PL210514B1

PL210514B1 - Preparat farmaceutyczny zawierający modyfikator odpowiedzi immunologicznej

Info

Publication number: PL210514B1
Application number: PL373303A
Authority: PL
Inventors: Raymond D. Skwierczynski; Terri F. Busch; Amy L. Gust-Heiting; Mary T. Fretland; Matthew T. Scholz
Original assignee: 3M Innovative Properties Co
Priority date: 2001-11-29
Filing date: 2002-11-27
Publication date: 2012-01-31
Also published as: RU2004116474A; PL373303A1; BR0214566A; US20030199538A1; DK1450804T3; HRP20040474B1; US20080275077A1; MXPA04005023A; EP1450804B1; CA2467828C; ATE406164T1; IL161786A; KR20040062974A; CN100473384C; IL161786A0; ES2312659T3; RU2327460C2; JP4447914B2; US7968562B2; AU2002363954B2

Abstract

Preparaty farmaceutyczne zawierające modyfikator odpowiedzi immunologicznej (IRM) wybrany z grupy obejmującej imidazochinolinoaminy, imidazotetrahydrochinolinoaminy, imidazopirydynoaminy, 6,7-sprzężone cykloalkiloimidazopirydynoaminy, 1,2-zmostkowane imidazochinolinoaminy, tiazolo-chinolinoaminy, oksazolo-chinolinoaminy, tiazolo-pirydynoaminy, oksazolo-pirydynoaminy, imidazonaftyrydyno-aminy, tetrahydroimidazonaftyrydynoaminy i tiazolo-naftyrydynoaminy; kwas tłuszczowy oraz hydrofobowy, aprotyczny składnik mieszalny z kwasem tłuszczowym są przydatne do leczenia schorzeń skórnych. Opisano nowe preparaty do stosowania miejscowo. W jednym przykładzie wykonania, preparaty miejscowe nadają się korzystnie do leczenia aktynowego rogowacenia, blizn chirurgicznych, raka podstawnokomórkowego, atopowego zapalenia skóry oraz brodawek.

Description

Przedmiotem wynalazku są preparaty farmaceutyczne zawierające modyfikator odpowiedzi immunologicznej (IRM) związek 2-metylo-1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]-naftyrydyno-4-aminę lub jego farmaceutycznie akceptowalną sól.

Preparaty przeznaczone są do stosowania miejscowo na skórę ssaka do leczenia schorzeń skóry.

Wiele imidazochinolinoamin, imidazopirydynoamin, 6,7-sprzężonych cykloalkiloimidazopirydynoamin, 1,2-zmostkowanych imidazochinolinoamin, tiazolochinolinoamin, oksazolochinolinoamin, tiazolopirydynoamin, oksazolopirydynoamin, imidazonaftyrydynoamin, imidazotetrahydronaftyrydynoamin i tiazolonaftyrydynoamin wykazywało silną aktywność immunostymulującą, przeciwwirusową i przeciwnowotworową (w tym przeciwrakową) i wykazano ich użyteczność, jako środków wspomagających do szczepionek. Związki te określane są razem jako związki „IRM” (modyfikator odpowiedzi immunologicznej immune response modifier). Jeden z tych związków IRM, znany jako imikwimod (imiquimod), został wprowadzony do obrotu w postaci preparatu miejscowego, Aldara™, do leczenia brodawek odbytowo-płciowych towarzyszących ludzkiemu wirusowi papilloma.

Mechanizm przeciwwirusowej i przeciwnowotworowej aktywności związków IRM wydaje się być słuszny w części dotyczącej wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej przez indukcję wielu ważnych cytokin (np. interferonów, interleukin, czynnika martwicy nowotworu, itd.). Wykazano, że związki te stymulują szybkie uwalnianie pewnych cytokin pochodnych monocytu/makrofaga i są również zdolne do stymulowania limfocytów B do wytwarzania przeciwciał odgrywających ważną rolę dla przeciwwirusowej i przeciwnowotworowej aktywności związków IRM. Jedną z dominujących immunostymulujących odpowiedzi na związki jest indukcja wytwarzania interferonu (IFN)-a, który uważa się za bardzo ważny w obserwowanej ostrej aktywności przeciwwirusowej i przeciwnowotworowej. Ponadto, zwiększenie ilości innych cytokin takich jak, na przykład, czynnika martwicy nowotworu (TNF), Interleukiny-1 (IL-1) i IL-6 także przynosi potencjalną korzyść i uważa się, że przyczynia się do przeciwwirusowych i przeciwnowotworowych właściwości tych związków.

Cholet J.L. et al. (Pharmaceutical Deveopment and Technology, vol. 4, no. 1, 1999, str.35-43) opisuje preparat miejscowy imikwimodu (imiquimod, ang.), nowy modyfikator odpowiedzi immunologicznej, by spowodować lokalne wytwarzanie cytokin przy leczeniu brodawek genitaliów zewnętrznych i odbytu. Badania wybranych surfaktantów, środków konserwujących i środków zwiększających lepkość do utworzenia kremu olej-w-wodzie wykazały, że kwasy tłuszczowe są korzystnym rozpuszczalnikiem dla miejscowo działających preparatów imikwimodu i wybrano kwas izostearynowy (ISA).

WO 00/40228 A2 ujawnia związki modyfikatory odpowiedzi immunologicznej (IRM) - imidazochinolinoamin, imidazopirydynoamin, 6,7-sprzężonych cykloalkiloimidazopirydynoamin, 1,2 zmostkowanych imidazochinolinoamin, tiazolochinolinoamin, oksazolochinolinoamin, tiazolopirydynoamin, oksazolopirydynoamin, imidazonaftyrydynoamin i tetrahydroimidazonaftyrydynoamin jako korzystnych w leczeniu stanów wokół i poniżej zmian śluzówki poprzez podanie terapeutycznie skutecznej dawki tych związków na powierzchnię.

Chociaż pewne korzystne skutki związków IRM są znane, możliwość uzyskania korzyści terapeutycznej przez stosowanie miejscowo związku IRM do leczenia poszczególnego schorzenia w konkretnym miejscu może zależeć od wielu czynników. Czynniki te obejmują podrażnienie skóry, na którą nanosi się preparat, spłukiwanie preparatu, nierozpuszczalność i/lub degradację związku IRM w preparacie, niestabilność fizyczną preparatu (np. rozdzielenie składników, zagęszczanie, wytrącanie /skupianie składnika czynnego, itp.), słabej przenikalności i niepożądanego dostarczania układowego podawanego miejscowo związku IRM.

Odpowiednio, istnieje ciągłe zapotrzebowanie na nowe sposoby i preparaty z tej klasy związków zapewniające największą korzyść terapeutyczną.

Przedmiotem wynalazku jest preparat farmaceutyczny zawierający modyfikator odpowiedzi immunologicznej i kwas tłuszczowy, który jako modyfikator odpowiedzi immunologicznej (IRM) zawiera 2-metylo-1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c] [1,5]-naftyrydyno-4-aminę lub jej farmaceutycznie akceptowalną sól oraz zawiera także hydrofobowy, aprotyczny składnik mieszający się wzajemnie z kwasem tłuszczowym i zawierający grupę węglowodorową o 7 lub więcej atomach węgla i dodatkowo zawiera środek hydrofilowy zwiększający lepkość wybrany spośród eterów celulozy i karbomerów. Korzystnie środek hydrofilowy zwiększający lepkość obejmuje karbomer. Preparat według wynalazku zawiera dodatkowo układ konserwujący i emulgator.

PL 210 514 B1

Korzystnie preparat według wynalazku zawiera:

(a) 0,001 do 5% wagowych 2-metylo-1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c] [1,5]naftyrydyno-4-aminy lub jej farmaceutycznie dopuszczalną sól, (b) 0,05 do 40% wagowo kwasu izostearynowego, (c) 1 do 30% wagowo hydrofobowego składnika aprotycznego, (d) 0,01 do 30% wagowo układu konserwującego.

Korzystnie według wynalazku preparat zawiera:

(a) 0,001 do 5% wagowych 2-metylo-1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftyrydyno-4-aminy lub jej farmaceutycznie akceptowalną sól, (b) 0,05 do 30% wagowo kwasu izostearynowego, (c) 1 do 30% wagowo hydrofobowego składnika p. m 303 aprotycznego, (d) 0,5 do 10% wagowo emulgatora, (e) 0,01 do 30% wagowo układu konserwującego i (f) 0,1 do 10% karbomeru.

Korzystnie preparat według wynalazku zawiera:

(a) 0,03 do 3% wagowo 2-metylo-1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo-[4,5-c][1,5]naftyrydyno-4-aminy lub jej farmaceutycznie dopuszczalną sól, (b) 3 do 25% wagowo kwasu izostearynowego, (c) 3 do 15% wagowo hydrofobowego składnika aprotycznego, (d) 0,75 do 3,5% wagowo emulgatora, (e) 0,1 do 25% wagowo układu konserwującego i (f) 0,5 do 5% wagowo karbomeru.

Hydrofobowy, aprotyczny składnik preparatu ma równowagę hydrofobowo lipofilową o wartości poniżej 2 natomiast pKa ma większe niż 14,2.

Współczynnik hydrofobowego, aprotycznego składnika do kwasu tłuszczowego wynosi 0,025:1 do 600:1 a połączony procent wagowy hydrofobowego, aprotycznego składnika i kwasu tłuszczowego wynosi 2 do 50. Kwas tłuszczowy korzystnie stanowi kwas izostearynowy. Hydrofobowy, aprotyczny składnik jest wybrany spośród grupy obejmującej aprotyczne estry kwasów tłuszczowych, węglowodory o 8 lub więcej atomach węgla i woski. Aprotycznym estrem kwasu tłuszczowego jest mirystynian izopropylu, palmitynian izopropylu, dimer dilinoleinian diizopropylu, trigliceryd kaprylowy/kaprynowy, wosk estrów cetylowych lub ich kombinacje.

Układ konserwujący według wynalazku zawiera środek zwiększający rozpuszczalność konserwanta, który obejmuje eter monoetylowy glikolu dietylenowego, glikol propylenowy lub ich kombinację.

Preparat, zawierający modyfikator odpowiedzi immunologicznej wybrany spośród grupy obejmującej imidazonaftyrydynoaminę, imidazotetrahydronaftyrydynoaminę i tiazolonaftyrydynoaminę, kwas tłuszczowy, hydrofobowy, aprotyczny składnik mieszający się wzajemnie z kwasem tłuszczowym i zawierający grupę węglowodorową o 7 lub więcej atomach węgla i dodatkowo zawierający jeden lub więcej układów konserwanta, emulgator i wodę może być podawany na skórę jako lek na schorzenia skórne.

Przykładowe schorzenie skórne obejmuje rogowacenie słoneczne, blizny chirurgiczne, rak podstawnokomórkowy, atopowe zapalenie skóry i brodawki.

Związki modyfikujące odpowiedź immunologiczną, sposoby ich wytwarzania, sposoby ich stosowania i kompozycje je zawierające opisano w US 6,194,425.

Związek IRM 2-metylo-1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]-naftyrydyno-4-amina według wynalazku ma o wzór X:

PL 210 514 B1

Preparaty miejscowe według wynalazku otrzymuje się stosując formę wolnej zasady związku IRM.

Ilość związku IRM, która będzie terapeutycznie skuteczna w specyficznej sytuacji będzie zależała od takich czynników jak aktywność poszczególnego związku, reżim dawkowania, miejsce podawania, poszczególny preparat i leczone schorzenie. Ogólnie, nie jest praktyczne określanie dokładnych ilości do podawania. Jednakże, znawcy z dziedziny potrafią określić odpowiednie terapeutycznie skuteczne ilości w oparciu o porady tutaj podane, informacje dostępne w dziedzinie dotyczące powyższych związków i rutynowe badania. Termin „terapeutycznie skuteczna ilość” oznacza ilość związku wystarczającą do wywołania skutku terapeutycznego, takiego jak indukcja cytokin, inhibicja odpowiedzi immunologicznej TH2, aktywności przeciwwirusowej lub przeciwnowotworowej, redukcja lub eliminacja bliznowacenia pochirurgicznego lub redukcja lub wchłonięcie rogowacenia słonecznego lub uszkodzeń poprzedzających rogowacenie słoneczne.

Ogólnie, ilość związku IRM obecnego w preparacie miejscowym według wynalazku będzie ilością skuteczną do leczenia docelowego schorzenia, zapobiegania nawrotowi schorzenia lub wspomagania odporności wobec schorzenia. Ilość lub stężenie związku IRM może zmieniać się od 0,001% do 10% wagowo w oparciu o całkowitą wagę preparatu, jak na przykład, od 0,03% do 5,0% wagowo, lub od 0,1 do 1,0% wagowo. W pewnych przykładach wykonania ilość związku IRM wynosi co najmniej 0,003% wagowo, jak na przykład, co najmniej 0,005%, co najmniej 0,01%, co najmniej 0,03%, co najmniej 0,10%, co najmniej 0,30% i co najmniej 1,0%. W innych przykładach wykonania, ilość związku IRM wynosi najwyżej 5,0% wagowo, jak na przykład najwyżej 3,0%, i najwyżej 1,0%.

Preparaty miejscowe zawierają dodatkowo kwas tłuszczowy. Stosowany tutaj termin „kwas tłuszczowy” oznacza kwas karboksylowy, nasycony lub nienasycony, zawierający 6 do 28 atomów węgla, jak na przykład, od 10 do 22 atomów węgla. Przykłady takich kwasów tłuszczowych obejmują kwas izostearynowy, kwas oleinowy i liniowe lub rozgałęzione łańcuchowe kwasy karboksylowe od 6 do 18 atomów węgla. Kwasy tłuszczowe mogą być obecne w preparacie w ilości wystarczającej do rozpuszczenia związku IRM. W jednym przykładzie ilość kwasu tłuszczowego może się zmieniać od 0,05%-40% wagowo względem całkowitej masy preparatu, na przykład, od 1%-30%, od 3%-15% i od 5%-10%.

W pewnych przykładach, ilość kwasu tłuszczowego wynosi co najmniej 3,0% wagowo, jak na przykład, co najmniej 5,0%, co najmniej 10,0%, i co najmniej 25%.

Kwas tłuszczowy, jako składnik preparatu może obejmować jeden kwas tłuszczowy lub więcej.

Preparaty miejscowe według wynalazku dodatkowo zawierają co najmniej jeden hydrofobowy, aprotyczny składnik mieszający się wzajemnie z kwasem tłuszczowym i zawierający grupę węglowodorową o 7 lub więcej atomach węgla.

Przez „hydrofobowy” należy rozumieć, że składnik jest zasadniczo nierozpuszczalny w wodzie, tj. niemieszający się z wodą i niezdolny do tworzenia micelli w wodzie oraz nie zawiera polioksyetylenu lub grup soli kwasowej. Korzystnie hydrofobowy, aprotyczny składnik posiada równowagę hydrofobowe lipofilową (HLB) o wartości poniżej 2. HLB składnika można określić jak opisano na przykład w Attwood, D., Florence, A. T., Surfactant Systems: Their Chemistry, Pharmacy, and Biology. New York: Chapman & Hall, 471-473, 1983.

Przez „aprotyczny” należy rozumieć, że składnik nie może oddać protonu do IRM i nie zawiera grup takich jak karboksylową, hydroksylowa, pierwszorzędowa i drugorzędowa aminowa, pierwszorzędowa i drugorzędowa amidowa lub czwartorzędowa grupa amoniowa. Korzystnie, składnik ten ma

PL 210 514 B1 pKa co najmniej 14,2 i zasadniczo nie rozpuszcza się lub nie tworzy kompleksu takiego jak para kwaszasada lub kompleksu lub kompleksu wiązania wodorowego ze związkiem IRM. Przez „zasadniczo nie” należy rozumieć, że współczynnik rozpuszczalności związku IRM w hydrofilowym, aprotycznym składniku do tej w kwasie izostearynowym jest mniejszy niż 1:40.

Preparaty do stosowania na skórę lub miejscowo korzystnie posiadają pewną minimalną ilość fazy olejowej zapewniającej takie właściwości jak smarowalność, odczuwanie na skórze, teksturę, itd. Jednakże, jeśli wszystkie składniki fazy olejowej rozpuszczają IRM, wówczas stopień nasycenia IRM w preparacie bę dzie malał , utrudniają c dostarczenie IRM z preparatu do skóry. Dodatek hydrofobowego, aprotycznego składnika może zwiększyć objętość fazy olejowej preparatu miejscowego do otrzymania pożądanych właściwości takich jak smarowalność i odczuwanie, równocześnie nieznacznie modyfikując stopień nasycenia lub aktywność termodynamiczną IRM. Na przykład, ilość kwasu tłuszczowego, który rozpuszcza IRM można zredukować w celu zwiększenia stopnia nasycenia IRM, równocześnie utrzymując wystarczającą objętość fazy olejowej przy pomocy dodatku hydrofobowego, aprotycznego składnika, który nie kompensuje zwiększonego nasycenia IRM. Zatem, preparat miejscowy według wynalazku może poprawiać zarówno właściwości fizyczne, jak i wymogi dostarczania leku. Stopień nasycenia i aktywność termodynamiczna IRM w tych preparatach jest równa stężeniu IRM w fazie olejowej podzielonemu przez stężenie nasycenia IRM w fazie olejowej. Gdy preparaty miejscowe według wynalazku zawierają nasycony IRM aktywność termodynamiczna lub stopień nasycenia jest jednością, a gdy częściowo nasycony aktywność termodynamiczna lub stopień nasycenia jest poniżej jedności.

Ilość hydrofobowego, aprotycznego składnika obecnego w preparacie według wynalazku może wynosić od 1% do 30% wagowo w oparciu o całkowitą masę preparatu, na przykład, od 3% do 15% wagowo, i od 5 do 10% wagowo. W pewnych przykładach wykonania, ilość hydrofobowego, aprotycznego składnika wynosi co najmniej 3,0% wagowo, na przykład, co najmniej 5,0%, i co najmniej 10,0%. Stosunek wagowy hydrofobowego, aprotycznego składnika do kwasu tłuszczowego może wynosić 0,025:1 do 600:1, na przykład, 0,5:1 do 50:1, i 2:1 do 30:1. Połączona ilość (procent wagowy całkowitej masy preparatu miejscowego) hydrofobowego, aprotycznego składnika i kwasu tłuszczowego może wynosić 2% do 50% wagowo, na przykład 2% do 30%, 5% do 30%, 5% do 20%, i 10% do 20%.

Przykłady użytecznych hydrofobowych, aprotycznych składników obejmują estry kwasów tłuszczowych, na przykład, mirystynian izopropylu, palmitynian izopropylu, dimer dilinoleinian diizopropylu, triglicerydy, na przykład, trigliceryd kaprylowy/kaprynowy, wosk estrów cetylowych, węglowodory o 8 lub więcej atomach węgla, na przykład, lekki olej mineralny, biała parafina mikrokrystaliczna i woski, na przykład, wosk pszczeli.

W pewnych przykł adach aprotycznym estrem kwasu tł uszczowego jest mirystynian izopropylu, palmitynian izopropylu, dimer dilinoleinian diizopropylu, trigliceryd kaprylowy/kaprynowy, wosk estrów cetylowych lub ich kombinacje.

Hydrofobowy, aprotyczny składnik jest wybrany spośród mirystynianu izopropylu, palmitynianu izopropylu, triglycerydu kaprylowego/kaprynowego i dimeru dilinoleinian diizopropylu.

Preparaty według wynalazku mogą także zawierać hydrofobowy środek zwiększający lepkość. Przykłady odpowiednich środków zwiększających lepkość obejmują etery celulozy takie jak hydroksypropylometyloceluloza, hydroksyetyloceluloza, hydroksypropyloceluloza i karboksymetyloceluloza, żywice polisacharydowe takie jak guma ksantanowa i homopolimery i kopolimery kwasu akrylowego usieciowane z allilową sacharozą lub allilowym pentaerytriolem tak jak polimery oznaczone jako karbomery w Farmakopei Stanów Zjednoczonych. Odpowiednie karbomery obejmują, na przykład, dostępne jako Carbopol™ 934P, Carbopol 971P, Carbopol 940, Carbopol 974P, Carbopol 980, i Pemulen™ TR-1 (USP/NF Monograph; Karbomer 1342), wszystkie dostępne od Noveon, Cleveland, Ohio.

W jednym przykł adzie wykonania wynalazku, ś rodek zwię kszający lepkość jest wybrany spośród Carbopolu 974P i 980. Środek zwiększający lepkość, jeśli jest obecny, to w ilości z zakresu od 0,1% do 10% wagowo całkowitej masy preparatu, jak na przykład, od 0,5% do 5% wagowo, od 0,5% do 1,5% wagowo i od 0,7% do 3% wagowo. W pewnych przykładach, ilość środka zwiększającego lepkość wynosi co najmniej 0,5% wagowo, na przykład, co najmniej 0,6% wagowo, co najmniej 0,7% wagowo, co najmniej 0,9% wagowo, i co najmniej 1,0% wagowo.

Preparaty według wynalazku mogą dodatkowo zawierać emulgator. Odpowiednie emulgatory obejmują niejonowe środki powierzchniowo czynne, jak na przykład, polisorbat 60, monostearynian sorbitanu, poliglycerylo-4 oleinian, eter laurylowy polioksyetylenu(4), itd. W pewnych przykładach, emulgator jest wybrany spośród poloksamerów (np. Pluronic™ F68, znany także jako Poloksamer 188,

PL 210 514 B1 poll(etylenowy glikol)-blok-poli(propylenowy glikol)-blok-poli(etylenowy glikol), dostępny od BASF, Ludwigshafen. Germany) i trioleinian sorbitanu (np. Span 85 dostępny od Uniqema, New Castle, DE). Emulgator jest zasadniczo obecny w ilości 0,1% do 10% wagowo całkowitej masy preparatu, na przykład, od 0,5% do 5% wagowo, i od 0,75% do 3,5% wagowo. W pewnych przykładach ilość emugatora wynosi co najmniej 1,0% wagowo, na przykład, co najmniej 2,5%, co najmniej 3,5%, i co najmniej 5,0%.

Preparat może także zawierać, co najmniej jeden środek chelatujący. Środek chelatujący działa chelatując jony metalu, które mogą być obecne w preparacie. Odpowiednie środki chelatujące obejmują sole etylenodiaminotetraoctanu (EDTA), takie jak sól disodowa. Jeśli jest zawarty, środek chelatujący jest zasadniczo obecny w ilości od 0,001% do 0,1% wagowo, i korzystnie od 0,01% do 0,05% wagowo. W pewnych przykładach wykonania, ilość środka chelatującego wynosi co najmniej 0,005% wagowo, jak na przykład, co najmniej 0,01%, i co najmniej 0,05%.

Preparat może także zawierać układ konserwujący. Układ konserwujący składa się co najmniej z jednego konserwanta wybranego spośród metyloparabenu, etyloparabenu, propyloparabenu, fenoksyetanolu, jodopropynylo butylokarbaminianu, kwasu sorbowego, monoestru kwasu tłuszczowego glyceryny takiego jak monolaurynian glicerynolu, i monoestru kwasu tłuszczowego glikolu propylenowego takiego jak monokaprylan glikolu propylenowego. Układ konserwujący może także obejmować środek zwiększający rozpuszczalność konserwanta, który zwiększa rozpuszczalność konserwanta w fazie wodnej, przykładowo eter monoetylowy glikolu dietylenowego i glikol propylenowy i ich kombinacja. Przykładowo układ konserwujący może składać się z metyloparabenu, propyloparabenu i glikolu propylenowego. W innym przykładzie układ konserwujący może składać się z metyloparabenu, etyloparabenu i eteru monoetylowego glikolu dietylenowego. W innym przykładzie, ukł ad konserwujący moż e skł adać się z fenoksyetanolu, metyloparabenu lub metylo- i etyloparabenu i eteru monoetylowego glikolu dietylenowego. W innym przykładzie, układ konserwujący może składać się z jodopropynylo butylokarbaminianu. W innym przykładzie układ konserwujący może składać się z jodopropynylo butylokarbaminianu, eteru monoetylowego glikolu dietylenowego i monolaurynian poli(glikolu etylenowego)(4).

W innym przykładzie układ konserwujący może składać się z jodopropynylo butylokarbaminianu, jednego lub więcej spośród metyloparabenu, etyloparabenu, propyloparabenu lub fenoksyetanolu i eteru monoetylowego glikolu dietylenowego. W powyższych przykładach metyloparaben, etyloparaben i propyloparaben, każdy może być obecny w preparatach w ilości z zakresu od 0,01% do 0,5% wagowo preparatu, na przykład, od 0,05% do 0,25% wagowo, i od 0,1% do 0,2% wagowo. Jodopropynylo butylokarbaminian może być obecny w preparatach w ilości z zakresu od 0,01% do 0,1%. Fenoksyetanol może być obecny w preparatach w ilości z zakresu od 0,1% do 1%. Glikol propenylowy i eter monoetylowy glikolu dietylenowego moż e każdy być obecny w preparatach w ilości z zakresu od 1% do 30% wagowo preparatu, jak na przykład, od 5 % do 25% wagowo, i od 10% do 15% wagowo. Układ konserwujący może być obecny w preparatach w ilości z zakresu od 0,01% do 30% wagowo preparatu, na przykład, od 0,05% do 30%, od 0,1% do 25% wagowo, i od 0,2% do 15% wagowo.

W kolejnym przykładzie, metyloparaben, etyloparaben, propyloparaben, jodopropynylo butylokarbaminian i fenoksyetanol mogą być rozpuszczone w glikolu propylenowym, monolaurynianie poli(glikolu etylenowego) (4) lub eterze monoetylowym glikolu dietylenowego przed dodaniem do preparatu. Układ konserwujący można wybrać tak, że spełnia kryteria skuteczności przeciwmikrobiologicznej określonej w Farmakopei Stanów Zjednoczonych <51>.

Preparaty według wynalazku mogą dodatkowo zawierać, co najmniej jeden środek do ustalania pH. Odpowiednie środki ustalające pH obejmują zasady organiczne i zasady nieorganiczne, jak na przykład KOH, NaOH. pH preparatów do stosowania miejscowo według wynalazku mieści się w zakresie od 3,5 do 7,0. W jednym przykładzie pH preparatów miejscowych według wynalazku znajduje się w zakresie od 4,0 do 6,0, korzystnie pH wynosi 5,0. W innym przykładzie pH preparatów miejscowych według wynalazku mieści się w zakresie od 5,5 do 6,5, korzystnie pH wynosi 6,0.

Powyższe preparaty mogą być w postaci emulsji olej-w-wodzie takiej jak krem lub płyn kosmetyczny. Taka emulsja może zawierać fazę olejową zawierającą związki IRM, kwas tłuszczowy w ilości wystarczającej do rozpuszczenia związków IRM, hydrofobowy, aprotyczny składnik i zawierający fazę wodną hydrofobowy środek zwiększający lepkość, na przykład karbomer. W pewnych przykładach ilość lub stężenie IRM w fazie olejowej może wynosić co najmniej 0,01%, na przykład, co najmniej 0,02%, co najmniej 0,1%, i co najmniej 1% w odniesieniu do masy fazy olejowej. W innych przykładach ilość lub stężenie IRM w fazie olejowej może wynosić najwyżej 20%, przykładowo najwyżej 10%, i najwyżej 5% w odniesieniu do masy fazy olejowej. Emulsja może być zakonserwowana tak, że poddana testowi

PL 210 514 B1 skuteczności antymikrobiotycznej, spełnia wymagania dla kremów miejscowych pakowanych w pojemniki wielokrotnego użycia.

Preparaty według wynalazku można stosować na powierzchnię skóry ssaka. W zależności od stężenia związku IRM, kompozycji preparatu i powierzchni skóry, efekt terapeutyczny związku IRM może rozciągać się tylko na warstwy powierzchniowe skóry lub do tkanek leżących poniżej powierzchni skóry.

Innym aspektem jest leczenie schorzenia skóry obejmujące podawanie na skórę jednego z powyższych preparatów.

Stosowany tu termin „schorzenie skóry” oznacza stan zapalny, zakaźny, nowotworowy lub inne schorzenie dotyczące powierzchni skóry lub które jest w wystarczającej bliskości powierzchni skóry by oddziaływał na nie środek terapeutyczny podawany miejscowo na powierzchnię skóry. Przykłady schorzenia skóry obejmują brodawki, atopowe zapalenie skóry, rak podstawnokomórkowy, blizny chirurgiczne i rogowacenie słoneczne.

W jednym przykładzie, preparaty można podawać na powierzchnię skóry do leczenia rogowacenia słonecznego (actinic keratosis - AK). Rogowacenia słoneczne są przednowotworowymi zmianami chorobowymi biologicznie uważanymi albo za raka in situ albo łuskowate śródnaskórkowe powstawanie nowotworu. AK jest najczęstszym nowotworem naskórkowym i jest wywoływany przez promieniowanie ultrafiotetowe (UV), typowo przez światło słoneczne. Ze względu na swoją przedrakową naturę, AK może być uważany za najważniejsze ujawnienie uszkodzenia skóry wywołanego przez słońce.

W pewnych przykł adach opisane preparaty są szczególnie korzystne do podawania na skórę przez czas wystarczający do uzyskania pożądanego skutku terapeutycznego bez niepożądanego ustrojowego wchłaniania IRM.

P r z y k ł a d y

Następujące przykłady mają dalej opisać preparat IRM według wynalazku.

P r z y k ł a d y 1-7 i porównawczy przykład C1

Tablica 1 zestawia preparaty miejscowe wytworzone zgodnie z wynalazkiem, w oparciu o kryterium wagowe.

T a b l i c a 1

Składnik	Krem miejscowy (procent wagowy)
	Przykład porównawczy C1 (Placebo)	Przykład 1	Przykład 2	Przykład 3	Przykład 4	Przykład 5	Przykład 6	Przykład 7
Związek IRM 1	0,00	0,001	0,003	0,010	0,03	0,10	0,30	1,00
Kwas Izostearynowy	5,00	5,00	5,00	5,00	5,00	5,00	7,00	10,00
Mirystynian izopropylu (NF)	10,00	10,00	10, 00	10,00	10,00	10,00	8,00	5,00
Karbomer 974P (NF)	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00	1,00
Poloxamer 188 (NF)	2,50	2,50	2,50	2,50	2,50	2,50	2,50	2,50
Glikol propylenowy (USP)	15,00	15,00	15,00	15,00	15,00	15,00	15,00	15,00
Metyloparaben (NF)	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20
Propyloparaben (NF)	0,10	0,10	0,10	0,10	0,10	0,10	0,10	0,10
Edetynian Disodowy (USP)	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
Wodorotlenek sodu (NF) roztwór, 20% wag.	0,50	0,50	0,50	0,50	0,50	0,50	0,50	0,55
Oczyszczona woda (USP)	65,65	65,649	65,647	65,64	65,62	65,55	65,35	64,60

Razem	100,00	100,00	100,00	100,00	100,00	100,00	100,00	100,00

PL 210 514 B1

Preparaty zestawione w tabeli 1 wytworzono następująco:

Otrzymanie fazy olejowej: 2-metylo-1-(2-metylopropylo)-1 H-imidazo[4,5-c] [1,5]naftyrydyno-4-aminę (związek IRM 1) rozpuszczono w kwasie izostearynowym i mirystynianie izopropylu, ogrzewając w miarę potrzeby. Następnie dyspergowano Karbomer 974P w fazie olejowej.

Otrzymywanie fazy wodnej: Edetynian disodowy rozpuszczono w wodzie. Metyloparaben i propyloparaben rozpuszczono w glikolu propenylowym i roztwór następnie dodano do fazy wodnej. Wówczas do fazy wodnej dodano Poloksamer 188 i mieszano do rozpuszczenia.

Połączenie faz: Fazę olejową dodano do fazy wodnej w warunkach otaczających. Emulsję następnie homogenizowano. Po homogenizacji dodano roztwór wodorotlenku sodu (20% wagowo) i powstały krem mieszano do wygładzenia i jednorodności. Zmierzono pH kremu i przeprowadzono ustalenie pH dodatkowym roztworem wodorotlenku sodu, w miarę potrzeby, do uzyskania docelowego pH 5 w czasie procesu.

Preparaty zawierające 2-metylo-1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c] [1,5]naftyrydyno-4-aminę (Związek IRM 1) przebadano względem ich zdolności wywołania wzrostu stężeń cytokiny u szczurów po podaniu miejscowo. Badanie to przeprowadzono w celu oszacowania indukcji cytokiny po pojedynczej dawce o różnej sile i w różnych momentach czasu lub po wielokrotnym, względem pojedynczego, dawkowania związku IRM 1. Preparaty opisane powyżej testowano badając w tkankach i w surowicy stężenia TNF-α, MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) i cytokin IFN-α po podaniu leku.

We wszystkich badaniach używano pozbawionych włosów samic szczura CD (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) o wadze 200-250 gram. Zwierzęta przydzielono losowo do grup leczenia i podzielono po pięć w każdej grupie leczenia.

Szczury przyzwyczajano do kołnierzy wokół szyi przez dwa kolejne dni przed faktycznym dozowaniem. Szczury zaopatrzono w kołnierze przed dozowaniem leku, aby zapobiec przyjmowaniu leku a następnie dozowano miejscowo 50 μL aktywnego kremu lub odpowiedniego placebo na prawy bok, po czym umieszczono zwierzęta osobno, kontynuując dozowanie. W różnych momentach po dozowaniu szczury usypiano i pobierano krew przez przekłucie serca. Krwi pozwolono zakrzepnąć w temperaturze pokojowej, od skrzepu oddzielono osocze poprzez wirowanie i przechowywano je w temperaturze -20°C do analizy stężeń cytokin.

Po pobraniu krwi szczury usypiano i usuwano ich skórę. Tkanki ze strony traktowanej (w) i z boku przeciwnego (z dala) uzyskano stosując 8 mm biopsję trepanem, ważono i umieszczano w 1,8 ml kriofiolce i szybko zamrażano w ciekłym azocie. Zamrożoną próbkę tkanki następnie zawieszano w 1,0 mL pożywki RPMI (Celox, Hopkins, MN) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (Sigma, St. Louis, MO), 2 mM L-glutaminy, penicylinę/streptomycynę i 2-merkaptoetanol (kompletny RPMI) połączoną z zestawem koktailowym III inhibitora proteazy (Calbiochem, San Diego, CA). Tkankę poddano homogenizacji stosując Tissue Tearor™ (Biospec Products, Bartlesville, OK) przez około 1 minutę. Zawiesinę tkanki następnie schładzając wirowano przy 2000 rpm (obr/min) przez 10 minut do uzyskania osadu a supernatant zbierano i przechowywano w temperaturze - 20°C do analizy stężeń cytokiny.

Oznaczenia ELISA szczurzych MCP-1 zakupiono od BioSource Intl. (Camarillo, CA) a szczurze TNF-α zakupiono od BD Pharmingen (San Diego, CA) i oznaczenia przeprowadzono według instrukcji producenta. Wyniki zarówno dla TNF-α i MCP-1 wyrażono w pg/200 mg tkanki lub pg/ml osocza. Czułość TNF-α ELISA wynosiła 31,2 pg/ml i MCP-1 ELISA wynosiła 11,7 pg/ml. Stężenia IFN-α zarówno w osoczu jak i tkance skórnej określono stosując oznaczenie biologiczne mierzące hamowanie wirusowego efektu cytopatycznego wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej na szczurze komórki fibroblastu LMS-C2 jak opisano (Reiter, M. J., Testerman, T. L., Miller, R. L., Weeks, C. E., i Tomai, M. A. (1994) „Cytokine Induction in Mice by the Immunomodulator Imiquimod.” J. Leukocyte Biol. 55, 234-240). Badania te przeprowadził IIT Research Institute, Chicago IL. Wyniki dla stężeń IFN-α znormalizowano do standardowego odniesienia szczurzego IFN-α, przy czym preparaty z wynikami opisano w U/mL i znormalizowano do mg tkanki.

Dane zestawione poniżej w tablicach 2-4 pochodzą z trzech osobnych doświadczeń i ich analizę przeprowadzono w celu 1) pomiarów farmakokinetycznych w pełnym zakresie czasowym, 2) pomiarów odpowiedzi na dawkę i 3) pomiarów dawkowania wielokrotnego względem jednokrotnego.

W celu określenia kinetyki miejscowego i układowego wytwarzania cytokin po miejscowym podawaniu związku IRM 1, przeprowadzono badanie pełnoczasowe (Badanie 1 z wynikami w tablicy 2) podając szczurom miejscowo preparat kremu miejscowego z przykładu 7. Osocze i próbki tkanki zebrano w 1, 2, 4, 8, 16, 24 i 48 godzinie po podaniu. Różnorodne cytokiny (MCP-1, TNF-α i IFN-α) analizowano osobno.

Z danymi tkankowymi, z każdej godziny pomiaru, analizę prowadzono przy pomocy testu par t-Studenta (w celu wykluczenia w granicach określonej zmienności) i analizowano różnice pomiędzy

PL 210 514 B1 tkanką traktowaną i tkanką kontrolną tego samego zwierzęcia. Wartość p poniżej alfa = 0,05 wskazywała na statystycznie znaczące różnice pomiędzy traktowaną i kontrolną tkanką w danej godzinie. Dane przedstawiono w tablicy 2.

T a b l i c a 2. Stężenia cytokiny w osoczu szczura i tkance skórnej po podaniu preparatu miejscowego z przykładu 7 Przebieg pełnoczasowe ^a

Czas (godziny) po podaniu	Dawka	Stężenie cytokiny ^b
TNF-α
osocze	traktowane miejsce	miejsce kontrolne
0	nie podano	0	NA	96 ± 5
16	placebo	0	103 ± 8	71 ± 6
1	1%	6+6	318±33^c	96±13
2	1%	0	1125 ± 74 ^c	124 ± 18
4	1%	0	1120 ± 51 ^c	129 ± 11
8	1%	24 ± 16	429 ± 56 ^c	91 ± 12
16	1%	6 ± 4	231 ± 22 ^c	87 + 27
24	1%	32 ± 32	198±28^c	103 ± 13
48	1%	49 ± 49	74 ± 10	69 ± 15
		MCP-1
0	nie podano	81 ± 30	NA	44 ± 2
16	placebo	144 ± 9	144 ± 41	42 ± 3
1	1%	86 ± 29	40 ± 8	42 ± 3
2	1%	123 ± 31	234 ± 29 ^c	50 ± 4
4	1%	101 ± 28	723 ± 89 ^c	41 ± 5
8	1%	438 ± 91 ^c	1474±202^c	38 ± 3
16	1%	424 ± 96 ^c	1209± 325^c	31 ± 5
24	1%	187 ± 39	813 ± 151 ^c	39 ± 1
48	1%	141 ± 24	145 ± 48 =	36 ± 6
		IFN-α
0	nietraktowane	<200	NA	<650
16	placebo	<200	<650	<650
1	1%	<200	<650	<650
2	1%	<200	<650	<650
4	1%	<200	<650	<650
8	1%	<200	3/5>650	<650
16	1%	<200	<650	<650
24	1%	<200	<650	<650
48	1%	<200	<650	<650

^a samice szczura CD pozbawione włosów traktowano miejscowo preparatem kremu zawierającego związek 1.

^b TNF-α i MCP-1 oznaczono metodą ELISA. IFN-α zmierzono stosując oznaczenie biologiczne. Wyniki przedstawiono w pg/ml dla próbek osocza i pg/200 mg tkanki dla próbek tkanki i przedstawiają średnią dla pięciu zwierząt ± SEM.

^c Wskazania p<0,05 w porównaniu do placebo dla próbek osocza albo różnicy pomiędzy tkanką traktowaną i tkanką kontrolną tego samego zwierzęcia.

PL 210 514 B1

Badania dawki wielokrotnego dozowania przeprowadzono w celu obserwacji efektów wielokrotnego dozowania (Badanie 2 z wynikami przedstawionymi w tablicy 3). Szczurom dozowano dwa razy w tygodniu przez sześć godzin przez trzy tygodnie preparat miejscowego kremu z przykładu 5. Dla porównania oznaczano placebo (Przykład porównawczy Cl) i szczury dozowane pojedynczą dawką i równocześ nie ostatnią dawką zestawu wielokrotnego dawkowania. Próbki osocza i tkanki pobrano w 8 i 24 godzinie po podaniu dawki i analizowano na MCP-1.

W badaniu 2 przeprowadzono analizę identyczną jak w badaniu 1. Zestaw danych zanalizowano uwzględniając traktowanie (wielokrotne lub jednokrotne) i punkt czasu przed analizą. Ponownie, dane placebo zebrano jedynie w 8 godzinie dla pojedynczej dawki, ale stosowano je do porównania placebo osobno do każdej z kombinacji sposobu dozowania i czasu. Wyniki zestawiono w tablicy 3 poniżej.

T a b l i c a 3.

Stężenia cytokiny w osoczu szczura i tkance skórnej po podaniu miejscowo preparatu miejscowego kremu z przykładu 5.

Dawka wielokrotna względem pojedynczej ^a

Czas (godziny) po podaniu	Dawka	Stężenie cytokiny ^Λ
MCP-1
Osocze	Miejsce traktowane	Miejsce kontrolne
0	Brak (nie podano)	89 ± 11	NA	20 ± 10
24	Placebo	41 ± 14	42 ± 15	28 ± 6
8	wielokrotna 0,1%	71 ± 13	784 ± 48 ^c	42 ± 5
24	wielokrotna 0,1%	105 ± 36	145±23^c	32 ± 6
8	pojedyncza 0,1%	73 ± 9	519± 99^c	33 ± 6
24	pojedyncza 0,1%	82 ± 3 ^c	412 ±130 ^c	35 ± 7

a b

samice szczura CD pozbawione włosów traktowano miejscowo preparatem kremu zawierającego związek 1.

MCP-1 oznaczono metodą ELISA. Wyniki przedstawiono w pg/ml dla próbek osocza i pg/200 mg tkanki dla próbek tkanki i przedstawiają średnią dla pięciu zwierząt ± SEM.

Wskazania p<0,05 w porównaniu do placebo dla próbek osocza albo różnicy pomiędzy tkanką traktowaną i tkanką kontrolną tego samego zwierzę cia.

Badanie odpowiedzi na dawkę (Badanie 3 z wynikami przedstawionymi w tablicy 4) przeprowadzono dozując preparaty miejscowego kremu z przykładów 3-5 i 7, zawierających różne stężenia związku IRM 1. Próbki osocza i tkanki pobrano po 8 i 24 godzinach po podaniu i analizowano dla MCP-1. Badania przetestowały miejscowe dostarczanie kremów zawierających związek IRM 1 ze względu na ich zdolność wpływania na miejscową indukcję MCP-1 w czterech stężeniach.

Dane dla osocza porównały leczenie aktywne do placebo (przykład porównawczy C1) osobno dla każdego punktu czasu. Należy zauważyć, że dane dla grupy placebo zostały zmierzone jedynie 24 godziny po podaniu i obserwacje porównywano do każdego punktu czasowego dla grupy aktywnej.

T a b l i c a 4.

Stężenia cytokiny w osoczu szczura i tkance skórnej po podaniu miejscowo preparatów z przykładów 3-5 i 7 ^a

Czas (godziny) po podaniu	Dawka	Stężenie Cytokiny ^b
MCP-1
Osocze	Miejsce traktowane	Miejsce kontrolne
1	2	3	4	5
0	kontrola	207 ± 96	NA	38 ± 12
24	placebo (Przykład porównawczy C1)	367±178	61 ± 14	20 ± 5
8	0,01% (Przykład 3)	81 ± 23	61 ± 12	36 ± 7

PL 210 514 B1 cd. tablicy 4

1	2	3	4	5
8	0,03% (Przykład 4)	81 ± 20	271 ± 29	48 ± 5
8	0,1% (Przykład 5)	153 ± 14	1119±122^c	51 ± 8
8	1,0% (Przykład 7)	135 ± 23	1370± 99^c	50 ± 15
24	0,01% (Przykład 3)	71 ± 18	183±49^c	33 ± 13
24	0,03% (Przykład 4)	71 ± 20	212±49^c	40 ± 7
24	0,1% (Przykład 5)	226 ± 73	628±127^c	40 ± 11
24	1,0% (Przykład 7)	149 ± 45	756 ± 38 ^c	30 ± 9

a b

Wskazania p<0,05 w porównaniu do placebo dla próbek osocza albo różnicy pomiędzy tkanką traktowaną i tkanką kontrolną tego samego zwierzęcia.

P r z y k ł a d y 8-13

Tablica 5 zestawia preparaty miejscowe w oparciu o procenty wagowe.

T a b l i c a 5

Składnik	Krem miejscowy (procenty wagowe)
	Przykład 8	Przykład 9	Przykład 10	Przykład 11	Przykład 12	Przykład 13
Związek IRM 2	0,01	0,03	0,10	1,00	0,003	0,30
Kwas Izostearynowy	5,00	5,00	5,00	10,00	5,00	5,00
Mirystynian izopropylu (NF)	10,00	10,00	10,00	5,00	10,00	10,00
Karbomer 974P (NF)	1,00	1,00	1,00	0,75	1,00	1,00
Poloksamer 188 (NF)	2,50	2,50	2,50	2,50	2,50	2,50
Glikol propenylowy (USP)	15,00	15,00	15,00	15,00	15,00	15,00
Metyloparaben (NF)	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20
Propyloparaben (NF)	0,10	0,10	0,10	0,10	0,10	0,10
Edetynian disodowy (USP)	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
Wodorotlenek sodu (NF) roztwór, 20% w/w	0,50	0,50	0,50	0,35	0,50	0,50
Oczyszczona woda (USP)	65,64	65,62	65,55	65,05	65,647	65,35

Razem	100,00	100,00	100,00	100,00	100,00	100,00

Preparaty zestawione w tablicy 5 otrzymano następująco:

Otrzymywanie fazy olejowej: N-[4-(4-amino-2-butylo-1 H-imidazo[4,5-c][1,5]naftyrydyn-1 -ylo)butylo]-N'-cykloheksylo-mocznik (Związek IRM 2) rozpuszczono w kwasie izostearynowym i mirystynianie izopropylu, ogrzewając w miarę potrzeby. Następnie dyspergowano Karbomer 974P w fazie olejowej.

PL 210 514 B1

Preparaty zawierające N-[4-(4-amino-2-butylo-1H-midazo[4,5-c][1,5]naftyrydyn-1-ylo)butylo]-N'-cykloheksylo-mocznik (Związek IRM 2) przebadano względem ich zdolności wywołania wzrostu stężeń cytokiny u szczurów po podaniu miejscowo. Badanie to przeprowadzono w celu oszacowania indukcji cytokiny po pojedynczej dawce o różnej sile i momentach czasu lub po wielokrotnym względem pojedynczego dawkowania związku IRM 2. Preparaty opisane powyżej testowano badając w tkankach i w surowicy stężenia TNF-α, MCP-1 i IFN-α po podaniu leku, jak opisano w przykładach 1-7.

Dane zestawione poniżej w tablicach 6-8 pochodzą z trzech osobnych doświadczeń i ich analizę przeprowadzono w celu

1) pomiarów farmakokinetycznych w pełnym zakresie czasowym,

2) pomiarów odpowiedzi na dawkę i

3) pomiarów dawkowania wielokrotnego względem jednokrotnego.

W celu określenia kinetyki miejscowego i układowego wytwarzania cytokin po miejscowym podawaniu związku IRM 2, przeprowadzono badanie pełnoczasowe (Badanie 1 z wynikami w tablicy 6) podając szczurom preparat kremu miejscowego z przykładu 11 jak opisano w przykładach 1-7.

Dane przedstawiono w tablicy 6.

T a b l i c a 6.

Stężenia cytokiny w osoczu szczura i tkance skórnej po podaniu preparatu miejscowego z przykładu 11 Przebieg pełnoczasowy ^a

Czas (godziny) po podaniu	Dawka	Stężenia cytokiny
TNF-α
Osocze	Miejsce traktowane	Miejsce kontrolne
1	2	3	4	5
0	nie podano	29 ± 15	NA	70 ± 11
16	placebo	42 ± 9	131 ± 32	69 ± 11
1	1%	38 ± 38	44 ± 14	35 ± 19
2	1%	2 ± 2	75 ± 20 ^c	33 ± 13
4	1%	3 ± 3	321±18^c	62 ± 20
8	1%	0	894 ±180 ^c	21 ± 9
16	1%	12 ± 12	377 ± 45 ^c	22 ± 12
24	1%	16 ± 8	285±15^c	52 ± 14
48	1%	24 ± 7	74 ± 9	65 ± 13
		MCP-1
0	nie podano	100 ± 20	NA	33 ± 7
16	placebo	144 ± 9	225±106	22 ± 4
1	1%	117 ± 17	56 ± 9	55 ± 9
2	1%	126 ± 29	50 ± 13	54 ± 8
4	1%	136 ± 29	161±18^c	71 ± 9
8	1%	189 ± 28	1020± 319	45 ± 15
16	1%	297 ± 35	1294±122^c	40 ± 9
24	1%	217 ± 12	1044±185^c	41 ± 11
48	1%	120 ± 22	134±14^c	34 ± 7
		IFN-α
0	nie podano	<65	NA	<650
16	placebo	<65	<650	<650
1	1%	<65	<650	<650

PL 210 514 B1 cd. tablicy 6

1	2	3	4	5
2	1%	<65	<650	<650
4	1%	<65	<650	<650
8	1%	<65	901 ±571	<650
16	1%	<65	1330± 386^c	<650
24	1%	<65	<650	<650
48	1%	<65	<650	<650

^a samice szczura CD pozbawione włosów traktowano miejscowo preparatem kremu zawierającego związek 2.

^b TNF-α i MCP-1 oznaczono metodą ELISA. TFN-α zmierzono stosując oznaczenie biologiczne. Wyniki przedstawiono w pg/ml dla próbek osocza i pg/200 mg tkanki dla próbek tkanki i przedstawiają średnią dla pięciu zwierząt ± SEM.

Badania dawki wielokrotnego dozowania przeprowadzono w celu obserwacji efektów wielokrotnego dozowania (Badanie 2 z wynikami przedstawionymi w tablicy 7). Szczurom dozowano dwa razy w tygodniu przez sześć godzin przez trzy tygodnie preparat miejscowego kremu z przykł adu 10. Dla porównania oznaczano placebo (przykład porównawczy C1) i szczury dozowane pojedynczą dawką i równocześ nie ostatnią dawką zestawu wielokrotnego dawkowania. Próbki osocza i tkanki pobrano w 16 i 24 godzinie po podaniu dawki i analizowano na MCP-1.

W badaniu 2 przeprowadzono analizę identyczną jak w badaniu 1. Zestaw danych zanalizowano uwzględniając traktowanie (wielokrotne lub jednokrotne) i punkt czasu przed analizą. Ponownie, dane placebo zebrano jedynie w 16 godzinie dla pojedynczej dawki, ale stosowano je do porównania placebo do każdej kombinacji traktowania i punktu czasowego osobno. Wyniki zestawiono w tablicy 7 poniżej.

T a b l i c a 7

Stężenia cytokiny w osoczu szczura i tkance skórnej po podaniu miejscowo preparatu kremu miejscowego z przykładu 10 Dawka wielokrotna względem pojedynczej ^a

Czas (godziny) po podaniu	Dawka	Stężenie cytokiny ^b
MCP-1
Osocze	Miejsce traktowane	Miejsce kontrolne
0	Brak (nie podano)	161 ± 58	NA	80 ± 22
16	Placebo	214 ± 35	71 ± 16	47 ± 11
16	Wielokrotna 0,1%	321 ± 62	1173±117^c	86 ± 14
24	Wielokrotna 0,1%	217 ± 43	388 ± 80 ^c	58 ± 5
16	Pojedyncza 0,1%	205 ± 32	1448±241 ^c	77 ± 15
24	Pojedyncza 0,1%	279 ± 45	1172±288^c	90 ± 15

^a samice szczura CD pozbawione włosów traktowano miejscowo preparatem kremu zawierającego związek 2. ^b MCP-1 oznaczono metodą ELISA, Wyniki przedstawiono w pg/ml dla próbek osocza i pg/200 mg tkanki dla próbek tkanki i przedstawiają średnią dla pięciu zwierząt ± SEM.

Badanie odpowiedzi na dawkę (Badanie 3 z wynikami przedstawionymi w tablicy 8) przeprowadzono dozując preparaty miejscowego kremu z przykładów 8-11, zawierających różne stężenia związku IRM 2. Próbki osocza i tkanki pobrano po 16 i 24 godzinach po podaniu i analizowano dla MCP-1.

Badania przetestowały miejscowe dostarczanie kremów zawierających związek IRM 2 ze względu na ich zdolność do wpływania na miejscową indukcję MCP-1 w czterech stężeniach.

Dane dla osocza porównały leczenie aktywne do placebo (przykład porównawczy C1) osobno dla każdego punktu czasu. Należy zauważyć, że dane dla grupy placebo zostały zmierzone tylko 16 godzin po podaniu i obserwacje porównywano do każdego punktu czasowego grupy aktywnej.

PL 210 514 B1

T a b l i c a 8. Stężenia cytokiny w osoczu szczura i tkance skórnej po podaniu miejscowo preparatów z przykładów 8-11 ^a

Czas (godziny) po podaniu	Dawka	Stężenie cytokiny ^b
MCP-1
Osocze	Miejsce traktowane	Miejsce kontrolne
0	kontrola	293 ± 23	NA	41 ± 11
16	placebo (Przykład porównawczy C1)	293 ± 76	44 ± 10	36 ± 12
16	0,01% (Przykład 8)	276 ± 50	257 ± 85	57 ± 20
16	0,03% (Przykład 9)	318 ± 86	210 ± 10	45 ± 9
16	0,10% (Przykład 10)	529±141	2622±616^c	73 ± 9
16	1,0% (Przykład 11)	345 ± 51	3166 ± 470 ^c	71 ± 11
24	0,01% (Przykład 8)	298 ± 65	276 ± 87	94 ± 32
24	0,03% (Przykład 9)	253 ± 34	427 ± 238	28 ± 14
24	0,10% (Przykład 10)	331 ± 93	1461 ± 264 ^c	19 ± 7
24	1,0% (Przykład 11)	358 ± 52	1952 ±185 ^c	17 ± 6

^c samice szczura CD pozbawione włosów traktowano miejscowo preparatem kremu zawierającego związek 2. ^c MCP-1 oznaczono metodą ELISA. Wyniki przedstawiono w pg/ml dla próbek osocza i pg/200 mg tkanki dla próbek tkanki i przedstawiają średnią dla pięciu zwierząt ± SEM.

^c Wskazania p<0,05 w porównaniu do placebo dla próbek osocza albo różnicy pomiędzy tkanką traktowaną i tkanką kontrolną tego samego zwierzę cia.

P r z y k ł a d y 14 - 18

Tablica 9 zestawia preparaty miejscowe wytworzone zgodnie z wynalazkiem, w oparciu o procenty wagowe.

T a b l i c a 9

Składniki	Kremy miejscowe (procenty wagowe)
	Przykład 14	Przykład 15	Przykład 16	Przykład 17	Przykład 18
Związek IRM 1	0,01	0,10	1,00	3,00	1,00
Kwas Izostearynowy (874)	5,00	5,00	10,00	25,00	10,00
*Dimer dilinoleinian diizopropylu	10,00	10,00	5,00	5,00	-
**Kaprylowe/kaprynowe triglycerydy	-	-	-	-	5,00
Karbomer 980, NF	0,70	0,70	0,70	0,90	0,70
Eter monoetylowy glikolu dietylenowego USA - NF	10,00	10,00	10,00	10,00	10,00
Disodowe EDTA, USP	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
Poloksamer 188, NF	2,50	2,50	2,50	2,50	2,50
Oczyszczona woda	70,94	70,85	69,95	52,55	69,95
Metyloparaben, NF	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20
Etyloparaben	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20
20% (w/w) NaOH	0,40	0,40	0,40	0,60	0,40

Razem % w/w	100,00	100,00	100,00	100,00	100,00

* Dostępny pod nazwą handlową PRIPURE 3786 u Uniguema, New Castle, DE ** Dostępny pod nazwą handlową Crodamol GTCC-PN u Croda, Inc, Parsippany, NJ

PL 210 514 B1

P r z y k ł a d y 19 - 24

Tablica 10 zestawia preparaty miejscowe w oparciu o procenty wagowe.

T a b l i c a 10

Składniki	Kremy miejscowe (procenty wagowe)
Przykład 19	Przykład 20	Przykład 21	Przykład 22	Przykład 23	Przykład 24
Związek IRM 2	0,003	0,03	0,10	1,00	3,00	1,00
Kwas izostearynowy (874)	5,00	5,00	5,00	10,00	25,00	10,00
dimer dilinoleinian diizopropylu	10,00	10,00	10,00	5,00	5,00	-
Kaprylowe/kaprynowe triglycerydy	-	-	-	-	-	5,00
Karbomer 980, NF	0,70	0,70	0,70	0,70	0,60	0,70
Eter monoetylowy glikolu dietylenowego USA - NF	10,00	10,00	10,00	10,00	10,00	10,00
Disodowy EDTA, USP	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
Poloksamer 188, NF	2,50	2,50	2,50	2,50	2,50	2,50
Oczyszczona woda	70,95	70,92	70,85	69,95	53,19	69,95
Metyloparaben, NF	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20
Etyloparaben	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20	0,20
20% (w/w) NaOH	0,40	0,40	0,40	0,40	0,26	0,40

Razem % w/w	100,00	100,00	100,00	100,00	100,00	100,00

Preparaty opisane w tablicach 9 i 10 wytworzono według następującego sposób ogólny:

Otrzymywanie fazy olejowej:

Związek IRM rozpuszczono w kwasie izostearynowym i dimer dilinoleinian diizopropylu (lub trigliceryd kwasu kaprylowego/kaprynowego) ogrzewając w miarę potrzeby.

Otrzymywanie fazy wodnej:

Edetynian disodowy rozpuszczono w wodzie. Do fazy wodnej następnie dodano Poloksamer 188 i mieszano do rozpuszczenia. Wówczas dodano Karbomer 980 do fazy wodnej i mieszano aż karbomer został całkowicie zdyspergowany i uwodniony. Metyloparaben i propyloparaben rozpuszczono w eterze monoetylowym glikolu etylenowego i roztwór następnie dodano do fazy wodnej.

Połączenie faz:

Fazę olejową dodano do fazy wodnej w warunkach otaczających. Emulsję następnie mieszano z dużą szybkością lub homogenizowano. Po homogenizacji dodano roztwór wodorotlenku sodu (20% wagowo) i powstały krem mieszano do wygładzenia i jednorodności. Zmierzono pH kremu i przeprowadzono ustalenie pH dodatkowym roztworem wodorotlenku sodu, w miarę potrzeby, do uzyskania docelowego pH 5 w czasie procesu.

P r z y k ł a d y 25 - 28

Tablica 11 zestawia preparaty miejscowe wytworzone zgodnie z wynalazkiem, w oparciu o procenty wagowe.

T a b l i c a 11

Składnik	Krem miejscowy (procenty wagowe)
Przykład 25	Przykład 26	Przykład 27	Przykład 28
1	2	3	4	5
Związek IRM 1	1	1	1	1
Kwas izostearynowy (874)	10	10	10	8
dimer dilinoleinian diizopropylu	5	5	5	1

PL 210 514 B1 cd. tablicy 11

1	2	3	4	5
Karbomer 980, NF	0,7	0,7	0,7	0,7
Eter monoetylowy glikolu dietylenowego USA - NF	10	10	10	10
Disodowy EDTA, USP	0,05	0,05	0, 05	0,05
Poloksamer 188, NF	2,5	2,5	2,5	2,5
Oczyszczona woda	Qs (ilość wystarczająca) do 100	Qs (ilość wystarczająca) do 100	Qs (ilość wystarczająca) do 100	Qs (ilość wystarczająca) do 100
Metyloparaben, NF	0,2	0,2	0,2	0,2
Etyloparaben	0,2	0,2	0,2	0,2
20% (w/w) NaOH	0,4	0,4	0,4	0,4
10% jodopropynylobutylokarbaminian w laurynianie PEG-4	-	1	-	-
Fenoksyetanol	-	-	0,5	-

P r z y k ł a d y 29 - 135

Kremy miejscowe zawierające związki IRM zestawione w Tablicy 12 wytworzono stosując ogólne sposoby opisane dla przykładów 1-24.

Każdy IRM został sformułowany w jeden lub więcej modelowych preparatów przedstawionych w tablicach 13 i 14. Tablica 15 zestawia wytworzone kremy do podawania miejscowo.

T a b l i c a 12

Związek IRM	Nazwa chemiczna
1	2
3	1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-amina
4	1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c][1,8]naftyrydyno-4-amina
5	2-butylo-1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c][1,8]naftyrydyno-4-amina
6	1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftyrydyno-4-amina
7	2-metylotlazólo[4,5-c]chinolino-4-amina
8	2-etoksymetylo-1-fenylometylo-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftyrydyno-4-amina
9	2-etylotiazolo[4,5-c]chinolino-4-amina
10	4-amino-2-butylo-a,a -dimetylo-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftyrydyno-1-etanol
11	N¹-[2-(4-amino-1H-imidazo [4,5-c]chinolino-1-ylo)etylo]benzamid
12	1-{2-[3-(3-pirydyl)propoksy]etylo}-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-amina
13	1-(2-fenoksyetylo)-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-amina
14	1-[(R)-1-fenyletylo]-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftyrydyno-4-amina
15	N⁴-[4-(4-amino-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-1-ylo)butylo]-4-morfolinokarboksoamid
16	N³-[4-(4-amino-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-1-yl)butylo]nikotynamid
17	1-{2-[3-(1,3-tiazol-2-yl)propoksy]etyl}-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-amina
18	1-[2-(pirydyno-4-ylometoksy)etylo]-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-amina
19	2-metylo-1-[5-(metylsulfonylo)pentylo]-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-amina
20	N-[3-(4-amino-2-metylo-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-1-ylo)propylo]cykloheksanokarboksoamid

PL 210 514 B1 cd. tablicy 12

1	2
21	N-[3-(4-amino-2-metylo-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-1-ylo)propylo]-2-metylopropanamid
22	N-[3-(4-amino-2-metylo-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-1-ylo)propylo]butanamid
23	2-butylo-1-{2-[(1-metyletylo)sulfonylo]etylo}-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-amina
24	N-{2-[4-amino-2-(etoksymetylo)-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-1-ylo]etylo)etanosulfonamid
25	N-{2-[4-amino-2-(etoksymetylo)-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-1-ylo]etylo}propanamid
26	1-[2-(metylsulfonylo)etylo]-2-propylo-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-amina
27	N-{2-[4-amino-2-(etoksymetylo)-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-1-ylo]etylo}-N'-etylotiomocznik
28	2-etylo-1-{4-[(1-metyletylo)sulfonylo]butylo}-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-amina
29	2-etylo-1-[4-(etylsulfonylo)butylo]-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-amina
30	N-{3-[4-amino-2-(etoksymetylo)-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-1-ylo]propylo}cyklopentanokarboksoamid
31	N-{3-[4-amino-2-(etoksymetylo)-6,7-dimetylo-1H-imidazo[4,5-c]pirydyno-1-ylo]propylo}morfolino-4-karbo- ksoamid
32	1-(2-metylopropylo)-6,7,8,9-tetrahydro-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-amina
33	8,9,10,11-tetrahydropirydo[1',2':1,2]imidazo[4,5-c]chinolino-6-amina
34	4-amino-a,a,2-trimetylo-6,7,8,9-tetrahydro-1H-imidazo[4,5-c]chinoline-1-etanol
35	2-hydroksymetylo-1-(2-metylopropylo)-6,7,8,9-tetrahydro-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-4-amina
36	2-butylo-1-(2-fenoksyetylo)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftyrydyno-4-amina
37	N-[3-(4-amino-2-metylo-1H-imidazo[4,5-c]chinolino-1-ylo)propylo]metanosulfonamid

T a b l i c a 13

Składnik	Model preparatu (procenty wagowe)
	A	B	C	D	E	F	G
IRM	0,01	0,1	1	1	1	1	1
kwas izostearynowy	5	5	5	20	42	13	6
Mirystynian izopropylu	10	10	10	10	2	10	10
Karbomer 974P	1	1	1	1	1	1,5	1
Oczyszczona woda	_*	_*	_*	_*	_*	_*	_*
Poloksamer 188	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5
Glikol propylenowy	15	15	15	15	13	15	15
Guma ksantanowa	-	-	-	-	0,4	-	-
Metyloparaben	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
EDTA disodowy	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
20% NaOH	0,7	0,7	0,7	0,7	0,7	0,7	0,7

*Qs (ilość uzupełniająca) do 100

PL 210 514 B1

T a b l i c a 14

Składnik	Model preparatu (procenty wagowe)
H	I	J	K	L	M
IRM	0,01	0,1	1	1	3	5
Izostearic kwas	5	5	5	10	10	10
dimer dilinoleinian diizopropylu	10	10	10	5	5	5
Karbomer 980	0,7	0,7	0,7	1,0	1,0	1,0
Oczyszczona woda	_*	_*	_*	_*	_*	_*
Poloksamer 188	2,5	2,5	2,5	2,6	2,6	2,6
Eter monoetylowy glikolu dietylenowego	10	10	10	10	10	10
Guma ksantanowa	-	-	-	0,1	0,1	0,1
Metyloparaben	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Etyloparaben	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
EDTA disodowy	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
20% NaOH	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4

*Qs (ilość uzupełniająca) do 100

T a b l i c a 15

Przykład	Związek IRM	Model preparatu
1	2	3
29	3	A
30	3	B
31	3	C
32	4	A
33	4	B
34	4	C
35	5	A
36	5	B
37	5	D
38	6	A
39	6	B
40	6	C
41	7	A
42	7	B
43	7	C
44	8	A
45	8	B
46	8	C
47	9	A
48	9	B

PL 210 514 B1 cd. tablicy 15

1	2	3
49	9	C
50	10	A
51	10	B
52	10	C
53	11	A
54	11	B
55	11	E
56	12	A
57	12	B
58	12	C
59	13	A
60	13	B
61	13	F
62	14	A
63	14	B
64	14	G
65	15	H
66	15	I
67	15	K
68	16	H
69	16	I
70	16	K
71	17	A
72	17	B
73	17	C
74	18	H
75	18	I
76	18	K
77	19	H
78	19	I
79	19	K
80	20	H
81	20	I
82	20	K
83	20	L
84	20	M
85	21	H
86	21	I

PL 210 514 B1 cd. tablicy 15

1	2	3
87	21	K
88	22	H
89	22	I
90	22	J
91	23	H
92	23	I
93	23	J
94	24	H
95	24	I
96	24	K
97	25	H
98	25	I
99	25	K
100	26	H
101	26	I
102	26	K
103	27	H
104	27	I
105	27	K
106	28	H
107	28	I
108	28	K
109	29	H
110	29	I
111	29	K
112	30	H
113	30	I
114	30	K
115	31	H
116	31	I
117	31	K
118	32	A
119	32	B
120	32	C
121	33	A
122	33	B
123	33	C
124	34	A

PL 210 514 B1 cd. tablicy 15

1	2	3
125	34	B
126	34	C
127	35	A
128	35	B
129	35	C
130	36	A
131	36	B
132	36	C
133	37	H
134	37	I
135	37	K

Kremy miejscowe z przykładów 29-135 badano stosując metodę testowania opisaną poniżej.

Wyniki przedstawiono w tablicy 16 poniżej, gdzie każda wartość jest średnią wartości od 3 szczurów w grupie badanej.

Sposób badania indukcji pojedynczą dawką MCP-1 Stosowano pozbawione włosów samice szczura CD (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) o wadze 200-250 gram. Zwierzęta przydzielono losowo do grup leczenia i podzielono po trzy w grupie leczenia.

Szczury przyzwyczajano do kołnierzy wokół szyi przez dwa kolejne dni przed faktycznym dozowaniem. Dozowano miejscowo 50 μΐ aktywny krem lub odpowiednie placebo na prawym boku i delikatnie wcierano w skórę szczura. Szczurom następnie założono kołnierze i umieszczono osobno, aby zapobiec spożyciu leku.

W wybranych momentach po podaniu preparatu szczury usypiano i pobierano krew (3 ml) przez przekłucie serca. Krwi pozwolono zakrzepnąć w temperaturze pokojowej. Osocze oddzielono od skrzepu poprzez wirowanie i przechowywano w temperaturze -20°C do analizy stężenia MCP-1.

Po pobraniu krwi szczury uśpiono i usunięto ich skórę. Próbki tkankowe (4 z każdej strony) ze strony traktowanej i z przeciwnej (nietraktowanej kremem) uzyskano stosując 8 mm biopsję trepanem, zważono, umieszczono w szczelnej 1,8 ml kriofiolce i szybko zamrożono w ciekłym azocie. Zamrożoną próbkę tkanki następnie zawieszono w 1,0 ml pożywki RPMI (Celox, Hopkins, MN) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (Sigma, St. Louis, MO), 2 mM L-glutaminy, penicylinę/streptomycynę i 2-merkaptoetanol (kompletny RPMI) połączonej z zestawem koktailowym III inhibitora proteazy (Calbiochem, San Diego, CA). Tkankę poddano homogenizacji stosując Tissue Tearor™ (Biospec Products, Bartlesville, OK) przez około 1 minutę. Następnie, schładzając, zawiesinę tkanki wirowano w 2000 rpm (obr/min) przez 10 minut do uzyskania osadu i supernatant zebrano i przechowywano w temperaturze -20°C do analizy stężeń MCP-1.

Oznaczenia ELISA szczurzych MCP-1 zakupiono od BioSource Intl. (Camarillo, CA) i przeprowadzono według instrukcji producenta.

Wyniki wyrażono w pg/ml i wartości dla próbek tkankowych znormalizowano do 200 mg tkanki.

Czułość MCP-1 ELISA wynosi 12 pg/ml.

T a b l i c a 16

MCP-1 (pg/ml)
Krem IRM	Krem placebo
Krem z przykładu	6 godzin	24 godziny
Osocze	Traktowane	Nietraktowa- ne	Osocze	Traktowane	Nietrakto- wane	Osocze	Nietraktowa- ne
1	2	3	4	5	6	7	8	9
29	123	202	46	291	55	34	142	59

PL 210 514 B1 cd. tablicy 16

1	2	3	4	5	6	7	8	9
30	119	92	31	177	201	43	142	59
31	212	1235	54	267	606	125	142	59
32	26	54	59	79	82	69	54	56
33	54	70	71	56	74	58	54	56
34	72	88	58	59	319	69	54	56
35	170	110	55	162	142	62	80	58
36	94	674	46	86	1216	96	80	58
37	153	1826	38	136	2036	77	80	58
38	178	65	120	211	121	86	142	59
39	193	220	61	259	263	59	142	59
40	226	1204	58	284	1086	95	142	59
41	54	82	96	45	88	71	73	96
42	65	129	78	54	126	88	73	96
43	77	824	68	89	1016	93	73	96
44	86	256	_*	177	488	_*	128	**28
45	172	1444	_*	157	1041	_*	128	**28
46	177	1720	_*	406	1023		128	**28
47	58	53	59	81	95	73	37	73
48	71	200	61	63	112	61	37	73
49	92	1254	62	83	1436	75	37	73
50	170	1033	56	_*	655	56	88
51	625	551	787		149	787	88	_*
52	811	348	314	_*	86	314	88	_*
53	70	63	46	76	47	45	7	31
54	68	35	27	71	26	24	7	31
55	75	35	21	44	33	32	7	31
56	115	44	_*	115	425	_*	201	**42
57	119	411	_*	267	1252	_*	201	**42
58	190	1560	_*	476	1508	_*	201	**42
59	155	46	36	271	41	53	107	54
60	123	53	58	175	80	69	107	54
61	133	172	52	151	1131	46	107	54
62	143	211	55	174	428	61	96	26
63	320	1614	51	230	1217	74	96	26
64	970	1094	529	425	390	99	96	26
65	43	34	57	46	81	61	83	59
66	29	73	28	32	42	74	83	59
67	19	54	61	25	34	72	83	59

PL 210 514 B1 cd. tablicy 16

1	2	3	4	5	6	7	8	9
68	60	77	82	91	72	35	68	72
69	143	74	52	99	73	59	68	72
70	59	77	34	91	134	60	68	72
71	259	79	62	134	84	57	177	53
72	138	255	65	122	990	63	177	53
73	251	999	63	293	1411	108	177	53
74	99	66	71	73	99	89	61	91
75	76	101	78	3	170	73	61	91
76	66	6779	64	188	4949	104	61	91
77	28	47	35	21	43	40	30	38
78	27	35	37	33	49	59	30	38
79	24	41	40	27	50	38	30	38
80	51	59	23	50	163	0	97	15
81	9	0	15	83	34	10	97	15
82***	61	32	0	121	303	45	97	15
82***	50	149	36	79	225	76	93	120
83	110	164	124	61	275	172	93	120
84	59	177	92	98	629	40	93	120
85	81	0	0	0	0	0	177	0
86	116	0	0	0	0	0	177	0
87	69	0	0	0	0	0	177	0
88	114	56	41	87	43	42	141	33
89	74	47	49	132	49	40	141	33
90	91	96	47	111	109	41	141	33
91	42	91	53	86	874	57	34	46
92	83	1238	74	92	1087	67	34	46
93	98	2037	64	114	1124	74	34	46
94	102	98	107	48	136	133	110	100
95	49	130	90	95	158	112	110	100
96	68	255	79	132	528	81	110	100
97	34	88	106	54	95	92	36	102
98	17	116	108	83	123	91	36	102
99	51	150	89	43	945	76	36	102
100	111	81	83	55	115	72	82	58
101	33	72	55	75	209	64	82	58
102	79	489	54	112	3199	103	82	58
103	82	88	69	31	107	94	7	61
104	13	66	55	61	72	63	7	61

PL 210 514 B1 cd. tablicy 16

1	2	3	4	5	6	7	8	9
105	75	83	87	54	60	69	7	61
106	72	96	103	64	168	158	8	137
107	21	129	98	48	168	75	8	137
108	95	314	72	135	3267	128	8	137
109	72	60	71	71	78	62	12	31
110	44	76	57	92	72	75	12	31
111	70	143	83	32	2397	68	12	31
112	66	67	120	28	84	70	30	102
113	46	107	106	70	1034	93	30	102
114	14	627	65	196	2880	111	30	102
115	39	38	41	84	77	90	84	157
116	73	81	90	64	57	223	84	157
117	66	113	52	79	91	61	84	157
118	132	59	59	135	46	52	_*	_*
119	123	184	31	144	104	42	_*	_*
120	124	1261	45	171	892	56	_*	_*
121	90	74	51	88	96	75	78	57
122	72	415	50	91	613	82	78	57
123	156	1502	52	226	1043	48	78	57
124	92	94	27	96	95	110	97	652
125	123	198	128	107	72	120	97	652
126	136	1828	97	73	1348	349	97	652
127	67	66	46	81	90	22	51	81
128	63	80	58	55	53	35	51	81
129	49	382	58	35	809	59	51	81
130	132	55	41	135	162	43	74	32
131	124	279	59	144	822	60	74	32
132	124	1901	13	171	1212	11	74	32
133	64	106	0	52	199	32	26	8
134	9	76	0	70	59	0	26	8
135	59	89	0	76	47	0	26	8

* stężenia MCP-1 nie zmierzono ** stężenie MCP-1 dotyczy miejsca traktowanego.

*** Krem z przykładu 82 stosowano w 2 odrębnych eksperymentach

P r z y k ł a d y 136 - 140

Tablica 17 zestawia preparaty miejscowe wytworzone zgodnie z wynalazkiem, w oparciu o procenty wagowe.

PL 210 514 B1

T a b l i c a 17

Składniki	Kremy miejscowe (procenty wagowe)
Przykład 136	Przykład 137	Przykład 138	Przykład 139	Przykład 140
Związek IRM 1	1	1	1	1	1
Kwas Izostearynowy	10	10	8	10	10
dimer dilinoleinian diizopropylu	-	5	1	5	5
Kaprylowe/kaprynowe triglycerydy	5	-	-	-	-
Karbomer 980	0,7	0,7	0,7	0,7	0,7
Eter monoetylowy glikolu dietylenowego	10	10	10	10	10
Disodowy EDTA	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05
Poloksamer 188	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5
Oczyszczona woda	Qs ilość wystarczająca do 100	Qs ilość wystarczająca do 100	Qs ilość wystarczająca do 100	Qs ilość wystarczająca do 100	Qs ilość wystarczająca do 100
Metyloparaben	0,2	0,1	0,2	0,2	0,2
Etyloparaben	0,2	0,1	0,2	0,2	0,2
20% (w/w) NaOH	Qs ilość wystarczająca do pH 5-5,5	Qs ilość wystarczająca do pH 5-5,5	Qs ilość wystarczająca do pH 5-5,5	Qs ilość wystarczająca do pH 6,5	Qs ilość wystarczająca do pH 5-5,5
Jodopropynylo butylokarbaminian	-	0,1	-	-	-
Laurynian PEG-4	-	0,9	-	-	-
Fenoksyetanol	-	1	-	-	-
Kwas sorbinowy	-	0,15	-	-	-

Kremy miejscowe z przykładów 136 -140 przebadano stosując opisaną metodę testowania.

Wyniki przedstawiono w tablicy 18, gdzie każda wartość jest średnią wartością od 3 szczurów w grupie leczenia.

„Normalne zwierzęta” nie były poddane leczeniu.

Sposób badania indukcji cytokiny pojedynczą dawką

Używano pozbawione włosów samice szczura CD (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) o wadze 200-250 gram. Zwierzęta przydzielono losowo do grup leczenia i podzielono po trzy w grupie leczenia.

Szczury przyzwyczajano do kołnierzy wokół szyi przez dwa kolejne dni przed faktycznym dozowaniem. Podawano 50 μL dawkę aktywnego kremu do prawego boku i delikatnie wtarto w skórę szczura. Szczurom następnie założono kołnierze i umieszczono osobno, aby zapobiec spożyciu leku.

godzin po podaniu szczury usypiano i pobierano krew (3 ml) przez przekłucie serca. Krwi pozwolono zakrzepnąć w temperaturze pokojowej, osocze oddzielono od skrzepu poprzez wirowanie i przechowywano w temperaturze -20°C do analizy stężenia cytokiny.

Po pobraniu krwi szczury uśpiono i usunięto ich skórę. Próbki tkankowe (4 z każdej strony) ze strony traktowanej i z przeciwnej (nietraktowanej kremem) uzyskano stosując 8 mm biopsję trepanem, zważono i umieszczono w szczelnej 1,8 ml kriofiolce i szybko zamrożono w ciekłym azocie. Zamrożoną próbkę tkanki następnie zawieszono w 1,0 ml pożywki RPMI (Celox, Hopkins, MN) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (Sigma, St. Louis, MO), 2 mM L-glutaminy, penicylinę/streptomycynę i 2-merkaptoetanol (kompletny RPMI) połączonej z zestawem koktailowym III inhibitora proteazy (Calbiochem, San Diego, CA). Tkankę poddano homogenizacji stosując Tissue Tearor™ (Biospec Products,

PL 210 514 B1

Bartlesville, OK) przez około 1 minutę. Następnie, schładzając zawiesinę tkanki wirowano w 2000 rpm (obr/min) przez 10 minut do uzyskania osadu.

Supernatant zebrano i przechowywano w temperaturze -20°C do analizy stężeń cytokiny. Oznaczenia ELISA szczurzych MCP-1 zakupiono od BioSource Intl. (Camarillo, CA) i szczurzy

TNF-α zakupiono w BD Pharmingen (San Diego, CA) i przeprowadzono według instrukcji producenta. Wyniki podano w pg/ml i wartości dla próbek tkankowych znormalizowano do 200 mg tkanki. Czułość MCP-1 ELISA wynosi 12 pg/ml a czułość TNF-α ELISA wynosi 31 pg/ml.

T a b l i c a 18

Indukcja Cytokiny
Zwierzęta traktowane kremem IRM	Normalne zwierzęta
Krem z Przykładu	MCP-1 (pg/ml)	TNF-α (pg/ml)	MCP-1	(pg/ml)	TNF-α	(pg/ml)
	Osocze	Trak- towane	Nietrak- towane	Osocze	Trakto- wane	Nietrak- towane	Osocze	Tkanka	Osocze	Tkanka
136	119	1208	51	64	808	85	73	39	64	67
137	90	1815	78	78	597	78	73	39	64	67
138	5	1351	27	66	636	69	73	39	64	67
139	62	1509	85	50	443	75	73	39	64	67
140	24	2373	28	80	948	95	73	39	64	67

Zastrzeżenia patentowe

Claims

1. Preparat farmaceutyczny zawierający modyfikator odpowiedzi immunologicznej i kwas tłuszczowy, znamienny tym, że jako modyfikator odpowiedzi immunologicznej (IRM) zawiera 2-metylo-1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]-naftyrydyno-4-aminę lub jej farmaceutycznie akceptowalną sól, oraz zawiera hydrofobowy, aprotyczny składnik mieszający się wzajemnie z kwasem tłuszczowym i zawierający grupę węglowodorową o 7 lub więcej atomach węgla i dodatkowo zawiera środek hydrofilowy zwiększający lepkość wybrany spośród eterów celulozy i karbomerów.

2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że środek hydrofilowy zwiększający lepkość obejmuje karbomer.

3. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że preparat zawiera dodatkowo układ konserwujący i emulgator.

4. Preparat według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera:

(a) 0,001 do 5% wagowych 2-metylo-1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftyrydyno-4-aminy lub jej farmaceutycznie dopuszczalną sól, (b) 0,05 do 40% wagowo kwasu izostearynowego, (c) 1 do 30% wagowo hydrofobowego składnika aprotycznego, (d) 0,01 do 30% wagowo układu konserwującego.

5. Preparat według zastrz. 4, znamienny tym, że zawiera:

(a) 0,001 do 5% wagowych 2-metylo-1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftyrydyno-4-aminy lub jej farmaceutycznie akceptowalną sól, (b) 0,05 do 30% wagowo kwasu izostearynowego, (c) 1 do 30% wagowo hydrofobowego składnika aprotycznego, (d) 0,5 do 10% wagowo emulgatora, (e) 0,01 do 30% wagowo układu konserwującego i (f) 0,1 do 10% karbomeru.

6. Preparat według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera:

(a) 0,03 do 3% wagowo 2-metylo-1-(2-metylopropylo)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftyrydyno-4-aminy lub jej farmaceutycznie dopuszczalną sól, (b) 3 do 25% wagowo kwasu izostearynowego, (c) 3 do 15% wagowo hydrofobowego składnika aprotycznego,

PL 210 514 B1 (d) 0,75 do 3,5% wagowo emulgatora, (e) 0,1 do 25% wagowo układu konserwującego i (f) 0,5 do 5% wagowo karbomeru.

7. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że hydrofobowy, aprotyczny składnik ma równowagę hydrofobowo lipofilową o wartości poniżej 2.

8. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że hydrofobowy, aprotyczny składnik ma pKa większe niż 14,2.

9. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że współczynnik hydrofobowego, aprotycznego składnika do kwasu tłuszczowego wynosi 0,025:1 do 600:1.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że połączony procent wagowy hydrofobowego, aprotycznego składnika i kwasu tłuszczowego wynosi 2 do 50.

11. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że kwas tłuszczowy jest kwasem izostearynowym.

12. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że hydrofobowy, aprotyczny składnik jest wybrany spośród grupy obejmującej aprotyczne estry kwasów tłuszczowych, węglowodory o 8 lub więcej atomach węgla i woski.

13. Preparat według zastrz. 12, znamienny tym, że aprotycznym estrem kwasu tłuszczowego jest mirystynian izopropylu, palmitynian izopropylu, dimer dilinoleinian diizopropylu, trigliceryd kaprylowy/kaprynowy, wosk estrów cetylowych lub ich kombinacje.

14. Preparat według zastrz. 3, znamienny tym, że układ konserwujący zawiera środek zwiększający rozpuszczalność konserwanta.

15. Preparat według zastrz. 3, znamienny tym, że środek zwiększający rozpuszczalność konserwanta obejmuje eter monoetylowy glikolu dietylenowego, glikol propylenowy lub ich kombinację.