. Poza tym istnieją różne modele in vivo i in vitro do badania zmian w jednym albo więcej aspektach reakcji odpornościowej na różne składniki antygenowe w celu zidentyfikowania związków najlepiej nadających się do wywołania specyficznej interesującej odpowiedzi immunologicznej. Związek można na przykład kontaktować z komórkami docelowymi, takimi jak makrofagi, komórki dendrytowe albo komórki Langerhansa in vitro i można mierzyć otrzymane cytokiny. Ponadto układy ekspresji genów można zastosować do identyfikowania specyficznych szlaków aktywowanych albo hamowanych przez poszczególny interesujący związek.

Wytwarzanie/wywoływanie cytokin można określić drogą traktowania ludzkiej krwi i/lub komórek związkami według niniejszego wynalazku i pomiaru wielkości wywołania za pomocą próby ELISA (R&D Systems). Takie sposoby można stosować także do oznaczania, jeżeli wywołanie zależy od receptora Toll. Cytotoksyczną odpowiedź na limfocyty T po podaniu związków według niniejszego wynalazku określa się drogą próby cytotoksyczności opartej na ⁵¹Cr. Jeżeli jest to pożądane, to skuteczność związku według wynalazku można pod tym względem porównywać z innymi związkami znanymi pod tym względem jako związki funkcyjne, takie jak lipid A, MPL, AGP, itp. Poza tym związki według wynalazku można oceniać w połączeniu z jednym albo więcej adiuwantem i/lub środkiem immunostymulującym do identyfikowania efektów synergistycznych (patrz na przykład amerykańskie opisy patentowe nr US 6,303,347 i 6,113,918 oraz WO 01/90129 opublikowane dnia 29 listopada 2001).

Modele zwierzęce, takie jak model wywoływania grypy u gryzoni i model wywoływania Listeria monocytogenes u gryzoni, są użyteczne do oceny aktywności adiuwanta i środka immunostymulującego. Krótko mówiąc, związek podaje się po wywołaniu grypy albo L. monocytogenes. Wskaźn ik choroby (zmierzwione futro, zgarbiona postawa i ciężki oddech), utrata ciężaru i umieralność, w przypadku grypy, albo liczba jednostek tworzących kolonie w śledzionach leczonych/nieleczonych myszy, monitoruje się w przypadku L. monocytogenes jako wskaźnik ochrony zapewnionej drogą podawania związków według wynalazku (patrz na przykład WO 01/90129 opublikowane dnia 29 listopada 2001).

Stosowane tu określenie „polipeptyd” stosuje się w jego konwencjonalnym znaczeniu, to jest jako sekwencję aminokwasów. Polipeptydy nie są ograniczone do specyficznej długości produktu, a zatem określeniem polipeptydu objęte są peptydy, oligopeptydy i białka oraz, o ile nie wskazano inaczej, takie określenia można stosować zamiennie. To określenie zatem nie odnosi się, ani nie wyklucza modyfikacji polipeptydu po ekspresji, na przykład glikozylacji, acetylowania, fosforylacji, itp.,

PL 220 536 B1 oraz innych modyfikacji znanych w tej dziedzinie, występujących zarówno naturalnie, jak i nienaturalnie. Polipeptyd może stanowić całe białko albo jego podsekwencję. Szczególnymi interesującymi, polipeptydami w kontekście niniejszego wynalazku są podsekwencje aminokwasowe zawierające epitopy, to jest determinanty antygenowe odpowiedzialne w znacznym stopniu za immunogenne właściwości polipeptydu i zdolne do wywoływania odpowiedzi immunologicznej.

Polipeptydy użyteczne w niniejszym wynalazku są tu nazywane czasami białkami nowotworowymi albo polipeptydami nowotworowymi, jako wskazówka, że ich identyfikacja została oparta przynajmniej częściowo na ich wyższych poziomach ekspresji w próbkach nowotworowych. Zatem „polipeptyd nowotworowy” albo „białko nowotworowe” dotyczy na ogół sekwencji polipeptydowej albo sekwencji polinukleotydowej kodującej taki polipeptyd, który daje ekspresję w znacznej proporcji próbek nowotworowych, na przykład zwłaszcza większą niż około 20%, w szczególności większą niż około 30%, a zwłaszcza większą niż około 50% albo więcej w badanych próbkach nowotworowych, na poziomie, który jest co najmniej dwukrotnie, a zwłaszcza co najmniej pięciokrotnie większy niż poziom ekspresji w normalnych tkankach, jak określono stosując przewidzianą tu reprezentatywną próbę.

W niektórych zalecanych postaciach realizacji polipeptydy, o których mowa wyżej, są polipeptydami immunogennymi, to jest reagują w sposób wykrywalny w oznaczeniach immunologicznych (takich jak ELISA albo próba stymulacji komórek T) z surowicami odpornościowymi i/lub komórkami T od pacjenta z rakiem. Wyszukiwanie pod kątem aktywności immunogennej można prowadzić stosując techniki dobrze znane specjaliście w tej dziedzinie i tak na przykład takie wyszukiwanie można prowadzić stosując takie sposoby jak te opisane przez Harlow i Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. W jednym z ilustracyjnych przykładów polipeptyd można unieruchamiać na stałym nośniku i kontaktować z surowicami od pacjenta umożliwiając wiązanie przeciwciał w surowicach z unieruchomionym polipeptydem. Niezwiązane surowice można następnie usuwać,

125 a związane przeciwciała wykrywać stosując na przykład ¹²⁵I-znakowane białko A.

Jak mógłby to rozpoznać specjalista w tej dziedzinie, opisane tu polipeptydy obejmują także immunogenne części tych polipeptydów. Stosowana tu „immunogenna część” jest fragmentem immunogennego polipeptydu, który sam reaguje immunologicznie (to jest wiąże się w sposób specyficzny) z komórkami B i/lub z powierzchniowymi receptorami antygenów komórek T, które rozpoznają polipeptyd. Części immunogenne można na ogół identyfikować stosując dobrze znane techniki, takie jak techniki zebrane przez Paula, Fundamental Immnunology, 3 wydanie, 243-247 (Raven Press, 1993) i cytowane tam referencje. Takie techniki obejmują wyszukiwanie polipeptydów pod względem ich zdolności do reagowania z przeciwciałami specyficznymi dla antygenów, surowicami i/lub liniami komórek T albo klonami. Stosowane tu surowice odpornościowe i przeciwciała są „antygenowospecyficzne”, jeżeli wiążą się specyficznie z białkiem (to jest reagują z białkiem w próbie ELISA albo innym oznaczeniu immunologicznym, a nie reagują w sposób wykrywalny z niespokrewnionymi proteinami). Takie surowice odpornościowe i przeciwciała można otrzymywać w sposób tu opisany oraz stosując dobrze znane techniki.

W jednym z zalecanych rozwiązań, część immunogenna opisanego tu polipeptydu jest częścią, która reaguje z surowicami odpornościowymi i/lub komórkami T na poziomie, który nie jest zasadniczo niższy niż reaktywność polipeptydu o pełnej długości (na przykład w próbie ELISA i w próbie reaktywności komórek T). Poziom immunogennej aktywności immunogennej części stanowi zwłaszcza co najmniej około 50%, w szczególności co najmniej około 70%, a zwłaszcza więcej niż około 90% immunogenności polipeptydu o pełnej długości. W pewnych warunkach będą identyfikowane korzystne immunogenne części, które mają poziom aktywności immunogennej większy niż poziom odpowiedniego polipeptydu o pełnej długości, to jest poziom aktywności większy niż około 100% albo 150% albo więcej aktywności immunogennej.

W niektórych innych rozwiązaniach ilustracyjne immunogenne części mogą zawierać peptydy, w których N-terminalna sekwencja wiodąca i/lub domena transbłonowa została poddana delecji. Inne ilustracyjne immunogenne części będą zawierać małą N- i/lub C-terminalną delecję (na przykład aminokwasy 1-30, a zwłaszcza aminokwasy 1-15) względem dojrzałego białka.

W innym rozwiązaniu kompozycja polipeptydowa może zawierać jeden albo więcej polipeptydów, które są immunologicznie reaktywne z komórkami T i/lub przeciwciałami wytwarzanymi przeciw polipeptydowi, a zwłaszcza polipeptydowi, który ma ujawnioną tu sekwencję aminokwasową albo jej immunogenny fragment albo wariant.

W innym rozwiązaniu, przewiduje się polipeptydy, które składają się z jednego albo więcej polipeptydów, które są zdolne do wzbudzania komórek T i/lub przeciwciał, które są immunologicznie reakPL 220 536 B1 tywne z jednym albo więcej opisanych tu polipeptydów albo jednym albo więcej polipeptydów zakodowanych przez sąsiadujące sekwencje kwasów nukleinowych zawartych w ujawnionych tu polinukleotydach albo ich immunogennych fragmentach albo wariantach.

Polipeptydy na N-terminalnym końcu białka mogą zawierać sekwencję sygnałową (albo wiodącą), która jednocześnie z translacją albo po translacji kieruje przenoszeniem białka. Dla ułatwienia syntezy, oczyszczania albo identyfikacji polipeptydu (na przykład poli-His) można go sprzęgać także z łącznikiem albo inną sekwencją, albo zwiększać wiązanie polipeptydu ze stałym nośnikiem. Polipeptyd można sprzęgać na przykład z obszarem Fc immunoglobuliny.

Wśród innych ilustracyjnych rozwiązań polipeptyd może być polipeptydem fuzyjnym, który zawiera, jak tu opisano, wiele polipeptydów, albo który zawiera co najmniej jeden polipeptyd, jak tu opisano, i niespokrewnioną sekwencję, taką jak znane białko nowotworowe. Partner fuzyjny może na przykład uczestniczyć przy zapewnianiu epitopów pomocniczych komórek T (immunologiczny partner fuzyjny), korzystnie epitopów pomocniczych komórek T rozpoznawanych przez ludzi, albo może uczestniczyć w ekspresji białka (środek zwiększający ekspresję) z wydajnością większą niż natywne białko rekombinacyjne. Niektórzy korzystni partnerzy fuzyjni są partnerami zarówno immunologicznymi, jak i zwiększającymi ekspresję. Innych partnerów fuzji można wybierać w taki sposób, aby zwiększyć rozpuszczalność polipeptydu albo umożliwić dotarcie polipeptydu do pożądanych przedziałów wewnątrzkomórkowych. Do jeszcze dalszych partnerów fuzji należą znaczniki powinowactwa, które ułatwiają oczyszczanie polipeptydu.

Polipeptydy fuzyjne można na ogół otrzymywać stosując standardowe techniki, włącznie ze sprzęganiem chemicznym. Polipeptyd fuzyjny daje korzystnie ekspresję w postaci polipeptydu rekombinacyjnego, umożliwiając powstawanie w układzie ekspresji wyższych poziomów polipeptydu fuzyjnego w stosunku do niepoddanego fuzji polipeptydu. Krótko mówiąc, sekwencje DNA kodujące składniki polipeptydowe można zbierać oddzielnie i poddawać ligacji do odpowiedniego wektora ekspresyjnego. Koniec 3' sekwencji DNA kodującej jeden składnik polipeptydowy poddaje się ligacji z łącznikiem peptydowym albo bez łącznika, z końcem 5' sekwencji DNA kodującej drugi składnik polipeptydowy, tak aby ramy odczytu sekwencji znajdowały się w fazie. Umożliwia to translację do pojedynczego polipeptydu fuzyjnego, który zachowuje aktywność biologiczną obydwu polipeptydów składowych.

Sekwencję łącznika peptydowego można używać do oddzielania pierwszego i drugiego składnika polipeptydowego na odległość wystarczającą do zapewnienia, aby każdy polipeptyd składał się w swoją drugorzędową i trzeciorzędową strukturę. Taką sekwencję łącznika peptydowego wprowadza się do polipeptydu fuzyjnego stosując standardowe techniki dobrze znane w tej dziedzinie. Odpowiednie sekwencje łącznika peptydowego można wybierać w oparciu o następujące czynniki: (1) ich zdolność przystosowania się do elastycznej rozszerzonej konformacji, (2) ich niezdolność przystosowania się do struktury drugorzędowej, która oddziaływałaby z epitopami funkcjonalnym na pierwszym i drugim polipeptydzie, (3) brak hydrofobowych albo naładowanych reszt, które mogłyby reagować z funkcyjnymi antygenowymi determinantami polipeptydów. Korzystne sekwencje łączników peptydowych zawierają reszty Gly, Asn i Ser. W sekwencji łącznika można stosować także inne prawie obojętne aminokwasy, takie jak Thr i Ala. Sekwencje aminokwasowe, które można użytecznie stosować jako łączniki, obejmują sekwencje opisane przez Maratea i innych, Gene 40: 39-46, 1985, Murphy i innych, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 8258-8262, w amerykańskich opisach patentowych nr US 4,935,233 i US 4,751,180. Sekwencja łącznika może na ogół mieć długość od 1 do około 50 aminokwasów. Sekwencje łącznika nie są wymagane wtedy, gdy pierwszy i drugi polipeptyd nie mają zasadniczych N-terminalnych obszarów aminokwasowych, które można stosować do oddzielania domen funkcyjnych i zapobiegania zaburzeniom sferycznym.

Poddane ligacji sekwencje DNA wiąże się operacyjnie z odpowiednimi transkrypcyjnymi albo translacyjnymi elementami regulatorowymi. Elementy regulatorowe odpowiedzialne za ekspresję DNA są usytuowane tylko w położeniu 5' względem sekwencji DNA kodującej pierwsze polipeptydy. Podobnie kodony zatrzymujące, wymagane do zakończenia sygnałów zakończenia translacji i transkrypcji, są obecne tylko w położeniu 3' względem sekwencji DNA kodującej drugi polipeptyd.

Jak opisano, polipeptyd fuzyjny może zawierać polipeptyd razem z niepokrewnym białkiem immunogennym, takim jak immunogenna proteina zdolna do ujawniania reakcji przypominania. Przykłady takich protein obejmują proteiny tężca, gruźlicy i zapalenia wątroby (patrz na przykład Stoute i inni, New Engl. J. Med., 336: 86-91, 1997).

W jednym z korzystnych rozwiązań immunologiczny partner fuzyjny pochodzi z Mycobacterium sp., taki jak fragment Ra12 pochodzący z Mycobacterium tuberculosis. Kompozycje Ra12 i sposoby

PL 220 536 B1 ich stosowania przy zwiększaniu ekspresji i/lub immunogenności heterologicznych sekwencji polinukleotydów/polipeptydów są znane z amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr 60/158585. Mówiąc pokrótce, Ra12 odnosi się do obszaru polinukleotydu, który jest podsekwencją kwasu nukleinowego MTB32A z Mycobacterium tuberculosis. MTB32A jest proteazą serynową o ciężarze cząsteczkowym 32 KD, kodowaną przez gen w zjadliwych i niezjadliwych szczepach M. tuberculosis. Sekwencja nukleotydów i sekwencja aminokwasów MTB32A została opisana (patrz na przykład amerykańskie zgłoszenie patentowe nr 60/158585, patrz także Skeiky i inni, Infection and lmmun. (1999) 67: 39984007). C-Terminalne fragmenty sekwencji kodującej MTB32A dają ekspresję na wysokich poziomach i pozostają jako rozpuszczalne polipeptydy w procesie oczyszczania. Co więcej , Ra12 może zwiększać immunogenność heterologicznych immunogennych polipeptydów, z którymi został poddany fuzji. Jeden z korzystnych polipeptydów fuzyjnych Ra12 zawiera C-terminalny fragment o ciężarze cząsteczkowym 14 KD, odpowiadający resztom aminokwasowym 192 do 323 MTB32A. Inne korzystne polinukleotydy Ra12 zawierają na ogół co najmniej około 15 kolejnych nukleotydów, co najmniej około 30 nukleotydów, co najmniej około 60 nukleotydów, co najmniej około 100 nukleotydów, co najmniej około 200 nukleotydów albo co najmniej około 300 nukleotydów, które kodują część polipeptydu Ra12. Polipeptydy Ra12 mogą zawierać sekwencję natywną (to jest sekwencję endogenną, która koduje polipeptyd Ra12 albo jego część) albo może zawierać wariant takiej sekwencji. Warianty polinukleotydów Ra12 mogą zawierać jedną albo więcej substytucji, addycji, delecji i/lub insercji, tak że aktywność biologiczna kodowanego polipeptydu fuzyjnego nie jest w zasadzie zmniejszona w porównaniu z polipeptydem fuzyjnym zawierającym naturalny polipeptyd Ra12. Warianty wykazują korzystnie co najmniej około 70% identyczności, korzystnie co najmniej około 80% identyczności, a zwłaszcza co najmniej około 90% identyczności względem sekwencji polinukleotydowej, która koduje naturalny polipeptyd Ra12 albo jego część.

W innych zalecanych rozwiązaniach immunologiczny partner fuzyjny pochodzi z białka D, powierzchniowego białka gram-ujemnej bakterii Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Pochodna białka D zawiera korzystnie w przybliżeniu jedną trzecią białka (na przykład pierwsze 100-110 N-terminalnych aminokwasów), a pochodną białka D można poddawać lipidowaniu. W niektórych korzystnych rozwiązaniach pierwsze 109 reszt partnera fuzyjnego, lipoproteiny D, znajduje się na końcu N wyposażając polipeptyd w dodatkowe egzogenne determinanty antygenowe komórek T i zwiększając poziom ekspresji w E. coli (zatem funkcjonując jako czynnik zwiększający ekspresję). Lipidowa część końcowa zapewnia optymalną prezentację antygenu względem komórek prezentujących antygen. Do innych partnerów fuzyjnych należy niestrukturalne białko z wirusa grypy, NS1 (hemaglutynina). Typowo stosuje się 81 N-terminalnych aminokwasów, chociaż można stosować różne fragmenty, które zawierają determinanty antygenowe wspomagające T.

W innym rozwiązaniu, immunologicznym partnerem fuzyjnym jest białko znane jako LYTA albo jej część (korzystnie część C-terminalna). LYTA pochodzi ze Streptococcus pneumoniae, który syntezuje amidazę N-acetylo-L-alaniny, znaną jako amidaza LYTA (kodowana przez gen LytA, Gene 43: 265-292, 1986). LYTA jest autolizyną, która specyficznie rozkłada niektóre wiązania w szkielecie peptydoglikanowym. C-Terminalna domena białka LYTA jest odpowiedzialna za powinowactwo do choliny albo niektórych analogów choliny, takich jak DEAE. Ta właściwość została wykorzystana do opracowania C-LYTA z E. coli dającej ekspresję plazmidów użytecznych do ekspresji białek fuzyjnych. Opisano oczyszczanie białek hybrydowych zawierających fragment C-LYTA na końcu aminowym (patrz Biotechnology 10: 795-798, 1992). W zalecanym rozwiązaniu powtarzającą się część LYTA można wprowadzić do polipeptydu fuzyjnego. Powtarzająca się część znajduje się w C-terminalnym obszarze rozpoczynającym się na reszcie 178. Szczególnie korzystna powtarzająca się część zawiera reszty 188-305.

Jeszcze inne ilustracyjne rozwiązanie obejmuje polipeptydy fuzyjne i kodujące je polinukleotydy, w których partner fuzyjny zawiera sygnał docelowy zdolny do kierowania polipeptydu do endosomalnego/lisosomalnego przedziału komórki, jak opisano w amerykańskim opisie patentowym nr US 5,633,234. Immunogenny polipeptyd, po poddaniu fuzji z tym sygnałem docelowym, będzie wiązać się bardziej skutecznie z cząsteczkami klasy II MHC, a przez to zapewniać większe pobudzanie in vivo komórek T CD4⁺ specyficznych dla polipeptydu.

Polipeptydy tu opisane otrzymuje się stosując każdą z dobrze znanych technik syntezy i/lub rekombinacji. Polipeptydy, części i ich warianty, które mają na ogół mniej niż około 150 aminokwasów, można wytwarzać drogą syntezy stosując techniki dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. W jednym z ilustracyjnych przykładów takie polipeptydy syntezuje się stosując każdą z dostępnych w hanPL 220 536 B1 dlu technik w fazie stałej, takich jak metoda syntezy w fazie stałej Merrifielda, w której aminokwasy dodaje się po kolei do rosnącego łańcucha aminokwasowego (patrz Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963). Sprzęt do automatycznej syntezy polipeptydów jest dostępny w handlu u dostawców, takich jak Perkin Elmer/Applied Bio-Systems Division (Foster City, CA), i można z nim pracować według instrukcji producenta.

Kompozycje polipeptydowe (zawierające polipeptydy fuzyjne) wydziela się, a „wydzielony” polipeptyd jest polipeptydem, który usuwa się ze swojego początkowego środowiska. Na przykład, naturalnie występującą proteinę albo polipeptyd wydziela się, jeżeli oddziela się go od pewnego albo wszystkich współistniejących materiałów w układzie naturalnym. Takie polipeptydy korzystnie również oczyszcza się i mają one czystość co najmniej około 90%, zwłaszcza co najmniej około 95%, a w szczególności co najmniej około 99%.

W innych aspektach niniejszego ujawnienia opracowano związki zawierające jeden albo więcej polinukleotydów, które kodują, jak podano wyżej, antygen polipeptydowy. Określenia „DNA” i „polinukleotyd” stosuje się tu w zasadzie zamiennie w odniesieniu do cząsteczki DNA, która została wydzielona w stanie wolnym z całego genomicznego DNA szczególnych gatunków. Stosowane tu określenie „wydzielony” oznacza, że polinukleotyd znajduje się w zasadzie z dala od innych sekwencji kodujących oraz że cząsteczka DNA nie zawiera dużych ilości niepokrewnego kodującego DNA, takiego jak duże fragmenty chromosomowe albo inne geny funkcyjne albo obszary kodujące polipeptyd. Oczywiście odnosi się to do początkowo wydzielonej cząsteczki DNA i nie wyklucza genów albo kodujących obszarów dodanych później do segmentu ręką człowieka.

Polinukleotydy mogą zawierać sekwencję natywną (to jest sekwencję endogenną, która koduje polipeptyd/proteinę według ujawnienia albo ich część) albo może zawierać sekwencję, która koduje wariant albo pochodną, a zwłaszcza immunogenny wariant albo pochodną takiej sekwencji. Warianty polinukleotydów będą zawierać typowo jedną albo więcej substytucji, addycji, delecji i/lub insercji, korzystnie tak, że immunogenność polipeptydu kodowanego przez wariant polinukleotydu nie jest w zasadzie mniejsza w stosunku do polipeptydu kodowanego przez podaną tu sekwencję polinukleotydową). Rozumie się także, że określenie „warianty” obejmuje homologiczne geny pochodzenia ksenogennego.

Jak podano wyżej, w niektórych zalecanych rozwiązaniach opisane wyżej polinukleotydy, na przykład warianty polinukleotydów, fragmenty i sekwencje hybrydyzujące, kodują polipeptydy, które są immunologicznie wzajemnie reaktywne z antygenowym albo immunogennym polipeptydem. W innych korzystnych rozwiązaniach takie polinukleotydy kodują polipeptydy, które mają poziom aktywności immunogennej co najmniej około 50%, korzystnie co najmniej około 70%, a zwłaszcza co najmniej około 90% aktywności podanej specyficznie wyżej sekwencji polipeptydowej.

Polinukleotydy tu opisane, albo ich fragmenty, niezależnie od długości samej sekwencji kodującej, można łączyć z innymi sekwencjami DNA, takimi jak promotory, sygnały poliadenylacji, dodatkowe miejsca dla enzymów restrykcyjnych, miejsca wielokrotnego klonowania, inne kodujące segmenty, itp., tak że ich ogólna długość może znacznie zmieniać się. Stąd bierze się pod uwagę, że można stosować fragment kwasu nukleinowego o prawie każdej długości, przy czym całkowita długość jest korzystnie ograniczona łatwością otrzymywania i stosowaniem w przewidzianym protokole rekombinacyjnego DNA. Na przykład w wielu rozwiązaniach uważa się za użyteczne ilustracyjne polinukleotydowe segmenty o ogólnych długościach około 10000, około 5000, około 3000, około 2000, około 1000, około 500, około 200, około 100, około 50 par zasad, itp., (włącznie ze wszystkimi długościami pośrednimi).

Kompozycje można identyfikować, otrzymywać i/lub przetwarzać przy użyciu każdej z szeregu dobrze znanych technik (patrz na ogół Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989, i inne referencje). Na przykład polinukleotyd można identyfikować, jak opisano bardziej szczegółowo niżej, drogą przeszukiwania macierzy DNA pod względem ekspresji związanej z nowotworem (to jest ekspresji, która jest co najmniej dwukrotnie większa w nowotworze niż w normalnej tkance, jak to określono stosując przewidzianą tu reprezentatywną próbę). Takie przeszukiwania można prowadzić na przykład stosując technologię mikromacierzy firmy Affymetrix, Inc. (Santa Clara, CA) zgodnie z instrukcjami producenta (i w zasadzie jak opisano przez Schena i innych, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10614-10619, 1996, i Hellera i innych, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155, 1997). Alternatywnie polinukleotydy można poddawać amplifikacji z cDNA otrzymanym z komórek dających ekspresję opisanych wyżej białek, takich jak komórki nowotworowe.

PL 220 536 B1

Do amplifikacji interesującej docelowej sekwencji obecnej w próbce dostępne jest wiele sposobów zależnych od matrycy. Jedną z najlepszych znanych metod amplifikacji jest polimerazowa reakcja łańcuchowa (PCR™), która jest znana bardziej szczegółowo z amerykańskich opisów patentowych nr US 4,683,195, 4,683,202 i 4,800,159. Mówiąc pokrótce, w PCR™ otrzymuje się dwie sekwencje starterów, które są komplementarne z obszarami na przeciwnych komplementarnych niciach sekwencji docelowej. Do mieszaniny reakcyjnej nadmiar trifosforanów dezoksynukleozydów dodaje się razem z polimerazą DNA (na przykład z polimerazą Taq). Jeżeli sekwencja docelowa jest zawarta w próbce, to startery będą wiązać się z tarczą, a polimeraza będzie powodować rozszerzanie się starterów wzdłuż sekwencji docelowej drogą dodawania na nukleotydach. Przez podnoszenie i obniżanie temperatury mieszaniny reakcyjnej rozszerzone startery będą dysocjować z sekwencji docelowej tworząc produkty reakcji, a nadmiar starterów będzie wiązać się z sekwencją docelową i z produktem reakcji, i proces powtarza się. W celu ilościowej oceny ilości poddanego amplifikacji mRNA można prowadzić korzystnie procedurę odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR™. Metodologie polimerazowej reakcji łańcuchowej są dobrze znane w tej dziedzinie.

W tej dziedzinie jest dobrze znany i dostępny szereg innych sposobów zależnych od matrycy, z których wiele jest odmianami techniki amplifikacji PCR™. Tytułem ilustracji niektóre takie sposoby obejmują ligazową reakcję łańcuchową (nazywaną LCR), znaną na przykład z europejskiego zgłoszenia patentowego nr 320308 i amerykańskiego opisu patentowego nr 4,883,750, Qbeta Replicase, opisany w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT/US87/00880, amplifikacja przemieszczania nici (SDA) i reakcja łańcuchowa naprawy (Repair Chain Reaction RCR). Jeszcze inne metody amplifikacji są znane z brytyjskiego opisu patentowego nr 2202328 i z międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr PCT/US89/01025. Inne sposoby postępowania przy amplifikacji kwasów nukleinowych obejmują układy amplifikacji oparte na transkrypcji (TAS) (międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT nr WO 88/10315), włącznie z amplifikacją opartą na sekwencji kwasu nukleinowego (NASBA) i 3SR. Z europejskiego zgłoszenia patentowego nr 329822 jest znany sposób amplifikacji kwasu nukleinowego polegający na cyklicznym syntezowaniu jednoniciowego RNA („ssRNA”), ssDNA i dwuniciowego DNA (dsDNA). Z międzynarodowego zgłoszenia patentowego PCT nr WO 89/06700 jest znany schemat amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego, oparty na hybrydyzacji sekwencji promotora/startera z docelowym jednoniciowym DNA („ssDNA”), a następnie transkrypcji wielu kopii sekwencji RNA. Specjaliści w tej dziedzinie znają także bardzo dobrze inne metody amplifikacji, takie jak „RACE” (Frohman, 1990) i „jednostronna PCR” (Ohara, 1989).

Poddaną amplifikacji część polinukleotydu można zastosować do wydzielania genu o pełnej długości z odpowiedniej biblioteki (na przykład biblioteki nowotworowego cDNA) stosując dobrze znane techniki. W takich technikach bibliotekę (cDNA albo genomiczną) przeszukuje się stosując jedną albo więcej sond albo starterów polinukleotydowych odpowiednich do amplifikacji. Bibliotekę wybiera się korzystnie pod względem wielkości, tak aby zawierała większe cząsteczki. Główne losowe biblioteki mogą okazać się także korzystne przy identyfikowaniu 5' i dalszych obszarów genów. Biblioteki genomowe są korzystne przy otrzymywaniu intronów i rozszerzania sekwencji 5'.

W przypadku technik hybrydyzacyjnych częściowa sekwencja może być znaczona (na przykład drogą translacji krzyżowej albo końcowego znakowania za pomocą ³²P) stosując dobrze znane techniki. Bibliotekę bakteryjną albo bakteriofagową przeszukuje się wtedy na ogół drogą hybrydyzowania filtrów zawierających poddane denaturacji kolonie bakterii (albo pasma zawierające płytki fagów) ze znaczoną sondą (patrz Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Kolonie albo płytki hybrydyzujące wybiera się i rozprowadza, a DNA wydziela się do dalszej analizy. Klony cDNA można analizować w celu określenia ilości dodatkowej sekwencji, na przykład drogą PCR stosując starter z częściowej sekwencji oraz starter z wektora. Mapy restrykcyjne i sekwencje częściowe można wytwarzać do identyfikacji jednego albo więcej nakładających się klonów. Następnie można oznaczać pełną sekwencję stosując standardowe techniki, które mogą polegać na wytwarzaniu szeregu klonów z delecjami. Otrzymane nakładające się sekwencje można następnie zestawiać w pojedynczą sąsiednią sekwencję. Cząsteczkę cDNA o pełnej długości można wytwarzać drogą ligacji odpowiednich fragmentów stosując dobrze znane techniki.

Alternatywnie techniki amplifikacji, takie jak techniki opisane wyżej, mogą okazać się użyteczne przy otrzymywaniu sekwencji kodującej o pełnej długości z częściowej sekwencji cDNA. Jedną z takich technik amplifikacji jest odwrócona PCR (patrz Triglia i inni, Nucl. Acids Res. 16: 8186, 1988), w której stosuje się enzymy restrykcyjne do wytwa rzania fragmentu w znanym obszarze genu. Fragment poddaje się następnie cyrkularyzacji drogą wewnątrzcząsteczkowej ligacji i stosuje jako matrycę

PL 220 536 B1 dla PCR z rozbieżnymi starterami pochodzącymi ze znanego obszaru. W alternatywnym sposobie podejścia sekwencje sąsiadujące z sekwencją częściową można odzyskiwać drogą amplifikacji ze starterem dla sekwencji łącznika i startera specyficznego dla znanego obszaru. Poddane amplifikacji sekwencje poddaje się typowo drugiej rundzie amplifikacji z tym samym starterem łącznika i drugim starterem specyficznym dla znanego obszaru. Wariant tego sposobu postępowania, w którym stosuje się dwa startery, które inicjują rozszerzanie się ze znanej sekwencji w przeciwnych kierunkach, jest znany ze zgłoszenia patentowego nr WO 96/38591. Inna taka technika jest znana jako „szybka amplifikacja końców cDNA” albo RACE. Ta technika polega na stosowaniu wewnętrznego startera i zewnętrznego startera, który hybrydyzuje z obszarem polyA, albo sekwencją wektora w celu identyfikacji sekwencji, które są 5' i 3' znanej sekwencji. Dodatkowe techniki obejmują wychwytową PCR (capture PCR) (Langerstrom i inni, PCR Methods Applic. 1: 111-19, 1991) i wędrowną PCR (walking PCR) (Parker i inni, Nucl. Acids. Res. 19: 3055-60, 1991). Do otrzymywania sekwencji cDNA o pełnej długości można stosować także i inne sposoby, w których stosuje się amplifikację.

W niektórych okolicznościach możliwe jest otrzymanie sekwencji cDNA o pełnej długości drogą analizy sekwencyjnej przeprowadzonej w bazie danych poddanego ekspresji znacznika sekwencji (EST), takiej jaka jest dostępna w banku genów GenBank. Poszukiwanie pokrywających się EST można prowadzić na ogół stosując dobrze znane programy (na przykład poszukiwania NCBI BLAST) i takie EST można zastosować do wytwarzania sąsiadującej sekwencji o pełnej długości. Sekwencje DNA o pełnej długości można otrzymywać także drogą analizy fragmentów genomowych.

W innych rozwiązaniach, sekwencje polinukleotydowe albo ich fragmenty, które kodują przedstawione wyżej polipeptydy, albo białka fuzyjne, albo ich równoważniki funkcyjne, można stosować w cząsteczkach rekombinacyjnego DNA do kierowania ekspresją polipeptydu w odpowiednich komórkach gospodarza. Na skutek samoistnej degeneracji kodu genetycznego można otrzymywać inne sekwencje DNA, które kodują w zasadzie tę samą albo funkcyjnie równoważną sekwencję aminokwasów, i te sekwencje można stosować do klonowania i ekspresji danego polipeptydu.

Sekwencje kodujące pożądany polipeptyd można syntezować, w całości albo częściowo, stosując metody chemiczne dobrze znane w tej dziedzinie (patrz Caruthers, M.H. i inni (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. i inni (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232).

Aby poddać ekspresji pożądany polipeptyd, sekwencje nukleotydowe kodujące polipeptyd, albo ich równoważniki funkcjonalne, można wprowadzać do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, to jest wektora, który zawiera elementy konieczne do transkrypcji i translacji wprowadzonej sekwencji kodującej. Do konstruowania wektorów ekspresyjnych zawierających sekwencje kodujące interesujący polipeptyd i odpowiednie transkrypcyjne i translacyjne elementy kontrolne można stosować metody dobrze znane specjaliście w tej dziedzinie. Te metody obejmują techniki in vitro rekombinacyjnego DNA, techniki syntezy oraz rekombinację genetyczną in vivo. Te techniki są opisane na przykład przez Sambrooka, J. i innych (1989) w Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., i Ausubela, F.M. i innych (1989) w Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.

„Elementy kontrolne” albo „sekwencje regulatorowe” zawarte w wektorze ekspresyjnym są tymi niepoddanymi translacji obszarami wektora - czynnikami wzmacniającymi, promotorami, 5' i 3' niepoddanymi translacji obszarami - które oddziaływują z białkami komórek gospodarza w celu przeprowadzenia transkrypcji i translacji. Takie elementy mogą zmieniać się pod względem swojej siły i specyficzności. W zależności od stosowanego układu wektora i gospodarza można stosować każdą liczbę odpowiednich elementów transkrypcyjnych i translacyjnych, włącznie z konstytutywnymi indukowalnymi promotorami.

W komórkach ssaków dostępny jest na ogół szereg układów ekspresji opartych na wirusach i na przykład w przypadkach, w których jako wektor ekspresyjny stosuje się adenowirus, sekwencje kodujące interesujący polipeptyd można poddawać ligacji do transkrypcyjno/translacyjnego kompleksu adenowirusa, składającego się z późnego promotora i trójdzielnej sekwencji wiodącej. Insercję w nieistotnym obszarze E1 albo E3 genomu wirusa można stosować do otrzymania zjadliwego wirusa, który może dawać ekspresję polipeptydu w zainfekowanych komórkach gospodarza (Logan, J. i Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). Ponadto do zwiększenia ekspresji w komórkach ssaka-gospodarza można stosować czynniki zwiększające transkrypcję, takie jak czynnik zwiększający oparty na wirusie mięsaka Rousa (RSV).

Do uzyskania bardziej skutecznej translacji sekwencji kodujących interesujący polipeptyd można stosować także specyficzne sygnały inicjujące. Do takich sygnałów należy inicjujący kodon ATG

PL 220 536 B1 i sąsiadujące sekwencje. W tych przypadkach, w których sekwencje kodujące polipeptyd, jego inicjujący kodon i następujące dalej sekwencje wprowadza się do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, mogą nie być konieczne żadne dodatkowe transkrypcyjne i translacyjne sygnały kontrolne. Jednak w tych przypadkach, w których wprowadza się tylko sekwencję kodującą, albo jej część, należy przewidywać egzogenne translacyjne sygnały kontrolne włącznie z inicjacyjnym kodonem ATG. Ponadto, w celu zapewnienia translacji całej insercji, kodon inicjujący powinien znajdować się we właściwej ramie odczytu. Egzogenne elementy translacyjne i kodony inicjujące mogą mieć różne pochodzenie, zarówno naturalne jak i syntetyczne. Skuteczność ekspresji można zwiększyć drogą inkluzji czynników wzmacniających, które są odpowiednie dla szczególnego stosowanego układu komórek, takiego jak układ opisany w literaturze (Scharf, D. i inni (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162).

W tej dziedzinie jest znany szereg protokołów wykrywania i pomiaru ekspresji produktów zakodowanych przez polinukleotydy, stosując specyficzne dla produktu przeciwciała poliklonalne albo monoklonalne. Przykłady obejmują próbę immunosorbenta związanego z enzymem (ELISA), próbę radioimmunologiczną (RIA) i sortowanie komórek aktywowanych drogą fluorescencji (FACS). W niektórych zastosowaniach może okazać się korzystna dwucentrowa próba immunologiczna oparta na przeciwciałach monoklonalnych, w której stosuje się przeciwciała monoklonalne reaktywne względem niezakłócających determinant antygenowych na danym polipeptydzie, przy czym można także stosować konkurencyjną próbę wiązania. Te i inne próby są opisane między innymi przez Hamptona R. i innych (1990, Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.) i Maddoxa, D.E. i innych (1983, J. Exp. Med. 158: 1211-1216).

Kompozycje farmaceutyczne i sposoby

Rozumie się, że jeżeli jest to pożądane, to ujawnione tu związki można podawać w połączeniu z innymi terapeutycznymi modalnościami, takimi jak związki przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe i przeciwgrzybicze, albo terapiami, różnymi środkami terapeutycznymi opartymi na DNA, środkami terapeutycznymi opartymi na RNA, środkami terapeutycznymi opartymi na polipeptydach i/lub z innymi immunoefektorami. W rzeczywistości, zasadniczo można wprowadzać każdy inny składnik, pod warunkiem, że dodatkowy składnik(i) nie wywiera znaczącego niekorzystnego wpływu na styczność z komórkami docelowymi albo tkankami gospodarza. Kompozycje można zatem wprowadzać razem z różnymi innymi środkami, jak jest to wymagane albo pożądane dla specyficznego rozwiązania (rozwiązań) wdrażanego wynalazku. Tytułem ilustracji kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać albo można je stosować w połączeniu z DNA kodującym jedną albo więcej terapeutycznych białek, antysensownych RNA, rybosomów, itp.

W jednym z aspektów związki według wynalazku i zawierające je kompozycje można podawać razem z antygenem w celu zapewnienia adiuwantowego albo wzmacniającego efektu antygenu, to jest zwiększania odpowiedzi immunologicznej pacjenta albo podmiotu. W innym aspekcie związki według wynalazku i kompozycje je zawierające podaje się, przy braku egzogennego antygenu, dla terapeutycznego efektu samego związku.

W innym aspekcie, w którym związek albo kompozycję podaje się razem z egzogennym antygenem, opracowano sposoby leczenia, łagodzenia i/lub znaczącej profilaktyki chorób zakaźnych u eukariotycznych pacjentów, szczególnie u zwierząt, a zwłaszcza u ludzi. Biorąc pod uwagę istotność sygnalizacji zależnej od TLR we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na prowokacje drobnoustrojem, to zdolność do stymulowania takich szlaków selektywnie i z minimalną toksycznością przedstawia silny środek do profilaktycznych i/lub terapeutycznych modalności leczenia przeciw szerokiemu zakresowi środków zakaźnych.

Opisane tu sposoby stosuje się w zasadzie przeciw każdemu rodzajowi środków zakaźnych, włącznie z bakteriami, wirusami, pasożytami i grzybami. Tytułem ilustracji wynalazek jest użyteczny do profilaktycznego i/lub terapeutycznego leczenia infekcji bakteryjnych przez szczepy spośród Pseudomonas, Escherichia, Klebsiella, Entero-bacter, Proteus, Serratia, Candida, Staphylococci, Streptccocci, Chlamydia, Mycoplasma i wiele innych. Ilustracyjne wirusowe stany chorobowe, które można leczyć przy zastosowaniu związków według wynalazku, obejmują stany wywołane na przykład przez wirusy grypy, adenowirusy, wirusy grypy rzekomej, wirusy nieżytu nosa, wirusy oddechowe (RSV), wirusy opryszczki, wirusy cytomegalii, wirusy zapalenia wątroby, na przykład wirusy zapalenia wątroby B i C, i inne. Ilustracyjne grzyby obejmują na przykład Aspergillis, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitus i inne.

W jednym z ilustracyjnych rozwiązań, opisano tu sposoby leczenia pacjentów, a zwłaszcza pacjentów mających obniżoną odporność, u których rozwinęła się albo którzy są zagrożeni rozwojem

PL 220 536 B1 infekcji, takich jak szpitalne infekcje bakteryjne i wirusowe. U około 2 milionów z 40 milionów pacjentów hospitalizowanych każdego roku rozwija się infekcja w czasie ich pobytu w szpitalu i u około 1% z nich albo u około 400000 pacjentów rozwija się szpitalne zapalenie płuc i z których więcej niż 7000 umiera. Powoduje to, że szpitalne zapalenie płuc jest główną przyczyną śmierci wskutek infekcji nabytej w szpitalu. Zatem w tym rozwiązaniu spełnia się ważną potrzebę skutecznego zapobiegawczego sposobu podejścia przy leczeniu infekcji szpitalnych.

W podobnym rozwiązaniu, opisano tu profilaktyczne leczenie pacjentów mających obniżoną odporność, takich jak pacjenci HIV-pozytywni, u których rozwinęła się albo którzy są zagrożeni rozwojem zapalenia płuc albo z zakażenia drobnoustrojami oportunistycznymi albo z reaktywacji zakażenia stłumionego albo utajonego. W roku 1992 w samych tylko Stanach Zjednoczonych Ameryki odnotowano około 20000 przypadków zakażeń przez Pneumocystis carinii u pacjentów z AIDS, a dodatkowo 60-70% wszystkich pacjentów z AIDS nabywa P. carinii po pewnym czasie swojej choroby. Zatem opisane są tutaj skuteczne zapobiegawcze metody dla populacji z tym ryzykiem.

W innym podobnym rozwiązaniu, opisane tu sposoby mogą być stosowane do leczenia innych populacji pacjentów, którzy mogą mieć obniżoną odporność albo mogą być zagrożeni rozwojem chorób zakaźnych, na przykład włącznie z pacjentami ze zwłóknieniem torbielowatym, przewlekłą obturacyjną chorobą płuc i innymi pacjentami, którzy mają obniżoną odporność i/lub pacjentami leczonymi w zakładzie.

W innym aspekcie, związki według wynalazku i opisane tu kompozycje mogą być stosowane (bez egzogennego antygenu) w sposobach leczenia, łagodzenia albo znaczącej profilaktyki alergicznych zaburzeń i stanów chorobowych, takich jak zapalenie zatok, chroniczne zapalenie zatok przy nieżycie nosa, astma, atopowe zapalenie skóry i łuszczyca. Taki sposób podejścia opiera się przynajmniej częściowo na zdolności związków do aktywowania wytwarzania cytokin z komórek docelowych, które mogą konkurować ze stereotypowymi reakcjami cytokinowymi typu alergii, charakteryzującymi się wytwarzaniem IL-4 albo nadreaktywnością względem aktywności IL-4. Podawanie niektórych z opisanych tu związków monosacharydowych i disacharydowych daje w wyniku ekspresję IFNgamma i IL-12 z komórek przetwarzających i zawierających antygen, jak również z innych komórek dających w wyniku zmniejszenie aktywności cytokin związanych z reakcjami alergicznymi, takich jak IL-4, 5, 6, 10 i 13.

W jeszcze innym aspekcie związki według wynalazku i zawierające je kompozycje (bez egzogennego antygenu) mogą być stosowane w sposobach leczenia autoimmunologicznych chorób i stanów chorobowych. Związki będą wybierane typowo spośród związków nadających się do antagonizowania, hamowania, albo innego negatywnego modulowania jednego albo więcej receptorów typu Toll, a zwłaszcza Tlr2 i/lub Tlr4 tak, że odpowiedź immunologiczna związana z danym stanem chorobowym polepsza się albo znacznie się jej zapobiega. W sposób ilustracyjny sposoby tu opisane można zastosować do leczenia stanów chorobowych, takich jak zapalna choroba jelita grubego, reumatoidalne zapalenie stawów, przewlekłe zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane i łuszczyca.

Związki według przedmiotowego wynalazku można stosować także jako adiuwanty i immunoefektory, które zwiększają wytwarzanie się przeciwciała u poddanych immunizacji zwierząt, stymulują wytwarzanie cytokin i stymulują odpowiedź immunologiczną z udziałem komórek, włącznie z cytotoksyczną odpowiedzią limfocytów T.

W opisanych tu sposobach, na przykład do wywoływania odpowiedzi immunologicznej u pacjenta, związki według przedmiotowego wynalazku i zawierające je kompozycje można komponować z farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem do zastrzyków albo połykania. Stosowane tu określenie „farmaceutycznie akceptowalny nośnik” oznacza medium, które nie zakłóca immunomodulatorowej aktywności składnika czynnego i nie jest toksyczny dla pacjenta, któremu się go podaje. Do farmaceutycznie akceptowalnych nośników należą emulsje typu olej w wodzie i woda w oleju, kompozycje wodne, liposomy, mikroperełki i mikrosomy. Nośnik może być na przykład mikrosferą albo mikrocząstką, która zawiera związek według niniejszego wynalazku wewnątrz macierzy sfery albo cząstki, albo zaadsorbowany na powierzchni sfery albo cząstki. Nośnik może być także wodnym roztworem albo dyspersją micelarną zawierającą trietyloaminę, trietanoloaminę albo inny środek, który nadaje kompozycji zasadowy odczyn, albo zawiesiną zawierającą wodorotlenek glinu, wodorotlenek wapnia, fosforan wapnia albo adsorbat tyrozyny. Nośniki mogą zawierać także inne rozpuszczalniki, media dyspersyjne, rozczynniki, powłoki, rozcieńczalniki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i opóźniające absorpcję, bufory, roztwory nośnikowe, zawiesiny, koloidy, itp. Stosowanie takich mediów i środków dla farmaceutycznie czynnych substancji jest dobrze znane w tej dziedzinie. Z wy20

PL 220 536 B1 jątkiem przypadków, gdy jakiekolwiek konwencjonalne media albo środek są niezgodne ze składnikiem czynnym, to bierze się pod uwagę ich stosowanie w kompozycjach terapeutycznych.

Kompozycje związków według przedmiotowego wynalazku, które można podawać pozajelitowo, to jest dootrzewnowo, podskórnie albo domięśniowo, zawierają następujące korzystne nośniki. Przykłady korzystnych nośników do stosowania podskórnego obejmują buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS) i 0,01-0,1% trietanoloaminy w wodzie USP do zastrzyków. Odpowiednie nośniki do zastrzyku domięśniowego zawierają 10% etanolu USP, 40% glikolu propylenowego i bilans w postaci akceptowalnego roztworu izotonicznego, takiego jak 5% dekstroza.

Przykłady korzystnych nośników do stosowania dożylnego zawierają 10% etanolu USP, 40% glikolu propylenowego USP i bilans w postaci wody USP do zastrzyków. Inny akceptowalny nośnik zawiera 10% etanolu USP i wodę USP do zastrzyków, a jeszcze inny akceptowalny nośnik zawiera 0,01-0,1% trietanoloaminy w wodzie USP do zastrzyków. Farmaceutycznie akceptowalne pozajelitowe rozpuszczalniki są takimi rozpuszczalnikami, które dają roztwór albo dyspersję, które można filtrować przez filtr 5 mikronów bez usuwania składnika czynnego.

Zalecanym sposobem podawania kompozycji tu opisanych jest podawanie do błony śluzowej, a zwłaszcza podawanie donosowe, albo podawanie drogą inhalacji (podawanie do płuc). Doprowadzanie leku do płuc można osiągnąć kilkoma różnymi sposobami podejścia, włącznie z nebulizatorami cieczy, opartymi na aerozolu inhalatorami z odmierzaną dawką (MDI) i urządzeniami do dyspergowania suchego proszku. Kompozycje do zastosowania w tego rodzaju podawaniach są typowo suchymi proszkami albo aerozolami. W przypadku podawania aerozoli, które są zalecanym sposobem podawania, kompozycje doprowadza się za pomocą inhalatorów, których niektóre rodzaje są opisane poniżej.

Suche proszki zawierają oprócz składnika czynnego nośnik, środek do zwiększania absorpcji oraz ewentualnie inne składniki. Nośnik jest na przykład mono-, di- albo polisacharydem, alkoholem cukrowym albo innym poliolem. Do odpowiednich nośników należy laktoza, glukoza, rafinoza, melezytoza, laktitol, maltitol, trehaloza, sacharoza, mannitol i skrobia, przy czym szczególnie korzystna jest laktoza, zwłaszcza w postaci swojego monohydratu. Nośniki obejmują także środki do zwiększania absorpcji, takie jak polipeptydy, środki powierzchniowo czynne, alkiloglikozydy, aminowe sole kwasów tłuszczowych albo fosfolipidy. Składniki kompozycji muszą mieć typowo rozdrobnioną postać, to jest ich średnia średnica objętościowa (ang. volume median diameter) powinna wynosić na ogół od około 30 do około 200 mikronów, zmierzona przyrządem do dyfrakcji promieni laserowych albo licznikiem Coultera. Pożądaną wielkość cząstek można uzyskiwać sposobami znanymi w tej dziedzinie, na przykład drogą mielenia, mikronizacji albo bezpośredniego strącania.

Donosowa droga podawania zapewnia liczne korzyści w porównaniu z innymi drogami podawania związków według niniejszego wynalazku. Jedna z zalet podawania donosowego polega na wygodzie. Układ do zastrzyków wymaga sterylizacji strzykawki podskórnej i otoczenia zakładu, prowadzi do troszczenia się wśród personelu medycznego co do ryzyka nabywania choroby drogą przypadkowego ukłucia zanieczyszczoną igłą. Ścisłe wymagania co do bezpiecznego usuwania zużytych igieł i strzykawek muszą być także nakładane w otoczeniu zakładu. W przeciwieństwie do tego podawanie donosowe wymaga niewiele czasu ze strony pacjenta i uczestniczącego personelu medycznego i jest daleko mniej uciążliwe dla zakładu niż w przypadku zastrzyków.

Druga ważna zaleta podawania donosowego polega na akceptacji przez pacjenta układu doprowadzania leku. Podawanie donosowe odbiera się jako podawanie nieinwazyjne, któremu nie towarzyszy ból, nie ma znacznych działań następczych i daje satysfakcję w postaci szybkiego usunięcia dolegliwości u pacjenta wykazującego objaw. Jest to szczególnie korzystne wtedy, gdy pacjentem jest dziecko. Inny ważny wzgląd polega na tym, że pacjent może sam sobie podawać przepisaną dawkę (dawki) sprayu donosowego.

W przypadku podawania donosowego kompozycje tu opisane można komponować w postaci cieczy albo substancji stałych. Takie kompozycje mogą zawierać jeden albo więcej adiuwantów, środków do zwiększania absorpcji składników czynnych drogą przepuszczania przez błonę nosową i (w przypadku kompozycji ciekłych) wodny rozcieńczalnik, na przykład wodę. Alternatywnie rozcieńczalnik może zawierać wodny bufor, taki jak bufor fosforanowy. Kompozycja może zawierać ponadto ewentualnie jeden albo więcej alkoholi wielowodorotlenowych i jeden albo więcej środków konserwujących, takich jak na przykład gentamycyna, bacytracyna (0,005%) albo krezol. Kompozycje można podawać do jamy nosowej w postaci sprayu stosując atomizator, nebulizator, rozpylacz, wkraplacz albo inne urządzenie, które zapewnia styczność roztworu z błoną śluzową nosa. Urządzenie może być urządzeniem prostym, takim jak prosty rozpylacz do nosa, który może być stosowany przez pacjenta

PL 220 536 B1 albo może być przyrządem bardziej złożonym do dokładniejszego dawkowania kompozycji, który można stosować w gabinecie lekarskim albo placówce medycznej.

Kompozycje proszkowe do nosa można wytwarzać drogą mieszania składnika czynnego i rozczynnika, przy czym obydwa mają pożądaną wielkość cząstek. Po pierwsze, przygotowuje się roztwór składnika czynnego i rozczynników cyklodekstrynowych, po czym następuje strącanie, filtracja i proszkowanie. Możliwe jest także usuwanie rozpuszczalnika drogą liofilizacji, a następnie proszkowania proszku do pożądanej wielkości cząstek stosując konwencjonalne techniki znane z literatury farmaceutycznej. Etapem końcowym jest klasyfikacja według wielkości, na przykład drogą przesiewania, otrzymując cząstki, które mają korzystnie średnicę od 30 do 200 mikronów. Proszki można podawać stosując insuflator donosowy albo można je umieścić w zestawie torebkowym w urządzeniu inhalacyjnym albo do wdmuchiwania. Igła wnika przez torebkę tworząc pory na wierzchu i w dnie torebki, a powietrze wprowadza się w celu wydmuchiwania cząstek proszku. Kompozycję proszkową można podawać także w strumieniu gazu obojętnego albo zawieszać w ciekłych organicznych płynach.

W specyficznym rozwiązaniu kompozycję farmaceutyczną można doprowadzać w układzie z kontrolowanym albo przedłużonym uwalnianiem. W jednym z rozwiązań, w celu uzyskania kontrolowanego albo przedłużonego uwalniania, można stosować pompkę (patrz Langer, Science, 249: 15271533 (1990), Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 10, Buschwald i inni, 1980, Surgery 88: 507, Saudek i inni, 1989 N. Engl. J. Med. 321: 574). W innym rozwiązaniu można stosować materiały polimeryczne do uzyskania kontrolowanego albo przedłużonego uwalniania agonisty receptora κ-opioidowego i/lub antagonisty opioidowego (patrz na przykład Medical Applications of Controlled Release, Langer i Wise (redaktorzy), CRC Pres., Boca Raton, Florida 1974), Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (redaktorzy), Wiley, New York (1984), Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macrol. Chem. 23: 61, patrz także Levy i inni, 1985, Science 228: 190, During i inni, 1989, Ann. Neurol. 25: 351, Howard i inni, 1989, J. Neurosurg. 71: 105, amerykańskie opisy patentowe nr US 5679377, 5916597, 5912015, 5989463, 5128326, zgłoszenie PCT nr WO 99/12154 i zgłoszenie PCT nr WO 99/20253). Przykłady polimerów stosowanych w kompozycjach o przedłużonym uwalnianiu obejmują, lecz nie tylko, polimetakrylan 2-hydroksyetylu, polimetakrylan metylu, polikwas akrylowy, polioctan etylenowinylu, polikwas metakrylowy, poliglikolidy (PLG), polibezwodniki, poli-N-winylopirolidon, polialkohol winylowy, poliakryloamid, poliglikol etylenowy, polilaktydy (PLA), polilaktydoglikolidy (PLGA) i poliortoestry. W korzystnym rozwiązaniu polimer stosowany w kompozycji o przedłużonym uwalnianiu jest obojętny, wolny od dających się ługować zanieczyszczeń, trwały przy przechowywaniu, sterylny i podatny na rozkład biologiczny. W jeszcze innym rozwiązaniu układ o kontrolowanym albo przedłużonym uwalnianiu można umieścić w pobliżu tarczy terapeutycznej, a zatem wymagając tylko ułamka systematycznej dawki (patrz na przykład Goodson w Medical Applications of Controlled Release, wyżej, tom 2, str. 115-138 (1984)).

Nośniki do stosowania z takimi kompozycjami farmaceutycznymi są nośnikami zgodnymi biologicznie i mogą być także podatne na rozkład biologiczny. W niektórych rozwiązaniach kompozycja zapewnia stosunkowo stały poziom uwalniania składnika czynnego. Jednak w innych rozwiązaniach może okazać się pożądana większa szybkość uwalniania bezpośrednio po podaniu. Skład takich kompozycji znajduje się dobrze na poziomie przeciętnych umiejętności w tej dziedzinie przy stosowaniu znanych technik. Ilustracyjne nośniki użyteczne pod tym względem obejmują mikrocząstki polilaktydoglikolidu, poliakrylanu, lateksu, skrobi, celulozy, dekstranu, itp. Inne ilustracyjne nośniki z opóźnionym uwalnianiem obejmują supramolekularne biowektory, które mają nieciekły hydrofilowy rdzeń (na przykład usieciowany polisacharyd albo oligosacharyd) oraz ewentualnie zewnętrzną warstwę zawierającą związek amfifilowy, taki jak fosfolipid (patrz na przykład amerykański opis patentowy nr US 5151254 i zgłoszenia patentowe PCT nr WO 94/20078, WO/94/23701 i WO 96/06638). Ilość związku czynnego zawartego w kompozycji o przedłużonym uwalnianiu zależy od miejsca wszczepienia, szybkości i oczekiwanego czasu trwania uwalniania oraz natury leczonego stanu chorobowego albo stanu, któremu się zapobiega.

Związki według przedmiotowego wynalazku można podawać pacjentowi w skutecznej ilości albo farmaceutycznie skutecznej ilości w celu uzyskania albo zwiększenia odpowiedzi immunologicznej u pacjenta. Stosowane tu określenie „skuteczna ilość” albo „farmaceutycznie skuteczna ilość” jest tą ilością, która wykazuje odpowiedź wyższą w porównaniu z nośnikiem albo ujemnymi kontrolami. „Ilość adiuwantowo skuteczna” jest tą ilością danego związku, która po podaniu w połączeniu z antygenem wykazuje odpowiedź wyższą niż reakcja dawana przez sam antygen. Dokładna dawka związków we22

PL 220 536 B1 dług przedmiotowego wynalazku, podawanych pacjentowi będzie zależeć od szczególnego zastosowanego związku, drogi podawania, kompozycji farmaceutycznej i pacjenta. Na przykład przy podawaniu podskórnym w celu zwiększenia reakcji na przeciwciało ilość zastosowanego związku wynosi od 1 do około 250 mikrogramów, a zwłaszcza od około 25 do około 50 mikrogramów, opartych na podawaniu typowemu dorosłemu pacjentowi o ciężarze 70 kg.

W innym rozwiązaniu ilustracyjne kompozycje immunogenne, na przykład kompozycje immunogenne i/lub szczepionki, zawierają, jak opisano wyżej, DNA kodujący jeden albo więcej polipeptydów, tak że polipeptyd wytwarza się in situ. Jak zauważono wyżej, polinukleotyd można podawać w każdym z wielu układów doprowadzania znanych przeciętnemu specjaliście w tej dziedzinie. W rzeczywistości w tej dziedzinie dobrze znanych jest wiele technik doprowadzania genów, takich jak techniki opisane przez Rollanda, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198, 1998, i w cytowanych tam referencjach. Odpowiednie układy ekspresji polinukleotydów będą zawierać oczywiście konieczne regulatorowe sekwencje regulatorowych DNA w celu ekspresji u pacjenta (takie jak odpowiedni promotor i sygnał kończący).

Zatem w niektórych rozwiązaniach opisane tu polinukleotydy kodujące immunogenne polipeptydy wprowadza się w celu ekspresji do odpowiednich komórek ssaka-gospodarza stosując szereg znanych układów opartych na wirusach. W jednym z ilustracyjnych rozwiązań retrowirusy zapewniają dogodną i skuteczną platformę dla układów doprowadzania genów. Wybraną sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd można wprowadzać do wektora i pakować do cząstek retrowirusa stosując techniki znane w tej dziedzinie. Wirus rekombinacyjny można następnie wydzielać i doprowadzać do pacjenta. Opisano szereg ilustracyjnych układów retrowirusowych (patrz na przykład amerykański opis patentowy nr US 5,219,740, Miller i Rosman (1989) BioTechniques 7: 980-990, Miller, A.D. (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14, Scarpa i inni (1991) Virology 180: 849-852, Burns i inni (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037, i Boris-Lawrie i Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109.

Ponadto opisano także szereg ilustracyjnych układów opartych na adenowirusach. Inaczej niż w przypadku retrowirusów, które integrują się z genomem gospodarza, adenowirusy utrzymują się poza chromosomami, a zatem minimalizują ryzyko związane z mutagenezą związaną z insercją (HajAhmad i Graham (1986) J. Virol. 57: 267-274, Bett i inni (1993) J. Virol. 67: 5911-5921, Mittereder i inni (1994) Human Gene Therapy 5: 717-729, Seth i inni (1994) J. Virol. 68: 933-940, Barr i inni (1994) Gene Therapy 1: 51-58, Berkner, K.L. (1988) BioTechnics 6: 616-629, i Rich i inni (1993) Human Gene Therapy 4: 461-476).

W celu doprowadzania polinukleotydów opracowano także różne układy wektorów oparte na adenozwiązanych wirusach (AAV). Wektory AAV można łatwo konstruować stosując techniki dobrze znane w tej dziedzinie (patrz na przykład amerykańskie opisy patentowe nr US 5,173,414 i 5,139,941, międzynarodowe zgłoszenia patentowe PCT nr WO 92/01070 i WO 93/03769, Lebkowski i inni (1988) Molec. Cell. Biol. 8: 3988-3996, Vincent i inni (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Carter, B.J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533-539, Muzyczka, N. (1992) Current lopics in Microbiol. and Immunol. 158: 97-129, Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801, Sheiling and Smith (1994) Gene Therapy 1: 165-169, i Zhou i inni (1994) J. Exp. Med. 179: 1867-1875.

Dodatkowe wektory wirusowe użyteczne przy doprowadzaniu polinukleotydów kodujących opisane tu polipeptydy drogą przenoszenia genów obejmują wektory wirusowe pochodzące z rodziny wirusów ospy, takich jak wirus krowianki i wirus ospy ptasiej. Tytułem przykładu rekombinacyjny wirus krowianki, dający ekspresję nowych cząsteczek, można konstruować w sposób następujący. DNA kodujący polipeptyd poddaje się najpierw insercji do odpowiedniego wektora, tak że sąsiaduje on z promotorem krowianki i flankującymi sekwencjami DNA krowianki, takich jak sekwencja kodująca kinazę tymidyny (TK). Ten wektor wykorzystuje się następnie do transfekcji komórek, które infekują się jednocześnie krowianką. Rekombinacja homologiczna służy do insercji promotora krowianki plus genu kodującego interesujący polipeptyd do genomu wirusa. Otrzymaną rekombinacyjną sup.(-)TK można wybrać drogą hodowania komórek w obecności 5-bromodezoksyurydyny i wybrać oporne na nią płytki wirusowe.

Układ infekcji/transfekcji oparty na krowiance można wykorzystać dogodnie do zapewnienia dającej się wywoływać, przejściowej ekspresji albo współekspresji jednego albo więcej opisanych tu polipeptydów w komórkach gospodarza organizmu. W tym szczególnym układzie komórki infekuje się najpierw in vitro rekombinacyjnym wirusem krowianki, który koduje polimerazę RNA bakteriofagu T7. Ta polimeraza ujawnia doskonałą specyficzność polegającą na tym, że dokonuje się transkrypcji tylko

PL 220 536 B1 matryc zawierających promotory T7. Po infekcji komórki poddaje się transfekcji interesującym polinukleotydem albo polinukleotydami, dokonywanej za pomocą promotora T7. Polimeraza poddana ekspresji w cytoplazmie z rekombinacyjnego wirusa krowianki dokonuje transkrypcji poddanego transfe kcji DNA do RNA, który następnie poddaje się translacji do polipeptydu drogą translacyjnych mechanizmów gospodarza. Taka metoda zapewnia przejściowe, cytoplazmowe wytwarzanie na wysokim poziomie dużych ilości RNA i jego produktów translacji (patrz na przykład Elroy-Stein and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 6743-6747, Fuerst i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8122-8126.

Alternatywnie wirusy ospy ptasiej, takie jak wirusy ospy drobiu i kanarków, można zastosować także do doprowadzania interesujących sekwencji kodujących. Rekombinacyjne wirusy ospy ptasiej, dające ekspresję immunogenów z patogenów ssaków, są znane jako nadające odporność ochronną, gdy podawane są nie-ptasim gatunkom. Stosowanie wektora Avipox jest szczególnie pożądane u człowieka i innych gatunków ssaków, ponieważ przedstawiciele rodzaju Avipox mogą replikować się wydajnie w odpowiednim gatunku ptasim, a zatem nie poddają się infekcji w komórkach ssaków. Sposoby otrzymywania rekombinacyjnych wirusów ospy ptasiej są znane w tej dziedzinie i stosuje się w nich rekombinację genetyczną, jak opisano wyżej w odniesieniu do wytwarzania wirusów ospy (patrz na przykład WO 91/12882, WO 89/03429 i WO 92/03545).

Do doprowadzania opisanych tu kompozycji polinukleotydowych, takich jak wektory znane z amerykańskich opisów patentowych nr US 5,843,723, 6,015,686, 6,008,035 i 6,015,694, można zastosować także szereg wektorów alfawirusowych. Stosować można także niektóre wektory oparte na wenezuelskim końskim zapaleniu mózgu (VEE), których ilustracyjne przykłady można znaleźć w amerykańskich opisach patentowych nr US 5,505,947 i 5,645,576.

Ponadto, do doprowadzania genów można także stosować molekularne sprzężone wektory, takie jak adenowirusowe wektory chimeryczne opisane przez Michaela i innych w J. Biol. Chem. (1993) 268: 6866-6869, i Wagnera i innych w Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 6099-6103.

Dodatkową ilustracyjną informację o tych i innych znanych układach doprowadzania opartych na wirusach można znaleźć na przykład u Fischer-Hocha i innych, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321, 1989, Flexnera i innych, Ann. N.Y. Acad. Sci. 569: 86-103, 1989, Flexnera i innych, Vaccine 8: 17-21, 1990, w amerykańskich opisach patentowych nr 4,603,112, 4,769,330 i 5,017,487, w WO 89/01973, US 4,777,127, GB 2200651, EP 0345242, WO 91/02805, u Berknera, Biotechnigues 6: 616-627, Rosenfelda i innych, Science 252: 431-434, 1991, Kollsa i innych, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219, 1994, Kass-Eslera i innych, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11498-11502, 1993, Guzmana i innych, Circulation 88: 2838-2848, 1993, oraz Guzmana i innych, Cir. Res. 73: 12021207, 1993.

W niektórych rozwiązaniach polinukleotyd można włączać do genomu komórki docelowej. Takie włączenie może mieć miejsce w specyficznym miejscu i orientacji poprzez rekombinację homologiczną (zastąpienie genu) albo może być wprowadzone w losowym, niespecyficznym miejscu (powiększenie genu). W jeszcze dalszych rozwiązaniach polinukleotyd można utrzymywać trwale w komórce jako oddzielny, episomalny segment DNA. Takie odcinki polinukleotydowe albo „episomy” kodują sekwencje wystarczające do umożliwienia utrzymywania i replikacji niezależnej od cyklu komórek gospodarza albo w synchronizacji z tym cyklem. Sposób, w jaki konstrukcja ekspresji jest doprowadzana do komórki, gdzie polinukleotyd pozostaje w komórce, zależy od rodzaju zastosowanej konstrukcji ekspresji.

W innym rozwiązaniu, polinukleotyd podaje się/doprowadza w postaci „nagiego” DNA, jak opisano na przykład u Ulmera i innych, Science 259: 1745-1749, 1993, i przejrzano u Cohena, Science 259: 1691-1692, 1993. Wychwytywanie nagiego DNA można zwiększyć drogą opłaszczania DNA na podatnych na rozkład biologiczny perełkach, które transportuje się skutecznie do komórek.

W jeszcze innym rozwiązaniu, opisaną tu kompozycję można doprowadzać drogą bombardowania cząstek, z których wiele zostało opisane. W jednym z ilustracyjnych przykładów przyspieszanie cząstek napędzanych gazem można prowadzić za pomocą urządzeń, takich jak urządzenia wytwarzane przez Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) i Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI), których kilka przykładów jest znane z amerykańskich opisów patentowych nr US 5,846,796, 6,010,478, 5,865,796, 5,584,807 i EP nr 0500799. Taki sposób podejścia oferuje doprowadzanie bezigłowe, w którym kompozycję suchego proszku mikroskopijnych cząstek, takich jak cząstki polinukleotydu albo polipeptydu, przyspiesza się do wysokiej prędkości w strumieniu gazowego helu wytwarzanym za pomocą urządzenia trzymanego w ręku, napędzając cząstki do interesującej docelowej tkanki.

PL 220 536 B1

W podobnym rozwiązaniu inne urządzenia i sposoby, które mogą być użyteczne przy napędzanym gazem, bezigłowym zastrzyku kompozycji tu opisanych obejmują urządzenia i sposoby dostarczone przez Bioject, Inc. (Portland, OR), których kilka przykładów jest znane z amerykańskich opisów patentowych nr US 4,790,824, 5,064,413, 5,312,335, 5,383,851, 5,399,163, 5,520,639 i 5,993,412.

W niektórych rozwiązaniach kompozycja farmaceutyczna jest korzystnie kompozycją, która wywołuje odpowiedź immunologiczną przeważnie typu Th1. Wysokie poziomy cytokin typu Th1 (na przykład IFN-γ, INFa, IL-2 i IL-12) mają skłonność do sprzyjania wywoływaniu odpowiedzi immunologicznych z udziałem komórek przeciw podanemu antygenowi. W przeciwieństwie do tego, wysokie poziomy cytokin typu Th2 (na przykład IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10) mają skłonność do sprzyjania wywoływaniu humoralnych odpowiedzi immunologicznych. Po zastosowaniu opracowanej tu kompozycji immunogennej u pacjenta będzie występowała odpowiedź immunologiczna, która obejmuje odpowiedzi typu Th1 i Th2. W korzystnym rozwiązaniu, w którym odpowiedź jest przeważnie typu Th1, poziom cytokin typu Th1 będzie wzrastać w większym stopniu niż poziom cytokin typu Th2. Poziomy tych cytokin można łatwo ustalić stosując próby standardowe. Alternatywnie albo dodatkowo wysokie poziomy cytokin typu Th2 (na przykład IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10) mogą być pożądane w pewnych zastosowaniach terapeutycznych. Poziomy tych cytokin można łatwo ustalić stosując próby standardowe. Co do przeglądu rodzin cytokin, to należy odnieść się do Mossmanna i Coffmana, Ann. Rev. Immunol. 7: 145173, 1989.

Ilustracyjne kompozycje do stosowania przy indukcji cytokin typu Th1 obejmują, na przykład, połączenie oligonukleotydów zawierających CpG (w których dinukleotyd CpG nie jest metylowany), jak opisano na przykład w WO 96/02555, WO 99/33488 i amerykańskich opisach patentowych nr US 6,008,200 i 5,856,462. Opisane są także immunostymulujące sekwencje DNA, na przykład przez Sato i innych, Science 273: 352, 1996. Inne środki immunostymulujące zawierają saponiny, takie jak QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA) i podobne pochodne saponin i ich mimetyków.

Do kompozycji tu opisanych można wprowadzać każdy z szeregu dodatkowych środków immunostymulujących, na przykład cytokiny, takie jak GM-CSF, interferony, albo interleukiny w celu dalszego modulowania interesującej odpowiedzi immunologicznej, a dodatkowo środki immunopobudzające Montanide ISA 720 (Seppic, Francja), SAF (Chiron, Kalifornia, Stany Zjednoczone), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), seria SBAS adiuwantów (na przykład SBAS-2 albo SBAS-4, dostępne w SmithKline Beecham, Rixensart, Belgia) i Enhanzyn™ (Corixa, Hamilton, MT). W WO 99/52549A1 opisano i można także stosować środki immunostymulujące oparte na eterach polioksyetylenowych.

Kompozycje farmaceutyczne tu opisane będą ponadto zawierać często jeden albo więcej buforów (na przykład obojętny buforowany roztwór soli fizjologicznej albo roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem), węglowodany (na przykład glukozę, mannozę, sacharozę albo dekstrany), mannitol, białka, polipeptydy albo aminokwasy, takie jak glicyna, przeciwutleniacze, środki bakteriostatyczne, środki chelatujące, takie jak EDTA albo glutation, adiuwanty (na przykład wodorotlenek glinowy), rozpuszczone środki, które nadają kompozycji właściwości izotoniczne, hipotoniczne albo słabo hipertoniczne z krwią odbiorcy, środki zawieszające, środki zagęszczające i/lub środki konserwujące. Alternatywnie kompozycje tu opisane można komponować w postaci liofilizatu.

Opisane tu kompozycje farmaceutyczne mogą być zawarte w pojemnikach z jedną dawką albo z wieloma dawkami, takich jak zatopione ampułki albo fiolki. Takie pojemniki zamyka się szczelnie w taki sposób, aby zachować sterylność i trwałość kompozycji do czasu użycia. Na ogół kompozycje można przechowywać w postaci zawiesin, roztworów albo emulsji w oleistych albo wodnych nośnikach. Alternatywnie kompozycję farmaceutyczną można przechowywać w stanie zamrożenia na sucho, wymagając tylko bezpośrednio przed użyciem dodatku sterylnego ciekłego nośnika.

Opracowanie odpowiednich reżimów dawkowania i leczenia przy stosowaniu opisanych tu szczególnych kompozycji w szeregu reżimów leczenia, włącznie na przykład z podawaniem doustnym, pozajelitowym, dożylnym, donosowym i domięśniowym i komponowania, jest dobrze znane w tej dziedzinie, a niektóre z nich są krótko omówione niżej w celu ogólnej ilustracji.

W niektórych zastosowaniach opisane tu kompozycje farmaceutyczne można doprowadzać do zwierzęcia drogą podawania doustnego. Kompozycje jako takie można komponować z obojętnym rozcieńczalnikiem albo z podatnym na asymilację jadalnym nośnikiem, albo można je zamykać w kapsułce żelatynowej z twardą albo miękką osłonką, albo można je prasować w tabletki, albo można je wprowadzać bezpośrednio do pożywienia w diecie.

Związki czynne można nawet wprowadzać z rozczynnikami i stosować w postaci dających się połykać tabletek, tabletek podpoliczkowych, kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, wafli,

PL 220 536 B1 itp. (patrz na przykład Mathiowitz i inni, Nature, 27 marzec 1997, 386 (6623): 410-4, Hwang i inni, Crit Rev Ther Drug Carrier Sits 1998, 15 (3): 243-84, amerykańskie opisy patentowe nr US 5641515, 5580579 i 5792451). Tabletki, kołaczyki, pigułki, kapsułki, itp. mogą zawierać także każdy z szeregu dodatkowych składników i na przykład można dodawać środek wiążący, taki jak guma tragakantowa, guma arabska, skrobia zbożowa albo żelatyna, rozczynniki, takie jak fosforan diwapniowy, środek rozpulchniający, taki jak skrobia zbożowa, skrobia ziemniaczana, kwas alginowy, itp., środek poślizgowy, taki jak stearynian magnezu, i środek słodzący, taki jak sacharoza, laktoza albo sacharyna, albo środek smakowo-zapachowy, taki jak mięta pieprzowa, olejek wintergrinowy albo wiśniowy środek smakowo-zapachowy. Gdy jednostkowa postać dawkowania jest kapsułką, to może ona zawierać, oprócz materiałów powyższego rodzaju, ciekły nośnik. Różne inne materiały mogą być zawarte jako powłoki albo do modyfikowania w inny sposób fizycznej postaci dawki jednostkowej. Na przykład tabletki, pigułki albo kapsułki mogą być powlekane szelakiem, cukrem albo jednym i drugim. Oczywiście każdy materiał stosowany przy otrzymywaniu jakiejkolwiek dawki jednostkowej powinien być farmaceutycznie czysty i w zasadzie n ietoksyczny przy stosowanych ilościach. Ponadto związki czynne można wprowadzać do preparatu i kompozycji o przedłużonym uwalnianiu.

Te kompozycje będą zawierać typowo co najmniej około 0,1% albo więcej związku czynnego, chociaż zawartość procentowa składnika (składników) czynnego może oczywiście zmieniać się i wynosić korzystnie od około 1 albo 2% do około 60 albo 70% albo więcej w stosunku do ciężaru albo objętości całej kompozycji. Oczywiście ilość składnika (składników) czynnych w każdej terapeutycznie skutecznej kompozycji można przygotowywać w taki sposób, że otrzyma się odpowiednią dawkę w każdej danej dawce jednostkowej związku. Specjalista w dziedzinie otrzymywania takich kompozycji farmaceutycznych będzie brać pod uwagę takie czynniki jak rozpuszczalność, dostępność biologiczna, biologiczny okres półtrwania, droga podawania, okres użytkowania produktu oraz inne względy farmakologiczne, i jako takie może być pożądany szereg dawek i reżimów leczenia.

W przypadku podawania doustnego kompozycje tu opisane można wprowadzać alternatywnie z jednym albo więcej rozczynników w postaci płukanki do ust, pasty do zębów, tabletki podpoliczkowej, sprayu do ust, albo podjęzykowego preparatu podawanego doustnie. Alternatywnie, składnik aktywny może być wprowadzony do roztworu do podawania doustnego, takiego jak roztwór zawierający boran sodu, glicerynę i wodorowęglan potasu, lub zawieszony w paście do zębów, lub dodany w terapeutycznie skutecznej ilości do kompozycji, która może zawierać wodę, środki wiążące, środki ścierające, środki smakowo-zapachowe, środki pieniące oraz środki zwilżające. Alternatywnie, kompozycjom można nadawać postać tabletki albo roztworu, które można umieszczać pod językiem albo rozpuszczać w ustach w inny sposób.

W pewnych okolicznościach będzie pożądane doprowadzanie opisanych tu kompozycji farmaceutycznych drogą podawania pozajelitowego, dożylnego, domięśniowego, a nawet dootrzewnowo. Takie sposoby podejścia są dobrze znane specjaliście w tej dziedzinie, z których niektóre opisuje się dalej, na przykład w amerykańskich opisach patentowych nr US 5,543,158, 5,641,515 i 5,399,363. W niektórych rozwiązaniach roztwory związków czynnych w postaci wolnej zasady albo farmaceutycznie akceptowalnych soli można przygotowywać w wodzie zmieszanej korzystnie ze środkiem powierzchniowo czynnym, takim jak hydroksypropyloceluloza. Dyspersje można otrzymywać także w glicerynie, ciekłych glikolach polietylenowych i ich mieszaninach oraz w olejach. W zwykłych warunkach przechowywania i stosowania takie preparaty będą na ogół zawierać środek konserwujący w celu zapobiegania rozwojowi drobnoustrojów.

Ilustracyjne farmaceutyczne postacie odpowiednie do stosowania jako zastrzyki obejmują sterylne wodne roztwory albo zawiesiny i sterylne proszki do odręcznego otrzymywania sterylnych roztworów albo dyspersji do zastrzyków (patrz na przykład amerykański opis patentowy nr US 5,466,468). We wszystkich przypadkach postać musi być sterylna i musi być ciekła w takim stopniu, aby była podatna na podawanie strzykawką. Postać musi być trwała w warunkach produkcyjnych i przechowywania oraz musi być chroniona przed zanieczyszczającym działaniem drobnoustrojów, takich jak bakterie i grzyby. Nośnik może być rozpuszczalnikiem albo medium dyspersyjnym zawierającym na przykład wodę, etanol, poliol (na przykład glicerynę, glikol propylenowy i ciekły poliglikol etylenowy, itp.), ich odpowiednie mieszaniny i/lub oleje roślinne. Odpowiednią płynność można utrzymywać, na przykład, poprzez zastosowanie powłoki, takiej jak lecytyna, poprzez utrzymywanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i/lub poprzez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. Zapobieganie działaniu drobnoustrojów może być ułatwione za pomocą różnych przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych środków, takich jak na przykład parabeny, chlorobutanol, fenol,

PL 220 536 B1 kwas sorbowy, thimerosal, itp. W wielu przypadkach korzystne będzie wprowadzanie środków izotonicznych, na przykład cukrów albo chlorku sodowego. Przedłużoną absorpcję kompozycji do zastrzyków można wywoływać poprzez zastosowanie w kompozycjach środków opóźniających absorpcję, na przykład monostearynianu glinu i żelatyny.

W jednym z rozwiązań, w przypadku pozajelitowego podawania w roztworze wodnym, roztwór powinien być odpowiednio buforowany, jeżeli jest to konieczne, a ciekły rozcieńczalnik powinien mieć izotoniczność nadaną za pomocą odpowiedniego roztworu soli fizjologicznej albo glukozy. Te szczególne roztwory wodne nadają się zwłaszcza do podawania dożylnego, domięśniowego, podskórnego i dootrzewnowego. W związku z tym, w świetle niniejszego opisu, sterylne wodne medium, które można stosować, będzie znane specjaliście w tej dziedzinie. Na przykład jedną dawkę można rozpuszczać w 1 ml izotonicznego roztworu NaCl i albo dodawać do 1000 ml płynu do wlewu podskórnego albo wstrzykiwać w proponowanym miejscu infuzji (patrz na przykład „Remington's Pharmaceutical Sciences”, 15 wydanie, str. 1035-1038 i 1570-1580). Pewna zmiana dawki będzie konieczna w zależności od stanu chorobowego leczonego pacjenta. Co więcej, w przypadku podawania ludziom, preparaty będą oczywiście spełniać korzystnie normy sterylności, gorączkotwórczości i ogólnego bezpieczeństwa oraz czystości, wymagane przez Biuro FDA Norm Biologicznych.

W innym rozwiązaniu, opisane tu kompozycje można komponować w postaci obojętnej albo w postaci soli. Ilustracyjne farmaceutycznie akceptowalne sole obejmują sole addycyjne z kwasami (utworzone z aminokwasowymi grupami białka), które tworzy się z kwasami nieorganicznymi, takimi jak na przykład kwas chlorowodorowy albo kwas fosforowy, albo z takimi kwasami organicznymi jak kwas octowy, szczawiowy, winowy, migdałowy, itp. Sole utworzone z wolnymi grupami karboksylowymi mogą pochodzić także z nieorganicznych zasad, takich jak na przykład wodorotlenek sodu, potasu, amonu, wapnia lub żelaza, i takich zasad organicznych jak izopropyloamina, trimetyloamina, histydyna, prokaina, itp. Po skomponowaniu roztwory będą podawane w sposób zgodny z kompozycją dawki i w takiej ilości, która jest terapeutycznie skuteczna.

W niektórych rozwiązaniach kompozycje farmaceutyczne można podawać za pomocą sprayów donosowych, drogą inhalacji i/lub innych aerozolowych nośników do doprowadzania. Sposoby doprowadzania genów, kwasów nukleinowych i kompozycji peptydowych bezpośrednio do płuc poprzez donosowe spraye aerozolowe są znane na przykład z amerykańskich opisów patentowych nr US 5,756,353 i 5,804,212. Podobnie doprowadzanie leków stosując wewnątrznosowe żywice w postaci mikrocząstek (Takenaga i inni, J Controlled Release, 2 marzec 1998, 52 (1-2): 81-7) i związki lizofosfatydyloglicerynowe (amerykański opis patentowy nr US 5,725,871) jest dobrze znane w dziedzinie farmaceutyków. Podobnie ilustracyjne doprowadzanie leków poprzez błonę śluzową w postaci osnowy na podłożu politetrafluoroetylenowym jest znane z amerykańskiego opisu patentowego nr US 5,780,045.

W niektórych rozwiązaniach do wprowadzania opisanych tu kompozycji do odpowiednich komórek/organizmu gospodarza stosuje się liposomy, nanokapsułki, cząstki lipidowe, pęcherzyki, itp. W szczególności kompozycje można komponować do podawania albo w postaci kapsułkowanej w ciekłej cząstce, liposomie, pęcherzyku, nanosferze albo nanocząstce, itp. Alternatywnie, kompozycje mogą być związane, kowalencyjnie albo niekowalencyjnie, z powierzchnią takich rozczynników nośnikowych.

Tworzenie i stosowanie preparatów liposomowych i liposomopodobnych jako potencjalnych nośników leków jest na ogół znane specjaliście w tej dziedzinie (patrz na przykład Lasic, Trends Biotechnol, lipiec 1998, 16 (7): 307-21, Takakura, Nippon Rinsho, marzec 1998, 56 (3): 691-5, Chandran i inni, Indian J Ex Biol., sierpień 1997, 35 (8): 801-9, Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995, 12 (2-3): 233-61, amerykańskie opisy patentowe nr US 5,567,434, 5,552,157, 5,565,213, 5,738,868 i 5,795,587).

Liposomy zostały zastosowane z powodzeniem z szeregiem rodzajów komórek, które normalnie są trudne do transfekcji innymi sposobami postępowania, włącznie z zawiesinami komórek T, pierwotnymi kulturami hepacytowymi i komórkami PC 12 (Renneisen i inni, J Biol Chem. 25 wrzesień 1990, 265 (27): 16337-42, Muller i inni, DNA Cell Biol, kwiecień 1990, 9 (3): 231-9). Poza tym liposomy są wolne od ograniczeń związanych z długością DNA, które są typowe dla układów doprowadzania opartych na wirusach. Liposomy zostały zastosowane skutecznie do wprowadzania genów, różnych leków, środków radioterapeutycznych, enzymów, wirusów, czynników transkrypcyjnych, efektorów alosterycznych, itp., do szeregu hodowanych linii komórkowych i zwierząt. Ponadto stosowanie liposomów

PL 220 536 B1 nie wydaje się być związane z reakcjami autoimmunologicznymi albo nieakceptowalną toksycznością po doprowadzeniu systemowym.

W niektórych rozwiązaniach liposomy tworzą się z fosfolipidów, które są zdyspergowane w medium wodnym i samorzutnie tworzą wielolamelarne, koncentryczne pęcherzyki dwuwarstwowe (nazywane także pęcherzykami wielolamelarnymi (MLV).

Alternatywnie, w innych rozwiązaniach, opracowano farmaceutycznie akceptowalne, nanokapsułkowe preparaty opisanych tu kompozycji. Nanokapsułki mogą na ogół wychwytywać związki w sposób trwały i odtwarzalny (patrz na przykład Quintanar-Guerrero i inni, Drug Dev Ind Pharm., grudzień 1988, 24 (12): 1113-28). W celu uniknięcia skutków ubocznych na skutek wewnątrzkomórkowego przeciążenia polimerami, takie ultradrobne cząstki (o wielkości około 0,1 μ) można konstruować stosując polimery, które mogą rozkładać się in vivo. Takie cząstki można wytwarzać, jak zostało to opisane na przykład przez Couvreura i innych, Crit Rev Ther Drug Carier Syst. 1988, 5 (1): 1-20, zur Muhlen i inni, Eur J Pharm Biopharm., marzec 1998, 45 (2): 149-55, Zambaux i inni, J Controlled Reiease, styczeń 1998, 50 (1-3): 31-40, oraz w amerykańskim opisie patentowym nr US 5,145,684. Terapie raka

Immunologiczne sposoby leczenia raka opierają się na rozpoznaniu, że komórki rakowe mogą często wymykać się mechanizmom obronnym organizmu przed nieprawidłowymi albo obcymi komórkami i cząsteczkami oraz że ta obrona mogłaby być stymulowana terapeutycznie w celu ponownego odzyskania utraconego względu, na przykład str. 623-648 u Kleina, Immunology (Wiley-Interscience, New York, 1982). Liczne ostatnie obserwacje, że różne immunologiczne efektory mogą bezpośrednio albo pośrednio hamować rozwój nowotworów, doprowadziły do ponownego zainteresowania się tym sposobem podejścia do terapii rakowej (patrz na przykład Jager i inni, Oncology 2001, 60 (1): 1-7, Renner i inni, Ann Hematol, grudzień 2000, 79 (12): 651-9.

Cztery podstawowe rodzaje komórek, których funkcja została związana z przeciwnowotworową odpornością komórek i eliminowaniem komórek rakowych z organizmu, obejmują i) limfocyty B, które wydzielają immunoglobuliny do osocza krwi w celu identyfikowania i znakowania komórek niesamoinwazyjnych, ii) monocyty, które wydzielają białka dopełniacza, które są odpowiedzialne za lizę i przetwarzanie opłaszczonych immunoglobuliną, docelowych komórek inwazyjnych, iii) limfocyty naturalnie zabijające, które mają dwa mechanizmy niszczenia komórek nowotworowych, cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał i naturalnego zabijania oraz iv) limfocyty T, które mają receptory specyficzne dla antygenu i wykazują zdolność rozpoznawania komórki nowotworowej zawierającej komplementarne cząsteczki markera (Schreiber, H, 1989, w Fundamental Immunology, W.E. Paul (redaktor), str. 923-955).

Immunoterapia rakowa skupia się na ogół na wywoływaniu humoralnych odpowiedzi immunologicznych, komórkowych odpowiedzi immunologicznych, albo jednego i drugiego. Ponadto, powszechnie przyjęto, że wywoływanie komórek pomocniczych CD4⁺ jest konieczne w celu wtórnego wywoływania albo przeciwciał albo cytotoksycznych komórek T CD8⁺. Antygeny polipeptydowe, które są selektywne albo idealnie specyficzne względem komórek rakowych, dostarczają potężnego sposobu podejścia przy wywoływaniu odpowiedzi immunologicznych przeciw rakowi.

Opisane tu kompozycje można stosować do stymulowania odpowiedzi immunologicznych przeciw rakowi. W takich sposobach opisane tu kompozycje farmaceutyczne podaje się pacjentowi, typowo zwierzęciu ciepłokrwistemu, a zwłaszcza człowiekowi. Pacjent może, ale nie musi być dotknięty rakiem. Kompozycje farmaceutyczne i szczepionki można podawać albo przed albo po chirurgicznym usunięciu nowotworów pierwotnych i/lub leczeniu, takim jak podawanie radioterapeutycznych albo konwencjonalnych leków chemioterapeutycznych. Jak omówiono wyżej, podawanie kompozycji terapeutycznych można prowadzić każdym odpowiednim sposobem, włącznie z podawaniem dożylnym, dootrzewnowym, domięśniowym, podskórnym, donosowym, przezskórnym, doodbytniczym, dopochwowym, miejscowym i doustnym.

W niektórych rozwiązaniach immunoterapia może być immunoterapią czynną, w której leczenie opiera się na stymulowaniu in vivo endogennego układu odpornościowego gospodarza w celu reakcji przeciw nowotworom z podawaniem środków modyfikujących odpowiedź immunologiczną (takich jak przewidziane tu polipeptydy albo polinukleotydy).

Drogi i częstość podawania opisanych tu kompozycji terapeutycznych, jak również dawka, będą zmieniać się pomiędzy osobnikami, i można je łatwo ustalić stosując standardowe techniki. Na ogół kompozycje farmaceutyczne i szczepionki można podawać poprzez wstrzyknięcie (na przykład doskórne, domięśniowe, dożylne albo podskórne), donosowo (na przykład drogą zasysania) albo doust28

PL 220 536 B1 nie. Korzystnie wciągu 52 tygodni można podawać od 1 do 10 dawek. Korzystnie podaje się 6 dawek w przedziałach 1 miesiąca, a szczepionki wspomagające można podawać potem okresowo. Dla poszczególnych pacjentów mogą być odpowiednie zmienne protokoły. Odpowiednia dawka jest ilością związku, który przy podawaniu, jak opisano wyżej, nadaje się do promowania przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej, i wynosi co najmniej 10-50% powyżej poziomu podstawowego (to jest bez leczenia). Taką odpowiedź można kontrolować drogą pomiaru przeciwciał przeciwnowotworowych u pacjenta albo drogą zależnego od szczepionki wytwarzania cytolitycznych komórek efektorowych zdolnych do zabijania komórek nowotworowych pacjenta in vivo. Takie szczepionki powinny nadawać się także do wywoływania odpowiedzi immunologicznej, która prowadzi do lepszego wyniku klinicznego (na przykład częstszej remisji, całkowitego albo częściowego albo dłuższego przeżywania bez chorób) u szczepionych pacjentów w porównaniu z pacjentami nieszczepionymi. Na ogół w przypadku kompozycji farmaceutycznych i szczepionek zawierających jeden albo więcej polipeptydów ilość każdego polipeptydu zawartego w dawce wynosi od około 25 μg do 5 mg na kg ciężaru gospodarza. Odpowiednie wielkości dawek będą zmieniać się z wielkością pacjenta, lecz będą wynosić typowo od około 0,1 do około 5 ml.

Na ogół odpowiednia dawka i reżim leczenia zapewniają związek (związki) czynny w ilości wystarczającej do zapewnienia terapeutycznego i/lub profilaktycznego skutku. Taką reakcję można kontrolować drogą ustalania lepszego wyniku klinicznego (na przykład częstszych remisji, całkowitego, albo częściowego, albo dłuższego przeżywania bez chorób) u leczonych pacjentów w porównaniu z pacjentami nieleczonymi. Wzrosty poprzednio istniejących odpowiedzi immunologicznych na białko nowotworowe korelują z lepszym wynikiem klinicznym. Takie odpowiedzi immunologiczne można na ogół oceniać stosując standardowe próby namnażania, cytotoksyczności, albo próby cytokinowe, które można prowadzić stosując próbki otrzymane od pacjenta przed i po leczeniu.

Wynalazek będzie dalej opisany za pomocą następujących nieograniczających przykładów i przykładów badawczych, które są podane tylko dla celów ilustracyjnych.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

Modyfikacje łańcuchów acylowych pierwotnych kwasów tłuszczowych

W tym przykładzie opisuje się otrzymywanie pochodnych pierwotnego kwasu tłuszczowego, które mają łańcuchy acylowe pierwotnych kwasów tłuszczowych o zmiennej długości, samodzielnie albo w połączeniu ze zmiennymi łańcuchami wtórnego kwasu tłuszczowego, na przykład związki 1a-c i 2a-c, w których pierwotne kwasy tłuszczowe o krótkim (C6) i średnim (C10) łańcuchu łączy się z wtórnymi kwasami tłuszczowymi o krótkim, średnim albo długim łańcuchu.

Te związki otrzymuje się stosując albo dobrze ustalony aglikon seryny (R₁ = CO₂H) albo, alternatywnie, stosując chemicznie bardziej trwałą i jonizującą jednostkę aglikonu fosforanu serynolu (R1 = CH2OPO3H2). Wybór fosforanu serylu/serynolu będzie opierać się na porównywaniu aktywności biologicznych znanych pochodnych serylowych 3a, b z nowymi fosforanami serynolu 4a, b.

PL 220 536 B1

3a R₂=C6 acyl (RC-526) 3b R₂=C₁₀ acyl (RC-527)

4a R2=Cgacyl 4b R2Cio acyl

Pochodne pierwotnych związków ze zmodyfikowanym łańcuchem syntezuje się drogą modyfikacji poprzednio opisanej metody (B1 u Johnsona i innych, amerykański opis patentowy nr US 6355251) stosując wspólny zaawansowany związek pośredni, który umożliwia wprowadzanie acyloksykwasów związanych amidowo albo estrowo pod koniec syntezy (Schemat I). Początkowy etap syntezy polega na glikolizacji akceptora 6 ze znanym tetraoctanem 5 (otrzymanym w 4 etapach z glukozaminy) otrzymując β-glikozyd 7 i przemianie 7 we wspólny zaawansowany związek pośredni (CAI) 8, który optymalizuje się w przypadku R1=CO2Bn. Selektywne 4-O-acylowanie i N-usuwanie grupy zabezpieczającej/acylowanie dają pochodną heksaacylową 9, którą przekształca się w 3-4 etapach w 1a-c albo 2a-c drogą fosforylowania i odblokowania.

Wymagane kwasy (R)-3-n-alkanoiloksyalkanowe otrzymuje się według Keegana i innych, Tetrahedron; Asymmetry, 7 (12): 3559-3564, 1996, wychodząc z odpowiednich estrów 3-oksometylowych. Wysoką czystość chemiczną i diastereoizomeryczną produktów 1 i 2 osiąga się albo drogą chromatografii w fazie normalnej na żelu krzemionkowym albo, alternatywnie, drogą chromatografii na celulozie albo chromatografii podziałowej ciecz-ciecz na żelu Sephadex LH-20. Czystość wydzielo1 13 nych soli trietyloamoniowych ustala się środkami spektroskopowymi (IR, ¹H- i ¹³C-NMR) i fizycznymi (analiza drogą spalania, FAB-MS) oraz HPLC.

P r z y k ł a d 2

Związki glicylowe i fosfonooksyetylowe (PE)

W tym przykładzie opisuje się syntezę związków glicylowych 11a, b i związków fosfonooksyetylowych (PE) 12a, b, które są prawie regioizomeryczne z 3a, b i 4a, b.

PL 220 536 B1

12a R₂=Caacy! 12b R₂=C₁₀acyI lia R₂=Ceacyl lib R₂=C₁₀acyl

Te związki otrzymuje się najłatwiej drogą bardziej zbieżnej syntezy niż synteza przedstawiona na Schemacie I, w której wspólny donor C6- albo C10-glikozylowy 13 sprzęga się z odpowiednią N-acylowaną (albo alternatywnie N-Troc-zabezpieczoną, niepokazaną) jednostką akceptorową 14 albo 15 w obecności jonu srebrowego otrzymując β-glikozydy 16 (Schemat II). Akceptor glicyny 14 otrzymuje się według Bulusu i innych, J Med Chem, 35 (19): 3463-3469, 1992, z etanoloaminy i bromooctanu benzylu (albo t-butylu), a następnie N-acylowania albo zabezpieczania. Fosforan 15 otrzymuje się drogą monofosforylowania N-acylowanej (albo zabezpieczonej) dietanoloaminy. Oczekuje się, że N-usunięcie grupy zabezpieczającej/acylowanie albo N,N-diacylowanie w przypadku Troczabezpieczonego aglikonu (Jiang i inni, Tetrahedron, 58 (43): 8833-8842, 2002) β-glikozydów 16 i odszczepienie fenylu i innych grup zabezpieczających otrzymanej pochodnej heksaacylowanej 17 da pożądane związki 11a, b i 12a, b, które wydziela się i charakteryzuje jako ich sole trietyloamonowe po oczyszczaniu chromatograficznym na żelu krzemionkowym albo żelu LH-20 albo celulozie DEAE.

Związki 16 są związkami nowymi i stanowią jeszcze inny aspekt niniejszego ujawnienia.

P r z y k ł a d 3

Wtórne eterolipidy

W tym przykładzie opisuje się syntezę pochodnych kwasu (R)-3-alkiloksytetradekanowego (18a, b), które są odporne na niekorzystny metabolizm i/lub hydrolizę wodną. W celu syntezy związków 18a, b należy otrzymać najpierw eterowe analogi lipidów związków wtórnych kwasów tłuszczowych 3a, b albo odpowiednie fosforany serynolu 5a, b. Jak przedstawiono retrosyntetycznie na Schemacie III syntezę cząsteczek docelowych 18a, b można osiągnąć drogą podstawienia kwasu (R)-3-heksyloksytetradekanowego albo kwasu (R)-3-decyloksytetradekanowego zamiast odpowiednich

PL 220 536 B1 acyloksykwasów, poczynając z selektywnym 3-O-acylowaniem wspólnego zaawansowanego produktu pośredniego 8 na Schemacie I i przechodząc przez produkt pośredni 9 (R₂=C₆- albo C₁₀-alkil, n = 9). Wymagane alkiloksykwasy 19 syntezuje się z kwasu (R)-3-hydroksytetradekanowego albo jego estru fenacylowego, produktów pośrednich przy syntezie acyloksykwasów, znanymi sposobami z ogólną wydajnością >50% (Keegan i inni, Tetrahedron: Asymmetry, 7 (12): 3559-3564, 1996, Watanabe i inni, Carbohydr Res, 332 (3): 257-277, 2001, Jiang, Bioorg Med Chem Lett, 12 (16): 2193-2196, 2002, Christ i inni, amerykański opis patentowy nr US 5530113, 1996).

S RjoCHaCan lub COjBn wspólny zaawansowany produkt pośredni

18a π-t (O; łlkil)

18b n=S (Cio aM) R^CHjOPOjHj tub CO2H

ΗΗΓπκ ΝΗΤπκ

Schemat III

P r z y k ł a d 4

Pierwotne i wtórne eterolipidy

W tym przykładzie opisuje się związki (20a, b) zawierające pierwotny eterolipid w położeniu C-3 cukru oraz trzy wtórne eterolipidy. Te związki syntezuje się drogą alkilowania acetonidu 21, produktu pośredniego przy syntezie donoru glikozylu 13 (Schemat II) z sulfonianem 22, który z kolei otrzymuje się w jednym etapie z alkoholowego prekursora 19 otrzymując dwueter 23 (Schemat IV). Grupy 4,6-funkcyjne i aktywacja anomeryczna dają chlorek glikozylu 24, który następnie przetwarza się jak na Schemacie II stosując w etapach N-acylowania odpowiednie alkiloksykwasy. Na alternatywnym schemacie w etapie 3-O-alkilowania można stosować pochodną 2-azydo⁴² albo 2-tri-fluoroacetamido⁴⁵.

P r z y k ł a d 5

Związki C-6-modyfikowane

W tym przykładzie opisuje się związki, które mają zablokowany 6-hydroksyl. W tym przykładzie stosuje się eter metylowy albo grupę fluorową w połączeniu ze związkami 25a, b i 26a, b fosforanu serylu albo serynolu. Jak wspomniano wyżej, te związki także stanowią aspekt ujawnienia.

PL 220 536 B1

Związki otrzymuje się z diolu 27, jak przedstawiono na Schemacie V. Produkt pośredni 27, otrzymany w dwóch etapach z acetonidu 21, poddaje się znanymi sposobami funkcjonalizacji w położeniu 6 (Christ i inni, amerykański opis patentowy nr 5530113, 1996, Watanabe i inni, Carbohydr Res, 333 (3): 203-231, 2001) otrzymując alkohol 28. Przemiana 28 w chlorki 29 w dwóch etapach i obróbka według Schematu II daje cząsteczki docelowe 25a, b i 26a, b. Związki z pierwotnymi i/lub wtórnymi wiązaniami eterowymi, jak opisano wyżej w Przykładzie 4, można modyfikować, jak opisano w tym przykładzie, w celu dalszego zabezpieczenia cząsteczek przed rozkładem chemicznym i enzymatycznym.

Claims

1. Związek o wzorze:

w którym n oznacza 1 albo 5, a R₆ oznacza COOH albo CH₂OPO₃H₂.

2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że n oznacza 1.

3. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że n oznacza 5.

4. Związek według zastrz. 2, znamienny tym, że R6 oznacza COOH.

5. Związek według zastrz. 3, znamienny tym, że R6 oznacza COOH.

Departament Wydawnictw UPRP