PL185125B1

PL185125B1 - Nowe związki, cyklopeptydy, sposób ich wytwarzania i ich stosowanie oraz preparat farmaceutyczny

Info

Publication number: PL185125B1
Application number: PL96316071A
Authority: PL
Inventors: Jonczyk┴Alfred; Goodman┴Simon; Diefenbach┴Beate; Sutter┴Arne; Hölzemann┴Günter; Kessler┴Horst; Dechantsreiter┴Michael
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1995-09-15
Filing date: 1996-09-13
Publication date: 2003-02-28
Also published as: US6001961A; ID18770A; PL316071A1; CN1149588A; CA2185489A1; CA2185489C; TW517064B; EP0770622B1; RU2157379C2; KR100438244B1; NO963853L; SK116796A3; SK282391B6; CZ264396A3; JP2007186525A; DE59604363D1; EP0770622A2; EP0770622A3; AU6558096A; JPH09132593A

Abstract

1. Nowe zwiazki, cyklopeptydy o wzorze 1 cyklo-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE) 1, w którym D oznacza D-Phe, Phe, D-homoPhe, homoPhe lub 4-Hal-Phe (w odmiame-D lub -L), E oznacza Val, Gly, Ala, Leu, Ile lub Lys, Hal oznacza F, Cl, Br, I, n wakuje albo oznacza rodnik alkilowy o 1-6 atomach wegla, benzyl, benzyloksykarbonyl lub rodnik aralki- lowy o 1-6 atomach wegla na funkcyjnej grupie a -aminowej rodnika odpowiedniego aminokwasu, pod wa- runkiem, ze co najmniej jeden rodnik aminokwasu dysponuje podstawnikiem n i przy czym, o ile chodzi o rodniki optycznie czynnych aminokwasów 1 pochodnych aminokwasów, to sa wlaczone zarówno ich od- miany-D jak 1 -L oraz ich fizjologicznie dopuszczalne sole, i przy czym wyklucza sie zwiazek . 5. Sposób wytwarzania zwiazku o wzorze 1 cyklo-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE) 1, w któr ym D oznacza D-Phe, Phe, D-homoPhe, homoPhe lub 4-Hal-Phe (w odmianie-D lub -L), E oznacza Val, Gly, Ala, Leu, Ile lub Lys, Hal oznacza F, Cl, Br, I, n wakuje albo oznacza rodnik alkilowy o 1-6 atomach wegla, benzyl, benzyloksykarbonyl lub rodnik aralki- lowy o 1-6 atomach wegla na funkcyjnej grupie a -aminowej rodnika odpowiedniego aminokwasu, pod wa- runkiem, ze co najmniej jeden rodnik aminokwasu dysponuje podstawnikiem n i przy czym, o ile chodzi o rodniki optycznie czynnych aminokwasów i pochodnych aminokwasów, to sa wlaczone zarówno ich od- miany-D jak i -L, albo jednej z jego soli, i przy czym wyklucza sie zwiazek , znamienny tym, ze uwalnia sie zwiazek o wzorze 1 z jednej z jego funkcyjnych pochodnych droga dzialania srodkiem solwolizujacym lub hydrogenolizujacym, albo ze na peptyd o wzorze 2 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe związki, cyklopeptydy, sposób ich wytwarzania i ich stosowanie oraz preparat farmaceutyczny, zawierający te nowe związki.

Te nowe cyklopeptydy są objęte ogólnym wzorem 1 cyklo-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE) 1, w którym D oznacza D-Phe, Phe, D-homoPhe, homoPhe lub 4-Hal-Phe (w odmianie-D lub -L),

E oznacza Val, Gly, Ala, Leu, Ile lub Lys,

Hal oznacza F, Cl, Br, I, n wakuje albo oznacza rodnik alkilowy o 1-6 atomach węgla, benzyl, benzyloksykarbonyl lub rodnik aralkilowy o 1-6 atomach węgla na funkcyjnej grupie α-aminowej rodnika odpowiedniego aminokwasu, pod warunkiem, ze co najmniej jeden rodnik aminokwasu dysponuje podstawnikiem n i przy czym, o ile chodzi o rodniki optycznie czynnych aminokwasów i pochodnych aminokwasów, to są włączone zarówno ich odmiany-D jak i -L oraz ich fizjologicznie dopuszczalne sole, i przy czym wyklucza się związek <Arg-Gly-Asp-NMe-Phe-Gly>.

Podobne związki, które jednak nie zawierają żadnej N-alkilacji, są znane np. z EP 0 406 428 i FEBS Lett. 291, 50-54 (1991).

Celem wynalazku było opracowanie nowych związków o cennych właściwościach, zwłaszcza takich związków, które mogłyby być stosowane do wytwarzania środków leczniczych.

Niespodziewanie stwierdzono, ze związki o wzorze 1 i ich sole mają bardzo cenne właściwości. Przede wszystkim działają one jako inhibitory integryn, przy czym zwłaszcza hamują oddziaływanie wzajemne między receptorami β3 lub β5 integryn a ligandami. Związki wykazują szczególnie duzą skuteczność działania w przypadku integryn ayfs, avβ3 i a^3 jak również przeciwko receptorom avβl, Η5ββ i asPg. Te działania można badać np. metodą opisaną przez J.W. Smitha et al. w Biol. Chem. 265, 12267-12271 (1990). Dodatkowo występują działania przeciwzapalne.

Zależność angiogenezy od oddziaływania wzajemnego między integrynami naczyniowymi i pozakomórkowymi proteinami matrycowymi jest opisana przez P.C. Brooksa, R.A. Clarka i D.A. Cheresha w Science 264, 569-71 (1994).

Możliwość hamowania tego oddziaływania wzajemnego a tym samym powodowania apotosis (programowanej śmierci) angiogenicznych komórek naczyniowych przez peptyd pierścieniowy jest opisana przez P.C. Brooksa, A.M. Montgomeryego, M Rosenfelda, R.A. Reisfelda, T.-Hu, G. Kliera i D.A. Cheresha w Cell 79, 1157-64 (1994).

Związki o wzorze 1, które blokują oddziaływanie wzajemne między receptorami integryn a ligandami, jak np. między fibrynogenem a receptorem fibrynogenu (glikoproteiną IIb/IIIa), przeszkadzają jako antagoniści GPIIb/IIIa rozprzestrzenianiu się komórek guza przez metastazę. Świadczą o tym następujące obserwacje:

Związki mogą hamować wiązanie się metaloproteinaz z integrynami i w ten sposób przeszkadzać w wykorzystywaniu przez komórki aktywności enzymatycznej proteinaz. Przykład stanowi hamowanie wiązania się MMP-2 (matrycowej metaloproteinazy-2) z receptorem α\β^3 witronektyny przez cyklo-RGD-peptyd, co jest opisane przez P.C. Brooksa et all. w Celi 85, 683-693 (1996).

Rozprzestrzenianie się komórek guza z lokalnego guza w układzie naczyniowym następuje w wyniku tworzenia się mikroagregatów (mikrozakrzepów) powstających wskutek oddziaływania wzajemnego między komórkami guza a płytkami krwi. Komórki guza są osłaniane przez mikroagregaty ochronne i nie zostają rozpoznane przez komórki układu odpornościowego.

185 125

Mikroagregaty mogą osadzać się na ściankach naczyń, co ułatwia dalsze wdzieranie się komórek guza w tkankę. Ponieważ w tworzeniu się mikrozakrzepów pośredniczy wiązanie się fibrynogenu z receptorami fibrynogenu na aktywowanych płytkach krwi, więc antagoniści GPIIa/IIIb mogą być traktowani jako skuteczne inhibitory metastazy.

Ponadto związki o wzorze 1 mogą być stosowane jako substancje przeciwbakteryjne w operacjach wszędzie tam, gdzie używa się biomateriały, wszczepy, cewniki lub stymulatory serca. Działają one odkażająco. Skuteczność aktywności przeciwbakteryjnej można udowodnić metodą opisaną przez P. Valentin-Weigunda et al., w Infection and Immunity, 2851-2855 (1988).

Ponieważ związki o wzorze 1 są inhibitorami wiązania fibrynogenu, czyli stanowią ligandy receptorów fibrynogenu na płytkach krwi, więc mogą one być stosowane in vivo jako środki diagnostyczne do wykrywania i lokalizowania skrzepów w układzie naczyniowym, jeżeli zostaną one podstawione rodnikiem znaczonym izotopem lub rodnikiem wykrywalnym za pomocą ultrafioletu. W metodzie przedstawiania obrazowego można także przy ich użyciu wykrywać i lokalizować guzy (tumorimaging; PET).

Związki o wzorze 1 jako inhibitory wiązania fibrynynogenu mogą być także stosowane jako skuteczne środki pomocnicze do badania metabolizmu płytek krwi w różnych stadiach ich aktywacji lub do badania międzykomórkowych mechanizmów sygnalizacyjnych receptora fibrynogenu. Wykrywalna jednostka dającej się wbudowywać „etykiety'’, np biotynyl, umożliwia, po związaniu z receptorem, badanie omówionych mechanizmów.

Związki mają więc właściwość hamowania wiązania się naturalnych lub sztucznych ligandów z integrynami, zwłaszcza z integrynami σνβ3, «v[K oraz α^β3 jak również σνβι, αγβ 6 i ανβ 8·

Ponadto w stosunku do stanu techniki mają one tę zaletę, ze dzięki N-alkilowaniu jednego lub kilku wiązań peptydowych osiąga się stabilizację metaboliczną i zwiększoną rozpuszczalność w tłuszczu. Przez zmniejszenie ilości możliwych mostków wodorowych, gdyż N-alkil nie może być donorem H dla C=O, polepsza się zdolność penetracji przez błony, toteż można osiągnąć zwiększoną wchłanialność doustną i do tego może wystąpić wzmozone wiązanie z proteina-i osocza.

N-alkilowanie wiązania peptydowego zwiększa zdolności inhibicyjne związków i podwyzsza selektywność inhibicji w stosunku do określonych integryn. Na selektywność można wpływać zwłaszcza poprzez położenie i ilość grup N-alkilowych.

Związki można stosować jako substancje czynne środków leczniczych w medycynie człowieka i w weterynarii, zwłaszcza do profilaktyki i do leczenia takich chorób jak choroby układu krążenia, zakrzepica, zawał serca, stwardnienie tętnic, stany zapalne, udar mózgowy, dusznica bolesna, choroby nowotworowe, choroby osteolityczne, zwłaszcza osteoporoza, angiogeneza i schorzenia powodowane przez angiogenezę, jak np. retynopatia cukrzycowa oka, zwyrodnienie plamiste, miopia, histoplazmoza oczna, zapalenie stawów, zapalenie stawu i kości, jaskra rubeotyczna, oraz wrzodziejące zapalenie okręznicy, choroba Crohna, stwardnienie rozsiane, łuszczyca, nawroty zwężenia po angioplastii. Ponadto związki mogą być stosowane do polepszania i wspierania procesów gojenia się ran w przypadku zakażeń mikrobowych i w razie ostrej niewydolności nerek.

Te działania można udowodnić za pomocą metod znanych z literatury, opisanych np. przez P.C. Brooksa i współpracowników w Cell 79, 1157-1164 (1994) lub w Science 264, 569-571 (1994).

Podane powyżej i poniżej skróty nazw rodników aminokwasowych oznaczają rodniki aminokwasów, takich jak:

Abu	kwas 4-aminomaslo\vy
Aha	kwas 6-aminopentanokarboksylowy-1
Ala	alanina
Asn	asparagina
Asp	kwas asparaginowy
Asp(OR)	kwas asparaginowy (β-ester)
Arg	arginina

185 125

Cha Cit Cys Dab Dap Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Lys(Ac) Lys(AcNH₂) Lys(AcSH) Met Nal Nle Om Phe 4-Hal-Phe Phg Pro Pya Sar Ser Tia HomoPhe Tic Thr Trp Tyr Val

3 -cykloheksyloalanina cytrulina cysteina kwas 2,4-dwuaminomasłowy kwas 2,3-dwuaminopropionowy glutamina kwas glutaminowy glicyna histydyna izoleucyna leucyna lizyna Ns-alkanoilolizyna Ns-aminoalkanoilolizyna Ns-merkaptoalkanoilolizyna metionina 3 -(2-naftylo)-alanina norleucyna ornityna fenyloalanina 4-chlorowco-fenyloalanina fenyloglicyna prolina 3-(2-pirydylo)-alanina sarkozyna (N-metyloglicyna) seryna 3-(2-tienylo)-alanina kwas 2-amino-4-fenylomasłowy kwas tetrahydroizochinolino- 3 -karboksylowy treonina tryptofan tyrozyna walina.

Dalsze skróty oznaczają:

BOC IIIrzęd.-butoksykarbonyl

Bzl DCCI DMF EDCI	benzyl dwucykloheksylokarbodwuimid dwumetyloformamid chlorowodorek N-etylo-N'-(3 -dwumetyloaminopropylo)-karbodwuimidu
Et Fmoc HOBt Me Mtr NMe OBut OMe OEt POA i-Pr	etyl 9-fluorenylometoksykarbonyl 1 -hydroksybenzotriazol metyl 4-metoksy-2,3,6-trójmetylofenylo-sulfonyl N-metylowaną grupę α-aminową ester IIIrzęd.-butylowy ester metylowy ester etylowy fenoksyacetyl izopropyl
TBTU	czterofluoroboran 2-( 1 H-benzotriazo1-1 ilo)-1,1,3,3 -czterometylouroniowy

185 125

TFA kwas trójfiuorooctowy.

Jeżeli wyżej wymienione aminokwasy mogą występować w kilku postaciach enancjomeiycznych, wtedy powyżej i poniżej są włączone, np. jako części składowe związków 0 wzorze 1, wszystkie te postacie oraz ich mieszaniny (np. postacie DL). Ponadto aminokwasy, np. jako części składowe związków o wzorze 1, mogą być zaopatrzone w odpowiednie znane grupy zabezpieczające.

W ramy wynalazku są także włączone takie peptydy, w których rodniki aminokwasowe są częściowo lub całkowicie podstawione. Pod pojęciem „podstawione” należy rozumieć, ze są włączone także tak zwane „proleki” (ang. prodrugs), jak np., wymieniając tylko niektóre, pochodne N-guanidynoacylowe Arg, β-estry Asp, pochodne Νε-alkanoilowe, -aminoalkanoilowe, -merkaptoalkanoilowe lizyny. Ponadto rodniki aminokwasowe mogą być częściowo C-alfa-alkilowane lub, np. dla celów diagnostycznych, znaczone izotopami. Są włączone także takie związki o wzorze 1, które w łańcuchach bocznych jednostek D i E dodatkowo są podstawione przez grupy aminowe, karboksylowe lub merkaptanowe, gdyz takie pochodne są ważnymi związkami wyjściowymi do wytwarzania wielkocząsteczkowych związków sprzężonych, np. dla celów immunologicznych i do otrzymywania przeciwciał. Ponadto jest możliwe stosowanie grup funkcyjnych w łańcuchu bocznym pewnych rodników aminokwasowych lub podstawionych rodników aminokwasowych w celu unieruchamiania peptydów na materiałach polimerowych do wytwarzania kolumn do chromatografii powinowactwa lub wykorzystywanie grup funkcyjnych do podstawiania diagnostycznymi reagentami pomocniczymi, takimi jak podstawniki fluoryzujące.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania 1 cyklo-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE) 1, w którym D oznacza D-Phe, Phe, D-homoPhe, homoPhe lub 4-Hal-Phe (w odmianie-D lub -L),

E oznacza Val, Gly, Ala, Leu, Ile łub Lys,

Hal oznacza F, Cl, Br, I, n wakuje albo oznacza rodnik alkilowy o 1-6 atomach węgla, benzyl, benzyloksykarbonyl lub rodnik aralkilowy o 1-6 atomach węgla na funkcyjnej grupie α-aminowej rodnika odpowiedniego aminokwasu, pod warunkiem, że co najmniej jeden rodnik aminokwasu dysponuje podstawnikiem n i przy czym, o ile chodzi o rodniki optycznie czynnych aminokwasów 1 pochodnych aminokwasów, to są włączone zarówno ich odmiany-D jak i -L, albo jednej z jego soli, i przy czym wyklucza się związek <Arg-Gly-Asp-NMe-Phe-Gly>, polegający na tym, że uwalnia się związek o wzorze 1 z jednej z jego funkcyjnych pochodnych drogą działania środkiem solwolizującym lub hydrogenolizującym, albo że na peptyd o wzorze 2

H - Z - OH 2, w którym Z oznacza -nArg-nGly-nAsp-nD-nE-,

-nGy-nAsp-nD-nE-nArg-, -nAsp-nD-nE-nArg-nGly-, -nD-nE-nArg-nGly-nAsp- lub -nE-nArg-nGly-nAsp-nD-, albo reaktywną pochodną takiego peptydu traktuje się środkiem cyklizującym. albo ze cyklopeptyd, który właściwie odpowiada wzorowi 1, lecz wykazuje jedną lub kilka wolnych grup aminowych, grup kwasowych i/lub aktywowanych atomów α-węgla, przeprowadza się w pochodną drogą alkilowania, acylowania lub estryfikacji, i/albo ze zasadowy albo kwaśny związek o wzorze 1 przekształca się w jego sól przez działanie kwasem lub zasadą.

Rodniki D, E i n mają powyżej i poniżej znaczenia podane dla wzorów 1 i 2, jeżeli wyraźnie nie podano inaczej. Litery zastosowane dla poszczególnych rodników nie wiążą się z kodem jednoliterowym dla aminokwasów.

W poprzednich wzorach alkil oznacza przede wszystkim metyl, etyl, izopropyl, n-butyl, IIrzęd.-butyl lub Illrzęd.-butyl.

185 125

Grupą D jest przede wszystkim Phe, także uprzywilejowana D-Phe, lecz także 4-HalPhe, szczególnie 4-I-Phe oraz homo-Phe, przy czym odmiany-D są tak samo korzystne.

Zmienny składnik n oznacza w peptydzie korzystnie podstawnik N-metylowy, N-etylowy, N-propylowy, N-benzylowy lub N-izopropylowy grupy α-aminowej, przy czym kilka rodników aminokwasowych może być N-podstawionych jednakowymi lub różnymi grupami alkilowymi.

Odpowiednio do tego przedmiotem wynalazku są zwłaszcza te związki o wzorze 1, w których co najmniej jeden z wymienionych rodników ma jedno z wyżej podanych uprzywilejowanych znaczeń.

Związki o wzorze 1 jak również substancje wyjściowe do ich wytwarzania można otrzymywać znanymi metodami, opisanymi w literaturze (np. w dziełach wzorcowych takich jak Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart), stosując warunki prowadzenia reakcji znane i nadające się do przeprowadzenia omówionych reakcji. Można także wykorzystać znane, tu bliżej nie omówione warianty.

Na życzenie substancje wyjściowe można tez wytwarzać in situ tak, że nie wyodrębnia się ich z mieszaniny poreakcyjnej, lecz natychmiast przetwarza dalej na związki o wzorze 1.

Związki o wzorze 1 można otrzymać przez wydzielenie ich w stanie wolnym z ich funkcyjnych pochodnych przez solwolizę, zwłaszcza hydrolizę, lub przez hydrogenolizę.

Korzystnymi substancjami wyjściowymi do solwolizy lub hydrogenolizy są takie substancje, które zamiast jednej lub kilku wolnych grup aminowych i/lub hydroksylowych zawierają odpowiednie zabezpieczone grupy aminowe i/lub hydroksylowe, zwłaszcza takie grupy, które zamiast atomu H związanego z atomem N zawierają grupę zabezpieczającą aminę, np. takie substancje, które odpowiadają wzorowi 1, lecz zamiast grupy NH2 zawierają grupę NHR' (gdzie R' oznacza grupę zabezpieczającą aminę, np. BOC lub CBZ).

Korzystnymi są także substancje wyjściowe, które zamiast atomu H w grupie hydroksylowej zawierają grupę zabezpieczającą hydroksyl, np. takie substancje, które odpowiadają wzorowi 1, lecz zamiast grupy hydroksy-fenylowej zawierają grupę R.0-fenylową (gdzie R oznacza grupę zabezpieczającą hydroksyl).

W cząsteczce substancji wyjściowej może być obecnych także kilka - jednakowych lub różnych, zabezpieczonych grup aminowych i/lub hydroksylowych. Gdy obecne grupy zabezpieczające różnią się od siebie, wówczas w wielu przypadkach można je odszczepiać selektywnie.

Wyrażenie „grupa zabezpieczająca aminę” jest ogólnie znane 1 dotyczy grup, które są zdolne do zabezpieczania (blokowania) grupy aminowej przed reakcjami chemicznymi, lecz są łatwo usuwalne po tym, gdy żądana reakcja chemiczna zostanie przeprowadzona w innych miejscach cząsteczki. Typowymi grupami tego rodzaju są zwłaszcza niepodstawione lub podstawione grupy acylowe, arylowe, aralkoksy-metylowe lub aralkilowe. Ponieważ grupy zabezpieczające aminę usuwa się po zakończeniu żądanej reakcji (lub kilku kolejnych reakcji), więc ich rodzaj i wielkość nie stanowi ograniczenia; uprzywilejowane są jednak grupy o 1 -20, zwłaszcza o 1-8 atomach-C. Określenie „grupa acylowa” należy rozumieć w niniejszym sposobie w najszerszym zakresie. Obejmuje ono grupy acylowe wywodzące się z alifatycznych, aralifatycznych, aromatycznych lub heterocyklicznych kwasów karboksylowych lub sulfonowych jak również zwłaszcza grupy alkoksykarbonylowe, aryloksykarbonylowe i przede wszystkim aralkoksykarbonylowe. Przykładami takich grup acylowych są: alkanoil jak acetyl, propionyl, butyryl; aralkanoil jak fenyloacetyl; aroil jak benzoil lub toluoil; arylo-ksyalkanoil jak POA; alkoksykarbonyl jak metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, 2,2,2-trójchloroetoksykarbonyl, BOC, 2-jodoetoksykarbonyl; aralkiloksykarbonyl jak CBZ („karbobenzoksyl”), 4-metoksybenzyloksykarbonyl, FMOC; arylosulfonyl jak Mtr. Uprzywilejowanymi grupami aminoochronnymi są BOC i Mtr, dalej CBZ, Fmoc, benzyl i acetyl.

Wyrażenie „grupa zabezpieczająca hydroksyl” jest również ogólnie znane i dotyczy grup, które są zdolne do zabezpieczania grupy hydroksylowej przed reakcjami chemicznymi, lecz są łatwo usuwalne po tym, gdy żądana reakcja chemiczna zostanie przeprowadzona w innych miejscach cząsteczki. Typowymi grupami tego rodzaju są wyżej omówione, nie podstawione lub podstawione grupy arylowe, aralkilowe lub acylowe, jak również grupy al185 125 kilowe. Rodzaj i wielkość grup zabezpieczających hydroksyl nie stanowią ograniczenia, gdyz usuwa się je po zakończeniu żądanej reakcji lub kilku kolejnych reakcji; uprzywilejowane są grupy o 1-20, zwłaszcza o 1-10 atomach-C. Przykładami grup zabezpieczających hydroksyl są między innymi: benzyl, p-nitrobenzoil, p-toluenosulfonyl, IIIrzęd.-butyl i acetyl, przy czym szczególnie uprzywilejowane są benzyl i IIIrzęd.-butyl. Grupy COOH w kwasach asparaginowym i glutaminowym chroni się uprzywilejowanie w postaci ich estrów IIIrzęd.-butylowych (np. Asp(OBut)).

Stosowane jako substancje wyjściowe pochodne funkcyjne związków o wzorze 1, można wytwarzać zwykłymi metodami syntezy aminokwasów i syntezy peptydów, np. takimi jak metody opisane w wymienionych dziełach wzorcowych i w zgłoszeniach patentowych, np. także metodą stałofazową według Merrifielda (B. F. Gysin u. R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 94, 3102ff. (1972)).

Wydzielanie wolnych związków o wzorze 1 z ich funkcyjnych pochodnych udaje się zależnie od użytej grupy ochronnej - np. za pomocą mocnych kwasów, korzystnie za pomocą TFA lub kwasu nadchlorowego, lecz także za pomocą innych mocnych kwasów nieorganicznych jak kwasu solnego lub siarkowego, mocnych organicznych kwasów karboksylowych jak kwasu trój chlorooctowego lub kwasów sulfonowych jak kwasu benzeno- lub p-toluenosulfonowego. Obecność dodatkowego obojętnego rozpuszczalnika jest możliwa, ale nie zawsze potrzebna. Jako obojętne rozpuszczalniki nadają się zwłaszcza rozpuszczalniki organiczne, np. kwasy karboksylowe jak kwas octowy, etery jak tetrahydrofuran lub dioksan, amidy jak DMF, węglowodory chlorowcowane jak dwuchlorometan, ponadto także alkohole jak metanol, etanol lub izopropanol jak również woda. Wchodzą w grę także mieszaniny wyżej wymienionych rozpuszczalników. TFA stosuje się zwłaszcza w nadmiarze bez dodatku innego rozpuszczalnika, kwas nadchlorowy w postaci mieszaniny kwasu octowego i 70 % kwasu nadchlorowego w stosunku 9:1. Temperatura reakcji rozszczepiania mieści się korzystnie w zakresie około 0-50°C, zwłaszcza stosuje się temperaturę z zakresu 15-30°C (temperaturę pokojową).

Grupy BOC, OBut i Mtr można np. odszczepiać korzystnie za pomocą TFA w dwuchlorometanie lub za pomocą około 3 do 5n HCl w dioksanie w temperaturze 15-30°, grupę FMOC za pomocą około 5-50% roztworu dwumetyloaminy, dwuetyloaminy lub piperydyny w DMF w temperaturze 15-30°C.

Grupy zabezpieczające, usuwalne hydrogenolitycznie (np. CBZ lub benzyl) można odszczepiać np. przez działanie wodorem w obecności katalizatora (np. katalizatora z metalu szlachetnego jak palladu, korzystnie na nośniku węglowym). Jako rozpuszczalniki nadają się przy tym wyżej omówione, zwłaszcza np. alkohole jak metanol lub etanol albo amidy jak DMF. Hydrogenolizę przeprowadza się z reguły w temperaturze około 0-100°C i pod ciśnieniem około 0,1-20 MPa, korzystnie w temperaturze 20-30°C pod ciśnieniem 0,1-1 MPa. Hydrogenoliza grupy CBZ udaje się np. dobrze na 5-10% Pd-C w metanolu lub za pomocą mrówczanu amonu (zamiast Hz) na Pd-C w mieszaninie metanol/DMF w temperaturze 20-30°C.

Związki o wzorze 1 można także otrzymać przez cyklizację związków o wzorze 2 w warunkach syntezy peptydów. Stosuje się przy tym zwykłe metody syntezy peptydów, np. takie jak opisane w Houben-Weyl, 1.c., tom 15/11, strony 1-806 (1974).

Reakcja udaje się zwłaszcza w obecności środka odwadniającego, np. karbodwuimidu jak DCCI lub EDC1, ponadto bezwodnika kwasu propanofosfonowego (porówn. Angew. Chem. 92, 129 (1980)), azydku dwufenylofosforylu lub 2-etoksy-N-etoksykarbonylo-1,2-dihydrochinoliny,' w obojętnym rozpuszczalniku, np. w węglowodorze chlorowcowanym jak dwuchlorometanie, eterze jak tetrahydrofuranie lub dioksanie, amidzie jak DMF lub dwumetyloacetamidzie, nitrylu jak acetonitrylu, lub w mieszaninach tych rozpuszczalników, w temperaturze od około -10°C do 40°C, zwłaszcza 0-30°C. W celu przyczynienia się do przebiegnięcia cyklizacji wewnątrzcząsteczkowej przed wytworzeniem wiązań peptydowych międzycząsteczkowych należy prowadzić postępowanie w rozcieńczonych roztworach (reguła rozcieńczeń).

Zamiast związków o wzorze 2 mogą być stosowane w reakcji tez odpowiednie reaktywne pochodne tych związków, w których reaktywne grupy są zablokowane pośrednio przez

185 125 grupy zabezpieczające. Pochodne aminokwasów o wzorze 2 mogą być stosowane np. w postaci ich aktywowanych estrów, które wytwarza się korzystnie in situ, np. przez dodanie HOBt lub N-hydroksysukcynimidu.

Substancje wyjściowe o wzorze 2 są z reguły nowe. Można je wytwarzać znanymi metodami, np. wyżej podanymi metodami syntezy peptydów i odszczepiania grup zabezpieczających.

Z reguły najpierw syntetyzuje się zabezpieczone estry pentapeptydu o wzorze R'-Z-OR, np. BOC-Z-OMe lub BOC-Z-OEt, które następnie zmydla się do kwasów o wzorze R'-Z-OH, np. BOC-Z-OH; od tych ostatnich odszczepia się grupę zabezpieczającą R', w wyniku czego otrzymuje się wolne peptydy o wzorze H-Z-OH (2).

Podstawianie cyklopeptydu, który jako taki odpowiada związkowi o wzorze 1, odbywa się również metodami znanymi jako metody alkilowania amin, estryfikowania kwasów karboksylowych lub podstawiania nukleofilowego alifatycznych atomów-C i opisanymi w każdym podręczniku chemii organicznej, np. J. March, Adv. Org. Chem., John Wiley & Sons N. Y. (1985).

Zasadę o wzorze 1 można przekształcić przez reakcję z kwasem w odpowiednią sól addycyjną kwasu. Jako kwasy do wykonywania tej reakcji wchodzą w grę zwłaszcza kwasy, które dają sole tolerowane fizjologicznie. Tak więc mogą być stosowane kwasy nieorganiczne, np. siarkowy, azotowy, kwasy chlorowcowodorowe jak chlorowodorowy lub bromowodorowy, kwasy fosforowe jak ortofosforowy, kwas sulfaminowy, ponadto kwasy organiczne, zwłaszcza alifatyczne, alicykliczne, aralifatyczne, aromatyczne lub heterocykliczne, jednolub wielozasadowe kwasy karboksylowe, sulfonowe lub siarkowe, np. kwas mrówkowy, octowy, propionowy, piwalinowy, dwuetylooctowy, malonowy, bursztynowy, pimelinowy, fumarowy, maleinowy, mlekowy, winowy, jabłkowy, benzoesowy, salicylowy, 2- lub

3-fenylo-propionowy, cytrynowy, glikonowy, askorbinowy, nikotynowy, izonikotynowy, metano-lub etanosulfonowy, etanodwusul-fonowy, 2-hydroksyetanosulfonowy, benzenosulfonowy, p-to-luenosulfonowy, naftaleno-jedno- i -dwusulfonowy, laurylosiarkowy. Sole z kwasami nie tolerowanymi fizjologicznie, np. pikryniany, mogą być stosowane do wyodrębniania i/lub oczyszczania związków o wzorze 1.

Natomiast kwas o wzorze 1 można przez reakcję z zasadą przekształcić w jedną z jego tolerowanych fizjologicznie soli metali lub soli amonowych. Jako sole wchodzą przy tym w grę zwłaszcza sole sodowe, potasowe, magnezowe, wapniowe i amoniowe, np. sole dwumetylo-, dwuetylo- lub dwuizopropylo-amoniowe, sole jednoetanolo-, dwuetanolo- lub trójetanoloamoniowe, sole cykloheksylo-, dwucykloheksyloamoniowe, sole dwubenzyloetylenodwuamoniowe, ponadto np. sole z N-metylo-D-glikaminą lub z argininą albo lizyną.

Preparat farmaceutyczny, zawierający znane substancje pomocnicze oraz substancję czynną wyróżnia się według wynalazku tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden związek o wzorze 1 cyklo-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE) 1, w którym D oznacza D-Phe, Phe, D-homoPhe, homoPhe lub 4-Hal-Phe (w odmianie-D lub -L),

E oznacza Val, Gly, Ala, Leu, Ile lub Lys,

Hal oznacza F, Cl, Br, I, n wakuje albo oznacza rodnik alkilowy o 1-6 atomach węgla, benzyl, benzyloksykarbonyl lub rodnik aralkilowy o 1-6 atomach węgla na funkcyjnej grupie α-aminowej rodnika odpowiedniego aminokwasu, pod warunkiem, ze co najmniej jeden rodnik aminokwasu dysponuje podstawnikiem n i przy czym, o ile chodzi o rodniki optycznie czynnych aminokwasów i pochodnych aminokwasów, to są włączone zarówno ich odmiany-D jak i -L i/lub jedną z jego fizjologicznie dopuszczalnych soli, i przy czym wyklucza się związek <Arg-Gly-AspNMe-Phe-Gly>.

Związki o wzorze 1 cyklo-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE) 1, w którym D oznacza D-Phe, Phe, D-homoPhe, homoPhe lub 4-Hal-Phe (w odmianie-D lub -L),

E oznacza Val, Gly, Ala, Leu, Ile lub Lys,

Hal oznacza F, Cl, Br, I,

185 125 n wakuje albo oznacza rodnik alkilowy o 1-6 atomach węgla, benzyl, benzyloksykarbonyl lub rodnik aralkilowy o 1-6 atomach węgla na funkcyjnej grupie α-aminowej rodnika odpowiedniego aminokwasu, pod warunkiem, ze co najmniej jeden rodnik aminokwasu dysponuje podstawnikiem n i przy czym, o ile chodzi o rodniki optycznie czynnych aminokwasów i pochodnych aminokwasów, to są włączone zarówno ich odmiany-D jak i -L albo ich fizjologicznie dopuszczalnych soli, i przy czym wyklucza się związek <Arg-Gly-Asp-NMe-PheGly>, stosuje się według wynalazku do wytwarzania środka leczniczego do leczenia zakrzepicy, zawału serca, stwardnienia tętnic, stanów zapalnych, udaru mózgowego, dusznicy bolesnej, chorób nowotworowych, chorób osteolitycznych, osteoporozy, retynopatii oczu, zapalenia stawu, zapalenia stawu i kości, jaskry rubeotycznej, wrzodziejącego zapalenia okręznicy, choroby Crohna, stwardnienia rozsianego, łuszczycy, nawrotów zwężenia, zakażeń mikrobowych lub ostrej niewydolności nerek.

Nowe związki o wzorze 1 i ich tolerowane fizjologicznie sole mogą być stosowane do wytwarzania preparatów farmaceutycznych przez przekształcanie ich razem z co najmniej jedną substancją nośnikową lub pomocniczą i, gdy jest to pożądane, razem z jedną lub kilkoma dalszymi substancjami czynnymi w odpowiednią postać dawkowania. Tak otrzymane preparaty mogą być używane jako środki lecznicze w medycynie lub w weterynarii. Jako substancje nośnikowe wchodzą w grę substancje organiczne lub nieorganiczne, które nadają się do stosowania jelitowego (np. doustnego lub doodbytniczego), pozajelitowego (np. w postaci zastrzyków dożylnych) albo lokalnego (np. miejscowego, przezskórnego, oftalmicznego lub przez nos) albo do stosowania w postaci aerozolu inhalacyjnego i nie reagują z nowymi związkami, np. woda lub izotoniczny roztwór wodny soli kuchennej, niższe alkohole, oleje roślinne, alkohole benzylowe, glikole polietylenowe, trój octan gliceryny i inne glicerydy kwasów tłuszczowych, żelatyna, lecytyna sojowa, węglowodany jak laktoza lub skrobia, stearynian magnezu, talk, celuloza, wazelina. Do podawania doustnego służą zwłaszcza tabletki, drażetki, kapsułki, syropy, soki lub krople, na uwagę zasługują specjalne tabletki powlekane i kapsułki z powłokami oraz otoczkami odpornymi na działanie soku żołądkowego. Do stosowania doodbytniczego służą czopki, do podawania pozajelitowego roztwory, zwłaszcza roztwory olejowe lub wodne, dalej zawiesiny, emulsje lub implantaty. Do stosowania miejscowego nadają się np. roztwory, które mogą być stosowane w postaci kropli do oczu, dalej np. zawiesiny, emulsje, kremy, maście lub kompresy. Do stosowania w postaci spray'u inhalacyjnego mogą być używane spray'e, które zawierają substancję czynną rozpuszczoną lub zawieszoną w gazie pędnym albo w mieszaninie gazów pędnych (np. CO 2 lub substancji zastępczych fluorochlorowęglowodorów). Substancję czynną stosuje się przy tym korzystnie w postaci zmikronizowanej, przy czym można dodawać jeden lub więcej dodatkowych, tolerowanych fizjologicznie rozpuszczalników, np. etanol. Roztwory inhalacyjne można podawać za pomocą zwykłych inhalatorów. Nowe związki można także liofilizować a otrzymane liofilizaty stosować do wytwarzania preparatów zastrzykowych. Zastrzyki mogą być przy tym dawane w postaci bolusowej lub jako ciągłe wlewy (np. dożylnie, domięśniowo, podskórnie lub śródpowłokowo). Omówione preparaty mogą być wyjaławiane i/lub zawierać substancje pomocnicze jak środki konserwujące, stabilizujące i/lub powierzchniowo czynne, emulgatory, sole wpływające na ciśnienie osmotyczne, substancje buforowe, substancje barwiące i/lub zapachowe. Gdy jest to pożądane, mogą one także zawierać jedną lub więcej dalszych substancji czynnych, np. także jedną lub więcej witamin.

Substancje według wynalazku mogą być podawane z reguły analogicznie jak inne znane, występujące w handlu peptydy, a zwłaszcza analogicznie jak związki opisane w US-A4 472 305, przede wszystkim w dawkach około 0,05-500, zwłaszcza 0,5-100 mg w jednostce dawkowania. Dawka dobowa mieści się przede wszystkim w zakresie około 0,01-2 mg/kg ciężaru ciała. Specjalna dawka dla każdego określonego pacjenta zależy jednak od najrozmaitszych czynników, np. od skuteczności działania zastosowanego określonego związku, od wieku, ciężaru ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, od pożywienia, od pory i drogi podawania, od prędkości wydalania, kombinacji substancji leczniczych i od stopnia ciężkości każdego schorzenia, którego dotyczy terapia. Stosowanie pozajelitowe jest uprzywilejowane.

185 125

Związek według niniejszego wynalazku, w którym Arg lub DArg jest zastąpiony przez Om lub DOrn może być używany jako substancja wyjściowa do syntezy peptydów według wynalazku, ponieważ Om można przekształcić w Arg przez guanidynowanie. Metoda ta nadaje się zwłaszcza do wytwarzania peptydów znaczonych przez ¹ *C lub ¹⁴C zawierających Arg.

Nowe związki o wzorze 1 można tez stosować jako ligandy integryny do wytwarzania kolumn do chromatografii powinowactwa używanych do oczyszczania integryn.

Ligand, to znaczy pochodna peptydu o wzorze 1, sprzęga się przy tym kowalencyjnie z nośnikiem polimerowym za pośrednictwem funkcji kotwicowych.

Jako polimerowe materiały nośnikowe nadają się znane już w chemii peptydów stałe fazy polimerowe o przeważających właściwościach hydrofitowych, np. usieciowane poprzecznie policukry, jak celuloza, sefaroza, Sephadex®, akrylamidy, polimery na bazie glikolu polietylenowego lub Tentakelpolymery®.

Jako funkcje kotwicowe, które są powiązane z nośnikami polimerowymi, nadają się przede wszystkim liniowe łańcuchy alkilenowe o 2-12 atomach C, które jednym końcem są połączone bezpośrednio z polimerem a na drugim końcu posiadają grupę funkcyjną, np. hydroksylową, aminową, merkaptanową, maleinoimidowa lub -COOH i do tego są zdolne do łączenia się z C- lub N-końcowym odcinkiem każdego peptydu.

Peptyd może przy tym łączyć się z kotwicą polimeru bezpośrednio lub poprzez drugą funkcję kotwicową. Peptydy mogą także zawierać rodniki aminokwasowe z funkcyjnymi łańcuchami bocznymi, poprzez które łączą się one z funkcjami kotwicowymi polimeru.

Ponadto pewne rodniki aminokwasowe, które są częściami składowymi peptydów o wzorze 1, mogą być tak zmodyfikowane w ich łańcuchach bocznych, że stoją one do dyspozycji do zakotwienia z kotwicami polimeru np. poprzez grupy SH-, OH- lub COOH-.

Możliwe są przy tym nadzwyczajne aminokwasy, jak np. pochodne fenyloalaniny, które w pozycji 4 pierścienia fenylowego niosą łańcuch merkapto-, hydroksy-, amino- lub karboksyalkilowy, przy czym grupa funkcyjna znajduje się na końcu łańcucha.

Przykładami rodników aminokwasowych, których łańcuch boczny może służyć bezpośrednio jako funkcja kotwicowa są np. Lys, Om, Arg, Dab, Dap, Asp, Asn, Glu, Gin, Ser, Thr, Cys, Cit lub Tyr.

Przykładami N-końcowych kotwic są takie rodniki jak np. -CO-CnH₂n-NH2, -CO-CnH2n-OH, -CO-C„H₂n-SH lub -CO- C_nH_2n-COOH zn=2-12, przy czym długość łańcucha alkilenowego nie jest krytyczna i ewentualnie może on być zastąpiony także przez odpowiednie rodniki arylowe lub alkiloarylowe.

Kotwicami C-końcowymi mogą być np. -O-CnH2n-SH-, -O-CnH2n-OH, -O-C_nH2n-NH2, O-CnH2n-COOH, -NH-CnH2n-SH, -NH-CnI bn-OH, -NH-CnH2n-NH2 lub -NH-CnH2n-COOH, przy czym dla n jak i dla łańcucha alkilenowego obowiązuje także uwaga podana w poprzednim fragmencie.

N- i C-końcowe kotwice mogą także służyć jako moduł kotwicowy dla już zaopatrzonego w funkcję łańcucha bocznego rodnika aminokwasowego. Wchodzą tu w grę np. takie rodniki aminokwasowe jak Lys(CO-C5H10-NH2), Asp(NH-C3H6-COOH) lub Cys(C3H6-NH2), przy czym kotwica zawsze jest powiązana z grupą funkcyjną łańcucha bocznego.

Wytwarzanie materiałów dla chromatografii powinowactwa stosowanej do oczyszczania integryn odbywa się w znanych warunkach w jakich prowadzi się kondensację aminokwasów, które juz zostały opisane we fragmencie dotyczącym wytwarzania związków o wzorze 1.

Oprócz stosowania cyklopeptydów do unieruchamiania ich na materiałach polimerowych do wytwarzania kolumn do chromatografii powinowactwa, jest możliwe używanie związków z ich wyposażonymi w funkcje łańcuchami bocznymi do dalszego podstawiania diagnostycznymi reagentami pomocniczymi, jak np podstawnikami fluoryzującymi

Ponadto jest możliwe wprowadzanie do łańcuchów bocznych rodników D i E dodatkowych grup funkcyjnych, takich jak grupy aminowe, merkaptanowe lub karboksylowe, za pośrednictwem których można następnie wytwarzać produkty sprzęgania z proteinami lub z innymi wielkocząsteczkowymi substancjami, np. dla celów immunologicznych i/lub wytwarzania przeciwciał.

185 125

Zarówno powyżej jak i poniżej wszystkie temperatury są podane w °C. W ponizszych przykładach zwrot „zwykłe wykańczanie” oznacza: gdy jest to pożądane dodaje się wodę, zobojętnia, poddaje ekstrakcji eterem lub dwuchloroetanem, rozdziela, suszy fazę organiczną siarczanem sodu, filtruje, odparowuje i oczyszcza przez chromatografię na żelu krzemionkowym i/lub przez krystalizację. RZ = czas retencji (minuty). Badanie analityczne odbywało się za pomocą HPLC na kolumnie Lichrosorb®RP select B (7 pm) - 250x4 mm, eluent A: 0,3% TFA w wodzie; eluent B: 0,3% TFA w mieszaninie propanol-2/woda (8:2). Gradient 1 - 99% B w ciągu 50 min przy 1 ml/min. Przepływ i detekcja przy 215 nm. M = pik cząsteczkowy w widmie masowym, otrzymany metodą „bombardowania szybkimi atomami” („Fast Atom Bombardment” - FaB).

Przykład I. Roztwór 0,6 g H-NMe-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Val-ONa [otrzymywanego np. z Fmoc-NMe-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Val-O-Wang, przy czym -O-Wang oznacza stosowany w zmodyfikowanych technikach Merrifielda rodnik żywicy

4-oksymetylo-fenoksy-etylo-polistyrenowej, przez odszczepienie grupy Fmoc za pomocą piperydyny/DMF i odszczepienie żywicy za pomocą TFA/CHzCis (1:1)] w 15 ml DMF rozcieńcza się porcją 85 ml dwuchlorometanu i dodaje 50 mg NaHCOj. Po ochłodzeniu w mieszaninie suchy lód/aceton dodaje się 40 pl azydku dwufenylofosforylu. Po 16 godzinach stania w temperaturze pokojowej roztwór zagęszcza się. Koncentrat filtruje się (kolumna zSephadexu G10 w mieszaninie izopropanol/woda 8:2) i po tym oczyszcza jak zwykle za pomocą HPLC. Po obróbce mieszaniną TFA/H ₂O (98:2) otrzymuje się cyklo-(NMe-Arg-GlyAsp-D-Phe-Val);

RZ = 18,1; FAB-MS (M+H): 589.

Analogicznie otrzymuje się przez cyklizację odpowiednich peptydów liniowych i odszczepienie grup zabezpieczających:

cyklo-(Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Val); RZ=17,9; FAB-MS (M+H): 589; cyklo-(Arg-Gly-NMe-Asp-DPhe-Val); RZ=18,3; FAB-MS (M+H): 589; cyklo-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val)xTFA; RZ=15,4; FAB-MS (M+H) : 589; cyklo-(Arg-Gly-AspNMeDPhe-Val); RZ=18,9; FaB-MS (M+H): 589; cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal); RZ=19,5; FAB-MS (M+H): 589; cyklo-(Arg-Gły-Asp-DPhe-NMeLys); RZ=11,1; FAB-MS (M+H): 618; cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeLys(benzyloksykarbonyl)xTFA;RZ=23,4;

FAB-MS (M+H) : 752;

cyklo-(NEtArg-Gly-Asp-DPhe-Yal); FAB-MS (M+iH): 603; cyklo-(Arg-NEtGly-Asp-DPhe-Val); FAB-MS (M+H): 603; cyklo-(Arg-Gly-NEt.As{>-DPhe-Val); FAB-MS (M+H): 603; cyklo-(Arg-Gly-Asp-NEtDPhe-Val); FAB-MS (m+H) : 603; cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NEtVal); FAB-MS (M+H): 603; cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe(4-1)-NMeVal); RZ=23,5; FAB-MS (M+H): 715; cyklo-(NPrArg-Gly-Asp-DPhe-Val); FaB-MS (M+H): 617; cyklo-(Arg-NPrGly-Asp-DPhe-Val); FAB-MS (M+iH): 617; cyklo-(Arg-Gly-NPrAsp-DPhe-Val); FAB-MS (M+1H) : 617; cyklo-(Arg-Gly-Asp-NPrDPhe-Val); FAB-MS (M+iH): 617; cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NPrVal); FAB-MS (M+H): 617; cyklo-(NBzlArg-Gly-Asp-DPhe-Val); FAB-MS (M+H) : 665; cyklo-(Arg-NBzlGly-Asp-DPhe-Val); FAB-MS (m+H) : 665; cyklo-(Arg-Gly-NBzlAsp-DPhe-Val); FAB-MS (M+H): 665; cyklo-(Arg-Gly-Asp-NBzlDPhe-Val); FAB-MS (M+H) : 665; cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NBzlVal); FAB-MS (M+H) : 665; cyklo-(Arg-Gly-Asp-Phe-DNMeVal) x TFA; RZ=18,2; FAB-MS (M+H) : 589; cyklo-(NMeArg-Gły-Asp-DPhe-Leu); FAB-MS (M+H) : 603; cyklo-(Arg-NMeGły-Asp-DPhe-Leu); FAB-MS (M+H) : 603; cyklo-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Leu); FAB-MS (M+H) : 603; cyklo-(Arg-Gly-Asp-NMeDPhe-Leu), FAB-MS (m+h) : 603, cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeLeu); FAB-MS (m+H) : 603;

185 125 cyklo-fNEtArg-Gly-Asp-DPhe-Leu); FAB-MS (M+H): 617; cyklo-(Arg-NEtGly-Asp-DPhe-Leu), FAB-MS (M+H) : 617; cyklo-fArg-Gly-NEtAsp-DPhe-Leu); FAB-MS (M+H) : 617; cyklo-CArg-Gly-Asp-NEtDPhe-Leu); FAB-MS (M+H) : 617; cyklo^Arg-Gly-Asp-DPhe-NEtLeu); FAB-MS (m+h) : 617; cyklo-fNPrArg-Gly-Asp-DPhe-Leu); FAB-MS (m+h) : 631; cyklo^Arg-NPrGly-Asp-DPhe-Leu); FAB-MS (m+h) : 631; cyklo^Arg-Gly-NPrAsp-DPhe-Leu); FAB-MS (M+H) : 631; cyklo-(Arg-Gly-Asp-NPi^DPhe-Leu); FAB-MS (M+H): 631; cyklo^Arg-Gly-Asp-DPhe-NPrLeu); FAB-MS (M+H): 631; cyklo-(NBzlArg-Gly-Asp-DPhe-Leu); FAB-MS (M+H) : 679; cyklo-(Arg-NBzlGly-Asp-DPhe-Leu); FAB-MS (m+H) : 679; cyklo^Arg-Gly-NBzIAsp-DPhe-Leu); FAB-MS (M+iH : 679; cyklo^Arg-Gly-Asp-NBzlDPhe-Leu); FAB-MS (m+H) : 679; cyklo-lArg-Gly-Asp-DPhe-NBzlLeu); FAB-MS (M+H): 679; cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeAla); RZ =16,2; FAB-MS (M+H): 561; cyklo-CArg-Gly-Asp-DPhe-NMeGly); RZ=14,3; FAB-MS (M+H): 547; cνklo-(DArg-Glν-Asp-DPhe-NMeVal) x TFA; RZ=18,7; FAB-MS (M+H) : 589. Przykład II. Roztwór 0,28 g cyklo-(Arg(Mtr)-Glν-Asp-NMePhe-DVal) [otrzymywanego przez cyklizację według przykładu I] w 8,4 ml tFa, 1,7 ml dwuchlorometanu i 0,9 ml tiofenolu pozostawia się w ciągu 4 godzin w temperaturze pokojowej, następnie zalezą i po rozcieńczeniu wodą suszy sublimacyjnie. Filtracja żelowa na Sephadexie G10 (kwas octowy/woda 1:1) i następujące po tym oczyszczanie w preparatywnej HPLC w podanych warunkach daje cyklo-(Arg-Gly-Asp-NMePhe-DVal); FAB-MS (M+H): 589

Analogicznie z cyklo-(Arg(Mtr)-Gly-NMeAsp-DPhe-Ile) otrzymuje się cyklo-(Arg-GlyNMeAsp-DPhe-Ile); FAB-MS (M+H): 603.

Przykład III. 80 mg cyklo-(Arg-Glν-Asp-DPhe-NMeVal) rozpuszcza się pięcio- do sześciokrotnie w 0,01 m HCl i po każdym rozpuszczeniu suszy sublimacyjnie. Wykonane po tym oczyszczanie przez HPLC daje cνklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xHCI; FAB-Ms (M+H):589.

Analogicznie otrzymuje się: z cykdobArg-NMcGly-Asp-DPhe-Yal) :

cyklo-(Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Val) xHCl; FAB-MS (M+^): 589; z cyklo^Arg-Gly-Asp-Phe-DNMeAal) :

cyklo^Arg-Gly-Asp-Phe-DNMe^al^HCi; RZ=18,2; FAB-MS (M+H): 589.

Analogicznie otrzymuje się przez działanie kwasem octowym (AcOH): z cνkio-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Vali:

cνkio-(Arg-Giy-NMeAsp-DPhe-Val)xAcOH; RZ=15,4; FAB-MS (M-^^) : 589.

Analogicznie otrzymuje się przez działanie kwasem metanosul-fonowym (MeSOjH): z cykloKArg-Gly-Asp-DIPie-NMeνηΚ :

cνkio-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xMeSO3H; RZ=17,8, FAB-MS (M+H): 589.

Przykład IV. W celu wytwarzania faz powinowactwa 0,9 g N-maleinimido-(CH2)s-CO-NH-(CH2)3-polimeru [otrzymywanego przez kondensację N-maleinimido-(CH2)5-COOH z H2N-(CH2)3-polimerem] przeprowadza się w stan zawiesiny w 10 ml 0,1 M fosforanu sodu jako buforu przy pH 7 i dodaje w temperaturze 4°C równoważnik cyklo^Arg-Gly-Asp-DPheNMeLys(CO(CH2)2SH). Miesza się w ciągu 4 godzin ogrzewając równocześnie mieszaninę reakcyjną do temperatury pokojowej, odfiltrowuje stałą pozostałość i przemywa dwukrotnie porcjami po 10 ml roztworu buforowego (pH 7) i następnie trzykrotnie porcjami po 10 ml wody. Otrzymuje się cyklo^Arg-Gty-Asp-DPhe-NMeLys^C^CHb^SB-CN-maleinimido(CH2)5-CONH-(CH2)3-polimer)).

Przykład V. Analogicznie jak w przykładzie IV otrzymuje się przez kondensację związku: polimer-O-(CFI^2)3-NH^2 [dostępnego w handlu] z cνkio-(Arg-Giν-Asp-NMe-DPheLys(CO(CH2)4-COOH) [otrzymywanego przez kondensację kwasu adypinowego z cyklo185 125 (Arg-Gly-Asp-NMe-DPhe-Lys) w omówionych warunkach] następującą fazę polimerową: cyklo-(Arg-Gly-Asp-NMe-DPhe-Lys-(CO-(CH2)4-CO-NH-(CH2)3-O-polimer).

Analogicznie otrzymuje się przez kondensację cyklo-(ŃMe-Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(CO-(CH2)5-NH2)) z HOOC-CH2-O-polimerem:

cyklo-(NMe-Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys-(CO-(CH2)₅-NH-CO-CH2-O-polimer)).

Poniższe przykłady dotyczą preparatów farmaceutycznych.

Przykład VI. Pojemniki szklane do zastrzyków

Roztwór 100 g cyklopeptydu o wzorze 1 i 5 g wodorofosforanu dwusodowego w 3 litrach dwukrotnie destylowanej wody nastawia się za pomocą 2n kwasu solnego na pH 6,5, filtruje jałowo i rozlewa do pojemników szklanych do zastrzyków, liofilizuje w jałowych warunkach i zamyka jałowo. Każdy pojemnik szklany do zastrzyków zawiera 5 mg substancji czynnej.

Przykład VII. Czopki

Stapia się mieszaninę 20 g substancji czynnej o wzorze 1 ze 100 g lecytyny sojowej i 1400 g masła kakaowego, rozlewa do form i pozostawia do ostygnięcia. Każdy czopek zawiera 20 mg substancji czynnej.

Przykład VIII. Roztwór

Przygotowuje się roztwór 1 g substancji czynnej o wzorze 1, 9,38 g NaH2PO 4Χ 2 H2O, 28,48 g Na2HPO4xl 2H22O, i 0,1 g chlorku benzalkoniowego w 940 ml dwukrotnie destylowanej wody. Nastawia się odczyn na pH 6,8, dopełnia do 1 litra i wyjaławia przez naświetlanie. Taki roztwór może być stosowany w postaci kropli do oczu.

Przykład IX. Maść

Miesza się w aseptycznych warunkach 500 mg substancji czynnej o wzorze 1 z 99,5 g wazeliny.

Przykład X. Tabletki

Z mieszaniny 1000 g cyklopeptydu o wzorze 1, 1 kg laktozy, 600 g celulozy mikrokrystalicznej, 600 g skrobi kukurydzianej, 1000 g poliwinylopirolidonu, 80 g talku i 10 g stearynianu magnezu wytwarza się w zwykły sposób przez prasowanie tabletki, z których każda zawiera 10 mg substancji czynnej.

Przykład XI. Drażetki

Przez prasowanie wytwarza się tabletki jak w przykładzie X i następnie powleka je warstwą składającą się z sacharozy, skrobi kukurydzianej, talku, tragakantu i barwnika.

Przykład XII. Kapsułki

Kapsułki z twardej żelatyny napełnia się w zwykły sposób substancją czynną o wzorze 1, tak że każda kapsułka zawiera 5 mg substancji czynnej.

Przykład XIII. Aerozol do inhalacji g substancji czynnej o wzorze 1 rozpuszcza się w 10 litrach izotonicznego roztworu NaCl i rozlewa roztwór do naczyń rozpyłowych z mechanizmem pompowania. Roztwór może być rozpylany w ustach lub w nosie. Jedno naciśnięcie rozpylające (około 0,1 ml) odpowiada dawce około 0,14 mg.

185 125

Cyclo - (nArg -nGly-nAsp-nD-nE)

Wzór 1

H-Z- OH

Wzór 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowe związki, cyklopeptydy o wzorze 1 cyklo-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE) 1, w którym D oznacza D-Phe, Phe, D-homoPhe, homoPhe lub 4-Hal-Phe (w odmianie-D lub -L),

E oznacza Val, Gly, Ala, Leu, Ile lub Lys,

Hal oznacza F, Cl, Br, I, n wakuje albo oznacza rodnik alkilowy o 1-6 atomach węgla, benzyl, benzyloksykarbonyl lub rodnik aralkilowy o 1-6 atomach węgla na funkcyjnej grupie α-aminowej rodnika odpowiedniego aminokwasu, pod warunkiem, że co najmniej jeden rodnik aminokwasu dysponuje podstawnikiem n i przy czym, o ile chodzi o rodniki optycznie czynnych aminokwasów i pochodnych aminokwasów, to są włączone zarówno ich odmiany-D jak i -L oraz ich fizjologicznie dopuszczalne sole, i przy czym wyklucza się związek <Arg-Gly-Asp-NMe-Phe-Gly>.
2. Enancjomer lub diastereoizomer nowego związku o wzorze 1 według zastrz. 1.
3. Związki według zastrz. 1 albo 2, w których D oznacza D-Phe lub Phe, n wakuje albo oznacza metyl, etyl, propyl, benzyl lub benzyloksykarbonyl, pod warunkiem, że jeden lub oba rodniki aminokwasu dysponują podstawnikiem n.
4. Związki według zastrz. 1, którymi są (a) cyklo-(NmeArg-Gly-Asp-D-Phe-Val);

(b) cyklo-(Arg-Gly-Asp-Dphe-NmeVal);

(c) cyklo-(Arg-NmeGly-Asp-Dphe-Val);

(d) cyklo-(Arg-Gly-NmeAsp-Dphe-V al);

(e) cyklo-(Arg-Gly-Asp-NmeDPhe-Val); oraz ich fizjologicznie dopuszczalne sole.
5. Sposób wytwarzania związku o wzorze 1 cyklo-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE) 1, w którym D oznacza D-Phe, Phe, D-homoPhe, homoPhe lub 4-Hal-Phe (w odmianie-D lub -L),

E oznacza Val, Gly, Ala, Leu, Ile lub Lys,

Hal oznacza F, Cl, Br, I, n wakuje albo oznacza rodnik alkilowy o 1-6 atomach węgla, benzyl, benzyloksykarbonyl lub rodnik aralkilowy o 1-6 atomach węgla na funkcyjnej grupie α-aminowej rodnika odpowiedniego aminokwasu, pod warunkiem, ze co najmniej jeden rodnik aminokwasu dysponuje podstawnikiem n i przy czym, o ile chodzi o rodniki optycznie czynnych aminokwasów i pochodnych aminokwasów, to są włączone zarówno ich odmiany-D jak i -L, albo jednej z jego soli, i przy czym wyklucza się związek <Arg-Gly-Asp-NMe-Phe-Gly>, znamienny tym, że uwalnia się związek o wzorze 1 z jednej z jego funkcyjnych pochodnych drogą działania środkiem solwolizującym lub hydrogenolizującym, albo ze na peptyd o wzorze 2

H - Z - OH 2, w którym Z oznacza -nArg-nGly-nAsp-nD-nE-,

-nGly-nAsp-nD-nE-nArg-,

-nAsp-nD-nE-nArg-nGly-,

-nD-nE-nArg-nGly-nAsp- lub -nE-nArg-nGly-nAsp-nD-, albo reaktywną pochodną takiego peptydu traktuje się środkiem cyklizującym, albo ze cyklopeptyd, który właściwie odpowiada wzorowi 1, lecz wykazuje jedną lub kilka wolnych grup aminowych, grup kwasowych i/lub aktywowanych atomów α-węgla, przeprowadza się w pochodną drogą alkilowania, acylowania lub estryfikacji, i/albo ze zasadowy albo kwaśny związek o wzorze 1 przekształca się w jego sól przez działanie kwasem lub zasadą.
6. Preparat farmaceutyczny, zawierający znane substancje pomocnicze oraz substancję czynną, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden związek o wzorze 1 cyklo-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE) 1, w którym D oznacza D-Phe, Phe, D-homoPhe, homoPhe lub 4-Hal-Phe (w odmianie-D lub -L),

E oznacza Val, Gly, Ala, Leu, Ile lub Lys,

Hal oznacza F, Cl, Br, I, n wakuje albo oznacza rodnik alkilowy o 1-6 atomach węgla, benzyl, benzyloksykarbonyl lub rodnik aralkilowy o 1-6 atomach węgla na funkcyjnej grupie α-aminowej rodnika odpowiedniego aminokwasu, pod warunkiem, że co najmniej jeden rodnik aminokwasu dysponuje podstawnikiem n i przy czym, o ile chodzi o rodniki optycznie czynnych aminokwasów 1 pochodnych aminokwasów, to są włączone zarówno ich odmiany-D jak i -L i/lub jedną z jego fizjologicznie dopuszczalnych soli, i przy czym wyklucza się związek <Arg-Gly-AspNMe-Phe-Gly>.
7. Stosowanie związków o wzorze 1 cyklo-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE) 1, w którym D oznacza D-Phe, Phe, D-homoPhe, homoPhe lub 4-Hal-Phe (w odmianie-D lub -L),

E oznacza Val, Gly, Ala, Leu, Ile lub Lys,

Hal oznacza F, Cl, Br, I, n wakuje albo oznacza rodnik alkilowy o 1-6 atomach węgla, benzyl, benzyloksykarbonyl lub rodnik aralkilowy o 1-6 atomach węgla na funkcyjnej grupie α-aminowej rodnika odpowiedniego aminokwasu, pod warunkiem, że co najmniej jeden rodnik aminokwasu dysponuje podstawnikiem n i przy czym, o ile chodzi o rodniki optycznie czynnych aminokwasów i pochodnych aminokwasów, to są włączone zarówno ich odmiany-D jak i -L albo ich fizjologicznie dopuszczalnych soli, i przy czym wyklucza się związek <Arg-Gly-Asp-NMe-PheGly>, do wytwarzania środka leczniczego do leczenia zakrzepicy, zawału serca, stwardnienia tętnic, stanów zapalnych, udaru mózgowego, dusznicy bolesnej, chorób nowotworowych, chorób osteolitycznych, osteoporozy, retynopatii oczu, zapalenia stawu, zapalenia stawu i kości, jaskry rubeotycznej, wrzodziejącego zapalenia okręznicy, choroby Crohna, stwardnienia rozsianego, łuszczycy, nawrotów zwężenia, zakażeń mikrobowych lub ostrej niewydolności nerek.
8. Stosowanie związków o wzorze 1 cyklo-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE) 1, w którym D oznacza D-Phe, Phe, D-homoPhe, homoPhe lub 4-Hal-Phe (w odmianie-D lub -L),

E oznacza Val, Gly, Ala, Leu, Ile lub Lys, Hal oznacza F, Cl, Br, I, n wakuje albo oznacza rodnik alkilowy o 1-6 atomach węgla, benzyl, benzyloksykarbonyl lub rodnik aralkilowy o 1-6 atomach węgla na funkcyjnej grupie α-aminowej rodnika odpowiedniego aminokwasu, pod warunkiem, ze co najmniej jeden rodnik aminokwasu dysponuje podstawnikiem n i przy czym, o ile chodzi o rodniki optycznie czynnych aminokwasów i pochodnych aminokwasów, to są włączone zarówno ich odmiany-D jak i -L albo ich fizjologicznie dopuszczalnych soli, i przy czym wyklucza się związek <Arg-Gly-Asp-NMe-PheGly>, do wytwarzania unieruchomionych ligandów dla chromatografii powinowactwa.
9. Stosowanie związków o wzorze 1 cyklo-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE) 1, w którym D oznacza D-Phe, Phe, D-homoPhe, homoPhe lub 4-Hal-Phe (w odmianie-D lub -L),

E oznacza Val, Gly, Ala, Leu, Ile lub Lys,

Hal oznacza F, Cl, Br, I, n wakuje albo oznacza rodnik alkilowy o 1-6 atomach węgla, benzyl, benzyloksykarbonyl lub rodnik aralkilowy o 1-6 atomach węgla na funkcyjnej grupie α-aminowej rodnika odpowiedniego aminokwasu, pod warunkiem, ze co najmniej jeden rodnik aminokwasu dysponuje podstawnikiem n i przy czym, o ile chodzi o rodniki optycznie czynnych aminokwasów i pochodnych aminokwasów, to są włączone zarówno ich odmiany-D jak i -L albo ich fizjologicznie dopuszczalnych soli, i przy czym wyklucza się związek <Arg-Gly-Asp-NMe-PheGly>, do oczyszczania integryn za pomocą chromatografii powinowactwa.