CN101863930A - 一些氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯化合物和它们的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明描述和要求保护是佐剂和免疫效应物的化合物。该化合物扩大免疫动物中抗体产生及刺激细胞因子产生和激活巨噬细胞。也公开了将化合物用做佐剂和免疫效应物的组合物和方法。

Description

一些氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯化合物和它们的用途
相关申请的交叉参考
本申请要求2003年1月6日提交的美国临时申请60/438,585的优先权，这里将该申请的内容整体并入为参考文献。
背景技术
Toll样受体(TLRs)与有效的天然免疫应答有关，并且识别对病原体唯一的不同结构成分；这种相互作用将免疫系统驱动成具有短期和长期结果的激活状态。在开发TLRs的激动剂和拮抗剂方面，这有重要意义，因为天然免疫应答的药物学操作可以产生更有效的疫苗和对自身免疫病、特应性过敏症、恶性病和感染性疾病的新的治疗方法。发现是Toll样受体激动剂的第一种微生物产物是LPS，一种对革兰氏阴性细菌特异的细菌细胞膜成分，其激活Toll样受体4(TLR-4)。尽管LPS是有效的免疫调节剂，但是由于它的极端毒性，包括系统炎性应答综合症的诱导，它的药物学用途有限。LPS的生物学活性内毒素亚结构部分是脂质-A，磷酸化多脂肪酸酰化的葡糖胺二糖，其用于在革兰氏阴性细菌外膜中锚定整个结构。通过脂质A的选择性化学修饰产生单磷酰脂质A化合物(MPLTM免疫刺激剂；Corixa Corporation；Seattle，WA)，可以改进脂质A的毒性作用。已经描述了在疫苗佐剂和其它应用中制备和使用MPLTM免疫刺激剂和结构类似化合物的方法(参见，例如美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094；4,987,237；Johnson等，J Med Chem 42：4640-4649(1999)；Ulrich和Myers，in Vaccine Design：The Subunit andAdjuvant Approach；Powell和Newman编辑；Plenum：New York，495-524，1995)。特别地，这些和其它参考文献证明当在具有蛋白质和碳水化合物抗原的疫苗制剂中使用MPLTM免疫刺激剂和相关的化合物时，其具有显著的佐剂活性，用于增强对抗原的体液和/或细胞介导的免疫及与Toll样受体的相互作用。
根据MPLTM免疫刺激剂和其它细菌细胞壁成分的经验，开发了一类新的合成化合物家族，氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGPs)。AGP化合物也做为激动剂和拮抗剂与TLR-4相互作用。AGPs包含无环和环化化合物(美国专利号6,113,918和6,303,347，1998年10月12日公开的WO 98/50399，2001年5月17日公开的WO 01/34617，2001年11月29日公开的WO 01/90129，和2002年2月14日公开的WO 02/12258)。象MPLTM免疫刺激剂，已经证明当这些化合物与抗原制备疫苗组合物时，它们保留了显著的佐剂特征，并且当与MPLTM免疫刺激剂比较，它们还具有相似或改进的毒性模式。也证明了AGPs的粘膜佐剂活性和在缺少抗原的情况下它们的有效性，这使得它们成为用于预防和/或治疗用途的有吸引力的化合物。
与MPLTM免疫刺激剂和类似物比较，AGPs提供的另一个显著优点是容易通过合成方法工业规模地生产AGPs。因为合成产生AGPs，所以它们没有MPL中发现的痕量生物杂质。这样，在一些方法中，诸如在必须最小化佐剂致热性的儿科免疫方法中，AGPs做为疫苗佐剂具有优于MPL的优点。然而，因为AGPs是化学合成的，非最佳的化合物稳定性将引起降解产物的积累，该降解产物的积累可以引起不同批次间可变的生物学活性和稳定性。从开发用于制备人类临床试验材料的GMP方法立场看，批次稳定性和不同批次的可变性是主要问题。因此，最期望的是与MPLTM免疫刺激剂等比较具有增加的生物活性，与Toll样受体相互作用，和/或最适于大规模GPL合成的化合物。本发明通过提供修饰的化合物以满足这些和其它需要，该修饰的化合物具有增加的生物活性、具有增加的酶促和化学降解抗性的稳定性和/或改进的安全模式。
发明内容
在一方面，本发明包括这里所定义的一些新的氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯化合物和其药物学上可接受的盐。本发明还包括含有该化合物和/或它们盐的组合物，和该化合物做为佐剂和凭其本身的特性做为药物学上有效化合物的应用方法。
发明详述
本发明化合物是氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯家族的成员。如下所述，本发明化合物不同地具有对6个酰基链(一级和二级)长度的修饰，烷基臂的结构修饰以包含磷酸部分，结构修饰以在C-3糖位置包含一级醚脂质及包含3个二级醚脂质和/或6-羟基保护基团。
化学上已知为ω-氨烷基2-氨基-2-脱氧-4-膦酰基-β-D-吡喃葡糖苷的AGPs是一类合成脂质A模拟物，其结构上与单磷酰脂质A中成分的主要生物学活性成分相关。在AGPs中，用N-[(R)-3-正烷酰氧基十四烷酰基]氨烷基糖苷配基单元取代了还原糖。象其它的二糖脂质A衍生物，AGPs包含用于获得最大生物学活性的6个脂肪酸，但是与二糖衍生物不同，AGPs含有构象上柔性的β-连接的糖苷配基单元，其允许6个脂酰链能量上有利的紧密堆积。认为6角形排列的6个脂肪酸的紧密堆积在脂质A样分子的生物活性中起主要作用(Seydel等，Immunobiol；187(3-5)：191-211，1993)。
本发明的化合物被认为是AGP家族成员。这些化合物包含6个酰基链(一级和二级)长度的修饰。
在一个最广义的方面中，本发明的一个特征是具有下列结构式(I)的APG化合物：
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH基团；n，m，p和q是从0到6的整数；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂肪酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4和R5相同或不同，并且选自H和甲基；R6和R7相同或不同，并且选自H、羟基、烷氧基、膦酰基、膦酰氧基、磺基、磺氧基、氨基、巯基、氰基、硝基、甲酰基和羧基，和其酯和酰胺；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代饱和脂肪族基团；或其药物学可接受的盐。
在本发明该方面的优选实施方式中，
-X和Y优选地都是氧原子；
-R1，R2和R3优选地是正酰基基团，并且最优选地独立地选自C6-C10直链酰基的基团(最优选地是饱和酰基基团)；
-R10，R11和R12优选地是具有1到10个，优选地3到9个，更优选地3到7个碳原子的未取代的饱和脂肪族(即，烷基)基团，并且最优选地是具有3到7个碳原子的相同的未取代的饱和脂肪族基团。
化合物1a，b和2a，b及它们药物学可接受的盐是这种类型化合物(I)的示例性成员。
Figure GSA00000097816700041
因此，本发明的化合物(I)类似一些已知的APGs，不同之处是它们具有更短的一级脂肪酸链。发现二级脂肪酸链长度的改变影响AGPs和3-D-MPL的二级脂肪酸同系物的免疫刺激能力(Johnson等，JMed Chem，42：4640-4649，1999)。一些天然脂质A变异体诸如R.sphaeroides脂质A的低内毒性(endotoxicity)部分是由于这些分子中存在更短的(C10)一级脂肪酸(Qureshi等，JBiol Chen；266(10)：6532-6538，1991)。同样地，一些螺杆菌属(Helicobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)LPS的低毒性可能是由于含有一级脂肪酸的六酰基成分的存在，该一级脂肪酸长度不同于毒性沙门氏菌属(Salmonella)脂质A中发现的一级脂肪酸长度(Moran等，JBacteriol；179(20)：6453-6463，1997；Kulshin等，Eur J Biochem；198(3)：697-704，1991)。尽管已经有限程度地研究了含有达到3个脂肪酸的脂质A合成亚基类似物(Hasegawa等，Biosci BiotechBiochem；59(9)：1790-1792，1995和Ogawa等，Carbohydr Res；220：155-164，1991)和脂质IVa的四酰基二糖类似物(Fukase等，Tetrahedron；54：4033-4050，1998)的一级酰基链长度之间的关系，但是就我们所知对于脂质A或脂质A模拟物的基本六酰化药效基团(pharmacophore)还没有进行过系统的研究。
也包含在本发明特征中的是一些甘氨酰和膦酰氧基乙基(PE)化合物(L-丝氨醇磷酸酯类)。这些是其中R5和R7是氢，n、m和q是0，且其中p是1且R6是COOH，或者其中p是2且R6是OPO3H2的上述结构式(I)的化合物。因此，这些化合物具有通式(II)：
Figure GSA00000097816700051
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代饱和脂肪族基团；或其药物学可接受的盐。
在本发明化合物(II)的优选实施方式中，
-X和Y优选地都是氧原子；
-R1，R2和R3优选地是正酰基基团，并且最优选地独立地选自C6-C10直链酰基基团；
-R10，R11和R12基团优选地是具有1到10个，优选地3到9个，更优选地3到7个碳原子的未取代的饱和脂肪族(即，烷基)基团，并且最优选地是具有3到7个碳原子的相同的未取代的饱和脂肪族基团。
化合物11a，b和12a，b是这种类型化合物(II)的示例性成员。
Figure GSA00000097816700061
化合物12a，12b含有烷基臂的结构修饰以包含磷酸酯部分。认为这种化合物比其它家族成员可能更稳定。这些化合物具有优于丝氨酰/丝氨醇磷酸酯类AGPs的优点，因为它们在糖苷配基单元中缺少立体中心(stereogenic center)，该特征可以使合成复杂化并且导致很难分离对映体或非对映体杂质。
本发明的另一种类型化合物是(R)-3-烷氧基十四烷酸衍生物。这些化合物具有上述相同的通式(II)，不同的是R1，R2和R3不是酰基，而是直链烷基，产生了R1O-，R2O-和R3O-醚，而不是羧酸衍生物。在这种类型化合物中，优选地R1，R2和R3是C6-C10烷基。它们可以相同或不同，但是最优选地它们相同。
这类化合物具有通式(III)
Figure GSA00000097816700071
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到11个碳原子的直链未取代饱和脂肪族基团；或其药物学可接受的盐。
在本发明化合物(III)的优选实施方式中，
-X和Y优选地都是氧原子；
-R1，R2和R3最优选地独立地选自未取代的C6-C10直链酰基基团；
-R10，R11和R12基团优选地是具有1到11个，优选地3到9个，更优选地3到7个碳原子的未取代的饱和脂肪族(即，烷基)基团，并且最优选地是具有3到7个碳原子的相同的未取代的饱和脂肪族基团。
化合物18a，b是这组化合物的示例性成员，在C-3糖位置含有一级醚脂质及3个二级醚脂质。
然而，本发明的另一种类型化合物具有结构式(IV)：
Figure GSA00000097816700082
其中Y现在是氧原子；X选自在直立或平伏位置的O和S；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1，R6是COOH，或p是2，R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代饱和脂肪族基团；或其药物学可接受的盐。
因此，这些化合物具有2个酰化链和一个非酰化醚链。
在本发明化合物(IV)的优选实施方式中，
-X优选地是氧原子；
-R1，R2和R3最优选地独立地选自未取代的C6-C10直链烷基基团；
-R10，R11和R12基团优选地是具有1到10个，优选地3到9个，更优选地3到7个碳原子的未取代的饱和脂肪族(即，烷基)基团，并且最优选地是具有3到7个碳原子的相同的未取代的饱和脂肪族基团。
化合物20a，b是这类化合物的示例性成员。
Figure GSA00000097816700091
这些化合物具有可以抵抗不利代谢和/或水解的特征。已经假设了如下逐渐成为减少脂质A毒性的防御机理：通过人类酰氧基酰基水解酶(AOAH)，在结构不同的脂质A分子中选择性移除正常的脂肪酸以产生拮抗剂脂质IVa(Erwin和Munford.，J Biol Chem 265(27)：16444-16449，1990)。然而，天然来源的3-D-MPL主要六酰基成分具有的更大毒性可能是由于存在结构不同于IVa的不太高度酰化的成分((Ulrich和Myers，Monophosphoryl lipid Aas an Adjuvant.Past experiences and new directions.In：Vaccine Design：TheSubunit and Adjuvant Approach.Powell M.F.编辑，Newman M.J.Plenum Press，New York，1995；495-524页，Johnson等，J Med Chem；42：4640-4649，1999)。3-D-MPL和其它脂质A制备物中的结构可变性本质上是由于半合成和分离方法期间的酯切割及关联LPS。实际上，已经报道了推定的类球红细菌(R.sphaeroides)脂质A(LPS诱导的TNF-α产生的有效拮抗剂)化学合成期间酯连接酰基的容易的水解切割产生了小量不期望的激动性副产物(Christ等，Science；268：80-83，1995)。因此，化学和/或酶促不稳定性可能是含有不稳定酯键的潜在脂质A药物的致命弱点。用具有醚键替代一级和/或二级酯连接的脂肪酸的水解稳定类似物已经克服了脂质A激动剂和拮抗剂分子中存在的酯连接脂肪酸的化学和代谢不稳定性(Christ等.上文，Lien等，J Biol Chem；，276(3)：1873-1880，2001)。
本发明的其它化合物具有6-羟基保护基团(blocking group)。这些化合物具有结构式(V)：
Figure GSA00000097816700101
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH基团；n，m，p和q是从0到6的整数；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4和R5相同或不同，并且选自H和甲基。R6和R7相同或不同，并且选自H、羟基、烷氧基、膦酰基、膦酰氧基、磺基、磺氧基、氨基、巯基、氰基、硝基、甲酰基和羧基，和其酯和酰胺；R8是膦酰基；PG表示下述的羟基保护基团，R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代饱和脂肪族基团；或其药物学可接受的盐。
术语“保护基团(protecting Group)(这里表示为“PG”)”指用于替代羟基的氢原子以封闭，防止，或降低该基团反应性的任何大量基团。可以在T.W.Greene和P.G.Futs，″Protective Groups inOrganic Chemistry″(Wiley)，Beaucage和Iyer，Tetrahedron 48：2223(1992)和Harrison等，Compendium of Synthetic OrganicMethods，1-8卷(Wiley)中发现保护基团的例子(及其常用简称的列举)。代表性羟基保护基团包括其中例如使用，例如，甲基、乙酰基，苄基，三苯甲基，烷基，四氢吡喃基，烯丙基和三取代的甲硅烷基基团形成醚或酯，羟基基团被酰基化或烷基化的保护基团，或者其中羟基基团被氟替代的保护基团。
本领域熟练技术人员可根据给定的化合物，目的或条件组而选择保护基团，这样可一般性地或选择性地在主导条件(其它反应性化合物的存在，pH，温度，等)下保护所讨论的反应性基团。可用于本发明的保护基团包括甲基、邻苯二甲酰，乙酰基(Ac)，苄基(Bn)，2，2，2-三氯乙氧基羰基(Troc)，叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)，叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)，和2，2，2-三氯-1，1-二甲基乙基氯甲酰基(TCBOC)基团。氟原子也可以用做保护基团。正如本领域所已知，某个保护基团或某类基团可能比其它基团更适合特定的化合物或给定的条件，并且在开发涉及具有反应性基团诸如羟基的化合物的方法方面利用了这些适合性。
在本发明这些化合物(V)的优选实施方式中，
-X和Y优选地都是氧原子；
-R1，R2和R3优选地是正酰基基团，最优选地是独立地选自C6-C10直链酰基基团；
-R10，R11和R12基团优选地是具有1到10个，优选地3到9个，更优选地3到7个碳原子的未取代的饱和脂肪族(即，烷基)基团，并且最优选地是具有3到7个碳原子的相同的未取代的饱和脂肪族基团。
这组的示例性成员包括与丝氨酰基或丝氨醇磷酸酯AGPs联合使用的具有甲基醚的化合物25a，b，或具有氟原子的化合物26a，b。
在脂质A衍生物合成期间，未保护的C-6糖羟基基团可能产生难于移除的小数量的杂质(Christ，上文)。这些副产物可能是由起始4，6-环磷酸酯形成和随后的重排产生的(Imoto等，Tetrahedron Lett；29(28)：2227-2230，1988)。
如这里所述，除了另外说明，术语“脂肪族”本身或做为另一个取代基的部分指直或支链，或环状烃基，或其组合，其可以是完全饱和的、单-或多不饱和的，并且可以包含具有规定的碳原子数(即C1-C10是指1至10个碳原子)的二-和多价基团。饱和烃族基团的例子包括诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基等基团，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等等。不饱和脂肪族基团是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和脂肪族基团的例子包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁间二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和高级同系物和异构体。典型地，脂肪族基团具有1到24个碳原子。“低级脂肪族基团”是短链脂肪族基团，通常具有8个或更少的碳原子。
术语“酰基”指通过去除羟基基团而衍生自有机酸的基团。酰基基团的例子包括乙酰基、丙酰基、十二烷酰基、十四烷酰基、异丁酰基等。因此，如这里所用的术语“酰基”意指包含另外定义为-C(O)-脂肪族的基团，其中优选地脂肪族基团是饱和脂肪族基团。
术语“药物学上可接受的盐”意指包括活性化合物的盐，其中根据这里所描述化合物上发现的特定取代基，用相对非毒性酸或碱制备该盐。当本发明化合物含有相对酸性官能性时，纯净地或在适合的惰性溶剂中，通过用足够量的期望碱接触中性形式的这种化合物可以获得碱加成盐。药物学上可接受的碱加成盐的例子包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐，或类似的盐。当本发明化合物含有相对碱性官能性时，纯净地或在适合的惰性溶剂中，通过用足够量的期望酸接触中性形式的这种化合物可以获得酸加成盐。药物学上可接受的酸加成盐的例子包括衍生于无机酸，如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等的盐，及来源于相对无毒有机酸诸如醋酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、延胡索酸、乳酸、苯乙醇酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、p-甲苯基磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸的盐等。也包括氨基酸盐诸如精氨酸盐等，和有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸的盐等(参见，例如Berge，S.M.，等，″PharmaceuticalSalts，″Journal of Pharmaceutical Science，66，1-19，1977)。本发明的一些特定化合物含有碱和酸官能性两者，该官能性允许化合物转化为碱或酸加成盐。
通过用碱或酸接触盐，并且用常规方法分离母体化合物可以再生中性形式的化合物。对于本发明目的而言，在一些物理性质，诸如在极性溶剂中的溶解度方面，母体形式的化合物不同于各种盐形式，但是在别的方面该盐却等同于母体形式的化合物。
除了盐形式，本发明还提供了前体药物形式的化合物。这里描述的化合物前体药物是在生理条件下容易受化学改变以提供本发明化合物的化合物。此外，在离体环境下，通过化学或生物化学方法可以将前体药物转化为本发明的化合物。例如，当前体药物放置在带有适合酶或化学试剂的经皮贴剂药池中时，前体药物可以慢慢地转化为本发明的化合物。
本发明的一些化合物可以以非溶剂化形式及溶剂化形式，包括水合形式存在。一般地，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并且旨在包含于本发明范围中。本发明的一些化合物可以存在多种结晶或无定形形式。一般地，所有物理形式都同样可以用于本发明所考虑的用途，并且旨在本发明范围中。
本发明的一些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋物、非对映异构体、几何异构体和单独的异构体都旨在包含在本发明的范围中。
本发明的化合物在组成这种化合物的一个或多个原子上也可以包含非天然比例的原子同位素。例如，可以用放射性同位素，诸如例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)放射性标记化合物。所有本发明化合物的放射性同位素变型，无论是否是放射性的都意欲包含在本发明范围中。
可以用任何适合的方法制备本发明的化合物；参见下面的实施例部分，已经描述了其中许多方法。例如，美国专利号6,113,918；美国专利号6,303,347；和PCT/US98/09385(WO 98/50300，1998年10月12日)中描述了用于制备本发明中所用的一些化合物的方法。利用Johnson，等，J.Med.Chem.42：4640-4649(1999)，Johnson，等，Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2273-2278(1999)，和PCT/US98/50399(WO 98/50399，1998年11月12日)中概述的方法可以制备其它化合物。一般地，上述参考文献中所述的合成方法和本领域熟悉的其它合成方法广泛地适用于制备这些化合物。例如，在制备具有不同酰基基团和取代的化合物方面，本领域技术人员将理解可以修改这里所述汇集方法(convergent methods)以利用替代酰化剂，或者可以利用含有适合连接的酰基基团的商购物质开始该方法。
在用于激发或增强免疫应答的组合物中，本发明的化合物与抗原诸如蛋白质或多肽抗原或表达蛋白质或多肽抗原的多核苷酸可以一起施用给温血动物，包括人类。本领域技术人员容易确定被施用以激发期望应答的抗原的量，并且所述抗原的量随施用抗原的类型、施用的途径和免疫程序表而变化。
也可以在没有外源抗原的情况下施用本发明的化合物，以激发通过非特异性抗性作用的直接保护，如下文所述：参见Persing，2001年11月29日WIPO公布的WO 01/90129。可以在快速疫苗制剂中使用具有刺激非特异性抗性和/或激发佐剂效果能力的化合物。本发明化合物与抗原一起施用在3到4周引起获得性粘膜免疫应答。例如，在4周期间，通过鼻内途径每周施用这种化合物，通过联合最初天然免疫应答提供的保护，及随后对目的抗原的获得性免疫应答，将提供快速和持久的保护。
可以用各种测定形式评测本发明的化合物以鉴定和筛选具有最适合本发明特定应用特征的这些化合物。例如，可以使用动物模型用于鉴定和估测本发明化合物施用后释放到系统循环中的细胞因子释放模式。此外，存在各种体外和体内模型，所述模型用于检查对不同抗原成分的一方面或多方面免疫应答的变化以鉴定最适于激发特异性目的免疫应答的化合物。例如，在体外，化合物可以与靶细胞，诸如巨噬细胞、树突状细胞或朗氏细胞接触，并且可以测定精细的细胞因子。此外，可以使用基因表达阵列以鉴定特定目的化合物激活或抑制的特定途径。
利用本发明化合物处理人血液和/或细胞，并且通过ELISA(R&D系统)测定诱导可以检测细胞因子诱导/产生。这种方法也可以用于检测是否诱导是依赖于Toll受体。通过基于51Cr的细胞毒性测定法可以检测施用本发明化合物后细胞毒性T淋巴细胞应答。如果期望，可以比较本发明化合物的这方面性能和已知在这方面起作用的其它化合物，诸如脂质A、MPL、AGPs等。此外，可以联合一种或多种佐剂和/或免疫调制剂评估本发明化合物以鉴定协同作用(参见，例如美国专利号6,303,347和6,113,918和2001年11月29日公开的WO01/90129)。
动物模型诸如鼠流感攻击模型和鼠单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)攻击模型可用于评估佐剂和免疫调制剂活性。简而言之，在施用本发明化合物后进行流感或单核细胞增生性李斯特氏菌攻击。监测发病指数(皱纹的皮毛、弓起的姿势和费力的呼吸)、体重损失和死亡率(对于流感)或处理/未处理小鼠脾脏中菌落形成单位(对于单核细胞增生性李斯特氏菌)做为本发明化合物施用所提供的保护的指征(参见，例如2001年11月29日公开的WO01/90129)。
在此使用时，术语“多肽”为其普通含义，即，是一种氨基酸序列。多肽不限于特定长度的产物；因此，多肽的定义中包括肽、寡肽和蛋白质，这些术语在此可交换使用，除非另外特别指明。该术语也并非是指或排除多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域所知的自然发生的和非自然发生的其它修饰。多肽可以是完整的蛋白质，或其亚序列。本发明中的特定目的多肽是含有表位(即实质上负责多肽的免疫原性并且能引发免疫应答的抗原决定簇)的氨基酸亚序列。
本发明所用的多肽在此有时称作肿瘤蛋白质或肿瘤多肽，表示它们的鉴定至少部分基于它们在肿瘤样品中的表达水平提高。因此，“肿瘤多肽”或“肿瘤蛋白质”一般是指本发明的多肽序列，或编码这种多肽的多核苷酸序列，它在实质比例的肿瘤样品中表达，例如，优选地在超过约20％、更优选地超过约30％、最优选地超过约50％或更多的被检测的肿瘤样品中表达，表达水平比在正常组织中的表达水平至少高2倍，优选地至少高5倍，这是利用此处所述的典型测定法测定的。
在某些优选实施方案中，本发明的多肽是免疫原性的，即，它们在免疫测定(如ELISA或T细胞刺激测定)中可与抗血清和/或癌症患者的T细胞可检测地反应。可利用本领域技术人员周知的技术进行对免疫原活性的筛查。例如，利用如Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988中所述的方法可以进行这些筛查。在一个说明性实施例中，多肽可固定于固体载体上，并与患者的血清接触，以使血清内的抗体与固定的多肽结合。然后除去未结合的血清，并利用例如125I-标记的蛋白A检测结合的抗体。
熟练技术人员应当知道，本发明也包括此处公开的多肽的免疫原性部分。在此使用，“免疫原性部分”是本发明的免疫原性多肽的片段，其本身对可识别该多肽的B细胞和/或T细胞表面抗原受体具有免疫学反应性(即，特异性结合)。一般可以用众所周知的技术，如Paul，Fundamental Immunology，第三版，243-247(Raven Press，1993)和此处引用的参考文献所概述的技术鉴定免疫原性部分。这些技术包括筛查多肽与抗原特异性抗体、抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力。在此使用时，如果抗血清和抗体能与抗原特异性结合(即，它们在ELISA或其它免疫测定中能与该蛋白质反应，但与无关蛋白质没有可检测到的反应)，则它们是“抗原特异性的”。可以如此处所述和利用众所周知的技术制备这些抗血清和抗体。
在一个优选实施方案中，本发明多肽的免疫原性部分是可与抗血清和/或T细胞以基本上不低于全长多肽反应性的水平(例如在ELISA和/或T细胞反应性测定中)反应的部分。优选地，免疫原性部分的免疫原活性水平为全长多肽的免疫原活性的至少约50％、优选地至少约70％、最优选地超过约90％。有时，鉴定优选的免疫原性部分，它们具有高于相应全长多肽的免疫原活性水平，例如，具有高于约100％或150％或更高的免疫原活性的水平。
在其它某些实施方案中，示例性免疫原性部分可包括N端前导序列和/或跨膜域已经缺失的肽。其它说示例性免疫原性部分相对于成熟蛋白质可含有小的N-和/或C-末端缺失(例如，1-30个氨基酸，优选地5-15个氨基酸)。
在另一个实施方案中，本发明的多肽组合物也可以含有一种或多种与所产生的抗本发明多肽的T细胞和/或抗体进行免疫学反应的多肽，特别是具有此处公开的氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段或变体。
在本发明的另一个实施方案中，提供这样的多肽：它们含有一种或多种能激发与此处所述一种或多种多肽进行免疫学反应的T细胞和/或抗体的多肽，此处公开的多核苷酸中所含邻接核酸序列编码的一种或多种多肽，或其免疫原性片段或变体。
多肽可以在蛋白质的N端含有信号(或前导)序列，该序列在翻译时或在翻译后引导该蛋白质的转移。多肽也可以与接头或其它序列(例如聚-His)偶联，以便于多肽的合成、纯化或鉴定，或增强该多肽与固体载体的结合。例如，多肽可以与免疫球蛋白Fc区偶联。
在其它示例性实施方案中，多肽可以是融合多肽，其含有如此处所述的多种多肽，或者含有至少一种此处所述的多肽和一种无关序列，如已知的肿瘤蛋白。例如，融合伴侣可帮助提供T辅助表位(免疫融合伴侣)，优选可被人体识别的T辅助表位，或者有助于以高于原始重组蛋白的产量表达该蛋白质(表达增强子)。某些优选的融合伴侣既是免疫性的又是增强表达的融合伴侣。可以选择其它融合伴侣，以提高多肽的溶解度，或使多肽能靶向希望的胞内区室。其它融合伴侣包括有利于多肽纯化的亲和标记。
融合多肽一般可以利用包括化学偶联在内的标准技术制备。优选地，融合多肽表达为一种重组多肽，使得在表达系统中的生产水平高于非融合多肽。简言之，编码多肽成分的DNA序列可以分开装配，并连接到合适的表达载体中。编码一种多肽成分的DNA序列3’末端在有或没有肽接头的情况下与编码第二多肽成分的DNA序列5’末端连接，使序列的阅读框同步。这允许翻译为单一的融合多肽，其保留了两种成分多肽的生物活性。
可以使用一种肽接头序列将第一和第二多肽成分分开一段距离，以确保每种多肽折叠为二级和三级结构。利用本领域周知的标准技术将这种肽接头序列加入到融合多肽中。可以根据下列因素选择合适的肽接头序列：(1)它们采取灵活延伸构象的能力；(2)它们不能采取可与第一和第二多肽上的功能表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可与多肽功能表位相互作用的疏水性或带电残基。优选的肽接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。在接头序列中也可使用其它接近中性的氨基酸，如Thr和Ala。可以用作接头的氨基酸序列包括Maratea等，Gene 40：39-46，1985；Murphy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：8258-8562，1986；美国专利号4,935,233和美国专利号4,751,180所公开的接头序列。接头序列长度一般为1个到约50个氨基酸。当第一和第二多肽含有可以用来分开功能结构域并防止空间干扰的非必需N端氨基酸区时，不需要肽接头序列。
连接的DNA序列可操作地连接合适的转录或翻译调节元件。负责DNA表达的调节元件只位于编码第一种多肽的DNA序列的5’。类似地，末端翻译所需的终止密码子和转录终止信号只存在于编码第二种多肽的DNA序列的3’。
融合多肽可以含有如此处所述的多肽和无关免疫原性蛋白质，如一种能激发记忆应答的免疫原性蛋白质。这类蛋白质的例子包括破伤风、结核和肝炎蛋白(参见，例如，Stoute等，New Engl.J.Med.336：86-91，1997)。
在一个优选实施方案中，免疫融合伴侣来源于分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)，如来自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的Ra12片段。美国专利申请60/158,585描述了Ra12组合物和方法提高异源多核苷酸/多肽序列的表达和/或免疫原性的用途。简言之，Ra12是指一个多核苷酸区，它是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)MTB32A核酸的亚序列。MTB32A是一种分子量为32KD的丝氨酸蛋白酶，由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的毒力株和无毒力株的基因编码。已经描述了MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列(例如，美国专利申请60/158,585；参见Skeiky等人，Infection and Immun.(1999)67：3998-4007)。MTB32A编码序列的C端片段高水平表达，在纯化过程中保持为可溶性多肽。而且，Ra12可以提高与之融合的异源免疫原性多肽的免疫原性。一种优选的Ra12融合多肽含有对应于MTB32A的氨基酸残基192-323的14KD的C端片段。其它优选的Ra12多核苷酸一般含有编码Ra12多肽一部分的至少约15个连续核苷酸，至少约30个核苷酸，至少约60个核苷酸，至少约100个核苷酸，至少约200个核苷酸，或至少约300个核苷酸。Ra12多核苷酸可以含有一种原始序列(即，编码一种Ra12多肽或其部分的内源序列)，或者可以含有该序列的一种变体。Ra12多核苷酸变体可以含有一个或多个置换、添加、缺失和/或插入，使得编码的融合多肽的生物活性基本上不低于含有原始Ra12多肽的融合多肽。优选地，这些变体显示与编码原始Ra12多肽或其部分的多核苷酸序列有至少约70％的同一性，更优选地至少约80％的同一性，最优选地至少约90％的同一性。
在其它优选实施方案中，免疫融合伴侣来源于蛋白质D-革兰氏阴性菌(Haemophilus influenza B)的表面蛋白(WO 91/18926)。优选地，蛋白质D衍生物含有该蛋白质的大约前三分之一(例如，N端前100-110个氨基酸)，并且蛋白D衍生物可以脂质化。在某些优选实施方案中，在N端含有脂蛋白D融合伴侣的前109个残基，以提供含有其它外源T细胞表位的多肽，并提高在大肠杆菌(E.coli)中的表达水平(从而作为表达增强子)。脂质尾确保抗原向抗原递呈细胞最佳递呈。其它融合伴侣包括来源于流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。一般使用N端81个氨基酸，但也可使用含有T辅助表位的不同片段。
在另一个实施方案中，免疫融合伴侣是被称作LYTA的蛋白质或其部分(优选地C端部分)。LYTA来源于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，该菌合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，被称作酰胺酶LYTA(由LytA基因编码；Gene 43：265-292，1986)。LYTA是一种自溶酶，可特异性降解肽聚糖主链中的某些键。LYTA蛋白的C末端结构域负责与胆碱或某些胆碱类似物(如DEAE)的亲和性。这种性质已被开发用于发展用于融合蛋白表达的大肠杆菌(E.coli)C-LYTA表达质粒。在氨基末端含C-LYTA片段的杂种蛋白的纯化已有描述(参见，Biotechnology 10：795-798，1992)。在一个优选实施方案中，LYTA的重复部分可以掺入融合蛋白中。在C末端区中发现一个开始于残基178的重复部分。一个特别优选的重复部分含有残基188-305。
另一个示例性实施方案涉及融合多肽，和编码它们的多核苷酸，其中融合伴侣含有能将多肽导向内体/溶酶体区室的导向信号，如美国专利号5,633,234所述。本发明的免疫原性多肽当与这种导向信号融合时，将更有效地与MHC II类分子结合，从而使该多肽特异的CD4+T细胞的体内刺激增强。
利用本领域周知的多种合成和/或重组技术制备本发明的多肽。一般少于约150个氨基酸的多肽、部分和其它变体能利用本领域技术人员周知的技术通过合成法产生。在一个示例性实施例中，利用可商品获得的固相技术，如Merrifield固相合成法合成这些多肽，其中向生长的氨基酸链中顺序添加氨基酸。参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2146，1963。多肽自动合成装置可购自供应商，如PerkinElmer/Applied BioSystems Division(Foster City，CA)，可以按照制造商的使用说明书操作。
本发明的多肽组合物(包括融合多肽)通常是分离的。“分离的”多肽是从其原始环境中移除出的多肽。例如，如果将一种天然存在的蛋白质或多肽与自然系统中的一些或全部共存物质分开，则该蛋白质或多肽是分离的。优选地，这种多肽也是纯化的，例如，纯度是至少约90％，更优选地至少约95％，最优选地至少约99％。
在其它方面，本发明提供了包含编码上述多肽抗原的一种或多种多核苷酸的化合物。术语“DNA”和“多核苷酸”在此基本上可交换使用，是指已经分离不含特定物种的总基因组DNA的DNA分子。“分离的”在此使用时是指多核苷酸基本上不含其它编码序列，而且DNA分子不含无关编码DNA的较大部分(如大染色体片段或其它功能基因或多肽编码区)。当然，这是指最初分离的DNA分子，不排除后来人工加到该片段中的基因或编码区。
多核苷酸可以含有原始序列(即，编码本发明的多肽/蛋白质或其部分的内源序列)，或可以含有编码该序列的变体或衍生物(优选地是一种免疫原性变体或衍生物)的序列。多核苷酸变体一般含有一个或多个置换、添加、缺失和/或插入，优选地使变体多核苷酸编码的多肽的免疫原性不实质上低于此处所述的多核苷酸序列编码的多肽。术语“变体”应当也包括异种来源的同源基因。
在某些优选实施方案中，上述多核苷酸，如多核苷酸变体、片段和杂交序列编码与此处所述抗原多肽或免疫原性多肽进行免疫学交叉反应的多肽。在其它优选实施方案中，这些多核苷酸编码免疫原活性水平为此处所述多肽序列的至少约50％、优选地至少约70％、更优选地至少约90％的多肽。
本发明的多核苷酸或其片段，无论编码序列本身的长度如何，都可以与其它DNA序列(如启动子、聚腺苷酸化信号、其它限制酶位点、多克隆位点、其它编码片段等)结合，使其总长度可能大大改变。因此考虑可以使用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选地受限于制备的容易程度和在预期重组DNA方案中的应用。例如，考虑总长度为约10000、约5000、约3000、约2000、约1000、约500、约200、约100、约50个碱基对等(包括所有中间长度)的示例性多核苷酸片段可用于本发明的许多实施方式。
可以利用多种完善确立的技术鉴定、制备和/或操作本发明的多核苷酸组合物(通常参见，Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold SpringHarbor，NY，1989，及其它类似的参考文献)。例如，如下详述，通过筛查cDNA微阵列的肿瘤相关表达(即，用此处所述典型测定法测定，在肿瘤中的表达比在正常组织中表达至少高2倍)，可鉴定多核苷酸。例如，这些筛查可以使用Affymetrix，Inc.的微阵列技术(SantaClara，CA)按照使用说明书进行(基本如Schena等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：10614-10619，1996和Heller等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：2150-2155，1997所述)。作为可替代的方案，也可从由细胞制备的cDNA扩增多核苷酸，该细胞表达此处所述蛋白质，如肿瘤细胞。
许多依赖模板的方法可用来扩增样品中存在的目的靶序列。最著名的扩增方法之一是聚合酶链式反应(PCRTM)，在美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159中详细描述了该扩增方法。简言之，在PCRTM中，制备两条与靶序列相对互补链上的区域互补的引物序列。向反应混合物中加入过量的脱氧核苷三磷酸以及DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)。如果样品中存在靶序列，引物将与靶序列结合，聚合酶将通过加入核苷酸使引物沿靶序列延伸。提高和降低反应混合物的温度，延伸的引物就可从靶序列上分离下来，形成反应产物，过量的引物将与靶序列和反应产物结合，该过程重复进行。为了确定扩增的mRNA的量，优选地可以进行反转录和PCRTM扩增过程。聚合酶链式反应方法在本领域众所周知。
其它许多依赖模板的方法在本领域已知并可使用，其中许多是PCRTM扩增技术的变型。例如，这些方法包括：连接酶链式反应(称为LCR)，如欧洲专利申请公开号320,308和美国专利号4,883,750所述；Qβ复制酶，如PCT国际专利申请公开号PCT/US87/00880所述；链置换扩增(SDA)和修复链反应(RCR)。英国专利申请号2 202 328和PCT国际专利申请公开号PCT/US89/01025还描述了其它扩增方法。其它核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)(PCT国际专利申请公开号WO 88/10315)，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR。欧洲专利申请公开号329,822描述了一种核酸扩增方法，它包括循环合成单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA(dsDNA)。PCT国际专利申请公开号WO 89/06700描述了一种核酸序列扩增方法，它是基于启动子/引物序列与单链靶DNA(“ssRNA”)杂交，随后该序列的许多RNA拷贝转录。其它扩增方法如“RACE”(Frohman，1990)和“单向PCR”(Ohara，1989)也为本领域技术人员所周知。
本发明的多核苷酸的扩增部分可用来利用众所周知的技术从适当的文库(例如肿瘤cDNA文库)中分离全长基因。在这些技术中，用一种或多种多核苷酸探针或适于扩增的引物筛查文库(cDNA或基因组文库)。优选地，按大小选择文库，使之包含较大的分子。为了鉴定基因的5’和上游区，也优选随机引物文库。为了获得内含子和延伸的5’序列，优选基因组文库。
对于杂交技术，部分序列可以用众所周知的技术标记(例如通过切口平移或用32P末端标记)。然后，一般通过用标记探针与含有变性菌落(或含有噬菌斑的菌苔)的滤纸杂交，筛查细菌或噬菌体文库(参见，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY，1989)。筛选并扩增杂交菌落或噬菌斑，分离DNA用于进一步分析。例如，可以使用来自部分序列的引物或来自载体的引物进行PCR，分析cDNA克隆，确定其它序列的含量。可产生限制酶切图谱和部分序列，以鉴定一种或多种重叠克隆。然后可利用标准技术确定完整序列，这可能包括产生一系列缺失克隆。然后将产生的重叠序列装配为一个邻接序列。利用众所周知的技术，通过连接合适的片段，产生全长cDNA分子。
做为可替代的方案，还能利用如上所述的扩增技术，以由部分cDNA序列获得全长编码序列。一种这样的扩增技术是反向PCR(参见，Triglia等，Nucl.Acids Res.16：8186，1988)，它使用限制酶在已知基因区中产生片段。然后通过分子内连接环化该片段，并且在使用来源于已知区的趋异引物的PCR中用作模板。在一种备选方法中，通过利用接头序列的引物和对已知区域特异的引物扩增，可得到与部分序列相邻的序列。通常利用相同的接头引物和对已知区域特异的第二条引物，对扩增的序列进行第二轮扩增。WO 96/38591描述了该方法的一种变型，它使用两条引物，起始从已知序列的相反方向延伸。另一种这样的技术被称为“快速cDNA末端扩增”或RACE。该技术包括利用可与polyA区或载体序列杂交的内部引物和外部引物鉴定位于已知序列5’和3’的序列。其它技术包括捕获PCR(Lagerstrom等，PCR Methods Applic.1：111-19，1991)和步移PCR(Parker等人，Nucl.Acids Res.19：3055-60，1991)。也可利用其它扩增方法获得全长cDNA序列。
在某些情况中，通过分析(如从GenBank数据库可以得到的)已表达序列标志(EST)数据库中提供的序列能获得全长cDNA序列。对重叠ESTs的检索一般可用众所周知的程序(例如，NCBI BLAST检索)进行，可利用这些EST产生连续的全长序列。也可通过基因组片段分析获得全长DNA序列。
在本发明的其它实施方案中，可以在重组DNA分子中使用编码这里所述多肽或融合蛋白或其功能相当物的多核苷酸序列或其片段，以引导该多肽在适合的宿主细胞中表达。由于遗传密码固有的简并性，可能产生编码基本上相同或功能相当的氨基酸序列的其它DNA序列，这些序列可用来克隆和表达特定多肽。
可以利用本领域众所周知的化学方法整个或部分地合成编码希望的多肽的序列(参见，Caruthers，M.H.等，(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-223，Horn，T.等，(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225-232)。
为了表达希望的多肽，编码多肽或功能相当物的核苷酸序列可以插入适合的表达载体中，即，含有插入编码序列转录和翻译所需元件的载体。可以利用本领域技术人员周知的方法构建含有编码目的多肽的序列和适合转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。例如，Sambrook，J.等.(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.，和Ausubel，F.M.等.(1989)CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York.N.Y.描述了这些技术。
表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是载体的非翻译区-增强子、启动子、5’和3’非翻译区，它们与宿主细胞蛋白质相互作用，实现转录和翻译。这些元件在强度和特异性方面可以变化。根据所用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的适合的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。
在哺乳动物细胞中，通常可以使用多种基于病毒的表达系统。例如，在使用腺病毒作为表达载体时，编码目的多肽的序列可以连接到由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒/转录翻译复合物中。在病毒基因组的非必需E1或E3区中插入可以用来获得能在感染的宿主细胞中表达该多肽的活病毒(Logan，J.和Shenk，T.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.81：3655-3659)。另外，也可利用转录增强子如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子增强在哺乳动物宿主细胞中的表达。
也可用特异起始信号实现编码目的多肽的序列的更有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入适合的表达载体中时，可不需要其它转录或翻译控制信号。然而，在只插入编码序列或其部分时，应当使用外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。此外，起始密码子应当在正确的阅读框内，以确保整个插入片段的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是不同来源的，是自然的和合成的。通过含有适于所用特定细胞系统的增强子，如文献中所述的增强子(Scharf，D.等人(1994)ResultsProbl.Cell Differ.20：125-162)，可提高表达效率。
利用产物特异的多克隆或单克隆抗体检测和测定多核苷酸编码产物之表达的多种方法在本领域周知。例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。对于某些应用，利用与特定多肽上两个不干扰表位有反应性的单克隆抗体的基于单克隆的双位点免疫测定法可能是优选的测定法，但是也可使用竞争结合测定。Hampton，R.等.(1990；Serological Methods，a Laboratory Manual，APS Press，St Paul.Minn.)和Maddox，D.E.等.(1983；J.Exp.Med.158：1211-1216)描述了这些及其它测定法。
药物组合物和方法
应当理解，希望时，此处公开的化合物也可以与其它治疗形式(诸如抗菌、抗病毒和抗真菌化合物)或者疗法(各种基于DNA的疗法，基于RNA的疗法、基于多肽的疗法)和/或与其它免疫效应物组合施用。实际上，假定其它成分在接触靶细胞或宿主组织后不引起明显的负面作用，则基本上可以包含任何其它成分。因此，如果实施本发明的特定实施方案需要或希望，这些组合物可与其它不同的试剂一起被递送。示例性地，本发明的药物组合物可以包含编码一种或多种治疗蛋白质、反义RNAs、核酶等的DNA或与它们联合使用。
一方面，本发明的化合物和包含它们的组合物可以与抗原一起被施用以提供佐剂或增强抗原的效果，即，增强患者或个体的免疫应答。在另一方面，对于化合物本身的治疗效果，可以在没有外源抗原的情况下施用本发明的化合物和组合物。
另一方面，在没有外源抗原的情况下施用化合物或组合物时，本发明提供了治疗、改善和/或实际上预防真核生物个体，特别是动物，优选人类中感染疾病的方法。由于TLR介导的信号对微生物激发的天然免疫应答的重要性，可选择地和以最小毒性刺激这种途径的能力代表了用于抗广泛感染物的预防和/或治疗处理形式的有效方法。
这里所述的方法可用于抗基本上任何类型的感染物，包括细菌、病毒、寄生虫和真菌。示例性地，本发明用于细菌感染的预防和/或治疗处理，所述细菌是来源于假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobactcr)，变形菌属(Proteus)、沙雷氏菌属(Serratia)、假丝酵母属(Candida)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Stredtococci)、衣原体属(Chlamydia)、支原体属(Mycoplasma)等等的物种。本发明可以治疗的示例性病毒疾病包括如流感病毒、腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒(RSVs)、疱疹病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒，例如乙肝病毒和丙肝病毒及其它病毒引起的疾病。示例性的真菌包括，例如曲霉属(Aspergillis)、白念珠菌(Candida albicans)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、Coccidioides immitus和其它真菌。
在一个示例性的实施方式中，本发明提供了用于治疗患有感染或处于患有感染风险的患者，特别是无免疫反应的患者的方法，所述感染是诸如医院的细菌和病毒感染。每年住院的4000万个体中约2百万个体在它们住院期间出现医源性感染，并且它们中1％，或约40万患者出现医源性肺炎，其中死亡7000人以上。这使得医源性肺炎成为医院获得性感染死亡的主要原因。因此，这种实施方案满足了医源性感染治疗的有效预防方法的重要需要。
在相关实施方案中，本发明提供了用于无免疫反应的患者、诸如HIV阳性患者的预防治疗，该患者已经患有肺炎或处于患有肺炎的风险，所述肺炎来源于机会性感染或来源于抑制或潜伏感染的再激活。在1992年，单独在美国就报道了约20,000例AIDS患者中的卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)感染。此外，所有AIDS患者中60-70％患者在它们患病期间的某个时间患有卡氏肺囊虫(Pneumocystiscarinii)。因此，本发明在该实施方案中为这种风险群体提供了有效的预防方法。
在另一个相关实施方式中，本发明的方法用于治疗无免疫反应的和/或处于患有感染疾病风险的其它患者群，包括，例如患有囊肿性纤维化、慢性阻塞性肺病和其它无免疫反应和/或住院的患者。
在本发明的另一方面，在用于治疗、改善或实际上预防变应性紊乱和疾病，诸如窦炎、慢性鼻窦炎、哮喘、特应性皮炎和银屑病的方法中使用本发明的化合物和组合物(无外源抗原)。这种方法至少部分是基于化合物激活靶细胞产生细胞因子的能力，这种细胞因子的产生可以竞争定型变应性类型的细胞因子应答(其特征在于IL-4的产生或对IL-4活性的超反应性)。这里所公开的一些单和二糖化合物的施用导致从抗原加工和呈递细胞及其它细胞表达IFN-γ和IL-12，引起了与变应性应答相关的细胞因子诸如IL-4，5，6，10和13的下调节。
还是在本发明的另一方面，在用于治疗自身免疫疾病的方法中使用本发明的化合物和组合物(无外源抗原)。该实施方式中使用的化合物通常选自能拮抗、抑制或负调节一种或多种Toll样受体，特别是Tlr2和/或Tlr4的化合物，以改善或实际上预防与特定疾病相关的自身免疫应答。示例性地，可以在疾病诸如炎性肠病、类风湿性关节炎、慢性关节炎、多发性硬化和银屑病的治疗中使用该实施方式提供的方法。
本发明的化合物也可以用做佐剂和免疫效应物，它们可以增加免疫动物中抗体产生，刺激细胞因子的产生和刺激细胞介导的免疫应答，包括细胞毒性T淋病细胞应答。
在本发明的方法中，例如用于实现个体免疫应答的方法中，本发明的化合物和组合物可以与用于注射或摄食的药物学可接受的载体一起配制。这里所用的术语“药物学上可接受的载体”意指不干扰活性组分免疫调节活性，并且对所施用的患者无毒的介质。药物学上可接受的载体包括油包水或水包油型乳液，含水组合物、脂质体、微珠和微粒体。例如，载体可以是在球体或颗粒基质中含有本发明化合物，或者本发明化合物吸附在球体或颗粒表面的微球体或微颗粒。载体也可以是含水溶液或微胶粒分散体(其含有使制剂实际上成为碱性的三乙胺、三乙醇胺或其它试剂)，或者含有氢氧化铝、氢氧化钙、磷酸钙或酪氨酸吸附剂的悬浮液。载体也可以包括所有的溶剂、分散体介质、媒介物、涂层、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。药物活性物质使用这些介质和试剂是本领域所熟知的。除非任何常规的介质或试剂与活性组分不兼容，否则在治疗组合物中可以考虑它的应用。
可以非肠道地，即腹膜内、皮下地或肌内施用的本发明化合物制剂包含下面优选的载体。皮下应用的优选载体的例子包括磷酸缓冲盐(PBS)溶液和用于注射的USP水中的0.01-0.1％三乙醇胺。用于肌内注射的适合载体包括10％USP乙醇，40％丙二醇和平衡可接受的等渗溶液诸如5％葡萄糖。
静脉内使用的优选载体的例子包括10％USP乙醇，40％USP丙二醇和用于注射的平衡USP水。另一种可接受的载体包括10％USP乙醇和用于注射的USP水；然而另一种可接受的载体是用于注射的USP水中的0.01-0.1％三乙醇胺。药物学可接受的非肠道溶剂是这样的溶剂，其提供可以通过5微米过滤器过滤，而不移除活性组分的溶液或分散体。
本发明组合物优选的施用方法是粘膜施用，特别是鼻内施用或通过吸入法施用(肺施用)。用几种不同的方法，包括液体雾化器、基于气溶胶的计量吸入器(MDIs)和干粉分配装置可以实现肺部药物递送。用于此类施用的组合物典型地是干粉或气溶胶。对于本发明优选的施用方法，气溶胶施用，用吸入器递送组合物，下面描述了一些类型的吸入器。
干粉除了活性组分外还包含载体、吸收促进剂和可选地其它组分。例如，载体是单、二或多糖，糖醇或另外的多元醇。适合的载体包括乳糖、葡萄糖、棉子糖、松三糖、乳糖醇、麦芽糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇；和淀粉。特别优选乳糖，尤其是一水化物形式的乳糖。也包括的是吸收促进剂诸如多肽、表面活性剂、烷基糖苷、脂肪酸或磷脂的胺盐。制剂组分通常必须是细碎的形式，即，通过激光衍射仪器或库耳特颗粒计数器测定的体积中值粒径通常应该是约30到约200微米。利用本领域已知的方法，例如磨碎、微粉化或直接沉淀可以产生期望的颗粒大小。
鼻内施用本发明化合物的途径比许多其它形式的施用本发明化合物的途径提供了许多优点。例如，鼻内施用的一个优点是方便性。注射系统需要皮下注射器灭菌，并且在医疗机构中，导致医务人员关心由于污染的针头偶然引起接触疾病的风险。对安全处置用过的针头和注射器的严格要求也必须强加于医疗机构。相反，就患者和主治医务人员而言，鼻内施用要求很少的时间，并且与注射系统比较，医疗机构的负担更小。
鼻内施用的第二个重要优点是患者对药物递送系统的接受性。鼻内施用被认为是非侵害性的，不伴随疼痛，没有明显的后效应，并且在显示症状的患者中产生了快速减轻疼痛的满意感觉。当患者是儿童时，这是特别的优点。另一个重要考虑的因素是患者也能自己施用规定剂量的鼻喷雾。
对于鼻内施用，本发明的组合物可以制成液体或固体。这种组合物可以含有一种或多种佐剂，通过渗透过鼻膜来增加活性组分吸收的试剂，和(用于液体组合物的)含水稀释剂，例如水。做为可替代的方案，稀释剂可以包含含水缓冲液诸如磷酸盐缓冲液。组合物还可以可选地包含一种或多种多元醇和一种或多种防腐剂诸如，庆大霉素、杆菌肽(0.005％)或甲酚。利用雾化器、喷雾器、喷射器、滴管或其它装置，可以向鼻腔施用喷雾形式的组合物，这确保了溶液与鼻粘膜接触。该装置可以是简单装置，诸如患者可以使用的简单鼻子喷雾器，或者可以是精心设计的仪器用于更精确地分配组合物，医务室或医疗机构中可以使用这种仪器。
通过混合均具有期望颗粒大小的活性试剂和赋形剂可以制备鼻粉末组合物。首先，制备活性试剂和环糊精赋形剂，接着沉淀、过滤和粉碎。也可以通过冷冻干燥除去溶剂，接着利用从药物学文献中可得知的常规技术将粉末粉碎为期望的颗粒大小。最后的步骤是大小分类，例如通过筛分得到优选地30和200微米之间直径的颗粒。可以利用鼻粉末吹入器施用粉末，或者粉末可以放置在吸入或吹入装置中设置的囊中。针刺穿囊以在囊的上和下部上形成孔，送入空气吹出粉末颗粒。也可以在惰性气体的喷射式喷雾中施用粉末制剂，或在液体有机流体中悬浮粉末制剂。
在具体的实施方式中，可以在可控制或持续释放系统中递送药物组合物。在一个实施方式中，可以用泵实现可控或持续的释放(参见，Langer，Science，249：1527-1533(1990)；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：10；Buschwald等，1980，Surgery 88：507；Saudek等，1989N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方式中，可以利用聚合材料实现κ鸦片样物质受体激动剂和/或鸦片样物质拮抗剂的可控或持续释放(参见，例如Medical Applications ofControlled Release，Langer和Wise(编辑)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida 1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug ProductDesign and Performance，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macrol.Chem.23：61；也参见Levy等，1985 Science 228：190；During等，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597，美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/12154；和PCT公开号WO 99/20253)。持续释放制剂中所用的聚合物例子包括，但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙烯醋酸酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、polyactides(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯(polyorthoester)。在优选的实施方式中，持续释放制剂中所用的聚合物是惰性的，无可浸出的杂质，在贮藏时是稳定的、无菌和生物可降解的。然而在另一个实施方式中，可控或持续释放系统可以放置在治疗靶附近，因此只需要一部分系统剂量(参见，例如Goodson，in Medical Applicationsof Controlled Release，上文，2卷，115-138页(1984))。
与这种药物组合物一起使用的载体是生物相容的，并且也可以是生物可降解的。在一些实施方式中，优选地，制剂提供相对恒定水平的活性成分释放。然而，在其它实施方式中，可能期望施用后立即更快速率的释放。这种组合物制剂在利用已知技术的本领域普通技术人员水平的范围内。这方面使用的示例性载体包括聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、胶乳、淀粉、纤维素、葡聚糖等的微颗粒。其它示例性延迟释放载体包括超分子的生物载体，其包含非液体的亲水核心(例如，交联的聚糖或寡糖)，和可选地含有两亲性化合物诸如磷脂的外层(参见，例如美国专利号5,151,254和PCT申请WO 94/20078，WO/94/23701和WO 96/06638)。持续释放制剂中含有的活性化合物的量取决于植入位点、释放的速率和期望的持续时间及待要治疗或预防的疾病性质。
以有效量或药物学有效量向个体施用本发明的化合物以实现或增强个体的免疫应答。这里所用的“有效量”或“药物学有效量”是显示超出载体或阴性对照的应答的量。“佐剂有效量”是当所述化合物与抗原联合施用时，使免疫应答显示超过单独抗原产生的应答的所述化合物的量。施用给患者的本发明化合物的精确剂量将取决于所用的特定化合物、施用途径、药物组合物和患者。例如，当皮下施用所用化合物以增强抗体应答时，基于施用给普通的70kg成年患者，所用的化合物的量从1到约250微克，优选地约25到约50微克。
在另一个实施方式中，示例性免疫原性组合物，例如本发明的免疫原性和/或疫苗组合物包含编码一种或多种上述多肽的DNA，以在原位产生多肽。如上所述，可以用本领域普通技术人员已知的各种递送系统中的任何递送系统施用多核苷酸。实际上，本领域熟知大量的基因递送技术，如Rolland，Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems15：143-198，1998和其中引用的参考文献中所述的基因递送技术。当然，适合的多核苷酸表达系统将包含在患者中表达所必需的DNA的调节序列(如，适合的启动子和终止信号)。
因此，在一些实施方案中，利用大量已知基于病毒的系统的任何一种系统，将编码这里所述免疫原性多肽的多核苷酸引入适合的哺乳动物宿主细胞中以进行表达。在一个示例性实施方式中，逆转录病毒提供了方便和有效的基因递送系统的平台。利用本领域已知的技术，选定的编码本发明多肽的核苷酸序列可以插入到载体中并且包装成逆转录病毒颗粒。然后，可以分离重组病毒，并且递送给患者。已经描述了大量示例性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7：980-990；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy 1：5-14；Scarpa等.(1991)Virology180：849-852；Burns等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8033-8037；和Boris-Lawrie and Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109)。
另外，也描述了许多示例性基于腺病毒的系统。与整合到宿主基因组中的逆转录病毒不同，腺病毒存在于染色体外，从而使得与插入诱变有关的危险最小(Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol.57：267-274；Bett等人(1993)J.Virol.67：5911-5921；Mittereder等人(1994)Human Gene Therapy 5：717-729；Set h等人(1994)J.Virol.68：933-940；Barr等人(1994)Gene Therapy1：51-58；Berkner，K.L.(1998)BioTechniques 6：616-629；Rich等人(1993)Human GeneTherapy 4：461-476)。
也发展了用于多核苷酸递送的多种腺伴随病毒(AAV)载体系统。AAV载体能用本领域众所周知的技术容易地构建。参见，例如，美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公开号WO 92/01070和WO93/03769；Lebkowski等人(1988)Molec.Cell.Biol.8：3988-3996；Vincent等人(1990)Vaccines 90(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)；Carter，B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology3：533-539；Muzyczka，N.(1992)Current Topicsin Microbiol.andImmunol.158：97-129；Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy5：793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy 1：165-169；Zhou等人(1994)J.Exp.Med.179：1867-1875。
可用于通过基因转移来递送编码本发明多肽的多核苷酸的其它病毒载体包括来自痘病毒家族的载体，如痘苗病毒和禽痘病毒。例如，可以如下构建表达新分子的痘苗病毒重组体。首先将编码多肽的DNA插入适合的载体中，使它与痘苗病毒启动子和侧翼痘苗DNA序列(如编码胸苷激酶(TK)的序列)相邻。然后用该载体转染同时用痘苗感染的细胞。利用同源重组向病毒基因组中插入痘苗启动子加编码目的多肽的基因。通过在5-溴脱氧尿苷存在下培养细胞并挑取具有抗性的病毒噬斑，筛选产生的TK.s up.(-)重组体。
以痘苗为基础的感染/转染系统能方便地用于引起此处所述的一种或多种多肽在生物宿主细胞中诱导型瞬时表达或共表达。在这种特定系统中，首先用编码噬菌体T7RNA聚合酶的痘苗病毒重组体体外感染细胞。该聚合酶显示强烈的特异性，因为它只转录含有T7启动子的模板。在感染后，用T7启动子驱动的目的多核苷酸转染细胞。在细胞质中从痘苗病毒重组体表达的聚合酶把转染的DNA转录为RNA，然后由宿主翻译机器翻译为多肽。该方法导致大量RNA及其翻译产物的高水平、瞬时、细胞质产生。参见，例如，Elroy-Stein和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：6743-6747；Fuerst等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：8122-8126。
做为可替代的方案，也能利用禽痘病毒(avipoxvirus)(如禽痘(fowlpox)和金丝雀痘病毒)递送目的编码序列。已知表达哺乳动物病原体免疫原的重组禽痘病毒对非禽类物种施用时可引起保护性免疫。在人和其它哺乳动物种中使用禽痘病毒载体是特别希望的，因为禽痘属的膜只能在易感禽类种中生产性复制，因此不感染哺乳动物细胞。产生重组禽痘病毒的方法在本领域周知，并且使用了遗传重组，如上对于痘苗病毒的产生所述。参见，例如，WO 91/12882；WO 89/03429；WO 92/03545。
许多甲病毒属载体也能用于递送本发明的多核苷酸组合物，如美国专利号5,843,723；6,015,686；6,008,035和6,015,694所述的载体。也能使用某些基于委内瑞拉马脑炎(VEE)的载体，其示例性例子见美国专利号5,505,947和5,643,576。
此外，分子偶联载体，如Michael等人，J.Biol.Chem.(1993)268：6866-6869和Wagher等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：6099-6103所述的腺病毒嵌合载体也能用于本发明的基因递送。
关于这些和其它基于病毒的已知递送系统的其它示例性信息可见于，例如：Fisher-Hoch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：317-321，1989；Flexner等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.569：86-103，1989；Flexner等人，Vaccine 8：17-21，1990；美国专利号4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美国专利号4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner，Biotechniques 6：616-627，1988；Rosenfeld等人，Science 252：431-434，1991；Kolls等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：215-219，1994；Kass-Eisler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11498-11502，1993；Guzman等人，Circulation88：2838-2848，1993；Guzman等人，Cir.Res.73：1202-1207，1993。
在某些实施方案中，多核苷酸可以整合到靶细胞的基因组中。这种整合可以是以特定位置和方向的同源重组(基因置换)，或者可以非特定位置地随机整合(基因增大)。在其它实施方案中，多核苷酸在细胞中可稳定保持为分开的附加型DNA片段。这些多核苷酸片段或“附加体”编码足以允许独立于宿主细胞周期或与之同步进行维持和复制的序列。向细胞递送表达构建体和细胞中多核苷酸保持的方式取决于所使用的表达构建体的类型。
在本发明的另一个实施方案中，如Ulmer等人，Science259：1745-1749，1993所述，和Cohen，Science 259：1691-1692，1993所综述，多核苷酸也可以作为“裸露的”DNA施用/递送。将DNA包被于可生物降解的珠上可提高裸露DNA的摄取，这些珠能被有效地输送到细胞内。
在另一实施方案中，本发明的组合物能通过粒子轰击法递送，已经描述了许多这样的方法。在一个示例性实例中，能用如PowderjectPharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和Powder ject Vaccines Inc.(Madison，WI)制造的装置实现气体驱动的粒子加速，美国专利号5,846,796；6,010,478；5,865,796；5,584,807；欧洲专利号0500799描述了其中一些实例。该方法提出一种无针递送法，其中用手持式装置产生的氦气气流将显微颗粒(如多核苷酸或多肽颗粒)的干粉制剂加速到高速，推动颗粒进入目的靶组织。
在有关实施方案中，可用于气体驱动无针注射本发明的组合物的其它装置和方法包括Bioject，Inc.(Portland，OR)所提供的方法，美国专利号4,790,824；5,064,413；5,312,335；5,383,851；5,399,163；5,520,639和5,993,412中描述了其中一些实例。
在本发明的某些实施方案中，药物组合物优选地诱导以Th1型为主的免疫应答。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)倾向于利于诱导针对施用抗原的细胞介导的免疫应答。相反，高水平的Th2型细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于利于诱导体液免疫应答。在施用此处所述的免疫原性组合物后，患者将支持包括Th1型和Th2型应答的免疫应答。在一个优选实施方案中，其中应答主要是Th1型，Th1型细胞因子的水平将增加到比Th2型细胞因子水平更高的程度。这些细胞因子的水平可容易地用标准测定法评价。作为替代方案，或者额外地，可能期望高水平Th2型细胞因子(如IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)用于某些治疗应用。这些细胞因子的水平可以容易地用标准测定法评价。关于细胞因子家族的综述参见Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol.7：145-173，1989。
用于诱导Th1型细胞因子的示例性组合物包括例如，含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)的组合，例如如WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利号6,008,200和5,856,462中所述。例如，Sato等人，Science 273：352，1996也描述了免疫刺激DNA序列。其它适合的免疫刺激剂包括皂角苷，诸如QS21(AquilaBiopharmaceuticals Inc.，Framingham，MA)和相关的皂角苷衍生物和其混合物。
本发明组合物中可以包含各种其它免疫刺激剂中的任何一种免疫刺激剂。例如，细胞因子，诸如GM-CSF，干扰素或白细胞介素用于进一步调节目的免疫应答。此外，Montanide ISA 720(Seppic，法国)、SAF(Chiron，加利福尼亚，美国)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐剂(例如SBAS-2或SBAS-4，可获自SmithKline Beecham，Rixensart，比利时)和EnhanzynTM免疫刺激剂(Corixa，Hamilton，MT)。也可以使用如WO 99/52549A1中所述的聚氧乙烯醚免疫刺激剂。
本发明的药物组合物常还含有一种或多种缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐溶液)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸(如甘氨酸)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(如EDTA)或谷胱甘肽、佐剂(如氢氧化铝)、使制剂相对于受体血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。做为可替代的方案，本发明的组合物也可配制为冻干品。
此处所述的药物组合物可存在于单剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓿或小瓶中。这些容器一般密封，以在使用前保持制剂的无菌和稳定性。制剂通常可贮存为油状或水状载体中的悬液、溶液或乳液。做为可替代的方案，药物组合物也可在冻干条件下贮存，在使用前只需加入无菌液体载体。
为了在多种治疗方案中使用此处所述的特定组合物，发展适当剂量和治疗方案，包括例如：口服、非肠道、静脉内、鼻内和肌内施用和制剂，这是本领域众所周知的，为了一般示例性目的，下面简要描述了其中一些。
在某些用途中，可以通过口服向动物施用此处公开的药物组合物。这样，这些组合物可以用惰性稀释剂或可吸收的食用载体配制，或者可以包封于硬壳或软壳的明胶胶囊中，或者可以压制成片剂，或者可以直接掺入日常饮食的食物中。
活性化合物甚至可以掺入赋形剂，并以可摄食的片剂、颊含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、薄膜纸囊剂等的形式使用(参见，例如，Mathiowitz等人，Nature 1997Mar 27；386(6623)：410-4；Hwang等人，Crit Rev Ther Drug Carrier Sits 1998；15(3)：243-84；美国专利5,641,515；美国专利5,580,579；美国专利5,792,451)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有多种其它成分中任何成分，例如，可以添加粘合剂，如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；甜味剂，如可以加入蔗糖、乳糖或糖精，或增香剂，如薄荷、冬青油或樱桃香料。当单位剂型是胶囊时，除上述材料之外还可含有液体载体。其它不同材料可以是包衣或以另外方式修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用紫胶漆、糖或两者包衣。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何材料都应当是药物纯的，并且在所使用的量基本上无毒。另外，也可以向持续释放的制品和制剂中掺入活性化合物。
这些制剂一般含有至少约0.1％的活性化合物或更多，尽管活性成分的百分数肯定可以变化，通常可以为总制剂重量或体积的约1或2％到约60％或70％或更多。一般按照在给定单位剂量的化合物中获得适当剂量，准备每种治疗上有用的组合物中活性化合物的量。制备这些药物制剂的技术人员应当考虑溶解度、生物利用性、生物半衰期、施用途径、产品保存期及其它药理学因素，因此，多种剂量和治疗方案可能是希望的。
对于经口施用，做为可替代的方案，本发明的组合物还可以掺入种或多种赋形剂，制成漱口药、牙粉、颊含片、喷口剂或舌下经口施用制剂的形式。可替代的方案，活性成分也可以掺入口服溶液(如含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的溶液)中，或分散于牙粉中，或以治疗有效的量加入可含有水、粘合剂、研磨剂、增香剂、发泡剂和湿润剂的组合物中。做为可替代的方案，组合物也可制成可置于舌下或溶解于口中的片剂或溶液形式。
在某些情况下，希望非肠道地、静脉内、肌内乃至腹膜内施用此处公开的药物组合物。这些方法为本领域技术人员所周知，例如在美国专利5,543,158；美国专利5,641,515和美国专利5,399,363中进一步描述了其中一些方法。在某些实施方案中，活性化合物作为游离碱或药理学可接受的盐的溶液可以在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散液。在普通贮存和使用条件下，这些制剂通常含有防腐剂防止微生物生长。
适于注射用的示例性药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末(例如，参见美国专利5,466,468)。在所有情况中，该形式必须是无菌的，必须是易注射的液体。在生产和贮存条件下必须稳定，必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散基质，例如其含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的适当混合液和/或植物油。例如，利用包被，如卵磷脂，在分散体时保持需要的颗粒大小，和/或利用表面活性剂，可以保持适当的流动性。利用不同抗细菌剂和抗真菌剂，例如paraben、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，有利于防止微生物的作用。在许多情况中，优选地含有等渗剂，如糖或氯化钠。在组合物中使用延缓吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶，能使注射组合物的吸收延长。
在一个实施方案中，对于水溶液中的胃肠外施用，必要时溶液应当适当地缓冲，首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，根据本公开内容，本领域技术人员可以了解能够使用的无菌水介质。例如，一剂量可溶解于1ml等渗NaCl溶液中，并加入到1000ml皮下输液中或在所述灌输部位注射(参见，例如，″Remington′sPharmaceutical Sciences″，第15版，1035-1038和1570-1580页)。根据治疗的患者病情，必须进行剂量上的某些改变。此外，对于人体施用，制品必须优选地满足FDA局生物标准所需的无菌、致热性和一般安全性和纯度标准。
在本发明的另一个实施方案中，此处公开的组合物可配制为中性或盐形式。示例性的药学可接受的盐包括酸性加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，以及与无机酸(如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐。与游离羧基形成的盐也能来自于无机碱，如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁，和有机碱，如异丙胺、三甲胺、组胺、普鲁卡因等。在配制后，以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用该溶液。
在某些实施方案中，可以通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气溶胶递送载体施用药物组合物。例如，美国专利5,756,353和美国专利5,804,212中描述了通过经鼻喷雾直接向肺递送基因、核酸和肽组合物的方法。同样地，利用鼻内微粒树脂(Takenaga等人，J ControlledRelease 1998Mar 2；52(1-2)：81-7)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利5,725,871)递送药物在制药领域也是众所周知的。同样地，美国专利5,780,045也描述了聚四氟乙烯支持基质形式的示例性透粘膜药物递送。
在某些实施方案中，利用脂质体、纳米胶囊、微粒、脂质颗粒、囊泡等向合适的宿主细胞/生物体中引入本发明的组合物。特别是，为了递送可以配制包封于脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中的本发明的组合物。做为可替代的方案，本发明的组合物也能与载体表面共价或非共价结合。
脂质体和脂质体样制品的形成及作为可能的药物载体的应用为本领域技术人员所周知(参见，例如，Lasic，Trends Biotechnol 1998Jul；16(7)：307-21；Takakura，Nippon Rinsho 1998Mar；56(3)：691-5；Chandran等人，Indian J Exp Biol.1997Aug；35(8)：801-9；Margalit，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1995；12(2-3)：233-61；美国专利5,567,434；美国专利5,552,157；美国专利5,565,213；美国专利5,738,868和美国专利5,795,587)。
脂质体已经成功地用于通常难以用其它方法转染的大量细胞类型，包括T细胞悬液、原代肝细胞培养物和PC 12细胞(Renneisen等人，J Biol Chem.1990 Sep 25；265(27)：16337-42；Muller等人，DNA Cell Biol.1990Apr；9(3)：221-9)。另外，脂质体没有基于病毒的递送系统所具有的DNA长度限制。脂质体已经有效地用于向多种培养细胞系和动物中引入基因、不同药物、放疗剂、酶、病毒、转录因子、变构效应物等。此外，脂质体的应用似乎与系统递送后自身免疫反应或无法接受的毒性无关。
在某些实施方案中，由分散于水介质中的磷脂形成脂质体，并且自发形成多层同心双层泡囊(也称为多层泡囊(MLVs))。
做为可替代的方案，在其它实施方案中，本发明提供本发明的组合物的药学可接受的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常能以稳定和可重复的方式包封化合物(参见，例如，Quintanar-Guerrero等人，Drug DevInd Pharm.1998 Dec；24(12)：1113-28)。为了避免胞内聚合过载引起的副作用，可以利用能在体内降解的聚合物设计这些超细颗粒(大小约为0.1μm)。能如Couvreur等人，Crit Rev Ther Drug CarrierSyst.1988；5(1)：1-20；zur Muhlen等人，Eur J Pharm Biopharm.1998Mar；45(2)：149-55；Zambaux等人，J Controlled Release 1998 Jan2；50(1-3)：31-40；和美国专利5,145,684所述制备这种颗粒。
癌症治疗
癌症治疗的免疫方法基于这样的认识，癌细胞常常可以逃避抗异常或外源细胞和分子的身体防御，并且这些防御可能被治疗刺激以收复失去的领地，例如Klein，Immunology(Wiley-Interscience，NewYork，1982)中623-648页。各种免疫效应物可以直接或间接地抑制肿瘤生长的大量最近的观察资料重新引起人们对这种癌症治疗方法的兴趣，例如，Jager，等，Oncology 2001；60(1)：1-7；Renner，等，AnnHematol 2000Dec；79(12)：651-9。
4种其功能与抗肿瘤细胞免疫和从身体排除肿瘤细胞有关的基本细胞类型是：i)B淋巴细胞，其向血浆中分泌免疫球蛋白以鉴定和标记非己侵入者细胞；ii)分泌补体蛋白的单核细胞，该补体蛋白负责裂解和加工免疫球蛋白包被的靶侵入者细胞；iii)天然杀伤淋巴细胞，其具有破坏肿瘤细胞的2种机理：依赖于抗体的细胞毒性和天然杀伤；和iv)T淋病细胞，其加工抗原特异性受体和具有识别带有补体标记分子的肿瘤细胞能力(Schreiber，H.，1989，in FundamentalImmunology(编辑).W.E.Paul，923-955页)。
癌症免疫治疗通常集中于诱导体液免疫应答，细胞免疫应答或两种免疫应答。而且，非常确定地，必需诱导CD4+T辅助细胞以次级诱导抗体或细胞毒性CD8+T细胞。对癌细胞是选择性或理想地特异性的多肽抗原提供了用于诱导抗癌症的免疫应答的有力方法，并且这是本发明的重要方面。
因此，在本发明的进一步方面，这里所述的药物组合物可以用于刺激抗癌症的免疫应答。在这种方法中，这里所述的药物组合物被施用给患者、通常是温血动物，优选地人类。患者可以或不可以患癌症。可以在原发肿瘤手术移除和/或治疗，诸如放射治疗或常规化学治疗药物施用前或后施用药物组合物和疫苗。如上所述，药物组合物的施用可以通过任何适合的方法，包括通过静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内、皮内、肛门、阴道、局部和口服途径施用。
在一些实施方式中，免疫治疗可以是主动免疫治疗，其中治疗依赖于通过施用免疫应答修饰剂(诸如这里所述的多肽和多核苷酸)而进行的内源宿主免疫系统的体内刺激以发生抗肿瘤反应。
这里所述治疗组合物的施用途径和频率及剂量随着个体而变化，并且容易利用标准技术确定它们。一般地，可以通过注射(例如，皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如吸入)或经口施用药物组合物和疫苗。优选地，可在52周期间内施用1-10次剂量。优选地，以1个月的间隔施用6次剂量，之后可定期进行加强接种。备选方法可能适于个体患者。一种合适的剂量是，当如上所述施用时，能增强抗肿瘤免疫应答，并且比基础(即未处理)水平至少高10-50％的化合物的量。这种应答可如下监测：测量患者中的抗肿瘤抗体，或能在体外杀伤患者肿瘤细胞的溶细胞效应细胞的疫苗依赖的产生。这些疫苗应该也能引起免疫应答，致使接种患者的临床后果比未接种患者改善(例如，更频繁的缓解，完全或部分或更长的无病存活)。通常，对于含有一种或多种多肽的药物组合物和疫苗，剂量中所含的每种多肽的量约为每kg宿主约25μg至5mg。合适的剂量大小因患者体重而异，但一般范围为约0.1mL至约5mL。
一般地，合适的剂量和治疗方案提供足以提供治疗和/或预防益处量的活性化合物。通过确定治疗患者比未治疗患者改善的临床后果(例如，更频繁的缓解，完全或部分或更长的无病存活)，能监测这种应答。预先存在的对肿瘤蛋白免疫应答的增强一般与改善的临床结果有关。这些免疫应答一般可用标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定法评价，可用治疗前和治疗后从患者中获得的样品进行这些方法。
通过下面仅仅为了示例性目的的非限制性实施例和试验实例进一步描述了本发明。这里所引用的所有参考文献都整体并入为参考文献。
实施例
实施例1
一级脂肪酰基链的修饰
这个实施例描述了具有单独的或联合可变二级脂肪酸链的可变长度一级脂肪酰基链的一级脂肪酸衍生物的制备。例如，化合物1a-c和2a-c，其中短(C6)和中(C10)链一级脂肪酸联合短、中或长链二级脂肪酸。
Figure GSA00000097816700441
利用公认的丝氨酸糖苷配基(R1＝CO2H)或可替代地利用化学上更稳定和可电离的丝氨醇磷酸酯糖苷配基单元(R1＝CH2OPO3H2)制备这些化合物。丝氨酰/丝氨醇磷酸酯的选择基于已知的丝氨酰衍生物3a，b和新的丝氨醇磷酸酯4a，b的生物活性比较。
Figure GSA00000097816700442
通过以前描述方法的修改方法(B1 in Johnson等，美国专利号6,355,251)，利用允许在接近合成结束时引入酰胺-和酯-连接的酰氧基酸的共同高级中间体，合成一级链修饰的化合物(方案I)。合成的最初步骤是受体6用已知四乙酸酯5(经4个步骤由葡糖胺制备)糖基化以产生β-糖苷7，并且7转化为共同高级中间体(Commonadvance intermediate，CAI)8，其对R1＝CO2Bn而言最优化。选择性4-O-酰化作用和N-去保护/酰化作用产生六酰基衍生物9，经3-4个步骤，其通过磷酸化和解封闭而转化为1a-c或2a-c。
方案I
根据Keegan等，Tetrahedron：Asymmetry；7(12)：3559-3564，1996，从适合的3-氧代甲基酯开始制备必需的(R)-3-正烷酰基氧基链烷酸。通过在硅胶上正相层析，或者作为可替代的方案，通过在Sephadex LH-20凝胶上液体-液体分配层析或纤维素层析实现产物1和2的高化学和非对映异构体纯度。通过光谱(IR，1H和13C NMR)和物理(燃烧分析，FAB-MS)方法及HPLC确定分离的三乙铵盐纯度。
实施例2
甘氨酰和膦酰氧基乙基(PE)化合物
这个实施例描述了甘氨酰化合物11a，b和膦酰氧基乙基(PE)化合物12a，b的合成，这些化合物与3a，b和4a，b是几乎部分区域异构的(regioisomeric)。
Figure GSA00000097816700461
通过比方案I中概述的合成更汇集的合成(ConvergentSynthesis)，最容易制备这些化合物，其中在银离子存在的情况下，共同的C6或C10糖基供体13偶联适合的N-酰化的(或者，做为可替代的方案，N-Troc保护的-未示出)受体单元14或15，产生β-糖苷16(方案II)。根据Bulusu等，J Med Chem，35(19)：3463-3469，1992，从乙醇胺和溴醋酸苄基(或叔丁基)酯制备甘氨酸受体14，接着进行N-酰化或保护。由N-酰化(或保护的)二乙醇胺的单磷酸化作用制备磷酸酯15。β-糖苷16的N-去保护/酰化或N，N-二酰化(在Troc保护的糖苷配基的情况下)(Jiang等，Tetrahedron；58(43)：8833-8842，2002)和切割所得到的六酰化衍生物17的苯基和其它保护基团，预期产生期望的化合物11a，b和12a，b，分离该化合物并且在硅胶或LH-20胶或DEAE纤维素上层析纯化后表征为它们的三乙铵盐。
化合物16是新的，并且形成了本发明的另一方面。
Figure GSA00000097816700471
方案II
实施例3
二级醚脂质
这个实施例描述了(R)-3-烷氧基十四烷酸衍生物(18a，b)的合成，其抗不利的代谢和/或水解。为了合成化合物18a，b，必需首先制备二级脂肪酸化合物3a，b的醚脂质类似物或相应的丝氨醇磷酸酯5a，b。如方案II中逆合成地显示的，通过用(R)-3-己氧基十四烷酸或(R)-3-癸氧基十四烷酸替换相应的酰氧酸，从方案I中共同高级中间体8的选择性3-O-酰化开始，接着通过中间体9(R2＝C6或R10烷基，n＝9)，可以获得目的分子18a，b的合成。用已知的方法，从(R)-3-羟基十四烷酸或其苯乙酮酯，酰氧基酸合成中的中间体，以大于50％的总产率合成必需的烷氧基酸19(Keegan等，Tetrahedron：Asymmetry，7(12)：3559-3564，1996，Watanabe等，Carbohydr Res；332(3)：257-277，2001，Jiang.，Bioorg Med Chem Lett；12(16)：2193-2196，2002，Christ等，美国专利号：5,530,113.1996)。
Figure GSA00000097816700481
方案III
实施例4
一级和二级醚脂质
这个实施例描述了在C-3糖位置含有一级醚脂质并含有3个二级醚脂质的化合物(20a，b)。通过用磺酸酯22(其从19的醇前体经一个步骤而产生)烷基化酮类化合物21(糖基供体13合成中的中间体(方案II))产生二醚23来合成这些化合物(方案IV)。4，6-官能作用和端基异构活化提供了糖基氯化物24，然后如方案I I中一样，利用N酰化步骤中相应的烷氧基酸加工处理该糖基氯化物24。在可替代的方案中，在3-O-烷基化步骤中可以利用2-叠氮基42或2-三氟乙酰胺基45衍生物。
Figure GSA00000097816700482
方案IV
实施例5
C-6修饰的化合物
这个实施例描述了具有封闭的6-羟基的化合物。这个实施例中，甲基醚或氟基团与丝氨酰或丝氨醇磷酸酯化合物25a，b和26a，b一起使用。如上所述，这些化合物也形成了本发明的一个方面。
如方案V中所示，从二醇27制备这些化合物。用已知的方法，在6-位上官能化用二步从酮类化合物21获得的中间体27(Christ等，美国专利号：5,530,113，1996；Watanabe等，Carbohydr Res；333(3)：203-231，2001)以产生醇28。28以二步转化为氯化物29以及根据方案I I进行的加工提供了靶分子25a，b和26a，b。可以如本实施例中所述修饰实施例4中所述具有一级和/或二级醚键的化合物以进一步保护分子免受化学和酶促降解。
Figure GSA00000097816700492
方案V
应当理解，前述实施例仅仅是示例本发明。可以对所用的组合物和/或方法进行一些修改，并且仍然可以实现本发明的目的。本发明的权利要求范围中考虑这种修改。
本发明还包括以下内容：
1、一种化合物，其具有下面的结构式(I)：
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n，m，p和q是从0到6的整数；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4和R5相同或不同，并且选自H和甲基；R6和R7相同或不同，并且选自H、羟基、烷氧基、膦酰基、膦酰氧基、磺基、磺氧基、氨基、巯基、氰基、硝基、甲酰基和羧基、和其酯和酰胺；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
2、如权利要求1所述的化合物，其中X和Y是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10饱和脂肪族酰基基团，并且R10、R11和R12独立地是具有3到9个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
3、如权利要求2所述的化合物，其中R10、R11和R12独立地是具有3到7个碳原子的直链未取代的脂肪族基团。
4、如权利要求1所述的化合物，其具有结构式：
Figure GSA00000097816700521
其中R1是COOH或CH2OPO3H2，并且R1、R2和R3分别是C6饱和酰基。
5、如权利要求1所述的化合物，其具有结构式：
Figure GSA00000097816700522
其中R1是COOH或CH2OPO3H2，且R1、R2和R3分别是C10饱和酰基。
6、如权利要求1所述的化合物，其具有结构式：
Figure GSA00000097816700523
其中R1是COOH或CH2OPO3H2，且R1、R2和R3分别是C6饱和酰基。
7、如权利要求1所述的化合物，其具有结构式：
Figure GSA00000097816700531
其中R1是COOH或CH2OPO3H2，且R1、R2和R3分别是C10饱和酰基。
8、一种化合物，其具有结构式(II)，
Figure GSA00000097816700532
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n和m是0；R1、R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1、R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO 3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10、R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
9、如权利要求8所述的化合物，其中X和Y是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10饱和脂肪族酰基基团，并且R10、R11和R12独立地是具有3到9个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
10、如权利要求9所述的化合物，其中R10、R11和R12独立地是具有3到7个碳原子的直链未取代的脂肪族基团。
11、如权利要求8所述的化合物，其具有结构式：
Figure GSA00000097816700541
其中R1、R2和R3分别是饱和C6酰基基团。
12、如权利要求8所述的化合物，其具有结构式：
Figure GSA00000097816700542
其中R1、R2和R3分别是饱和C10酰基基团。
13、如权利要求11所述的化合物，其具有结构式：
Figure GSA00000097816700543
其中R1、R2和R3分别是饱和C6酰基基团。
14、如权利要求11所述的化合物，其具有结构式：
Figure GSA00000097816700551
其中R1、R2和R3分别是饱和C10酰基基团。
15、一种化合物，其具有结构式(III)：
Figure GSA00000097816700552
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n和m是0；R1、R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1、R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10、R11和R12独立地选自具有1到11个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
16、如权利要求15所述的化合物，其中X和Y是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10饱和脂肪族酰基基团，并且R10、R11和R12独立地是具有3到9个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
17、如权利要求16所述的化合物，其中R10、R11和R12独立地是具有3到7个碳原子的直链未取代的脂肪族基团。
18、如权利要求15所述的化合物，其具有结构式：
Figure GSA00000097816700561
其中n是1或5，并且R6是COOH或CH2OPO3H2。
19、如权利要求18所述的化合物，其中n是1。
20、如权利要求18所述的化合物，其中n是5。
21、一种化合物，其具有结构式(IV)：
Figure GSA00000097816700562
其中Y是氧；X选自在直立或平伏位置的O和S；n和m是0；R1、R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H基团，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10、R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
22、如权利要求21所述的化合物，其中X和Y是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10饱和脂肪酰基基团，并且R10、R11和R12独立地是选自具有3到9个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
23、如权利要求22所述的化合物，其中R10、R11和R12独立地是具有3到7个碳原子的直链未取代的脂肪族基团。
24、如权利要求21所述的化合物，其具有结构式：
Figure GSA00000097816700571
其中n是1或5，且R6是COOH或CH2OPO3H2。
25、一种化合物，其具有结构式(V)：
Figure GSA00000097816700572
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n，m，p和q是从0到6的整数；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4和R5相同或不同，并且选自H和甲基；R6和R7相同或不同，并且选自H、羟基、烷氧基、膦酰基、膦酰氧基、磺基、磺氧基、氨基、巯基、氰基、硝基、甲酰基和羧基、和其酯和酰胺；R8是膦酰基；PG表示羟基保护基团，且R10、R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
26、如权利要求25所述的化合物，其中X和Y是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10饱和脂肪族酰基基团，并且R10、R11和R12独立地是具有3到9个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
27、如权利要求26所述的化合物，其中R10、R11和R12独立地是具有3到7个碳原子的直链未取代的脂肪族基团。
28、如权利要求25所述的化合物，其中X和Y是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10饱和脂肪族酰基基团，并且R10、R11和R12分别是具有11个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
29、如权利要求28所述的化合物，其中PG表示-OCH3或F。
30、一种化合物，其具有结构式：
Figure GSA00000097816700581
其中TCBOC表示2，2，2-三氯-1，1-二甲基乙基氯甲酰基保护基团；Troc表示2，2，2-三氯乙氧基羰基保护基团，R1和R3是C6或C10饱和脂肪族酰基基团，并且R7是被保护的羧基或磷酸酯基团。
31、一种药物组合物，其包含：
(a)有效量的具有结构式(I)的化合物：
Figure GSA00000097816700591
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n，m，p和q是从0到6的整数；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4和R5相同或不同，并且选自H和甲基；R6和R7相同或不同，并且选自H、羟基、烷氧基、膦酰基、膦酰氧基、磺基、磺氧基、氨基、巯基、氰基、硝基、甲酰基和羧基、和其酯和酰胺；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐；和
(b)药物学可接受的载体。
32、如权利要求31所述的组合物，其中X和Y是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10饱和脂肪族酰基基团，并且R10、R11和R12独立地是具有3到9个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
33、如权利要求32所述的组合物，其中R10，R11和R12独立地是具有3到7个碳原子的直链未取代的脂肪族基团。
34、权利要求31所述的组合物，其适于粘膜施用。
35、权利要求31所述的组合物，其适于鼻内施用。
36、如权利要求31所述的组合物，其进一步包含抗原，并且包含佐剂有效量的结构式(I)化合物或其盐。
37、一种药物组合物，其包含：
(a)有效量的具有结构式(II)的化合物：
Figure GSA00000097816700601
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐；和
(b)药物学可接受的载体。
38、如权利要求37所述的组合物，其中X和Y是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10饱和脂肪族酰基基团，并且R10、R11和R12独立地是具有3到9个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
39、如权利要求38所述的化合物，其中R10，R11和R12独立地是具有3到7个碳原子的直链未取代的脂肪族基团。
40、权利要求37所述的组合物，其适于粘膜施用。
41、权利要求37所述的组合物，其适于鼻内施用。
42、如权利要求37所述的组合物，其进一步包含抗原，并且包含佐剂有效量的结构式(II)化合物或其盐。
43、一种药物组合物，其包含：
(a)有效量的具有结构式(III)的化合物：
Figure GSA00000097816700611
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到11个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐；和
(b)药物学可接受的载体。
44、如权利要求43所述的组合物，其中X和Y是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10饱和脂肪族酰基基团，并且R10，R11和R12独立地是具有3到9个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
45、如权利要求44所述的组合物，其中R10，R11和R12独立地是具有3到7个碳原子的直链未取代的脂肪族基团。
46、权利要求43所述的组合物，其适于粘膜施用。
47、权利要求43所述的组合物，其适于鼻内施用。
48、如权利要求43所述的组合物，其进一步包含抗原，并且包含佐剂有效量的结构式(III)化合物或其盐。
49、一种药物组合物，其包含：
(a)有效量的具有结构式(IV)的化合物：
Figure GSA00000097816700621
其中Y是氧；X选自在直立或平伏位置的O和S；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H基团，并且R8和R9至少之一是膦酰基；R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐；和
(b)药物学可接受的载体。
50、如权利要求49所述的组合物，其中X和Y是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10饱和脂肪酰基基团，并且R10、R11和R12独立地是具有3到9个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
51、如权利要求50所述的组合物，其中R10，R11和R12独立地是具有3到7个碳原子的直链未取代的脂肪族基团。
52、权利要求49所述的组合物，其适于粘膜施用。
53、权利要求49所述的组合物，其适于鼻内施用。
54、如权利要求49所述的组合物，其进一步包含抗原，并且包含佐剂有效量的结构式(II)化合物或其盐。
55、一种用于增强个体的免疫应答的方法，该方法包括给所述个体施用有效量的具有结构式(I)的化合物：
Figure GSA00000097816700631
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n，m，p和q是从0到6的整数；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4和R5相同或不同，并且选自H和甲基；R6和R7相同或不同，并且选自H、羟基、烷氧基、膦酰基、膦酰氧基、磺基、磺氧基、氨基、巯基、氰基、硝基、甲酰基和羧基、和其酯和酰胺；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
56、如权利要求55所述的方法，进一步包括给所述个体施用外源抗原。
57、用于改善或实质上预防个体中感染性疾病、自身免疫疾病或变应性疾病的方法，该方法包括给所述个体施用有效量的具有结构式(I)的化合物：
Figure GSA00000097816700641
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n，m，p和q是从0到6的整数；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4和R5相同或不同，并且选自H和甲基；R6和R7相同或不同，并且选自H、羟基、烷氧基、膦酰基、膦酰氧基、磺基、磺氧基、氨基、巯基、氰基、硝基、甲酰基和羧基、和其酯和酰胺；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
58、一种用于增强个体的免疫应答的方法，该方法包括给所述个体施用有效量的具有结构式(II)的化合物：
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH基团；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
59、如权利要求58所述的方法，进一步包括给所述个体施用外源抗原。
60、用于改善或实质上预防个体中感染性疾病、自身免疫疾病或变应性疾病的方法，该方法包括给所述个体施用有效量的具有结构式(II)的化合物：
Figure GSA00000097816700661
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH基团；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
61、一种用于增强个体的免疫应答的方法，该方法包括给所述个体施用有效量的具有结构式(III)的化合物：
Figure GSA00000097816700662
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到11个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
62、如权利要求61所述的方法，进一步包括给所述个体施用外源抗原。
63、用于改善或实质上预防个体中感染性疾病、自身免疫疾病或变应性疾病的方法，该方法包括给所述个体施用有效量的具有结构式(III)的化合物：
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到11个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
64、一种用于增强个体的免疫应答的方法，该方法包括给所述个体施用有效量的具有结构式(IV)的化合物：
Figure GSA00000097816700681
其中Y是氧；X选自在直立或平伏位置的O和S；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约2O个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
65、如权利要求64所述的方法，进一步包括给所述个体施用外源抗原。
66、用于改善或实质上预防个体中感染性疾病、自身免疫疾病或变应性疾病的方法，该方法包括给所述个体施用有效量的具有结构式(IV)的化合物：
Figure GSA00000097816700691
其中Y是氧；X选自在直立或平伏位置的O和S；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的脂酰基残基，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。

Claims (28)

1.一种化合物，其具有结构式(III)：
Figure FSA00000097816600011
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n和m是0；R1、R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的直链烷基基团，并且其中R1、R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10、R11和R12独立地选自具有1到11个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
2.如权利要求1所述的化合物，其中X和Y是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10烷基基团，并且R10、R11和R12独立地是具有3到9个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
3.如权利要求2所述的化合物，其中R10、R11和R12独立地是具有3到7个碳原子的直链未取代的脂肪族基团。
4.如权利要求1所述的化合物，其具有结构式：
其中n是1或5，并且R6是COOH或CH2OPO3H2。
5.如权利要求4所述的化合物，其中n是1。
6.如权利要求4所述的化合物，其中n是5。
7.一种化合物，其具有结构式(IV)：
Figure FSA00000097816600021
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；n和m是0；R1、R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的直链烷基基团，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H基团，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10、R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐。
8.如权利要求7所述的化合物，其中X是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10烷基基团，并且R10、R11和R12独立地是选自具有3到9个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
9.如权利要求8所述的化合物，其中R10、R11和R12独立地是具有3到7个碳原子的直链未取代的脂肪族基团。
10.如权利要求7所述的化合物，其具有结构式：
Figure FSA00000097816600031
其中n是1或5，且R6是COOH或CH2OPO3H2。
11.一种药物组合物，其包含：
(a)有效量的具有结构式(III)的化合物：
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的直链烷基基团，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到11个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐；和
(b)药物学可接受的载体。
12.如权利要求11所述的组合物，其中X和Y是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10烷基基团，并且R10、R11和R12独立地是具有3到9个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
13.如权利要求12所述的组合物，其中R10，R11和R12独立地是具有3到7个碳原子的直链未取代的脂肪族基团。
14.权利要求11所述的组合物，其适于粘膜施用。
15.权利要求11所述的组合物，其适于鼻内施用。
16.如权利要求11所述的组合物，其进一步包含抗原，并且包含佐剂有效量的结构式(III)化合物或其盐。
17.一种药物组合物，其包含：
(a)有效量的具有结构式(IV)的化合物：
Figure FSA00000097816600041
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的直链烷基基团，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H基团，并且R8和R9至少之一是膦酰基；R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐；和
(b)药物学可接受的载体。
18.如权利要求17所述的组合物，其中X是氧，R1、R2和R3独立地选自C6-C10烷基基团，并且R10、R11和R12独立地是具有3到9个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团。
19.如权利要求18所述的组合物，其中R10，R11和R12独立地是具有3到7个碳原子的直链未取代的脂肪族基团。
20.权利要求17所述的组合物，其适于粘膜施用。
21.权利要求17所述的组合物，其适于鼻内施用。
22.如权利要求17所述的组合物，其进一步包含抗原，并且包含佐剂有效量的结构式(IV)化合物或其盐。
23.具有结构式(III)的化合物：
Figure FSA00000097816600051
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的直链烷基基团，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到11个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐在制备用于增强个体的免疫应答的药物中的用途。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述药物和外源抗原联合施用。
25.具有结构式(III)的化合物：
Figure FSA00000097816600061
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；Y选自O和NH；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的直链烷基基团，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到11个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐在制备用于改善或实质上预防个体中感染性疾病、自身免疫疾病或变应性疾病的药物中的用途。
26.具有结构式(IV)的化合物：
Figure FSA00000097816600062
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的直链烷基基团，并且
其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐在制备用于增强个体的免疫应答的药物中的用途。
27.如权利要求26所述的用途，其中所述药物和外源抗原联合施用。
28.具有结构式(IV)的化合物：
Figure FSA00000097816600071
其中X选自在直立或平伏位置的O和S；n和m是0；R1，R2和R3相同或不同，并且是具有1到约20个碳原子的直链烷基基团，并且其中R1，R2或R3之一可选地是氢；R4选自H和甲基；p是1且R6是COOH，或p是2且R6是OPO3H2；R8和R9相同或不同，并且选自膦酰基和H，并且R8和R9至少之一是膦酰基；且R10，R11和R12独立地选自具有1到10个碳原子的直链未取代的饱和脂肪族基团；
或其药物学可接受的盐在制备用于改善或实质上预防个体中感染性疾病、自身免疫疾病或变应性疾病的药物中的用途。
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