ES2556970T3 - Ciertos compuestos de fosfato de aminoalquil glucosaminida y sus usos - Google Patents

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Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula:**Fórmula** donde n es 1 o 5 y R6 es COOH o CH

Description

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DESCRIPCION
Ciertos compuestos de fosfato de aminoalquil glucosaminida y sus usos Referencias cruzadas a aplicaciones relacionadas
Esta aplicacion reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos 60/438,585 presentada el 6 de enero de 2003.
Antecedentes de la invencion
Los receptores tipo Toll (TLR), han sido relacionados con la potente respuesta inmune innata y reconocen los diversos componentes estructurales que son unicos a los patogenos; esta interaccion lleva al sistema inmune a un estado activado, con consecuencias a corto y a largo plazo. Existe interes significativo en desarrollar agonistas y antagonistas de TLRs ya que la manipulation farmacologica de las respuestas inmunes innatas puede llevar a vacunas mas efectivas y a novedosas metodologlas terapeuticas para enfermedades autoinmunes, atopicas, malignas e infecciosas. El primer producto microbiano que se descubrio ser un agonista receptor tipo Toll fue LPS, un componente de la membrana bacteriana especlfico de las bacterias gram-negativas, que activa el receptor tipo Toll 4 (TLR-4). Aunque el LPS es un potente agente inmunomodulador, su uso medicinal es limitado debido a su extrema toxicidad, incluyendo la induction del slndrome de respuesta sistemica antiinflamatoria. La fraction subestructural endotoxica biologicamente activa de LPS es un llpido A, una glucosamina disacarido, acido graso acilado de forma multiple, fosforilado, que sirve para anclar toda la estructura en la membrana externa de la bacteria gram-negativa. Los efectos toxicos del llpido A pueden ser mejorados por modification qulmica selectiva del llpido A para producir compuestos monofosforilados del llpido A (MpLTM inmunoestimulante; Corixa Corporation; Seattle, WA). Los metodos para hacer y usar compuestos inmunoestimulantes y estructuralmente similares a MPLtm en adyuvantes de vacunas y otras aplicaciones han sido descritos (vease, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nos. 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 y 4,912,094; 4,987,237; Johnson et al., J Med Chem 42:4640-4649 (1999); Ulrich and Myers, en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach; Powell and Newman, Eds.; Plenum: New York, 495-524, 1995). En particular, estas y otras referencias han demostrado que inmunoestimulantes de MPL™ y compuestos relacionados tenlan actividades adyuvantes significativas cuando son usados en formulaciones de vacunas con antlgenos de protelna y carbohidratos para mejorar la inmunidad humoral y/o mediada por celulas a los antlgenos e interactuar con receptores tipo Toll.
Extrayendo de la experiencia con inmunoestimulantes MPL™ y otros componentes de la pared celular, se desarrollo una familia de compuestos sinteticos novedosos, los fosfatos de aminoalquil glucosaminida (AGPs). Los compuestos AGP tambien interactuan con TLR-4, como agonistas y antagonistas. Los AGPs incluyen tanto compuestos aclclicos como compuestos clclicos (Patentes de EE.UU. Nos. 6,113,918 y 6,303,347, WO 98/50399 publicada el Octubre 12 de 1998, Wo 01/34617, publicada el 17 de mayo de 2001, WO 01/90129, publicada el 29 de noviembre de 2001, y WO 02/12258, publicada el 14 de febrero de 2002). Como inmunoestimulante MPL™, se ha demostrado que estos compuestos retienen caracterlsticas adyuvantes significativas cuando son formulados con antlgenos en las composiciones de vacunas y, adicionalmente, tienen perfiles similares o mejorados de toxicidad cuando son comparados con inmunoestimulantes de MPL™. Los AGPs tambien demuestran actividad adyuvante en la mucosa y son efectivos en la ausencia de un antlgeno, haciendolos compuestos atractivos para el uso profilactico y/o terapeutico.
Otra ventaja significativa ofrecida por los AGPs sobre el inmunoestimulante MPL™ y similares es que los AGPs son facilmente producibles en una escala comercial por medios sinteticos. Ya que son producidos sinteticamente los AGPs son libres de contaminantes traza biologicos encontrados en MPL. Como tal los AGPs tendrlan una ventaja sobre los MPL como adyuvantes de vacunas en ciertas circunstancias, tales como en protocolos de inmunizacion pediatricos donde la pirogenicidad del adyuvante debe ser minimizada. Sin embargo, puesto que los AGPs son sintetizados qulmicamente, una estabilidad del compuesto menos que optima puede llevar a la acumulacion de productos de degradation que pueden resultar en actividad y estabilidad biologica variable de un lote a otro lote. Desde el punto de vista del proceso de desarrollo de GMP para la fabrication de materiales para pruebas cllnicas humanas, la estabilidad del lote y variabilidad de un lote a otro lote son problemas mayores. Por lo tanto, son deseados los compuestos que tienen una actividad biologica aumentada en comparacion con el inmunoestimulante MPL™ y similares, que interactuan con receptores tipo Toll y/o son optimizados para slntesis de GPL a gran escala. La presente invencion aborda estas necesidades y mas al proveer compuestos modificados para mejorar la actividad y estabilidad biologica, con una resistencia aumentada a la degradacion enzimatica y qulmica, y/o perfiles de seguridad mejorados.
Resumen de la invencion
En un aspecto de la invencion, esta invencion comprende ciertos compuestos de fosfato de aminoalquil glucosaminida, como se definen aqul, y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
Descripcion detallada de la invencion
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Los compuestos de la invencion son miembros de la familia de 4-fosfato de aminoalquil glucosaminida (AGP). Como se describe, abajo, los compuestos de la invencion poseen de forma variable modificaciones para las longitudes de las seis cadenas acilo (primario y secundario), modificaciones estructurales del brazo alquilo para incluir una fraccion de fosfato, la modification estructural para incluir un lipido de eter primario en la position C-3 de azucar como tambien tres lipidos de eter secundarios, y/o un grupo bloqueador 6-hidroxilo.
Conocidos quimicamente como w-aminoalquil 2-amino-2-desoxi-4-fosfono-p-D-glucopiranosidos las AGPs son una clase de lipidos A mimeticos sinteticos que son estructuralmente relacionados al componente activo biologico mayor del componente en el lipido A monofosforilo. En las AGPs el azucar reductor ha sido remplazado con una unidad N- [(R)-3-n-alcanoiloxitetradecanoil] aglucona de aminoalquilo. Como otras derivados de lipido A disacarido, las AGPs comprenden seis acidos grasos para la actividad biologica maxima, pero a diferencia de los derivados de disacaridos, las AGPs contienen una unidad de aglucona p enlazada conformacionalmente flexible que permite el empaque apretado energeticamente favorable de las seis cadenas de acilos grasos. El empaque apretado de seis acidos grasos en un despliegue hexagonal se cree que juega un papel esencial en la bioactividad de moleculas tipo lipido A (Seydel et al., Immunobiol; 187(3-5):191-211, 1993).
Los compuestos de la presente invencion son considerados miembros de la familia AGP. Estos compuestos incluyen modificaciones a las longitudes de las seis cadenas de acilos (primaria y secundaria).
Se revela un compuesto que tiene la formula (III):
imagen1
donde X es seleccionado del grupo que consiste de O y S en la posicion axial o ecuatorial; Y es seleccionado del grupo que consiste de O y NH; n y m son 0; R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son grupos alquilo de cadena recta que tienen desde 1 a 20 atomos de carbono y donde uno de R1, R2 o R3 es opcionalmente hidrogeno; R4 es seleccionado del grupo que consiste de H y metilo; p es 1 y R6 es COOH o p es 2 y R6 es OPO3H2; R8 y R9 son iguales o diferentes y son seleccionados del grupo que consiste de fosfono y H, y por lo menos uno de R8 y R9 es fosfono; y R10, R11 y R12 son independientemente seleccionados de grupos alifaticos saturados no sustituidos de cadena recta que tienen desde 1 a 11 atomos de carbono;
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
La presente invencion provee un compuesto que tiene la formula:
imagen2
donde n es 1 o 5 y R6 es COOH o CH2OP3H2.
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Tambien se revela un compuesto que tiene la formula (IV):
imagen3
donde X es seleccionado del grupo que consiste de O y S en la posicion axial o ecuatorial; n y m son 0; R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y son grupos alquilo de cadena recta que tienen desde 1 a 20 atomos de carbono y donde uno de Ri, R2 o R3 es opcionalmente hidrogeno; R4 es seleccionado del grupo que consiste de H y metilo; p es 1 y R6 es COOH o p es 2 y R6 es OPO3H2; R3 y Rg son iguales o diferentes y son seleccionados del grupo que consiste de fosfono y H, y por lo menos uno de Re y Rg es fosfono; y R10, R11 y R12 son independientemente seleccionados de grupos alifaticos saturados no sustituidos de cadena recta que tienen desde 1 a 10 atomos de carbono; o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
La presente invencion tambien provee un compuesto que tiene la formula:
imagen4
donde n es 1 o 5 y R6 es COOH o CH2OPO3.
Estos compuestos tienen atributos que permiten la resistencia a metabolismos desfavorables y/o hidrolisis acuosa. Se ha postulado que la elimination selectiva de los acidos grasos normales en moleculas de lipido A estructuralmente diversas por la hidrolasa aciloxiacil humana (AOAH) para producir el lipido IVa antagonista evoluciono como un mecanismo de defensa para reducir la toxicidad del lipido A (Erwin and Munford., J Biol Chem 265(27):16444-16449, 1990). Sin embargo, la mayor toxicidad de 3-D-MPL derivada naturalmente relativa a aquella del componente hexaacilo principal es probablemente debida a la presencia de componentes menos altamente acilados con estructuras diferentes del lipido IVa (Ulrich and Myers, Monophosphoryl lipid A as an Adjuvant. Past experiences and new directions. In: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach. Ed. Powell M.F., Newman M.J. Plenum Press, New York, 1995; p. 495-524, Johnson et al., J Med Chem; 42:4640-4649, 1999). La variabilidad estructural en 3-D-MPL y otras preparaciones de lipido A surgen intrinsecamente del LPS relacionado como tambien de la ruptura del ester durante procedimientos semisinteticos y de aislamiento. De hecho, ha sido reportado que la ruptura hidrolitica superficial de grupos acilo enlazados con ester durante la sintesis quimica de un lipido A R. capsulatus putativo, un antagonista potente de production de TNF-a LPS inducido, produce cantidades menores de subproductos agonisticos no deseados (Christ et al., Science; 268:80-83, 1995). Por lo tanto, la inestabilidad quimica y/o enzimatica puede ser el talon de Aquiles de un potencial farmaco con base de lipido A que contiene enlaces ester labiles. La inestabilidad quimica y metabolica de acidos grasos con enlaces ester presente tanto en el agonista de lipido A como en las moleculas antagonistas ha sido superada con analogos hidroliticamente estables que poseen enlaces eter en lugar de acidos grasos con enlaces ester primarios y/o secundarios. (Christ et al. supra, Lien et al., J Biol Chem; 276(3):1873-1880, 2001).
Como se discute aqui, el termino “alifatico” por si solo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, una cadena recta o ramificada, o un radical ticlico de hidrocarburo, o una combination del
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mismo, que puede ser completamente saturado, mono o poliinsaturado y puede incluir radicales di y multivalentes, teniendo el numero de atomos de carbono designado (es decir, C1-C10 significa uno a diez carbonos). Ejemplos de radicales de hidrocarburos saturados incluyen grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexilo)metilo, ciclopropilmetilo, homologos e isomeros de, por ejemplo, n- pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, y similares. Un grupo alifatico no saturado es uno que tiene uno o mas enlaces dobles o enlaces triples. Ejemplos de grupos alifaticos no saturados incluyen vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2- isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo, y los homologos e isomeros mas altos. Tlpicamente, un grupo alifatico tendra desde 1 a 24 atomos de carbono. Un grupo “alifatico mas bajo” es un grupo alifatico de cadena mas corta, que generalmente tiene ocho o menos atomos de carbono.
El termino “acilo” se refiere al grupo derivado de un acido organico por la eliminacion del grupo hidroxi. Ejemplos de grupos acilo incluyen acetilo, propionilo, dodecanoilo, tetradecanoilo, isobutirilo, y similares. Por lo tanto, se entiende que el termino “acilo” como se usa aqul incluye alifatico saturado.
El termino “sales farmaceuticamente aceptables” se pretende que incluya sales de los compuestos activos las cuales son preparadas con acidos y bases relativamente no toxicos, dependiendo de los sustituyentes particulares encontrados en los compuestos aqul descritos. Cuando compuestos de la presente invencion contienen funcionalidades relativamente acidas, pueden obtenerse sales de adicion basica, poniendo en contacto la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente de la base deseada, pudiendo ser pura o en un solvente inerte adecuado. Ejemplos de sales de adicion basica farmaceuticamente aceptables incluyen sodio, potasio, calcio, amoniaco, amina organica, o sal de magnesio, o una sal similar. Cuando compuestos de la presente invencion contienen funcionalidades relativamente basicas, pueden obtenerse sales de adicion acida poniendo en contacto la forma neutral de tales compuestos con una cantidad suficiente del acido deseado, tanto puro o en un solvente inerte adecuado. Ejemplos de sales de adicion acida farmaceuticamente aceptables incluyen aquellas derivadas de acidos inorganicos como clorhldrico, bromhldrico, nltrico, carbonico, monohidrogenocarbonico, fosforico, monohidrogenofosforico, dihidrogenofosforico, sulfurico, monohidrogenosufurico, yodhldrico, o acidos fosforosos y similares, como tambien las sales derivadas de acidos organicos relativamente no toxicos como acetico, propionico, isobutlrico, maleico, malonico, benzoico, succlnico, suberico, fumarico, lactico, mandelico, ftalico, bencenosulfonico, p-tolilsulfonico, cltrico, tartarico, metanosulfonico, y similares. Tambien estan incluidas sales de aminoacidos tales como alginato y similares, y sales de acidos organicos como acido glucuronico o galacturonico y similares (vease, por ejemplo, Berge, S.M., et al, "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19, 1977). Ciertos compuestos especlficos de la presente invencion contienen funcionalidades basicas y acidas que permiten que los compuestos sean convertidos a sales de adicion basica o acida.
Las formas neutras de los compuestos pueden ser regeneradas poniendo en contacto la sal con una base o acido y aislando el compuesto original en la forma convencional. La forma original del compuesto difiere de las diversas formas de sales en ciertas propiedades flsicas, tales como solubilidad en solventes polares, pero de otra manera las sales son equivalentes a la forma original del compuesto para los propositos de la presente invencion.
Ademas de formas salinas, la presente invencion provee compuestos que estan en una forma de profarmaco. Los profarmacos de los compuestos descritos aqul son aquellos compuestos que facilmente experimentan cambios qulmicos bajo condiciones fisiologicas para proveer los compuestos de la presente invencion. Adicionalmente los profarmacos pueden ser convertidos a los compuestos de la presente invencion por metodos qulmicos o bioqulmicos en un ambiente ex vivo. Por ejemplo, los profarmacos pueden ser lentamente convertidos a los compuestos de la presente invencion cuando son colocados en el deposito de un parche transdermico con una enzima o un reactivo qulmico adecuado.
Ciertos compuestos de la presente invencion pueden existir en formas no solvatadas como tambien en formas solvatadas, incluyendo formas hidratadas. En general, las formas solvatadas son equivalentes a formas no solvatadas y se pretende que sean incluidas dentro del ambito de la presente invencion. Ciertos compuestos de la presente invencion pueden existir en multiples formas cristalinas y amorfas. En general, todas las formas flsicas son equivalentes para los usos contemplados por la presente invencion y se pretende que se encuentren dentro del alcance de la presente invencion.
Ciertos compuestos de la presente invencion poseen atomos de carbono asimetricos (centros opticos) o dobles enlaces; se pretende que los racematos, diastereomeros, isomeros geometricos e isomeros individuales se encuentren todos incluidos dentro del alcance de la presente invencion.
Los compuestos de la presente invencion tambien pueden contener proporciones no naturales de isotopos atomicos en uno o mas de los atomos que constituyen dichos compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden ser radiomarcados con isotopos radioactivos, tales como por ejemplo tritio (3H), yodo-125(125I) o carbono-14 (14C). Todas las variaciones isotopicas de los compuestos de la presente invencion, ya sean o no radioactivos, se pretende que sean abarcados dentro del ambito de la presente invencion.
Los compuestos de la presente invencion pueden ser preparados por cualquier metodo adecuado; vease la seccion de Ejemplos abajo, muchos de los cuales han sido descritos. Por ejemplo, procesos para preparar ciertos
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compuestos utiles en la presente invencion son descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 6,113,918; Patente de los Estados Unidos No. 6,303,347; y PCT/US98/09385 (WO 98/50300, 12 de octubre de 1998). Sin embargo otros compuestos pueden ser preparados usando los metodos descritos en Johnson, et al., J. Med Chem. 42:4640-4649 (1999), Johnson, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2273-2278 (1999), y PCT/US98/50399 (WO 98/50399, 12 de noviembre 12 de 1998). En general, los metodos sinteticos descritos en las referencias arriba mencionadas y otros metodos sinteticos de otra forma familiares en el arte son ampliamente aplicables para la preparacion de estos compuestos. Por ejemplo, haciendo compuestos que tienen diferentes grupos acilos y sustituciones, una persona experimentada en el arte apreciara que los metodos convergentes descritos all! pueden ser modificados para usar agentes acilantes alternativos, o pueden ser iniciados con materiales disponibles comercialmente que tienen unidos grupos acilo apropiados.
En composiciones para obtener o mejorar una respuesta inmune, los compuestos de la invencion son administrados a un animal de sangre caliente, incluyendo humanos, con un antlgeno tal como una protelna o antlgeno polipeptido o un polinucleotido que expresa una protelna o antlgeno polipeptido. La cantidad de antlgeno administrado para obtener una respuesta deseada puede ser facilmente determinada por una persona experimentada en el arte y variara con el tipo de antlgeno administrado, ruta de administracion y programa de inmunizacion.
Los compuestos de la presente invencion tambien pueden ser administrados sin un antlgeno exogeno, para obtener proteccion inmediata por medio de un efecto de resistencia no especlfico, como se describe abajo; vease Persing et al., Publicacion WIPO WO 01/90129, 29 de noviembre de 2001. Compuestos que tienen la habilidad de estimular resistencia no especlfica y/o de obtener un efecto adyuvante pueden ser usados en una formulacion de vacuna rapida. La administracion de compuestos de la presente invencion con antlgeno conduce a una respuesta inmune de mucosa adquirida en el transcurso de tres a cuatro semanas. La administracion semanal de tales compuestos, por medio de una ruta intranasal por ejemplo, sobre un periodo de cuatro semanas proveera una proteccion rapida y duradera combinando la proteccion provista por la respuesta inmune innata inicial, seguida por la respuesta inmune adquirida para el antlgeno de interes.
Los compuestos de la presente invencion pueden ser evaluados en una variedad de formatos de analisis para identificar y seleccionar aquellos que tienen las caracterlsticas mas aptas para una aplicacion dada de la invencion. Por ejemplo, se pueden usar modelos animales para identificar y evaluar perfiles de liberation de citoquina a la circulation sistemica seguidos por la administracion de un compuesto de la presente invencion. Adicionalmente, existen modelos in vitro e in vivo para examinar cambios en uno o mas aspectos de una respuesta inmune a diferentes compuestos antigenicos para lograr identificar los compuestos mas apropiados para obtener una respuesta inmune especlfica de interes. Por ejemplo, un compuesto puede ser puesto en contacto con celulas objetivo tales como macrofagos, celulas dendrlticas o celulas de Langerhans in vitro, y pueden cuantificarse citoquinas elaboradas. Adicionalmente, pueden usarse disposiciones de expresion genetica para identificar rutas especlficas activadas o inhibidas por un compuesto particular de interes.
La induccion/produccion de citoquina puede ser determinada usando el tratamiento de sangre y/o celulas humanas con compuestos de la presente invencion y midiendo la induction con ELISA (Sistemas R & D). Tales metodos tambien pueden ser usados para determinar si la induccion es dependiente del receptor tipo Toll. La respuesta citotoxica del linfocito T despues de la administracion de los compuestos de la presente invencion es determinada por el analisis de citotoxicidad basado en 51Cr. Si se desea, el desempeno en este respecto del compuesto inventivo puede ser comparado con otros compuestos que se conocen por ser funcionales en este respecto, tales como el llpido A, MPL, AGPs o similares. Adicionalmente, los compuestos de la invencion pueden ser evaluados en combination con uno o mas agentes adyuvantes y/o inmunomoduladores para identificar efectos sinergicos (vease por ejemplo Patentes de los Estados Unidos Nos; 6,303.347 y 6,113,918, y WO 01/90129, publicada el 29 de noviembre de 2001).
Modelos animales tales como el modelo de exposition de influenza murlnica y el modelo de exposition murlnica a Listeria monocytogenes son utiles para determinar la actividad adyuvante e inmunomoduladora. En resumen, el compuesto es administrado seguido por una exposicion a influenza o a L. monocytogenes. El Indice de enfermedad (pelaje alterado, postura arqueada y respiration trabajosa), perdida de peso y mortalidad, en el caso de influenza o el numero de unidades formadoras de colonia en los bazos de los ratones tratados/no tratados, en el caso de L. Monocytogenes, son monitorizados como una indication de la proteccion provista por la administracion del compuesto de la invencion (vease por ejemplo, WO 01/90129 publicado Noviembre 29, 2001).
Como se usa aqul, el termino “polipeptido” es usado en su significado convencional, es decir, como una secuencia de aminoacidos. Los polipeptidos no son limitados a una longitud especlfica del producto; por lo tanto, los peptidos, oligopeptidos, y protelnas estan incluidos dentro de la definition de polipeptido, y tales terminos pueden ser usados aqul intercambiablemente a no ser que se indique especlficamente de otra manera. Este termino tampoco se refiere a o excluye modificaciones postexpresion del polipeptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, como tambien otras modificaciones conocidas en el arte, tanto de origen natural como de origen no natural. Un polipeptido puede ser una protelna completa, o una subsecuencia de la misma. Polipeptidos particulares de interes en el contexto de esta invencion son subsecuencias de aminoacidos que comprenden epltopos, es decir,
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determinantes antigenicos sustancialmente responsables de las propiedades inmunogenicas de un polipeptido y que son capaces de producir una respuesta inmune.
Los polipeptidos utiles en la presente invencion son algunas veces mencionados como protelnas tumorales o polipeptidos tumorales, como una indicacion de que su identification ha sido basada por lo menos en parte por sus niveles aumentados de expresion en muestras tumorales. Por lo tanto, un “polipeptido tumoral” o una “protelna tumoral”, se refiere generalmente a una secuencia de polipeptidos de la presente invencion, o una secuencia de polinucleotidos que codifica tal polipeptido, que es expresado en una proportion sustancial de muestras tumorales, por ejemplo preferiblemente mayor que aproximadamente 20%, mas preferiblemente mayor que aproximadamente 30%, y mas preferiblemente mayor que aproximadamente 50% o mas de muestras tumorales analizadas, a un nivel que es por lo menos dos veces mayor, y preferiblemente por lo menos cinco veces mayor, mayor que el nivel de expresion en tejidos normales, tal como se determina usando un analisis representativo provisto aqul.
En ciertas realizaciones preferidas, los polipeptidos utiles en la presente invencion son inmunogenicos, es decir, reaccionan de forma detectable dentro de un inmunoensayo (tal como ELISA o un analisis de estimulacion de celulas T) con antisuero y/o celulas T de un paciente con cancer. El examen para la actividad inmunogenica puede ser realizada usando tecnicas bien conocidas para los expertos en el arte. Por ejemplo, tales examenes pueden ser realizados usando metodos tales como aquellos descritos en Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En un ejemplo ilustrativo, un polipeptido puede ser inmovilizado sobre un soporte solido y puesto en contacto con suero del paciente para permitir el enlace de anticuerpos dentro del suero al polipeptido inmovilizado. El suero no enlazado puede entonces ser eliminado y los anticuerpos enlazados pueden ser detectados usando, por ejemplo, Protelna A marcada con 125I.
Como serla reconocido por el experto en el arte, las porciones inmunogenicas de los polipeptidos revelados aqul tambien son utiles en la presente invencion. Una “portion inmunogenica”, como se usa aqul, es un fragmento de un polipeptido inmunogenico de la invencion que es a su vez reactivo inmunologicamente (es decir, se enlaza especlficamente) con las celulas B y/o receptores de antlgeno de la superficie de las celulas T que reconoce el polipeptido. Las porciones inmunogenicas pueden ser generalmente identificadas usando tecnicas bien conocidas, como aquellas resumidas en Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993) y referencias citadas alll. Tales tecnicas incluyen examinar los polipeptidos en cuanto a su habilidad para reaccionar con anticuerpos, antisuero y/o llneas de celulas T o clones especlficos para antlgeno. Como se usa aqul, antisuero y anticuerpos son “especlficos para antlgeno” si se enlazan especlficamente a un antlgeno (es decir, reaccionan con la protelna en un ELlSA u otro inmunoensayo, y no reaccionan de forma detectable con protelnas no relacionadas). Tal antisuero y anticuerpos pueden ser preparados como se describe aqul, y usando tecnicas bien conocidas.
En una realization preferida, una porcion inmunogenica de un polipeptido util en la presente invencion es una porcion que reacciona con antisuero y/o celulas T a un nivel que no es substancialmente menor que la reactividad del polipeptido de longitud completa (es decir, en ELISA o un analisis de reactividad de celulas T). Preferiblemente, el nivel de actividad inmunogenica de la porcion inmunogenica es por lo menos aproximadamente 50%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 70% y mas preferiblemente mayor que aproximadamente 90% de la inmunogenicidad para el polipeptido de longitud completa. En algunas ocasiones, seran identificadas porciones inmunogenicas preferidas que tienen un nivel de actividad inmunogenica mayor que aquel del polipeptido de longitud completa que le corresponde, por ejemplo, que tienen actividad inmunogenica mayor que aproximadamente 100% o 150% o mas.
En otras ciertas realizaciones, porciones inmunogenicas ilustrativas pueden incluir peptidos en los cuales una secuencia gula con terminal N y/o un dominio transmembrana han sido borrados. Otras porciones inmunogenicas ilustrativas van a contener una pequena elimination del terminal N y/o del terminal C (por ejemplo, 1-30 aminoacidos, preferiblemente 5-15 aminoacidos), con relation a la protelna madura.
En otra realizacion, una composition de polipeptido util en la presente invencion puede tambien comprender uno o mas polipeptidos que son inmunologicamente reactivos con celulas T y/o anticuerpos generados contra un polipeptido de la invencion, particularmente un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacido revelada aqul, o a un fragmento inmunogenico o variante del mismo.
En otra realizacion, se proveen polipeptidos que comprenden uno o mas polipeptidos que son capaces de obtener celulas T y/o anticuerpos que son inmunologicamente reactivos con uno o mas polipeptidos descritos aqul, o uno o mas polipeptidos codificados por secuencias de acido nucleico contiguas contenidas en los polinucleotidos revelados aqul, o fragmentos inmunogenicos o variantes del mismo.
Los polipeptidos pueden comprender una secuencia senal (o llder) en el extremo del terminal N de la protelna, la cual cotraslacionalmente o postraslacionalmente dirige la transferencia de la protelna. El polipeptido tambien puede ser conjugado a un enlazador u otra secuencia para facilitar la slntesis, purification o identificacion del polipeptido (por ejemplo, poli-His), o para mejorar el enlace del polipeptido a un soporte solido. Por ejemplo, un polipeptido puede ser conjugado a una region de inmunoglobulina Fc.
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Dentro de otras realizaciones ilustrativas, un polipeptido puede ser un polipeptido de fusion que comprende multiples polipeptidos como son descritos aqui, o que comprende por lo menos un polipeptido como se describe aqui y una secuencia sin relacion, tal como una proteina tumoral conocida. Un asociado de fusion puede, por ejemplo, asistir en proveer epitopos ayudantes T (un asociado de fusion inmunologico), preferiblemente epitopos ayudantes T reconocidos por humanos, o puede asistir en expresar la proteina (un mejorador de expresion) a mas altos rendimientos que la proteina recombinante nativa. Ciertos asociados de fusion preferidos son asociados de fusion mejoradores tanto inmunologicos como de expresion. Otros asociados de fusion pueden ser seleccionados para aumentar la solubilidad del polipeptido o para permitir que el polipeptido sea direccionado a compartimentos intracelulares deseados. Adicionalmente, los asociados de fusion incluyen etiquetas de afinidad, las cuales facilitan la purificacion del polipeptido.
Los polipeptidos de fusion pueden ser preparados generalmente usando tecnicas estandar, incluyendo conjugacion quimica. Preferiblemente, un polipeptido de fusion es expresado como un polipeptido recombinante, permitiendo la produccion de niveles aumentados, relativos a polipeptidos no fusionados., en un sistema de expresion. En resumen, secuencias de ADN que codifican los componentes del polipeptido pueden ser ensambladas separadamente, y ligadas a un vector de expresion apropiado. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente del polipeptido esta ligada, con o sin un enlazador de peptido, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo polipeptido componente para que las estructuras de lectura de las secuencias esten en fase. Esto permite el traslado a un polipeptido de fusion unico que mantenga la actividad biologica de ambos polipeptidos componentes.
Una secuencia enlazadora de peptido puede ser usada para separar el primero y segundo componentes polipeptidicos con suficiente distancia para asegurar que cada polipeptido se pliegue a sus estructuras secundarias y terciarias. Tal secuencia enlazadora de peptido es incorporada en el polipeptido de fusion usando tecnicas estandar bien conocidas en el arte, Secuencias enlazadoras de peptido adecuadas pueden ser elegidas con base en los siguientes factores: (1) su habilidad para adoptar una conformacion flexible extendida; (2) su inhabilidad para adoptar una estructura secundaria que pueda interactuar con epitopos funcionales en el primero y segundo polipeptidos; y (3) la falta de residuos hidrofobos o cargados que puedan reaccionar con los epitopos funcionales de peptido. Las secuencias enlazadoras de peptido preferidas contienen residuos Gly, Asn y Ser. Otros aminoacidos neutros cercanos, tales como Thr y Ala tambien pueden ser usados en la secuencia de enlace. Las secuencias de aminoacido que pueden ser utilmente usadas como enlazadores incluyen aquellas reveladas en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; Patente de los Estados Unidos No. 4,935,233 y Patente de los Estados Unidos No. 4,751,180. La secuencia enlazadora puede tener generalmente desde 1 a aproximadamente 50 aminoacidos en longitud. Las secuencias enlazadoras no son requeridas cuando el primero y segundo polipeptidos tienen regiones de aminoacidos de terminal N no esenciales que pueden ser usadas para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia esterica.
Las secuencias ligadas de ADN son enlazadas operablemente a elementos regulatorios trascripcionales o traslacionales adecuados. Los elementos regulatorios responsables de la expresion de ADN estan localizados solamente en 5' de la secuencia de ADN que codifica los primeros polipeptidos. De manera similar, los codones de pausa requeridos para finalizar las senales de terminacion de traslacion y trascripcion solamente estan presentes en 3' de la secuencia de ADN que codifica el segundo polipeptido.
El polipeptido de fusion puede comprender un polipeptido como se describe aqui junto con una proteina inmunogenica no relacionada, tal como una proteina inmunogenica capaz de obtener una respuesta de memoria. Ejemplos de tales proteinas incluyen proteinas de tetano, tuberculosis y hepatitis (vease, por ejemplo, Stoute et al. New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997).
En una realizacion preferida, el asociado de fusion inmunologico es derivado de una Mycobacterium sp., tal como un fragmento Ra12 derivado de Mycobacterium tuberculosis. Las composiciones de Ra12 y metodos para su uso en el mejoramiento de la expresion y/o inmunogenicidad de secuencias heterologas de polinucleotido/polipeptido son descritas en la Aplicacion de Patente de los Estados Unidos 60/158,585. Brevemente, el Ra12 se refiere a una region de un polinucleotido que es una subsecuencia de un acido nucleico MTB32A de Mycobacterium tuberculosis. El MTB32A es una proteasa de serina con peso molecular de 32KD codificado por un gen en cepas virulentas y avirulentas de M. Tuberculosis. La secuencia de nucleotido y la secuencia de aminoacido de MTB32A han sido descritas (por ejemplo, Aplicacion de Patente de los Estados Unidos 60/158,585; vease tambien, Skeiky et al., Infection and Immun. (1999) 67:3998-4007). Fragmentos C terminales de la secuencia que codifica MTB32A expresan a altos niveles y se mantienen como un polipeptido soluble a traves del proceso de purificacion. Ademas, el Ra12 puede mejorar la inmunogenicidad de polipeptidos inmunogenicos heterologos con los que se ha fusionado. Un polipeptido de fusion Ra12 preferido comprende un fragmento C terminal de 14KD que corresponde a los residuos de aminoacidos 192 a 323 de MTB32A. Otros polinucleotidos Ra12 preferidos generalmente comprenden por lo menos aproximadamente 15 nucleotidos consecutivos, por lo menos aproximadamente 30 nucleotidos, por lo menos aproximadamente 60 nucleotidos, por lo menos aproximadamente 100 nucleotidos, por lo menos aproximadamente 200 nucleotidos, o por lo menos aproximadamente 300 nucleotidos que codifican una porcion de un polipeptido Ra12. Los polinucleotidos Ra12 pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endogena que codifica un polipeptido Ra12 o una porcion del mismo) o puede comprender una variante de tal secuencia. Las variantes del polinucleotido Ra12 pueden contener una o mas sustituciones, adiciones, eliminaciones
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y/o inserciones tales que la actividad biologica del polipeptido de fusion codificado no sea sustancialmente disminuida, con relacion a un polipeptido de fusion que comprende un polipeptido Ra12 nativo. Las variantes preferiblemente exhiben por lo menos aproximadamente 70% de identidad, mas preferiblemente por lo menos aproximadamente 80% de identidad y mas preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% de identidad a una secuencia de polinucleotido que codifica un polipeptido Ral2 nativo o una porcion del mismo.
Dentro de otras realizaciones preferidas, un asociado de fusion inmunologico es derivado de la protelna D, una protelna de superficie de la bacteria gram-negativa Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Preferiblemente, un derivado de la protelna D que comprende aproximadamente el primer tercio de la protelna (por ejemplo, el primer terminal N de 100-110 aminoacidos), y un derivado de la protelna D puede ser lipidado. Dentro de ciertas realizaciones preferidas, los primeros 109 residuos de un asociado de fusion de la Lipoprotelna D esta incluido en el terminal N para proveer al polipeptido con epltopos adicionales exogenos de celula T y para aumentar el nivel de expresion en E. Coli (por lo tanto funcionando como un mejorador de expresion). La cola del llpido asegura la presentacion optima de las celulas que presentan de antlgeno a antlgeno. Otros asociados de fusion incluyen la protelna no estructural del virus de la influenza, NS1 (hemaglutinina). Tlpicamente, se usan los aminoacidos del terminal N 81, aunque pueden ser usados diferentes fragmentos que incluyen epltopos de ayudantes T.
En otra realizacion, el asociado de fusion inmunologico es la protelna conocida como LYTA, o una porcion de la misma (preferiblemente la porcion terminal C). La LYTA es derivada del Streptococcus pneumoniae, el cual sintetiza un N-acetil-L-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gen 43:265-292, 1986). La LYTA es una autolisina que degrada especlficamente ciertos enlaces en el esqueleto del peptidoglicano. El dominio C terminal de la protelna LYTA es responsable por la afinidad a la colina o a algunos analogos de colina tales como DEAE. Esta propiedad ha sido explotada para el desarrollo de plasmidos que expresan E. Coli C-LYTA utiles para la expresion de protelnas de fusion. La purificacion de protelnas hibridas que contienen el fragmento C-LYTA en el terminal del aminoacido han sido descritas (vease Biotechnology 10:795-798, 1992). Dentro de una realizacion preferida, una porcion repetida de LYTA puede ser incorporada a un polipeptido de fusion. Una porcion repetida es encontrada en la region C terminal comenzando en el residuo 178. Una porcion de repeticion particularmente preferida incorpora los residuos 188-305.
Aun otra realizacion ilustrativa involucra polipeptidos de fusion, y los polinucleotidos que los codifican, donde los asociados de fusion comprenden una senal objetivo capaz de dirigir un polipeptido al compartimento endosomal/lisosomal, como es descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,633,234. Un polipeptido inmunogenico de la invencion, cuando es fusionado con su senal objetivo, se va a asociar mas eficientemente con las moleculas clase II MHC y por lo tanto proveen una estimulacion in vivo mejorada de celulas T CD4+ especlficas para el polipeptido.
Polipeptidos utiles en la presente invencion son preparados usando cualquiera de una variedad de tecnicas sinteticas y/o recombinantes bien conocidas. Polipeptidos, porciones y otras variantes generalmente menos que aproximadamente 150 aminoacidos pueden ser generados por medios sinteticos, usando tecnicas bien conocidas a aquellos con experiencia ordinaria en el arte. En un ejemplo ilustrativo, tales polipeptidos son sintetizados usando cualquiera de las tecnicas de fase solida comercialmente disponibles, tales como el metodo de slntesis de fase solida de Merrifield, donde aminoacidos son secuencialmente agregados a una cadena de aminoacidos en crecimiento. Vease Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. El equipo para la slntesis automatizada de polipeptidos esta disponible comercialmente de suplidores tales como Perkin Elmer/Applied Biosystems Division (Foster City, CA), y puede ser operado de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
En general, las composiciones de polipeptidos (incluyendo polipeptidos de fusion) utiles en la presente invencion son aisladas. Un polipeptido “aislado” es uno que es retirado de su ambiente original. Por ejemplo, una protelna o polipeptido de origen natural es aislado si esta separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferiblemente, tales polipeptidos tambien son purificados, por ejemplo, son por lo menos aproximadamente 90% puros, mas preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% puros y mas preferiblemente por lo menos aproximadamente 99% puros.
En otros aspectos, se proveen compuestos que comprenden uno o mas polinucleotidos que codifican un antlgeno de polipeptido como se describe aqul arriba. Los terminos “ADN” y “polinucleotido” son usados esencialmente intercambiablemente aqul para hacer referencia a una molecula de ADN que ha sido aislada libre de ADN genomico total de una especie en particular. “Aislado”, como se usa aqul, significa que un polinucleotido esta sustancialmente lejos de otras secuencias codificadoras, y que la molecula de ADN no contiene porciones grandes de ADN codificador no relacionado, tal como fragmentos cromosomicos grandes u otros genes funcionales o regiones codificadoras de polipeptidos. Evidentemente, esto hace referencia a la molecula de ADN como es aislada originalmente, y no excluye genes o regiones codificadoras despues agregadas al segmento por la mano humana.
Los polinucleotidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endogena que codifica un polipeptido/protelna util en la presente invencion o una porcion del mismo) o puede comprender una secuencia que codifica una variante o derivada, preferiblemente una variante inmunogenica o derivada, de tal secuencia. Tlpicamente, variantes de polinucleotido van a contener una o mas sustituciones, adiciones, eliminaciones y/o
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inserciones, preferiblemente tales que la inmunogenicidad del polipeptido codificado por el polinucleotido variante no sea sustancialmente disminuida relativa a un polipeptido codificado por una secuencia de polinucleotido especlficamente expuesta aqul). El termino “variantes” tambien debe ser entendido por abarcar genes homologos de origen xenogenico.
En ciertas realizaciones preferidas, los polinucleotidos expuestos arriba, por ejemplo variantes de polinucleotido, fragmentos y secuencias hibridantes, codifican polipeptidos que son inmunologicamente de reactividad cruzada con un polipeptido antigenico o inmunogenico como se expone aqul arriba. En otras realizaciones preferidas, tales polinucleotidos codifican polipeptidos que tienen un nivel de actividad inmunogenica de por lo menos aproximadamente 50%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 70%, y mas preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% de ese nivel para una secuencia de polipeptido especlficamente expuesta aqul.
Los polinucleotidos revelados o fragmentos del mismo, sin importar la longitud de la secuencia codificadora, pueden ser combinados con otras secuencias de ADN, tales como promotores, senales de poliadenilacion, sitios de restriction enzimatica adicionales, multiples sitios de donation, otros segmentos codificadores, y similares, tal que su longitud total puede variar considerablemente. Es por lo tanto contemplado que un fragmento de acido nucleico de casi cualquier longitud puede ser utilizado, con la longitud total preferiblemente siendo limitada por la facilidad de preparation y uso en el protocolo previsto del ADN recombinante. Por ejemplo, segmentos de polinucleotido ilustrativos con longitudes totales de aproximadamente 10,000, aproximadamente 5000, aproximadamente 3000, aproximadamente 2,000, aproximadamente 1,000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50 pares de bases en longitud, y similares, (incluyendo todas las longitudes intermedias) son contempladas por ser utiles en muchas implementaciones de esta invention.
Composiciones de polinucleotidos utiles en la presente invencion pueden ser identificadas, preparadas y/o manipuladas usando cualesquiera de una variedad de tecnicas bien establecidas (vease generalmente, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y otras referencias similares). Por ejemplo, un polinucleotido puede ser identificado, como se describe en mas detalle abajo, examinando una microdisposicion de cADNs de expresion tumoral asociada (es decir, expresion que es por lo menos dos veces mayor en un tumor que en tejido normal, como es determinado usando un analisis representativo provisto aqul). Tales examenes pueden ser realizados, por ejemplo, usando la tecnologla de microdisposicion de Affymetrix, Inc. (Santa Clara, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante (y esencialmente como se describe por Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996 y Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155, 1997). Alternativamente, los polinucleotidos pueden ser amplificados de cADN preparado de celulas que expresan las protelnas descritas aqul, tales como celulas tumorales.
Muchos procesos dependientes de plantilla estan disponibles para amplificar una secuencia objetivo de interes presente en una muestra. Uno de los metodos de amplification mejor conocidos es el de reaction en cadena de la polimerasa (PCR™) el cual se describe en detalle en la Patente de U.S. Nos. 4,683,195, 4,683,202 y 4,800,159. Brevemente, en PCR™, dos secuencias cebadoras son preparadas las cuales son complementarias a las regiones sobre cadenas opuestas complementarias de la secuencia objetivo. Un exceso de trifosfatos desoxinucleosidos es agregado a una mezcla de reaccion junto con una polimerasa de ADN (por ejemplo, polimerasa Taq). Si la secuencia objetivo esta presente en una muestra, los cebadores van a enlazarse al objetivo y la polimerasa va a causar que los cebadores sean extendidos a lo largo de la secuencia objetivo agregando nucleotidos. Al aumentar y disminuir la temperatura de la mezcla de reaccion, los cebadores extendidos van a disociarse del objetivo para formar productos de reaccion, los cebadores en exceso van a enlazarse al objetivo y al producto de reaccion y el proceso es repetido. Preferiblemente los procedimientos de transcription inversa y amplificacion por PCR™ pueden ser realizados para cuantificar la cantidad de ARNm amplificado. Las metodologlas de la reaccion en cadena de la polimerasa son bien conocidas en el arte.
Cualquiera de un numero de otros procesos dependientes de plantilla, muchos de los cuales son variaciones de la tecnica de amplificacion por PCR™, son facilmente conocidos y disponibles en el arte. Ilustrativamente, algunos de esos metodos incluyen la reaccion en cadena de la ligasa (llamada LCR), descrita por ejemplo, en Eur. Pat. Appl. Publ. No. 320,308 y Patente de los Estados Unidos No. 4,883,750; Qbeta Replicase, descrita en la Publication de Solicitud Internacional de Patente PCT No. PCT/US87/00880; Amplificacion por Desplazamiento de la Cadena (SDA) y Reaccion en Cadena de Reparation (RCR). Otros metodos de amplificacion son descritos en la Solicitud de Patente. No. 2 202 328 de Gran Bretana, y en la Publicacion de Solicitud Internacional de Patente PCT N°. PCT/US89/01025. Otros procedimientos de amplificacion de acidos nucleicos incluyen sistemas de amplificacion basados en transcripcion (TAS) (Publicacion de Solicitud Internacional de Patente PCT No. WO 88/10315), incluyendo amplificacion basada en secuencia de acido nucleico (NASBA) y 3SR. Eur. Pat. Appl. Publ. No. 329,822 describe un proceso de amplificacion de acido nucleico que involucra la slntesis clclica del ARN de una cadena (“ssARN”), ssADN, y ADN de doble cadena (dsADN). La PCT Intl. Pat. Appl. Publ. No. WO 89/06700 describe un esquema de amplificacion de secuencia de acido nucleico basado en la hibridacion de una secuencia promotora/cebadora a un ADN objetivo de cadena unica (“ssADN”) seguido por la transcripcion de muchas copias de ARN de la secuencia. Otros metodos de amplificacion tales como “RACE” (Frohman, 1990), y “PCR de un lado” (Ohara, 1989) tambien son bien conocidos a aquellos con experiencia en el arte.
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Una porcion amplificada de un polinucleotido de la presente invention puede ser usada para aislar un gen de longitud completa de una biblioteca apropiada (por ejemplo, una biblioteca de cADN tumoral) usando tecnicas bien conocidas. Dentro de tales tecnicas, se examina una biblioteca (cADN o genomica) usando una o mas sondas o cebadores adecuados para la amplification. Preferiblemente, se selecciona una biblioteca de acuerdo al tamano para incluir moleculas mas grandes. Bibliotecas cebadas aleatorias pueden tambien ser preferidas para identificar las regiones 5' y corriente arriba de genes. Se prefieren bibliotecas genomicas para obtener intrones y extender secuencias 5'.
Para tecnicas de hibridacion, una secuencia parcial puede ser marcada (por ejemplo, por traslacion por muesca o marcado final con 32P) usando tecnicas bien conocidas. Una biblioteca bacteriana o bacteriofaga es entonces generalmente examinada por filtros hibridantes que contienen colonias de bacterias desnaturalizadas (o tamices que contienes placas bacteriofagas) con la sonda marcada (vease Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Se seleccionan y se expanden colonias hibridantes o placas, y el ADN es aislado para analisis adicional. Clones de cADN pueden ser analizados para determinar la cantidad de secuencia adicional por, por ejemplo, PCR usando un cebador de la secuencia parcial y un cebador del vector. Mapas de restriction y secuencias parciales pueden ser generadas para identificar uno o mas clones solapados. La secuencia completa puede entonces ser determinada usando tecnicas estandar, que pueden involucrar generar una serie de clones de elimination. Las secuencias solapadas resultantes pueden entonces ser ensambladas en una sola secuencia contigua. Una molecula de cADN de longitud completa puede ser generada ligando fragmentos adecuados, usando tecnicas bien conocidas.
Alternativamente, tecnicas de amplificacion, tales como aquellas descritas arriba, pueden ser utiles para obtener una secuencia codificadora de longitud completa de una secuencia parcial de cADN. Un ejemplo de tal tecnica de amplificacion es el PCR inverso (vease Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988), el cual usa enzimas de restriccion para generar un fragmento en la region conocida del gen. El fragmento es entonces circularizado por ligation intramolecular y usado como plantilla para PCR con cebadores divergentes derivados de la region conocida. Dentro de un abordaje alternativo, secuencias adyacentes a una secuencia parcial pueden ser recuperadas por amplificacion con un cebador a una secuencia enlazadora y un cebador especlfico a una region conocida. Las secuencias amplificadas son tlpicamente sometidas a una segunda ronda de amplificacion con el mismo cebador enlazador y un segundo cebador especlfico para la region conocida. Una variation sobre este procedimiento, el cual utiliza dos cebadores que inician la extension en direcciones opuestas de la secuencia conocida, se describe en WO 96/38591. Otra tecnica similar se conoce como “rapida amplificacion de extremos de cADN” o RACE. Esta tecnica involucra el uso de un cebador interno y un cebador externo, los cuales se hibridizan a una region poliA o secuencia de vector, para identificar secuencias que son 5' y 3' de una secuencia conocida. Tecnicas adicionales incluyen PCR de captura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991) PCR por pase (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60, 1991). Otros metodos que utilizan amplificacion pueden tambien ser usados para obtener una secuencia de cADN de longitud completa.
En ciertas ocasiones, es posible obtener una secuencia de cADN de longitud completa por analisis de secuencias provistas en un dato de bases de etiqueta de secuencia expresada (EST), tales como la disponible de GenBank. Generalmente pueden realizarse busquedas de ESTs solapados usando programas bien conocidos (por ejemplo, busquedas NCBI BLAST), y tales ESTs pueden ser usados para generar una secuencia contigua de longitud completa. Secuencias de ADN de longitud completa tambien pueden ser obtenidas por analisis de fragmentos genomicos.
En otras realizaciones, las secuencias de polinucleotidos o fragmentos de las mismas que codifican los polipeptidos expuestos aqul arriba, o protelnas de fusion o los equivalentes funcionales de las mismas, pueden ser usadas en moleculas recombinantes de ADN para dirigir la expresion de un polipeptido en celulas huesped adecuadas. Debido a la degeneration inherente del codigo genetico, otras secuencias de aDn que codifican sustancialmente la misma o una secuencia de aminoacido funcionalmente equivalente puede ser producida y estas secuencias pueden ser usadas para clonar y expresar un polipeptido dado.
Secuencias que codifican un polipeptido deseado pueden ser sintetizadas, completas o en parte, usando metodos qulmicos bien conocidos en el arte (vease Caruthers, M. H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232).
Para lograr expresar un polipeptido deseado, las secuencias de nucleotido que codifican el polipeptido, o sus equivalentes funcionales, pueden ser insertadas en el vector de expresion apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcription y traduction de la secuencia codificadora insertada. Metodos bien conocidos para aquellos expertos en el arte pueden ser usados para construir vectores de expresion que contienen secuencias que codifican un polipeptido de interes y elementos adecuados de control transcripcional y de traduccion. Estos metodos incluyen tecnicas recombinantes de ADN in vitro, tecnicas sinteticas, y recombination genetica in vivo. Tales tecnicas son descritas, por ejemplo, en Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., y Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.
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Los “elementos control” o “secuencias reguladoras” presentes en un vector de expresion son aquellas regiones no traducidas del vector, -mejoradores, promotores, regiones no traducidas 5' y 3'- que interaction con protelnas celulares huesped para llevar a cabo la trascripcion y traduccion. Tales elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema vector y huesped utilizado, pueden ser usados cualquier numero de elementos adecuados de trascripcion y traduccion, incluyendo promotores constitutivos e inducibles.
En celulas de mamlferos, un numero de sistemas de expresion basados en virus es generalmente disponible. Por ejemplo, en casos donde un adenovirus es usado como un vector de expresion, las secuencias que codifican un polipeptido de interes pueden estar ligadas a un complejo de trascripcion/traduccion de adenovirus que consiste del promotor tardlo y la secuencia gula tripartita. La insercion en una region no esencial E1 o E3 del genoma viral puede ser usada para obtener un virus viable que es capaz de expresar el polipeptido en celulas huesped infectadas (Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). Adicionalmente, los mejoradores de transcripcion, tales como el mejorador de virus sarcoma Rous (RSV), pueden ser usados para aumentar la expresion en las celulas huesped de mamlfero.
Senales especlficas de iniciacion tambien pueden ser usadas para lograr una traduccion mas eficiente de secuencias que codifican un polipeptido de interes. Tales senales incluyen el codon de iniciacion ATG y secuencias adyacentes. En casos donde las secuencias que codifican el polipeptido, su codon de iniciacion, y secuencias corriente arriba son insertadas dentro de los vectores de expresion apropiados, no se necesitan senales adicionales de control transcripcionales o de traduccion. Sin embargo, en casos donde solo la secuencia de codificacion, o una porcion de la misma, es insertada, senales de control de traduccion exogenas incluyendo el codon de iniciacion ATG deben ser provistos. Ademas, el codon de iniciacion debe estar en el marco correcto de lectura para asegurar la traduccion de la insercion completa. Elementos exogenos de traduccion y codones de iniciacion pueden ser de varios orlgenes, tanto natural como sintetico. La eficiencia de expresion puede ser mejorada por la inclusion de mejoradores que son apropiados para el sistema celular particular que es usado, tal como los descritos en la literatura (Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).
Una variedad de protocolos para detectar y medir la expresion de productos codificados con polinucleotidos, usando anticuerpos policlonales o monoclonales especlficos para el producto son conocidos en el arte. Ejemplos incluyen ensayos inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y clasificador celular activado por fluorescencia (FACS). Un inmunoensayo de dos sitios, con base monoclonal usando anticuerpos monoclonales reactivos a dos epltopos que no interfieren sobre un polipeptido dado puede ser preferido para algunas aplicaciones, pero tambien puede ser usado un ensayo de enlace competitivo. Estos y otros ensayos se describen, entre otros lugares, en Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.) y Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216).
Composiciones farmaceuticas y metodos
Debe entenderse que, si se desea, los compuestos revelados aqul pueden ser administrados en combinacion con otras modalidades terapeuticas, tales como compuestos o terapias antimicrobianas, antivirales y antifungicas, varios agentes terapeuticos con base de ADN, agentes terapeuticos basados en ARN, agentes terapeuticos basados en polipeptido y/o con otros inmunoefectores. De hecho, esencialmente cualquier otro componente tambien puede ser incluido, con la condicion de que el componente(s) adicional no cause un efecto adverso significativo tras el contacto con las celulas objetivo o tejidos del huesped. Las composiciones por lo tanto pueden ser administradas junto con otros agentes como sea requerido o deseado para las realizaciones especlficas de la invencion que sean implementadas. Ilustrativamente, las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden incluir, o ser usadas en conjuncion con, ADN que codifica una o mas protelnas terapeuticas, ARNs antisentido, ribozimas o similares.
Los metodos descritos aqul son aplicables esencialmente contra cualquier tipo de agente infeccioso, incluyendo bacterias, virus, parasitos, y hongos. Ilustrativamente, la invencion es util para el tratamiento profilactico y/o terapeutico de infecciones bacterianas causadas por especies de Pseudomonas, Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Serratia, Candida, Staphylococci, Streptococci, Chlamydia, Mycoplasma y otras numerosas. Condiciones virales ilustrativas que pueden ser tratadas de acuerdo con la invencion incluyen aquellas causadas, por ejemplo, por virus de Influenza, Adenovirus, virus de Parainfluenza, Rhinovirus, virus sincicial respiratorio (RSVs), Herpes virus, Citomegalovirus, Virus de Hepatitis, por ejemplo, virus de Hepatitis B y C, y otros. Hongos ilustrativos incluyen, por ejemplo, Aspergillis, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitus, y otros.
Tambien se describen aqul metodos para el tratamiento de sujetos, particularmente sujetos inmunocomprometidos que han desarrollado o estan a riesgo de desarrollar infecciones, tales como infecciones bacterianas nosocomiales y virales. Aproximadamente 2 millones de 40 millones de individuos hospitalizados cada ano desarrollan infecciones nosocomiales durante su estadla y aproximadamente 1% de estas, o aproximadamente 400,000 pacientes, desarrollan neumonla nosocomial, mas de 7000 de los cuales mueren. Esto hace que la neumonla nosocomial sea la causa llder de muerte en infecciones adquiridas en el hospital. Por lo tanto, esto llena una necesidad importante para acercamientos profilacticos efectivos en el tratamiento de infecciones nosocomiales.
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Tambien se describen aqul tratamientos profilacticos para pacientes inmunocomprometidos, tales como pacientes VIH positivos, quienes han desarrollado o estan a riesgo de desarrollar neumonla de una infeccion oportunista o de la reactivacion de una infeccion suprimida o latente. En 1992, aproximadamente 20,000 casos de infecciones de Pneumocystis carinii en pacientes con SIDA fueron reportados en los Estados Unidos solamente. Adicionalmente, 60-70% de todos los pacientes con SIDA adquieren P. carinii en algun punto durante su enfermedad. Por lo tanto, se describen aqul metodos profilacticos efectivos para esta poblacion en riesgo.
Los metodos descritos aqul pueden ser usados para tratar otras poblaciones de pacientes que pueden estar inmunocomprometidos y/o en riesgo de desarrollar enfermedades infecciosas, incluyendo, por ejemplo, pacientes con fibrosis clstica, enfermedad pulmonar obstructiva cronica y otros pacientes inmunocomprometidos y/o institucionalizados.
Los compuestos y composiciones que se describen aqul pueden ser utilizados (sin un antlgeno exogeno) en metodos para tratar, mejorar, o prevenir sustancialmente trastornos y condiciones alergicas, tales como sinusitis, rinosinusitis cronica, asma, dermatitis atopica y psoriasis. Este acercamiento esta basado por lo menos en parte en la habilidad de los compuestos para activar la produccion de citoquinas de celulas objetivo que pueden competir con respuestas de citoquina estereotlpicas tipo alergicas caracterizadas por la produccion de IL-4 o hiperrespuesta a la actividad de IL-4. La administracion de ciertos de los compuestos mono y disacaridos revelados aqul resultan en la expresion de IFN-gamma y IL-12 de celulas que procesan y presentan antlgenos, como tambien otras celulas, resultando en subregulacion de citoquinas asociadas con respuestas alergicas tales como IL-4, 5, 6, 10 y 13.
Los compuestos y composiciones descritas aqul pueden ser utilizados (sin un antlgeno exogeno) en metodos para tratar enfermedades y condiciones autoinmunes. Los compuestos seran tlpicamente seleccionados de aquellos capaces de antagonizar, inhibir o modular negativamente uno o mas receptores tipo Toll, particularmente Tlr2 y/o Tlr4, tales como una respuesta autoinmune asociada con una condition dada es mejorada o sustancialmente prevenida. Ilustrativamente, los metodos pueden ser usados en el tratamiento de condiciones tales como enfermedad inflamatoria intestinal, artritis reumatoide, artritis cronica, esclerosis multiple y psoriasis.
Los compuestos de la invention tambien pueden ser usados como adyuvantes e inmunoefectores que mejoran la generation de anticuerpos en animales inmunizados, estimulan la produccion de citoquinas y estimulan una respuesta inmune mediada por celulas incluyendo una respuesta citotoxica de linfocito T.
En metodos descritos aqul, por ejemplo, para causar un efecto en la respuesta inmune de un individuo, los compuestos y composiciones descritas aqul pueden ser formulados con un vehlculo farmaceutico aceptable para inyeccion o ingestion. Como se usa aqul, “vehlculo farmaceuticamente aceptable” significa un medio que no interfiere con la actividad inmunomoduladora del ingrediente activo y no es toxico para el paciente al cual se le administra. Los vehlculos farmaceuticamente aceptables incluyen emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, composiciones acuosas, liposomas, microperlas y microsomas. Por ejemplo, el vehlculo puede ser una microesfera o micropartlcula que tiene un compuesto de esta invencion dentro de la matriz de la esfera o partlcula o adsorbida en la superficie de la esfera o partlcula. El vehlculo tambien puede ser una solution acuosa o dispersion micelar que contiene trietilamina, trietanolamina u otro agente que vuelve la formulation alcalina en naturaleza, o una suspension que contiene hidroxido de aluminio, hidroxido de calcio, fosfato de calcio o adsorbato de tirosina. Los vehlculos tambien pueden incluir todos los solventes, medios de dispersion, vehlculos, revestimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de absorcion, reguladores, soluciones vehlculo, suspensiones, coloides, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en el arte. Excepto en tanto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, su uso en las composiciones terapeuticas es contemplado.
Formulaciones de los compuestos de la invencion que pueden ser administradas parenteralmente, es decir, via intraperitoneal, via subcutanea o via intramuscular incluyen los siguientes vehlculos preferidos. Ejemplos de vehlculos preferidos para uso subcutaneo incluyen una solucion salina reguladora de fosfato (PBS) y 0.01-0.1% de trietanolamina en Agua USP para Inyeccion. Vehlculos apropiados para inyeccion intramuscular incluyen 10% de etanol USP, 40% de propilenglicol y el balance una solucion isotonica aceptable tal como 5% dextrosa.
Ejemplos de vehlculos preferidos para uso intravenoso incluyen 10% de etanol USP, 40% propilenglicol USP y el balance de Agua USP para Inyeccion. Otro vehlculo aceptable incluye 10% etanol y Agua uSp para Inyeccion; aun otro vehlculo aceptable es 0.01-0.1% trietanolamina en Agua USP para inyeccion. Solventes parenterales farmaceuticamente aceptables son tales que proveen una solucion o dispersion que puede ser filtrada a traves de un filtro de 5 micrones sin eliminar el ingrediente activo.
Un metodo preferido de administracion de las composiciones descritas aqul es administracion a traves de la mucosa, particularmente administracion intranasal o administracion por inhalation (administracion pulmonar). La distribution pulmonar de farmacos puede ser lograda por varias metodologlas diferentes, incluyendo nebulizadores llquidos, inhaladores con dosis medida con base de aerosol (MDIs), y aparatos para la dispersion de polvos secos. Composiciones para el uso en administraciones de este tipo son tlpicamente polvos secos o aerosoles. Para la
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administracion de aerosoles, el cual es el metodo preferido de administracion, las composiciones son distribuidas por inhaladores, algunos de los cuales son descritos abajo.
Los polvos secos contienen, ademas del ingrediente activo, un vehlculo, un mejorador de absorcion, y opcionalmente otros ingredientes. El vehlculo es, por ejemplo, un mono, di o polisacarido, un alcohol azucarado u otro poliol. Vehlculos apropiados incluyen lactosa, glucosa, rafinosa, melezitosa, lactitol, maltitol, trehalosa, sacarosa, manitol; y almidon. La lactosa es particularmente preferida, especialmente en la forma de su monohidrato. Tambien se incluyen mejoradores de absorcion tales como polipeptidos, surfactantes, glicosidos de alquilo, sales de amino y acidos grasos o fosfollpidos. Los ingredientes de la formulacion tlpicamente deben estar en una forma finamente dividida, es decir, su diametro medio de volumen debe generalmente ser desde aproximadamente 30 a aproximadamente 200 micrones, como es medido por un instrumento de difraccion de laser o un contador Coulter. El tamano de partlcula deseado puede ser producido usando metodos conocidos en el arte, por ejemplo, triturado, micronizacion o precipitacion directa.
La via de administracion intranasal provee numerosas ventajas sobre muchas otras formas de administracion para los compuestos de esta invencion. Por ejemplo, una ventaja de la administracion intranasal es la conveniencia. Un sistema inyectable requiere esterilizacion de la jeringa hipodermica y en el marco institucional, conlleva a preocupaciones entre el personal medico sobre el riesgo de contraer la enfermedad al clavarse accidentalmente la aguja contaminada. Tambien deben ser impuestos en el marco institucional estrictos requisitos para la eliminacion segura de la aguja usada y la jeringa. En contraste, la administracion intranasal requiere poco tiempo de parte del paciente y del personal de atencion medica, y es mucho menos molesto para la institucion que los inyectables.
Una segunda ventaja importante de la administracion intranasal es la aceptacion del paciente del sistema de administracion del farmaco. La administracion intranasal es percibida como no invasiva, no esta acompanada de dolor, no tiene efectos posteriores significativos y produce la gratificacion de alivio rapido en el paciente que exhibe el slntoma. Esto es de particular ventaja cuando el paciente es un nino. Otra consideracion importante es que el paciente puede ser capaz de administrarse a si mismo la dosificacion(es) prescrita del aerosol nasal.
Para administracion intranasal las composiciones de esta invencion pueden ser formuladas como llquidos o como solidos. Tales composiciones pueden contener uno o mas adyuvantes, agentes para mejorar la absorcion de los ingredientes activos por permeacion a traves de la membrana nasal, y (para composiciones llquidas) un diluyente acuoso, por ejemplo agua. Alternativamente, el diluyente puede comprender un regulador acuoso tal como un regulador de fosfato. La composicion puede ademas incluir opcionalmente uno o mas alcoholes polihldricos y uno o mas agentes conservantes tales como, por ejemplo, gentamicina, bacitracina (0.005%), o cresol. Las composiciones pueden ser administradas a la cavidad nasal en la forma de un aerosol usando un atomizador, nebulizador, rociador, gotero u otro aparato que asegure el contacto de la solucion con las membranas mucosas nasales. El aparato puede ser uno simple tal como un rociador nasal simple que puede ser usado por el paciente, o puede ser un instrumento mas elaborado para una administracion mas precisa de las composiciones, que puede ser usado en la consulta de un medico o en una instalacion medica.
Pueden hacerse composiciones de polvos nasales mezclando el agente activo y el excipiente, teniendo ambos el tamano de partlcula deseado. Primeramente, se hace una solucion del agente activo y los excipientes de ciclodextrina, seguida por precipitacion, filtracion y pulverizacion. Tambien es posible eliminar el solvente por liofilizacion, seguida de pulverizacion del polvo al tamano de partlcula deseado usando tecnicas convencionales, conocidas en la literatura farmaceutica. El ultimo paso es la clasificacion por tamano por ejemplo tamizado, para obtener partlculas que esten preferiblemente entre 30 y 200 micrones de diametro. Los polvos pueden ser administrados usando un insuflador nasal, o pueden ser colocados en una capsula situada en un aparato de inhalacion o insuflador. Se hace penetrar una aguja a traves de la capsula para hacer poros en la parte de arriba y de abajo de la capsula y se envla aire para liberar las partlculas de polvo. La formulacion en polvo tambien puede ser administrada por aerosol en chorro de un gas inerte o suspendida en fluidos organicos llquidos.
En una realizacion especlfica, la composicion farmaceutica puede ser administrada por un sistema de liberacion controlado o sostenido. En una realizacion, puede ser usada una bomba para lograr una liberacion controlada o sostenida (vease Langer, Science, 249:1527-1533 (1990); Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:10; Buschwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989 N. Engl. J. Med. 321:574). En otra realizacion, pueden ser usados materiales polimericos para lograr una liberacion controlada o sostenida del agonista del receptor de k- opioide y/o antagonista de opioide (vease por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macrol. Chem. 23:61; vease tambien Levy et al., 1985 Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105; Patente de los Estados Unidos No. 5,679,377; Patente de los Estados Unidos No. 5,916,597, Patente de los Estados Unidos No. 5,912,015; Patente de los Estados Unidos No. 5,989,463; Patente de los Estados Unidos No. 5,128,326; Publicacion PCT No. WO 99/12154; y Publicacion PCT No. WO 99/20253). Ejemplos de pollmeros usados en formulaciones de liberacion sostenida incluyen, pero no estan limitados a, poli(2- hidroxi metacrilato de etilo), poli(metacrilato de metilo), poli(acido acrllico), poli(acetato de etileno-co-vinilo), poli(acido metacrllico), poliglicolidos (PLG), polianhldridos, poli(pirrolidona de N-vinilo), poli(alcohol de vinilo),
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poliacrilamida, poli(etilen glicol), poliactidas (PLA), poli(lactido-co-glicolidos)(PLGA), y poliortoesteres. En una realizacion preferida, el polimero usado en una formulacion de liberacion sostenida es inerte, libre de impurezas lixiviables, estable durante el almacenamiento, esteril, y biodegradable. En aun otra realizacion, un sistema de liberacion controlada o sostenida puede ser situado en proximidad al objetivo terapeutico, por lo tanto requiriendo solo una fraccion de la dosis sistematica (vease por ejemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
Los vehiculos para uso con tales composiciones farmaceuticas son biocompatibles, y tambien pueden ser biodegradables. En ciertas realizaciones, la formulacion preferiblemente provee un nivel relativamente constante de liberacion del componente activo. En otras realizaciones, sin embargo, se puede desear un indice mas rapido de liberacion inmediatamente despues de la administracion. La formulacion de tales composiciones se encuentra dentro de un nivel de experiencia ordinaria en el arte usando tecnicas conocidas. Vehiculos ilustrativos utiles en este aspecto incluyen microparticulas de poli(lactido-co-glicolido), poliacrilato, latex, almidon, celulosa, dextrano y similares. Otros vehiculos ilustrativos de liberacion retrasada incluyen biovectores supramoleculares, que comprenden un nucleo hidrofilico no liquido (por ejemplo, un polisacarido entrecruzado u oligosacarido) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifilico, tal como un fosfolipido (vease por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,151,254 y aplicaciones PCT WO 94/20078, WO 94/23701, WO 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenido dentro de una formulacion de liberacion sostenida depende del sitio de implantacion, el indice y la duracion esperada de liberacion y la naturaleza de la condition que va a ser tratada o prevenida.
Los compuestos de la invention pueden ser administrados a un individuo en una cantidad efectiva o una cantidad farmaceuticamente efectiva, para efectuar o mejorar la respuesta inmune del individuo. Como se usa aqui, “cantidad efectiva” o “cantidad farmaceuticamente efectiva” es aquella cantidad que muestra una respuesta sobre y por encima del vehiculo o los controles negativos. Una “cantidad adyuvante efectiva” es aquella cantidad del compuesto en cuestion que, cuando es administrada en conjuncion con un antigeno, muestra una respuesta sobre y por encima de aquella producida por el antigeno solo. La dosis precisa de los compuestos de la presente invencion que puede ser administrada a un paciente va a depender del compuesto particular usado, la ruta de administracion, la composition farmaceutica, y el paciente. Por ejemplo, cuando es administrada subcutaneamente para mejorar una respuesta del anticuerpo, la cantidad del compuesto usado es desde 1 a aproximadamente 250 microgramos, preferiblemente desde aproximadamente 25 a aproximadamente 50 microgramos basado en la administracion a un paciente adulto tipico de 70 kg.
En otra realizacion, las composiciones ilustrativas inmunogenicas, por ejemplo, composiciones inmunogenicas y/o vacunas, descritas aqui comprenden ADN que codifica uno o mas de los polipeptidos como son descritos arriba, tal que el polipeptido es generado in situ. Como se destaca arriba, el polinucleotido puede ser administrado dentro de cualquiera de una variedad de sistemas de administracion conocidos para aquellos de experiencia ordinaria en el arte. De hecho, numerosas tecnicas de administracion de genes son bien conocidas en el arte, tales como aquellas descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998, y las referencias citadas alli. Los sistemas de expresion de polinucleotidos apropiados van, por supuesto, a contener las secuencias de ADN regulatorias necesarias para la expresion en un paciente (tal como un acelerador adecuado y una senal de terminacion).
Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los polinucleotidos que codifican polipeptidos inmunogenicos descritos aqui son introducidos dentro de celulas huesped de mamifero adecuadas para expresion usando cualquiera de un numero de sistemas de base viral conocidos. En una realizacion ilustrativa, los retrovirus proveen una plataforma conveniente y efectiva para sistemas de administracion de genes. Una secuencia de nucleotido seleccionada que codifica un polipeptido de la presente invencion puede ser insertada a un vector y empacada en particulas retrovirales usando tecnicas conocidas en el arte. El virus recombinante puede entonces ser aislado y administrado a un sujeto. Un numero de sistemas retrovirales ilustrativos han sido descritos (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,219,740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Bums et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; y Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.
Adicionalmente, un numero de sistemas ilustrativos basados en adenovirus tambien han sido descritos. A diferencia de los retrovirus que se integran al genoma del huesped, los adenovirus persisten extracromosomicamente minimizando por lo tanto los riesgos asociados con la mutagenesis insercional (Haj-Ahmad y Graham (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616-629; y Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476).
Diversos sistemas de vector virus adenoasociados (AAV) tambien han sido desarrollados para la administracion de polinucleotidos. Los vectores AAV pueden ser facilmente construidos usando tecnicas bien conocidas en el arte. Vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,173,414 y 5,139,941; Publicaciones Internacionales Nos. WO 92/01070 y WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539;
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Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; y Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:18671875.
Vectores virales adicionales utiles para la administracion de polinucleotidos que codifican los polipeptidos de la presente invention por transferencia de genes incluyen aquellos derivados de la familia de virus de viruela, tales como el vaccinia virus y el virus de la viruela aviar. Por ejemplo, recombinantes del vaccinia virus que expresan las moleculas novedosas pueden ser construidos como sigue. El ADN que codifica un polipeptido es primero insertado en un vector apropiado para que este adyacente a un promotor de vaccinia y secuencias de ADN de vaccinia flanqueante, tales como la secuencia que codifica la timidina quinasa (TK). Este vector es entonces usado para transfectar celulas que son simultaneamente infectadas con vaccinia. La recombination homologa sirve para insertar el promotor de vaccinia mas el gen que codifica el polipeptido de interes en el genoma viral. El recombinante TK.sup.(-) resultante puede ser seleccionado cultivando las celulas en la presencia de 5-bromodesoxiuridina y seleccionando placas virales resistentes a este.
Un sistema de infeccion/transfeccion basado en vaccinia puede ser convenientemente usado para proveer una expresion inducible, transitoria o coexpresion de uno o mas polipeptidos descritos aqul en las celulas huesped de un organismo. Es este sistema particular, las celulas son primero infectadas in vitro con un virus de vaccinia recombinante que codifica bacteriofago T7 ARN polimerasa. Esta polimerasa muestra una especificidad exquisita en cuanto a que solo transcribe plantillas que tienen los promotores T7. Despues de la infection, las celulas son trasfectadas con el polinucleotido o polinucleotidos de interes, impulsado por el promotor T7. La polimerasa expresada en el citoplasma del recombinante de virus de vaccinia trascribe el ADN transfectado en ARN que es entonces traducido a un polipeptido por la maquinaria traductora del huesped. El metodo provee para una production citoplasmica de alto nivel, transitoria, de grandes cantidades de ARN y sus productos de traduction. Vease, por ejemplo, Elroy-Stein and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:6743-6747; Fuerst et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:8122-8126.
Alternativamente, tambien pueden usarse virus de viruela aviar, tales como el virus de viruela aviar y viruela de canario, para administrar las secuencias codificadoras de interes. Se sabe que virus de viruela aviar recombinantes, que expresan inmunogenos de patogenos de mamlfero, proveen una inmunidad protectora cuando son administrados a especies no aviares. El uso de un vector de viruela aviar es particularmente deseable en humanos u otras especies de mamlferos ya que los miembros del genero de viruela aviar solamente pueden replicarse productivamente en especies aviares susceptibles y por lo tanto no existen celulas de mamlfero infecciosas. Se conocen en el arte metodos para producir virus de viruela aviar recombinantes y utilizan recombinacion genetica, como se describe arriba con respecto a la produccion de virus de vaccinia. Vease, por ejemplo, WO 91/12882; WO 89/03429; y WO 92/03545.
Cualquiera de un numero de vectores de alfavirus tambien pueden ser usados para la administracion de composiciones de polinucleotidos de la presente invencion, tales como aquellos vectores descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,843,723; 6,015,686; 6,008,035 y 6,015,694. Ciertos vectores basados en la Encefalitis Equina Venezolana (VEE) tambien pueden ser usados, ejemplos ilustrativos de los cuales pueden ser encontrados en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,505,947 y 5,643,576.
Ademas, vectores moleculares conjugados, tales como los vectores de adenovirus quimericos descritos en Michael et al. J. Biol. Chem. (1993) 268:6866-6869 y Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099-6103, tambien pueden ser usados para la administracion de genes bajo la invencion.
Information ilustrativa adicional en estos y otros sistemas de administracion con base viral conocidos puede ser encontrada, por ejemplo, en Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,603,112, 4,769,330, y 5,017,487; WO 89/01973; Patente de los Estados Unidos No. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass- Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; y Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993.
En ciertas realizaciones, un polinucleotido puede ser integrado en el genoma de una celula objetivo. Esta integracion puede ser en el lugar y orientation especlficos via recombinacion homologa (remplazo de genes) o puede ser integrada en un sitio aleatorio, no especlfico (acrecentamiento de genes). En aun mas realizaciones, el polinucleotido puede ser mantenido establemente en la celula como un segmento separado, episomico de ADN. Tales segmentos de polinucleotido o “epitomas” codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replication independiente de o en sincronizacion con el ciclo celular del huesped. La forma en la que la estructura de expresion es administrada a una celula y donde en la celula permanece el polinucleotido es dependiente del tipo de estructura de expresion utilizada.
En otra realization de la invencion, un polinucleotido es administrado/entregado como ADN “desnudo”, por ejemplo como se describe en Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 y revisado por Cohen, Science 259:1691-1692,
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1993. La absorcion del ADN desnudo puede ser aumentada cubriendo con ADN perlas biodegradables, las cuales son eficientemente transportadas a las celulas.
En aun otra realizacion, una composition de la presente invention puede ser administrada a traves de una metodologla de bombardeo de partlculas, muchos de los cuales han sido descritos. En un ejemplo ilustrativo, la aceleracion de partlculas impulsadas por gas puede ser logrado con aparatos tales como aquellos fabricados por Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) y Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI), algunos ejemplos de los cuales son descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,846,796; 6,010,478; 5,865,796; 5,584,807; y Patente EP No. 0500 799. Esta metodologla ofrece una metodologla de administration libre de agujas donde una formulation de polvo seco de partlculas microscopicas, tales como partlculas de polinucleotidos o de polipeptidos, son aceleradas a alta velocidad dentro de un chorro de gas de helio generado por un aparato portatil, que propulsa las partlculas al tejido objetivo de interes.
En una realizacion relacionada, otros aparatos y metodos que pueden ser utiles para la inyeccion de las composiciones impulsadas por gas sin aguja descritas aqul incluyen aquellos provistos por Bioject, Inc. (Portland, OR), algunos ejemplos de los cuales son descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,790,824; 5,064,413; 5,312,335; 5,383,851; 5,399,163; 5,520,639 y 5,993,412.
La composicion farmaceutica es preferiblemente una que induzca una respuesta inmune predominantemente del tipo Th1. Altos niveles de citoquinas tipo Th1 (por ejemplo, IFN-g, TNF-a, IL-2 y IL-12) tienden a favorecer la induction de respuestas inmunes mediadas por celula a un antlgeno administrado. En contraste, altos niveles de citoquinas tipo Th-2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10) tienden a favorecer la induccion de respuestas humorales inmunes. Despues de la aplicacion de una composicion inmunogenica como se provee aqul, un paciente va a soportar una respuesta inmune que incluye respuestas tipo Th-1 y Th-2. Dentro de una realizacion preferida, en la cual una respuesta es predominantemente tipo Th-1, el nivel de citoquinas tipo Th-1 va a aumentar en una mayor medida que el nivel de las citoquinas tipo Th-2. Los niveles de estas citoquinas pueden ser evaluados facilmente usando analisis estandar. Alternativamente, o adicionalmente, altos niveles de citoquinas tipo Th-2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6, y IL-10) pueden ser deseados para ciertas aplicaciones terapeuticas. Los niveles de estas citoquinas pueden ser evaluados facilmente usando analisis estandar. Para un repaso de las familias de citoquinas, vease Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.
Composiciones ilustrativas para el uso en la induccion de citoquinas tipo Th-1 incluyen, por ejemplo, una combination de oligonucleotidos que contienen CpG (en el cual el dinucleotido CpG no esta metilado) como se describe, por ejemplo, en WO 96/02555, WO 99/33488 y Patente de los Estados Unidos Nos. 6,008,200 y 5,856,462. Secuencias de aDn inmunoestimulatorias tambien son descritas, por ejemplo, por Sato et al., Science 273:352, 1996. Otros inmunoestimulantes apropiados comprenden saponinas, tales como QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), y derivados de saponina relacionados y mimeticos de la misma.
Cualquiera de una variedad de inmunoestimulantes adicionales puede ser incluida en las composiciones de esta invencion. Por ejemplo, citoquinas, tales como GM-CSF, interferones o interleucinas para modular adicionalmente una respuesta inmune de interes. Adicionalmente, Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), las series SBAS de adyuvantes (por ejemplo, SbAS-2 o SBAS-4, disponibles de SmithKline Beecham, Rixensart, Belgica), y Enhanzyn™ immunostimulant (Corixa, Hamilton, MT). Inmunoestimulantes de eter de polioxietileno, son descritos en WO 99/52549A1 y tambien pueden ser usados.
Las composiciones farmaceuticas descritas aqul usualmente tambien van a comprender uno o mas reguladores (por ejemplo, solution salina neutra regulada o solution salina de fosfato regulada), carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextrano), manitol, protelnas, polipeptidos o aminoacidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostaticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutationa, adyuvantes (por ejemplo, hidroxido de aluminio), solutos que vuelven la formulacion isotonica, hipotonica o debilmente hipertonica con la sangre de un receptor, agentes de suspension, agentes espesantes y/o conservantes. Alternativamente, las composiciones descritas aqul pueden ser formuladas como un liofilizado.
Las composiciones farmaceuticas descritas aqul pueden ser presentadas en recipientes de una dosis o dosis multiples, tales como ampollas selladas o viales. Tales recipientes son tlpicamente sellados de tal forma para preservar la esterilidad y estabilidad de la formulacion hasta su uso. En general, las formulaciones pueden ser almacenadas como suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehlculos de aceite o acuosos. Alternativamente, una composicion farmaceutica puede ser almacenada en una forma liofilizada que requiere solamente la adicion de un vehlculo llquido esteril inmediatamente antes de su uso.
El desarrollo de reglmenes adecuados de dosificacion y tratamiento para usar las composiciones particulares descritas aqul en una variedad de reglmenes de tratamiento, incluyendo por ejemplo, administracion y formulacion oral, parenteral, intravenosa, intranasal, e intramuscular, son bien conocidos en el arte, algunos de los cuales son brevemente discutidos abajo para propositos generales de ilustracion.
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En ciertas aplicaciones, las composiciones farmaceuticas reveladas aqul pueden ser administradas a animales a traves de administracion oral. Como tales, estas composiciones pueden ser formuladas con un diluyente inerte o con un vehlculo comestible asimilable, o pueden estar contenidas en capsulas de gelatina de envoltura dura o suave, o pueden ser comprimidas en tabletas, o pueden ser incorporadas directamente con el alimento de la dieta.
Los compuestos activos pueden incluso ser incorporados con excipientes y usados en la forma de tabletas digeribles, tabletas bucales, pastillas, capsulas, ellxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares (vease, por ejemplo, Mathiowitz et al., Nature 1997 Mar 27;386(6623):410-4; Hwang et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Sits 1998;15(3):243-84; Patente de los Estados Unidos. 5,641,515; Patente de los Estados Unidos 5,580,579 y Patente de los Estados Unidos 5,792,451). Las tabletas, pastillas, plldoras, capsulas y similares tambien pueden contener cualquiera de una variedad de componentes adicionales, por ejemplo, un enlazador, tal como goma de tragacanto, acacia, almidon de malz o gelatina; excipientes, tales como fosfato de dicalcio; un agente desintegrador, tal como almidon de malz, almidon de patata, acido alglnico y similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio; y un agente endulzante, tal como sacarosa, lactosa o sacarina pueden ser agregados o un agente saborizante, tal como menta, aceite de gaulteria, o sabor de cereza. Cuando la forma de la unidad de dosificacion es una capsula, puede contener, ademas de los materiales del tipo arriba mencionados, un vehlculo llquido. Otra variedad de materiales pueden estar presentes como revestimientos o de otra forma para modificar la forma flsica de unidad de dosificacion. Por ejemplo, las tabletas, plldoras, o capsulas pueden estar cubiertas con shellac, azucar, o ambas. Por supuesto, cualquier material usado en la preparacion de la forma de unidad de dosificacion debe ser farmaceuticamente pura y sustancialmente no toxica en las cantidades usadas. Adicionalmente, los compuestos activos pueden ser incorporados a una preparacion y formulaciones de liberacion sostenida.
Tlpicamente, estas formulaciones van a contener por lo menos aproximadamente 0.1% del compuesto activo o mas, aunque el porcentaje del ingrediente(s) activo puede, por supuesto, ser variado y puede ser convenientemente entre aproximadamente 1 o 2% y aproximadamente 60% o 70% o mas del peso o volumen de la formulacion total. Naturalmente, la cantidad del compuesto(s) activo en cada composition terapeuticamente util puede ser preparada de tal forma que una dosificacion adecuada sera obtenida en cualquier dosis unica dada del compuesto. Factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, vida media biologica, via de administracion, vida util del producto, como tambien otras consideraciones farmacologicas seran contempladas por alguien experto en el arte de preparar tales formulaciones farmaceuticas, y como tal, una variedad de dosis y reglmenes de tratamiento pueden ser deseados.
Para la administracion oral las composiciones descritas aqul pueden alternativamente ser incorporadas con uno o mas excipientes en la forma de enjuague bucal, pasta dental, tableta bucal, aerosol oral, o formulaciones orales administradas sublingualmente. Alternativamente, el ingrediente activo puede ser incorporado en una solution oral tal como una que contiene borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio, o dispersado en una pasta dental, o agregado en una cantidad terapeuticamente efectiva a una composicion que puede incluir agua, enlazadores, abrasivos, agentes saborizantes, agentes espumantes, y humectantes. Alternativamente las composiciones pueden ser fabricadas en una tableta o forma de solucion que puede ser situada debajo de la lengua o de otra manera disuelta en la boca.
En ciertas circunstancias sera deseable administrar las composiciones farmaceuticas reveladas aqul parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, o inclusive intraperitonealmente. Tales metodologlas son bien conocidas para el experto en el arte, algunas de las cuales son descritas adicionalmente, por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos 5,543,158; Patente de los Estados Unidos 5,641,515 y Patente de los Estados Unidos 5,399,363. En ciertas realizaciones, las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacologicamente aceptables pueden ser preparadas en agua apropiadamente mezclada con un surfactante, tal como hidroxipropilcelulosa. Tambien se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicol llquido, y mezclas del mismo y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones generalmente van a contener un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Formas farmaceuticas ilustrativas apropiadas para uso inyectable incluyen soluciones esteriles acuosas o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones esteriles inyectables (por ejemplo, vease Patente de los Estados Unidos 5,466,468). En todos los casos la forma debe ser esteril y debe ser fluida al punto de que exista facil aplicabilidad por jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabrication y almacenamiento y debe ser preservada contra la action contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehlculo puede ser un solvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilen glicol llquido, y similares), mezclas apropiadas del mismo, y/o aceites vegetales. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de dispersion y/o por el uso de surfactantes. La prevention de la accion de microorganismos puede ser facilitada por varios agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal, y similares. En varios casos, sera preferido incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede ser lograda por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
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En una realizacion, para la administracion parenteral en una solucion acuosa, la solucion debe ser regulada adecuadamente si es necesario y el diluyente llquido primero debe volverse isotonico con suficiente solucion salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente apropiadas para la administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. En conexion con esto, un medio acuoso esteril que puede ser utilizado sera conocido para aquellos expertos en el arte a la luz de la presente divulgacion. Por ejemplo, una dosificacion puede ser disuelta en 1 ml de solucion isotonica de NaCl y puede ser agregada a 1000 ml de fluido para hipodermoclisis o inyectado en el sitio de infusion propuesto, (vease por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, paginas 1035-1038 y 1570-1580). Alguna variation en la dosificacion ocurrira necesariamente dependiendo de la condition del sujeto que esta siendo tratado. Ademas, para la administracion en humanos, las preparaciones cumpliran por supuesto preferiblemente con esterilidad, pirogenicidad, y los estandares generales de seguridad y pureza requeridos por la Oficina de Estandares Biologicos de la FDA.
Las composiciones reveladas aqul pueden ser formuladas en una forma neutra o de sal. Sales farmaceuticamente aceptables ilustrativas incluyen las sales de adicion acida (formadas con los grupos amino libres de la protelna) y las cuales son formadas con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorhldrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien pueden ser derivadas de bases inorganicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio, o hidroxidos ferricos, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procalna y similares. Tras la formulation, las soluciones seran administradas de una manera compatible con la formulation de la dosificacion y en una cantidad que sea terapeuticamente efectiva.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmaceuticas pueden ser administradas por aerosoles intranasales, por inhalation, y/u otros vehlculos de administracion por aerosol. Metodos para administrar genes, acidos nucleicos, y composiciones de peptidos directamente a los pulmones mediante aspersores nasales por aerosol han sido descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos 5,756,353 y Patente de los Estados Unidos 5,804,212. De forma similar, la administracion de farmacos utilizando resinas de micropartlcula intranasales (Takenaga et al., J Controlled Release 1998 Mar 2;52(1-2):81-7) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (Patente U. S. 5,725,871) tambien es bien conocida en las artes farmaceuticas. De forma similar, la administracion transmucosa ilustrativa de farmacos en la forma de una matriz de soporte de politetrafluoroeteileno se describe en la Patente de los Estados Unidos 5,780,045.
En ciertas realizaciones, se usan liposomas, nanocapsulas, micropartlculas, partlculas de llpidos, veslculas, y similares, para la introduction de las composiciones aqul descritas en organismos/celulas de huesped adecuadas. En particular, las composiciones aqul descritas pueden ser formuladas para administracion encapsulada en una partlcula de llpido, un liposoma, una veslcula, una nanoesfera, o una nanopartlcula o similares. Alternativamente, las composiciones descritas aqul pueden ser enlazadas, tanto covalentemente como no covalentemente, a la superficie de tales vehlculos transportadores.
La formation y uso de preparaciones de liposoma y tipo liposoma como potenciales vehlculos de farmacos es generalmente conocida para aquellos con experiencia en el arte (vease por ejemplo, Lasic, Trends Biotechnol 1998 Jul;16(7):307-21; Takakura, Nippon Rinsho 1998 Mar;56(3):691-5; Chandran et al., Indian J Exp Biol. 1997 Aug;35(8):801-9; Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995;12(2-3):233-61; Patente de los Estados Unidos 5,567,434; Patente de los Estados Unidos 5,552,157; Patente de los Estados Unidos 5,565,213; Patente de los Estados Unidos 5,738,868 y Patente de los Estados Unidos 5,795,587).
Los liposomas han sido usados con exito con un cierto numero de tipos de celulas que son normalmente diflciles de transfectar por otros procedimientos, incluyendo suspensiones de celulas T, cultivos primarios de hepatocitos y celulas PC 12 (Renneisen et al., J Biol Chem. 1990 Sep 25;265(27):16337-42; Muller et al., DNA Cell Biol. 1990 Apr;9(3):221-9). Adicionalmente, los liposomas estan libres de las restricciones de la longitud de ADN que son tlpicas en los sistemas de administracion con base viral. Los liposomas han sido usados efectivamente para introducir genes, diversos farmacos, agentes radioterapeuticos, enzimas, virus, factores de transcription, efectores alostericos y similares, a una variedad de llneas celulares cultivadas y animales. Adicionalmente, el uso de liposomas no parece estar asociado con respuestas autoinmunes o toxicidad inaceptable despues de la administracion sistemica.
En ciertas realizaciones, los liposomas son formados de fosfollpidos que son dispersados en un medio acuoso y forman espontaneamente veslculas de doble capa multilamelares concentricas (tambien llamadas veslculas multilamelares (MLVs).
Alternativamente, tambien son descritas aqul formulaciones de nanocapsulas farmaceuticamente aceptables de las composiciones descritas aqul. Las nanocapsulas pueden generalmente atrapar compuestos de una forma estable y reproducible (vease, por ejemplo, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev Ind Pharm. 1998 Dec;24(12):1113-28). Para evitar efectos secundarios debido a una sobrecarga intracelular polimerica, tales partlculas ultrafinas (con tamano de aproximadamente 0.1 pm) pueden ser disenadas usando pollmeros que son capaces de ser degradados in vivo. Tales partlculas pueden ser hechas como se describe, por ejemplo, por Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier
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Syst. 1988;5(1):1-20; zur Muhlen et al., Eur J Pharm Biopharm. 1998 Mar;45(2):149-55; Zambaux et al. J Controlled Release. 1998 Jan 2;50(1-3):31-40; y la Patente de los Estados Unidos 5,145,684.
Terapias contra el cancer
Metodologla inmunologicas para terapias contra el cancer se basan en el reconocimiento de que las celulas cancerlgenas pueden usualmente evadir las defensas del cuerpo contra celulas y moleculas aberrantes y extranas, y que estas defensas pueden ser estimuladas terapeuticamente para recuperar el terreno perdido, por ejemplo, paginas 623-648 en Klein, Immunology (Wiley-Interscience, New York, 1982). Numerosas observaciones recientes de que varios efectores inmunes pueden inhibir directa o indirectamente el crecimiento de tumores ha llevado a un renovado interes en esta metodologla de terapia contra el cancer, por ejemplo, Jager, et al., Oncology 2001;60(1):1- 7; Renner, et al., Ann Hematol 2000 Dec;79(12):651-9.
Cuatro tipos de celula basicos cuyas funciones han sido asociadas con inmunidad celular antitumoral y la eliminacion de celulas tumorales del cuerpo son: i) linfocitos B los cuales secretan inmunoglobulinas al plasma sangulneo para identificar y marcar las celulas invasoras no propias; ii) monocitos los cuales secretan las protelnas de complemento que son responsables por romper o procesar las celulas invasoras objetivo cubiertas por inmunoglobulina; iii) los asesinos naturales, linfocitos que tienen dos mecanismos para la destruccion de celulas tumorales, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y matanza natural; y iv) linfocitos T que procesan receptores antlgeno especlficos y tienen la capacidad de reconocer una celula tumoral que lleve moleculas marcadoras complementarias (Schreiber, H., 1989, in Fundamental Immunology (ed). W. E. Paul, pp. 923-955).
La inmunoterapia contra el cancer generalmente se enfoca en inducir respuestas humorales inmunes, respuestas celulares inmunes, o ambas. Ademas, esta bien establecido que la induccion de celulas ayudantes CD4+T es necesaria para inducir secundariamente anticuerpos o celulas citotoxicas CD8+T. Antlgenos de polipeptido que son selectivos o idealmente especlficos para celulas cancerlgenas ofrecen una metodologla poderosa para inducir respuestas inmunes contra el cancer.
Las composiciones farmaceuticas descritas aqul pueden ser usadas para estimular una respuesta inmune contra el cancer. Dentro de tales metodos, las composiciones farmaceuticas descritas aqul son administradas a un paciente, tlpicamente un animal de sangre caliente, preferiblemente un humano. Un paciente puede o puede no estar afligido por cancer. Las composiciones farmaceuticas y vacunas pueden ser administradas antes de o despues de la extirpacion quirurgica de tumores primarios y/o tratamiento tal como la administracion de radioterapia o farmacos quimioterapeuticos convencionales. Como se discute arriba, la administracion de las composiciones farmaceuticas puede ser realizada por cualquier metodo apropiado, incluyendo la administracion por ruta intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutanea, intranasal, intradermica, anal, vaginal, topica y oral.
Dentro de ciertas realizaciones, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia activa, en la cual el tratamiento depende en la estimulacion in vivo del sistema inmune endogeno del huesped para reaccionar contra tumores con la administracion de agentes modificadores de la respuesta inmune (tales como polipeptidos y polinucleotidos como los que se proveen aqul).
Las rutas y frecuencia de administracion de las composiciones terapeuticas descritas aqul, como tambien la dosificacion, variaran de un individuo a otro, y pueden ser facilmente establecidas usando tecnicas estandar. En general, las composiciones farmaceuticas y vacunas puede ser administradas por inyeccion (por ejemplo, intracutanea, intramuscular, intravenosa o subcutanea), intranasal (por ejemplo, por aspiracion) u oralmente. Preferiblemente, entre 1 y 10 dosificaciones pueden ser administradas en un periodo de 52 semanas. Preferiblemente, se administran 6 dosificaciones, a intervalos de 1 mes, y pueden ser administrados refuerzos de vacunaciones periodicamente a partir de entonces. Protocolos alternativos pueden ser apropiados para pacientes individuales. Una dosificacion adecuada es una cantidad de un compuesto que, cuando es administrada como se describe arriba, es capaz de promover una respuesta inmune antitumoral, y esta por lo menos 10-50% por encima del nivel basal (es decir, sin tratamiento). Tal respuesta puede ser monitorizada midiendo los anticuerpos antitumorales en un paciente o por la generacion dependiente de vacunacion de celulas citollticas efectoras capaces de matar las celulas tumorales del paciente in vitro. Tales vacunas tambien deben ser capaces de causar una respuesta inmune que conlleva un resultado cllnico mejorado (por ejemplo, remisiones mas frecuentes, supervivencia completa, parcial o mas larga libre de enfermedad) en pacientes vacunados en comparacion con pacientes no vacunados. En general, para composiciones farmaceuticas y vacunas que comprenden uno o mas polipeptidos, la cantidad de cada polipeptido presente en una dosificacion varla desde aproximadamente 25 mg a 5mg por kg del huesped. Tamanos de dosis adecuados variaran con el tamano del paciente, pero tlpicamente oscilan desde aproximadamente 0.1 mL a aproximadamente 5 mL.
En general, una dosificacion y un regimen de tratamiento apropiados proveen el compuesto(s) activo en una cantidad suficiente para proveer beneficios terapeuticos y/o profilacticos. Tal respuesta puede ser monitorizada estableciendo un resultado cllnico mejorado (por ejemplo, remisiones mas frecuentes, supervivencia completa, parcial o mas larga libre de enfermedad) en pacientes tratados en comparacion con pacientes no tratados. Aumentos en respuestas inmunes preexistentes a una protelna tumoral generalmente se correlacionan con un
resultado clinico mejorado. Tales respuestas inmunes pueden generalmente ser evaluadas usando proliferation estandar, analisis de citotoxicidad o citoquina, los cuales pueden ser realizados usando muestras obtenidas de un paciente antes y despues del tratamiento.
5 La presente invention se describe adicionalmente por medio de los siguientes Ejemplos y Ejemplos de Prueba no limitantes que son dados para propositos ilustrativos solamente.
Ejemplos
10 Ejemplo 1
Modificaciones de la cadena acilo graso primaria
Este ejemplo describe la preparation de derivados primarios de acidos grasos que tienen cadenas acilo graso 15 primarias de longitud variable, solas o en combination con cadenas variables de acido graso secundarias. Por ejemplo, los compuestos 1a-c y 2a-c, donde acidos grasos primarios de cadena corta (Ce) y cadena mediana (C10) son combinados con acidos grasos secundarios de cadena corta, mediana, o larga.
imagen5
Estos compuestos son preparados usando aglucona de serina (Ri=CO2H) bien establecida, o alternativamente, usando una unidad quimicamente mas estable e ionizable de aglucona de fosfato de serinol (Ri=CH2OP3H2). La selection de fosfato de seril/serinol sera basada en la comparacion de las actividades biologicas de los derivados de
25 serilo conocidos 3a,b con fosfatos de serinol novedosos 4a,b.
imagen6
Los derivados de los compuestos de cadena primaria modificados son sintetizados por una modificacion de un 30 metodo previamente descrito (B1 en Johnson et al., Patente de los Estados Unidos No. 6,355,251) utilizando un intermediario avanzado comun que permite la production de acidos de aciloxilo enlazados con amida y ester cerca del final de la sintesis (Esquema I). El paso inicial en la sintesis es la glicosilacion del aceptador 6 con el tetraacetato 5 conocido (preparado en 4 pasos desde la glucosamina) para dar p-glicosido 7 y la conversion de 7 a un intermediario conocido comun (CAI) 8, el cual es optimizado para R1=CO2Bn. La 4-O-acilacion selectiva y N- 35 desproteccion/acilacion resulta en el derivado de hexaacilo 9, el cual es convertido en 3-4 pasos a 1a-c o 2a-c a traves de fosforilacion y desbloqueo.
5
10
15
20
25
30
imagen7
2-4 pasos
IHTroc
,OAc
Arcr-v^—\ 'o-Y 6
OTBS
NHTroc
NHTroc NHTrOC
NMTroc NHTroc
SFyKzO
R^CHjOBno COjBn
ntermediario Avanzado Comun
Troc = COzCM^CCh
TBS = SICMe)2Btf
3 pasos
3 o 4pasos
la-c
2A-C
1 R2=Cfr Cj().Cj4
' n n=l or S
acilo
NO SON COMPUESTOS DE LA INVENCION
Esquema I
Los acidos requisito (R)-3-n-alcanoiloxialcanoicos son preparados de acuerdo a Keegan et al., Tetrahedron: Asymmetry; 7(12):3559-3564, 1996, empezando con los esteres de 3-oxo metilo apropiados. La alta pureza qulmica y diastereomerica de los productos 1 y 2 es lograda por cromatografla de fase normal o gel de sllice o, alternativamente, a traves de cromatografla en celulosa o cromatografla de particion llquido-llquido en gel Sephadex LH-20. La pureza de las sales de trietilamonio aisladas es establecida por espectroscopla (IR, 1H y 13C RMN) y medios flsicos (analisis de combustion, FAB-MS), como tambien por HPLC.
Ejemplo 2
Compuestos de Glicilo y fosfonooxietilo (PE)
El ejemplo describe la slntesis de los compuestos de glicilo 11a,b y compuestos de fosfonooxietilo (PE) 12a,b, los
imagen8
Estos compuestos son mas facilmente preparados por una slntesis mas convergente que la que se describe en el Esquema I, en el cual un donante comun glicosilo C6 o C10 13 es acoplado con una unidad aceptador N-acilada (o, alternativamente, N-Troc protegida- no mostrada) 14 o 15 en la presencia de un ion de plata para dar b-glicosidos 16 (Esquema II). El aceptador de glicina 14 es preparado de acuerdo con Bulusu et a., J Med Chem; 35(19):3463-3469, 1992 de etanolamina y bromoacetato de bencilo (o t-butilo) seguido por N-acilacion o proteccion. El fosfato15 es preparado por monofosforilacion de dietanolamina N-acilada (o protegida). N-desproteccion/acilacion o N,N- diacilacion en caso de aglucona Troc-protegida (Jiang et al., Tetrahedron; 58(43):8833-8842, 2002) de los b- glicosidos 16 y se espera que la ruptura de los grupos fenilo y otros grupos protectores de la derivada hexaacilada resultante 17 produzca los compuestos deseados 11a,b y 12a,b, los cuales son aislados y caracterizados como sus sales trietilamonio despues de la purificacion cromatografica en sllice o gel LH-20 o celulosa DEAE.
5
10
15
20
25
30
El Esquema II se muestra abajo:
imagen9
Esquema II Ejemplo 3
Llpidos de eter secundarios
Este ejemplo describe la slntesis de derivados de acido (R)-3-alquiloxitetradecanoico (18a,b) los cuales son resistentes a metabolismo no favorable y/o hidrolisis acuosa. Para sintetizar los compuestos 18a,b los analogos de llpidos de eter de los compuestos de acidos grasos secundarios 3a,b o los fosfatos de serinol correspondientes 5a,b deben hacerse inicialmente. Como se muestra retrosinteticamente en el Esquema III, la slntesis de las moleculas objetivo 18a,b puede ser lograda sustituyendo el acido (R)-3-hexiloxitetradecanoico o el acido (R)-3- deciloxitetradecanoico por los aciloxiacidos correspondientes empezando con la 3-O-acilacion selectiva del intermediario comun avanzado 8 en el Esquema I y procediendo a traves del intermedio 9 (R2=C6 o C10 alquilo, n=9). Los alquiloxiacidos requisito 19 son sintetizados a partir de acido (R)-3-hidroxitetradecanoico o su ester de fenacilo, intermedios en las sintesis aciloxiacidas, por metodos conocidos con un rendimiento total >50% (Keegan et al., Tetrahedron: Asymmetry; 7(12):3559-3564, 1996, Watanabe et al., Carbohydr Res; 332(3):257-277, 2001, Jiang., Bioorg Med Chem Lett; 12(16):2193-2196, 2002, Christ et al., Patente de los Estados Unidos No: 5,530,113. 1996).
imagen10
Ejemplo 4
Lipidos de eter primarios y secundarios
5
10
15
20
25
Este ejemplo describe los compuestos (20a,b) que contienen un llpido de eter primario en la posicion de azucar C-3 como tambien tres llpidos de eter secundarios. Estos compuestos son sintetizados por alquilacion de acetinida 21, un intermedio en la slntesis del donante glicosilo 13 (Esquema II), con sulfonato 22, el cual a su vez es generado en un paso a partir del alcohol precursor de 19, para producir dieter 23 (Esquema IV). La funcionalizacion 4,6 y activacion anomerica provee cloruro de glicosilo 24, el cual es entonces procesado como en el Esquema II usando los alquiloxiacidos correspondientes en los pasos de N-acilacion. En un esquema alternativo, el derivado de 2- azido42 o 2-trifluoroacetamida45 puede ser utilizado en el paso de 3-O-alquilacion.
imagen11
Ejemplo 5
Compuestos modificados C-6
Este ejemplo describe los compuestos que tienen un 6-hidroxilo bloqueado. En este ejemplo un eter de metilo o un grupo fluoro es usado en conjuncion con compuestos serilo o serinol de fosfato 25a,b y 26a,b.
imagen12
Los compuestos son preparados de diol 27 como se muestra en el Esquema V. El intermedio 27, obtenido en dos pasos de acetonida 21, es funcionalizado en la posicion 6 por metodos conocidos (Christ et al., Patente US No: 5,530,113, 1996; Watanabe et al., Carbohydr Res; 333(3):203-231, 2001) para producir alcohol 28. La conversion de 28 a los cloruros 29 en dos pasos y la elaboracion de acuerdo al Esquema II provee las moleculas objetivo 25a,b y 26a,b. Compuestos con enlaces de eter primarios y/o secundarios como se describen en el Ejemplo 4 arriba pueden ser modificados como se describe en este ejemplo para adicionalmente proteger las moleculas contra la degradacion qulmica y enzimatica.
5
imagen13
Se entiende que los anteriores ejemplos son simplemente ilustrativos de la presente invencion.

Claims (6)

  1. 5
    10
    15
    20
    Reivindicaciones
    1. Un compuesto que tiene la formula:
    imagen1
    donde n es 1 o 5 y R6 es COOH o CH2OP3H2.
  2. 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 donde n es 1.
  3. 3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 donde n es 5.
  4. 4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 3 donde R6 = COOH.
  5. 5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 2 donde R6 = COOH.
  6. 6. Un compuesto que tiene la formula:
    imagen2
    donde n es 1 o 5 y R6 es COOH o CH2OPO3.
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