PL184037B1 - Zastosowanie Lactobacillus plantarum - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie Lactobacillus plantarum zawierajacych specyficzna wzgledem man nozy adhezyne oraz wykazujacych zdolnosc do kolonizowania ludzkiej sluzówki jelitowej do wytwarzania leku do leczenia ostrego zapalenia zoladka i jelit, hamujacego przywieranie patogenicznych bakterii eksprymujacych fimbrie typu 1, zwlaszcza bakterii nalezacych do Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Salmonella i Shigella albo Escherichia coli, do powierz- chni komórek nablonkowych. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie Lactobacillus plantarum, zdolnych do przywierania do powierzchni komórek nabłonkowych, szczególnie ludzkiej śluzówki jelitowej, do wytwarzania leku do stosowania w profilaktyce i/lub leczeniu chorób bakteryjnych wywoływanych przez patogenne bakterie przywierające do komórek nabłonkowych w podobny sposób.

Rodzime bakterie sąjednym z głównych mechanizmów obronnych chroniących organizm człowieka lub zwierzęcia przed kolonizacją przez atakujące bakterie. Pacjenci immunosupresyjni, leczeni antybiotykiem i odżywiani pozajelitowo są zagrożeni chorobami zakaźnymi, takimi jak posocznica, zapalenie opon lub infekcje dróg moczowych wskutek szerzenia się bakterii pochodzących ze zwykłej populacji z odchodów. Jednym z mechanizmów tego procesu może być bakteryjna translokacja, definiowana jako przejście żywych bakterii z przewodu pokarmowego do węzłów limfatycznych krezki i innych organów.

Zatrucie krwi, posocznica, jest wciąż bardzo pospolitym powikłaniem chirurgicznym związanym z chirurgią brzucha, o wysokim stopniu zagrożenia śmiercią. Bakterie lub produkty bakterii mogą penetrować wadliwie działającą ścianę jelit i infekować lub indukować nieprawidłowe działanie w innych oddalonych organach, takich jak płuca, wątroba, serce itp., co prowadzi do dysfunkcji wielu organów lub tak zwanej choroby oddziału intensywnej opieki. Tacy pacjenci są dziś leczeni przez podawanie antybiotyków i zabieg chirurgiczny na ropniu w zakresie, w którym można go zlokalizować. Obecnie antybiotyki podaje się zwyczajowo przed operacją jelit w celu obniżenia ryzyka infekcji pooperacyjnych i wywoływanych nimi chorób.

184 037

Jednakże kuracja antybiotykowa jest związana z destrukcją normalnej flory jelitowej i nadmierną proliferacją patogennych bakterii.

Te odkrycia doprowadziły do zwiększonego zainteresowania gatunkami drobnoustrojów, które mogą korzystnie wpływać na równowagę drobnoustrojową gospodarza, np. przez wytwarzanie czynników przeciwdrobnoustrojowych lub konkurencyjny wzrost. Lactobacillus należą do najczęściej badanych gatunków i wykazano, że w pewnych przypadkach przeciwdziałają one namnażaniu się patogenów.

Bakterie przebywające w jelicie mogą powodować choroby w kolonizowanym gospodarzu, takie jak biegunka w jelitach, lub kolonizują wtórnie normalnie sterylne miejsca, takie jak drogi moczowe, powodując infekcję dróg moczowych, lub krwioobieg, powodując posocznicę.

Patogeniczne bakterie różnią się od bakterii nie wywołujących choroby tym, że wykazują tak zwane czynniki zjadliwości. Ważnym czynnikiem zjadliwości jest zdolność do przywierania do cząsteczek receptorów węglowodanów komórki gospodarza. Jest to ważny etap, ponieważ umożliwia on kolonizację oraz dostarczanie toksyn i innych powodujących zapalenie substancji w bliskie sąsiedztwo komórek gospodarza. Takie toksyczne substancje, dostarczone przez przywartą bakterię, osiągają lokalnie znacznie wyższe stężenie niż w przypadku wydzielania np. przez bakterie przebywające w świetle jelit.

Do bakterii powodujących infekcję dróg moczowych należą Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella i Proteus, należące do rodziny Enterobacteriaceae. Większość tych bakterii ma fimbrie typu 1, nadające zdolność przywierania do zawierających mannozę receptorów, np. na ludzkich komórkach nabłonka pochwy i do białka śluzu moczowego Tamma-Horsefalla. Wykazano, że fimbrie typu 1 stanowią czynnik zjadliwości dla zapalenia pęcherza, które może zależeć zarówno od zwiększonej zdolności do zstępowania do dróg moczowych nadawanej przez wiązanie się z komórkami nabłonka pochwy i okołocewkowymi, jak też od wzrostu podrażnienia spowodowanego wiązaniem się z komórkami nabłonka w drogach moczowych. [Tak więc tylko bakterie z fimbriami typu 1 były w stanie indukować odpowiedź cytokinową, to jest zapalenie, w hodowanych komórkach nabłonka dróg moczowych].

Do bakterii wywołujących biegunkę należą bakterie Salmonella i Shigella, lecz jelitowe przerosty Klebsiella lub Enterobacter także związano z biegunką u małych dzieci. Wykazano u myszy, że fimbrie typu 1 są czynnikiem zjadliwości dla biegunkowych chorób wywoływanych przez Salmonella. Jest też prawdopodobne, że fimbrie typu 1 ułatwiają również kolonizację przez inne bakterie i polepszają dostarczanie toksycznych substancji w pobliże nabłonka, powodując biegunkę.

W opisie EP-A2-0 199 535 opisano biologicznie czystą kulturę Lactobacillus acidophilus, numer dostępu ATCC 53 103, wyodrębnioną z ludzkich odchodów, zdolną do przywierania do komórek śluzówki w testach in vitro. L. acidophilus dobrze znosi przejście przez górną część przewodu żołądkowo-jelitowego. Nie wykazano jednak przywierania in vivo.

W publikacji WO 89/05849 opisano bakterie kwasu mlekowego wyodrębnione z przewodu żołądkowo-jelitowego świń i wybrane dzięki, między innymi, przywieraniu do komórek nabłonkowych przewodu żołądkowo-jelitowego u świń in vitro i tolerancji względem kwasu i żółci. Takich bakterii można użyć do fermentacji mleka, które następnie można dać prosiętom dla zapobiegania biegunce lub leczenia biegunki wywołanej między innymi przez E. coli.

Publikacja WO 93/01823 dotyczy procesu wyodrębniania szczepów Lactobacillus o zdolności do zagnieżdżania się w ludzkiej śluzówce jelit in vivo oraz pozostawania tam po doustnym podawaniu przez co najmniej 10 dni. Zgłoszenie to w szczególności dotyczy dwu nowych szczepów Lactobacillus, które zdeponowano zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim w DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gm-bH), Braunschweig, Niemcy, 2 lipca 1991, to jest

Lactobacillus plantarum 299' DSM 6595

Lactobacillus casei ssp rhamnosus 271 DSM 6594 j ak też ich wariantów do stosowania w profilaktyce lub leczeniu infekcj i bakteryjnych w przewodzie żołądkowo-jelitowym, szczególnie w zastępstwie antybiotyków w związku z operacjami chirurgicznymi.

184 037

Opis patentowy SE 463598 dotyczy preparatu zwiększającego przywieranie bakterii do przewodu żołądkowo-jelitowego, zawierającego białko sprzyjające przywieraniu, nazywane adhezyną, otrzymane z Lactobacillus.

Publikacja WO 90/09398 dotyczy produktów hamujących przywieranie, wzrost i/lub przeżycie patogenów. Tymi produktami są metabolity Lactobacillus hamujące patogeny, takie jak szczepy Escherichia coli, Clostridium, Salmonella, Campylobacter i Streptococcus.

Nieoczekiwanie odkryto, że pewne szczepy Lactobacillus przywierają do pokrytych D-mannozą. kuleczek agarozowych, przy czym ta zdolność jest skorelowana ze zdolnością do aglutynacji erytrocytów w sposób wrażliwy na mannozę, jak też ze zdolnością do przywierania do ludzkich linii komórek nabłonkowych HT-29 okrężnicy w sposób umożliwiający hamowanie metylo-a-D-mannozydem. Działanie nadjodanem na komórki HT-29 uniemożliwiło wrażliwe na mannozę przywieranie, co wskazuje, że związany z komórką receptor miał naturę węglowodanową. Działanie na bakterie proteinazą K także uniemożliwiło przywieranie, co wskazuje, że wiązanie objęło struktury białkowe na powierzchni komórki bakteryjnej. Uważa się więc, że przywierająca część Lactobacillus, adhezyna, przywiera do zawierających mannozę receptorów na powierzchni komórek nabłonkowych. Takie przywieranie zdaj e się być związane ze zdolnością tych bakterii do przeciwdziałania patogenicznym bakteriom i stymulacji mechanizmów obronnych gospodarza.

W szczególności to przywieranie wywołuje zdolność osłabiania translokacji patogenicznych lub potencjalnie patogenicznych bakterii na nietkniętym nabłonkujelitowym, hamowania przywierania potencjalnie patogenicznych bakterii bezpośrednio do powierzchni komórek nabłonkowych, zmniejszając ich zdolność do dostarczania toksycznych i zapalnych substancji do śluzówki oraz osłabiania zapalnych uszkodzeń jelit wywoływanych przez niespecyficzne czynniki drażniące tworząc mikrośrodowisko korzystne dla rekonstrukcji śluzówki. Ścisły kontakt z komórkami nabłonkowymi może także zwiększać zdolność bakterii do interakcji z układem odpornościowym. Takie szczepy Lactobacillus mogąnp. uruchamiać aktywację fagocytów i stymulować komórki prezentujące antygeny polepszając odporność.

Specyficzne względem mannozy adhezyny opisano w przypadku wielu Gram-ujemnych bakterii, w tym członków rodziny Enterobacteriaceae, takich jak gatunki E. Coli, Klebsiella, Shigella i Salmonella, Pseudomonas echinoides, Vibrio cholerae i Vibrio parahaemolyticus.

Zdefiniowano optymalny receptor dla specyficznej względem mannozy adhezyny E. coli i wiadomo, że zawiera on sekwencję mannozaa1-4mannozap, występującą w glikoproteinach ssaków. Dokładna struktura receptora mannozo-specyficznych adhezyn innych enterobakteryjnych gatunków nie została jeszcze zdefiniowana, takjak struktura receptora specyficznej względem mannozy adhezyny szczepów Lactobacillus plantarum. Jednakże uważano, że receptor powinien zawierać sekwencję Manal-2Man. Przypuszczano, że mannozo-specyficzne L. plantarum będą wykazywały silniejsze działanie hamujące na bakterie związane z zawierającymi mannozę receptorami w porównaniu z ich działaniem na bakterie wiążące się z innymi strukturami receptorów'.

Okazało się, że rzeczywiście Lactobacillus plantarum zawierające specyficzną względem mannozy adhezynę hamują wiązanie się patogenicznych bakterii eksprymujących specyficzne względem mannozy adhezyny z powierzchnią komórek nabłonkowych. W ten sposób zmniejsza się ich zdolność do atakowania śluzówki lub dostarczania toksycznych i powodujących zapalenie substancji na śluzówkę.

Tak więc wynalazek dotyczy zastosowania Lactobacillus plantarum zawierających specyficzna względem mannozy adhezynę oraz wykazujących zdolność do kolonizowania ludzkiej śluzówki jelitowej do wytwarzania leku do leczenia ostrego zapalenia żołądka i jelit, hamującego przywieranie patogenicznych bakterii eksprymujących fimbrie typu 1, zwłaszcza bakterii należących do Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Salmonella i Shigella albo Escherichia coli, do powierzchni komórek nabłonkowych, względnie do wytwarzania leku do leczenia infekcji dróg moczowych, hamującego przywieranie patogenicznych bakterii eksprymujących fimbrie typu 1,

184 037 zwłaszcza bakterii należących do Klebsiella Enterobacter, Proteus albo Escherichia coli, do powierzchni komórek nabłonkowych.

Zgodnie z wynalazkiem korzystnie stosuje się Lactobacillus plantarum wykazujące podobieństwo> 50% do Lactobacillus plantarum 299 o numerze depozytu DSM 6595, na podstawie analizy pełnego chromosomowego DNA z użyciem endonukleaz restrykcyjnych, a zwłaszcza Lactobacillus plantarum 299v o numerze depozytu DSM 9843.

Korzystnie Lactobacillus plantarum stosuje się w połączeniu z nośnikiem.

Zgodnie z wynalazkiem Lactobacillus plantarum stosuje się zwłaszcza do wytwarzania leku hamującego przywieranie Escherichia coli eksprymujących fimbrie typu 1 do ludzkich komórek nabłonkowych pochwy i dróg moczowych.

W szczególności stosuje się Lactobacillus plantarum przywierające do pokrytych D-mannozą perełek agarozowych.

Korzystne szczepy Lactobacillus plantarum to:

Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595

Lactobacillus plantarum 299v DSM 9843

Lactobacillus plantarum 79

Lactobacillus plantarum 105

Lactobacillus plantarum 107.

Wydaje się, że dwa czynniki odgrywająistotnąrolę w ekologicznym działaniu Lactobacillus. Pierwszym czynnikiem jest zdolność do kolonizowania jelita, to znaczy do przetrwania w dużej liczbie przez określony czas po ostatnim podaniu żywych bakterii. Ta właściwość może być ważna odnośnie zdolności Lactobacillus do hamowania wzrostu i proliferacji patogenicznych bakterii, lecz nie stanowi ona warunku wystarczającego. Drugim czynnikiem jest zdolność do bezpośredniego wiązania się z nabłonkowymi komórkami jelita. Może to być jeden z czynników ułatwiających kolonizację, lecz nie warunkuje on kolonizacji. Zdolność do przywierania do nabłonka nie gwarantuje, że szczep będzie zdolny do kolonizacji.

Patogeniczne bakterie jelitowe eksprymujące specyficzne względem mannozy fimbrie typu 1 należązwłaszcza do Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Salmonella i Shigella spp., np. Klebsiella pneumoniae. Salmonella typhimurium i Shigella flexneri oraz Escherichia coli.

Zdolność do przywierania bezpośrednio do komórek nabłonkowych może w przypadku szczepów Lactobacillus odgrywać istotną rolę w osłabianiu przemieszczania się i wywoływania stanu zapalnego śluzówki przez bakterie patogeniczne, gdyż Lactobacillus zajmująniszę ekologiczną w sąsiedztwie nabłonka. Ścisłe połączenie z nabłonkiem umożliwią także bakteriom Lactobacillus zmienianie mikrośrodowiska, które bezpośrednio wpływa na komórki nabłonka jelitowego, co przyspiesząjego naprawę po uszkodzeniu spowodowanym przez czynniki drażniące.

Lactobacillus plantarum opisane powyżej są użyteczne w profilaktyce i/lub leczeniu stanów związanych z translokacją patogenicznych lub potencjalnie patogenicznych bakterii przez nienaruszony nabłonekjelitowy. Translokacja oznacza przejście żywych bakterii przez nabłonek jelitowy w taki sposób, że można je wyodrębnić np. z kreskowych węzłów chłonnych, krwi lub innych narządów.

Zgodnie z wynalazkiem można stosować Lactobacillus plantarum w połączeniu ze znanymi nośnikami. Do takich nośników do wytwarzania środków farmaceutycznych do stosowania w profilaktyce lub leczeniu chorób bakteryjnych w jelitach należą np. fizjologicznie tolerowane substraty fermentowane przez określone bakterie, a także różnego rodzaju produkty żywnościowe, zwłaszcza oparte na skrobi lub mleku, lecz również obojętne substancje stałe lub ciekłe, takie jak solanka lub woda. Odpowiedni substrat powinien zawierać ciecz lub stałe włókna, które nie są wchłaniane w przewodzie żołądkowo-jelitowym i które po sfermentowaniu przez Lactobacillus tworzą kwasy karboksylowe. Jako przykładowe odpowiednie substraty zawierające skrobię można wymienić zboża, takie jak owies i pszenica, kukurydzę, warzywa korzeniowe, takie jak ziemniaki, oraz pewne owoce, takie jak zielone banany.

Korzystnym substratem w takich środkach, zapewniającym również tym środkom doskonałą wartość odżywczą, jest roztwór odżywczy oparty na mące owsianej, np. opisany w WO 89/08405.

184 037

Środki farmaceutyczne można podawać w dowolny odpowiedni sposób, korzystnie doustnie lub doodbytniczo, np. w postaci lewatywy. Możnaje także podawać dojelitowo przez cewnik wprowadzony do jelit przez . żołądek, albo bezpośrednio do jelit. Testy wykazały, że osiąga się wzrost skuteczności, gdy zastosuje się włókna spożywcze np. w postaci kleiku owsianego lub β-glukanów. Leczenie powinno prowadzić się raz lub kilka razy dziennie przez 1-2 tygodnie.

Figura 1 przedstawia dendrogram pokazujący podobieństwo w procentach pomiędzy różnymi zbadanymi szczepami Lactobaciiius, scharakteryzowanymi metodą REA opartą na współczynniku korelacji momentu iloczynu Pearsona oraz UPMGA.

Poniżej opisano badania szczepów Lactobaciilus oraz próby biologiczne.

Wyodrębnianie szczepów Lactobaciilus

Szczepy Lactobaciilus pobrano z próbek ludzkiej śluzówki. Biopsje z różnych części okrężnicy pobrano metodą endoskopową, a kawałki śluzówki jelitowej z jelita cienkiego, to znaczy z jelita czczego i krętego, wycięto podczas operacji chirurgicznych. Próbki śluzówki natychmiast umieszczano w specjalnej pożywce (0,9% NaCl, 0,1% pepton, 0,12% Tween 80 i 0,02% cystyna; wszystkie wartości w % odnoszą się do udziałów wagowo/objętościowych), poddano homogenizacji w łaźni ultradźwiękowej przez 2 minuty i mieszano przez minutę przed umieszczeniem na agarze Rogosa (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA). Płytki inkubowano w warunkach anaerobowych w 37°C przez 2 dni (Gas Pak Anaerobic System, BBL). Z każdej płytki wybrano przypadkowo 1-3 kolonie, po czym hodowano jako czyste kultury 5-9 krotne na agarze Rogosa i uzyskane gęste kultury przechowywano w zamrożonym buforze w -80°C. Wyodrębniono w ten sposób szczepy Lactobaciilus piantarum 299 i 299v, a także 105,275 i 386; Lactobaciilusfermentum 8704:3; Lactobaciilus reuteri 108, 8557:1, 8557:3; Lactobaciilus rhamnosus 271; Lactobaciilus agiiis 294. W podobny sposób wyodrębniono szczepy Lactobaciilus z jelit szczura i świni, odpowiednio Lactobacillus reuteri R2LC oraz 1063, 1068 i 1044.

Szczepy Lactobaciilus wyodrębniono również z nigeryjskiego ogi lub pito w następujący sposób. Wyjściową próbkę poddawano obróbce w łaźni ultradźwiękowej przez 5 minut, mik-sowano w aparacie Vortex przez 2 minuty, rozcieńczono i inkubowano na agarze Rogosa (Difco) przez 3 dni w 37°C. Zbadano przypadkowo wybrane kolonie bakteryjne. W ten sposób uzyskano szczepy Lactobaciilus piantarum 79 i 107, 125, 98, 53, 97M2, 97, 101, 120 i 44.

Szczepy Lactobaciilus wyodrębniono również z kiszonki, a w szczególności Lactobaciilus piantarum 36e, 256 i ATCC8014. So5 stanowi wyjściową hodowlę Lactobaciilus piantarum otrzymanąz Sockerbolaget, Arlov, a Lactobaciilus reuteri BR stanowi szczep stosowany w skali przemysłowej w mleku BRA (Aria Ekonomisk Forening, Sztokholm, Szw^c^jj^).

Identyfikacja szczepów

ATCC 14917^Ti DSM 20016^T stanowią typowe szczepy odpowiednio Lactobaciilus piantarum i Lactobacillus reuteri. Typowy szczep określa gatunek i powinien być oznaczany literąT. Wszystkie inne szczepy o homologii DNAtDNA powyżej 70% względem określonego typowego szczepu określa się jako należące do tego konkretnego gatunku.

W International Journal of Systematic Bacteriology (1995)45:670-675 M-L Johansson i inni opisali klasyfikację wyodrębnionych szczepów na podstawie analizy pełnego chromosomowego DNA z wykorzystaniem endonukleaz restrykcyjnych. W technice „fingerprint uzyskuje się grupy lub skupiska genetyczne odzwierciedlające przy porównaniu podobieństwo z pełnym układem. Na podstawie tej metody analitycznej szczepy Lactobaciilus piantarum można podzielić na odrębne grupy genetyczne 1a, 1b i 1c, co przedstawiono na fig. 1. Wszystkie szczepy w skupieniu 1c wykazują podobieństwo względem L. piantarum 299> 50%, a szczepy 299v, 107, 105 i 79 wykazują podobieństwo 70%.

Szczepy 299 i 299v, które wyodrębniono ze śluzówki jelit zdrowych ludzi, zdeponowano w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH odpowiednio 2 lipca 1991 i 16 marca 1995, gdzie nadano im numery depozytowe DSM 6595 (299) i DSM 9843 (299v).

Identyfikacja fenotypowa

Szczepy 29^, 299v, 79,105 i 107 stanowią Gram-dodatnie, katalazo-ujemne pałeczki rozwijające się na agarze Rogosa przy pH 5,5, zdolne do wytwarzania kwasu mlekowego z glukozy

184 037 w warunkach anaerobowych. Zdolność szczepów do fermentacji różnych węglowodanów podano w tabeli 1. Testy przeprowadzono z użyciem API 50 CH zgodnie z instrukcj ami producenta.

Fenotypowo szczepy można zidentyfikować jako Lactobacillus plantarum.

Tabela 1

Zdolność fermentacyjna szczepów L. plantarum 299, L. plantarum 299v, L plantarum 107, L. plantarum 105 i L. plantarum 275 w API 50CH w 30°C i 37°C

	L. plantarum 299	L. plantarum 299v	L. plantarum 107	L. plantarum 105	L. plantarum 79
30°C	37°C	30°C	37°C	30°C	37°C	30°C	37°C	30°C	37°C
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Gliceryna	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Erytrytol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D-arabinoza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
L-arabinoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Ryboza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
D-Ksyloza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
L-Ksyloza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Adonitol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
β-Metylo-ksyl ozyd	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Galaktoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
D-Glukoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
D-Fruktoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
D-Mannoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
L-Sorboza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Ramnoza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Dulcytol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Inozytol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Mannitol	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Sorbitol	+	+	+	+	+	+	+	+	+ ·	+
α-Metylo-D-mannozyd	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
α-Metylo-D-glukozyd	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
N-Acetylo-glukozamina	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Amigdalina	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Arbutyna	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Eskulina	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Salicyna	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Celobioza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Maltoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Laktoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Melibioza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+

184 037 ciąg dalszy tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Sacharoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Trehaloza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Inulina	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Melezytoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
D-rafinoza	-	-	+	-	+	-	-	-	-	-
Skrobia	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Glikogen	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Ksylitol	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
β-Gencjobioza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
D-Turanoza	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
D-Liksoza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D-Tagaroza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D-Fukoza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
L-Fukoza	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
D-Arabitol	-	-	+	-	+	-	+	-	+	-
L-Arabitol	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Glukonian	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
2-Ketoglukonian	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
5-Ketoglukonian	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Profile plazmidowe

Szczepy zbadano metodą opisanąprzez Chassy’ego i innych (1976) pod względem zawartości plazmidów·'. Lactobacillus plantarum 299,299v, 79 i 105 wykazują identyczne profile plazmidowe, to znaczy 5 plazmidów o 4,9,15,21 i>30 MDa. Lactobacillus plantarum 107 zawiera 3 plazmidy o 4, 15 i 21 MDa.

Hodowla Lactobacillus plantarum 299

- Inokulum z zamrażarki w -80°C dodaje się do 50 ml Lactobacillus Carrying Medium (LCM, Efthymiou & Hansen, J. Infect. Dis., 110:258-267, 1962) lub Rogosa,

- inkubuje się przez około 40 godzin w 37°C,

- 50 ml stosuje się do zaszczepienia 500 ml LCM,

- inkubuje się przez około 40 godzin w 37°C ,

- 500 ml stosuje się do zaszczepienia 5 litrów,

- inkubuje się około 25-30 godzin w 37°C,

- odwirowuje się przy 10 000 obrotów/minutę przez 10 minut,

- przemywa się raz roztworem soli fizjologicznej,

- peletkę rozpuszcza się w około 1 litrze roztworu soli fizjologicznej.

Ocenia się, że ilość ta wystarcza na około 400-500 litrów kleiku z mąki owsianej. Pożywek nie optymalizowano. Pożywka Rogosa działała lepiej niż LCM, być może z uwagi na lepiej działający bufor. Do LCM dodano 2% glukozy. Tę samą procedurę można zastosować dla otrzymywania innych szczepów Lactobacillus.

Kolonizacja przez Lactobacillus plantarum - in vivo

Aby ocenić zdolność do kolonizacji in vivo 12 zdrowym ochotnikom podawano przez 10 dni 100 ml ciekłego kleiku z mąki owsianej zawieraj ącego 8 x 10⁷ CFU/g zliofilizowanego szcze184 037 pu Lactobacillus opisanego w WO 93/01823. Lactobacillus plantarum 299 można znaleźć w dominującej pozycji na śluzówce jelitowej 10 dni po zakończeniu podawania kleiku.

W innym teście zbadano zdolność szczepów L. plantarum 105 i 107 do kolonizacji. Zliofilizowany preparat zawierający 1,5 x 10⁹ CFU każdego z badanych szczepów podawano doustnie raz dziennie przez 8 dni. Biopsje z odbytu pobierano w dniu poprzedzającym podawanie oraz w 1 i 8 dni po zakończeniu podawania. Dodatkowe biopsje pobrano z jelita czczego. Żadnego z podawanych szczepów nie wyodrębniono z płytek Rogosa w 8 dni po zakończeniu podawania.

Test hemaglutynacji

W celu zbadania, czy adhezyny ze szczepów Lactobacillus są zbliżone do adhezyn względem receptorów zawierających mannozę w rodzinie Enterobacteriaceae, np. występujących w szczepach E. coli, związanych z fimbriami typu 1 i uczestniczących w wiązaniu z komórkami nabłonka okrężnicy, wykonano testy hemaglutynacji z erytrocytami różnego pochodzenia.

Przemyte bakterie zawieszano w stężeniu 2 x 10¹⁰/ml w PBS i dwukrotnie rozcieńczone zawiesiny bakteryjne mieszano na szkiełkach mikroskopowych z równymi objętościami 3% zawiesin erytrocytów w PBS, albo z PBS zawierającym 100 mM metylo-a-D-mannozydu. Szkiełka łagodnie przechylano w regularnych odstępach czasu, a aglutynację stwierdzano po 15 minutach gołym okiem oraz stosując mikroskop z silnym oświetleniem przy powiększeniu 250 x. Odwrotność największego rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej zapewniającego widoczną aglutynację w ciągu 15 minut określano jako miano aglutynacji.

Związane z błoną glikoproteiny erytrocytów zawierająmannozę, a E. coli z adhezynami specyficznymi względem mannozy aglutynuje szereg erytrocytów w sposób wrażliwy na mannozę.

Szczepy L.. plantarum należące do grupy genetycznej 1cα-glutynująerytrocyty człowieka, świnki morskiej, kurczaka, kota, psa, myszy, szczura, królika, konia i świni, ale znacznie rzadziej erytrocyty owcy i erytrocyty bydlęce. Z wyjątkiem erytrocytów owcy i erytrocytów bydlęcych metylo-a-D-mannozyd całkowicie hamuje lub znacznie zmniejsza aglutynację. Słabąhemaglutynację wrażliwą na mannozę zaobserwowano w przypadku pewnych szczepów grupy 1b, podczas gdy dla innych grup genetycznych uzyskano wynik negatywny.

Wrażliwa na mannozę hemaglutynacja (MSHA) L. plantarum j est bardzo podobna do występującej w przypadku E. coli, lecz zaobserwowano pewne różnice. I tak w przypadku Z. plantarum erytrocyty kurczaka wykazują, najwyższe miano MSHA, natomiast erytrocyty końskie należały do grupy najmniej aktywnych erytrocytów. Natomiast w przypadku E. coli erytrocyty końskie wykazywały najwyższe miano, nieznacznie wyższe niż dla erytrocytów kurczaka. Erytrocyty świnki morskiej wykazywały porównywalnie silną aktywność hemaglutynacyjnąz L. plantarum i E. coli, natomiast ludzkie erytrocyty wykazywały niską aktywność w porównaniu z innymi erytrocytami z E. coli, ale porównywalną aktywność w aglutynacji wo ł^t^c^r^oś^tii L. plcmtanmt.

Przywieranie do komórek HT-29

Zbadano zdolność różnych szczepów Lactobacillus do przywierania do nabłonkowych komórekjelitowych ludzkiej linii okrężniczych komórek nowotworowych HT-29 (w sposób opisany przez A. Wolda i innych, Infection and Immunity, październik 1988, 2531-2537). Komórki ludzkiej linii gruczolaoraka HT-29 hodowano w pożywce Eagle'a uzupełnionym 10% płodowej surowicy cielęcej, 2 mM L-glutaminy i 50 pg/ml gentamycyny (Sigma Chemical Co., Saint Louis, Mo, USA). W kilka dni po zlaniu komórek oddzielonoje w buforze zawierającym EDTA (0,54 mM), przemyto i zawieszono w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) w stężeniu 5x10⁶/ml Bakterie zebrano, przemyto i zawieszono w HBSS w stężeniu 5 x 109/ml (2 x gęstość optyczna 1,5 przy 597 nm). Komórki, bakterie i HBSS zmieszano w stosunku 1:1:3 i inkubowano w wytrząsarce o ruchu pionowym przez 30 minut w 4°C. Komórki przemyto raz PBS schłodzonym w lodzie i utrwalono obojętną buforowaną formaliną (Histofix, Histolab, Gotebrog, Szwecja). Liczbę bakterii przywierających do każdej z co najmniej 40 komórek oznaczono metodą kontrastowej mikroskopii interferencyjnej (powiększenie 500 x, Nicon Optophot, z kontrastowym oprzyrządowaniem interferencyjnym, Bergstrom Instruments, Goteborg, Szwecja), po czym obliczano średnią liczbę bakterii/komórkę. W celu zbadania hamowania przywierania włączono testy z dodatkiem 1,5% różnych monocukrów (glukozy, mannozy, metylo-a-D-man10

184 037 nozydu). Wyniki podano poniżej w tabeli 2, w której nagłówki, poza szczepem i grupą genetyczną, oznaczają: _;

- HT-29 VH oznacza średnią liczbę bakterii/komórkę; liczbę doświadczeń podano w nawiasach;

- α-metylomannozyd, mannoza i glukoza - wyniki oznaczają odpowiednio średnie liczby bakterii komórkę w obecności odpowiednio α-metylomannozydu, mannozy i glukozy; liczbę doświadczeń podano w nawiasach;

- n oznacza liczbę sparowanych wartości przy porównaniu przywierania w obecności i bez α-menylomannozydu;

- d oznacza średniąróżnicę pomiędzy doświadczeniami w obecności i bez α-metylomannozydu; liczba dodatnia oznacza hamowanie w obecności mannozydu;

- p oznacza wielkość p dla porównania; test T Studenta dla wartości sparowanych.

Tabela 2

Szczep		Grupa genetyczna	HT-29 VH	α-Metylo- -mannozyd	Mannoza	Glukoza	n	d	P
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
299v	L.plantarum	1c	11,2(9)	5,9(9)	8,3(4)	11,4(6)	9	5,3	0,004
299	L.plantarum	1c	10,7(8)	4,9(8)	11,6(3)	10,6(5)	8	5,8	0,002
79	L.plantarum	1c	11,7(8)	5,7(8)	6,8(3)	10,7(5)	8	5,9	<0,0001
105	L.plantarum	1c	10,8(7)	7,8(7)	9,8(2)	10,3(4)	7	3,0	0,15
107	L.plantarum	1c	10,3(7)	6,9(7)	10,8(2)	15,3(4)	7	3,4	0,01
386	L.plantarum	1c	5,8(4)	. 4,6(4)	7,0(4)	7,6(4)	4	1,2	0,59
275	L.plantarum	1c	1,6(3)	1,3(3)	2,9(3)	3,1(3)	3	0,3	0,52
36E	L.plantarum	1b	6,0(6)	6,6(6)	7,7(2)	3,5(2)	6	-0,6	0,58
256	L.plantarum	1b	4,9(6)	4,5(6)	7,7(3)	9,8(6)	6	0,4	0,74
125	L.plantarum	1c	8,7	2,9	-	-	3	-	0,0036
ATCC14917	L.plantarum	1b	5,6(6)	6,2(3)	1,9(1)	9(1)	3	-0,6	0,70
So5	L.plantarum		1,3(1)	1,6(1)	3,5(1)	2,7(1)
ATCC8014	L.plantarum		4,8(5)	1,0(1)	5,0(1)	5,0(1)
98	L.plantarum	1b	0,2(5)	0(1)
53	L.plantarum	1a	0,4(5)	0(1)
97M2	L.plantarum		6,4(5)	7,7(2)			2	-0,2	0,70
97	L.plantarum	1a	1,2(4)	6,7(1)
101	L.plantarum	1a	0,3(1)	1,0(1)	4,2(1)	3,8(1)
120	L.plantarum		0(4)	0(1)
44	L.plantarum		3,1(1)	6,7(1)	9,7(1)	6,5(1)
8704:3	L.fermentum		2,8(3)	10,9(1)
BR	L.reuteri		5,3(4)	13,6(1)
108	L. reuteri		0,3(4)	0(1)
1063	L.reuteri		2,5(4)	12,1(1)
1068	L.reuteri		2,2(1)	3,3(1)
1044	L.reuteri		1,7(4)	2,6(2)

184 037 ciąg dalszy tabeli 2

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
M90	L.reuteri		4,0(4)	1,3(1)	2,7(1)	4,0(1)
8557:1	L.reuteri		2,0(4)	4,1(1)
8557:3	L.reuteri		0,8(4)	0,8(1)
DSM20016T	L.reuteri		5,0(3)	13,8(1)
R2LC	L.reuteri		0(3)	1,15(1)	0,3(1)	0,8(1)
294	L.agilis		0,7(3)	2,4(1)
271	L. rhamnosus		0(2)

Na podstawie tych wyników można stwierdzić, że pierwsze 5 szczepów Lactobacillus wykazuje silne przywieranie do komórek HT-29 in vitro, przy czym przywieranie to jest hamowane przez cukier, α-metylomannozyd.

Test przywierania powtórzono dla szczepów Lactobacillus plantarum oraz dla 5 szczepów Escherichia coli. 4 dzikie szczepy wyodrębnione z flory odbytniczej dzieci z Pakistanu zidentyfikowano jako E. coli na podstawie biotypowania w sposób opisany przez M. F. Bettelheima i innych., J. Med. Microbiol. 2:225-236, 1969. Szczepy E. coli hodowano przez noc w 37°C w statycznym bulionie Luria zawierającym 0,1% CaCI₂, aby ułatwić ekspresję fimbrii typu 1 z adhezynami specyficznymi względem mannozy. Transformantowy szczep E. coli 506 MS zapewniający ekspresję fimbrii typu 1 i adhezyn specyficznych względem mannozy hodowano na tryptynowym agarze sojowym zawierającym 25 pg chloramfenikolu/ml. Szczepy L. plantarum hodowano na agarze Rogosa przez 24 godziny w warunkach aerobowych w 37°C.

W celu zbadania hamowania przywierania następujące monocukry włączono w ostatecznym stężeniu 60 mM do testów przywierania: D-glukoza (USB, Cleveland, Ohio, USA), metyloα-D-glukozyd (Sigma), D-mannoza (Merck, USA), N-acetylo-glucozamina (USB), N-acetylo-galaktozamina (USB) i kwas N-acetylo-neuraminowy kwas (Sigma).

Szczepy L. plantarum 299 i 299v, które, jak to wykazano uprzednio, kolonizują się u ludzkich ochotników, przywierają do komórek HT-29 w umiarkowanym stopniu (około 10 bakterii/komórkę). Podobnie było w przypadku wszystkich szczepów z wyjątkiem jednego ze szczepów L. plantarum należącego do grupy genetycznej 1c. Metylo-a-D-mannozyd zmniejsza przywieranie tych szczepów o 45-73%. Niższy stopień przywierania (2-5 bakterii/komórkę) zaobserwowano w przypadku szczepów z grupy 1b. Ich przywieranie zmniejszało się pod wpływem metylo-a-D-mannozydu o 33-58%. W przypadku innych szczepów L. plantarum, nie należących do grupy genetycznej 1b lub 1 c, liczba przywierających bakterii była niewielka, a samo przywieranie nie było hamowane przez metylo-a-D-mannozyd.

D-mannoza również zmniejsza przywieranie L. plantarum 299 i 299v, choć w mniejszym stopniu niż metylo-a-D-mannozyd. Żaden z innych zbadanych monocukrów, D-glukoza, metylo-a-D-glukozyd, L-fukoza, galaktoza, N-acetylo-glukozamina, N-acetylo-galaktO/zamina i kwas N-acetylo-neuraminowy nie hamował przywierania L. plantarum 299 lub 299v do komórek HT-29.

Stopień przywierania szczepów E. coli z adhezynami specyficznymi względem mannozy wykazywał poziom przywierania 15-45 bakterii/komórkę. Przywieranie E. coli 506 MS było hamowane w podobnym stopniu (94%) zarówno przez metylo-a-D-mannozyd, jak iD -mannozę.

Wyniki badań przywierania bakterii do komórek HT-29 po inkubowaniu w obecności lub bez 60 mM metylo-a-D-mannozydu, przemywaniu i obliczeniu wartości średnich dla 3 doświadczeń (dla E. coli 345, 253, 810 i 476 tylko jedno doświadczenie) podano poniżej w tabeli 3.

Wiązanie z D-mannozą unieruchomioną na kuleczkach agarozowych

Testy wiązania bakterii z kuleczkami agarozowymi pokrytymi D-mannozą przeprowadzono w sposób opisany przez Sancheza i Jonsona (APMIS., 1990, 98:353-357), z niewielkimi

184 037 modyfikacjami. Przemyte bakterie zawieszone w stężeniu 10¹⁰/ml w PBS zmieszano na szkiełkach mikroskopowych z równymi objętościami zawiesiny 1:4 w PBS handlowych kuleczek agarozowych zawierających kowalencyjnie związaną D-mannozę (Agaroza-p-aminofenylo-a-D-mannopiranozyd, Sigma, St. Louis, USA) lub samych kuleczek agarozowych (4% kuleczek agarozowych, PL-Biochemical, Milwaukee, Wis, USA). Szkiełka kołysano przez 2 minuty, po czym obserwowano metodą kontrastowej mikroskopii interferencyjnej (powiększenie 500 x, Nicon Optophot). Przywieranie bakterii do kuleczek pokrytych mannozą przy braku wiązania się ich z samymi kuleczkami agarozowymi uważano za reakcję dodatnią. Wyniki tego testu podano w tabeli 3. Wiązanie z kuleczkami pokrytymi mannozą oceniano w sposób następujący:

- Brak różnicy w wiązaniu w porównaniu z kuleczkami kontrolnymi nie zawierającymi mannozy;

+ Bakterie pokrywają 50% lub więcej powierzchni kuleczek tworząc cienką warstwę ;

++ Bakterie pokrywają całą powierzchnię kuleczek grubą warstwą, czasami o wyglądzie powłoki wielowarstwowej.

Wiązanie z kuleczkami agarozowymi pokrytymi mannozą obserwowano w przypadku wszystkich szczepów L. plantarum, które przywierają do komórek HT-29 i powodują aglutynację erytrocytów w sposób wrażliwy na mannozę, to znaczy wszystkich szczepów należących do grupy 1c oraz szczepów ATCC 14917'T 256 i 36E z grupy 1b. Najbardziej dodatnie szczepy reagują silnie z kuleczkami agarozowymi pokrytymi mannozą; słabe reakcje zaobserwowano w przypadku L. plantarum 275 oraz ATCC 14917⁷' i 256. Wszystkie szczepy L plantarum, w przypadku których w próbie przyczepności wrażliwej na mannozę uzyskano wynik negatywny, dają również wynik negatywny w próbie wiązania z kuleczkami pokrytymi mannozą, z wyjątkiem L. plantarum 97 należącego do podgrupy 1b. Jednakże szczep ten czasami wykazywał również przyczepność wrażliwą na mannozę w innych doświadczeniach.

E. coli 506 MS wiązał się w przybliżeniu w takim samym stopniu jak silnie dodatnie szczepy L. plantarum.

Tabela 3

Szczep	Grupa genetycz- na	Przywieranie bakterii do komórek (średnia ± SD)	Wiązanie z kuleczkami agarozowymi pokrytymi mannozą
HBSS	+ metylomannozyd	P
1	2	3	4	5	6
L. plantarum
97	1a	1,2 ±0,9	1,5 ± 0,9		+
101	1a	0,5 ± 0,4	1,1 ±0,8		-
53	1a	0,8 ± 0,4	2,0 ± 0,9		-
ATCC 14917T	1b	5,2 ± 0,8	2,2 ± 0,7	0,070	+
256	1b	3,7 ± 0,3	1,8 ±0,5	0,020	+
36E	1b	2,4 ± 1,8	16 ± 1,5	0,17	++
98	1b	0,6 ± 0,6	0,4 ± 0,2		-
299 (=DSM6595)	1c	8,1 ± 1,1	3,8 ± 0,5	0,029	++
299v(=D5M9843)	1c	11,7 ± 1,4	3,4 ± 0,5	0,017	++
107	1c	11,9 ± 1,7	3,7 ± 0,5	0,020	++
105	1c	13,3 ±5,0	3,8 ± 0,4	0,093	++
79	1c	12,1 ±3,5	3,3 ± 0,4	0,056	++

184 037 ciąg dalszy tabeli 3

1	2	3	4	5	6
125	1c	8,7 ± 1,6	2,9 ± 1,7	0,0036	++
275	1c	2,9 ± 0,3	16 ± 0,2	0,038	+
386	1c	11,6 ±2,8	4,1 ± 0,9	0,021	++
So5		2,2 ± 0,4	4,6 ± 2,2		-
ATCC 8014T		2,7 ± 1,0	4,5 ± 1,5		-
120		0,9 ± 0,6	0,8 ± 0,7		-
44		1,4 ± 1,2	16 ± 0,2
E. coli
345		18,4	0,7
253		45,4	2,7
810		26,2	0,5
476		16,3	1,7
S06 MS		34,5 ± 8,9	2,6 ± 0,9	0,020	++

Utlenianie m-nadjodanem i obróbka enzymatyczna bakterii i komórek HT-29

Przemyte bakterie lub komórki HT-29 zawieszano w 0,01M m-nadjodanie (Merck, USA) w 0,1 M buforze cytrynianowo-fosforanowym o pH 4,5. Bakterie inkubowano w 37°C przez 1 godzinę, natomiast komórki HT-29 inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 lub 30 minut. Po inkubacji bakterie lub komórki odwirowywano, przemywano dwukrotnie PBS i ponownie zawieszano w HBSS. Kontrolne inkubacje prowadzono w 0,01M jodanie sodowym (Mallinckrodt Chemical Works, Saint Louis, Mo, USA) w takim samym buforze, lub w samym buforze.

Przemyte bakterie lub komórki HT-29 zawieszano w PBS zawierającym 2 mg/ml proteinazy K (15 jednostek/mg. Sigma) lub w samym PBS, inkubowano w 37°C przez 1 godzinę, po czym przemywano i ponownie zawieszano w sposób opisany powyżej.

Obróbka komórek HT-29 nadjodanem przez 15 lub 30 minut prowadzi do rozkładu komórek; tylko 5-10% komórek pozostaje po obróbce i prowadzonym następnie teście przywierania. Przywieranie wrażliwego na mannozę L. piantarum do komórek poddawanych obróbce przez 15 minut pozostaje w dalszym ciągu znaczące (p=0,41 w stosunku do grupy kontrolnej w buforze), natomiast komórki poddawane obróbce przez 30 minut nie wiążą Z. piantarum w sposób wrażliwy na mannozę (p=0,033 w stosunku do grupy kontrolnej w buforze), a obróbka nadjodanem przez 30 minut prawie w całości likwiduje przywieranie (p=0,0005 w stosunku do grupy kontrolnej w buforze, p=0,0067 w stosunku do grupy kontrolnej z jodanem). Utlenianie nadjodanem powierzchniowych węglowodanów komórek bakteryjnych nie wpływa znacząco na wiązanie.

Obróbka L. piantarum proteinaząK całkowicie likwiduje ich zdolność do przywierania do komórek HT-29 (p=0,0008, tabela 5), natomiast nie obserwuje się zmniejszenia przywierania E. coii 506 MS po obróbce bakterii tym enzymem. Obróbka komórek HT-29 proteinaząK nie wywiera wyraźnego wpływu na przywieranie L. piantarum 299v (p=0,36), natomiast powoduje zmniejszenie przywierania E. coii 506 MS z fimbriami typu 1 (p=0,15, tabela 4).

Doświadczenia te potwierdzają, że receptor wiązania komórek ma charakter węglowodanowy, oraz że budowa białka na powierzchni komórki bakteryjnej odgrywa rolę w przywieraniu do tego receptora.

Przywieranie Salmonella typhimurium do komórek HT-29

Salmonella jest głównym patogenem choroby biegunkowej. Wiele szczepów Saimoneiii przenosi fimbrie typu 1, co można wykryć na podstawie hemaglutynacj i wrażliwej na mannozę.

184 037

Do testu przywierania wybrano szczep Salmonella pochodzący od pacjenta z chorobą układu żołądkowo-jelitowego. Salmonella typhimurium 11014, wywołujący aglutynację erytrocytów wrażliwą na mannozę. Szczep Salmonella znaczono sondą fluorescencyjną FITC (izotiocyjanian fluoresceiny, Sigma) inkubując na zimno bakterie i FITC w buforze węglanowym o pH 9,6 przez noc. Bakterie przemyło 3 razy przez użyciem w testach przywierania.

W teście przywierania 0,1 ml komórek HT-29 (5· 10⁶/ml) zmieszano z 5-10⁸ fluorescencyjnych Salmonella oraz 5.10⁸ nieznaczonych Lactobacillus plantarum 299 lub 299v. Mieszaninę inkubowano przez 30 minut w wytrząsarce o ruchu pionowym na zimno. Po przemyciu komórek przywierające bakterie zliczano pod mikroskopem z oprzyrządowaniem do wykrywania fluorescencji. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli.

Tabela 4

Przywieranie do komórek HT-29

	Liczba bakterii/komórkę
Salmonella typhimurium 11014	25
Salmonella typhimurium 11014 + 2,5% metylo-aD-mannozydu	1
Salmonella typhimurium 11014 + Lactobacillus plantarum 299	7
Salmonella typhimurium 11014 + Lactobacillus plantarum 299v	12

Z powyższej tabeli w sposób oczywisty wynika, że szczep Salmonella przywiera do ludzkich komórek okrężnicy, czyli do komórek HT-29 według mechanizmu specyficznego względem mannozy. Takie wrażliwe na mannozę przywieranie może być w znacznym stopniu blokowane przez Lactobacillus plantarum. Bakterie były wprowadzane równocześnie w jednakowych ilościach.

Jest bardzo prawdopodobne, że jeśli szczep Lactobacillus doda się przed szczepem patogenicznym, może on zająć miejsca dla bakterii patogenicznych przenoszących adhezyny specyficzne względem mannozy, co uniemożliwi ich osadzenie się i wywołanie choroby.

Ostra niewydolność wątrobyjest w wysokim stopniu śmiertelna, a znaczący udział w śmiertelności można przypisać posocznicy. U pacjentów krytycznie chorych lub z obniżoną odpornością większość infekcj i j est wywołana przez własną mikroflorę pacj entów, a u wielu pacjentów·', którzy umarli na skutek posocznicy lub niewydolności wielu narządów, wykryto bakterie jelitowe, dla których nie zidentyfikowano ogniska zakaźnego, co wskazuje, że infekcje te mogą pochodzić z jelita. Z uwagi na bardzo częste występowanie klinicznie znaczącej posocznicy bakteryjnej podczas nagłej niewydolności wątroby, podniesiono możliwość leczenia zapobiegawczego. Przy ostrej niewydolności wątroby lub po poważnej operacji chirurgicznej wątroby następuje zwiększone przemieszczanie się bakterii z jelita, co może wyjaśnić pewne z powikłań infekcyjnych zaobserwowanych w takich warunkach. W celu wyjaśnienia mechanizmu i znalezienia możliwych środków zaradczych opracowano następujący model.

Testy na szczurach

Wpływ uzupełniającego podawania Lactobacillus przy ostrej uszkadzającej niewydolności wątroby.

Celem tego doświadczenia było zbadanie wpływu podawania doodbytniczego różnych szczepów Lactobacillus na stopień przemieszczania się bakterii w modelu ostrej niewydolności wątroby. Zbadano także wpływ takiego podawania na szereg Enterobacteriaceae w okrężnicy i jelicie ślepym.

Samce szczura Sprague-Dawley o wadze 200-300 g podzielono na 7 grup po 6 zwierząt: normalną, kontrolną z ostrym uszkodzeniem wątroby (ALI), z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus reuteri R2CL (SR), z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus rhamnosus 271

184 037 (SS), z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus plantarum 299v (SP), z uzupełniającym podawaniem Lactobacillusfermentum 8704:3 (SF) i z uzupełniającym podawaniem Lactobacillus reuteri 108 (ST). Wszystkie zwierzęta, które otrzymywały zwykłą karmę dla szczurów (R3, Lactamin AB, Sztokholm) oraz wodę bez ograniczeń przez cały czas doświadczenia, trzymano w temperaturze pokojowej 22°C w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Różne szczepy Lactobacillus podawano doodbytniczo raz dziennie przez 8 dni. Dzienna dawka uzupełniająca szczepów Lactobacillus wynosiła około 3 x 10⁹ CFU/zwierzę, podawana w 3 ml. Ostrą niewydolność wątroby wywołano w 8 dniu przez dootrzewnową iniekcję D-galaktozaminy (Sigma Chemical Co., St Louis, USA), 1,1 g/kg wagi ciała, co spowodowało zwiększone przedostawanie się bakterii ze światłajelita do odległych narządów-·. W przypadku grupy kontrolnej z ostrą niewydolnością wątroby zwykły roztwór soli wprowadzano uzupełniająco przez 8 dni, po czym w 8 dniu wywołano uszkodzenie wątroby. Próbki pobierano w 24 godziny po rozwinięciu się uszkodzenia wątroby. Przy znieczuleniu eterem wykonywano laparotomię w postaci pośredniego wcięcia w warunkach aseptycznych. Krew wrotnąi aortalną zbierano do testów bakteriologicznych. Pobierano próbki z płata ogoniastego wątroby i kreskowych węzłów chłonnych (MLN) do badań bakteriologicznych, a zawartość jelita ślepego i okrężnicy do zliczania bakterii.

Przy wykonywaniu analizy bakteriologicznej próbki tkanki umieszczano w 5 ml sterylnej pożywki transportowej. Próbki umieszczano w łaźni ultradźwiękowej na 5 minut, po czym miksowano w aparacie Chiltem (Terma-Glas, Szwecja) przez 2 minuty. Całkowite aerobowe miano płytki uzyskiwano umieszczając 1,0 ml próbki na mózgowo-sercowym agarze infuzyjnymBHI (Oxoid), po czym prowadzono inkubację przez 3 dni w 37°C. Całkowite anaerobowe miano płytki uzyskiwano umieszczając 1,0 ml próbki na mózgowo-sercowym agarze infuzyjnym BHI (Oxoid), po czym prowadzono inkubację w 37°C w warunkach anaerobowych. Po 3 dniach liczbę kolonii powstałych na każdej płytce zliczano i dokonywano korekty związanej z wagą wyjściowej tkanki. Próbki tkanki określano podając ilość gramów tkanki. Wszystkie wartości podawano jako średnia ± SEM (średni błąd pomiaru). Wyniki poddawano obróbce statystycznej z wykorzystaniem niesparowanego testu t Studenta. Poziom prawdopodobieństwa poniżej 0,05 uznawano za znaczący (p <0,05).

Tabela 5

Przemieszczanie się bakterii do wątroby i MLN

Grupa	Wątroba, CFU/g	MLN, CFU/g
ALI	5300 ± 1750	4940± 2060
SR	880 ± 530*	-
SS	1460± 990*	180± 40*
SP	20 ± 10**	-
SF	160 ± 80**	70± 30*
ST	930 ± 850*	20 ± 5*

* oznacza p< 0,05, ** oznacza p< 0,01

Wstępne podawanie szczurom Lactobacillus plantarum 299v znacząco zmniejsza przemieszczanie się bakterii z jelita oraz poprawia stan wątroby.

Mikroflorę bakteryjnąbadano pobierając próbki z zawartości jelita ślepego i okrężnicy, po czym natychmiast umieszczano je w 5 ml sterylnej pożywki transportowej, umieszczano w łaźni ultradźwiękowej i miksowano w aparacie Chiltem jak poprzednio. Miana żywych Enterobacteriaceae otrzymywano z agaru z czerwienią fioletową, żółciiąi glukozą VRBG Oxoid), który inkubowano w warunkach aerobowych w 37°C przez 24 godziny.

184 037

Tabela 6

Miano Enterobacteriaceae w okrężnicy i jelicie ślepym

Grupa	CFU/g w okrężnicy	CFU/g w jelicie ślepym
Normalna	4,1 ± 1,7	6,5 ± 0,3
ALI	6,8 ± 0,2	4,9 ± 0,1
SR	6,7 ± 0,2	5,1 ± 0,2
SS	5,1 ± 1,1	3,5 ± 1,1
SP	4,7 ± 1,0*	4,3 ± 0,2
SF	1,9 ± 1,2**	5,5 ± 0,2
ST	3,0 ± 1,4	4,3 ± 0,1

* oznacza p < 0,05, ** oznacza p < 0,01

Z powyższej tabeli wynika, że miano Enterobacteriaceae w okrężnicy i jelicie ślepym, zmniejsza się we wszystkich grupach, którym uzupełniająco podawano Lactobacillus.

Test kliniczny

Pro Viva (zupkę głogową opartą na owsie fermentowanym z Lactobacillus plantarum 299v, Skamejeriema Ekonomisk Forening, Malmo, Szwecja) podano 26 dzieciom chorym na ostre zapalenie żołądka ijelit w szpitalu w Szczecinie, Polska, średnio przez 5,5 dnia. Produkt podawano w ilości 400 ml/dzień: 200 ml rano i 200 ml wieczorem.

Przed leczeniem u wszystkich dzieci występowało 3-9 luźnych stolców/dzień; w wyniku leczenia ilość ta zmniejszyła się do 1-2 stolców/dzień. U 6 pacjentów przed leczeniem w hodowlach ze stolców znajdowały się patogeny, Salmonella u 3 dzieci, enteropatogenne E. coli u 2 dzieci, oraz Enterobacter aeromonas i Giardia intestinalis u 1 dziecka. Po leczeniu wszystkie hodowle stolcowe były wolne od tych patogenów. Wiadomo, że wszystkie patogeny z wyjątkiem Giardia intestinalis zawierają fimbrie typu 1 i przywierają do jelitowych komórek nabłonkowych według mechanizmu specyficznego względem mannozy. Wydaje się, że zdolność Lactobacillus plantarum 299v do konkurowania z patogenami w stosunku do miejsc wiązania na glikoproteinach zawierających mannozę jest odpowiedzialna za zanikanie tych bakterii w hodowlach stolcowych po podaniu Lactobacillus plantarum.

Wniosek

Bardzo rozpowszechnione występowanie specyficznych względem mannozy adhezyn u Gram-ujemnych bakterii żyjących w przewodzie jelitowym sugeruje, że adhezyny te odgrywają rolę w kolonizacji jelitowej. Specyficzna względem mannozy adhezyna nigdy dotąd nie została zidentyfikowana u gatunków Gram-dodatnich, takich jak Lactobacillus plantarum. Można przyjąć, że zdolność do przywierania do receptorów zawierających mannozę odgrywa znaczącą rolę w zdolności tej bakterii do kolonizacji. Jednakże również bakterie, które nie wykazują zdolności do przywierania do receptorów śluzówkowych, mogą z powodzeniem kolonizować w przewodziejelitowym; dotyczy to np. szczepu 271, który nie przywiera dojelitowych komórek nabłonkowych.

Zdolność do wiązania się z receptorami zawierającymi mannozę na nabłonku prawdopodobnie zapewnia. Lactobacillus plantarum specjalną zdolność do przeciwdziałania oddziaływaniu bakterii patogenicznych. Po pierwsze są dobrym kolonizatorem jelitowym. Po drugie będą one konkurować z patogenicznymi bakteriami względem miejsc receptorowych, które odgrywają ważną rolę w zdolności patogenicznych bakterii do kolonizacji, czyli względem receptorów śluzówkowych zawierających mannozę. Po trzecie wiążąc się z receptorami obecnymi na jelitowych komórkach nabłonkowych Lactobacillus plantarum będą mogły wpływać na bezpośrednie mikrootoczenie komórek nabłonkowych. Dzięki temu zmiana w mikrootoczeniu powodowana przez Lactobacilli będzie prawdopodobnie bardziej wpływać na komórki nabłonkowe niż gdyby bakterie Lactobacillus przebywały w miej scu bardziej oddalonym od nabłonka. Po czwarte dzię184 037 ki wiązaniu się z receptorami zawierającymi mannozę na komórkach nabłonkowych Lactobacillus plantarum będą zdolne do przeszkadzania w przywieraniu bakterii patogenicznych, zmniejszając w ten sposób ich zdolność do doprowadzania toksycznych lub w inny sposób drażniących substancji bezpośrednio do komórek nabłonkowych, co stanowi często warunek wstępny patogenicznego działania tych bakterii.

184 037

Podobieństwo (%) bo 40 50 60 70 80 90 100 <

llll llllll llllll II n n li nn i mi In nm n li nm ι ιι Ιι ιι ιιι n linii mul min ,ι ,) lc hzE

- Lb. plantarum .101— Lb. plantarum 97

- Lb. plantarum 53

- Lb. plantarum 256—,

- Lb. plantarum ATCC 14917^T

- Lb. plantarum 36E | 1 b

- Lb. plantarum 95 I ~ Lb. plantarum 98 —>

- Lb. plantarum 299- Lb. plantarum 299/

- Lb. plantarum 107

- Lb. plantarum 105

- Lb. plantarum 79

- Lb. plantarum 275

- Lb. plantarum 386-1

- Lb. plantarum So5

- Lb. plantarum ATCC 8014 • Lb. plantarum 120 • Lb. plantarum 44

Lb.‘plantarum CH Lb. pentosus ATCC 8041^T Lb.’plantarum' 442 Lb. fermentom ATCC 1493)^T Pd. acidiactl CCUG 32235 ^T Lb. reuteri DSM 20016 Lb. reuteri OSM 20015 Lb. reuteri N2LC Lb. reuteri N51C:2 Lb. reuteri N2J Lb. reuteri N5DJ Lb. reuteri 1044 Lb. reuteri 8557:1 Lb. reuteri 1048 Lb. reuteri 8557:3 Lb. gasseri DSM 20243^T Lb. vaginalis CCUG 31452

Lb. amytomnis DSM 20532 ^T Lb.be/veticus DSM 20075 ^T Lb. 'plantarum’ ATCC 10776

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie Lactobacillus plantarum zawierających specyficznąwzględem mannozy adhezynę oraz wykazujących zdolność do kolonizowania ludzkiej śluzówki jelitowej do wytwarzania leku do leczenia ostrego zapalenia żołądka i jelit, hamującego przywieranie patogenicznych bakterii eksprymujących fimbrie typu 1, zwłaszcza bakterii należących do Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Salmonella i Shigella albo Escherichia coli, do powierzchni komórek nabłonkowych.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, Lactobacillus plantarum wykazujących podobieństwo > 50% do Lactobacillus plantarum 299 o numerze depozytu DSM 6595, na podstawie analizy pełnego chromosomowego DNA z użyciem endonukleaz restrykcyjnych.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, Lactobacillus plantarum 299v o numerze depozytu DSM 9843.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, Lactobacillus plantarum w połączeniu z nośnikiem.
5. 5. Zastosowanie Lactobacillus plantarum zawierających specyficzną względem mannozy adhezynę oraz wykazujących zdolność do kolonizowania ludzkiej śluzówki jelitowej do wytwarzania leku do leczenia infekcji dróg moczowych, hamującego przywieranie patogenicznych bakterii eksprymujących fimbrie typu 1, zwłaszcza bakterii należących do Klebsiella, Enterobacter, Proteus albo Escherichia coli, do powierzchni komórek nabłonkowych.
6. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, Lactobacillus plantarum wykazujących podobieństwo > 50% do Lactobacillus plantarum 299 o numerze depozytu DSM 6595, na podstawie analizy pełnego chromosomowego DNA z użyciem endonukleaz restrykcyjnych.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 5 albo 6, Lactobacillus plantarum 299v o numerze depozytu DSM 9843.
8. 8. Zastosowanie według zastrz. 5 albo 6, Lactobacillus plantarum w połączeniu z nośnikiem.
9. 9. Zastosowanie według zastrz. 5, do wytwarzania leku hamującego przywieranie Escherichia coli eksprymujących fimbrie typu 1 do ludzkich komórek nabłonkowych pochwy i dróg moczowych.

   * * *