FR2831555A1 - Procede de selection de souches de bacteries lactiques a gram positif non pathogenes capables de lutter contre des infections par des bacteries pathogenes - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de sélection de souches de bactéries lactiques à Gram positif non pathogènes capables de lutter contre des infections par des bactéries pathogènes pour lesquelles la pathogénicité est consécutive à une adhésion tissulaire, consistant à choisir une souche présentant l'ensemble des propriétés suivantes : a - la capacité d'adhérer aux tissus d'un organe susceptible d'être infecté; b - la capacité des bactéries de cette même souche de se fixer les unes aux autres via des sites d'adhésion mutuelle; et c - la capacité de se fixer aux déterminants d'attachement de la souche bactérienne pathogène responsable de l'infection. Les souches bactériennes ainsi sélectionnées sont utilisables dans la fabrication de compositions thérapeutiques destinées à prévenir ou traiter les troubles pathologiques associés à l'infection de l'organe d'un hôte par des souches bactériennes pathogènes.

Description

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L'invention concerne un procédé de sélection de souches de bactéries lactiques à Gram positif permettant de lutter contre des infections de nature pathogène par des souches de bactéries à Gram négatif ou à Gram positif, telles que des souches de bactéries entéropathogènes.

Les pathologies digestives sévères induites par des bactéries entéropathogènes sont fréquentes chez les animaux d'élevage. C'est notamment le cas des colibacilloses qui restent la cause principale des diarrhées rencontrées dans les élevages porcins. Dans la majorité des cas, des souches bactériennes de l'espèce Escherichia coli entéropathogènes sont responsables des diarrhées.

La pathogénicité des souches de l'espèce Escherichia coli est consécutive à une adhésion tissulaire à la paroi du duodénum.

Plus généralement, dans le cas des bactéries dont la pathogénicité est médiée par une adhésion tissulaire, l'adhésion est souvent stéréospécifique et ne peut avoir lieu que si le tissu porte un type de récepteur bien particulier. L'interaction entre une lectine bactérienne et un sucre tissulaire est un exemple typique d'interaction stéréospécifique. Ces molécules de lectines sont fréquemment portées par des appendices filamenteux appelés fimbriae.

Les fimbriae sont de très fins filaments protéiques trouvés principalement, et très couramment, chez les bactéries à Gram négatif. Elles peuvent se répartir sur toute la surface de la cellule ou être plus localisées. Une fimbriae consiste en sous-unités protéiques linéaires répétées. Ces sous-unités sont souvent riches en acides aminés non polaires, si bien que les cellules porteuses de fimbriae tendent à avoir des surfaces plus hydrophobes que celles des cellules qui en sont dépourvues. Chez les bactéries à Gram négatif, de nombreux types de fimbriae assurent l'adhésion des cellules entre elles ou des cellules à une surface quelconque. Chaque type de fimbriae possède en effet sa lectine et n'adhère qu'à un récepteur spécifique composé d'épitopes glycoprotéiques et/ou glycolipidiques.

De façon générale, les bactéries entéropathogènes n'expriment pas leurs appendices de fixation, tels que les fimbriae, dans l'environnement mais seulement une fois ingérées, la synthèse de ces appendices étant favorisée par les conditions physico-chimiques du tube digestif.

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Les bactéries Escherichia coli K88 qui expriment comme appendice de fixation les fimbriae K88, appartiennent à ce type de bactéries pathogènes.

Escherichia coli K88 colonise sans difficulté le duodénum, lequel ne contient pas une flore protectrice aussi complexe que les autres régions distales du tube digestif.

C'est par chimiotactisme que le pathogène se rapproche de la muqueuse du duodénum et se fixe aux premiers récepteurs présents dans le mucus. Le pathogène accède ensuite par son passage à travers le gel muqueux à l'épithélium des villosités duodénales sous-jacentes auquel il se fixe avec avidité. C'est la fixation du pathogène qui induit une cascade de mécanismes intracellulaires conduisant à l'expression d'une virulence.

La fixation des fimbriae K88 sur les récepteurs des microvillosités induit dans un premier temps la synthèse d'entérotoxines par le pathogène qui provoque dans un deuxième temps une inversion des canaux ioniques et une perte d'ions Cl-associée à une sécrétion permanente d'eau par les entérocytes.

Lors d'une infection massive, ce phénomène pris dans sa globalité cause une déshydratation aiguë entraînant souvent la mort de l'animal en quelques heures seulement.

Chez le porc, les infections par des souches bactériennes de sérotype K88 sont fréquentes chez les animaux en pré-sevrage et jusqu'à deux semaines en post-sevrage.

Pour ce qui est des animaux âgés de 40 à 75 jours, c'est-à-dire dans la deuxième phase du post-sevrage et jusqu'au début de l'engraissement, les infections sont généralement provoquées par des souches bactériennes de sérotype 0138, K8 ou K85.

De façon conventionnelle, on lutte contre les infections bactériennes par administration d'antibiotiques. Les antibiotiques ne sont efficaces qu'à des doses de plus en plus élevées, ce qui présente l'inconvénient de multiplier les effets secondaires négatifs consécutifs à une antibiothérapie trop lourde (Bartlett J. G., Clinical of Infectious Diseases, 1992,15 (4), 573-581). Ce phénomène est cependant inévitable dans la mesure où les bactéries pathogènes au contact répété des antibiotiques tendent à développer une antibiorésistance qui est responsable de l'inefficacité des traitements.

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D'autres alternatives au traitement antibiotique ont été proposées : - une première solution consiste à utiliser des composés naturels prébiotiques additionnés à la nourriture qui sont capables d'amplifier sélectivement la croissance de certaines espèces bactériennes inoffensives de la flore intestinale afin que celle-ci assure une fonction protectrice optimale en un minimum de temps ; - une deuxième solution repose sur la production in vitro de flores fécales ou de cultures de souches bactériennes dans le but d'administrer aux animaux, via les aliments ou l'eau de boisson, des bactéries exogènes inoffensives qui viendraient renforcer les éléments constitutifs de la flore contre des pathogènes indésirables.

Cette solution semble montrer une certaine efficacité. Malheureusement, la manipulation et la conservation de flores complexes est extrêmement délicate si on désire maintenir un niveau de protection optimal constant.

- Une troisième solution consiste à utiliser un nombre beaucoup plus limité de souches bactériennes isolées d'une flore. Les étapes de sélection des bactéries les plus intéressantes ainsi que les connaissances de leur devenir dans le tube digestif ont souvent été négligées.

L'ensemble de ces méthodes est insatisfaisant dans la mesure où les souches obtenues se sont souvent révélées insuffisamment efficaces in vivo.

L'invention vise à améliorer la lutte contre les souches bactériennes en fournissant un procédé de sélection de souches de bactéries probiotiques particulièrement efficaces dans les conditions physiologiques.

Plus précisément, l'invention concerne un procédé de sélection de souches de bactéries lactiques à Gram positif non pathogènes capables de lutter contre des infections par des bactéries pathogènes pour lesquelles la pathogénicité est médiée par une adhésion tissulaire, consistant à choisir une souche présentant l'ensemble des propriétés suivantes : a-la capacité d'adhérer aux tissus d'un organe susceptible d'être infecté ; b-la capacité des bactéries de cette même souche de se fixer les unes aux autres via des sites d'adhésion mutuelle ; et c-la capacité de se fixer aux déterminants d'attachement de la souche bactérienne pathogène responsable de l'infection

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De façon préférée, les souches de bactéries lactiques à Gram positif sont sélectionnées parmi les bactéries naturellement présentes dans l'organe infecté de l'hôte.

Parmi les souches bactériennes dont la pathogénicité est consécutive à une adhésion tissulaire, on peut citer les souches enthéropathogènes

d'Escherichia coli. L'une des plus répandues est la souche identifiée par son sérotype ECET/0147 : K88ac (Erickson et al., Infection and Immunity, 1992,60, 983-988).

D'autres entérobactéries pathogènes dont la pathogénicité est consécutive à une adhésion tissulaire sont les Salmonelles. Chez ces bactéries, qui sont plus particulièrement responsables des infections rencontrées chez les volailles, les fimbriae sont indispensables pour initier une colonisation, en particulier dans le caecum des volailles, étape préliminaire à l'infection.

Encore un autre exemple de souche bactérienne dont la pathogénicité est consécutive à une adhésion tissulaire est Helicobacter pylori, laquelle est responsable de maladies inflammatoires gastriques chroniques et d'ulcérations gastriques et duodénales. L'adhésion d'Helicobacter sur des cellules gastriques par le biais des adhésines à la surface du pathogène se fixant à un récepteur sur la muqueuse gastrique est primordiale pour déclencher le processus de l'ulcération.

Dans le cas du pathogène Campylobacter jejuni, ce sont les liposaccharides qui jouent la fonction d'adhésine permettant la fixation aux cellules épithéliales et au mucus provoquant un état diarrhéique sévère chez l'homme.

On peut également citer Yersinia ou les clostridies comme autres espèces de souches bactériennes dont la pathogénicité est consécutive à une adhésion tissulaire.

Le procédé de l'invention est plus particulièrement avantageux pour sélectionner des bactéries capables de lutter contre des bactéries pathogènes exprimant des fimbriae en vue d'une adhésion tissulaire stéréospécifique.

La triple particularité d'adhérence qui caractérise les bactéries lactiques à Gram positif sélectionnées selon le procédé de l'invention assure une activité antimicrobienne améliorée.

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Cette activité peut être spécifique ou non spécifique.

On préfère que les bactéries lactiques sélectionnées présentent en outre la particularité de pouvoir se fixer de façon sélective aux déterminants d'attachement de la souche bactérienne pathogène exprimant les fimbriae.

La sélectivité peut être mise en évidence en démontrant l'absence d'adhésion de la souche de bactéries lactiques à des bactéries n'exprimant pas de fimbriae et résultant de la mutation de la souche bactérienne pathogène exprimant les fimbriae.

Les propriétés a), b) et c) des bactéries lactiques peuvent être mises en évidence de façon indépendante.

Néanmoins, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les propriétés b) et c) sont mises en évidence de façon simultanée dans un milieu physiologique tamponné approprié. Le milieu physiologique utilisable pour ce faire doit refléter les conditions physiologiques du milieu dans lequel la bactérie lactique devra finalement exercer son activité. La composition du milieu physiologique pourra être déterminée par l'homme du métier à la lumière de ses connaissances de l'état de la technique en fonction de la portion d'organe infectée.

De façon générale, le milieu physiologique tamponné contiendra essentiellement différents électrolytes influant sur le pH, les sécrétions biliaires, les sécrétions pancréatiques, les sécrétions gastriques et des extraits de mucus.

De manière préférée, l'organe infecté est une portion du tube digestif.

Lorsque l'organe infecté est le duodénum, le milieu physiologique contient notamment un extrait du mucus duodénal et les enzymes des sécrétions digestives et plus particulièrement des sels biliaires, des sécrétions gastriques et des sécrétions digestives pancréatiques.

Par ailleurs, on introduira avantageusement dans le milieu physiologique concerné des ions chlorures sous forme de sel et/ou d'acide chlorhydrique, les ions chlorures étant naturellement sécrétés et présents dans le bol alimentaire de la région pylorique.

Lorsque les ions chlorures sont ajoutés sous forme d'acide chlorhydrique, et en fonction de la quantité d'acide chlorhydrique introduit, il peut être nécessaire de neutraliser l'acidité du milieu par addition d'une base de façon à

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rétablir le pH à la valeur du pH physiologique, qui est d'environ 6 au niveau de la muqueuse du duodénum médian.

Les sels utilisables pour l'incorporation d'ions chlorures sont préférablement les sels de métaux alcalins ou alcalino-terreux, le chlorure de sodium étant préféré.

Comme base utilisable pour rétablir le pH, on préfère avoir recours aux bases minérales telles que NaHCOs, Na2C03, KHC03 et K2C03, mieux encore NaHC03 et KHC03 sont utilisés.

En vue de lutter contre les infections bactériennes qui touchent le duodénum du porc, on utilisera par exemple un tampon physiologique d'un pH entre 5,5 et 6,5, préférablement entre 5,8 et 6,2, par exemple de 6, à base de pepsine porcine gastrique, de mucus gastrique de porc, de pancréatine de porc, d'extrait de bile porcine et d'une solution de NaCI.

De préférence, le tampon physiologique contient : - pepsine porcine gastrique : 2g - mucus gastrique de porc : 1 g - pancréatine de porc : 1 g - extrait de bile porcine : 4, 5 g - solution aqueuse de NaCI à 5 g/t : qsp 1 litre.

La pepsine porcine gastrique, le mucus gastrique de porc, la pancréatine de porc et l'extrait de bile porcine sont facilement disponibles dans le commerce.

Quant aux propriétés d'adhésion tissulaire à l'organe infecté, (propriétés a), elles seront facilement mises en évidence in vitro par l'homme du métier par mise en oeuvre de méthodes conventionnelles.

A titre d'illustration, les capacités d'adhérence des lactobacilles à la paroi duodénale du porc sont mises en évidence : - dans un tampon de pH compris entre 7 et 8, tel que le tampon de Krebs Heuselait de formulation : - solution aqueuse 0, 12M de NaCI : 7 g - solution aqueuse 0,014M de KCI : 0, 1 g - solution aqueuse 0, 025M de NaHC03 : 2,1 g - solution aqueuse 0, 001 M de KH2PO4 : 0,13 g - eau : qsp 1 litre,

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dont le pH est de 7,4.

Ainsi, selon un mode de réalisation préféré du procédé de sélection, les propriétés b) et c) sont évaluées simultanément dans un milieu physiologique tamponné reflétant les conditions physiologiques de l'organe infecté.

Lorsque l'organe infecté est le duodénum, le milieu physiologique tamponné comprend un extrait de mucus duodénal, les enzymes des sécrétions digestives et plus particulièrement des sels biliaires, des sécrétions gastriques et des sécrétions digestives pancréatiques ainsi que les électrolytes naturellement prescrits dans le duodénum et influant le pH.

L'invention concerne par ailleurs l'utilisation de souches de bactéries lactiques à Gram positif sélectionnée selon le procédé de l'invention pour la fabrication d'une composition thérapeutique destinée à prévenir ou traiter les troubles pathologiques associés à une infection de l'organe d'un hôte par des souches bactériennes pathogènes.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la souche de bactéries lactiques à Gram positif est naturellement présente dans l'organe infecté de l'hôte.

De façon avantageuse, la souche bactérienne pathogène est une souche entérotoxinogène ou vérotoxinogène et, par exemple, une souche de l'espèce

Escherichia coli.

Selon l'invention, l'hôte est préférablement un animal tel qu'une volaille, un porc, un bovin, un chien, un chat, un cheval, un ovin, un caprin ou un poisson, mieux encore un porc.

Dans la suite, on illustre plus précisément le procédé de l'invention en vue de lutter contre les infections bactériennes affectant le duodénum du porc.

EXEMPLE Les souches de lactobacilles testées sont des souches fraichement isolées du duodénum de porcelets âgés de 6 à 16 semaines ou de truies âgées de 2 ans. Une seule souche a été isolée par animal. Les animaux ont été sélectionnés dans différents élevages européens. Les souches ont toutes été isolées à partir d'une culture initiale sur gélose MRS à 37 C en micro-aérobiose et ont ensuite été identifiées d'après une étude de fermentation des sucres sur galerie API

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50CH. Les genres bactériens principaux finalement testés sont Lactobacillus et Leuconostoc.

La gélose MRS (de Man. Rogosa et Sharpe) est préparée par dissolution de 70 g du mélange A suivant dans 1 litre l'eau :
Mélange A :
Peptone 10 g
Extrait de viande de boeuf 10 g
Extrait de levures 5 g
Dextrose 20 g
Complexe de sorbitan monoléate 1 g
Citrate d'ammonium 2 g
Acétate de sodium 5 g
Sulfate de magnésium 0,1 g
Sulfate de manganèse 0,05 g
Phosphate de potassium dibasique 2 g
Agar 15 g.

Le pH final de la gélose est 6, 5 + 0, 2 à 250 C.

Des cultures de ces lactobacilles sont préparées simplement par prélèvement de bactéries à la surface de la gélose MRS et mise en suspension dans le tampon de Krebs-Heuselait pour atteindre une valeur de 109 bactéries/ml.

La souche de bactéries pathogènes dont l'éradication est souhaitée appartient à l'espèce Escherichia coli. Cette souche a été isolée dans le tube digestif d'un animal très malade. Les colibacilloses diarrhéiques sévères qui s'étaient propagées à tout un élevage étaient causées par cette souche ETEC LT+, 0149 ; K91, K88ac.

Le criblage des lactobacilles est réalisé par mise en oeuvre des trois protocoles opératoires suivants.

. Protocole opératoire pour la mise en évidence des propriétés d'adhérence tissulaire à la muqueuse et aux entérocytes du duodénum.

Plusieurs porcelets âgés de 6 mois ont été tués et le duodénum de ces animaux a été découpé en segments de 10 cm qui ont été vigoureusement lavés avec le tampon de Krebs (tampon 1) défini ci-dessus, de manière à se

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débarrasser du chyme intestinal, du mucus et des débris résiduels de bactéries.

Une fois lavés, les segments intestinaux ont été ouverts sur toute leur longueur puis immergés dans un tampon glycérolé (tampon 2 défini ci-dessous) contenant des inhibiteurs d'enzymes afin d'assurer la stabilité structurale de la muqueuse pendant la conservation. Les échantillons ont ainsi été conservés à-20 C. La concentration en glycérol a été ajustée afin d'éviter les dégâts cellulaires causés par une cristallisation lors de la réfrigération. Le jour de l'essai, une pièce intestinale a été découpée en morceaux de 1 cm2 rapidement déposée dans une solution tamponnée à 4 C pendant 15 minutes puis lavée à trois reprises dans du tampon pendant 3 fois 10 minutes afin d'éliminer le glycérol en excès. Les segments intestinaux ont ainsi été conservés dans le tampon 2 quelques minutes en attendant leur utilisation.

La préparation des entérocytes a été réalisée à partir des pièces intestinales lavées. La muqueuse duodénale (microvillosités) a été soigneusement raclée en surface avec une lame de microscope en verre et propre puis resuspendue dans 2 ml de tampon. Les cellules entérocytes ont été dissociées entre elles et les traces de glycérol ainsi que les cellules endommagées ou éclatées ont été éliminées par une succession de lavages et de centrifugations à 3000 tours/minute. Entre chaque étape de lavage, un échantillon a été observé en coloration de Gram jusqu'à ce que les cellules apparaissent isolées et en parfait état. La solution d'entérocytes bien préparée peut se conserver 4 à 5 jours à 4 C sans risque de contamination.

Dans un erlenmeyer de 25 ml est disposée une pièce intestinale de 2 cm2 dans 18 ml de tampon 1 à laquelle sont ajoutés 2 ml de la suspension de bactéries lactiques.

L'ensemble est agité doucement à 10 rotations par minute à 37 C pendant 30 minutes. Il n'y a pas d'adhérence aux entérocytes lorsque la solution tamponnée reste troublée du fait de la présence de bactéries en suspension. Il y a adhérence aux entérocytes lorsque la solution tamponnée redevient limpide.

L'adhérence peut être confirmée par une coloration de Gram, en mettant en contact dans un tube hémolyse de 3 ml de capacité 500 ui de la suspension de bactéries lactiques diluée au 1/10 (108 bactéries/ml) avec 500 ! de la suspension d'entérocytes préalablement préparée.

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En cas de non adhérence aux entérocytes, les bactéries lactiques pourpres sont anarchiquement dispersées autour des entérocytes (rosées).

En cas d'adhérence, les bactéries sont accolées partiellement ou totalement aux entérocytes.

Les lactobacilles à retenir sont ceux pour lesquelles l'adhérence a pu être mise en évidence.

Formulation du tampon glycérolé (tampon 2) : - 1 partie en volume de glycérol pur, - 1 partie en volume de tampon tris-EDTA, la composition du tampon Tris-EDTA qui présente un pH de 7,6 étant la suivante : -tris hydroxyméthylaminométhane : 10 mM - acide éthylène diamine tétracétique : 5 mM - NaCI : 0, 155 M - eau : qsp 1 litre.

Protocole opératoire pour la mise en évidence des propriétés d'autoagrégation et de co-agrégation (propriétés b) et cn, c'est-à-dire de l'adhérence entre les bactéries lactiques d'une même souche ou entre les bactéries lactiques d'une souche et les bactéries d'une souche pathogène d'Escherichia coli.

Les bactéries lactiques ont été cultivées sur une gélose MRS (Difco) à 3r C dans une jarre afin de reconstituer des conditions microaérophiles. A la gélose MRS est ajouté le tampon 3 préparé à partir du mélange enzymatique suivant :
Pepsine porcine gastrique 2g
Mucus gastrique de porc 1 g
Pancréatine de porc 1 g
Extrait de bile porcine 4,5 g

Solution de NaCI à 5 g/i 1 litre, par mise en oeuvre des étapes suivantes.

La pepsine et la solution aqueuse de NaCI sont mises en présence, et le pH est ajusté à 2 par addition d'une solution aqueuse 10M d'HCI. A ce mélange sont ajoutés en deux étapes le restant des enzymes (mucus, pancréatine et extrait de bile). Intermédiairement, le pH d'une solution intermédiaire est amené à 5 à l'aide d'un tampon carbonaté 4 (30 ml de Na2C03 : 0, 2M ; 20 ml de

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NaHC03 : 0, 2M ; et 200 ml d'eau) afin de limiter les risques de dénaturation enzymatique. Le pH de la solution finale est alors ajusté à 6 par utilisation du même tampon 4 décrit ci-dessus.

Le volume de la solution est alors ajusté à 1 litre avec la solution de NaCI à 5 g/l en fiole jaugée et le pH est de nouveau contrôlé pour confirmer une valeur de pH 6.

Les souches d'Escherichia coli ont été cultivées pendant 18 heures à 37 C sur une gélose BHI en aérobiose.

La gélose BHI (Brain heart Infusion Agar) est préparée par dissolution de 52 g du mélange B suivant dans 1 litre d'eau.

Cette gélose présente un pH de 7, 4 + 0,2 à 25 C.

Mélange B :
Infusion de cerveau de boeuf 200 g
Infusion de coeur de boeuf 250 g
Peptones 10 g
Dextrose 2 g
Chlorure de sodium 5 g
Phosphate disodique 2,5 g
Agar 15 g.

Les colonies d'Escherichia coli et de bactéries lactiques ont été prélevées avec une anse de platine stérile à la surface de la gélose et désagrégées dans un volume de 2 ml de solution de NaCI à 5 g/) afin de constituer une suspension homogène. Ces suspensions ont ensuite été diluées dans le même tampon afin d'atteindre une valeur approximative d'absorbance de 1,5 + 0,1 mesurée à une longueur d'onde de 600 nm.

Un volume de 1 ml de suspension de bactéries lactiques a été mélangé avec 2 ml du tampon 3 décrit ci-dessus. La même dilution a été réalisée avec la suspension d'Escherichia coli. Les absorbances sont ainsi ajustées à une valeur proche de 0,5 (108 bactéries/ml) pour une longueur d'onde de 600 nm. Les 3 ml de suspension de bactéries lactiques sont ensuite ajoutés aux 3 ml de suspension de bactéries pathogènes dans un tube unique stérile et hermétiquement bouché. Après plusieurs retournements du tube pendant une période de 10 secondes, un échantillon de 1 ml a été prélevé afin de mesurer

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l'absorbance (temps TOh). Un autre prélèvement a ensuite été réalisé après 4 heures d'incubation à 37 C sous faible agitation à 30 tours par minute (sur table d'agitation rotationnelle verticale) pour une dernière mesure d'absorbance (temps T4h). Dans les mêmes conditions d'incubation, les témoins nécessaires pour mesurer le phénomène d'adhérence entre les bactéries d'une même souche ont été réalisés de la même manière mis à part que les 3 ml de suspension de bactéries lactiques ont été dilués dans 3 ml du tampon 3 décrit ci-dessus. Les concentrations des différents composants du tampon enzymatique lors des tests d'agrégation sont diminuées (du fait de l'addition des suspensions bactériennes) et ainsi ajustées à des valeurs désirées qui sont : 1,3 g/) de pepsine, 0,6 g/) de mucus gastrique, 0,6 g/) de pancréatine et 0,3% d'extrait de bile.

L'appréciation de l'intensité du phénomène d'adhérence entre bactéries (auto-agrégation) est apportée par les valeurs d'absorbances des témoins négatifs à TOh et T4h ne contenant que les bactéries d'une souche de lactobacille ou de pathogène en suspension dans une solution physiologique.

% auto-agrégation après 4 heures entre des bactéries d'une même souche :

O. D. Lc (TOh) - 0. 0. Lc (T4h) x 100 = % auto-agrégation O. D. Lc (TOh) O. D. Lc (T4h) = absorbance de la suspension de lactobacilles mesurée après 4 heures
O. D. Lc (TOh) = absorbance de la suspension de lactobacilles mesurée à

TO.

Le pourcentage de co-agrégation est calculé avec l'équation standard de Handley et al. (Journal of General Microbiology, 1987, 133 : 3207-3217) : (O. D. Lc + O. D. Ec)/2- (O. D. L + O. D. E) x 100 = % co-agrégation (O. D. Lc + O. D. Ec) /2
O. D. Lc et O. D. Ec correspondent aux valeurs respectives des absorbances lues à 600 nm après 0 ou 4 heures d'incubation des témoins caractérisés uniquement par la souche de lactobacille ou la souche de E. coli.

O. D. L + O. D. E correspond à la valeur de l'absorbance des cultures mixtes (lactobacilles + E. coli) lue après la même période d'incubation.

(O. D. Lc + O. D. Ec) /2 représente la valeur moyenne de l'absorbance des suspensions mixtes.

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La figure 1 rapporte les résultats obtenus concernant les propriétés d'autoagrégation et de co-agrégation dans le cas de 21 souches de lactobactéries adhérentes à la muqueuse duodénale porcine.

- D 209 L. mesen. cremoris - D 7 L. acidophilus - D 57 L. fermentum - D 204 L. fermentum - 0 58 : L. helveticus - D 40 L. fermentum - D 638 L. fermentum - D 27 L. acidophilus - D 228 L. lactis - D 60 L. acidophilus - D 18 L. acidophilus - S 43 : L. acidophilus - S 53 L. fermentum - S 55 L. acidophilus - D 70 L. acidophilus - J 6 L. acidophilus

- D 438 L. fermentum - D 453 L. lactis - D 2 L salivarius - D 9 L. fermentum - D 41 L. lactis
Les résultats montrent clairement que les trois critères de sélection qui ont été choisis (adhérence, auto-agrégation et co-agrégation) ont pu être observés simultanément et sont régis par des mécanismes de reconnaissance très vraisemblablement différents. En effet, sur les 70 souches adhérentes à la muqueuse duodénale seulement 10 sont à la fois auto et co-ag régantes. Cependant, certaines souches peuvent être très auto-agrégantes tout en développant une co-agrégation de très faible intensité avec E. coli (souches J18,

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S55, S53, D438 de la Figure 1) et vice-versa (souches D204, D40, D27 de la Figure 1).

L'intensité du phénomène de co-agrégation peut être supérieure à celle du phénomène d'auto-agrégation, même si celui-ci atteint déjà un niveau satisfaisant.

D'autre part, de nombreuses souches probiotiques adhérentes à la muqueuse duodénale n'ont pas développé d'activité agrégante (exemple des souches D2, D9 et D41 de la Figure 1).

- Protocole opératoire de mesure de la spécificité du phénomène d'adhérence aux bactéries pathogènes exprimant les fimbriae K88.

Pour cette étude, la souche de bactéries pathogènes utilisée est une souche d'Escherichia coli mutée qui ne présente plus la capacité d'exprimer les fimbriae K88 mais uniquement les fimbriae de type 1 (fimbriae communes rencontrées sur la surface de toutes les bactéries E. coli commensales non pathogènes). L'absence ou la présence des fimbriae K88 a été confirmée après culture par la réalisation d'un test Fimbrex (K88 Fimbrex Kit, CVL, Weybridge).

Cette souche est cultivée sur gélose BHI à 37 C, ie gé ! ose BH ! étant telle que définie ci-dessus.

Les propriétés d'auto-agrégation et de co-agrégation sont mises en évidence à partir des 10 souches de lactobacilles précédemment sélectionnées qui présentent dans le test précédent (Figure 1) des valeurs de co-agrégation supérieures ou égales à 10.

Les résultats obtenus sont également rapportés à la Figure 1.

Sur les 10 souches adhérentes, auto-agrégantes et co-agrégantes, seulement 2 souches de lactobacilles ont développé une activité co-agrégante persistante envers la souche mutée d'Escherichia coli malgré l'absence de fimbriae K88 alors que les autres souches de bactéries lactiques n'avaient pas de propriété co-agrégante avec cette même souche mutée.

Un nombre limité de souches ainsi sélectionnées ont été capables d'adhérer à la muqueuse duodénale, de s'auto-agréger et également de coagréger spécifiquement les lectines K88 des espèces pathogènes Escherichia coli entéropathogènes (8 sur les 70 initialement isolées). Les bactéries

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sélectionnées pour la réalisation de préparations médicamenteuses sont représentées par 3 souches de Lactobacillus fermentum, 2 souches de Lactobacillus acidophilus, 1 souche de Lactobacillus helveticus et 1 souche de

Leuconostoc lactis.

Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne une composition thérapeutique comprenant une souche de bactéries lactiques à Gram positif sélectionnée par le procédé de sélection de l'invention.

Une telle composition peut être produite par mélange d'une souche de bactéries lactiques à Gram positif sélectionnée selon le procédé de l'invention avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Ainsi, selon un dernier de ses aspects, l'invention concerne le procédé de préparation d'une composition thérapeutique comprenant la sélection d'une souche de bactéries lactiques à Gram positif par le procédé de l'invention et le mélange de la souche avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Procédé de sélection de souches de bactéries lactiques à Gram positif non pathogènes capables de lutter contre des infections par des bactéries pathogènes pour lesquelles la pathogénicité est consécutive à une adhésion tissulaire, consistant à choisir une souche présentant l'ensemble des propriétés suivantes : a-la capacité d'adhérer aux tissus d'un organe susceptible d'être infecté ; b - 1a capacité des bactéries de cette même souche de se fixer les unes aux autres via des sites d'adhésion mutuelle ; et c-la capacité de se fixer aux déterminants d'attachement de la souche bactérienne pathogène responsable de l'infection.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les bactéries lactiques à Gram positif sont choisies parmi les bactéries naturellement présentes dans l'organe infecté de l'hôte.

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'on choisit les bactéries lactiques qui se fixent de façon sélective aux déterminants d'attachement de la souche bactérienne pathogène.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les souches bactériennes pathogènes appartiennent à une souche entéropathogène.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la souche bactérienne pathogène est une souche de l'espèce Escherichia coli.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'organe infecté utilisé dans la mise en oeuvre de la sélection est une portion du tube digestif.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'organe infecté est le duodénum.

8. Composition thérapeutique comprenant une souche de bactéries lactiques à Gram positif sélectionnée par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.

9. Utilisation d'une souche de bactéries lactiques à Gram positif sélectionnée selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour la fabrication d'une composition thérapeutique destinée à prévenir ou traiter les

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troubles pathologiques associés à une infection de l'organe d'un hôte par des souches bactériennes pathogènes.

10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'hôte est un animal.

11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'animal est le porc.

12. Procédé de production d'une composition thérapeutique comprenant la sélection d'une souche de bactéries lactiques à Gram positif par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et le mélange de la souche avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les propriétés b) et c) sont évaluées simultanément dans un milieu physiologique tamponné reflétant les conditions physiologiques de l'organe infecté.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'organe infecté est le duodénum et en ce que le milieu physiologique tamponné comprend un extrait de mucus duodénal, les enzymes des sécrétions digestives et plus particulièrement des sels biliaires, des sécrétions gastriques et des sécrétions digestives pancréatiques ainsi que les électrolytes naturellement présents dans le duodénum et influant le pH.