PL198434B1 - Nowe mostkowane indenopirolokarbazole, kompozycje farmaceutyczne zawierające te związki i ich zastosowanie - Google Patents

Abstract

1. Nowe mostkowane indenopirolokarbazole o wzorze I w którym: pier scie n B i pier scie n F, niezale znie, i ka zdy wraz z atomami w egla, z którymi jest po laczony, wybiera si e z grupy obejmuj acej: a) nienasycony 6-cz lonowy karbocykliczny pier scie n aromatyczny, w którym od 1 do 3 atomów w egla mo ze by c zast apionych atomami azotu; b) nienasycony 5-cz lonowy karbocykliczny pier scie n aromatyczny; i c) nienasycony 5-cz lonowy karbocykliczny pier scie n aromatyczny, w którym 1) jeden atom w egla jest zast apiony atomem tlenu, azotu lub siarki; 2) dwa atomy w egla s a zast apione atomem siarki i atomem azotu, atomem tlenu i atomem azotu, lub dwoma atomami azotu; lub 3) trzy atomów w egla s a zast apione trzema atomami azotu; R 1 , R 4 , R 6 i R 7 ka zdy oznacza atom H; Y oznacza O; n oznacza 1; A 1 , A 2 i B 1 , B 2 s a niezale znie atomami H, lub wzi ete razem tworz a form e =O; R 2 oznacza prosto la ncuchowy, cykliczny lub rozga leziony C 1 -C 4 alkil, lub OH; R 3 oznacza atom H, halogen, grup e -CH 2 OCH 2 OEt, 3-(3'-NH 2 -fenyl), lub prosto la ncuchowy, cykliczny........................ PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku są nowe skondensowane arylowe i heteroarylowe mostkowane indenopirolokarbazole, określane tutaj jako mostkowane indenopirolokarbazole. Przedmiotem wynalazku są również kompozycje farmaceutyczne i zastosowanie tych mostkowanych indenopirolokarbazoli do wytwarzania leku do leczenia.

Tło wynalazku

Pochodzący z bakterii materiał określany jako K-252a jest unikalnym związkiem, który przyciągnął znaczącą uwagę w czasie kilku ostatnich lat dzięki różnym posiadanym funkcjonalnym aktywnościom. K-252a jest indolokarbazolowym alkaloidem oryginalnie wydzielonym z kultury Nocardiosis sp. (Kase, H i in. 39 J. Antibiotics 1059, 1986). K-252a jest inhibitorem kilku enzymów, w tym białka kinazy C (PKC), która gra centralną rolę w regulacji funkcji komórek, oraz kinazy tyrozyny trk. Opisane funkcjonalne aktywności K-252a i jego pochodnych są liczne i zróżnicowane: inhibicja guzów (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4877776, 4923986 i 5063330; publikacja europejska nr 238011 na nazwisko Nomato); aktywność antyowadobójcza (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4735939); inhibicja zapalenia (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4816450); leczenie chorób związanych z komórkami nerwowymi (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5461146; 5621100; 5621101; i publikacja WIpO WO 94/02488, opublikowana 3 lutego 1994 w imieniu Cephalon, Inc. i Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.); oraz leczenie choroby stercza (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5516771 i 5654427). K-252a także opisano jako hamujące wytwarzanie IL-2 (patrz Grove, D. S. i in., Experimental Cell Research 193: 175-182, 1991).

Opisane indolokarbazole mają kilka wspólnych cech. W szczególności każdy obejmuje trzy pięcioczłonowe pierścienie, które wszystkie obejmują ugrupowanie azotowe; staurosporyna (pochodząca ze Streptomyces sp.) i K-252a obejmują ponadto ugrupowanie cukrowe związane przez dwa wiązania N-glikozydowe. K-252a i staurosporynę badano dokładnie ze względu na ich przydatność jako środki lecznicze. Indolokarbazole są ogólnie lipofilowe, co ułatwia im przekraczanie względnie łatwo biologicznych błon i, w odróżnieniu od białkowych materiałów, wykazują dłuższy czas półtrwania in vivo.

Chociaż K-252a pochodzi normalnie z pożywki kultury poprzez proces fermentacji, uzyskano pełną syntezę naturalnego izomeru (+) i nienaturalnego izomeru (-), w której trzy chiralne węgle cukru mają przeciwne konfiguracje (patrz Wood i in., J. Am. Chem. Soc. 117: 10413, 1995, i publikacja WIPO WO 97/07081). Jednakże ta synteza nie jest praktyczna dla przemysłowego zastosowania.

Poza indolokarbazolowymi alkaloidami reprezentowanymi przez K-252a i staurosporynę, wytworzono syntetyczne małe organiczne cząsteczki, które są biologicznie czynne i znane jako skondensowane pirolokarbazole (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5475110; 5591855; 5594009; 5705511; i 5616724).

Znane są także skondensowane izoindolony, które są nie zawierającymi indoli cząsteczkami, które można chemicznie zsyntetyzować de novo (patrz publikacja WIPO WO 97/21677).

Opisano także pewne makrocykliczne pochodne bis-indolilomaleimidu (patrz np. opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5710145; 5672618; 5552396 i 5545636).

Opisano także pochodne cukrowe indolopirolokarbazoli (patrz publikacja WIPO W098/07433).

Istnieje zapotrzebowanie na nowe pirolokarbazolowe pochodne, które wykazują korzystne właściwości. Przedmiotem wynalazku jest ten, jak też inne ważne cele.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku są nowe skondensowane arylowe i heteroarylowe mostkowane indenopirolokarbazole, określane tutaj jako mostkowane indenopirolokarbazole. Nowe związki według wynalazku mają wzór ogólny I:

R.

Z

PL 198 434 B1 które szczegółowo opisano w opisie poniżej. Związki te są przydatne, między innymi, do polepszania indukowanej czynnikiem troficznym aktywności komórek reagujących na czynnik troficzny, np., neuronów cholinergicznych, i mogą także działać jako środki polepszające przeżywalność innych komórek typu neuronów, np., dopaminergicznych i glutaminianergicznych, a więc są stosowane w środkach farmakologicznych i leczniczych. Niniejsze związki są także przydatne w leczeniu zaburzeń związanych ze zmniejszoną aktywnością ChAT albo śmiercią lub uszkodzeniem neuronów ruchowych rdzenia kręgowego, a także przydatne w leczeniu chorób związanych z apoptotyczną śmiercią komórki centralnego i obwodowego układu nerwowego, układu odpornościowego, oraz chorób zapalnych.

Pewne mostkowane indenopirolokarbazolowe związki opisane w wynalazku mogą także znaleźć zastosowanie w leczeniu stanów chorobowych obejmujących złośliwe namnażanie komórek, takie jak rak.

Przedmiotem wynalazku są również kompozycje farmaceutyczne zawierające nowe związki według wynalazku oraz ich zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia wyżej wymienionych chorób lub zaburzeń. Podano również w opisie wynalazku, sposób wytwarzania niniejszych mostkowanych indenopirolokarbazoli. Inne przydatne sposoby będą oczywiste dla specjalistów w świetle niniejszego opisu.

Krótki opis rysunków

Figura 1 jest schematycznym rysunkiem pokazującym ogólne wytwarzanie mostkowanych indenopirolokarbazoli.

Figura 2 jest schematycznym rysunkiem pokazującym ogólne wytwarzanie mostkowanych indenopirolokarbazoli.

Figura 3 jest schematycznym rysunkiem pokazującym wytwarzanie związanych z żywicą indenopirolokarbazoli.

Figura 4 jest schematycznym rysunkiem pokazującym wytwarzanie zabezpieczonych, rozpuszczalnych indenopirolokarbazoli.

Figura 5 jest schematycznym rysunkiem pokazującym wytwarzanie związku pośredniego V.

Figura 6 jest schematycznym rysunkiem pokazującym wytwarzanie mostkowanych indenopirolokarbazoli z użyciem sposobu A.

Figura 7 jest schematycznym rysunkiem pokazującym wytwarzanie mostkowanych indenopirolokarbazoli z użyciem sposobu B.

Figura 8 jest schematycznym rysunkiem pokazującym wytwarzanie podstawionych na pierścieniu B mostkowanych indenopirolokarbazoli.

Figura 9 jest schematycznym rysunkiem pokazującym derywatyzację pierścienia E mostkowanych indenopirolokarbazoli.

Szczegółowy opis

Przedmiotem wynalazku są nowe mostkowane indenopirolokarbazole o wzorze ogólnym I:

w którym:

pierścień B i pierścień F, niezależnie, i każdy wraz z atomami węgla, z którymi jest połączony, wybiera się z grupy obejmującej:

a) nienasycony 6-członowy karbocykliczny pierścień aromatyczny, w którym od 1 do 3 atomów węgla może być zastąpionych atomami azotu;

PL 198 434 B1

b) nienasycony 5-członowy karbocykliczny pierścień aromatyczny; i

c) nienasycony 5-członowy karbocykliczny pierścień aromatyczny, w którym

1) jeden atom węgla jest zastąpiony atomem tlenu, azotu lub siarki;

2) dwa atomywęęla s ąą zstąąione atomem siarki i atomem azztu,atomem tlenni atomem azztu, lub dwoma atomami azotu; lub

3) trzy atomów węgla są zastąpione trzema atomami azotu;

R¹, R^{4, r6 i} R^{7 k}aż^dy oznacza atom H^;

Y oznacza O; n oznacza 1;

Al A² i βΐ, B² są niezależnie atomami H, lub wzięte razem tworzą formę =O;

R² oznacza prostołańcuchowy, cykliczny lub rozgałęziony C1-C4 alkil, lub OH;

R³ oznacza atom H, halogen, grupę -CH2OCH2OEt, 3-(3'-NH2-fenyl), lub prostołańcuchowy, cykliczny lub rozgałęziony Ci-Csalkil;

R⁵ oznacza atom H lub prostołańcuchowy, cykliczny lub rozgałęziony Ci-Cealkoksyl;

R⁸ oznacza atom H, metyl, CH2OH, CO2Etyl lub prostołańcuchowy, cykliczny lub rozgałęziony

Ci-Cealkoksyl;

Z oznacza wiązanie lub O; m oznacza 1 lub 2.

Związki według wynalazku obejmują wszystkie diastereomery i enancjomery wokół atomów węgla, z którymi są związane podstawniki r2, r7 i r8.

Korzystne mostkowane indenopirolokarbazole są reprezentowane następującym wzorem:

W pewnych korzystnych odmianach związków o wzorze II, związki mają diastereomery o wzorze

W innych korzystnych odmianach związków o wzorze II, związki mają enancjomery o wzorze:

PL 198 434 B1

W pewnych korzystnych odmianach związków o wzorze I i II, R¹ oznacza H. W kolejnych korzystnych odmianach, R²oznacza H, hydroksyl albo podstawiony lub nie podstawiony alkil.

W innych korzystnych odmianach R\ R⁴, R⁶ i R⁷ oznaczają niezależnie H, lub R³ oznacza H, podstawiony lub nie podstawiony alkil, chlorowiec, R5 oznacza wodór, podstawiony lub nie podstawiony alkoksyl, R i R oznaczają niezależnie H, albo R oznacza H i R oznacza podstawiony albo nie podstawiony alkil.

W pewnych korzystnych odmianach, Y oznacza O.

W kolejnych korzystnych odmianach Z oznacza wiązanie albo O.

W jeszcze korzystniejszych odmianach, m i n oznaczają niezależnie 1 lub n oznacza 1 i m oznacza 2.

W pewnych szczególnie korzystnych odmianach, Y oznacza O, Z oznacza wiązanie lub O oraz m i n oznaczają niezależnie 1 lub m oznacza 2 i n oznacza 1.

W kolejnych korzystnych odmianach, AW i B¹b2 oznaczają niezależnie =O lub H, H.

W pewnych szczególnie korzystnych odmianach każda Ri, r4, r6 i r7 oznacza H, Y oznacza =O, n oznacza 1, A A i Β B niezależnie oznaczają =O lub H, H, R oznacza H, OH lub niższy alkil, R3 oznacza H lub podstawiony alkil, każda R5 i R⁸ oznacza H lub alkoksyl, korzystnie metoksyl, Z oznacza wiązanie lub O i m oznacza 1 lub 2.

W innych korzystnych odmianach, związki według wynalazku są przedstawione wzorami:

PL 198 434 B1

w których R³ i R⁵ wybiera się niezależnie z grupy obejmującej H, F, Br, -OH, -CBOCBOEt, 3-(3'-NH2-fenyl) i alkil mający 1 do 8 atomów węgla lub alkoksyl mający od 1 do 8 atomów węgla.

Korzystnymi związkami są również te, w których r5 wybiera się niezależnie z grupy obejmującej H lub prostołańcuchowy, cykliczny lub rozgałęziony alkoksyl mający od 1 do 8 atomów węgla.

Pewnymi szczególnie korzystnymi odmianami związków o wzorze II są związki II-1, II-1b, II-2, II-3, II-4a, II-4b, II-5, II-6, II-7a, II-7b, II-8, II-9, II-10, II-11, II-12, II-13, II-14a, II-14b, II-15, II-16a i II-16b, których struktury przedstawiono w tabeli 8, dalej.

Pewne korzystne chiralnie specyficzne odmiany związków o wzorze II przedstawiono w tabeli 9, dalej.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca jako związek aktywny związek o wzorze I lub wzorze II i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Kompozycje farmaceutyczne korzystnie stosuje się do hamowania jednej lub więcej aktywności kinazy trk, aktywności kinazy VEGFR, lub aktywności PDGFR, przy czym kompozycja obejmuje związek o wzorze I i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W innych korzystnych zastosowaniach, kompozycja polepsza czynnik tropiczny lub aktywność ChAT rdzenia kręgowego, przy czym kompozycja obejmuje związek o wzorze I i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

W innych korzystnych zastosowaniach, kompozycja służy do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom stercza, takim jak rak stercza lub dobrotliwy przerost stercza.

W innych korzystnych zastosowaniach, kompozycja służy do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom angiogennym takim jak lite guzy, endometrioza, retynopatia diabetyczna, łuszczyca, hemangioblastoma, zaburzenia oczne lub zwyrodnienie plamki żółtej.

W innych korzystnych zastosowaniach, kompozycja służy do leczenia lub zapobiegania nowotworzeniu, reumatoidalnemu zapaleniu stawów, zwłóknieniu płucnemu, zwłóknieniu szpiku, nienormalnemu gojenie ran, miażdżycy tętnic lub nawrotowi zwężenia.

PL 198 434 B1

Inne korzystne kompozycje farmaceutyczne służą do leczenia lub zapobiegania chorobie Alzheimera, stwardnieniu zanikowemu bocznemu, chorobie Parkinsona, udarowi, niedokrwieniu, chorobie

Huntingtona, demencji wskutek AIDS, epilepsji, stwardnieniu rozsianemu, neuropatii obwodowej lub uszkodzeniu mózgu lub rdzenia kręgowego.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również zastosowanie nowych związków według wynalazku do wytwarzania leku do hamowania aktywności kinazy trk obejmującego związek o wzorze I w ilości dostatecznej do spowodowania skutecznej inhibicji. W korzystnej odmianie związek o wzorze I służy do wytwarzania leku do leczenia zapalenia. W innej korzystnej odmianie receptorem kinazy trk jest trk A.

W innych odmianach przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie nowych związków według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom stercza, i podaje się pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia lub zapobiegania leczniczo skuteczną ilość związku o wzorze I w leku.

W korzystnej odmianie, zaburzeniem stercza jest rak stercza lub dobrotliwy przerost stercza.

W innych odmianach, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie nowych związków według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom angiogennym, w których aktywność kinazy VEGFR daje wkład do stanów patologicznych, gdzie podaje się lek zawierający związek o wzorze I w ilości dostatecznej do spowodowania zetknięcia receptora czynnika wzrostu naczyniowego śródbłonka ze skuteczną ilością hamującą związku.

W innej odmianie przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom angiogennym, gdzie podaje się pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia lub zapobiegania lek zawierający leczniczo skuteczną ilość związku o wzorze I.

W korzystnej odmianie, zaburzeniem angiogennym jest lity nowotwór, zaburzenia oczne, zwyrodnienie plamki żółtej, endometrioza, retynopatia cukrzycowa, łuszczyca lub hemangioblastoma.

W innych odmianach przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom, w których aktywność PDGFR daje wkład do stanów patologicznych, gdzie podaje się lek zawierający związek o wzorze I w ilości dostatecznej do spowodowania zetknięcia receptora pochodzącego z płytek czynnika wzrostu ze skuteczną ilością hamującą związku.

W innej odmianie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom patologicznym, gdzie podaje się pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia lub zapobiegania lek zawierający leczniczo skuteczną ilość związku o wzorze I.

W korzystnych odmianach zaburzeniem patologicznym jest nowotworzenie, reumatoidalne zapalenie stawów, zwłóknienie płucne, zwłóknienie szpiku, nienormalne gojenie ran, miażdżyca tętnic lub nawrót zwężenia.

W innych odmianach, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie do leczenia zaburzeń charakteryzujących się odchyloną od normy aktywnością komórek reagujących na czynnik troficzny, gdzie podaje się lek zawierający związek o wzorze I w ilości dostatecznej do spowodowania zetknięcia receptora komórki czynnika troficznego ze skuteczną ilością indukującą aktywność związku.

W korzystnych odmianach aktywnością komórek reagujących na czynnik troficzny jest aktywność ChAT.

W innej odmianie przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie do leczenia lub zapobiegania chorobie Alzheimera, stwardnieniu zanikowemu bocznemu, chorobie Parkinsona, udarowi, niedokrwieniu, chorobie Huntingtona, demencji AIDS, epilepsji, stwardnieniu rozsianemu, neuropatii obwodowej, lub uszkodzeniom mózgu lub rdzenia kręgowego, polegający na tym, że podaje się pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia lub zapobiegania leczniczo skuteczną ilość związku o wzorze I.

Związki według niniejszego wynalazku obejmują wszystkie diastereomery i enancjomery. Związki o wzorze (I) są także określane tutaj jako związek (I) i to samo dotyczy związków o innych numerach wzorów.

W niniejszym wynalazku, termin karbocykliczny odnosi się do grup cyklicznych, w których część pierścieniowa jest złożona wyłącznie z atomów węgla. Terminy heterocyklo i heterocykliczny odnoszą się do grup cyklicznych, w których część pierścieniowa obejmuje co najmniej jeden heteroatom taki jak O, N, lub S.

W niniejszym wynalazku, termin alkil oznacza prostołańcuchową, cykliczną, lub rozgałęzioną grupę alkilową mającą 1 do 8 atomów węgla, taką jak metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, s-butyl, t-butyl, pentyl, izoamyl, neopentyl, 1-etylopropyl, heksyl, oktyl, cyklopropyl i cyklopentyl. Ugru8

PL 198 434 B1 powanie alkilowe zawierających alkil grup, takich jak grupy alkoksylowe, alkoksykarbonylowe i alkiloaminokarbonylowe, ma takie same znaczenia jak alkil zdefiniowany powyżej. Niższymi grupami alkilowymi, które są korzystne, są grupy alkilowe, jak zdefiniowano powyżej, które zawierają 1 do 4 atomów węgla. Termin alkenyl ma obejmować prostołańcuchowe lub rozgałęzione łańcuchy węglowodorowe mające co najmniej jedno podwójne wiązanie węgiel-węgiel. Przykłady grup alkenylowych obejmują grupy etenylowe i propenylowe. W niniejszym wynalazku termin alkinyl ma obejmować prostołańcuchowe lub rozgałęzione łańcuchy węglowodorowe mające co najmniej jedno potrójne wiązanie węgiel-węgiel. Przykłady grup alkinylowych obejmują grupy etynylowe i propynylowe.

Ugrupowanie acylowe zawierających acyl grup, takich jak grupy acyloksylowe, ma obejmować prostołańcuchową lub rozgałęzioną grupę alkanoilową mającą 1 do 6 atomów węgla, taką jak formyl, acetyl, propanoil, butyryl, waleryl, piwaloil lub heksanoil.

W niniejszym wynalazku termin aryl oznacza grupę mającą 6 do 12 atomów węgla, taką jak fenyl, bifenyl i naftyl. Korzystne grupy arylowe obejmują niepodstawione lub podstawione grupy fenylowe i naftylowe. Termin heteroaryl w niniejszym wynalazku określa grupę arylową, w której jeden lub więcej pierścieniowych atomów węgla jest zastąpionych hetero-atomem (to jest, nie węglowym), takim jak O, N lub S. Korzystne grupy heteroarylowe obejmują grupy pirydylowe, pyrimidylowe, pirolilowe, furylowe, tienylowe, imidazolilowe, triazolilowe, tetrazolilowe, chinolilowe, izochinolilowe, benzoimidazolilowe, tiazolilowe, pirazolilowe i benzotiazolilowe.

Termin aralkil (lub aryloalkil) ma obejmować grupę mającą od 7 do 15 atomów węgla, obejmującą grupę alkilową niosącą grupę arylową. Przykłady grup aralkilowych obejmują grupę benzylową, fenetylową, benzhydrylową i naftylometylową. Grupy alkilowe i ugrupowania alkilowe zawarte w podstawnikach, takich jak grupy aralkilowe, alkoksylowe, aryloalkoksylowe, hydroksyalkoksylowe, alkoksyalkoksylowe, hydroksyalkilotio, alkoksyalkilotio, alkilokarbonyloksylowe, hydroksyalkilowe i acyloksylowe, mogą być podstawione lub niepodstawione. Podstawiona grupa alkilowa ma 1 do 3 niezależnie wybranych podstawników, korzystnie hydroksyli, niższych alkoksyli, niższych alkoksyalkoksyli, podstawionych lub niepodstawionych aryloalkoksy-niższych alkoksyli, podstawionych lub niepodstawionych heteroaryloalkoksy-niższych alkoksyli, podstawionych lub niepodstawionych aryloalkoksyli, podstawionych lub niepodstawionych heterocykloalkoksyli, chlorowców, karboksyli, niższych alkoksykarbonyli, nitro, amino, mono- lub di-niższych alkiloamino, dioksolanów, dioksanów, ditiolanów, ditionów, furanów, laktonów lub laktamów.

Podstawione grupy arylowe, podstawione grupy heteroarylowe i podstawione grupy aralkilowe mają 1 do 3 niezależnie wybranych podstawników, będących korzystnie niższymi alkilami, hydroksylami, niższymi alkoksylami, karboksylami, niższymi alkoksykarbonylami, nitro, amino, mono- lub di-niższymi alkiloamino i chlorowcami.

Grupy heterocykliczne tworzone z atomem azotu obejmują grupy pirolidynylowe, piperydynylowe, piperydynowe, morfolinylowe, morfolinowe, tiomorfolinowe, N-metylopiperazynylowe, indolilowe, izoindolilowe, imidazolowe, imidazolinowe, oksazolinowe, oksazolowe, triazolowe, tiazolinowe, tiazolowe, pirazolowe, pirazolonowe i triazolowe. Grupy heterocykliczne tworzone z atomem tlenu obejmują grupy furanowe, tetrahydrofuranowe, piranowe i tetrahydropiranowe.

Grupy hydroksyalkilowe są grupami alkilowymi, które mają dołączoną grupę hydroksylową. Chlorowce obejmują fluor, chlor, brom i jod.

W niniejszym wynalazku, termin heteroaryloalkil oznacza grupę aryloalkilową, która zawiera heteroatom. Termin oksy oznacza obecność atomu tlenu. Tak więc grupy alkoksylowe są grupami alkilowymi, które są związane przez atom tlenu i grupy karbonyloksylowe oznaczają grupy karbonylowe, które są dołączone przez atom tlenu.

Termin heterocykloalkoksyl oznacza grupę alkoksylową, która ma grupę heterocykliczną związaną ze swoim ugrupowaniem alkilowym, a termin aryloalkoksyl oznacza grupę alkoksylową, która ma grupę arylową związaną ze swoim ugrupowaniem alkilowym. Termin alkilokarbonyloksyl oznacza grupę o wzorze -O-C(=O)-alkil.

W niniejszym wynalazku termin alkiloksy-alkoksyl oznacza grupę alkoksylową, która zawiera podstawnik alkiloksylowy związany z jej ugrupowaniem alkilowym. Termin alkoksy-alkilotio oznacza grupę alkilotio (to jest grupę o wzorze -S-alkil), która zawiera podstawnik alkoksylowy związany z jej ugrupowaniem alkilowym. Termin hydroksy-alkilotio oznacza grupę alkilotio (to jest, grupę o wzorze -S-alkil), która zawiera podstawnik hydroksylowy związany z jej ugrupowaniem alkilowym.

W niniejszym wynalazku termin monosacharyd ma swoje zwyczajne znaczenie jako prosty cukier.

PL 198 434 B1

W niniejszym wynalazku termin aminokwas oznacza cząsteczkę zawierającą grupę aminową i grupę karboksylową. Odmiany aminokwasów obejmują α-aminokwasy; to jest, kwasy karboksylowe o wzorze ogólnym HOOC-CH(NH2)-(łańcuch boczny).

Łańcuchy boczne aminokwasów obejmują naturalnie występujące i nie występujące w naturze ugrupowania. Nie występujące w naturze (to jest, nienaturalne) aminokwasowe łańcuchy boczne są ugrupowaniami, które stosuje się w miejsce naturalnie występujących aminokwasowych łańcuchów bocznych, np., w analogach aminokwasów. Patrz, np., Lehninger, Biochemistry, wyd. 2, Worth Publishers, Inc. 1975, str. 73-75, dołączane niniejszym jako odnośniki.

Korzystne α-aminokwasy obejmują glicynę, alaninę, prolinę, kwas glutaminowy i lizynę, mające konfiguracje D, konfigurację L lub jako racemat.

Łańcuchy boczne dalszych reprezentatywnych α-aminokwasów pokazano poniżej w tabeli 1.

W pewnych korzystnych odmianach, grupy podstawników dla związków o wzorach I i II obejmują reszty aminokwasowe po usunięciu ugrupowania hydroksylowego grupy karboksylowej; to jest, grupy o wzorze -C(=O)-CH(NH2)-(łańcuch boczny).

Grupy funkcyjne obecne na związkach o wzorze I mogą zawierać grupy zabezpieczające. Np., podstawniki aminokwasowego łańcucha bocznego związków o wzorze I mogą być podstawione grupami zabezpieczającymi, takimi jak grupy benzyloksykarbonylowe lub t-butoksykarbonylowe. Grupy zabezpieczające są znane jako takie jako chemiczne grupy funkcyjne, które można selektywnie dołączać i usuwać z grup funkcyjnych, takich jak grupy hydroksylowe i grupy karboksylowe. Te grupy są obecne w związku chemicznym dla spowodowania obojętności takiej grupy funkcyjnej na warunki reakcji chemicznych, którym poddawany jest związek. Można stosować dowolne z wielu grup zabezpieczających według niniejszego wynalazku. Jedną z takich grup zabezpieczających jest benzyloksy10

PL 198 434 B1 karbonyl (Cbz; Z). Inne korzystne grupy zabezpieczające według wynalazku można znaleźć u Greene'a,

T.W. i Wutsa, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis wyd. 2, Wiley & Sons, 1991.

Mostkowane związki indenopirolokarbazolowe wykazały ważne funkcjonalne farmakologiczne aktywności, które znajdują zastosowanie w wielu układach, w tym w dziedzinie badań i terapii. Takie pochodne są przydatne jako środki lecznicze. Aktywności związków wykazują pozytywne działanie na funkcje i/lub przetrwanie komórek reagujących na czynnik troficzny. Wpływ na funkcje i/lub przetrwanie komórek reagujących na czynnik troficzny, np., komórek linii neuronów, wykazano stosując dowolne z następujących testów: (1) test hodowanej acetylotransferazy choliny rdzenia kręgowego (ChAT); lub (2) test aktywności hodowanej ChAT podstawnych neuronów.

W niniejszym wynalazku termin wpływ, przy stosowaniu do modyfikacji terminów funkcja i przetrwanie oznacza pozytywną lub negatywną zmianę. Wpływ pozytywny można określić tutaj jako polepszenie lub polepszanie, a wpływ negatywny można określić tutaj jako inhibicję lub hamowanie.

W niniejszym wynalazku, terminy polepszać lub polepszanie, gdy użyto ich do modyfikacji terminów funkcja lub przetrwanie oznacza, że obecność mostkowanego związku indenopirolokarbazolowego ma pozytywny wpływ na funkcje i/lub przetrwanie komórki reagującej na czynnik troficzny w porównaniu z komórką w nieobecności związku. Na przykład w sposób nie ograniczający, w odniesieniu do przetrwania, np., neuronu cholinergicznego, związek będzie powodował polepszenie przetrwania populacji cholinergicznych neuronów przy zagrożeniu śmiercią (np. wskutek choroby, stanu degeneracyjnego lub naturalnego starzenia) w porównaniu z populacją cholinergicznych neuronów nie potraktowanych takim związkiem, jeśli potraktowana populacja ma względnie dłuższy okres funkcjonalności niż nie potraktowana populacja.

W niniejszym wynalazku hamować i inhibicja oznacza, że specyficzna odpowiedź określonej substancji (np., aktywność enzymatyczna) jest względnie obniżona w obecności mostkowanego związku indenopirolokarbazolowego.

W niniejszym wynalazku, termin trk odnosi się do rodziny receptorów neurotrofinowych o wysokim powinowactwie obejmujących obecnie trk A, trk B i trk C i inne związane z błonami białka, z którymi może się wiązać neurotrofina.

W niniejszym wynalazku, inhibicja VEGFR implikuje przydatność w przypadku np., chorób, w których gra ważną rolę angiogeneza, takich jak lite guzy, endometrioza, retynopatia cukrzycowa, łuszczyca, guz mózgu z angioblastów, jak też inne choroby oczu i raki.

Inhibicja trk implikuje przydatność w, np., chorobach stercza, takich jak rak stercza i dobrotliwy przerost stercza oraz leczeniu bólu przy zapaleniu.

Inhibicja receptora czynnika wzrostu z płytek (PDGFR) implikuje przydatność w, np., różnych formach nowotworzenia, reumatoidalnym zapaleniu stawów, zwłóknieniu płuc, zwłóknieniu szpiku, nienormalnym gojeniu ran, chorobach z zakończeniem sercowo-naczyniowym, takich jak miażdżyca tętnic, nawrót zwężenia, po-angioplastyczny nawrót zwężenia, itp.

W niniejszym wynalazku terminy rak i rakowy odnoszą się do dowolnego złośliwego rozrostu komórek u ssaka. Przykłady obejmują raka stercza, dobrotliwy przerost stercza, raka jajników, piersi, mózgu, płuc, trzustki, jelita grubego, żołądka, lite guzy głowy i szyi, nerwiaka, raka komórek nerek, chłoniaka, białaczkę, inne znane nowotwory złośliwe układów krwiotwórczych i inne znane raki.

W niniejszym wynalazku terminy neuron, komórka linii neuronowej i komórka neuronalna obejmują między innymi heterogenną populację neuronowych typów mających pojedyncze lub liczne mediatory i/lub pojedyncze lub liczne funkcje; korzystnie, są to neurony cholinergiczne i czuciowe. W niniejszym wynalazku, zwrot neuron cholinergiczny oznacza neurony centralnego układu nerwowego (CNS) i obwodowego układu nerwowego (PNS), których neurotransmiterem jest acetylocholina; przykładami są neurony podstawowe przodomózgowia, prążkowiowe i rdzenia kręgowego. W niniejszym wynalazku, zwrot neuron czuciowy obejmuje neurony reagujące na wpływy środowiska (np., temperaturę, ruch) z, np., skóry, mięśni i stawów; przykładem jest neuron ze zwoju nerwowego korzenia tylnego.

Komórka reagująca na czynnik troficzny, jak zdefiniowano w wynalazku, oznacza komórkę obejmującą receptor, z którym czynnik troficzny może się specyficznie wiązać; przykłady obejmują neurony (np., neurony cholinergiczne i czuciowe) i komórki nienerwowe (np., monocyty i komórki nowotworowe).

Mostkowane związki indenopirolokarbazolowe opisane w wynalazku znajdują zastosowanie w układach badawczych i leczniczy np. do inhibicji aktywności enzymatycznej. Np., w dziedzinie baPL 198 434 B1 dań, związki można stosować do opracowywania testów i modeli do dalszego polepszania zrozumienia roli inhibicji kinazy białkowej seryny/treoniny lub tyrozyny (np., PKC, kinaza tyrozyny trk) w mechanistycznych aspektach związanych zaburzeń i chorób. W układzie leczniczym związki, które hamują te enzymatyczne aktywności, można stosować do inhibicji szkodliwych konsekwencji tych enzymów przy zaburzeniach, takich jak rak.

Jak pokazują przykłady poniżej, inhibicję enzymatycznej aktywności z użyciem mostkowanych związków indenopirolokarbazolowych można określić stosując, np., następujące testy:

1. test inhibicji aktywności kinazy tyrozyny trkA;

2. inhibicję stymulowanej NGF fosforylacji trk w preparatach pełnych komórek;

3. test inhibicji kinazy receptora czynnika wzrostu naczyniowych komórek śródbłonka (VEGFR);

4. test inhibicji aktywności PKC; i

5. test inhibicji PDGFR.

Ujawnione mostkowane związki indenopirolokarbazolowe można stosować do polepszania funkcji i/lub przetrwania komórek linii neuronów u ssaka, np., człowieka. W tych kontekstach, związki można stosować indywidualnie lub z innymi skondensowanymi pirolokarbazolami i/lub indolokarbazolami, lub w kombinacji z innymi korzystnymi cząsteczkami, które także wykazują zdolność do wywoływania funkcji i/lub przetrwania wyznaczonej komórki.

Wiele neurologicznych zaburzeń charakteryzuje się obecnością komórek nerwowych, które są umierające, uszkodzone, upośledzone funkcjonalnie, poddane degeneracji aksonów, zagrożone śmiercią, itp. Takie zaburzenia obejmują, miedzy innymi: chorobę Alzheimera; motoryczne zaburzenia nerwowe (np. stwardnienie zanikowe boczne); chorobę Parkinsona; zaburzenia mózgowo-naczyniowe (np., udar, niedokrwienie); chorobę Huntingtona; demencję AIDS; epilepsje; stwardnienie rozsiane; obwodowe neuropatie (np., atakujące neurony DRG w związanej z chemioterapią neuropatii obwodowej) w tym neuropatię cukrzycową; zaburzenia indukowane pobudzającymi aminokwasami; i zaburzenia związane ze wstrząsowym lub przenikającym uszkodzeniem mózgu lub rdzenia kręgowego.

ChAT katalizuje syntezę neurotransmitera acetylocholiny i jest uważana za enzymatyczny marker dla funkcjonalnego neuronu cholinergicznego. Funkcjonalny neuron jest także zdolny do przetrwania. Przetrwanie neuronu testuje się ilościowo poprzez specyficzny pobór i enzymatyczną konwersję barwnika (np., kalceiny AM) w żywych neuronach.

Ze względu na ich zmienne przydatności, mostkowane związki indenopirolokarbazolowe ujawnione w wynalazku znajdują zastosowanie w wielu sytuacjach. Związki można stosować do rozwijania modeli in vitro przetrwania, funkcji, identyfikacji komórek nerwowych lub do selekcji innych syntetycznych związków, które wykazują aktywności podobne do mostkowanych związków indenopirolokarbazolowych. Związki można stosować w środowisku naukowym do badania, określania i ustalania celów cząsteczkowych związanych z odpowiedziami funkcjonalnymi. Np., przez radioznakowanie mostkowanego związku indenopirolokarbazolowego związanego ze specyficzną funkcją komórkową (np., mitogenezą), można zidentyfikować docelową jednostkę, z którą wiąże się pochodna, wydzielić ją i oczyścić dla zbadania.

Związki są przydatne, między innymi, nie tylko do polepszania indukowanej czynnikiem troficznym aktywności komórek reagujących troficznie, np., neuronów cholinergicznych, lecz mogą także działać jako czynniki sprzyjające przetrwaniu dla innych komórek typu neuronów, np. dopaminergicznych lub glutaminianergicznych. Czynnik wzrostu może regulować przetrwanie neuronów sygnalizując kaskady w dół od małych białek wiążących GTP ras, rac i cdc42 (Denhardt, D.T., Biochem. J., 1996, 318, 729). Specyficznie, aktywacja ras prowadzi do fosforylowania i aktywacji pozakomórkowej aktywowanej receptorem kinazy (ERK), którą wiązano ze wzrostem biologicznym i procesami różnicowania. Stymulacja rac/cdc42 prowadzi do wzrostu aktywacji JNK i p38, odpowiedzi związanych ze stresem, apoptozą i zapaleniem. Chociaż odpowiedzi czynnika wzrostu pojawiają się głównie szlakiem ERK, wpływanie na te wymienione procesy może prowadzić do alternatywnych mechanizmów przetrwania neuronów, które mogą naśladować właściwości polepszania przetrwania czynnika wzrostu (Xia i in., Science, 1995, 270, 1326). Związki mogą także działać jako środki sprzyjające przetrwaniu dla neuronów i komórek nienerwowych przez mechanizmy związane, lecz także odmienne, od mediowanego czynnikiem wzrostu przetrwania, np., inhibicją szlaków JNK i p38 MAPK, która może prowadzić do przetrwania przez inhibicję procesów apoptotycznej śmierci komórki.

Niniejsze związki są przydatne w leczeniu zaburzeń związanego ze zmniejszoną aktywnością ChAT lub śmiercią, uszkodzeniem neuronów ruchowych rdzenia kręgowego, a także znajdują zasto12

PL 198 434 B1 sowanie np. w chorobach związanych z apoptotyczną śmiercią komórki centralnego i obwodowego układu nerwowego, układu odpornościowego i w chorobach zapalnych.

Mostkowane związki indenopirolokarbazolowe opisane w wynalazku mogą także znaleźć zastosowanie w leczeniu stanów chorobowych obejmujących złośliwe namnażanie komórek, takich jak wiele raków.

Farmaceutycznie dopuszczalne sole związków (I) obejmują farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne kwasów, sole metali, sole amoniowe, sole addycyjne organicznych amin i sole addycyjne aminokwasów. Przykładami soli addycyjnych kwasów są nieorganiczne sole addycyjne kwasów, takie jak chlorowodorek, siarczan i fosforan, oraz organiczne sole addycyjne kwasów takie jak octan, maleinian, fumaran, winian, cytrynian i mleczan; przykładami soli metali są sole metali alkalicznych, takie jak sól litu, sól sodu i sól potasu, sole wapniowców, takie jak sól magnezu i sól wapnia, sól glinu i sól cynku; przykładami soli amoniowych są sól amonu i sól tetrametyloamoniowa; przykładami soli addycyjnych organicznych amin są sole z morfoliną i piperydyną; a przykładami soli addycyjnych aminokwasów są sole z glicyną, fenyloalaniną, kwasem glutaminowym i lizyną.

Związki przedstawione w wynalazku można komponować w kompozycje farmaceutyczne mieszając je z farmaceutycznie dopuszczalnymi nietoksycznymi zaróbkami i nośnikami. Takie kompozycje można wytwarzać do podawania pozajelitowego, szczególnie w postaci ciekłych roztworów lub zawiesin; lub doustnego podawania, szczególnie w postaci tabletek lub kapsułek; lub donosowego, szczególnie w postaci proszków, kropli do nosa lub aerozoli; lub skórnego, poprzez np. przezskórne plastry.

Kompozycję można dogodnie podawać w postaciach dawek jednostkowych i można wytwarzać dowolnymi sposobami dobrze znanymi w dziedzinie farmacji, np., jak opisuje Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980). Preparaty do pozajelitowego podawania mogą zawierać jako wspólne zaróbki sterylną wodę lub solankę, poli(glikole alkilenowe) takie jak poli(glikol etylenowy), oleje roślinne, uwodorniane naftaleny i tym podobne. W szczególności, biokompatybilny, biodegradujący polimer laktydowy, kopolimer laktydowy/glikolidowy, lub kopolimery polioksyetylenowopolioksypropylenowe mogą być przydatnymi zaróbkami do kontrolowania uwalniania związków czynnych. Inne potencjalnie przydatne układy dostarczania pozajelitowego dla tych związków czynnych obejmują cząstki kopolimeru etylen-octan winylu, pompy osmotyczne, implantowane układy infuzyjne i liposomy. Preparaty do podawania inhalacyjnego zawierają jako zaróbki, np., laktozę, lub mogą być roztworami wodnymi zawierającymi, np., eter polioksyetyleno-9-laurylowy, glikocholan i dezoksycholan, lub olejowymi roztworami do podawania w postaci kropli do nosa, lub jako żel do wprowadzania do nosa. Preparaty do podawania pozajelitowego mogą także obejmować glikocholany do podawania policzkowego, salicylan do podawania doodbytniczego lub kwas cytrynowy do podawania dopochwowego. Preparaty na plastry przezskórne są korzystnie emulsjami lipofilowymi.

Związki według wynalazku można stosować jako jedyny środek czynny w kompozycji farmaceutycznej. Alternatywnie, można je stosować w kombinacji z innymi składnikami czynnymi, np., innymi czynnikami wzrostu, które ułatwiają przetrwanie neuronów lub regenerację aksonów w chorobach lub zaburzeniach.

Związek o wzorze I i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole można podawać doustnie lub inaczej, np., jako maść lub iniekcję. Stężenia związków według wynalazku w terapeutycznej kompozycji może się zmieniać. Stężenie będzie zależało od czynników, takich jak łączna dawka podawanego leku, chemiczna charakterystyka (np., hydrofobowość) stosowanych związków, drogę podawania, wiek, masę ciała i objawy pacjenta, itp. Związki według wynalazku typowo dostarcza się w wodnym roztworze fizjologicznym buforu zawierającym około 0,1 do 10% wag./obj. związku do pozajelitowego podawania. Typowe zakresy dawek wynoszą od około 1 ng/kg do około 1 g/kg masy ciała dziennie; korzystnym zakresem dawek jest od około 0,01 mg/kg do 100 mg/kg masy ciała dziennie i korzystnie około 0,1 do 20 mg/kg raz do czterech razy dziennie. Korzystne dawkowanie podawanego leku może zależeć od zmiennych takich jak typ i rozmiar postępów choroby lub zaburzenia, całkowity stan zdrowia danego pacjenta, względna biologiczna skuteczność związku wybranego i kompozycji zaróbki związku oraz drogi podawania.

Związki o wzorze I i farmaceutycznie dopuszczalne sole można podawać same, lub w postaci różnych kompozycji farmaceutyczne, w zależności od farmakologicznej aktywności i celu podawania. Kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku można wytwarzać jednorodnie mieszając skuteczną ilość związku o wzorze I lub farmaceutycznie jego dopuszczalnej soli, jako składnika czynnego, z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Nośnik może przybierać wiele form odpowiednio

PL 198 434 B1 do formy kompozycji odpowiedniej do podawania. Pożądane jest, aby takie kompozycje farmaceutyczne wytwarzać w postaci dawki jednostkowej odpowiedniej do doustnego lub innego niż doustne podawania. Postaci do innego niż doustne podawania obejmują maści i iniekcje.

Tabletki można wytwarzać stosując zaróbki, takie jak laktoza, glukoza, sacharoza, mannitol i metyloceluloza, środki dezintegrujące, takie jak skrobia, alginian sodu, karboksymetyloceluloza wapniowa i krystaliczna celuloza, środki smarujące, takie jak stearynian magnezu i talk, środki wiążące, takie jak żelatyna, poli(alkohol winylowy), poliwinylopirolidon, hydroksypropyloceluloza i metyloceluloza, surfaktanty, takie jak ester kwasu tłuszczowego sacharozy i ester kwasu tłuszczowego sorbitolu i tym podobne, w konwencjonalny sposób. Korzystnie każda tabletka zawiera 15-300 mg składnika czynnego.

Granulki można wytwarzać stosując zaróbki, takie jak laktoza i sacharoza, środki dezintegrujące, takie jak skrobia, środki wiążące, takie jak żelatyna i tym podobne, w konwencjonalny sposób. Proszki można wytwarzać stosując zaróbki, takie jak laktoza i mannitol i tym podobne w konwencjonalny sposób. Kapsułki można wytwarzać stosując żelatynę, wodę, sacharozę, gumę arabską, sorbitol, glicerynę, krystaliczną celulozę, stearynian magnezu, talk i tym podobne w konwencjonalny sposób. Korzystnie każda kapsułka zawiera 15-300 mg składnika czynnego.

Preparaty syropowe można wytwarzać stosując cukry, takie jak sacharoza, woda, etanol i tym podobne w konwencjonalny sposób.

Maść można wytwarzać stosując podstawy maści, takie jak wazelina, ciekła parafina, lanolina i makrogol, emulgatory, takie jak laurylomleczan sodu, chlorek benzalkoniowy, ester kwasu monotłuszczowego sorbitanu, karboksymetyloceluloza sodowa i guma arabska, i tym podobne w konwencjonalny sposób.

Preparaty do iniekcji można wytwarzać stosując rozpuszczalniki, takie jak wodę, solankę fizjologiczną, oleje roślinne (np., oliwę i olej arachidowy), oleinian etylu i glikol propylenowy, środki solubilizujące, takie jak benzoesan sodu, salicylan sodu i uretan, środki izotonizujące, takie jak chlorek sodu i glukozę, konserwanty, takie jak fenol, krezol, ester p-hydroksybenzoesowy i chlorobutanol, przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy i pirosiarczyn sodu i tym podobne w konwencjonalny sposób.

Wynalazek zilustrowano poniżej następującymi przykładami, które mają wyjaśniać wynalazek. Te przykłady nie mają, i nie powinny być interpretowane, jako ograniczenia zakresu ujawnienia.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

Inhibicja aktywności kinazy tyrozyny trkA

Wybrane mostkowane związki indenopirolokarbazolowe testowano na ich zdolność do inhibicji aktywności kinazy domeny ludzkiej cytoplazmatycznej trkA w ekspresji bakulowirusowej z użyciem oparty na ELISA test, jak opisano wcześniej (Angeles i in., Anal. Biochem. 236: 49-55, 1996). W skrócie, 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania powleczono roztworem substratu (białko fuzyjne S-transferazy C-y1/glutationu rekombinacyjnej ludzkiej fosfolipazy (Rotin i in., EMBO J., 11: 559-567, 1992). Badania inhibicji przeprowadzono w 100 ąl mieszankach testowych zawierających 50 mM Hepes, pH 7,4, 40 ąM ATP, 10 mM MnCL, 0,1% BSA, 2% DMSO i różne stężenia inhibitora. Reakcję zainicjowano dodając kinazę trkA i pozostawiając na 15 minut w temperaturze 37°C. Następnie dodano przeciwciało wobec fosfotyrozyny (UBI), z kolei drugorzędowe sprzężone z enzymem przeciwciało, znakowane alkaliczną fosfatazą kozia anty-mysia IgG (Bio-Rad). Aktywność związanego enzymu mierzono przez wzmacniany układ wykrywania (Gibco-BRL). Dane inhibicji zanalizowano stosując esowate równanie dawka odpowiedź (zmienne nachylenie) w GraphPad Prism. Stężenie powodujące 50% inhibicję aktywności kinazy określono jako „IC₅₀. Wyniki podsumowano w tabeli 2.

T a b e l a 2

Działanie inhibicyjne mostkowanych związków indenopirolokarbazolowych na aktywność kinazy trkA

Związek nr	trkA (% inhibicji przy 300 nM) IC50, nM
1	2
II-1	13
II-2	20
II-3	9

PL 198 434 B1 cd. tabeli 2

1	2
II-4a	76
Il-4b	16
II-5	72
II-6	6
II-7a	11
II-7b	5
II-8	254
II-9	(34)
II-10	(17)
II-11	121
II-12	17
II-14a	14
II-14b	242

P r z y k ł a d 2

Inhibicji stymulowanej NGF fosforylacji trk w preparacie pełnych komórek

Inhibicję stymulowanej NGF fosforylacji trk przez wybrane mostkowane związki indenopirolokarbazolowe przeprowadzono stosując zmodyfikowaną procedurę, jak opisano poniżej, w porównaniu z wcześniej opisaną (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5516771). Komórki NIH3T3 transfekowane trkA hodowano na 100 mm szalkach. Komórki tuż przed zlaniem pozbawiono surowicy zastępując pożywkę wolnym od surowicy 0,05% BSA-DMEM zawierającym związek (100 nM i 1 ąM) lub DMSO (dodawany do kontrolnych) na jedną godzinę w temperaturze 31°C. Następnie dodano do komórek NGF (Harlan/Bioproducts for Science) w stężeniu 10 ng/ml w ciągu 5 minut. Komórki poddano lizie w buforze zawierającym detergent i inhibitory proteazy. Sklarowane lizaty komórek znormalizowano na białko stosując metodę BCA i immunoprecypitowano przeciwciałem anty-trk. Poliklonalne przeciwciało anty-trk wytworzono wobec peptydu odpowiadającemu 14 aminokwasom na końcu karboksylowym trk (Martin-Zanca i in., Mol. Cell. Biol. 9: 24-33, 1989). Immunokompleksy zebrano na kulkach Protein A Sepharose (Sigma Chem. Co., St. Lois, MO), oddzielono metodą elektroforezy na żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE) i przeniesiono na membranę z poli(difluorku winylidenu) (PVDF). Membranę poddano hybrydyzacji z anty-fosfotyrozynowym przeciwciałem (UBI), następnie inkubowano ze sprzężoną z peroksydazą chrzanu kozią anty-mysią IgG (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Fosforylowane białka uwidoczniono stosując ECL (Amersham Lite Science, Inc., Arlington Heights, ID). Pole pasma białka trk zmierzono i porównano ze stymulowaną NGF kontrolą. Użyty system oceny inhibicji, oparty na procentowym zmniejszeniu pasma białka trk, był następujący: 0 = brak spadku; 1 = 1-25%; 2 = 26-49%; 3 = 50-75%; 4 = 76-100%. Wyniki pokazano poniżej w tabeli 3.

T a b e l a 3

Wpływ mostkowanych związków indenopirolokarbazolowych na stymulowaną NGF fosforylację trkA w komórkach NIh3t3

	Ocena inhibicji
Związek nr	przy 100 nM	przy 1000 nM
1	2	3
II-1	3	4
II-3	1	4

PL 198 434 B1 cd. tabeli 3

1	2	3
II-4b	0	2
II-6	4	4
II-7a	3	4
II-7b	3	4

P r z y k ł a d 3

Inhibicja aktywności kinazy receptora czynnika wzrostu naczyniowych komórek śródbłonka Mostkowane związki indenopirolokarbazolowe zbadano na ich działanie inhibicyjne na aktywność kinazy poddanej ekspresji bakulowirusowej domeny kinazy receptora VEGF (ludzki flk-1, KDR, VEGFR2) stosując procedurę opisaną dla próby ELISA kinazy trkA opisaną powyżej. Kinazową mieszaninę reakcyjną, obejmującą 50 mM Hepes, pH 7,4, 40 μΜ ATP, 10 mM MnCh, 0,1% BSA, 2% DMSO i różne stężenia inhibitora, przeniesiono na płytki pokryte PLC-y/GST. Dodano kinazę VEGFR i reakcji pozwolono przebiegać przez 15 minut w temperaturze 37°C. Detekcję fosforylowanego produktu przeprowadzono metodą dodania anty-fosfotyrozynowego przeciwciała (UBI). Drugorzędowe sprzężone z enzymem przeciwciało dodano dla schwytania kompleksu przeciwciało-fosforylowany PLC-y/GST. Aktywność związanego enzymu zmierzono wzmacnianym systemem detekcji (GibcoBRL). Dane inhibicji zanalizowano stosując esowate równanie dawka-odpowiedź (zmienne nachylenie) w GraphPad Prism. Wyniki podsumowano w tabeli 4.

T a b e l a 4

Działanie inhibicyjne mostkowanych związków indenopirolokarbazolowych na aktywność kinazy receptora VEGf

Związek nr	Kinaza VEGFR (% inhibicji przy 300 nM) IC50, nM
1	2
II-1	30
II-1b	67
II-2	>10000
II-3	71
II-4a	17
II-4b	184
II-5	398
II-6	9
II-7a	87
II-7b	260
II-8	26
II-9	318
II-10	601
II-11	205
II-12	20
II-13	8

PL 198 434 B1 cd. tabeli 4

1	2
II-14a	32
II-14b	538
II-15	25
II-16a	43
II-16b	57

P r z y k ł a d 4

Inhibicja aktywności kinazy białkowej C

Aktywność kinazy białkowej C określono stosując test płytkowy Millipore Multiscreen TCA, jak opisuje Pitt, A.M. i Lee C. (J. Biomol. Screening, 1: 47-51, 1996). Testy przeprowadzono w 96-dołkowych płytkach Multiscreen-DP (Millipore). Każdą 40 ml mieszaniny testowej zawierała 20 mM Hepes, pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 2,5 mM EGTA, 2,5 mM CaCl₂, 80 mg/ml fosfatydyloseryny, 3,2 mg/ml dioleiny, 200 mg/ml histonu H-1 (Fluka), 5 mM [γ-³²Ρ]ΑΤΡ, 1,5 ng kinazy białkowej C (UBI; mieszane izozymy a, b, g), 0,1% BSA, 2% DMSO i testowany mostkowany skondensowany związek pirolokarbazolowy. Reakcji pozwolono przebiegać przez 10 minut w temperaturze 37°C, następnie zatrzymano dodając lodowaty 50% kwas trichlorooctowy. Płytki pozostawiono do zrównoważenia przez 30 minut w temperaturze 4°C, następnie przemyto lodowatym 25% TCA. Do płytki dodano cocktail scyntylacyjny i radioaktywność określono stosując licznik scyntylacji Wallac MicroBeta 1450 PLUS. Wartości IC₅₀ obliczono dopasowując dane do esowatego równania dawka odpowiedź (zmienne nachylenie) w GraphPad Prism. Wyniki podsumowano w tabeli 5.

T a b e l a 5

Działanie inhibicyjne mostkowanych związków indenopirolokarbazolowych na aktywność kinazy białkowej C

Związek nr	PKC (% inhibicji przy 1 pM) IC50, nM)
1	2
II-1	1300
II-2	(-9)
II-3	(23)
II-4a	(18)
II-4b	(28)
II-5	(37)
II-6	221
Il-7a	696
Il-7b	568
II-8	1078
II-9	(5)
II-10	(5)
II-11	(19)
II-12	518
II-13	576

PL 198 434 B1 cd. tabeli 5

1	2
II-14a	126
II-14b	1239
II-15	(02)
II-16a	46

P r z y k ł a d 5

Inhibicja aktywności kinazy receptora czynnika wzrostu z płytek krwi

Mostkowane związki indenopirolokarbazolowe zbadano na ich działanie inhibicyjne na aktywność poddanej ekspresji bakulowirusowej domeny kinazy receptora PDGF3 stosując test ELISA kinazy trkA opisany powyżej. Testy przeprowadzono w powleczonych substratem (PLC-y/GST) 96-dołkowej płytkach do mikromiareczkowania. Każde 100 pl mieszaniny reakcyjnej zawierało 50 mM HEPES, pH 7,4, 20 pM ATP, 10 mM MnCh, 0,1% BSA, 2% DMSO i różne stężenia inhibitora. Reakcję rozpoczęto dodając prefosforylowany rekombinacyjny ludzki enzym (10 ng/ml PDGF3-P) i pozwolono jej przebiegać przez 15 minut w temperaturze 37°C. Prefosforylowany enzym wytworzono przed użyciem przez inkubację kinazy w buforze zawierającym 20 pM ATP i 10 mM MnCh przez 1 godzinę w temperaturze 4°C. Detekcji fosforylowanego produktu dokonano dodając anty-fosfotyrozynowe przeciwciało (UBI) sprzężone z peroksydazą chrzanu (HRP). Dodano później roztwór substratu HRP zawierający 3,3'-5,5'-tetrametylobenzydynę i nadtlenek wodoru i płytki inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano kwasem i powstałą absorbancję odczytano przy 450 nm stosując czytnik Microplate Bio-kinetics (Bio-Tek 5 Instrument EL 312e). Dane inhibicji zanalizowano stosując esowate równanie dawka-odpowiedź (zmienne nachylenie) w GraphPad Prism. Wyniki podsumowano w tabeli 6.

T a b e l a 6

Działanie inhibicyjne na PDGFR mostkowanych związków indenopirolokarbazolowych

Związek nr	PDGFR (% inhibicji przy 1 pM) IC50, nM
	I-1	1383
	I-2	(7)
	I-3	(28)
	I-4a	(0)
	I-4b	(17)
	I-5	1076
	I-6	96
	I-7a	(36)
	I-7b	(34)
	I-8	(15)
	I-9	(24)
	I-10	(23)
	I-11	(15)
	I-12	125
	I-13	1229
	I-14a	81
	I-14b	1406

PL 198 434 B1

P r z y k ł a d 6

Polepszenie aktywności ChAT rdzenia kręgowego

Jak przedyskutowano wcześniej, ChAT jest specyficznym biochemicznym znacznikiem dla funkcjonalnych neuronów cholinergicznych. Neurony cholinergiczne są głównym cholinergicznym wkładem do tworzenia hippokampa, jądra węchowego, jądra międzykonarowego, kory, migdałków i części wzgórza wzrokowego. W rdzeniu kręgowym motoryczne neurony są neuronami cholinergicznymi, które zawierają ChAT (Phelps i in., J. Comp. Neurol. 273:459-472 (1988)). Aktywność ChAT zastosowano do zbadania wpływu neurotrofin (np. NGF lub NT-3) na przetrwanie i/lub funkcję neuronów cholinergicznych. Test ChAT służy także jako wskaźnik regulacji poziomów ChAT w neuronach cholinergicznych.

Mostkowane związki indenopirolokarbazolowe zwiększały aktywność ChAT w teście kultury dysocjowanego embrionalnego rdzenia kręgowego szczura (tabela 7). Np., w tych testach, związek bezpośrednio dodano do kultury dysocjowanego rdzenia kręgowego. Związki zwiększające aktywność ChAT o co najmniej 120% względem aktywności kontroli uważano za aktywne. Wyniki podsumowano w tabeli 7.

T a b e l a 7

Polepszenie aktywności ChAT rdzenia kręgowego przez mostkowane związki indenopirolokarbazolowe

ChAT rdzenia kręgowego, % kontroli
Związek nr	Aktywność przy 30 nM	Maksymalna aktywność
II-1	114	139 przy 300 nM

Metodyka: Komórki płodowe rdzenia kręgowego szczura dysocjowano i doświadczenia przeprowadzono jak opisano (Smith i in., J. Cell Biology 101:1608-1621 (1985); Glicksman i in., J. Neurochem. 61:210-221 (1993)). Dysocjowane komórki wytworzono z rdzeni kręgowych wyciętych szczurom (dzień embrionalny 14-15) metodą standardowej trypsynowej dysocjacji (Smith i in., powyżej). Komórki umieszczono na płytkach przy 6x 10⁵ komórek/cm² na powlekanych poli-1-ornityną plastykowych dołkach do kultur tkankowych w wolnej od surowicy pożywce N2 uzupełnionej 0,05% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) (Bottenstein i in., PNAS USA 76:514-517 (1979)). Kultury inkubowano w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze 5% CO2/95% powietrza przez 48 godzin. Aktywność ChAT zmierzono po 2 dniach in vitro stosując modyfikację procedury Fonnuma (Fonnum, J. Neurochem. 24:407-409 (1975)) według McManamana i in. i Glicksmana i in. (McManaman i in., Developmental Biology 125:311-320 (1988); Glicksman i in., J. Neurochem., supra).

Związki o wzorze II opisane w przykładach wymieniono w tabeli 8. Wartości P¹, R⁴, R⁶ i R⁷ to H; Y oznacza O a n wynosi 1.

II

T a b e l a 8

Związek nr	A1A2	B1B2	R2	R3	R5	Rs	Z	m
1	2	3	4	5	6	7	8	9
II-1	H, H	O	H	H	H	H	wiązanie	1
Il-1b	H, H	O	H	H	H	H	wiązanie	1

PL 198 434 B1 cd. tabeli 8

1	2	3	4	5	6	7	8	9
II-2	H, H	O	Et	H	H	H	wiązanie	1
II-3	H, H	O	H	H	H	Me	wiązanie	1
II-4a	H, H	O	H	H	H	Me	wiązanie	2
II-4b	H, H	O	H	H	H	Me	wiązanie	2
II-5	H, H	O	H	3-Br	H	Me	wiązanie	1
II-6	H, H	O	H	H	10-OMe	H	wiązanie	1
II-7a	H, H	O	H	H	H	Me	O	1
II-7b	H, H	O	H	H	H	Me	O	1
II-8	O	H, H	H	H	H	H	wiązanie	1
II-9	H, H	O	H	3-(3'-NH2-Ph)	H	H	wiązanie	1
II-10	O	O	OH	H	H	H	wiązanie	1
II-11	H, H	O	H	H	H	CO2-Et	wiązanie	1
II-12	H, H	O	H	H	H	CH2-OH	wiązanie	1
II-13	H, H	O	H	H	9-OMe	H	wiązanie	1
II-14a	H, H	O	H	H	H	H	wiązanie	1
II-14b	H, H	O	H	H	H	H	wiązanie	1
II-15	H, H	O	H	3-CH2O- CH2OEt	H	H	wiązanie	1
II-16a	H, H	O	H	H	H	H	O	1
II-16b	H, H	O	H	H	H	H	O	1

Ogólny opis syntetycznych procesów i przykładów

Ogólną drogę syntezy wykorzystaną do wytwarzania mostkowanych indenopirolokarbazoli według wynalazku pokazano na fig. 1 i 2. Ogólne procedury syntezy indenopirolokarbazoli (III)/(VIII) może przeprowadzić jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5705511, dołączanym niniejszym w całości jako odnośnik. Gdy R¹ oznacza H, azot laktamowy indenopirolokarbazolu (III)/(VIII) zabezpiecza się odpowiednią grupą zabezpieczającą otrzymując (IV)/(IX). Zabezpieczone związki traktuje się odpowiednią zasadą w bezwodnym organicznym rozpuszczalniku(ach), co daje ciemnoczerwony roztwór, co jest powodowane obecnością karbanionu. Reakcja karbanionu z dwufunkcjonalnym reagentem (V) daje elektrofilową addycję do wiązania C=Y (V) prowadząc do początkowego związku pośredniego (VI)/(X). Potraktowanie związku pośredniego(ich) (VI) (X) i/lub (VII)/(XI) kwasem sulfonowym lub kwasem Lewisa, np. eteratem trifluorku boru, daje mostkowany indenopirolokarbazol (I)/(II).

Strategię zabezpieczania azotu laktamowego (pokazaną na fig. 3 i 4) można realizować w procesie katalizowanym kwasem lub zasadą. Katalizowaną kwasem reakcję można prowadzić ze związanym z żywicą reagentem pozwalającym na unieruchomienie indenopirolokarbazolu (III)/(VIII) na nośniku polimerycznym, takim jak oparta na polistyrenie kwasowa żywica Rink (XII) (fig. 3), otrzymując (XIII). Alternatywnie, katalizowaną kwasem reakcję można prowadzić z rozpuszczalnym reagentem z wytworzeniem związku (XIV) (fig. 4). Zabezpieczony sililem związek (XV) wytwarza się w warunkach zasadowej katalizy (fig. 4).

Figura 5 opisuje kilku sposobów wytwarzania związku pośredniego (V). Procedura (a) opisuje transformacje różnych acetali (XVI) do (XVII, Z=wiązanie). Np., ester-acetal/ketal (XVI, D = COOR)

PL 198 434 B1 redukuje się całkowicie do odpowiedniego alkoholu i następnie utlenia (np., utlenianie Swerna lub Dess-Martina) ^do aWetiyido-acetakkketakj (Χ^Η R⁸ = H). A^|terna^tywnⁱe^, ester-aceta^e^ (XVL D = COOR) częściowo redukuje się DIBAL z wytworzeniem aldehydu (XVII, r8 = H) bezpośrednio. Podobnie, redukcja nrtryto-aceta^ (^XVI D = CN) DBAŁ ^daje akletyd (^XVIh ^r8 = ^H). Keto-acetate/tetate wywarza s^ię przez dodanie reagentów Grignarda do amido-acetalu/ketalu Weinreba (XVI, D = CON(OMe)Me).

Związek pośredni (XVII, Z=wiązanie) można także otrzymać w dwuetapowej procedurze wyjaśnionej w procedurze (b). Dodanie reagentu metaloorganicznego (XIX) do acetalu/ketalu (XVIII) daje alken (XX), który po ozonolizie i przetwarzaniu redukcyjnym daje keto-acetal/ketal (XVII). Wytwarzanie związku pośredniego (XVII, Z = heteroatom) w dwuetapowej procedurze wyjaśniono w procedurze (c). Sprzęganie acetalu (XXII) z alkenem (XXI), następnie ozonoliza (z przetwarzaniem redukującym) powstałego alkenu daje keto-acetal/ketal (XVII). Alternatywnie, związek pośredni (XVII, Z = heteroatom) wytwarza się w dwuetapowej procedurze wyjaśniono w procedurze (d). Reakcja związku (XXIV) z acetalem/ketalem (XVIII) daje (XXV), który przetwarza się w keto-acetal/ketal (XVII) sposobami opisanymi w procedurze (a). Kondensacja keto-acetalu/ketalu (XVII) z hydroksyloaminami, hydrazynami, N-alkilo-N-alkoksyaminami i aminami daje związek pośredni (XXVI) niosący elektrofilową grupę funkcyjną C=N.

Związany z żywicą indenopirolokarbazol (XIII) [fig. 6, sposób A] traktuje się nadmiarem reagentu Grignarda jako zasadą, co wytwarza ciemnoczerwony roztwór karbanionu. Dalsza reakcja z (V) daje produkty pochodzące z addycji elektrofilowej do grupy C=Y. Przetworzenie wodą i odcięcie produktów) rozcieńczonym kwasem (1% TFA w chlorku metylenu) z żywicy powoduje wydzielenie związku(ów) (XXVII) i/lub (XXVIII). Potraktowanie związku pośredniego(ich) (XXVII) i/lub (XXVIII) kwasem sulfonowym lub kwasem Lewisa, np. eteratem trifluorku boru, daje mostkowany indenopirolokarbazol (II).

Podobną strategię stosuje się do reakcji rozpuszczalnego zabezpieczonego laktamem związku pośredniego, np. (XV) (fig. 7, sposób B). Jednakże w tym przypadku związek pośredni (XV) traktuje się Tritonem B w pirydynie jako zasadzie zamiast reagencie Grignarda. Związek pośredni(e) (XXIX) i/lub (XXX) można wydzielać z nietkniętą zabezpieczającą grupą laktamową, i poddawać chromatograficznemu oczyszczaniu. Jak w sposobie A, (fig. 6), potraktowanie kwasem Lewisa (takim jak eterat trifluorku boru) daje mostkowany indenopirolokarbazol (II), gdzie R¹=E.

Wprowadzenia grup R³, R⁴, R5 i R⁶ można dokonać jak opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5705511 i 4923986, których ujawnienia dołącza się niniejszym w całości jako odnośniki. Podstawnik r3 można inaczej wprowadzić po skonstruowaniu mostkowanych indenopirolokarbazoli, jak pokazano na fig. 8. Pozycje 3 pierścienia B bromuje się związkiem dostarczającym NBS (XXXI). Węglowy fragment wprowadza się następnie wykorzystując katalizowane palladem reakcje Stille, Suzuki, Hecka, Kumady lub Castro-Stephensa z wytworzeniem związków typu (XXXII), (XXXIII), itp. Ponadto, związek (XXXI) może dać dostęp do związków, w których grupa bromu jest zastępowana heteroatomem, np. opartą na aminie grupą przez wykorzystanie katalizowanego palladem aminowania Buchwalda.

W procesie utleniania związaną tlenem grupę można wprowadzić na węglu indenowym pierścienia E, jak pokazano na fig. 9, związek (XXXIV). Te reakcje chemiczne powodują także utlenianie grupy metylenowej laktamu (pierścień A) dając pochodną imidu, jak to pokazano.

P r z y k ł a d 7

Wytwarzanie związanych z żywicą Rinka związków pośrednich: (XIII-A), (XIII-B) i (XIII-C) (fig. 3)

P r z y k ł a d 7-A

Trójszyjną kolbę okrągłodenną wyposażoną w górne mieszadło mechaniczne i pułapkę Deana-Starka kolejno napełniono kwasową żywicą Rink XII (10,00 g, 0,64 mmol/g), 1-metylo-2-pyrolidynonem (⁸⁰ m^ ^benzenem (³⁵⁰ m^ Vlll-^A [^A1,A2=H ^r3=^r4=^r5=^r6=^h] (^{3,00 g}) ^{i k}wasem p-toluenosulfonowym (1,00 g). Mieszaninę reakcyjną ogrzano do refluksu przez 20 godzin i następnie przesączono. Żywicę przemyto THF (5x 175 ml) i przesącz odstawiono. Żywicę następnie kolejno przemyto DMSO (4 x 100 ml), 2% wodnym roztworem NaHCO3 (4 x 100 ml), wodą (4 x 100 ml), DMSO (2 x 200 ml), THF (4 x 100 ml) i octanem etylu (4 x 100 ml). Żywicę osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem (24 godzin) otrzymując 11,70 (0,47 mmol/g) związanego z żywicą VIII-A (XIII-A).

Początkowe popłuczyny THF odparowano, pozostałość rozcieńczono wodą (750 ml) i powstały osad przesączono i kolejno przemyto wodą, 2% wodnym roztworem NaHCO3 (4 x 100 ml) i wodą (4 x 100 ml). Po osuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem odzyskano VIII-A (1,28 g).

PL 198 434 B1

P r z y k ł a d 7-B

W podobn^y sposób, VIII-B [A1,A2=O, B¹,B²=H2, R³=R⁴=R⁵=R⁶=H], (0,5 g) sprzężono z ^kwasową żywicą Rink XII (1,52 g) z wytworzeniem 1,58 g związanego z żywicą VIII-B, (XIII-B).

P r z y k ł a d 7-C ^{W p}o^do^bn^y sposób, ^VIII-C [a^1,A2=^H2, ^b1,B²=^o, ^r3=^r4=^r5=^h, ^R6=¹⁰-^OMeL (^{1,02 g}) s^prz^ężono z kwasową żywicą Rink XII (3,12 g) z wytworzeniem 3,70 (0,46 mmol/g) związanego z żywicą związku VIII-C, (XIII-C) wraz z odzyskanym związkiem VIII-C (0,44 g).

P r z y k ł a d 8

Wytwarzanie związku (II-1), związku (II-2), związku (II-3), związku (II-4a), związku (II-4b), związku (II-6) i związku (II-8). [sposób A, fig. 6]

P r z y k ł a d 8-A

Do zawiesiny (XIII-A), (1,25 g) w THF (24 ml) dodano 1,0 M roztwór EtMgBr (6,25 ml w THF) i mieszaninę mieszano przez godzinę przed dodaniem HMPA (5,0 ml). Po wymieszaniu przez 10 minut dodano dietoksybutyroaldehyd (3,0 g) [który wytworzono zgodnie z literaturową procedurą, Paquette, L. A., Backhaus, D., Braum, R., Underiner, T. L. i Fuchs, K. J. Am. Chem. Soc. 1997, 225, 966271], i mieszaninę mieszano przez 20 godzin. Reakcję zalano 10% wodnym roztworem NH4Cl (5 ml) i przesączono. Żywicę kolejno przemyto 10% wodnym roztworem NH4Cl (3 x 10 ml), wodą (3 x 10 ml), THF (3 x 10 ml), DMF (3 x 10 ml), wodą (3 x 10 ml), THF (3 x 10 ml) i eterem (3 x 10 ml). Żywicę osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, rozpuszczono w chlorku metylenu (15 ml) i potraktowano kwasem trifluorooctowym (0,15 ml). Po wymieszaniu przez godzinę, mieszaninę przesączono i przesącz odparowano. Powstałą pozostałość rozpuszczono w chlorku metylenu (20 ml) i potraktowano tosylanem pirydyniowym (50 mg) i powstały roztwór mieszano przez 4 godziny. Po tym czasie mieszaninę przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i solanką i osuszono nad MgSO4. Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej HPLC (Zorbax RX-8, 4 x 25 cm, eluowano 60% MeCN/wodą/0,1% kwasem trifluorooctowym). Odpowiednie frakcje zobojętniono NaHCO3 i ekstrahowano do chlorku metylenu (3 x 50 ml) i osuszono nad MgSO4. Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano 70,2 mg związku II-1 jako białego proszku, który miał następujące cechy: ⁵C NMR (DMSO-d6) δ 171.8, 143,3, 142,4, 141,4, 140,1, 140,0, 136,6, 129,2, 127.9, 127,4, 127,1, 126,8, 124,1 (2C), 122,7, 121,6, 121,5, 118,3, 112,1, 88,1, 79,2, 56,6, 45,6, 33,4, 24,8, ¹H NMR (DMSO-d6) δ 9,21 (d, J = 7,5, 1H), 8,62 (s, 1H), 7,98 (d, J = 7,7, 1H), 7,86 (d, J = 8,3, 1H), 7,71 (d, J = 7,3, 1H), 7,49 (dd, J = 7,9, 7,4, 1H), 7,41 (dd, J =7,5, 7,4, 1H), 7,36 - 7,27 (m, 2H), 6,86 (d, J = 6,0, 1H), 5,63 - 5,58 (m, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,53 (d, J = 3,3, 1H), 2,23 - 2,14 (m, 1H), 1,96 - 1,92 (m, 1H), 0,96 - 0,88 (m, 1H), 0,60 - 0,57 (m, 1H); MS m/z (M+H) obliczone 379, obserwowane 379.

Wydzielono także metodą preparatywnej HPLC z tej mieszaniny reakcyjnej produktów związek ^II-² (^0,5 m^g) ^któr^y mⁱa^ł nas^tępuj^ące cec^hy: ^{1h nmr} (D^MSO-^d6) ^{δ 9,17} (d, ^J = 8,1, W), ^8,62 (s, W), 7,98 (d, J = 7,0, 1H), 7,85 (d, J = 6,8, 1H), 7,57 (d, J = 6,8, 1H), 7,49 (dd, J = 7,9, 7,4, 1H), 7,44 - 7,26 (m, 3H), 6,81 (d, J = 6,0, 1H), 5,43 - 5,33 (m, 1H), 4,43 (s, 2H), 2,23 - 2,14 (m, 1H), 1,96 - 1,92 (m, 1H), 1,45 - 1,55 (m, 2H), 0,96 - 0,88 (m, 1H), 0,60 - 0,57 (m, 1H), 0,29 (t, J = 7,0, 3H); MS m/z (M+H) obliczone 407, obserwowane 407.

P r z y k ł a d 8-B

W podobny sposób, jak opisano powyżej dla związku II-1, żywicę (XIII-A) (70,3 mg) potraktowano 1,1-dietoksy-2-pentanonem (0,75 ml) [który wytworzono zgodnie z literaturową procedurą, Sworin, M. i Neuman, W. L. J. Org. Chem. 1988, 53, 4894-6], z wytworzeniem związku II-3 (3,5 mg), który wydzielono metodą preparatywnej TLC (żel krzemionkowy, z elucją 50% EtOAc/toluen) i który miał następujące właściwości: ¹H NMR (DMSO-d6) δ 9,42 (d, J = 8,2, 1H), 8,58 (s, 1H), 7,95 (d, J = 7,4, 1H), 7,79 (d, J = 8,3, 1H), 7,71 (d, J = 7,1), 7,50 - 7,20 (m, 4H), 6,81 (d, J = 5,9, 1H), 4,90 (s, 2H), 4,46 (s, 1H), 2,35 - 2,20 (m, 1H), 1,98 (s, 3H), 1,75 - 1,60 (m, 1H), 1,25 - 1,00 (m, 1H), 0,35 - 0,15 (m, 1H); MS m/z (M+H) obliczone 393, obserwowane 393.

P r z y k ł a d 8-C

W podobny sposób, (XIII-A) (74,3 mg) potraktowano 1,1-dietoksy-2-heksanonem [który wytworzono zgodnie z literaturową procedurą, Brenner, J. E., J. Org. Chem. 1961,26, 22-7] (0,75 ml) z wytworzeniem związku II-4a (2,10 mg) i związku II-4b (1,06 mg), które indywidualnie wydzielono metodą preparatywnej HPLC (Zorbax RX-8, 4 x 25 cm, 65% MeCN/woda/0,1% kwas trifluorooctowy). Związek ^II-⁴a mtoł nas^tępuj^ące wła^ściwo^ści: ¹IH ^NMR (D^MSO-^d6) ^{δ 9,30} (d, ^J = ^8,3 W), ^8,55 (s, W), ^7,97 (d, J = 7,2, 1H), 7,65 (d, J = 8,5, 1H), 7,59 (d, J = 7,5), 7,48 (dd, J = 7,8, 7,2, 1H) 7,39 - 7,15 (m, 3H), 6,31

PL 198 434 B1 (dd, J = 5,9, 5,5, 1H), 5,02 (s, 1H), 4,88 (s, 2H), 0,88 (s, 3H), inne alifatyczne sygnały utracone pod pikami rozpuszczalnika; MS m/z (M+H) obliczone 407, obserwowane 407. Związek II-4b miał następujące właściwości: ¹H NMR (DMSO-d_s) δ 9,43 (d, J = 8,1, 1H), 8,59 (s, 1H), 7,99 (d, J = 7,3, 1H), 7,75 - 7,65 (m, 2H), 7,49 (dd, J = 7,0, 6,4, 1H), 7,43 (dd, J = 8,2, 8,1, 1H), 7,36 - 7,25 (m, 2H), 6,75 (s, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,50 (s, 1H), 1,95 (s, 3H), inne alifatyczne sygnały utracone pod pikami rozpuszczalnika; MS m/z (M+H) obliczone 407, obserwowane 407.

P r z y k ł a d 8-D

W podobny sposób, (XIII-C) (1,00 g) potraktowano dietoksybutyroaldehydem (3,65 g) z wytworzeniem związku II-6 (87,8 mg), który wydzielono metodą preparatywnej HPLC (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, 65% MeCN/woda/0,1% kwas trifluorooctowy) i który miał następujące właściwości: ¹H NMR (DMSO-d6) δ 9,09 (d, J = 8,6, 1H), 8,60 (s, 1H), 7,95 (d, J = 7,4, 1H), 7,84 (d, J = 8,3, 1H), 7,47 (dd, J = 7,2, 7,0, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,29 (dd, J = 7,0, 7,0, 1H), 6,98 (dd, J = 8,6, 1,9, 1H), 6,83 (d, J = 6,0, 1H), 5,65 - 5,55 (m, 1H), 4,88 (s, 2H), 4,48 (d, J = 3,9, 1H), 3,82 (s, 3H), 2,25 - 2,10 (m, 1H), 2,08 - 1,85 (m, 1H), 0,96 - 0,75 (m, 1H), 0,65 - 0,50 (m, 1H); MS m/z (M+Na) obliczone 431, obserwowane 431.

P r z y k ł a d 8-E

W podobny sposób, żywicę (XIII-B) (153,2 mg) potraktowano dietoksybutyroaldehydem (1,5 ml) z wytworzeniem związku II-8 (3,6 mg), który wydzielono metodą preparatywnej HPLC (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, 65% MeCN/woda/0,1% kwas trifluorooctowy) i który miał następujące właściwości: ¹H NMR (DMSO-d6) δ 9,09 (d, J = 7,9, 1H), 8,81 (s, 1H), 7,81 - 7,73 (m, 3H), 7,48 - 7,35 (m, 3H), 7,24 (dd, J = 7,6, 7,5, 1H), 6,85 (d, J = 6,2, 1H), 5,63 - 5,59 (m, 1H), 4,86 (s, 2H), 4,61 (d, J = 3,6, 1H), 3,82 (s, 3H), 2,21 - 2,13 (m, 1H), 1,96 - 1,90 (m, 1H), 0,87 - 0,79 (m, 1H), 0,61 - 0,56 (m, 1H); MS m/z (M+H) obliczone 379, obserwowane 379.

P r z y k ł a d 9

Wytwarzanie związku II-7a i związku II-7b (sposób A, fig. 6)

P r z y k ł a d 9-A

Wytwarzanie (1,1-dietoksyetoksy)aceton

Do zimnej (0°C) zawiesiny NaH (2,68 g, 60%) w THF (150 ml) dodano roztwór 1,1-dietoksyetanolu [który wytworzono zgodnie z literaturową procedurą, Zirkle, C. L. I in., J. Org. Chem. 1961,26, 395-407] (9,00 g) w THF (20 ml) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez godzinę przed dodaniem chlorku metallilu (8,0 ml). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano do refluksu przez noc, ochłodzono i przesączono przez warstwę celitu. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce obrotowej i pozostałość oczyszczono metodą kolumnowej chromatografii (krzemionka, 20% eter/heksan) z wytworzeniem eteru 1,1-dietoksyetylowo-metallilowego (11,5, 90%). Ozonoliza oziębionego (-30°C) roztworu tego eteru (6,00 g) w EtOAc (80 ml) prowadzono do zaniku substratu w TLC (1 godzina). Po tym czasie reakcję przedmuchano tlenem, potraktowano Pd(OH)2 (150 mg) i mieszano w atmosferze wodoru przez noc. Katalizator odsączono i przesącz zatężono w wyparce obrotowej. Powstałą pozostałość oczyszczono metodą kolumnowej chromatografii (krzemionka, 20% EtOAc/heksan) z wytworzeniem tytułowego związku (4,53 g, 82%).

P r z y k ł a d 9-B

Zgodnie ze sposobem A (fig. 6), żywicę (XIII-A) (230,2 mg) potraktowano EtMgBr (1,25 ml), następnie (1,1-dietoksyetoksy)acetonem (przykład 8-A) (1,2 ml). Po przetworzeniu i odcięciu z żywicy, część surowej mieszaniny produktowej (10,5 mg) rozpuszczono w chlorku metylenu (20 ml) i potraktowano eteratem BF3 (20 μΙ). Po wymieszaniu przez 2,5 godziny roztwór przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i solanką przed osuszeniem nad MgSO4. Po przesączeniu i usunięciu rozpuszczalnika powstałą pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej HPLC (Zorbax RX-8, 4 x 25 cm, 65% MeCN/woda/0,1% kwas trifluorooctowy) z wytworzeniem związku II-7a (2,34 mg) i związku II-7b (1,34 mg). Związek (II-7a) miał następujące właściwości: ¹H NMR (CDCh) δ 9,35 - 9,20 (m, 1H), 7,87 (d, J = 7,6, 1H), 7,62 (d, J = 7,0, 1H), 7,60 - 7,45 (m, 1H), 7,49 (dd, J = 7,7, 7,5, 1H), 7,40 (d, J = 8,1, 1H), 7,37 - 7,26 (m, 3H), 6,22 (s, 1H), 5,20 - 4,85 (m, 1H), 4,47 (s, 1H), 3,67 (d, J = 12,7, 1H), 3,52 (d, J = 11,8, 1H), 3,40 (d, J = 12,7, 1H), 3,38 (d, J = 11,8, 1H), 1,91 (s, 3H); MS m/z (M+H) obliczone 409, obserwowane 409. Związek II-7b miał następujące właściwości: ¹H NMR (CDCls) δ 9,58 - 9,22 (m, 1H), 7,82 (d, J = 7,4, 1H), 7,60 - 7,40 (m, 3H), 7,37 - 7,27 (m, 3H), 7,21 (d, J = 8,1, 1H), 5,81 (s, 1H), 5,21 (s, 1H), 5,10 - 4,80 (m, 1H), 4,59 (d, J = 13,5, 1H), 4,38 (dd, J = 13,5, 5,3, 1H), 4,21 (d, J = 13,1, 1H), 3,82 (d, J = 13,2, 1H), 1,13 (s, 3H); MS m/z (M+H) obliczone 409, obserwowane 409.

PL 198 434 B1

P r z y k ł a d 10

Wytwarzanie związku II-5 (fig. 8)

Do roztworu związku II-1 (8,1 mg) w THF (2 ml) dodano NBS (4,6 mg) i mieszaninę mieszano przez noc. Dodano jeszcze NBS (4,5 mg) i mieszaninę mieszano przez 2,5 godziny. Nierozpuszczalną substancję odsączono i przesącz zatężono w wyparce obrotowej. Powstałą pozostałość oczyszczono metodą kolumnowej chromatografii (C-18, 65% MeCN/woda/0,1% kwas trifluorooctowy). Odpowiednie frakcje zobojętniono NaHCO3 i ekstrahowano do chlorku metylenu (3 x 20 ml) i osuszono nad MgSO4. Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano związek II-5 (5,1 mg) jako biały proszek, który miał następujące cechy: ¹H NMR (DMSO-d6) δ 9,22 (d, J = 7,4, 1H), 8,67 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,86 (d, J = 8,7, 1H), 7,72 (d, J = 7,0, 1H), 7,63 (d, J = 7,8, 1H), 7,42 (dd, J = 7,5, 7,3, 1H), 7,35 (dd, J = 7,3, 7,2, 1H), 6,86 (d, J = 6,0, 1H), 5,63 - 5,58 (m, 1H), 4,94 (s, 2H), 4,54 (d, J = 3,1, 1H),

2,30 - 2,14 (m, 1H), 2,00 - 1,82 (m, 1H), 0,96 - 0,88 (m, 1) 0,62 - 0,50 (m, 1) MS m/z (M+H) obliczone 457/9 (1:1), obserwowane 457/9 (1:1).

P r z y k ł a d 11

Wytwarzanie związku pośredniego XV (fig. 4)

Do roztworu VIII-A [A^A^H², ^B1,B2=^{O, r3}=^r4=^r5=^r6=^h] (^{1,05 g}) w D^MF (²⁵ m^l) ^do^dano trietyloaminę (0,75 ml) i chlorek t-butylodimetylosililu (TBS-Cl) (0,65 g). Po wymieszaniu przez 3 godziny reakcję zatrzymano nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i ekstrahowano do EtOAc. Warstwę organiczną przemyto wodą i solanką i osuszono nad MgSO4. Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika powstałą pozostałość utarto eterem z wytworzeniem związku XV (848 mg). Popłuczyny odparowano pozostawiając pozostałość, którą oczyszczono metodą kolumnowej chromatografii (krzemionka, 1% EtOAc/CH-Cl·) i otrzymano dodatkowy produkt (502 mg, łączna wydajność 94%) o nas^tępuj^ąc^yc^h właściwościach s^pe^ktralnych: ^{1h nmr} (^DM^^^<^_f;) δ 11.94 (s, ^1H), 9,32 (d, ^J = 7,6, 1H), 8,03 (d, J = 7,7, 1H), 7,64 (d, J = 7,2, 1H), 7,58 (d, J = 8,1, 1H), 7,44 (dd, J = 7,7, 7,6, 1H), 7,39 (dd, J = 7,7, 7,6, 1H), 7,32 (d, J = 7,3, 1H), 7,25 (dd, J = 7,6, 7,3, 1H), 5,00 (s, 2H), 4,14 (s, 2H), 0,99 (s, 9H), 0,46 (s, 6H); MS m/z (M+H) obliczone 425, obserwowane 425.

P r z y k ł a d 12

Wytwarzanie związku II-1 sposobem B (fig. 7)

Roztwór Tritonu B w pirydynie (0,45 M) wytworzono rozpuszczając 40% roztwór Tritonu B w metanolu (10 ml) w pirydynie (10 ml). Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem (20 mm Hg) do końcowej objętości ~8 ml. Pozostałość rozcieńczono pirydyną do 50 ml, przesączono i przechowywano pod azotem. Roztwór XV (20,3 mg) w pirydynie (2,0 ml) przepłukano argonem i potraktowano 300 μΙ Tritonu B (0,45 M w pirydynie) i dietoksybutyroaldehydem (50 μΙ). Po wymieszaniu przez 2 godziny mieszaninę ekstrahowano do EtOAc, przemyto 1N wodnym roztworem HCl, solanką i osuszono nad MgSO4. Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika addukt rozpuszczono w CH₂Cl₂ (10 ml) i potraktowano eteratem BF3 (10 μ). Po wymieszaniu przez 2,0 godziny roztwór przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i solanką przed osuszeniem nad MgSO4. Usunięcie rozpuszczalnika w wyparce obrotowej dało pozostałość, którą oczyszczono metodą preparatywnej HPLC (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, 65% MeCN/woda/0,1% kwas trifluorooctowy). Odpowiednie frakcje zobojętniono NaHCO3 i ekstrahowano do chlorku metylenu (3 x 20 ml) i osuszono nad MgSO4. Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano II-1 (11,8 mg, wydajność 65%), którego widma ¹H NMR i MS oraz czas retencji HPLC były identyczne jak substancji wytworzonej i wydzielonej sposobem A, opisanej w przykładzie 8-A.

P r z y k ł a d 13

Wytwarzanie związku II-9 (fig. 8)

Do zawiesiny bromowego związku II-5 (6,2 mg) w 1-propanolu (4,0 ml) dodano kwas 3-aminofenyloborowy (3,8 mg). Po wymieszaniu przez 0,25 godziny kolejno dodano Pd(OAc)₂ (2,0 mg) Ph3P (4,8 mg), Na₂CO3 (2,8 mg) i wodę (2,0 ml). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 0,75 godziny, ochłodzono, ekstrahowano do CH₂Cl₂ i przemyto wodą i solanką. Warstwę organiczną osuszono nad MgSO4 i rozpuszczalnik usunięto w wyparce obrotowej z wytworzeniem pozostałości, którą oczyszczono metodą preparatywnej HPLC (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, 50% MeCN/woda/0,1% kwas trifluorooctowy). Odpowiednie frakcje zobojętniono NaHCO3 i ekstrahowano do chlorku metylenu (3 x 20 ml) i osuszono nad MgSO4. Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano związek II-9 (3,1 mg, wydajność 49%) i miał on następujące właściwości spektralne: ¹H NMR (DMSO-d,) δ 9,22 (d, J = 7,5, 1H), 8,66 (s, 1H), 8,00 - 7,25 (m, 8H), 7,12 (dd, J = 7,1, 7,0, 1H), 6,95 - 6,80 (m, 3H), 6,53 (d, J = 6,0, 1H), 5,63 - 5,58 (m, 1H), 4,99 (s, 2H), 4,55 (s, 1H),

PL 198 434 B1

2,25 - 2,10 (m, 1H), 1,95 - 1,90 (m, 1H), 0,98 - 0,88 (m, 1H), 0,65 - 0,57 (m, 1H); MS m/z (M+H) obliczone 470, obserwowane 470.

P r z y k ł a d 14

Wytwarzanie związku II-10 (fig. 9)

Do roztworu związku II-1 (5,0 mg) w DMSO (1 ml) dodano NaCN (4,3 mg) i mieszaninę ogrzano do 145°C przez godzinę. Mieszaninę ochłodzono, ekstrahowano do EtOAc i przemyto wodą (3 x 20 ml) i solanką. Warstwę organiczną osuszono nad MgSO4, przesączono i odparowano z wytworzeniem pozostałości, którą oczyszczono metodą preparatywnej HPLC (Zorbax RX-8, 2,5 x 25 cm, 55% MeCN/woda/0,1% kwas trifluorooctowy). Odpowiednie frakcje zobojętniono NaHCO3, ekstrahowano do chlorku metylenu (3 x 20 ml) i osuszono nad MgSO4. Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano związek II-10 (2,7 mg, wydajność 50%) i miał on następujące właściwości spektralne: ¹H NMR (DMSO-d6) δ 11,4 (s, 1H), 8,86 (d, J = 7,9, 1H), 8,79 (d, J = 7,6, 1H), 7,90 (d, J = 8,3, 1H), 7,62 - 7,55 (m, 2H), 7,49 (dd, J = 7,6, 7,4, 3H), 7,40 (dd, J = 7,4, 7,3, 1H), 7,35 (dd, J = 7,5, 7,4, 1H), 6,86 (d, J = 6,0, 1H), 6,03 (s, 1H), 5,40 - 5,30 (m, 1H), 2,25 - 2,14 (m, 1H), 2,03 - 1,90 (m, 1H),

1,10 - 0,98(m, ΙΗ^Ο,⁸²-0,77 (m, 1H).

P r z y k ł a d 15

Wytwarzanie związku II-11 (sposób A, fig. 6)

Zgodnie ze sposobem A, żywicę (XIIIa) (150,2 mg) poddano reakcji z EtMgBr (1,0 ml), następnie 2,5-dioksopentanianem etylu [Schmidt, U., Reidl, B. Synthesis, 1993, 809] (1,5 ml). Po przetworzeniu i odcięciu z żywicy, surową mieszaninę reakcyjną produktów rozpuszczono w chlorku metylenu (20 ml) i potraktowano eteratem BF3 (20 μΙ). Po wymieszaniu przez 2,5 godziny roztwór przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i solanką przed osuszeniem nad MgSO4. Po przesączeniu i usunięciu rozpuszczalnika powstałą pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej HPLC (Zorbax RX-8, 4 x 25 cm, 55%-75% gradient MeCN/woda/0,1% kwas trifluorooctowy) z wytworzeniem związku 11-11 (^6,4 m^g\ ^któr^y mtał nas^tępuj^ące właściwości: ^{H NMR} (D^MSO-^d6) ^{δ 9,36} (d ^J = ^7,7, 1H), ^8,68 (s, 1H), 8,00 (d, J = 7,7, 1H), 7,83 (d, J = 8,3, 1H), 7,58-7,15 (m, 5H), 6,97 (d, J = 5,9, 1H), 4,93 (s, 2H), 4,82 (s, 1H), 4,48 (q, J = 7,1,2H), 2,42 - 1,91 (m, 2H), 1,37 (t, 3H, J = 7,1), 1,25 - 0,63 (m, 2H).

P r z y k ł a d 16

Wytwarzanie związku II-12

Roztwór związku II-11 (3,4 mg) w THF (2 ml) potraktowano 2 M roztworem LiBH4 (1,0 ml w THF) i mieszaninę mieszano przez 1,5 godziny. Reakcję zatrzymano przez dodanie 1N wodnego roztworu HCl (4 ml). Po wymieszaniu przez 20 minut dodano 10% wodny roztwór NaOH (15 ml) i mieszaninę ekstrahowano do chlorku metylenu (3 x 10 ml). Po osuszeniu nad MgSO4 mieszaninę przesączono i rozpuszczalnik odparowano z wytworzeniem związku II-12 (0,32 mg), który miał następujące właściwości: ¹H NMR (DMSO-d6) δ 9,35 (d, J = 7,7, 1H), 8,62 (s, 1H), 7,98 (d, J = 7,7, 1H), 7,83 (d, J = 8,2, 1H), 7,75 (d, J = 8,2, 1H), 7,50 - 7,25 (m, 4H), 6,84 (d, J = 7,7, 1H), 6,11 (s, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,71 (s, 1H), 4,50 - 4,40 (m, 1H), 4,30 - 4,20 (m, 1H) 2,42 - 1,91 (m, 2H), 1,25 - 0,63 (m, 2H); MS m/z (M+H) obliczone 409, obserwowane 409.

P r z y k ł a d 17

Wytwarzanie związku II-13

Według procedury z przykładu 11, roztwór mieszaniny około 95-5 VIII-C [A1,A2=H2, B1,B2=O, R3=R4=R5=H, R6=OMe)] i VIII-D [A1,A2=H2, B1,B2=O, R3=R4=R6=H, R5=OMe)] (1,25 g) sililowano w DMF (45 ml) z trietyloaminą (0,85 ml) i chlorkiem t-butylodimetylosililu (0,65 g) z wytworzeniem ^VIIIB-^TDBMS (^{1,41 g}^ ^któr^y mⁱa^ł nas^tępuj^ące właściwości s^pe^ktratoe: ¹IH ^NMR (D^MSO-^d6) ^{δ 11,91} (s, 1H), 9,18 (d, J = 8,6, 1H), 7,99 (d, J = 7,8, 1H), 7,56 (d, J = 8,0, 1H), 7,42 (dd, J = 7,7, 7,6, 1H),

7,30 - 7,20 (m, 2H), 6,95 (dd, J = 7,6, 2,5, 1H), 4,97 (s, 2H), 4,09 (s, 2H), 3,81 (55, 3H), 0,99 (s, 9H), 0,45 (s, 6H). Wydzielono także metodą kolumnowej chromatografii VIIID-TBDMS (65 mg), który miał nas^tępuj^ące właścwości s^pe^ktratoe: ¹IH ^NMR (^DMS°-^d6) ^{δ 11,92} (s, 1H), ^9,01 (d ^J = 1,8, 1H), ^8,02 (d, J = 7,9, 1H), 7,58 (d, J = 8,1, 1H), 7,53 (d, J = 8,3, 1H), 7,44 (dd, J = 7,2, 7,1, 1H), 7,25 (dd, J = 7,2, 7,1, 1H), 6,91 (dd, J = 8,1,2,7, 1H), 4,99 (s, 2H), 4,06 (s, 2H), 3,78 (s, 3H), 0,99 (s, 9H), 0,46 (s, 6H).

Synteza w roztworze związku II-13.

Według procedury z przykładu 12, roztwór VIIID-TBDMS (10,3 mg) w pirydynie (2,0 ml) przepłukano argonem i potraktowano 350 μl Tritonu B (0,45 M w pirydynie) i dietoksybutyroaldehydem (50 μΙ) (który wytworzono zgodnie z literaturową procedurą, Paquette, L. A., Backhaus, D., Braum, R., Underiner, T. L. i Fuchs, K. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 9662-71, dołączanym niniejszym w całości

PL 198 434 B1 jako odnośnik). Po wymieszaniu przez 2 godziny, mieszaninę ekstrahowano do EtOAc, przemyto 10% wodnym roztworem CuSO₄ (3 x 50 ml), solanką i osuszono nad MgSO₄. Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika pozostałość eluowano przez żel krzemionkowy (30% EtOAc/heksan) i aktywną w UV frakcję zatężono, rozpuszczono w CH₂Cl₂ (4 ml) i potraktowano eteratem BF3 (10 μΙ). Po wymieszaniu przez 2,0 godziny roztwór przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i solanką przed osuszeniem nad MgSO4. Usunięcie rozpuszczalnika w wyparce obrotowej dało pozostałość, którą utarto z eterem z wytworzeniem czystego związku II-13 (4,6 mg), który miał następujące właściwości spektralne: ¹H NMR (DMSO-d6) δ 8,92 (d, J = 2,3, 1H), 8,59 (s, 1H), 7,97 (d, J = 7,7, 1H), 7,86 (d, J = 8,3, 1H), 7,59 (d, J = 8,2, 1H), 7,47 (dd, J = 7,7, 7,6, 1H), 7,28 (dd, J = 7,5, 7,4, 1H), 6,89 (dd, J = 8,3, 2,4, 1H), 6,82 (d, J = 6,0), 5,55 - 5,50 (m, 1H), 4,99 (s, 2H), 4,53 (d, J = 3,5, 1H), 3,85 (s, 3H),

2,30 - 2,20 (m, 1H), 2,10 - 1,90 (m, 1H), 1,10 - 0,90 (m, 1H), 0,73 - 0,66 (m, 1H); MS m/z (M+H) obllczone 409, obserwowane 409.

P r z y k ł a d 18

Synteza związku II-14a i związku II-14b

Synteza VIIIA-TBDPS. Do roztworu VIII-A (6,2 g) w DMF (150 ml) dodano TEA (9,7 ml), t-butylochloro-difenylosilan (tBDPS-Cl, 10,5 ml) i katalityczną ilość dimetyloaminopirydyny. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 50°C przez 15 godzin. Dodano jeszcze trietyloaminę (5,0 ml) i tBDPS-Cl (5,0 ml) i mieszaninę reakcyjną trzymano w temperaturze 50°C przez 20 godzin. Reakcję zatrzymano NaHCO3 i ekstrahowano do EtOAc. Warstwę organiczną przemyto wodą (2 x 100 ml) i solanką przed osuszeniem nad MgSO4. Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika powstałą pozostałość utarto z mieszaniną 1:1 eter:heksan z wytworzeniem produktu (9,1 g, 83%) VIIIA-TBDPS, który miał następujące właściwości spektralne: ¹H NMR (DMSO-d6) δ 11,95 (s, 1H), 9,21 (d, J = 1,8, 1H), 7,80 - 7,20 (m, 16H), 7,13 (dd, J = 8,1,2,7, 1H), 4,83 (s, 2H), 4,13 (s, 2H), 1,25 (s, 9H); MS m/z (M+H) obliczone 549, obserwowane 549.

Synteza w roztworze II-17

Roztwór VIIIA-TBDPS (102,5 mg) w pirydynie (4,0 ml) przepłukano argonem i potraktowano 1,0 ml Tritonu B (0,45 M w pirydynie) i dietoksybutyroaldehydem (140 μ) [który wytworzono zgodnie z literaturową procedurą, Paquette, L. A., Backhaus, D., Braum, R., Underiner, T. L. i Fuchs, K. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 9662-71]. Po wymieszaniu przez 2 godziny mieszaninę ekstrahowano do EtOAc, przemyto 10% wodnym roztworem CuSO4 (3 x 50 ml), solanką i osuszono nad MgSO4. Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika pozostałość eluowano przez żel krzemionkowy (30% EtOAc/heksan) i czynną w UV frakcję zatężono, rozpuszczono w CH₂Cl₂ (10 ml) i potraktowano eteratem BF3 (10 μ). Po wymieszaniu przez 0,5 godziny, roztwór przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i solanką przed osuszeniem nad MgSO4. Usunięcie rozpuszczalnika w wyparce obrotowej dało pozostałość, którą oczyszczono metodą kolumnowej chromatografii (żel krzemionkowy, 25% EtOAc/heksan) z wytworzeniem produktu (75,5 mg), który miał następujące właściwości spektralne: ¹H NMR (DMSO-d6) δ 9,08 (d, J = 7,2, 1H), 7,86 (d, J = 8,2, 1H), 7,73 (d, J = 6,9, 1H), 7,70 - 7,24 (m, 15H), 6,88 (d, J = 5,9, 1H), 5,72 (m, 1H), 4,86 (s, 2H), 4,55 (d, J = 3,3, 1H), 2,30 - 2,20 (m, 1H),

2,10 - 1,90 (m, 1H), 1,10 - 0,90 (m, 1H), 0,73 - 0,66 (m, 1H); MS m/z (M+Na) obliczone 639, obserwowane 639.

Rozdzielanie enancjomerów zabezpieczonych TBDPS Il-1a metodą chiralnej HPLC i wytwarzanie związków II-14a i II-14b.

Zabezpieczony TBDPS II-1a rozpuszczono w minimalnej ilości mieszaniny (1:4, objętościowo) CHCh:EtOH i 500 μl porcje wstrzyknięto na kolumnę CHIRACEL OD (1 cm wewnętrznej średnicy x 25 cm) i 100% etanol (1,5 ml/min) użyto jako eluent. Frakcje z każdego przebiegu odpowiadające enancjomerowi A (24,0-27,0 minut) i enancjomerowi B (36,0-39,0 minut) zebrano i zatężono oddzielnie. Pojedyncze enancjomery zabezpieczonego TBDPS II-1a rozpuszczono w THF (12 ml) i dodano do 0,1 M roztworu wodnego KF (4,6 ml) buforowanego HF (0,125 ml 0,1 M roztworu wodnego). Każdy roztwór mieszano przez 40 godzin. Roztwór rozpuszczono w DCM i przemyto wodnym roztworem NaHCO3. Warstwę wodną ekstrahowano DCM (3 x 100 ml) i połączone warstwy organiczne natychmiast przepuszczono przez korek MgSO4 i odparowano pozostawiając pozostałość, którą utarto z mieszaniną 1:1 eter:heksan i oczyszczono metodą preparatywnej HPLC, jak opisano w przykładzie 8-A. Czasy retencji HPLC i dane spektralne MS każdego enancjomeru odpowiadają autentycznemu II-1a. Związek II-14a (2,84 mg) otrzymano z czystością 97% i związek II-14b (3,52 mg) otrzymano z czystością 90%, jak określono metodą chiralnej HPLC. Chiralną czystość pojedynczych enancjomerów określono

PL 198 434 B1 stosując kolumnę CHIRACEL OD (0,46 cm średnica wewnętrzna x 5 cm) stosując mieszaninę 1:1 metanol/etanol jako eluent (0,25 ml/minutę). Rt = dla II-14a: 14,0 min i Rt = dla II-14b: 20,5 min.

P r z y k ł a d 19

Synteza związku II-15

Do zawiesiny VIII-A (1 g, 3,2 ntmol) w THF (40 ml) dodano NBS (632 mg, 3,5 mmol) i mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i powstałe żółto-pomarańczowe ciało stałe umieszczono w zawiesinie w metanolu (50 ml). Zawiesinę przesączono i ciało stałe przemyto jeszcze metanolem. Po osuszeniu bromowy związek (R³=Br) (^1,09 g, ^2,8 mmo( w^ydajno^ść ⁸⁸%) o^dz^ys^kano jato Madożótte dato state: (M^S: m^/z (M+^H) 389, 391).

Do roztworu powyższego bromku (1,09 g, 2,8 mmol) w benzenie (60 ml) i N-metylopirolidynonie (6 ml) dodano 4,4'-dimetoksybenzhydrol (818 mg, 3,4 mmol) i kwas p-toluenosulfonowy (532 mg, 2,8 mmol) i mieszaninę ogrzewano do refluksu. Po 24 godzinach mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej i rozcieńczono octanem etylu (200 ml). Warstwę organiczną przemyto NaHCO3 (2x), H2O (2x) i solanką (2x). Warstwę organiczną osuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Surową substancję oczyszczono metodą kolumnowej chromatografii (10% EtOAc-heksan) z wytworzeniem żądanej zabezpieczonej DMB 3-bromoindolowej pochodnej (1,5 g, 2,4 mmol, wydajność 87%) jako pomarańczowego ciała stałego: (MS m/z (M+H) 615, 617).

250 ml zamykaną probówkę napełniono zabezpieczonym DMB 3-bromowym związkiem (1,5 g, 2,4 mmol), dichlorkiem bis(trifenylofosfinylo)palladu (100 mg, 0,14 mmol), bezwodnym octanem sodu (3,9 g, 4,8 mmol) i metoksyetanolem (50 ml). Probówkę naprzemiennie opróżniano i napełniano CO, pozostawiając ją w atmosferze CO. Następnie zanurzono ją w łaźni olejowej w temperaturze 150°C. Po 4 godzinach probówkę ochłodzono do temperatury pokojowej i znów napełniono CO. Powtórzono to jeszcze raz, reakcja przebiegała łącznie 10 godzin. Mieszaninę rozcieńczono octanem etylu (250 ml), przemyto wodą, osuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość utarto z metanolem z wytworzeniem 3-karboksylowego związku (1,29 g, 2,02 mmol, wydajność 84%) jako żółtego ciała stałego: MS m/z (M+H) 639.

Do roztworu powyższego estru (1,2 g, 1,9 mmol) w chlorku metylenu (20 ml) dodano tioanizol (1 ml), następnie TFA (4 ml). Po wymieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną odparowano do suchej masy i pozostałość umieszczono w zawiesinie w eterze dietylowym. Zawiesinę przesączono i ciało stałe przemyto eterem dietylowym, aż przesącz był bezbarwny. Ciało stałe osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem estru (636 mg, 1,54 mmol) jako białawego ciała stałego: MS m/z (M+H) 413.

Powyższy ester (500 mg, 1,2 mmol) umieszczono w zawiesinie w chlorku metylenu (15 ml) i dodano roztwór wodorku diizobutyloglinu w chlorku metylenu (5,5 ml, 5,5 mmol, 1,0 M). Po 2 godzinach w temperaturze pokojowej reakcję zatrzymano metanolem. Rozpuszczalnik usunięto w wyparce obrotowej i do pozostałości dodano wodę. Zawiesinę przesączono i ciało stałe osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Żądany produkt [A1,A2=O, B_hB2=H2, R3=3-CH2OH, R4=R5=R6=H, Q=NH] (367 mg, 1,08 mmol) otrzymano jako bladożółte ciało stałe: MS m/z (M+H) 341 m/e.

Powyższy alkohol (360 mg, 0,9 mmol) [A1,A2=O, B_hB2=H2, R3=3-CH2OH, R4=R5=R6=H, Q=NH] umieszczono w zamykanej probówce z etanolem (15 ml). Do tej zawiesiny dodano bezwodnik trifluorooctowy (254 ml, 1,8 mmol). Reakcję ogrzewano w temperaturze 70°C przez 15 godzin. Probówkę ochłodzono i rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Powstałe ciało stałe utarto z metanolem, przesączono i osuszono z wytworzeniem żądanego eteru (239 mg, 0,65 mmol, wydajność 72%) jako pomarańczowe ciało stałe: MS m/z (M+H) 369.

Według procedury z przykładu 11, powyższy eter (100 mg, 0,27 mmol) sililowano w DMF (5 ml) z trietyloaminą (0,75 ml, 0,54 mmol)) i chlorkiem t-butylodimetylosililu (81,0 mg, 0,54 mmol). Po przetworzeniu w wodzie i odparowaniu rozpuszczalnika, ciało stałe utarto z eterem:heksanem (1:1) z wytworzeniem produktu (114,6 mg, 0,24 mmol, 88%) jako pomarańczowego ciała stałego: MS m/z (M+H) 483.

Według procedury z przykładu 12, roztwór powyższego eteru (23,0 mg, 0,048 mmol) w pirydynie (4,0 ml) przepłukano argonem i potraktowano 200 μΙ Tritonu B (0,45 M w pirydynie) i 5,5-dimetylo1,3-dioksano-2-propionaldehydem (50 μ). Khanna, I. K.; Weier, R.M.; Yu. Y.; Collins, P. W.; Miyashiro, J. M.; i in., J. Med. Chem. 1997, 40, 1619-33 dołączany niniejszym w całości jako odnośnik. Po 0,5 godziny dodano jeszcze Triton B (200 μl 0,45 M w pirydynie). Powtórzono to dwukrotnie. Na koPL 198 434 B1 niec, mieszaninę ekstrahowano do EtOAc, przemyto 10% wodnym roztworem CuSO₄ (3 x 50 ml), solanką i osuszono nad MgSO₄. Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika pozostałość eluowano przez żel krzemionkowy (30% EtOAc/heksan) i czynną w UV frakcję zatężono, rozpuszczono w CH2Cl2 (4 ml) i potraktowano katalityczną ilością tosylanu pirydyniowego (1 mg). Mieszaninę ogrzewano do refluksu przez 48 godzin i następnie rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Powstałą pozostałość rozpuszczono w THF (8,0 ml) i dodano do 0,1 M roztworu wodnego KF (2,9 ml) buforowanego HF (0,09 ml 0,1 M roztworu wodnego). Po wymieszaniu przez 20 godzin roztwór ekstrahowano do DCM i przemyto wodnym roztworem NaHCO3. Warstwę wodną ekstrahowano DCM (3 x 100 ml) i połączone warstwy organiczne natychmiast przepuszczono przez korek MgSO4 i odparowano pozostawiając pozostałość, którą utarto z mieszaniną 1:1 eter:heksan i oczyszczono metodą preparatywnej HPLC, jak opisano w przykładzie 8-A. Dało to żądany produkt II-15 (1,26 mg, 6,0%), ^któr^y mⁱa^ł nas^tępuj^ące wtaśdwości spieMra^e: ¹IH ^NMR (D^MSO-^d6) δ ^9,41 (d, J = ^2,3 1H), ^8,53 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,80 - 7,25 (m, 5H), 6,33 (d, J = 6,0. 1H), 5,31 (m, 1H), 4,95 (s, 2H), 4,66 (s, 2H), 4,48 (m, 1H), 3,50 (q, J = 6,8, 2H), 2,30 - 2,20 (m, 1H), 2,10 - 1,90 (m, 1H), 1,25 (t, J = 6,8, 3H),

1,10 - 0,90 (m, 1H), 0,73 - 0,66 (m, 1H); MS m/z (M+H) obllccone 437, obberwowane 437.

P r z y k ł a d 20

Synteza związku II-1b

Wytwarzanie XIV (DMB-VIIIA). Trójszyjną kolbę okrągłodenną wyposażoną w górne mieszadło mechaniczne i pułapkę Deana-Starka kolejno napełniono DMB-OH (2,44 g, 10 mmol), 1-metylo-2-pyrolidynonem (30 ml), benzenem (270 ml), VIII-A (3,10 g, 10 mmol) i kwasem p-toluenosulfonowym (1,90 g, 10 mmol). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano do refluksu. Po 2 godzinach mieszanina reakcyjna stała się jednorodna i ogrzewano ją jeszcze przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej, rozcieńczono EtOAc (200 ml), przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 (4 x 100 ml), wodą (4 x 100 ml) i warstwę organiczną osuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość utarto z EtOAc/heksanem i powstałe ciało stałe przesączono i osuszono pod silnie zmniejszonym ciśnieniem z wytworzeniem XIV (fig. 4) [A1,A2=H2, B1,B2=O, R3=R4=R5=R6=H, Q=NH, R'=R=H], (5,2 g, 98%), który miał następujące właściwości spektralne: ¹H NMR (CDCh-d6) δ 9,54 (d, J = 7,82, 1H), 8,55 (s, 1H), 7,68 (d, J = 7,8, 1H), 7,60 - 6,70 (m, 15H), 4,71 (s, 2H), 4,03 (s, 2H), 3,78 (s, 6H); MS m/z (M+H) obliczone 537, obserwowane 537.

Do roztworu XIV (fig. 4) (102,5 mg) w THF (6,0 ml) dodano roztwór THF EtMgBr (0,8 ml 1,0 M) i mieszaninę mieszano przez godzinę. Dodano 5,5-dimetylo-1,3-dioksane-2-propion-aldehydu (300 ^l) [który wytworzono zgodnie z procedurą literaturową, Khanna, I. K.; Weier, R.M.; Yu. Y.; Collins, P. W.; Miyashiro, J. M.; i in., J. Med. Chem. 1997, 40, 1619-33] i mieszaninę mieszano przez 3 godziny. Reakcję zatrzymano wodnym roztworem NH4Cl i ekstrahowano do EtOAc. Warstwę organiczną przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i solanką przed osuszeniem nad MgSO4. Usunięcie rozpuszczalnika w wyparce obrotowej dało pozostałość, którą oczyszczono metodą kolumnowej chromatografii (żel krzemionkowy, 40% EtOAc/heksan) z wytworzeniem dwu frakcji odpowiadających dwu diastereomerycznym adduktów: MS m/z (M+H) 709. Bardziej polarną frakcję (25 mg) rozpuszczono w dichlorometanie (10 ml) i potraktowano eteratem BF3 (10 μΊ).

Po wymieszaniu przez 1,5 godziny roztwór przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i solanką i warstwę organiczną osuszono nad bezwodnym MgSO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Powstałą pozostałość oczyszczono metodą preparatywnej HPLC, jak opisano w przykładzie 8-A, z wytworzeniem produktu (1,75 mg), który miał następujące właściwości spektralne: ¹H NMR (DMSO-d6) δ 9,20 (d, J = 7,46, 1H), 3,56 (s, 1H), 7,97 (d, J = 7,7, 1H), 7,69 (d, J = 8,2, 1H), 7.57 (d, J = 7,3, 1H), 7,52 - 7,20 (m, 4H), 6,57 (m, 1H), 5,1 (m, 1H), 4,88 (s, 2H), 4,67 (s, 1H), 2,30 - 2,20 (m, 1H), 2,10 - 1,90 (m, 1H), 1,10 - 0,90 (m, 1H), 0,73 - 0,66 (m, 1H); MS m/z (M+H) obliczone 379, obserwowane 379.

P r z y k ł a d 21

Synteza związków II-16a i II-16b

Roztwór VIIIA-TBDPS (patrz przykład 18) (214 mg) w pirydynie (4,0 ml) przepłukano argonem i potraktowano 750 μl Tritonu B (0,45 M w pirydynie) i roztworem 2,2-dietoksy-etoksy-acetaldehydu (200 mg) [który wytworzono zgodnie z literaturową procedurą: Aparico, F. J. L.; Benitez, F. Z.; Gonzalez, F. S.; Carbohydr. Res. 1983, 297-302, którego ujawnienie dołącza się niniejszym w całości jako odnośnik], w pirydynie (2 ml). Dodano jeszcze Triton B (250 μΙ) po 2 godzinach. Po mieszaniu przez 0,5 godzin, mieszaninę ekstrahowano do EtOAc, przemyto 10% wodnym roztworem CuSO4 (3 x 50 ml),

PL 198 434 B1 solanką i osuszono nad MgSO4. Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika, pozostałość eluowano przez żel krzemionkowy (35% EtOAc/heksan) i czynną w UV frakcję zatężono, rozpuszczono w CH2Cl2 (10 ml) i potraktowano eteratem BF3 (10 pl). Po wymieszaniu przez 0,5 godziny roztwór przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i solanką przed osuszeniem nad MgSO4. Usunięcie rozpuszczalnika w wyparce obrotowej dało pozostałość, którą oczyszczono metodą kolumnowej chromatografii (żel krzemionkowy, 35% EtOAc/heksan) z wytworzeniem dwu frakcji odpowiadających dwu diastereomerycznym adduktom: MS m/z (M+H) 725. Każdy addukt rozpuszczono w CHgCL (10 ml) i potraktowano eteratem BF3 (10 μΙ). Po wymieszaniu przez 0,5 godziny rozpuszczalnik usunięto w wyparce obrotowej i każdą pozostałość rozpuszczono w THF (15 ml) i dodano do 0,1 M roztworu wodnego KF (5,8 ml) buforowanego HF (0,20 ml 0,1 M roztworu wodnego). Każdy roztwór mieszano przez 20 godzin, ekstrahowano do DCM i przemyto wodnym roztworem NaHCO3. Warstwę wodną ekstrahowano DCM (3 x 100 ml) i połączone warstwy organiczne natychmiast przepuszczono przez korek MgSO4 i odparowano. Powstałą parę pozostałości rozpuszczono w CHgCL (10 ml) i potraktowano eteratem BF3 (10 μ) i mieszano przez 48 godzin.

Każdą mieszaninę reakcyjną ekstrahowano do CH2Ch i przemyto nasyconym wodnym roztworem NaHCO3 i solanką przed osuszeniem nad MgSO4. Usunięcie rozpuszczalnika w wyparce obrotowej dało pozostałość, którą oczyszczono metodą preparatywnej HPLC, jak opisano w przykładzie 8-A. Jeden diasteromer, związek II-16a, (wydzielono 2,38 mg) miał następujące właściwości spektralne: ⁿC NMR (DMSO-d6) δ 172,0, 142,6, 142,5, 142,1, 141,0, 139,8, 134,8, 130,6, 128,0, 127,2, 127,0, 126^ 124A 124^ 122,7, 121^ 121^ 116^ 112,1, 80,0, 70,0, 69,1, 65,6, 54,1, 45^,7; ¹H NMR (DMSO-d6) δ 9,23 (d, J = 7,7, 1H), 8,58 (s, 1H), 7,99 (d, J = 7,7, 1H), 7,77 (d, J = 8,3, 1H), 7,63 (d, J = 7,22, 1H), 7,48 - 7,30 (m, 4H), 6,56 (s, 1H), 5,10 (m, 1H), 4,90 (s, 2H), 4,70 (m, 1H), 3,80-3,60 (m, 2H), 3,30 - 3,00 (m, 2H) MS m/z (M+Na) obliczone 395, obserwowane 395.

Inny diastereomer, związek II-16b, (wydzielono 1,00 mg) miał następujące właściwości spektralne: ¹H NMR (DMSO-d6) δ 9,21 (d, J = 7,7, 1H), 8,59 (s, 1H), 7,99 (d, J = 7,7, 1H), 7,77 - 7,30 (m, 6H), 5,95 (s, 1H), 5,05 (m, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,63 (m, 1H), 4,55 - 4,30 (m, 2H), inne sygnały utracone pod pikiem rozpuszczalnika; MS m/z (M+Na) obliczone 395, obserwowane 395.

Związki o wzorze II można ponadto zrozumieć w odniesieniu do tablicy 9, która podaje pewne korzystne odmiany oznaczone jako wzór III, w którym pokazano centra chiralne (*), Wartości dla R\ ^{r4 r6 i r7} to ^H; Y oznacza ^{O; i} n w^ynos^{i 1}.

Związek nr	A1A2	B1B2	R2	R3	R5	R8	Z	m	R2 R7 R8
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
III-A1	H, H	O	H	H	H	H	wiązanie	1	RSR
III-A2	H, H	O	H	H	H	H	wiązanie	1	SSR
III-A3	H, H	O	H	H	H	H	wiązanie	1	RRS
III-A4	H, H	O	H	H	H	H	wiązanie	1	SRS

PL 198 434 B1 cd. tabeli 9

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
III-B1	H, H	O	Et	H	H	H	wiązanie	1	RSR
III-B2	H, H	O	Et	H	H	H	wiązanie	1	SSR
III-B3	H, H	O	Et	H	H	H	wiązanie	1	RRS
III-B4	H, H	O	Et	H	H	H	wiązanie	1	SRS
III-C1	H, H	O	H	H	H	Me	wiązanie	1	RSR
III-C2	H, H	O	H	H	H	Me	wiązanie	1	SSR
III-C3	H, H	O	H	H	H	Me	wiązanie	1	RRS
III-C4	H, H	O	H	H	H	Me	wiązanie	1	SRS
III-D1	H, H	O	H	H	H	Me	wiązanie	2	RRS
III-D2	H, H	O	H	H	H	Me	wiązanie	2	SRS
III-D3	H, H	O	H	H	H	Me	wiązanie	2	RSR
III-D4	H, H	O	H	H	H	Me	wiązanie	2	SSR
III-E1	H, H	O	H	3-Br	H	Me	wiązanie	1	RSR
III-E2	H, H	O	H	3-Br	H	Me	wiązanie	1	SSR
III-E3	H, H	O	H	3-Br	H	Me	wiązanie	1	RRS
III-E4	H, H	O	H	3-Br	H	Me	wiązanie	1	SRS
III-F1	H, H	O	H	H	10-OMe	H	wiązanie	1	RSR
III-F2	H, H	O	H	H	10-OMe	H	wiązanie	1	SSR
III-F3	H, H	O	H	H	10-OMe	H	wiązanie	1	RRS
III-F4	H, H	O	H	H	10-OMe	H	wiązanie	1	SRS
III-G1	H, H	O	H	H	H	Me	O	1	SSS
III-G2	H, H	O	H	H	H	Me	O	1	RSS
III-G3	H, H	O	H	H	H	Me	O	1	RRR
III-G4	H, H	O	H	H	H	Me	O	1	SRR
III-H1	O	H, H	H	H	H	H	wiązanie	1	RSR
III-H2	O	H, H	H	H	H	H	wiązanie	1	SSR
III-H3	O	H, H	H	H	H	H	wiązanie	1	RRS
III-H4	O	H, H	H	H	H	H	wiązanie	1	SRS
III-I1	H. H	O	H	3-(3'-NH2-Ph)	H	H	wiązanie	1	RSR
III-I2	H, H	O	H	3-(3'-NH2-Ph)	H	H	wiązanie	1	SSR
III-I3	H, H	O	H	3-(3'-NH2-Ph)	H	H	wiązanie	1	RRS
III-I4	H, H	O	H	3-(3'-NH2-Ph)	H	H	wiązanie	1	SRS

PL 198 434 B1 cd. tabeli 9

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
III-J1	O	O	O H	H	H	H	wiązanie	1	SSR
III-J2	O	O	OH	H	H	H	wiązanie	1	RSR
III-J3	O	O	OH	H	H	H	wiązanie	1	RRS
III-J4	O	O	O H	H	H	H	wiązanie	1	SRS
III-K1	H, H	O	H	H	H	CO2-Et	wiązanie	1	RSR
III-K2	H, H	O	H	H	H	CO2-Et	wiązanie	1	SSR
III-K3	H, H	O	H	H	H	CO2-Et	wiązanie	1	RRS
III-K4	H, H	O	H	H	H	CO2-Et	wiązanie	1	SRS
III-L1	H, H	O	H	H	H	CH2OH	wiązanie	1	RSR
III-L2	H, H	O	H	H	H	CH2OH	wiązanie	1	SSR
III-L3	H, H	O	H	H	H	CH2OH	wiązanie	1	RRS
III-L4	H, H	O	H	H	H	CH2OH	wiązanie	1	SRS
III-M1	H, H	O	H	H	9-OMe	H	wiązanie	1	RSR
III-M2	H, H	O	H	H	9-OMe	H	wiązanie	1	SSR
III-M3	H, H	O	H	H	9-OMe	H	wiązanie	1	RRS
III-M4	H, H	O	H	H	9-OMe	H	wiązanie	1	SRS
III-N1	H, H	O	H	H	H	H	wiązanie	1	RSR
III-N2	H, H	O	H	H	H	H	wiązanie	1	SSR
III-N3	H, H	O	H	H	H	H	wiązanie	1	RRS
III-N4	H, H	O	H	H	H	H	wiązanie	1	SRS
III-P1	H, H	O	H	3-CH2O- CH2OEt	H	H	wiązanie	1	RSR
III-P2	H, H	O	H	3-CH2O- CH2OEt	H	H	wiązanie	1	SSR
III-P3	H, H	O	H	3-CH2O- CH2OEt	H	H	wiązanie	1	RRS
III-P4	H, H	O	H	3-CH2O- CH2OEt	H	H	wiązanie	1	SRS
III-Q1	H, H	O	H	H	H	H	O	1	RSS
III-Q2	H, H	O	H	H	H	H	O	1	SSS
III-Q3	H, H	O	H	H	H	H	O	1	RRR
III-Q4	H, H	O	H	H	H	H	O	1	SRR

W zamiarze każdy z patentów, zgłoszeń i drukowanych publikacji wspomnianych w tym dokumencie patentowym jest niniejszym włączony jako odnośnik w całości. Jak zauważą specjaliści, możPL 198 434 B1 na dokonać wielu zmian i modyfikacji w korzystnych odmianach wynalazku bez odchodzenia od ducha wynalazku, Wszystkie takie odmiany mają się mieścić w zakresie wynalazku.

Claims (3)

1. Nowe mostkowane indenopirolokarbazole o wzorze I w którym:

pierścień B i pierścień F, niezależnie, i każdy wraz z atomami węgla, z którymi jest połączony, wybiera się z grupy obejmującej:

a) nienasyccny6-członoowk^arkboyklicznypierśśieńaromatyczny,w któó/m od1 do3 atomów węgla może być zastąpionych atomami azotu;

b) nienasycony 5-członowy karbocykliczny pierścień aromatyczny; i

c) nienasycony 5-członowy karbocykliczny pierścień aromatyczny, w którym

1) jeden atom węgla jest zastąpiony atomem tlenu, azotu lub siarki;

2) dwa atoma węęlas sz nstąpionyatomam siarkii atomam asntu,atomam tI emi atomam amtu, lub dwoma atomami azotu; lub

3) trzy atomów węgla są zastąpione trzema atomami azotu; R¹, R⁴, R- i R⁷ każdy oznacza atom H;

Y oznacza O;

n oznacza 1;

Ai, A² i Bi, B² są niezależnie atomami H, lub wzięte razem tworzą formę =O;

R² oznacza prostołańcuchowy, cykliczny lub rozgałęziony C1-C4 alkil, lub OH;

R³ oznacza atom H, halogen, grupę -CtOCtOEt, 3-(3'-NH2-fenyl), lub prostołańcuchowy, cykliczny lub rozgałęziony Ci-Csalkil;

R⁵ oznacza atom H lub prostołańcuchowy, cykliczny lub rozgałęziony Ci-Csalkoksyl;

R⁸ oznacza atom H, metyl, CH2OH, CO2Etyl lub prostołańcuchowy, cykliczny lub rozgałęziony

Ci-Csalkoksyl;

Z oznacza wiązanie lub O; m oznacza 1 lub 2.

2. Związek według zastrz. 1 o wzorze:

PL 198 434 B1

3. Związek według zastrz. 2 w postaci diastereomerów o wzorze:

4. ZZiąąeeweediu gzatrz. 2 w ppotaai e nancjomerówo wzorze:

5. Związek według zastrz. 1, w którym R¹ ozaacza H.

6. Zwiąąze wee-ugzzsrrz. 1 , w którym R² 2ooaacz H, hyyroOkslalboppOdrawiona I uUnieepostawioay alkil.

7. Zwiąązn wee-uu zzsrrz. 1, w którym R³, R⁴, R⁵ i R⁶ oooaaczją nieezleenie H, ppOdrawiona lub aiepodstawioay alkil, chlorowiec, lub R³ ozaacza H, podstawiony lub aiepodstawioay alkil, chlorowiec, R⁵ ozaacza H, podstawioay lub aiepodstawioay alkoksyl.

8. Zw^ąze wee-ug zzstrz. 1 któryrn R' i R2ooocaczjąn ieezleenieH, a Ibb R2 7oocaczHi rR ozaacza podstawioay lub aiepodstawioay alkoksyl.

9. Związek według zastrz. 1, w którym Y ozaacza O.

10. Związek według zastrz. 1, w którym Z ozaacza wiązaaie lub O.

11. Związek według zastrz. 1, w którym m i a ozaaczają aiezalenaie 1 lub a ozaacza 1 i m ozaacza 2.

12. Związek według zastrz. 1, w którym Y ozaacza O, Z ozaacza wiązaaie lub O i m i a ozaaczają aiezalenaie 1 lub m ozaacza 2 i a ozaacza 1.

13. Związek według zastrz. 1, w którym A¹ A² i B^² ozaaczają aiezalenaie =O lub H, H.

PL 198 434 B1

14. Związek według zastrz. 1, w którym R¹, R⁴, R⁶ i R⁷ oznaczają H, Y oznacza O, n oznacza 1, A¹ A² i B¹B² oznaczają niezależnie =O lub H, H, R² oznacza H, OH lub niższy alkil, R³ oznacza H lub podstawiony alkil, r5 i R⁸ oznaczają niezależnie H lub alkoksyl, Z oznacza wiązanie lub O i m oznacza 1 lub 2.

15. Związek według zastrz. 1 o wzorze:

16. Związekwedłuu g astrz. 1 5,w którym R'R R⁵5yyieras ięn iezależniez zrupp o bejmującej H, F, Br, -OH,-CH2OCH2OEt, 3-(3'-NH2-fenyl);

i alkil mający 1 do 8 atomów węgla lub alkoksyl mający od 1 do 8 atomów węgla.

17. Związek według zastrz. 16, w którym r5 wybiera się niezależnie z grupy obejmującej H lub prostołańcuchowy, cykliczny lub rozgałęziony C₁-C8alkoksyl.

18. Związek według zastrz. 17 o wzorze:

PL 198 434 B1

PL 198 434 B1

21. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, żk jako awizark aktywac aawirra tkrapkstyzaaik zkstrzaaz ilość aowrgo awizaks o waorar (I), w którym wzacztkir podztawaiki zą takir jak to okrrśloao w aaztrakżkais 1 i farmazkstczaaik dopszazaalac aośaik.

22. Kc^r^f^c^2^ac^^ farmaazktyczny wekłus zastrz. Z1, zznmieenn tym, dek Zo-zystyymizwiąznami aktcwacmi zą awizaki wkdłsg aaztra. 18 i farmazkstczaaik dopszazaalac aośaik.

23. Kompozycza według zas^z. 21, 22, znamienna tym, że szósta się ją do

Ikzakaia Isb aapobikgaaia aabsrakaiom ztkrzaa.

24. Kc^rm^c^^\,^c^jjj farmaceusyczna według zas^z. 23, znamienna tym, że zabuszeniem jkzt rak ztkrzaa Isb dobrotliwc prakrozt ztkrzaa.

25. Komppoycja farmaazktyczny wekług ζ^^ζ. ZT zznmieenn tym, dek ztysujazię ją do i ekzaaia lsb aapobikgaaia aabsrakaiom aagiogkaacm.

26. Kompozy^a farmaceisyczna według zaszc^. 25, znamienna tym, że zaburzeniem angiogkaacm zą litk gsac, kadomktrioaa, rktcaopatia zskraczowa, łszazacza, gsa móags a aagioblaztów, aabsrakaia ozaak lsb awcrodaikaik plamki żółtej.

27. Komppoycja farmaazutycznιnwekług ζ^^ζ. ZT zznmieenn tym, zek ztysujazię ją do i ekzaaia lsb aapobikgaaia tworakais zię aowotworów, rksmatoidalakms aapalkais ztawów, awłókaikais płsz, awłókaikais zapiks, aikaormalakms gojmis raa, miażdżczc tętaiz, lsb aawrotowi awężmia.

28. Komppoycja farmaazktyczny wekług ζβίΛζ. Z2, zznmieenn tym, Zż ztysujazię ją do i ekzaaia lsb aapobikgaaia zhorobik Alahkimkra, ztwardaikais aaaikowkms bozaakms, zhorobik Parkiazoaa, sdarowi, aikdokrwikais, zhorobik Hsatiagtoaa, dkmkazji AIDS, kpilkpzji, ztwardaikais roaziaakms, aksropatii obwodowkj lsb szakodakaiom móags lsb rdakaia kręgowkgo.

29. nowego związku o wzorze I, w którym wszystkie pods1:awniki są takie jak okrkśloao w aaztra. 1 do wctwaraaaia lkks do hamowaaia aktywnośzi kiaaac trk i zpowodowaaia zkstkzaakj iahibizji.

30. Zaztozowaaik wkdłsg aaztra. 29, znamienne tym, żk kiaaaz trk jkzt trk A.

31. Zaztozowaaik wkdłsg aaztra. 29, znaiienne ty,, żk lkk jkzt do lkzakaia aapalkaia.

32. Zastósowenie wekług ζθι^ζ. 29, znamiennn tym, że i ek jdo i ekzenia i ub ζηρο^βηθΓ'^ aabsrakaiom ztkrzaa.

33. Zastósowasie wekług ζθι^ζ. 33, znamiennn tym, że zabutzeniem zterzzy j zak ztyrzza lsb dobrotliwc prakrozt ztkrzaa.

34. Zaztozowaaik wkdłsg aaztra. 29, znaieenne ty,, żk lkk jkzt do lkzakaia lsb aapobikgaaia aabsrakaiom aagiogkaacm.

35. Zaztozowaaik wkdłsg aaztra. 34, znaieenne ty,, żk aabsrakaikm aagiogkaacm zą litk gsac, kadomktrioaa, rktcaopatia zskraczowa, łszazacza, gsa móags a aagioblaztów, aabsrakaia ozaak lsb awcrodaikaik plamki żółtój.

PL 198 434 B1

36. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że lek jest do leczenia lub zapobiegania zaburzeniom, w których aktywność PDGFR daje wkład do stanów patologicznych i spowodowania zetknięcia receptora pochodzącego z płytek czynnika wzrostu ze skuteczną ilością hamującą związku.

37. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że lek jest do leczenia I ub zapobiegania nowotworzeniu, reumatoidalnemu zapalenie stawów, zwłóknieniu płuc, zwłóknieniu szpiku, nienormalnemu gojeniu ran, miażdżycy tętnic lub nawrotowi zwężenia.

38. Zastosowanie według zas^z. 29, znamienne tym, że I ek jess do leczenia lut) zapobiegania zaburzeniom charakteryzującym się odchyloną od normy aktywnością komórek reagujących na czynnik troficzny i spowodowania zetknięcia receptora komórki czynnika troficznego ze skuteczną ilością indukującą aktywność związku.

39. Zastosowanie według zas^z. 29, znamienne tym, że I ek jess do leczenia lub zapobiegania chorobie Alzheimera, stwardnieniu zanikowemu bocznemu, chorobie Parkinsona, udarowi, niedokrwieniu, chorobie Huntingtona, demencji AIDS, epilepsji, stwardnieniu rozsianemu, neuropatii obwodowej lub uszkodzeniom mózgu lub rdzenia kręgowego.