FR3094207A1 - Utilisation de la gentamicine pour inhiber/ empecher la formation de biofilm - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique comprenant de la gentamicine pour son utilisation comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien. La présente invention se rapporte également à l’utilisation de la gentamicine pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface et a un dispositif médical comprenant à sa surface de la gentamicine. La présente invention trouve une application notamment dans le domaine pharmaceutique, le domaine médical. Figure à publier avec l’abrégé : Fig. 1

Description

UTILISATION DE LA GENTAMICINE POUR INHIBER/ EMPECHER LA FORMATION DE BIOFILM

La présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique comprenant de la gentamicine pour son utilisation comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien.

La présente invention se rapporte également à l’utilisation de la gentamicine pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface.

La présente invention se rapporte également un dispositif médical comprenant à sa surface de la gentamicine.

La présente invention trouve une application notamment dans le domaine pharmaceutique, le domaine médical.

Etat de la technique

Les biofilms sont formés de différentes couches de bactéries ou de microorganismes, contenus dans une matrice solide. Ils se développent pour former des communautés microbiennes, dont l’une des propriétés est d’adhérer aux surfaces submergées. Cette adhésion est soit non spécifique (adhérence), soit spécifique (adhésion proprement dite) (Costerton et al. Bacterial Biofilms. Sciences 1999 ; 284-6) :

L’adhérence ou adhésion réversible : Les microorganismes présents se rapprochent des surfaces par gravimétrie, mouvements browniens ou par chimiotactisme s’ils possèdent des flagelles. Au cours de cette première étape de fixation, faisant intervenir uniquement des phénomènes purement physiques et des interactions physico-chimiques faibles, les microorganismes peuvent encore être facilement décrochés.

L’adhésion : Cette étape plus lente fait intervenir des interactions de plus forte énergie ainsi que le métabolisme microbien et les appendices cellulaires du microorganisme (flagelles, pilis, ,….). L’adhésion est un phénomène actif et spécifique. Certains premiers colonisateurs vont s’attacher de manière irréversible à la surface grâce notamment à la synthèse d’exopolysaccharides (EPS). Ce processus est relativement lent et dépend des facteurs environnementaux et des microorganismes en présence.

Ces biofilms sont omniprésents dans de nombreux domaines, dans lesquels ils présentent des risques sanitaires et causent des dommages relativement importants.

En santé humaine par exemple, les biofilms sont responsables d’infections de plus en plus difficiles à juguler : sur toute la sphère ORL (conduit auditif, muqueuse nasale, conjonctive de l’œil …), sur les dents (apparition de tartre, de caries, …), sur les bronches, les poumons (chez les patients atteints de mucoviscidose …), au niveau du tractus urogénital (…). Ils sont en outre à l’origine de la plupart des pathologies nosocomiales (plus de 10 000 décès par an) en se formant au niveau de cathéters, ou d’implants (valves cardiaques, hanches artificielles, sondes urinaires…) (J.W. Costerton, P. Stewart et E.P. Greenberg, Bacterial Biofilms : « A common cause of persistent infections ». Science, vol. 284, pp1318-1322).

Les biofilms bactériens se développant sur des implants ou lors d’infections chroniques constituent des réservoirs de pathogènes à l’origine de nombreuses infections nosocomiales.

Malgré la mise en œuvre de mesures préventives, les biofilms sont difficiles à éradiquer en raison de leur tolérance caractéristique à des doses élevées d’antibiotiques.

Les infections ostéoarticulaires sont des infections qui touchent les os et/ou les articulations qui sont fréquemment dues à des staphylocoques. Il existe également des infections ostéoarticulaires complexes qui apparaissent plus particulièrement chez les individus porteurs de prothèse articulaire ou de dispositifs médicaux implantables. Ces infections sont particulièrement difficiles à traiter dans la mesure où elles présentent fréquemment une résistance aux antibiotiques, notamment de par la présence de biofilm.

En particulier, il est connu que la surface de prothèses, notamment articulaire est un territoire favorable pour la prolifération des bactéries et la formation de biofilm.

Une étude ayant pour objet de comparer avec un procédé particulier, la concentration minimale inhibitrice (CMI) et la CMI du biofilm (CMIb) sur 29 isolats cliniques de Staphylococcus aureus d’antibiotiques utilisés dans le traitement des infections osseuses et articulaires, a été réalisée. Dans cette étude, certains antibiotiques avaient une concentration minimale inhibitrice (CMI) et la CMI du biofilm (CMIb) similaires ou inversement une distribution CMIb très différente de celle de la CMI, la CMIb au-dessus du point de rupture (« Breakpoint »). En outre, des antibiotiques ont montré un effet souche dépendant. Enfin les résultats in-vivo décrits pour un seul antibiotique testé ont montré une éventuelle réduction de la formation de biofilm (Jason Tasse, Delphine Croisier, Stéphanie Badel-Berchoux, Pascal Chavanet, Thierry Bernardi, Christian Provot and Frédéric Laurent « Preliminary results of a new antibiotic susceptibility test against biofilm installation in device-associated infections: the Antibiofilmogram” Pathogens and Disease, June 2016, Vol. 74, No. 6)

Il existe donc un réel besoin de trouver un nouveau moyen/composé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un moyen/composé permettant d’empêcher la formation de biofilm et/ou dégrader les biofilms.

En particulier, il existe donc un réel besoin de trouver un nouveau moyen/composé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un moyen/composé permettant d’empêcher la formation de biofilm et/ou dégrader les biofilms présents notamment à la surface de prothèses et/ou de dispositif médical implantable.

Il existe donc un réel besoin de trouver un nouveau moyen/composé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un moyen/composé permettant d’empêcher la formation de biofilm et/ou dégrader les biofilms.

En particulier, il existe un réel besoin de trouver un nouveau moyen/composé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un moyen/composé permettant d’empêcher la formation de biofilm et/ou dégrader les biofilms présents notamment à la surface de prothèses et/ou de dispositif médical implantable.

Il existe également un réel besoin de trouver un nouveau moyen/composé permettant de prévenir/traiter les biofilms d’infections ostéo-articulaires, de plaies incluant les plaies superficielles, profondes, les infections du pied diabétique, brûlures, escarres.

En particulier, il existe donc un réel besoin de trouver un nouveau moyen/composé palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l’art antérieur, en particulier d’un moyen/composé permettant d’empêcher la formation de biofilm au niveau des plaies et/ou d’infections, par exemple ostéo-articulaires.

Description de l’invention

La présente invention résout les inconvénients et obstacles de l’art antérieur en fournissant une composition pharmaceutique comprenant de la gentamicine pour son utilisation comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien.

La gentamicine est un antibiotique de la famille des aminosides (aminoglycosides). Son activité bactéricide est basée principalement sur l’inhibition de la synthèse des protéines, altérant ainsi la perméabilité de la membrane cellulaire, ce qui entraine la rupture progressive de l'enveloppe cellulaire puis éventuellement la mort de la cellule. La gentamicine possède une action bactéricide à des concentrations égales ou légèrement supérieures aux concentrations inhibitrices, déterminées pour chaque isolat de souche.

La gentamicine est utilisée sous forme de sulfate en solution injectable, par voie parentérale.

En général, les espèces sensibles à la gentamicine sont :

parmi les aérobies à Gram +, Corynebacterium, Listeria monocytogenes, Staphylococcus méti-S, staphylococcus méti-R,

parmi les aérobies à Gram -, Acinetobacter baumanni, Branhamella catarrhalis, Campylobacter, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, francisella, Haemophilus influenzae, Klebsiella, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia.

Il existe également des espèces résistantes par exemple :

parmi les aérobies à Gram +, les entérocoques, Nocardia asteroides, Streptococcus, et

parmi les aérobies à Gram -, Alcaligenes denitrificans, Burkholderia, flavobacterium sp, Providencia stuartii, Stenotrophomonas maltophilia.

Ce spectre correspond à celui des formes systémiques de la gentamicine. Avec les présentations pharmaceutiques locales, les concentrations obtenues in situ sont très supérieures aux concentrations plasmatiques.

Par voie injectable, la gentamicine est utilisée, entre autres, dans la prise en charge des infections articulaires, des endocardites, des infections cutanées, les infections méningées, les infections respiratoires, les infections urinaires et urogénitales. Par voie locale, la gentamicine est utilisée en particulier dans la prise en charge des conjonctivites bactériennes, des kératites bactériennes et des ulcères cornéens.

Dans toutes ces utilisations thérapeutiques connues, la gentamicine est utilisée en tant qu’antibiotique bactéricide, c’est-à-dire comme inhibiteur de la synthèse de protéines et l’altération de la perméabilité membranaire des bactéries allant jusqu’à la mort de la cellule.

Henry-Stanley et al. décrivent dans l’article « Aminoglycoside inhibition of Staphylococcus aureus biofilm formation is nutrient dependent » (Journal of Medical Microbiology (2014), 63, 861–869) que « il semble raisonnable de supposer que, afin que la formation de biofilm sur des sutures ait lieu, en présence de concentrations bactéricides de gentamicine, un nombre seuil de cellules planctoniques résistantes à la gentamicine doit être présent dans l’inoculum initial ». En d’autres termes, la gentamicine est décrite et connu comme un bactéricide détruisant les bactéries présentent dans le milieu.

Toutefois, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que la gentamicine permet avantageusement d’inhiber la formation de biofilm et en particulier inhibe la première étape indispensable à cette formation, à savoir le dépôt et la fixation, également dénommé respectivement adhérence et adhésion, des bactéries sur une surface.

En particulier, les inventeurs ont notamment démontré cette inhibition dans des conditions in-vitro utilisées comprenant en une incubation courte (4h) de souches cliniques de Staphylococcus aureus, en présence de gentamicine dès le début de l’incubation. Tel que décrit dans les exemples, les inventeurs ont démontré et caractérisé l’effet d’un composé, en l’occurrence la gentamicine, sur la formation initiale du biofilm, les étapes d’adhérence et adhésion.

Les inventeurs ont également démontré de manière surprenante que la gentamicine permet avantageusement d’inhiber la formation de biofilm et en particulier inhibe la première étape indispensable à cette formation, à savoir le dépôt et la fixation, également dénommé respectivement adhérence et adhésion, des bactéries sur des plaies et/ou au niveau d’infection ostéoarticulaire. En particulier, les inventeurs ont notamment démontré cette inhibition, tel que décrit dans les exemples, dans des conditions in-vivo via une inoculation sur un cathéter implanté en sous-cutané dans la cuisse d’une souris et en mesurant l’effet, dans des exemples de conditions de pharmacocinétique/pharmacodynamique définies en fonction, des effets de la gentamicine sur l’installation en biofilm sur le cathéter des mêmes souches cliniques utilisées in-vitro.

Aussi, la présente invention a également pour objet l’utilisation d’une composition pharmaceutique comprenant de la gentamicine pour médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien au niveau de plaies et/ou d’infections.

Dans la présente par biofilm bactérien on entend tout biofilm connue de l’homme du métier susceptible d’être formé par une bactérie. Il peut s’agir par exemple d’un biofilm formée par une bactérie choisie dans le groupe comprenant Acetobacter aurantius, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Agrobacterium tumefaciens, Azorhizobium caulinodans, Azotobacter vinelandii, Bacillus anthracis, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus fusiformis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacteroides gingivalis, Bacteroides melaninogenicus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Branhamella catarrhalis, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium welchii, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium fusiforme, Coxiella burnetii Ehrlichia chaffeensis, Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus galllinarum, Enterococcus maloratus, Escherichia coli Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum Gardnerella vaginalis Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus pertussis, Haemophilus vaginalis, Helicobacter pylori Klebsiella pneumoniae, Klebsiella rhinoscleromatis-klebsiella oxytoca, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Legionella pneumophila, Methanobacterium extroquens, Microbacterium multiforme, Micrococcus luteus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium diphtheriae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis , Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides Pasteurella multocida, Pasteurella tularensis, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas maltophilia, Rhizobium radiobacter, Rickettsia prowazekii, Rickettsia mooseri, Rickettsia psittaci, Rickettsia quintana, Rickettsia rickettsii, Rickettsia trachomae, Rochalimaea henselae, Rochalimaea quintana, Rothia dentocariosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus cricetus, Streptococcus faceium, Streptococcus faecalis, Streptococcus ferus, Streptococcus gallinarum, Streptococcus lactis, Streptococcus mitior, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus rattus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Vibrio comma, Vibrio parahemolyticus, Vibrio vulnificus, Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica,Yersinia pestis et Yersinia pseudotuberculosis.

Dans la présente par plaie on entend toute plaie connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une plaie superficielle, par exemple de plaie de l’épiderme et/ou du derme, par exemple de taille inférieure à 5 cm. Il peut s’agir également de plaie profonde, par exemple une plaie de l’épiderme et du derme avec exposition du tissu sous cutané. Il peut s’agir également de brûlures, escarres. Il peut s’agir également de toutes plaies susceptibles de s’infecter, par exemple de toutes plaies susceptibles d’être infectées par exemple dans lesquelles l’infection retardant ou compromettant la guérison de la plaie.

Selon l’invention, le médicament peut être destiné à un mammifère, par exemple un mammifère choisi dans le groupe comprenant l’ordre Monotremata, Didelphimorphia, Paucituberculata, Microbiotheria, Notoryctemorphia, Dasyuromorphia, Peramelemorphia, Diprotodontia, Tubulidentata, Sirenia, Afrosoricida, Macroscelidea, Hyracoidea, Proboscidea, Cingulata, par exemple le tatou, Pilosa, Scandentia, Dermoptera, Primates, Rodentia, Lagomorpha, Erinaceomorpha, Soricomorpha, Chiroptera, Pholidota, Carnivora, Perissodactyla, Artiodactyla et Cetacea.

Il peut s’agir par exemple d’un humain ou d’un animal. Il peut s’agir par exemple d’un animal d’élevage, d’un animal de compagnie, d’un animal en voie de disparition ou de tout autre animal.

Par exemple, l’animal d’élevage peut être choisi dans le groupe comprenant les bovins, porcins, ovins, caprins, camelins, canins, équins, murins. Par exemple, l’animal de compagnie peut être choisi dans le groupe comprenant les canins et les félins.

Dans la présente, par médicament on entend un médicament à usage humain ou un médicament vétérinaire.

Dans la présente par individu on entend un mammifère, par exemple un mammifère choisi dans le groupe comprenant l’ordre Monotremata, Didelphimorphia, Paucituberculata, Microbiotheria, Notoryctemorphia, Dasyuromorphia, Peramelemorphia, Diprotodontia, Tubulidentata, Sirenia, Afrosoricida, Macroscelidea, Hyracoidea, Proboscidea, Cingulata, par exemple le tatou, Pilosa, Scandentia, Dermoptera, Primates, Rodentia, Lagomorpha, Erinaceomorpha, Soricomorpha, Chiroptera, Pholidota, Carnivora, Perissodactyla, Artiodactyla et Cetacea.

Il peut s’agir par exemple d’un humain ou d’un animal. Il peut s’agir par exemple d’un animal d’élevage, d’un animal de compagnie, d’un animal en voie de disparition ou de tout autre animal.

Par exemple, l’animal d’élevage peut être choisi dans le groupe comprenant les bovins, porcins, ovins, caprins, camelins, canins, équins, murins. Par exemple, l’animal de compagnie peut être choisi dans le groupe comprenant les canins et les félins.

Dans la présente par infection on entend toute infection connue de l’homme du métier pour lesquels des biofilms sont susceptibles de se former. Il peut s’agir par exemple d’infections choisies dans le groupe comprenant les infections ostéoarticulaires, les infections du pied diabétique, les infections de plaies cutanées telles que brûlures et/ou les escarres, les infections pulmonaires.

Dans la présente le médicament/composition pharmaceutique peut être sous toute forme qui peut être administrée à un humain ou à un animal. L'administration peut être effectuée directement, c'est-à-dire pure ou pratiquement pure, ou après mélange de la gentamicine avec un support et/ou un support pharmaceutiquement acceptable.

Selon la présente invention, le médicament peut être sous forme liquide, par exemple sous la forme d’une solution injectable et/ou d’une solution pulvérisable, sous forme native ou par exemple encapsulée dans des nanoparticules.

Selon la présente invention, le médicament peut être un médicament pour une administration topique-transdermique, par exemple choisi dans le groupe comprenant un onguent, une crème, un gel, une lotion, une émulsion à base de silicone, un timbre, une mousse, un patch transdermique et/ou un spray. Le médicament peut également être associé à un pansement.

Selon la présente invention, le médicament peut être un médicament pour une administration parenterale, par exemple une administration sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse.

L'administration peut être définie de manière à permettre l'administration d'une dose acceptable et efficace médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien. Par exemple, l'administration peut comprendre une dose de gentamicine supérieure à 3 mg/kg de poids corporel, par exemple de 3 à 10 mg/kg de poids corporel.

Selon l’invention, l'administration peut être effectuée avec une dose ou plusieurs doses par jour.

Selon l’invention la composition peut comprendre concentration de gentamicine pour une administration à une dose supérieure à 3 mg/kg de poids corporel, par exemple de 3 à 10 mg/kg de poids corporel.

Selon l’invention, la composition peut comprendre une concentration de la gentamicine supérieure à 3mg/kg, par exemple de 3 à 10 mg/kg

Selon la présente invention, la composition, par exemple en utilisation topique, peut comprendre une concentration de gentamicine supérieure à 3mg/kg, par exemple supérieure à 7mg/kg.

La présente invention a également pour objet l’utilisation de la gentamicine pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface.

En particulier, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que la gentamicine permet avantageusement d’inhiber la formation de biofilm et en particulier inhibe la première étape indispensable à cette formation, à savoir le dépôt et la fixation, également dénommé respectivement adhérence et adhésion, des bactéries sur une surface.

Dans la présente invention par surface on entend toute surface connue de l’homme du métier sur laquelle un biofilm peut se former. Il peut s’agir par exemple d’une surface biotique ou abiotique.

Dans la présente par surface biotique on entend toute surface biotique connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une surface biotique choisie dans le groupe comprenant la peau, les muqueuses, les dents, toute surface du système vasculaire, par exemple les vaisseaux sanguins, les parois de l’endocarde, toute surface du système lymphatique, toute surface du système digestif, toute surface du système respiratoire, par exemple les parois du système broncho-pulmonaire, toute surface de la sphère Oto-Rhino-Laryngée.

Dans la présente la surface biotique peut être une surface saine et/ou présentant au moins une lésion et/ou infection. Il peut s’agir par exemple d’une surface biotique comprenant une plaie, une plaie infectée, une plaie en voie de cicatrisation, une plaie suturée, une cicatrice, une brûlure.

Dans la présente, par plaie, on entend toute plaie connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une plaie superficielle, par exemple de plaie de l’épiderme et/ou du derme, par exemple de taille inférieure à 5 cm. Il peut s’agir également de plaie profonde, par exemple une plaie de l’épiderme et du derme avec exposition du tissu sous cutané. Il peut s’agir également de brûlures, escarres. Il peut s’agir également de toutes plaies susceptibles de s’infecter, par exemple de toutes plaies susceptibles d’être infectées, l’infection retardant ou compromettant la guérison de la plaie.

Dans la présente par infection on entend toute infection connue de l’homme du métier pour lesquels des biofilms sont susceptibles de se former. Il peut s’agir par exemple d’infections choisies dans le groupe comprenant les infections ostéoarticulaires, les infections du pied diabétique, les infections de plaies cutanées telles que brûlures et escarres, les infections du système respiratoire, par exemple système broncho-pulmonaire, les infections de la sphère Oto-Rhino-Laryngée, les infections du système cardio-vasculaire, les infections du système digestif.

Dans la présente par surface abiotique on entend toute surface abiotique connue de l’homme du métier. Il peut s’agir également de toute surface de dispositif connue de l’homme du métier sur laquelle une bactérie est susceptible de former un biofilm. Il peut s’agir par exemple de la surface d’un dispositif médical, par exemple un cathéter, une aiguille, un cathéter à chambre implantable (ou Porth-a-Cath), une valve, par exemple une valve cardiaque, une prothèse, par exemple une prothèse articulaire, une prothèse ligamentaire, un implant dentaire, une prothèse de voies urinaires, la membrane péritonéale, des cathéters de dialyse péritonéale, des greffes vasculaires synthétiques, des stents, les dispositifs de fixation interne, des sutures percutanées et/ou trachéale, des tubes de ventilation.

Il peut s’agir par exemple de toute surface présente dans les salles/pièces d'urgence médicales, de traitements médicaux, d'opération, les blocs opératoires, les salles/pièces des unités de soins intensifs (USI), les salles/pièces des unités de maladies infectieuses, les salles/pièces des unités d'oncologie et / ou d'autres unités recevant des patients gravement immunodéprimés, des salles/pièces d'isolement, de cabines d'avion. Il peut s’agir également de toute surface des salles/pièces de laboratoire, de laboratoire biologique, de laboratoire d’analyses biologiques, de salle d'incubation et d'un autre volume clos de toute nature dans laquelle un biofilm est susceptible de se former.

Dans la présente, la surface abiotique peut être formée par tout matériau connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’un matériau biocompatible ou non. Par exemple, le matériau peut être tout matériau biocompatible connu de l’homme du métier, par exemple tout matériau utilisé pour la réalisation d’une prothèse, par exemple une prothèse ostéo-articulaire, une valve cardiaque, un implant dentaire. Par exemple, le matériau peut être tout matériau utilisé dans des tuyaux ou tout contenant permettant le passage d’un fluide, par exemple dans des unités de production de l’industrie agro-alimentaire, pharmaceutique.

Dans la présente, la surface abiotique peut être par exemple une surface métallique, une surface formée par un alliage, une surface polymérique. Par exemple, le métal peut être tout métal connu de l’homme du métier, par exemple un métal choisi dans le groupe comprenant le titane, le cuivre, le fer, l’aluminium, le nickel, le tungstène, l’argent, l’or, le palladium, le vanadium, le molybdène. Par exemple, l’alliage peut être tout alliage connu de l’homme du métier, par exemple un alliage choisi dans le groupe comprenant l’acier, le laiton, le cuivre-nickel, cuivre-palladium, argent-or, argent-palladium, molybdène-vanadium, molybdène-tungstène. Par exemple, le polymère peut être tout polymère connu de l’homme du métier susceptible de constituer et/ou recouvrir une surface. Il peut s’agir par exemple d’un polymère choisi dans le groupe comprenant le polytétrafluoroéthylène (PTFE), les polysiloxanes, les polyuréthanes, les polymères fonctionnalisés.

Dans la présente par surface on entend également toute surface connue de l’homme du métier sur laquelle une bactérie est susceptible de former un biofilm. Il peut s’agir par exemple de la surface d’un dispositif médical, par exemple un cathéter, une prothèse, d’un mur d’habitation, d’une pièce, par exemple un bloc opératoire

Lorsque la gentamicine est utilisée pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface, par exemple d’un dispositif médical, elle peut être sur la surface externe dudit dispositif et/ou la surface du dispositif susceptible d’être en contact avec tissu et/ou liquide biologique.

Dans la présente, lorsque la gentamicine est utilisée pour d’inhiber la formation de biofilm et en particulier inhibe la première étape indispensable à cette formation, à savoir le dépôt et la fixation, également dénommé respectivement adhérence et adhésion, des bactéries sur une surface, elle peut être utilisée à une concentration supérieure à 20µg/mm².

Dans la présente, l’utilisation de la gentamicine pour inhiber la formation d’un biofilm bactérien sur une surface peut être effectuée à une dose comprise de de 3 à 10 mg/kg d’individu, préférentiellement de 3 à 8mg/Kg d’individu, et par jour.

Avantageusement, lorsque la gentamicine est utilisée à une dose comprise de 3 à 10mg/kg d’individu, préférentiellement de 3 à 8mg/Kg d’individu, et par jour, elle permet d’obtenir des concentrations sériques de gentamicine comprise de 4 à plus de 8 µg/mL, préférentiellement à des concentrations sériques de 4 à 8 µg/mL.

Dans cette utilisation, la gentamicine peut être sous toute forme adaptée connue de l’homme du métier. Par exemple, elle peut être utilisée directement, c'est-à-dire pure ou pratiquement pure, ou après mélange de la gentamicine avec un support et/ou un support pharmaceutiquement/cliniquement acceptable. Par exemple la gentamicine peut être utilisée sous forme liquide, par exemple d’une solution applicable sur une surface, par exemple à l’aide d’un pinceau, et/ou d’une solution pulvérisable.

Les inventeurs ont également démontré de manière surprenante que la gentamicine permet avantageusement d’inhiber la formation de biofilm et en particulier inhibe la première étape indispensable à cette formation, à savoir le dépôt et la fixation, également dénommé respectivement adhérence et adhésion, des bactéries sur une surface, par exemple une surface de dispositif médicaux.

La présente invention a également pour objet un dispositif médical comprenant à sa surface de la gentamicine.

Dans la présente par dispositif médical on entend tout dispositif médical connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple de tout dispositif médical qui peut être appliqué à l’être-humain ou l’animal. Il peut s’agir par exemple d’un dispositif médical implantable, par exemple un cathéter, une aiguille, une prothèse, un pace marker, un organe artificiel, un stérilet, une sonde échographique.

Dans cette utilisation, la gentamicine peut être utilisée seule ou en présence /combinaison/mélange avec du poly(méthacrylate de méthyle) (PMMA).

Dans la présente, la concentration de la gentamicine à la surface du dispositif peut être une concentration supérieure à 20µg/mm².

La présente invention se rapporte également à un procédé de prévention de la formation d’un biofilm bactérien, ledit procédé comprenant l’administration d’une composition pharmaceutique comprenant de la gentamicine.

Dans la présente par « prévenir la formation de biofilms » on entend empêcher en présence de microorganismes l’adhésion et/ou la fixation de ceux-ci sur une surface.

Les conditions, quantités et voies d’administration peuvent être telles que décrites dans la présente, par exemple ci-dessus.

Lors de son utilisation pour la prévention de la formation d’un biofilm sur une surface, la gentamicine peut être mise en contact et/ou appliquée sur ladite surface par tout procédé et/ou dispositif adapté connu de l’homme du métier. Par exemple, la mise en contact et/ou application peut être effectuée par aspersion de la gentamicine sur la surface, par trempage de la surface dans une composition comprenant de la gentamicine, par aspersion ou trempage de gentamicine en association avec un composant censé agir également contre la formation de biofilm, tel que le cuivre. L’homme du métier, de par ces connaissances générales saura choisir et/ou adapter les procédés connus d’application et/ou de mise en contact en fonction des surfaces.

Par exemple, lorsque la gentamicine est utilisée pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface abiotique, par exemple un dispositif médical, elle peut être appliquée sur la surface externe dudit dispositif par tout procédé connu de l’homme du métier. Par exemple, la mise en contact ou application peut être effectuée par aspersion de la gentamicine sur ladite surface, par trempage du dispositif médical dans une solution comprenant la gentamicine, par aspersion ou trempage de ladite solution. La solution peut comprendre en outre un ou plusieurs actifs, par exemple un composé connu pour inhiber la formation de biofilm, par exemple du cuivre.

Lorsque la gentamicine est utilisée pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface abiotique, la gentamicine peut être sous toute forme adaptée connue de l’homme du métier. Par exemple la gentamicine peut être utilisée sous forme liquide et/ou sous forme de poudre.

Par exemple, lorsque la gentamicine est utilisée pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface abiotique, par exemple un dispositif médical, elle peut être appliquée préalablement à l’implantation et/ou l’utilisation dudit, par exemple, dispositif médical.

Lorsque la gentamicine est utilisée pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface biotique, la gentamicine peut être sous toute forme adaptée connue de l’homme du métier. Par exemple la gentamicine peut être utilisée sous forme liquide, par exemple administrée par voie parentérale, et/ou sous forme ingérable, par exemple administrée per os, ou sous une forme adaptée pour une application topique, par exemple une pommade, une crème, un pansement/support tissé ou non tissé imprégné.

L'homme de l'art comprend bien que le terme "forme" tel qu'utilisé ici se réfère à la formulation pharmaceutique du médicament pour son utilisation pratique.

La présente invention se rapporte également à un procédé de prévention de la formation d’un biofilm bactérien au niveau des plaies et/ou d’infections, ledit procédé comprenant l’administration d’une composition pharmaceutique comprenant de la gentamicine.

Dans la présente, le procédé de prévention de la formation d’un biofilm bactérien au niveau des plaies et/ou d’infections peut comprendre une étape d’application d’une composition pharmaceutique comprenant de la gentamicine.

Dans la présente l’application peut être réalisée par toute méthode connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une application par aspersion de la composition, par un onguent, une crème, un gel, une lotion, une émulsion à base de silicone, un timbre, une mousse, un spray, et/ou un pansement associé à de la gentamicine sous toute forme possible.

Pour cette application, on peut, par exemple, utiliser les formes galéniques décrites ci-dessus. L’application peut donc être réalisée en fonction de la forme galénique utilisée et/ou des plaies et/ou d’infections à traiter.

Les conditions, quantités et voies d’administration peuvent être telles que décrites dans la présente, par exemple ci-dessus.

La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant de la gentamicine à une dose supérieure ou égale à 3%, par exemple comprise de 3% à 10% en pourcentage en poids par rapport au poids total de la composition destinée à être utilisée comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm sur une surface.

La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant de la gentamicine à une dose supérieure à 4µg/ml par exemple comprise de 4 à 32 µg/ml destinée à être utilisée comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm sur une surface.

L’utilisation de la composition selon l’invention peut être effectuée sur toute surface connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une surface biotique ou abiotique telle que définie ci-dessus. Il peut s’agir par exemple d’une ou plusieurs surfaces telles que définies ci-dessus.

Dans la présente, lors de l’utilisation d’une composition pharmaceutique comprenant de la gentamicine comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien au niveau de surface, la concentration/quantité gentamicine peut être supérieure ou égale à 3%, par exemple comprise de 3% à 10% en pourcentage en poids par rapport au poids total de la composition

Dans la présente, lors de l’utilisation d’une composition pharmaceutique comprenant de la gentamicine comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien au niveau de surface, la concentration/quantité gentamicine peut être supérieure à 4 µg/ml par exemple comprise de 4 à 32 µg/ml.

Les conditions, quantités et voies d’administration de la composition selon l’invention peuvent être telles que décrites dans la présente, par exemple ci-dessus. L’homme du métier de par ces connaissances générales saura adapter les conditions et voies d’administrations de la composition.

Dans la présente invention, les compositions pharmaceutiques de la présente invention peuvent comprendre en outre un support pharmaceutiquement acceptable, un adjuvant ou un véhicule.

Dans la présente invention, un support pharmaceutiquement acceptable, un adjuvant ou un véhicule inclut n’importe quel solvant, diluant ou autre véhicule liquide, dispersion ou auxiliaire de suspension, agent tensio-actif, agent isotonique, agent épaississant ou émulsifiant, conservateur, liant solide, lubrifiant et analogue, adaptés à la forme posologique particulière souhaitée. Remington Pharmaceutical Sciences, seizième édition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) décrit différents supports utilisés dans la formulation de compositions pharmaceutiquement acceptables et des techniques connues pour leur préparation. Sauf dans le cas où un milieu support conventionnel s’avèrerait incompatible avec les composés selon l’invention, par exemple en produisant un quelconque effet biologique indésirable ou bien en interagissant de manière délétère avec tout autre composant (s) de la composition pharmaceutiquement acceptable, son utilisation est envisagée comme tombant dans le cadre de la présente invention. Quelques exemples de constituants qui peuvent servir de supports pharmaceutiquement acceptables comprennent, mais ne sont pas limités à, des échangeurs d'ions, l'alumine, le stéarate d'aluminium, la lécithine, des protéines sériques telles que l'albumine sérique humaine, des substances tampons telles que les phosphates, la glycine, l'acide sorbique, ou sorbate de potassium, des mélanges de glycérides partiels d'acides gras végétaux saturés, l'eau, des sels ou des électrolytes tels que le sulfate de protamine, le phosphate disodique, l'hydrogénophosphate de potassium, le chlorure de sodium, des sels de zinc, la silice colloïdale, le trisilicate de magnésium, le polyvinylpyrrolidone, des polyacrylates, des cires, les polymères de polyéthylène-polyoxypropylène, des sucres tels que le lactose, le glucose et le saccharose ; des amidons tels que l'amidon de maïs et de pomme de terre ; la cellulose et ses dérivés tels que la carboxyméthylcellulose sodique, l'éthylcellulose et l'acétate de cellulose; la tragacanthe en poudre ; malt ; gélatine ; talc ; des excipients tels que le beurre de cacao et les cires pour suppositoires ; des huiles telles que l'huile d'arachide, l'huile de graine de coton ; l'huile de carthame ; huile de sésame ; huile d'olive ; huile de maïs et l'huile de soja ; glycols ; un tel propylène glycol ou le polyéthylène glycol ; des esters tels que l'oléate d'éthyle et le laurate d'éthyle ; la gélose ; des agents tels que l'hydroxyde de magnésium et l'hydroxyde d'aluminium en tampon ; l'acide alginique ; une solution saline isotonique ; la solution de Ringer ; l'alcool éthylique, et de tampon de phosphate de solutions, ainsi que d'autres lubrifiants compatibles non toxiques tels que le laurylsulfate de sodium et le stéarate de magnésium, ainsi que des agents colorants, des agents de démoulage, des agents d'enrobage, des agents édulcorants, aromatisants et parfumants, des conservateurs et des antioxydants peuvent également être présents dans la composition, selon le jugement du galéniste.

Les compositions pharmaceutiquement acceptables de la présente invention peuvent être administrées à des humains et autres animaux par voie orale, rectale, parentérale, intracisternale, intravaginale, intrapéritonéale, topique (par exemple par des poudres, des pommades, des gouttes, des pansements, des patchs transdermiques), buccale, sous forme de pulvérisation orale ou nasale, ou similaire, par exemple selon la gravité de l'infection à traiter.

Les formes galéniques liquides pour l'administration orale comprennent, mais sans s'y limiter, des émulsions pharmaceutiquement acceptables, des microémulsions, des solutions, des suspensions, des sirops et des élixirs. En plus des composés actifs, les formes galéniques liquides peuvent contenir des diluants inertes couramment utilisés dans l'art tels que, par exemple, l'eau ou d'autres solvants, des agents et des émulsifiants tels que l'alcool éthylique, l'alcool isopropylique, le carbonate d'éthyle, l'acétate d'éthyle, l'alcool benzylique, le benzoate de benzyle, le propylèneglycol, le 1,3-butylène glycol, le diméthylformamide, les huiles (en particulier, les graines de coton, d'arachide, de maïs, de germe, d'olive, et de sésame), le glycérol, l'alcool tétrahydrofurfurylique, des polyéthylèneglycols et des esters d'acides gras de sorbitan et des mélanges de ceux-ci. Outre les diluants inertes, les compositions orales peuvent également comprendre des adjuvants tels que des agents mouillants, des agents émulsifiants et de suspension, des édulcorants, des aromatisants et des agents parfumants.

Les formes galéniques solides pour une administration orale comprennent des capsules, des comprimés, des pilules, des poudres et des granulés. Dans de telles formes galéniques solides, le composé actif est mélangé avec au moins un support inerte, excipient ou support pharmaceutiquement acceptable tel que le citrate de sodium ou le phosphate dicalcique et / ou a) des charges ou des diluants tels que les amidons, le lactose, le saccharose, le glucose, le mannitol et l'acide silicique, b) des liants tels que, par exemple, la carboxyméthylcellulose, l'alginate, la gélatine, la polyvinylpyrrolidone, le saccharose et la gomme arabique, c) des humectants tels que le glycérol, d) des agents délitants tels que l’agar-agar, le carbonate de calcium, l’amidon de pomme de terre ou de manioc, l'acide alginique, certains silicates et le carbonate de sodium, e) des accélérateurs d'absorption tels que des composés d'ammonium quaternaire, f) des agents mouillants tels que, par exemple, l'alcool cétylique et le monostéarate de glycérol, g) des absorbants tels que le kaolin, le talc et l'argile bentonite et h) des lubrifiants tels que le stéarate de calcium, le stéarate de magnésium, des polyéthylèneglycols solides, le laurylsulfate de sodium et des mélanges de ceux-ci. Dans le cas des capsules, des comprimés et des pilules, la forme galénique peut également comprendre des agents tampons.

Une forme galénique peut être, par exemple une nanoparticule comprenant de la gentamicine. Il peut s’agir par exemple de toutes nanoparticules adaptées connue de l’homme du métier, par exemple des nanoparticules de polymère d’acide polylactique, de poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA).

Avantageusement, lorsque la forme galénique est une nanoparticule, elle peut permettre après administration une libération contrôlée et/ou prolongée de la gentamicine.

Des compositions solides d'un type similaire peuvent également être employées comme charges dans des capsules de gélatine molle ou dure en utilisant des excipients tels que le lactose ou sucre de lait ainsi que des polyéthylèneglycols de haut poids moléculaire de polyéthylène et analogues. Les formes galéniques solides de comprimés, dragées, gélules, pilules et granules peuvent être préparées avec des enrobages et des enveloppes tels que des enrobages entériques et d'autres enrobages bien connus dans l'art pharmaceutique, la formulation. Elles peuvent éventuellement contenir des agents opacifiants et peuvent également être d'une composition telle qu'elles libèrent l'ingrédient actif (s) uniquement, ou préférentiellement, dans une certaine partie du tractus intestinal, facultativement de manière retardée. Des exemples de compositions d'enrobage qui peuvent être utilisées comprennent des substances polymères et des cires. Des compositions solides d'un type similaire peuvent également être employées comme charges dans des capsules de gélatine molle et dure en utilisant des excipients tels que le lactose ou sucre de lait ainsi que des polyéthylèneglycols de haut poids moléculaire de polyéthylène et analogues.

comprend deux images numérisées (scan) de plaque 96 puits (Figure 1A et Figure 1B). La Figure 1A est une image numérisée de la plaque après magnétisation et représente le résultat brut de l’Antibiofilmogramme de la souche S14 et la Figure 1B est une image numérisée de la plaque après magnétisation et représente le résultat brut de l’Antibiofilmogramme de la souche de la souche S39. La colonne 1 correspond aux contrôles : puits 1A ; 1C ; 1E ; 1G avec uniquement du milieu ; puits 1B ; 1D ; 1F ; 1H avec du milieu et la souche seule. Chaque ligne de A à H de la colonne 9 correspond à des concentrations différentes en µg/ml de gentamicine à savoir de la ligne A à la ligne H : 16 / 8 / 4 / 2 / 1 / 0,5 / 0,250 /0,125 µg/ml.

comprend deux fois quatre images obtenues en microscopie confocale et un diagramme en bâton (Figure 2A et Figure 2B de culture de souche bactérienne, respectivement S14 et S39. Sur les diagrammes en bâton, l’ordonnée correspond au taux de recouvrement de la surface du fond des puits par le biofilm, en pourcentage. Les conditions de culture sont en l’absence de gentamicine (Témoin), avec de la gentamicine à une concentration de 0,5 fois la CMI (SubCMI), avec de la gentamicine à une concentration égale à la CMI (CMI), avec de la gentamicine à une concentration égale à la CMIb (CMIb).

représente deux diagrammes sur lequel l’ordonnée correspond au Log 10 du nombre d’unité formant colonie (CFU) ramené à une quantité de 1g de cathéter et l’abscisse les conditions expérimentales de traitement des souris. Sur cette figure S14 ou S39 correspond respectivement à la souche S14 ou S39, H12 ou H24 au temps post-infection 12h ou 24h, et 1-8 ou > 8 à la concentration en gentamicine 1 à 8mg/L ou >8mg/L.

D’autres avantages pourront encore apparaître à l’homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.

EXEMPLES

Exemple 1 : gentamicine comme inhibiteur de la formation de biofilm - antibiofilmogramme

Dans cet exemple, un Antibiofilmogramme a été réalisé afin de démontrer l’inhibition de la formation d’un biofilm par la gentamicine et déterminer des doses de gentamicine efficaces contre la formation de biofilm dans un puits de microplaque en polystyrène. Cet exemple démontre clairement que les Concentration Minimales Inhibitrices de formation de biofilm (CMIb) sont différentes des Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) définissant la sensibilité à l’antibiotique par rapport à son activité bactéricide. Ces CMIb peuvent différer entre 2 souches alors que les CMI sont identiques 1µg/ml.

Pour déterminer et mesurer l’effet de la gentamicine sur la formation de biofilm, plus précisément l’adhésion des bactéries, première étape de la formation d’un biofilm, les souches S14 et S39 de Staphylococcus aureus ont été incubées dans les puits d’une microplaque 96 puits en présence de différentes concentrations de gentamicine avec un facteur de dilution de 2 entre chaque concentration. Les concentrations testées allaient de 0,125µg/ml à 16µg/ml de gentamicine. Ce test est dénommé par la société BioFilm Control Antibiofilmogramme®. L’inoculum de bactéries était de 4.10⁶bactéries/ml, dans 200µl de milieu BHI (Brain Heart Infusion, bouillon cœur cerveau), en présence de microbilles magnétiques (Toner 4, référence TON004) à la concentration de 2µl pour 200µl, soit 10µl/ml).

La microplaque a été incubée pendant 4h à 37°C, puis a été recouverte de 120µl de liquide contraste (Liquide de contraste ; référence LIC001) et a été posée 1 minute sur un bloc porte-aimants (référence BKTMB) conçu de telle sorte que chaque mini-aimant soit centré par rapport aux 96 puits. La microplaque a été ensuite posée sur un scanner et l’image a été acquise, puis analysée par le logiciel BFCE3 qui quantifie l’agrégation des microbilles magnétiques au centre des puits, et fournit une valeur de BFI (Biofilm Formation Index). Un BFI de 20, ou proche de 20, correspond à une agrégation maximale, donc une absence de formation de biofilm, donc une efficacité anti-adhésion de la gentamicine. Au contraire, un BFI de 0 correspond à une totale immobilité des microbilles complètement bloquées par les bactéries adhérées. Toutes les valeurs intermédiaires, permettant une mesure quantitative de l’efficacité de la gentamicine sont possibles.

Les Figure 1A et Figure 1B montrent des Antibiofilmogrammes réalisés sur 2 souches de Staphylococcus aureus S14 et S39 sur un ensemble de 11 antibiotiques, dont la gentamicine qui fait l’objet de cette demande. La gentamicine est testée, en fonction de dilutions de concentrations, en colonne 9.

La Figure 1A est une photographie (scan) de la plaque après magnétisation et représente le résultat brut de l’Antibiofilmogramme de S14 et la figure 1B est une photographie de la plaque après magnétisation et représente le résultat brut de l’Antibiofilmogramme de S39.

Sur la Figure 1A, la colonne 1 correspond aux contrôles (puits 1A ; 1C ; 1E ; 1G) avec uniquement du milieu, sans souche = spot ; puits 1B ; 1D ; 1F ; 1H avec du milieu et la souche seule = absence de spot – biofilm). Chacune de ces conditions témoins a donc été faite en quadruplicates. La gamme de gentamicine comprenant le milieu, les microbilles et la souche S14 correspond à la colonne 9, et démarre (puits ligne A) de 16µg/ml à 0,125µg/ml de milieu (puits H), les dilutions étant réalisées d’un facteur 2. Tel que montré sur la Figure 1A le puits B9 est le premier à montrer un spot net, et en conséquence indique que la CMIb de la gentamicine est de 8µg/ml pour la souche S14.

En d’autres termes, les puits A9 et B9 de la Figure 1A démontrent clairement que la gentamicine inhibe la formation de biofilm de la souche S14 de Staphylococcus aureus. Il est ainsi montré que la CMIb, Concentration Minimale Inhibitrice de formation de biofilm est de 8µg/ml pour la souche S14 de Staphylococcus aureus.

Sur la Figure 1B, la colonne 1 correspond aux contrôles (puits 1A ; 1C ; 1E ; 1G) avec uniquement du milieu, sans souche = spot ; puits 1B ; 1D ; 1F ; 1H avec du milieu et la souche seule = absence de spot – biofilm). Chacune de ces conditions témoins a donc été faite en quadruplicates. La gamme de gentamicine comprenant le milieu, les microbilles et la souche S39 correspond à la colonne 9, et démarre au puits ligne A de 16µg/ml à 0,125µg/ml de milieu (puits ligne H), les dilutions étant réalisées d’un facteur 2. Tel que montré sur la figure 1B, le puits en D9 montre une altération du spot après magnétisation, n’est pas parfait/identique comparativement à ceux en A9, B9 ou C9. Le premier puits dans lequel un spot parfait est observé est en C9 et en conséquence indique que la CMIb de la gentamicine est de 4µg/ml pour la souche S39 de Staphylococcus aureus.

En d’autres termes, les puits A9 à C9 de la Figure 1B démontrent clairement que la gentamicine inhibe la formation de biofilm de la souche S39 de Staphylococcus aureus. Il est ainsi montré que la CMIb, Concentration Minimale Inhibitrice de formation de biofilm est de 4µg/ml pour la souche S39 de Staphylococcus aureus.

Exemple 2 : évaluation par microscopie confocale de la gentamicine comme inhibiteur de la formation de biofilm/inhibiteur de l’adhésion des bactéries sur une surface

L’exemple 2 confirme par microscopie confocale les interprétations de l’Antibiofilmogramme. Il est clairement montré que l’antibiotique gentamicine, utilisé à la dose CMI (dose définie comme étant suffisante pour l’activité bactéricide de la gentamicine sur la souche considérée, obtenue classiquement par une méthode de détermination de sensibilité à un antibiotique (AST) comme l’antibiogramme ou Etest (marque déposée) de bioMérieux à savoir notamment la souche S14 et S39 n’est pas actif sur la formation de biofilm sur le plastique. Par contre, à la dose CMIb (définie comme efficace en prévention de formation de biofilm), la souche n’a pas adhéré à la surface. Ces résultats ont été obtenus pour les souches S14 et S39 dont les CMI sont de 1µg/ml et caractérisent les souches comme sensibles à la gentamicine (un staphylocoque étant défini résistant selon les recommandations 2018 de l’EUCAST comme ayant une CMI strictement supérieure à 1µg/ml).

En d’autres termes, cet exemple démontre clairement que la gentamicine permet d’inhiber la formation de biofilm indépendamment de son effet antibiotique connu.

Des microplaques 6 puits en polystyrène de la même nature et présentant exactement les mêmes propriétés que les microplaques utilisées dans l’exemple 1 (Antibiofilmogramme®) à savoir microplaque Costar 6 puits, référence 3736. Les microplaques 6 puits ont été utilisées afin d’obtenir une surface suffisante de formation de biofilm pour une observation en microscopie confocale. Les concentrations correspondant aux CMI et CMIb des souches ont été testées. En parallèle, les contrôles en absence d’antibiotiques, des souches S14 et S39 ont été réalisés. Après une incubation de 4h à 37°C (similaire aux conditions utilisées dans l’exemple 1 (l’Antibiofilmogramme®), les fonds des microplaques ont été découpés et assemblés avec une lame de verre afin de pouvoir procéder à l’observation en microscopie confocale. Les conditions d’observation étaient les suivantes : Objectif : x40 ; Zoom : x2 ; Format : 2048*2048 pixels ; Puissance laser ; Zmax et Zmin : nombre d’images de la pile ; Taille entre chaque image : 0,42µm. Une coloration « Live/Dead » a été réalisée. Le colorant SYTO9 colore les bactéries vivantes (et les mortes), alors que le colorant Propidium iodide colore spécifiquement les bactéries mortes. Le résultat a été obtenu avec une analyse de 2880 Images (« Slices »).

Les résultats obtenus sont représentés sur la Figure 2 Le taux de recouvrement de la surface du fond des puits par le biofilm, en pourcentage de recouvrement de surface, est indiqué en ordonnée. Sur la Figure 2A, la densité de bactéries S14 adhérées sur le fond des puits a été montrée et analysée. Tel que montré sur la Figure 2A, en l’absence d’antibiotique et/ou à des concentrations inférieures à la CMI, notamment égale à 0,5 CMI (sub CMI) l’antibiotique était sans effet sur la formation de biofilm. En outre, cet exemple démontre également que l’antibiotique, à une dose la dose CMI permet une diminution de l’adhésion des bactéries mais ne permet pas de l’inhiber. En particulier, 15% de la surface du fond du puits a été recouverte après 4 d’incubation ce qui est trop important pour une utilisation dans un traitement thérapeutique, le traitement étant insuffisamment efficace. Tel que montré sur la Figure 2A, l’incubation à une concentration égale à la CMIb a permis d’inhiber l’adhésion des bactéries, notamment de la souche S14 de S. aureus et donc la formation de biofilm. Ainsi, la dose CMIb (8µg/ml) est capable de quasiment inhiber totalement l’adhésion. Une représentation graphique, résultat de l’analyse des images, est fournie.

La Figure 2B représente les résultats obtenus avec la souche S39 de S. aureus. En particulier, la Figure 2B représente la densité de bactéries S39 adhérées sur le polystyrène et comprend l’analyse correspondante. Tel que démontré, par rapport au contrôle (témoin) ne comprenant pas d’antibiotique, les doses subCMI (1/2 CMI) et CMI permettent une diminution de l’adhésion des bactéries. Toutefois cette diminution ne permet pas d’inhiber la formation de biofilm. En particulier, plus de 5%, voire plus de 8 % de la surface du puits a été recouverte par les bactéries ce qui est trop important pour une éventuelle utilisation dans un traitement thérapeutique, le traitement étant insuffisamment efficace. Par contre, la dose CMIb (4µg/ml) a été capable d’inhiber l’adhésion de la souche S39 de S. aureus. Une représentation graphique, résultat de l’analyse des images, est fournie.

Exemple 3 : évaluation in-vivo de la gentamicine comme inhibiteur de la formation de biofilm/inhibiteur de l’adhésion des bactéries sur une surface

Dans cet exemple, l’effet de la gentamicine a été observé sur l’infection d’un cathéter implanté dans un modèle animal.

Cet exemple démontre et confirme dans un modèle animal d’infection que la gentamicine, utilisée aux doses en lien à la CMIb a permis d’inhiber l’adhésion des bactéries sur le cathéter et peut donc être utilisée pour prévenir l’infection d’un cathéter (simulant une prothèse, ou plus généralement un support abiotique).

Deux souches de Staphylococcus aureus, S14 et S39, ont été utilisées. Elles se caractérisent, pour la gentamicine, par des CMI (Concentration Minimale Inhibitrice) de 1µg/ml pour S14 et 1µg/ml pour S39, ainsi que des CMIb (Concentration Minimale Inhibitrice de formation biofilm) de 8µg/ml pour S14 et 4µg/ml pour S39.

La taille d’inoculum testée était de 7 Log CFU/souris (soit 8,3 Log CFU/mL). Les souches ont été isolées sur milieu Chapman agar puis mises en culture à 37°C pendant 18h. Pour chaque souche, une colonie isolée a été re-suspendue dans 9mL de milieu BHI en agitation pendant 6h à 37°C puis le bouillon ainsi obtenu a été inondé sur milieu MH agar (extrait de bœuf 2g/L ; hydrolysat acide de caséine 17,5g/L ; amidon 1,5g/L ; agar 17g/L) placé à 37°C pendant 18h. La culture sur boite a été ensuite raclée dans 10mL d’eau physiologique stérile (en présence de billes de verre pour éviter la formation d’agrégats) et vortexée 5 secondes à vitesse maximale. Des dilutions successives ont été réalisées afin de mesurer la densité optique à une longueur d’onde de 595nm (DO595nm) (Spectrophotomètre Eppendorf) et la charge bactérienne après culture des dilutions sur milieu MH agar a été déterminée. Il a été considéré qu’une DO = 0,250 a permis d’obtenir un inoculum de 8,3 Log CFU/mL soit 7 Log CFU/souris.

Les souris ont reçu (15 minutes pré-infection) un traitement antibiotique « préventif » par voie sous-cutanée, ou du sérum physiologique pour les conditions témoins. Ces doses ont été déterminées suite à une étude PK/PD. Pour chaque groupe expérimental, 7 souris ont été utilisées.

Ainsi, pour la souche S14, les doses retenues étaient de 1mg/kg (pour simuler une exposition >1-<8 mg/L ; soit >1-<8µg/ml), supérieure à la CMI mais inférieure à la CMIb, et 7mg/kg (pour simuler une exposition >8 mg/L ; soit >8µg/ml), supérieure à la CMIb. Pour la souche S39, les doses retenues étaient de 1mg/kg (pour simuler une exposition >1-<4 mg/L ; soit >1-<4µg/ml), supérieure à la CMI mais inférieure à la CMIb, et 3mg/kg (pour simuler une exposition >4 mg/L ; soit >4µg/ml), supérieure à la CMIb. En parallèle, les animaux témoins ont reçu du sérum physiologique. La solution commerciale injectable de gentamicine a été utilisée. Puis une anesthésie fixe par injection intrapéritonéale d’un mélange kétamine (50mg/kg) et xylazine (10mg/kg) a été administrée. Le mélange d’anesthésiques a été réalisé comme suit : 4ml Kétamine + 2ml de xylazine +10 ml d’eau physiologique. Environ 120µl ont été injectés en IP chez la souris. Les flancs ont été rasés puis désinfectés (cycle Bétadiné). Une incision cutanée puis sous-cutanée de 0,2cm a été réalisée stérilement et un segment d’1cm de cathéter en polyuréthane coupé en deux parties longitudinales (Ref ES-04730 Arrow international) a été inséré en sous cutané (à 2 cm de distance du point d’incision). Le dépôt de l’inoculum bactérien a été effectué dans un même temps. Le volume déposé était de 50µL par souris et la concentration testée était de 10⁶log CFUs par cathéter. L’incision a été ensuite suturée et désinfectée. Les souris ont été euthanasiées à différents temps post-infection (4h, 12h et 24h) par anesthésie puis dislocation cervicale. Les segments de cathéter ont été prélevés. Ils ont été utilisés pour quantification bactérienne après sonication de façon à quantifier le biofilm bactérien résiduel.

Chaque segment en polyuréthane a été individuellement et stérilement lavé dans un tube Eppendorf (3 lavages successifs avec 300µL d’eau physiologique stérile). Après le dernier lavage, le cathéter a été remis en suspension dans 1mL d’eau physiologique stérile, placé dans un bain à ultrasons à température ambiante pendant 3 min (AdvantageLab) puis vigoureusement vortexé de façon à décrocher les bactéries adhérentes au cathéter. Des cultures de dilutions successives (pur, 10^-2, 10^-4) de cette suspension bactérienne ont été ensuite réalisées sur géloses Chapman. Les cultures ont été placées à l’étuve à 37°C pendant 48h avant lecture.

Les résultats sont illustrés sur la Figure 3. La Figure 3A représente le dénombrement des bactéries de la souche S14 attachées sur le cathéter implanté en fonction de l’absence de gentamicine (témoin), une concentration égale à la CMI ou à une concentration égale à la CMIb. Tel que démontré sur la Figure 3A la concentration de gentamicine dans les conditions contrôle et CMI, montre l’inefficacité de la gentamicine à la dose CMI à inhiber l’adhésion des bactéries, aux temps de mesure 12h et 24h. Une analyse de variance ANOVA One Way complétée par un test post-hoc de Bonferroni a été utilisée. Une différence était considérée comme statistiquement significative si p<0,05 (*), p<0,01 (**) ou p<0,001 (***). A l’inverse, pour les temps 12h et 24h, le traitement par la gentamicine à la dose CMIb a statistiquement montré une différence significative par rapport au contrôle (***). Les résultats sont exprimés en log(CFU)/gramme de cathéter, CFU signifiant Colony Forming Unit, soit le nombre de colonies bactériennes sur une boite.

La Figure 3B, représente le dénombrement des bactéries de la souche S39 attachées sur le cathéter implanté en fonction de l’absence de gentamicine (témoin), une concentration égale à la CMI ou à une concentration égale à la CMIb. Tel que démontré sur la figure 3B, la concentration de gentamicine dans les conditions contrôle et CMI, montre l’inefficacité de la gentamicine à la dose CMI d’inhiber l’adhésion des bactéries, aux temps de mesure 12h et 24h. Une analyse de variance ANOVA One Way complétée par un test post-hoc de Bonferroni a été utilisée. Une différence était considérée comme statistiquement significative si p<0.05 (*), p<0.01 (**) ou p<0.001 (***). A l’inverse, pour les temps 12h et 24h, le traitement par la gentamicine à la dose CMIb a statistiquement montré une différence significative par rapport au contrôle (***). Les résultats sont exprimés en log(CFU)/gramme de cathéter, CFU signifiant Colony Forming Unit, soit le nombre de colonies bactériennes sur une boite.

Cet exemple démontre clairement que la gentamicine permet d’inhiber l’adhésion des bactéries sur une surface, par exemple une prothèse. En outre cet exemple démontre clairement que les concentrations usuelles d’utilisation de la gentamicine comme antibiotique ne permettent pas d’empêcher/inhiber l’adhésion des bactéries.

Claims (6)

1. Composition pharmaceutique comprenant de la gentamicine pour son utilisation comme médicament pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien.
2. Composition pour son utilisation comme médicament selon la revendication 1, pour la prévention de la formation d’un biofilm bactérien au niveau des plaies et/ou d’infections.
3. Composition pour son utilisation comme médicament selon la revendication 2, dans laquelle les infections sont choisies dans le groupe comprenant les infections ostéoarticulaires, les infections du pied diabétique, les brûlures, les escarres et les infections pulmonaires.
4. Composition pharmaceutique comprenant de la gentamicine pour la prévention et/ou l’inhibition de la formation d’un biofilm bactérien sur une surface.
5. Dispositif médical comprenant à sa surface de la gentamicine.
6. Dispositif selon la revendication 5 dans laquelle la gentamicine est à une concentration supérieure à 20µg/mm².