ES2200057T3 - Uso de lactobacillus como adhesivo epitelial. - Google Patents
Uso de lactobacillus como adhesivo epitelial.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE AL USO DE LACTOBACILUS PLANTARUM QUE POSEEN UNA ADHESINA ESPECIFICA DE MANOSA PARA LA PREPARACION DE UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE INHIBE LA UNION DE BACTERIAS PATOGENAS QUE EXPRESAN ADHESINAS ESPECIFICAS DE MANOSA SOBRE LA SUPERFICIE CELULAR EPITELIAL. UNA CEPA DE LACTOBACILUS PLANTARUM QUE PUEDE SER UTILIZADA EN LA INVENCION SE ADHIERE A CUENTAS DE AGAROSA RECUBIERTAS DE D-MANOSA, Y PERTENECE PREFERENTEMENTE A UN GRUPO DE L. PLANTARUM CON MAS DE UN 70 % DE SIMILITUD CON L. PLANTARUM 299 EN TERMINOS DE REA. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO AL USO DE DICHAS CEPAS PARA LA PREPARACION DE UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE ES UTILIZADA EN EL TRATAMIENTO CURATIVO Y/O PROFILACTICO DE LA TRANSLOCACION BACTERIANA, GASTROENTERITIS Y OTRAS ENFERMEDADES CAUSADAS POR BACTERIAS PATOGENAS QUE EXPRESAN ADHESINAS ESPECIFICAS DE MANOSA.
Description
Uso de lactobacillus como adhesivo
epitelial.
El presente invento se refiere a cepas de
Lactobacillus que tienen la propiedad de adherirse a las
superficies de las células epiteliales, especialmente en la mucosa
intestinal humana, y que se pueden usar como tratamiento
profiláctico y/o curativo de las alteraciones bacterianas causadas
por bacterias patógenas que se adhieren a las células epiteliales de
forma similar.
Los microorganismos endógenos constituyen uno de
los mecanismos principales de defensa que protegen al cuerpo humano
y animal contra la invasión bacteriana. Los pacientes
inmunosuprimidos, tratados con antibióticos y alimentados
parenteralmente se encuentran con el riesgo de contraer
enfermedades infecciosas como la sepsis, la meningitis o
infecciones del tracto urinario producidas por la expansión de
bacterias derivadas principalmente de la población fecal normal. Un
mecanismo detrás de este proceso puede ser la translocación
bacteriana, que se define como el paso de bacterias viables del
tracto gastrointestinal a los nódulos linfáticos mesentéricos y a
otros órganos.
El envenenamiento de la sangre, sepsis, continúa
siendo una complicación quirúrgica muy común en relación con la
cirugía abdominal que causa una gran proporción de muertes. Las
bacterias o los productos bacterianos pueden atravesar la pared
intestinal que funciona mal e infectar o inducir el funcionamiento
defectuoso de otros órganos como los pulmones, el hígado, el
corazón, etc., y todo ello conduce a una disfunción múltiple de los
órganos, que se conoce como enfermedad de cuidados intensivos
(intensive-care-disease).
Estos pacientes son todavía hoy día tratados mediante la
administración de antibióticos y tratamiento quirúrgico del absceso
hasta el punto que pueda ser localizado. En la actualidad se
administran convencionalmente antibióticos antes de una
intervención quirúrgica del intestino para reducir así el riesgo de
infecciones postoperatorias y de enfermedades causadas por eso. Sin
embargo, el tratamiento con antibióticos está asociado con la
destrucción de la flora intestinal normal y con la proliferación de
bacterias aún más patógenas.
Estos descubrimientos han conducido a un interés
creciente por conocer las especies microbianas que pueden afectar
beneficiosamente al balance microbiano del hospedante, por ejemplo,
mediante la producción de componentes antimicrobianos o por
crecimiento competitivo. Lactobacillus se encuentra entre
las especies más estudiadas y, en ciertas ocasiones, se ha
demostrado que contrarresta la proliferación de patógenos.
Las bacterias que residen en el intestino pueden
provocar enfermedades en el hospedante colonizado tales como
diarrea intestinal o al colonizar secundariamente lugares
normalmente estériles, como el tracto urinario producir infección
del tracto urinario, o como el torrente sanguíneo causar
sepsis.
Las bacterias patógenas difieren de aquellas que
no provocan enfermedades por la posesión de los llamados factores
de virulencia. Un importante factor de virulencia es la capacidad
de adherirse a las moléculas de carbohidratos de los receptores de
las células del hospedante. Esta es una etapa importante, tanto
porque facilita la colonización como porque facilita la liberación
de toxinas y otras sustancias que producen inflamación en las
proximidades de las células hospedantes. Si estas sustancias
tóxicas son liberadas por una bacteria adherente alcanzan unas
concentraciones locales muy superiores a las que alcanzarían si
fueran secretadas, por ejemplo, por bacterias que residen en el
lumen intestinal.
Las bacterias que causan infección del tracto
urinario incluyen Escherichia coli, Enterobacter,
Klebsiella y Proteus, todas ellas pertenecientes a la
familia Enterobacteriaceae. La mayoría de estas bacterias
posee fimbrias tipo 1 que les confiere la capacidad de adherirse a
los receptores que contienen manosa, por ejemplo las células del
epitelio vaginal humana, y a la proteína
Tamm-Horsefall, proteína de la mucosa urinaria. Las
fimbrias tipo 1 se han mostrado un factor de virulencia en la
cistitis, lo que puede depender tanto de un aumento en la capacidad
de ascender por el tracto urinario que le confiere su unión a las
células del epitelio vaginal y periuretral, como de un aumento del
efecto irritante causado por la unión a las células epiteliales en
el tracto urinario. [De este modo, sólo las bacterias con fimbrias
tipo 1 fueron capaces de inducir una respuesta citoquina, es decir
inflamación, en células del epitelio urinario de cultivo.]
Las bacterias que causan diarrea incluyen
Salmonella y Shigella, pero la proliferación
intestinal de Klebsiella o Enterobacter también se ha
asociado con diarrea en lactantes de corta edad. Se ha mostrado en
ratón que las fimbrias tipo 1 son un factor de virulencia para la
enfermedad diarréica causada por Salmonella. Es también
probable que las fimbrias tipo 1 faciliten también la colonización
de otras bacterias e intensifiquen la liberación de sustancias
tóxicas en las proximidades del epitelio, causando por tanto
diarrea.
El documento
EP-A2-0 199 535 describe un cultivo
biológicamente puro de Lactobacillus acidophilus, nº de
acceso ATCC 53 103, aislado a partir de heces humanas, que es capaz
de adherirse a las células de la mucosa en ensayos efectuados in
vitro. L. acidophilus consigue su paso a través de la
parte alta de la pared del tracto gastrointestinal. Sin embargo, no
se ha demostrado su adherencia in vivo.
El documento WO 89/05849 describe bacterias del
ácido láctico aisladas del tracto gastrointestinal en cerdos y
seleccionadas gracias a, entre otras, su adherencia a las células
del epitelio gastrointestinal de cerdo in vitro y su
tolerancia al ácido y la bilis. Dichas bacterias pueden usarse para
la fermentación de la leche que puede entonces administrarse a las
crías de cerdo para prevenir o tratar entre otras la diarrea de
E. coli.
El documento WO 93/01823 alude a un procedimiento
para aislar cepas de Lactobacillus con la capacidad de establecerse
in vivo en la mucosa intestinal humana y de permanecer allí
después de su administración oral durante al menos 10 días. Dicha
aplicación hace referencia especialmente a dos nuevas cepas de
Lactobacillus, las cuales se encuentran depositadas el 2 de
Julio de 1991 y según el Acuerdo de Budapest en el DSM - Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH -, Braunschweig,
Alemania, esto es
| Lactobacillus plantarum 299 | DSM 6595 | |
| Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 | DSM 6594 |
así como a sus variantes que se usan en la
profilaxis o tratamiento de las infecciones bacterianas del tracto
gastrointestinal, especialmente sustituyendo a antibióticos en
relación con las operaciones quirúrgicas.
El documento SE 463 598 alude a un preparado para
incrementar la adherencia de las bacterias al tracto
gastrointestinal; tal preparado se dice que contiene una proteína
promotora de la adhesión, llamada adhesina, que se obtiene del
Lactobacillus.
El documento WO 90/09398 alude a productos que
inhiben la adhesión, crecimiento y/o supervivencia de patógenos.
Dichos productos son metabolitos de Lactobacillus que
inhiben a patógenos tales como cepas de Escherichia coli,
Clostridium, Salmonella, Campylobacter y
Streptococcus.
El documento WO 93/09793 alude a composiciones de
Lactobacillus y leche descremada y a métodos para la
prevención de infecciones urogenitales microbianas. El invento se
relaciona particularmente con la capacidad de ciertas cepas de
Lactobacillus hidrofóbicas o hidrofílicas para adherirse a
las células uroepiteliales y resistir la acción de ciertos agentes
antimicrobianos, lo que previene infecciones urogenitales. El
mecanismo de adherencia que se describe involucra interacciones
hidrofóbicas e hidrofílicas entre adhesiones de la pared celular de
naturaleza no protéica en Lactobacillus y adhesiones
protéicas de los sobrenadantes circundantes.
Sorprendentemente se ha encontrado ahora que
ciertas cepas de Lactobacillus se adhieren a bolas de agarosa
recubiertas de D-manosa; tal capacidad se
correlaciona con su capacidad de aglutinar eritrocitos de un modo
sensible a manosa, así como con su capacidad de adherirse a la
línea celular epitelial del colon humano HT-29 de
manera inhibible por
metil-alfa-D-manósido.
El tratamiento con peryodato de estas células HT-29
suprime su adherencia sensible a la manosa lo que confirma que el
receptor de unión a la célula tenía naturaleza de carbohidrato.
Tratamientos de la bacteria con proteinasa K también suprimen la
adherencia, lo que indica que esta unión compromete a estructuras
protéicas de la superficie celular bacteriana. Por tanto, se cree
que la adhesina, que es la parte adhesiva de Lactobacillus, se
adhiere a receptores que contienen manosa de la superficie de
células epiteliales. Esta adherencia parece estar relacionada con
la capacidad de estas bacterias para contrarrestar a bacterias
patógenas y estimular los mecanismos de defensa del hospedante.
En particular esta adherencia origina una
capacidad de disminuir la traslocación de bacterias patógenas o
potencialmente patógenas a lo largo del epitelio intestinal
intacto, al inhibir la adherencia de bacterias potencialmente
patógenas directamente a la superficie de la célula epitelial,
reduciendo por tanto su capacidad de liberar sustancias tóxicas e
inflamatorias a la mucosa y de disminuir el daño inflamatorio
intestinal causado por irritantes no específicos al crearse un
microambiente favorable para la reconstrucción de la mucosa. Una
estrecha asociación con las células del epitelio puede también
aumentar la capacidad de la bacteria para interaccionar con el
sistema inmune. Estas cepas de Lactobacillus pueden, por
ejemplo, desencadenar la activación de fagocitos y estimular a las
células presentadoras de antígenos lo que intensifica la
inmunidad.
La presente invención está basada en el uso de
Lactobacillus plantarum que tiene una adhesina específica de
manosa para la preparación de una composición farmacéutica que
inhibe la unión de bacterias patógenas que expresan adhesinas
específicas de manosa a la superficie de células epiteliales. Con
esto su capacidad de invadir o liberar sustancias tóxicas y que
producen inflamación en la mucosa se reducirá.
Las adhesinas específicas de manosa se han
descrito diversas bacterias Gram-negativas,
incluyendo miembros de la familia Enterobacteriaceae, como
especies de E. coli, Klebsiella, Shigella y
Salmonella y Pseudomonas echinoides, Vibrio
cholerae y Vibrio parahaemolyticus.
El receptor óptimo para la adhesina específica de
manosa de E. coli se ha descrito y se sabe que contiene la
secuencia
manosa-alfa1-4manosa\beta que se
da en las glicoproteínas de mamíferos. La estructura exacta del
receptor de las adhesinas específicas de manosa de otras especies
enterobacterianas no se ha descrito aún, como tampoco se ha descrito
la estructura del receptor de la adhesina específica de manosa de
las cepas de Lactobacillus plantarum. Se cree, sin embargo,
que el receptor debiera tener una secuencia
Man-alfa1-2Man. Es posible que L.
plantarum específica de manosa tenga un efecto inhibitorio más
pronunciado en bacterias que se unen a los receptores que contienen
manosa comparado con su efecto en bacterias que se unen a otras
estructuras de receptor.
El invento alude al empleo de Lactobacillus
plantarum 299v, número de déposito DSM 9843, que tiene adhesina
específica de manosa así como capacidad para colonizar la mucosa
intestinal humana, para la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de la infección del tracto
urinario al inhibir la adherencia de las bacterias patógenas que
expresan fimbrias tipo 1, especialmente bacterias pertenecientes a
Klebsiella, Enterobacter, Proteus o
Escherichia coli, a las células del epitelio uretral
humanas.
Cepas de Lactobacillus plantarum
relacionadas son:
| Lactobacillus plantarum 299 | DSM 6595 | |
| Lactobacillus plantarum 79 | ||
| Lactobacillus plantarum 105 | ||
| Lactobacillus plantarum 107 |
El invento también alude al empleo de
Lactobacillus plantarum 299v, número de depósito DSM 9843,
en combinación con un vehículo convencional para la preparación de
una composicion farmacéutica que inhibe la unión de bacterias
patógenas que expresan adhesinas específicas de manosa a la
superficie de células epiteliales para el tratamiento profiláctico o
curativo de alteraciones bacterianas.
Dos factores parecen cruciales en el ejercicio de
estos efectos ecológicos de Lactobacilli. El primero es la
capacidad de colonizar el intestino, esto es sobrevivir en gran
número por un período de tiempo después de la última administración
de bacterias vivas. Esta propiedad puede ser importante para la
capacidad de Lactobacilli para suprimir el crecimiento y la
proliferación de bacterias patógenas, pero no suficiente. El segundo
es la capacidad de unirse directamente a células del epitelio
intestinal. Este puede ser uno de los factores que promueva la
colonización, pero no es un requisito previo para la colonización.
La capacidad de adherirse al epitelio no garantiza que la cepa sea
capaz de colonizar.
Las bacterias entéricas patógenas que expresan
fimbrias tipo 1 específico de manosa pertenecen especialmente a las
subespecies (spp.) de Klebsiella,
Enterobacter, Proteus, Salmonella y
Shigella, como por ejemplo, Klebsiella pneumoniae,
Salmonella typhimurium y Shigella flexneri y
Escherichia coli.
La capacidad para adherirse directamente a las
células epiteliales puede ser importante para las cepas de
Lactobacillus para disminuir la translocación y la inducción
de inflamación de la mucosa por las bacterias patógenas, dado que
Lactobacilli ocupa un nicho ecológico cercano al epitelio.
Una estrecha asociación con el epitelio también facilita que
Lactobacilli cambie el microambiente, lo que afecta
directamente a las células del epitelio intestinal, y por tanto,
promueve la reparación tras el daño causado por agentes
irritantes.
Los vehículos convencionales para una composición
farmacéutica para el tratamiento profiláctico o curativo de
alteraciones bacterianas en el intestino son, por ejemplo,
sustratos aceptables fisiológicamente fermentados por las bacterias
en cuestión, así como productos alimenticios de diversos tipos,
especialmente aquellos basados en almidón o leche, pero también
sustancias sólidas o líquidas inertes, como disolución salina o
agua. Un sustrato adecuado debiera contener fibras líquidas o
sólidas que no se reabsorben en el tracto gastrointestinal y que
cuando fermentan por Lactobacillus forman ácidos
carboxílicos. Como ejemplo de sustratos adecuados que contienen
almidón pueden mencionarse los cereales tales como avena y trigo,
maíz, raíces vegetales como las patatas y ciertas frutas como las
bananas verdes.
De acuerdo con el invento un sustrato preferido
para la composición, que también aporta a ésta un excelente valor
nutricional, es una disolución nutritiva basada en harina de avena,
según se describe por ejemplo en el documento WO 89/08405.
La Figura 1 es un dendrograma que muestra la
similitud en porcentaje (%) entre diferentes cepas analizadas de
Lactobacillus que han sido caracterizadas por el método- REA,
basado en el coeficiente de correlación del momento del producto
Pearson y UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic
Mean).
Se han obtenido muestras de cepas de
Lactobacillus de la mucosa humana. Se obtuvieron biopsias de
diferentes partes del colon mediante enteroscopía y fragmentos de la
mucosa intestinal del intestino delgado, es decir, del yeyuno e
íleon, se extrajeron coincidiendo con operaciones quirúrgicas. Las
muestras de mucosa se pusieron inmediatamente en un medio especial
(0,9% NaCl, 0,1% peptona, 0,1% Tween 80 y 0,02% cistina; todos los
valores se refieren a % en peso/volumen), se homogeneizaron en un
baño de ultrasonidos durante 2 minutos y se agitaron durante 1
minuto antes de colocarlas sobre agar Rogosa (Difco Laboratories,
Detroit, Michigan EE.UU.). Las placas se incubaron anaeróbicamente a
37ºC durante 2 días (Gas Pak Anaerobic System, BBL). Entre una y
tres colonias se tomaron al azar de cada palca, se hicieron crecer
en cultivos puros entre 5 y 9 veces sobre agar Rogosa y se guardaron
como cultivos densos en un tampón congelado a -80ºC. Merced a este
procedimiento se aislaron las cepas Lactobacillus plantarum
299 y 299v, así como 105, 275 y 386; Lactobacillus fermentum
8704:3; Lactobacillus reuteri 108, 8557:1, 8557:3;
Lactobacillus rhamnosus 271; Lactobacillus agilis
294. De modo similar se aislaron cepas de Lactobacillus de
intestinos de rata y cerdo, esto es Lactobacillus reuteri
R2LC y 1063, 1068 y 1044, respectivamente.
También se aislaron cepas de Lactobacillus
a partir del ogi o pito nigerianos de la siguiente
manera. La muestra original se trató en un baño de ultrasonidos
durante 5 minutos y se mezcló por agitación con vórtice durante 2
minutos, se diluyó y después se incubó en agar Rogosa (Difco)
durante 3 días a 37ºC. Se analizaron colonias de bacterias escogidas
al azar. Por este procedimiento se obtuvieron las cepas de
Lactobacillus plantarum 79 y 107, 125, 98, 53, 97M2, 97,
101, 120 y 44.
También se aislaron cepas de Lactobacillus
a partir de ensilaje, esto es Lactobacillus plantarum 36E,
256 y ATCC8014. So5 es un cultivo iniciador de
Lactobacillus plantarum obtenido por Sockerbolaget, Arlöv y
Lactobacillus reuteri BR es la cepa que se emplea
comercialmente en leche BRA (BRA-milk, Arla
Ekonomisk Förening, Estocolmo, Suecia).
ATCC 14917^{T} y DSM 20016^{T} son las cepas
tipo de Lactobacillus plantarum y Lactobacillus
reuteri, respectivamente. Una cepa tipo define la especie y
debe estar marcada con una ``^{T}''. El resto de cepas que
presenten una homología DNA:DNA con una cepa tipo particular de más
del 70% se dice que pertenecen a esa especie particular.
En International Journal of Systematic
Bacteriology (1995) 45:670-675, Johansson,
M-L, et al. describen la clasificación de las cepas
aisladas por medio de análisis del DNA cromosómico total mediante
endonucleasas de restricción. En la huella genética obtenida se
forman grupos genéticos o clusters que reflejan esta
similaridad en el patrón global de comparación. De acuerdo con este
método de análisis las cepas de Lactobacillus plantarum
pueden dividirse en diferentes grupos genéticos 1a, 1b, 1c, como
puede verse en la Figura 1. Todas las cepas del grupo genético 1c
tienen una similaridad con L. plantarum 299 > 50% y las
cepas 299v, 107, 105 y 79 tienen una similaridad >
70%.
Las cepas 299 y 299v, ambas aisladas de
mucosa intestinal humana sana, se depositaron el 2 de Julio de 1991
y el 16 de Marzo de 1995, respectivamente, en el Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH y se les dió los números
de déposito DSM 6595(299) y DSM 9843 (299v).
Las cepas 299, 299v, 79, 105 y 107
son Gram-positivas, que crecen como bastoncitos
catalasa-negativos en agar Rogosa a pH 5,5 y que son
capaces de producir ácido láctico a partir de glucosa
anaeróbicamente. La capacidad de estas cepas de fermentar distintos
carbohidratos se muestra en la Tabla 1. Los análisis se han llevado
a cabo mediante el API 50 CH de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
Estas cepas pueden identificarse fenotípicamente
como Lactobacillus plantarum.
| L. plantarum | L. plantarum | L. plantarum | L. plantarum | L. plantarum | ||||||
| 299 | 299v | 107 | 105 | 79 | ||||||
| 30^{o}C | 37^{o}C | 30^{o}C | 37^{o}C | 30^{o}C | 37^{o}C | 30^{o}C | 37^{o}C | 30^{o}C | 37^{o}C | |
| Glicerol | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Eritriol | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| D-arabinosa | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| L-arabinosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Ribosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| D-xilosa | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| L-xilosa | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Adonitol | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| \beta-metil-xilósido | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Galactosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| L. plantarum | L. plantarum | L. plantarum | L. plantarum | L. plantarum | ||||||
| 299 | 299v | 107 | 105 | 79 | ||||||
| 30^{o}C | 37^{o}C | 30^{o}C | 37^{o}C | 30^{o}C | 37^{o}C | 30^{o}C | 37^{o}C | 30^{o}C | 37^{o}C | |
| D-glucosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| D-fructosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| D-manosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| L-sorbosa | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Ramnosa | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Dulcitol | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Inositol | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Manitol | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Sorbitol | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| \alpha-metil-D-manósido | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| \alpha-metil-D-glucósido | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| N-acetil-glucosamina | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Amigdalina | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Arbutina | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Asculina | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Salicina | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Celobiosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Maltosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Lactosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Melobiosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Sacarosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Trehalosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Insulina | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Melecitosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| D-rafinosa | - | - | + | - | + | - | - | - | - | - |
| Almidón | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Glucógeno | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Xilitol | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| \beta-gentobiosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| D-turanosa | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| D-lixosa | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| D-tagarosa | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| D-fucosa | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| L-fucosa | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| D-arabitol | - | - | + | - | + | - | + | - | + | - |
| L-arabitol | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Gluconato | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 2-ceto-gluconato | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 5-ceto-gluconato | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
Las cepas se analizaron de acuerdo con el método
descrito por Chassy et al. (1976) para determinar su contenido en
plásmidos. Lactobacillus plantarum 299, 299v,
79 y 105 presentaron perfiles plasmídicos idénticos,
es decir, cinco plásmidos de 4, 9, 15, 21 y >30 MDa.
Lactobacillus plantarum 107 tenía tres plásmidos de 4, 15 y 21
MDa.
- -
- Se añade un inóculo de un congelador a -80ºC a 50 ml de medio de Lactobacillus (Lactobacillus Carrying Medium, LCM, Efthymiou & Hansen, J. Infect. Dis., 110:258-267, 1962) o de Rogosa,
- -
- se incuba alrededor de 40 horas a 37ºC,
- -
- se inoculan los 50 ml en 500 ml de LCM,
- -
- se incuban unas 40 horas a 37ºC,
- -
- se inoculan 500 ml en 5 litros,
- -
- se incuban aproximadamente 25-30 horas a 37ºC,
- -
- se centrifuga a 10.000 rpm durante 10 minutos,
- -
- se lava una vez en disolución salina fisiológica,
- -
- el sedimento se disuelve en aproximadamente 1 litro de disolución salina fisiológica.
Esta cantidad se estima suficiente para
aproximadamente 400-500 litros de gachas de harina
de avena. Los medios de cultivos no están optimizados. Rogosa
funcionó mejor que LCM, posiblemente debido a su mejor función
tamponadora. Se añadió un 2% de glucosa al LCM. El mismo
procedimiento de cultivo puede emplearse en la producción de otras
cepas de Lactobacillus.
Para evaluar la capacidad de colonizar in
vivo se administró a 12 voluntarios sanos 100 ml de gachas de
harina de avena líquidas que contenían 8 x 10^{7} CFU/g de cepa
liofilizada de Lactobacillus, durante 10 días, según se
describe en el documento WO 93/01823. Se encontró Lactobacillus
plantarum 299 en posición dominante en la mucosa intestinal 10
días después de finalizada su administración.
En otro ensayo se analizó la capacidad para
colonizar de las cepas L. plantarum 105 y 107. Una
preparación liofilizada que contenía 1,5 x 10^{9} CFU de cada cepa
de prueba se ingirió una vez al día durante 8 días. Se tomaron
biopsias del recto un día antes del comienzo de la administración y
uno y ocho días después de que se terminase la administración.
Además, también se tomaron biopsias del yeyuno. No se reaisló
ninguna de las cepas administradas, a partir de placas de Rogosa,
ocho días después del final de la administración.
Con el fin de investigar si las adhesinas de las
cepas de Lactobacillus se asemejaban a las adhesinas de los
receptores que contienen manosa dentro de la familia
Enterobacteriaceae, por ejemplo las que se encuentran en
cepas de E. coli, que a su vez se asocian con fimbrias tipo
1 y median la unión a células epiteliales de colon, se efectuaron
análisis de hemaglutinación con eritrocitos de origenes
diferentes.
Las bacterias lavadas se suspendieron, 2 x
10^{10}/ml en PBS y suspensiones de bacterias diluidas dos veces
se mezclaron en portaobjetos de microscopio con volumenes iguales
de suspensiones de eritrocitos al 3% en PBS, o en PBS que contenía
100 mM de metil- alfa-D-manósido.
Los portaobjetos se agitaron muy suavemente en intervalos regulares
y la aglutinación se leyó 15 minutos después a ojo y mediante el
empleo de microscopio de luz brillante a un aumento de 250 x. Se
registró como título de aglutinación el valor recíproco de la
dilución de suspensión bacteriana más alta que dió aglutinación
visible a los 15 minutos.
Las glicoproteínas unidas a membrana de los
eritrocitos contienen manosa y E. coli con adhesinas
específicas de manosa aglutinó un amplio intervalo de eritrocitos de
forma sensible a la manosa.
Las cepas de L. plantarum pertenecientes
al grupo genético 1c aglutinaron eritrocitos de seres humanos,
conejos de Indias, pollos, gatos, perros, ratones, ratas, conejos,
caballos y cerdos, pero más raramente eritrocitos ovinos y bovinos.
Con la excepción de los eritrocitos de ovejas y bueyes, las
aglutinaciones fueron completamente inhibidas, o muy reducidas por
el
metil-alfa-D-manósido.
Se observó una débil hemaglutinación sensible a manosa en algunas
cepas del grupo 1b, mientras que otros grupos genéticos dieron
negativo.
La hemaglutinación sensible a manosa (MSHA,
mannose-sensitive hemagglutination) de L.
plantarum se asemejó mucho a la de E. coli, aunque con
algunas diferencias. Así con L. plantarum los eritrocitos de
pollo dieron los mayores títulos de MSHA, mientras que los
eritrocitos de caballo resultaron una de las especies de eritrocitos
menos activas. Sin embargo, en E. coli los eritrocitos de
caballo proporcionaron los mayores títulos, incluso ligeramente
superiores que los obtenidos para los eritrocitos de pollo.
Comparativamente los eritrocitos de los conejillos de Indias
mostraron una fuerte actividad de hemaglutinación tanto en L.
plantarum como en E. coli, mientras que los eritrocitos
humanos fueron de baja actividad en E. coli comparados con
los de otras especies, pero comparativamente activos en aglutinación
en L. plantarum.
\newpage
Se analizaron varias cepas de
Lactobacillus en su capacidad para adherirse a las células
del epitelio intestinal de la línea celular HT-29 de
carcinoma de colon humano (según método descrito por Wold, A, et
al., Infection and Immunity, Oct. 1988, p.
2531-2537). Para ello las células de la línea
celular de adenocarcinoma humano HT-29 se cultivaron
en medio Eagle suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mM de
L-glutamina y 50 \mug/ml de gentamicina (Sigma
Chemical Co., Saint Louis, Mo, EE.UU.). Unos días después de que las
células alcanzaron la confluencia éstas se despegaron con tampón
que contenía EDTA (0,54 mM), se lavaron y se suspendieron en
disolución salina balanceada de Hank (HBSS, Hank's balanced salt
solution) a 5 x 10^{6}/ml. Las bacterias se recogieron,
lavaron y suspendieron en HBSS a 5 x 10^{9}/ml (2 x una densidad
óptica de 1,5 a 597 nm). Las células, las bacterias y el HBSS se
mezclaron en proporción 1:1:3 y se incubaron con rotación oscilante
durante 30 minutos a 4ºC. Las células se lavaron una vez con PBS
enfriado en hielo y se fijaron con formalina tamponada neutra
(Histofix, Histolab, Göteborg, Suecia). El número de bacterias
unidas a cada una de al menos 40 células se determinó mediante
microscopio de contraste de interferencia (aumento de 500 x, Nicon
Optophot, con equipo de contraste de interferencia, Bergström
Instruments, Göteborg, Suecia) y se calculó el número medio de
bacterias por célula. Para analizar la inhibición de la adherencia
se incluyó en el ensayo de adherencia 1,5% de varios monosacáridos
(glucosa, manosa, metil-
alfa-D-manósido). Los resultados se
muestran más adelante en la Tabla 2, en la cual los
encabezamientos, aparte de cepa y grupo genético, son como
sigue:
- HT-29 VH es el valor medio del
número de bacterias/célula; el número de experimentos realizados se
muestra dentro del paréntesis;
- alfa-metil manósido, manosa y
glucosa respectivamente se refieren al valor medio del número de
bacterias/célula en presencia de alfa-metil
manósido, manosa y glucosa, respectivamente; el número de
experimentos realizados se muestra dentro del paréntesis;
- n es el número de valores emparejados que
comparan la adherencia en presencia y ausencia de
alfa-metil manósido;
- d es la diferencia media en presencia y
ausencia de alfa-metil manósido; un valor positivo
indica inhibición con el manósido;
- p es el valor p de comparación obtenido del
test de la T de Student de los valores emparejados.
| Cepa | Grupo | HT-29 | \alpha-metil | manosa | glucosa | n | d | p | |
| genérico | VH | manósido | |||||||
| 299v | L. plantarum | 1c | 11,2(9) | 5,9(9) | 8,3(4) | 11,4(6) | 9 | 5,3 | 0,004 |
| 299 | L. plantarum | 1c | 10,7(8) | 4,9(8) | 11,6(3) | 10,6(5) | 8 | 5,8 | 0,002 |
| 79 | L. plantarum | 1c | 11,7(8) | 5,7(8) | 6,8(3) | 10,7(5) | 8 | 5,9 | <0,0001 |
| 105 | L. plantarum | 1c | 10,8(7) | 7,8(7) | 9,8(3) | 10,3(4) | 7 | 3,0 | 0,15 |
| 107 | L. plantarum | 1c | 10,3(7) | 6,9(7) | 10,8(2) | 15,3(4) | 7 | 3,4 | 0,01 |
| 386 | L. plantarum | 1c | 5,8(4) | 4,6(4) | 7,0(4) | 7,6(4) | 4 | 1,2 | 0,59 |
| 275 | L. plantarum | 1c | 1,6(3) | 1,3(3) | 2,9(3) | 3,1(3) | 3 | 0,3 | 0,52 |
| 36E | L. plantarum | 1b | 6,0(6) | 6,6(6) | 7,7(2) | 3,5(2) | 6 | - 0,6 | 0,58 |
| 256 | L. plantarum | 1b | 4,9(6) | 4,5(6) | 7,7(3) | 9,8(6) | 6 | 0,4 | 0,74 |
| 125 | L. plantarum | 1c | 8,7 | 2,9 | - | - | 3 | - | 0,0036 |
| ATCC14917 | L. plantarum | 1b | 5,6(6) | 6,2(3) | 1,9(1) | 9(1) | 3 | -0,6 | 0,70 |
| So5 | L. plantarum | 1,3(1) | 1,6(1) | 3,5(1) | 2,7(1) | ||||
| ATCC8014 | L. plantarum | 4,8(5) | 1,0(1) | 5,0(1) | 5,0(1) | ||||
| 98 | L. plantarum | 1b | 0,2(5) | 0(1) | |||||
| 53 | L. plantarum | 1a | 0,4(5) | 0(1) | |||||
| 97M2 | L. plantarum | 6,4(5) | 7,7(2) | 2 | -0,2 | 0,70 | |||
| 97 | L. plantarum | 1a | 1,2(4) | 6,7(1) | |||||
| 101 | L. plantarum | 1a | 0,3(1) | 1,0(1) | 4,2(1) | 3,8(1) | |||
| 120 | L. plantarum | 0(4) | 0(1) | ||||||
| 44 | L. plantarum | 3,1(1) | 6,7(1) | 9,7(1) | 6,5(1) | ||||
| 8704:3 | L. fermentum | 2,8(3) | 10,9(1) |
| Cepa | Grupo | HT-29 | \alpha-metil | manosa | glucosa | n | d | p | |
| genérico | VH | manósido | |||||||
| BR | L. reuteri | 5,3(4) | 13,6(1) | ||||||
| 106 | L. reuteri | 0,3(4) | 0(1) | ||||||
| 1063 | L. reuteri | 2,5(4) | 12,1(1) | ||||||
| 1068 | L. reuteri | 2,2(1) | 3,3(1) | ||||||
| 1044 | L. reuteri | 1,7(4) | 2,6(2) | ||||||
| M90 | L. reuteri | 4,0(4) | 1,3(1) | 2,7(1) | 4,0(1) | ||||
| 8557:1 | L. reuteri | 2,0(4) | 4,1(1) | ||||||
| 8557:3 | L. reuteri | 0,8(4) | 0,8(1) | ||||||
| DSM20016T | L. reuteri | 5,0(3) | 13,8(1) | ||||||
| R2LC | L. reuteri | 0(3) | 1,15(1) | 0,3(1) | 0,8(1) | ||||
| 294 | L. agilis | 0,7(3) | 2,4(1) | ||||||
| 271 | L. rhamnosus | 0(2) |
A partir de estos resultados puede verse que las
primeras cinco cepas de Lactobacillus muestran una fuerte
adherencia a las células HT-29 in vitro, la
cual es inhibida por el azúcar alfa-metil
manósido.
Este test de adherencia se repitió con las cepas
de Lactobacillus plantarum y con otras cinco cepas de
Escherichia coli. Se aislaron cuatro cepas naturales de la
flora rectal de lactantes pakistaníes que se identificaron como
E. coli por biotipificación, según lo describen Bettelheim,
M. F., et al., J. Med. Micorbiol. 2:225-236, 1969.
Estas cepas de E. coli se cultivaron toda la noche a 37ºC en
caldo de cultivo estático de Luria que contenía 0,1% de CaCl_{2}
para promover la expresión de las adhesinas específicas de manosa
con fimbrias tipo 1. La cepa transformante de E. coli 506 MS
que expresa fimbrias tipo 1 y adhesinas específicas de manosa se
cultivó en agar tríptico de soja que contenía 25 \mug de
cloranfenicol/ml. Las cepas de L. plantarum se cultivaron
aeróbicamente en agar Rogosa durante 24 horas a 37ºC.
Para analizar la inhibición a la adherencia se
incluyeron en el test de adherencia los siguientes monosacáridos a
una concentración final de 60 mM: D-glucosa (USB,
Cleveland, Ohio, EE.UU.),
metil-alfa-D-glucósido
(Sigma), D-manosa (Merck, EE.UU.),
N-acetil-glucosamina (USB),
N-acetil-galactosamina (USB) y ácido
N-acetil-neuramínico (Sigma).
Las cepas de L. plantarum 299 y 299v, que
anteriormente se había demostrado que colonizaban a voluntarios
humanos, se mostró que se adhieren a las células
HT-29 de forma moderada (aproximadamente 10
bacterias/célula). Esto también se observó para todas las demás
cepas de L. plantarum pertenecientes al grupo genético 1c, a
excepción de una. El
metil-alfa-D-manósido
redujo la adherencia de estas cepas en 45-73%. En
las cepas del grupo 1b se observó un menor grado de adherencia
(2-5 bacterias/célula). Su adherencia se redujo por
metil-alfa-D-manósido
en un 33-58%. Otras cepas de L. plantarum que no
pertenecían a los grupos 1b o 1c se adhirieron en números bajos y su
adherencia no fue inhibida por el
metil-alfa-D-manósido.
La D-manosa también redujo la
adherencia de L. plantarum 299 y 299V, pero en un
grado menor que el
metil-alfa-D-glucósido.
Ninguno de los otros monosacáridos analizados, es decir,
D-glucosa,
metil-alfa-D-glucósido,
L-fucosa, galactosa,
N-acetil-glucosamina,
N-acetil-galactosamina y ácido
N-acetil-neuramínico, inhibieron la
adherencia de L. plantarum 299 ni 299v a las células
HT-29.
Las cepas de E. coli con adhesinas
específicas de manosa analizadas se adhirieron a un nivel de
15-45 bacterias/célula. La adherencia de E. coli
506 MS se inhibió hasta niveles similares (94%) tanto por el
metil-alfa-D-manósido
como por la D-manosa.
Los resultados de la adherencia de las bacterias
a las células HT-29 tras incubación en presencia y
ausencia de 60 mM de
metil-alfa-D-manósido
y tras el lavado y el cálculo de los valores medios de 3
experimentos (un único experimento para E. coli 345, 253,
810 y 476) se muestran abajo en la Tabla 3.
Los análisis de la unión de las bacterias a las
bolas de agarosa recubiertas de D-manosa se
realizaron de acuerdo a Sanchez y Jonson (APMIS., 1990,
98:353-357), con pequeñas modificaciones. Las
bacterias lavadas, suspendidas en PBS a 10^{10}/ml se mezclaron
sobre portaobjetos de microscopio con volumenes iguales de una
suspensión 1:4 en PBS de bolas de agarosa comercial que contenían
D-manosa unida covalentemente
(Agarosa-p-aminofenil-alfa-D-manopiranósido,
Sigma, St. Louis, EE.UU.) o simplemente bolas de agarosa (agarosa
en bolas al 4%, PL-Biochemical, Milwaukee, Wis,
EE.UU.). Los portaobjetos se agitaron muy suavemente durante 2
minutos y después se observaron en un microscopio de contraste de
interferencia (aumento de 500 x, Nicon Optiphot). La observación de
bacterias adheridas a las bolas de agarosa recubiertas de manosa en
ausencia de unión a las bolas de agarosa sin recubrir se consideró
una reacción positiva. Los resultados de este análisis se muestran
en la Tabla 3. La unión a las bolas de agarosa recubiertas de
manosa se estimó como sigue:
- -
- Sin diferencia en la unión al compararlas con el control de las bolas sin manosa;
- +
- Las bacterias cubren el 50% o más de la superficie específica de las bolas en una capa fina;
- ++
- Las bacterias cubren toda la superfie específica de las bolas en una capa gruesa, incluso a veces pareciendo un revestimiento de múltiples capas.
Todas las cepas de L. plantarum que se
adhirieron a las células HT-29 y que aglutinaron
eritrocitos de forma sensible a la manosa también se unieron a las
bolas de agarosa recubiertas de D-manosa, es decir,
todas las cepas del grupo 1c y las ATCC 14917^{T}, 256 y 36E del
grupo 1b. La mayoría de las cepas positivas reaccionaron
considerablemente con las bolas de agarosa recubiertas con manosa;
tan sólo se observaron reacciones débiles en L. plantarum 275,
ATCC 14917^{T} y 256. Todas las cepas de L. plantarum
que habían dado negativo en la adherencia sensible a la manosa
también dieron negativo con las bolas recubiertas de manosa, a
excepción de L. plantarum 97 perteneciente al subgrupo 1a.
Sin embargo, esta cepa había mostrado ocasionalmente adherencia
sensible a manosa en otros experimentos.
E. coli 506 MS se unió aproximadamente al
mismo nivel que las cepas más positivas de L. plantarum.
| Grupo | Bacterias adheridas/célula | Unión a bolas de | |||
| Cepa | genérico | (media \pm DE) | agarosa recubiertas | ||
| HBSS | + metil-manósido | p | de manosa | ||
| L. plantarum | |||||
| 97 | 1a | 1,2 \pm 0,9 | 1,5 \pm 0,9 | + | |
| 101 | 1a | 0,5 \pm 0,4 | 1,1 \pm 0,8 | - | |
| 53 | 1a | 0,8 \pm 0,4 | 2,0 \pm 0,9 | - | |
| ATCC 14917^{T} | 1b | 5,2 \pm 0,8 | 2,2 \pm 0,7 | 0,070 | + |
| 256 | 1b | 3,7 \pm 0,3 | 1,8 \pm 1,5 | 0,020 | + |
| 36E | 1b | 2,4 \pm 1,8 | 1,6 \pm 1,5 | 0,17 | ++ |
| 98 | 1b | 0,6 \pm 0,6 | 0,4 \pm 0,2 | - | |
| 299 (=DSM6595) | 1c | 8,1 \pm 1,1 | 3,8 \pm 0,5 | 0,029 | ++ |
| 299v (=DSM9843) | 1c | 11,7 \pm 1,4 | 3,4 \pm 0,5 | 0,017 | ++ |
| 107 | 1c | 11,9 \pm 1,7 | 3,7 \pm 0,5 | 0,020 | ++ |
| 105 | 1c | 13,3 \pm 5,0 | 3,8 \pm 0,4 | 0,093 | ++ |
| 79 | 1c | 12,1 \pm 3,5 | 3,3 \pm 0,4 | 0,056 | ++ |
| 125 | 1c | 8,7 \pm 1,6 | 2,9 \pm 1,7 | 0,0036 | ++ |
| 275 | 1c | 2,9 \pm 0,3 | 1,6 \pm 0,2 | 0,038 | + |
| 386 | 1c | 11,6 \pm 2,8 | 4,1 \pm 0,9 | 0,021 | ++ |
| So5 | 2,2 \pm 0,4 | 4,6 \pm 2,2 | - |
| Grupo | Bacterias adheridas/célula | Unión a bolas de | |||
| Cepa | genérico | (media \pm DE) | agarosa recubiertas | ||
| HBSS | + metil-manósido | p | de manosa | ||
| L. plantarum | |||||
| ATCC 8014^{T} | 2,7 \pm 1,0 | 4,5 \pm 1,5 | - | ||
| 120 | 0,9 \pm 0,6 | 0,8 \pm 0,7 | - | ||
| 44 | 1,4 \pm 1,2 | 1,6 \pm 0,2 | - | ||
| E. coli | |||||
| 345 | 18,4 | 0,7 | |||
| 253 | 45,4 | 2,7 | |||
| 810 | 26,2 | 0,5 | |||
| 476 | 16,3 | 1,7 | |||
| SO6MS | 34,5 \pm 8,9 | 2,6 \pm 0,9 | 0,020 | ++ |
Las bacterias o las células HT-29
lavadas se suspendieron en 0,01 M de metaperyodato (Merck, EE.UU.)
en tampón fosfato-citrato 0,1 M a pH 4,5. Las
bacterias se incubaron a 37ºC durante una hora, mientras que las
células HT-29 se incubaron a temperatura ambiente
15-30 minutos. Tras la incubación, las bacterias o
las células se centrifugaron, se lavaron dos veces en PBS y se
suspendieron en HBSS. Las incubaciones control se realizaron con
0,01 M de yodato sódico (Mallinckrodt Chemical Works, Saint Louis,
Mo, EE.UU.) en el mismo tampón que el descrito o en tampón
sólo.
Las bacterias o las células HT-29
lavadas se suspendieron en PBS que contenía 2 mg/ml de Proteinasa K
(15 unidades/mg, Sigma) o en PBS sólo, se incubaron a 37ºC durante
una hora y se lavaron y suspendieron como se describió
anteriormente.
El tratamiento de las células
HT-29 con peryodato durante 15 ó 30 minutos condujo
a la destrucción celular; sólo un 5-10% de las
células permaneció tras el tratamiento y el posterior ensayo de
adherencia. Aún así, la adherencia sensible a la manosa de L.
plantarum a las células que habían sido tratadas durante 15
minutos permaneció elevada (p=0,41 en relación con el control de
tampón), mientras que las células que se habían tratado durante 30
minutos no se unieron a L. plantarum de manera sensible a la
manosa (p=0,033 en relación con el control de tampón) y el
tratamiento de peryodato durante 30 minutos casi suprimió la
adherencia (p=0,0005 en relación al control de tampón, p=0,0067 en
relación al control de yodato). La oxidación del peryodato de los
carbohidratos de la superficie celular bacteriana no afectó
demasiado a la unión.
El tratamiento de L. plantarum con
proteinasa K anuló completamente su capacidad de adherirse a las
células HT-29 (p=0,0008, Table 5), mientras que no
se observó reducción en la adherencia de E. coli 506 MS tras
el tratamiento de las bacterias con este enzima. El tratamiento con
proteinasa K de las células HT-29 no tuvo claros
efectos en la adherencia de L. plantarum 299v (p=0,36), pero
tendió a reducir la adherencia de E. coli 506 MS con fimbrias
tipo 1 (p=0,15, Tabla 4).
Estos experimentos confirman que el receptor
unido a la célula es de tipo carbohidrato y que una estructura
protéica en la superficie de la célula bacteriana está implicada en
la adhesión a dicho receptor.
Salmonella es un patógeno importante en
las enfermedades diarréicas. Muchas cepas de Salmonella
portan fimbrias tipo 1, que puede detectarse por hemaglutinación
sensible a manosa.
Para este análisis de adherencia se seleccionó
una cepa de Salmonella derivada de un paciente con
enfermedad gastrointestinal, Salmonella typhimurium 11014, la
cual exhibe aglutinación sensible a manosa de los eritrocitos. Esta
cepa de Salmonella se marcó con la sonda fluorescente FITC
(Isotiocianato de fluoresceina, Sigma) incubando las bacterias y
FITC en un tampón carbonato, pH 9,6, toda la noche en frío. Las
bacterias se lavaron 3 veces antes de ser usadas en el ensayo de
adherencia.
Para este ensayo, 0,1 ml de células
HT-29 (5 x 10^{6}/ml) se mezclaron con 5 x
10^{8} bacterias de Salmonella fluorescente y 5 x 10^{8}
bacterias no marcadas de Lactobacillus plantarum 299 o
299v. La mezcla se incubó en frío durante 30 minutos con
rotación oscilante. Tras lavar las células, se contabilizaron las
bacterias adheridas en un microscopio equipado para la detección de
fluorescencia. Los resultados se presentan en la tabla de abajo.
| Número de bacterias / célula | |
| Salmonella thypimurium 11014 | 25 |
| Salmonella thypimurium 11014 | 1 |
| + 2,5% metil-\alpha-D manósido | |
| Salmonella thypimurium 11014 | 7 |
| + Lactobacillus plantarum 299 | |
| Salmonella thypimurium 11014 | 12 |
| + Lactobacillus plantarum 299v |
Es evidente a partir de la Tabla de arriba que la
cepa de Salmonella se adhirió a las células de colon
humanas, esto es a las células HT-29, vía un
mecanismo específico de manosa. Esta adherencia sensible a la
manosa pudo ser bloqueada en gran medida por Lactobacillus
plantarum. Ambas bacterias estaban presentes simultáneamente, en
cantidades iguales.
Es probable que si la cepa de
Lactobacillus fue añadida con anterioridad a la cepa
patógena ocupase los sitios para las bacterias patógenas portadoras
de adhesinas específicas de manosa, resultando por tanto imposible
para ellas el llegar a estabilizarse y causar la enfermedad.
El fallo hepático agudo tiene una elevada
mortalidad y una proporción significativa de esta mortalidad puede
atribuirse a la elevada incidencia de sepsis. En pacientes
críticamente enfermos o inmunocomprometidos la mayoría de las
infecciones están causadas por la microflora del propio paciente y
muchos pacientes que mueren de sepsis o de fallo de múltiples
órganos tienen bacterias entéricas para las que no se han
identificado focos sépticos, lo que indica que esas infecciones se
han podido originar en el tubo digestivo. Debido a la elevada
frecuencia de sepsis bacteriana clínicamente significativa durante
fallos hepáticos fulminantes se ha suscitado la posibilidad de
llevar a cabo un tratamiento profiláctico. En el fallo hepático
agudo o tras una operación importante de hígado hay una mayor
translocación bacteriana desde el tubo digestivo, que podría
explicar algunas de las complicaciones infecciosas que se observan
en esas condiciones. Con el fin de elucidar el mecanismo y
encontrar posibles medidas preventivas se ha diseñado el siguiente
modelo.
Efecto de un suplemento con Lactobacilli
en fallos de lesión hepática aguda
El objetivo de este experimento es estudiar el
efecto de un suplemento rectal con diferentes cepas de
Lactobacillus hasta el punto de translocación bacteriana en
un modelo de lesión hepática aguda. También se investiga la
infuencia de tal administración en el número de
Enterobacteriaceae en colon e intestino ciego.
Ratas macho Sprague-Dawley con un
peso de 200-300 g se dividieron en 7 grupos de seis
animales cada uno: normal, control de lesión hepática aguda (ALI),
suplementado con Lactobacillus reuteri R2CL (SR),
suplementado con Lactobacillus rhamnosus 271 (SS),
suplementado con Lactobacillus plantarum 299v (SP),
suplementado con Lactobacillus fermentum 8704:3 (SF) y
suplementado con Lactobacillus reuteri 108 (ST). Todos los
animales recibieron comida normal para ratas (R3, Lactamin AB,
Estocolmo) y agua ad libitum durante todo el experimento y
se mantuvieron en ciclos de 12 horas de luz/oscuridad y a
temperatura ambiente de 22ºC. Las diferentes cepas de
Lactobacillus se administraron rectalmente una vez
diariamente durante 8 días. El suplemento diario de las cepas de
Lactobacillus fue de alrededor a 3 x 10^{9} CFU por animal
en 3 ml. La lesión aguda del hígado se indujo en el 8º día mediante
inyección intraperitoneal de D-galactosamina (Sigma
Chemical Co., St. Louis, EE.UU.), 1,1 g/kg de peso corporal, lo que
trae consigo un aumento en la filtración de las bacterias desde el
lumen intestinal hasta órganos distantes. En el grupo control de
lesión hepática aguda, la disolución salina normal se suplementó
diariamente durante 8 días y la lesión hepática se indujo el 8º
día. Las muestras se recogieron 24 horas después de haber inducido
la lesión hepática. Bajo anestesia con éter se llevó a cabo una
laparotomía a través de una incisión en la línea media en
condiciones de asepsia. Se tomaron sangre portal y aórtica para los
análisis bacterianos. Se obtuvieron muestras del lóbulo caudado del
hígado y de los nódulos linfáticos mesentéricos (MLN, mesenteric
lymph nodes) para el estudio bacteriológico; contenidos cecales
y colónicos para el recuento bacteriano.
En los análisis bateriológicos las muestras de
tejido se colocaron en 5 ml de medio estéril de transporte. Las
muestras se colocaron en un baño ultrasónico durante 5 minutos y se
agitaron en un Chiltern (Terma-Glass, Suecia)
durante 2 minutos. El recuento de las placas aeróbicas totales se
efectuó tras colocar 1,0 ml de muestra en una infusión de agar BHI
cerebro-corazón (Oxoid) e incubarlas a 37ºC durante
3 días. El recuento de placas anaeróbicas se efectuó tras colocar
las muestras en BHI e incubarlas bajo condiciones anaeróbicas a
37ºC. Tras 3 días se contabilizó el número de colonias formadas en
cada placa y se corrigió atendiendo al peso del tejido original. Las
muestras de tejido se expresaron por gramos de tejido. Todos los
valores se presentaron como media \pm EEM (Error Éstandar de la
Media). Los resultados fueron evaluados estadísticamente empleando
el test t de Student de no emparejados. Un nivel de probabilidad
menor que 0,05 se consideró significativo (p<0,05).
| Grupo | Hígado, CFU/g | MLN, CFU/g |
| ALI | 5300 \pm 1750 | 4940 \pm 2060 |
| SR | 880 \pm 530* | - |
| SS | 1460 \pm 990* | 180 \pm 40* |
| SP | 20 \pm 10** | - |
| SF | 160 \pm 80** | 70 \pm 30* |
| ST | 930 \pm 850** | 20 \pm 5* |
| *Indica p < 0,05 | **Indica p < 0,01 |
El tratamiento previo de las ratas con
Lactobacillus plantarum 299v redujo significativamente la
translocación bacteriana desde el tubo digestivo y mejoró el estado
del hígado.
Se investigó la microflora bacteriana mediante la
toma de muestras del contenido del intestino ciego y del colon que
fueron inmediatamente colocadas en 5 ml de medio estéril de
transporte, colocadas en un baño de ultrasonidos y agitadas en
Chiltern como anteriormente se ha descrito. Los recuentos de
Enterobacteriaceae viables se obtuvieron a partir del agar
"violet
red-bile-glucose" VRBG
(Oxoid) que se incubó aeróbicamente a 37ºC durante 24 horas.
| Grupo | CFU/g en el colon | CFU/g en el intestino ciego |
| Normal | 4,1 \pm 1,7 | 6,5 \pm 0,3 |
| ALI | 6,8 \pm 0,2 | 4,9 \pm 0,1 |
| SR | 6,7 \pm 0,2 | 5,1 \pm 0,2 |
| SS | 5,1 \pm 1,1 | 3,5 \pm 1,1 |
| SP | 4,7 \pm 1,0 * | 4,3 \pm 0,2 |
| SF | 1,9 \pm 1,2 ** | 5,5 \pm 0,2 |
| ST | 3,0 \pm 1,4 | 4,3 \pm 0,1 |
| * Indica p < 0,05 | ** Indica p < 0,01 |
La tabla anterior muestra que el recuento de
Enterobacteriaceae en colon al igual que en el intestino
ciego disminuyó en todos los grupos de ratas suplementados con
Lactobacillus.
Se suministró Pro Viva (sopa de escaramujo basada
en avena fermentada con Lactobacillus plantarum 299v,
Sk\ring{a}nemejerierna Ekonomisk Förening, Malmö, Sweden) a 26
niños que sufrían de gastroenteritis aguda en el hospital de
Szezecin, Polonia, durante un período medio de 5,5 días. El
producto se dió en una cantidad de 400 ml/día; 200 ml por la mañana
y 200 ml por la tarde.
Antes de empezar el tratamiento todos los niños
hacían entre 3 y 9 deposiciones blandas por día, lo que se redujo
tras el tratamiento hasta una frecuencia de 1-2
deposiciones por día. Seis pacientes tenían patógenos en los
cultivos de heces efectuados con anterioridad al tratamiento, esto
es Salmonella en 3 niños, E. coli enteropatógena en 2
niños, Enterobacter aeromonas y Giardia intestinalis
en 1 niño. Tras el tratamiento todos estos patógenos estaban
ausentes en los cultivos de heces. Todos estos patógenos, con la
excepción de Giardia intestinalis se sabe tienen fimbrias
tipo 1 y se adhieren a las células de los epitelios intestinales vía
mecanismos específicos de manosa. Es probable que la capacidad de
Lactobacillus plantarum 299v para competir con los patógenos
por los sitios de unión a las glicoproteínas que contienen manosa en
las células epiteliales, o en la capa de mucosa, sea la responsable
de la desaparición de estas bacterias de los cultivos de heces tras
la administración de Lactobacillus plantarum.
La extendida incidencia de las adhesinas
específicas de manosa entre las bacterias
Gram-negativas que residen en el tracto intestinal
sugiere que estas adhesinas son importantes en el proceso de
colonización intestinal. Nunca con anterioridad se había
identificado una adhesina específica de manosa en una especie
Gram-positiva tal como Lactobacillus
plantarum. Puede asumirse que la capacidad de adherirse a los
receptores que contienen manosa tiene su importancia en la
pronunciada capacidad colonizadora de esta bacteria. Sin embargo,
también bacterias que no poseen la capacidad de adherirse a los
receptores de la mucosa pueden ser buenos colonizadores del tracto
intestinal, por ejemplo la cepa 271, que no se adhiere a las células
epiteliales del intestino.
Probablemente, la capacidad de unirse a
receptores que contienen manosa en el epitelio proporciona a
Lactobacillus plantarum la capacidad especial de
contrarrestar el efecto de bacterias patógenas. En primer lugar,
es un buen colonizador intestinal. En segundo lugar, competirá con
las bacterias patógenas por los sitios de los receptores que son
importantes para la capacidad colonizadora de las bacterias
patógenas, es decir, los receptores de la mucosa que contienen
manosa. En tercer lugar, al unirse a los receptores presentes en las
células del epitelio intestinal Lactobacillus plantarum será
capaz de influir sobre el micromedio cercano a estas células
epiteliales. Entonces, el cambio en el micromedio llevado a cabo por
Lactobacilli afectará más probablemente a las células
epiteliales que si estas bacterias Lactobacilli residieran
en un lugar más distante del epitelio. En cuarto lugar,
Lactobacillus plantarum al unirse a los receptores que
contienen manosa de las células epiteliales será capaz de
obstaculizar la unión de bacterias patógenas, reduciendo por tanto
su capacidad de liberar directamente sustancias tóxicas, o de otro
modo irritantes, a las células epiteliales, lo que es a menudo un
requisito previo para la acción patógena de esas bacterias.
Claims (2)
1. Uso de Lactobacillus plantarum 299v,
con el número de depósito DSM 9843, que tiene adhesinas específicas
de manosa así como capacidad para colonizar la mucosa intestinal
humana, para la preparación de una composición farmacéutica para el
tratamiento de una infección del tracto urinario al inhibir la
adherencia de las bacterias patógenas que expresan fimbrias tipo 1,
especialmente bacterias pertenecientes a Klebsiella,
Enterobacter, Proteus o Escherichia coli, a las células
del epitelio uretral humanas.
2. Uso, de acuerdo con la reivindicación 1, de
Lactobacillus plantarum 299v, con el número de depósito DSM
9843, en combinación con un vehículo convencional para la
preparación de una composición farmacéutica.
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