PL182738B1

PL182738B1 - Ciekły preparat immunoglobuliny

Info

Publication number: PL182738B1
Application number: PL95318265A
Authority: PL
Inventors: René Bruegger; Katharina Gennari; Gerhard Hodler; Bernard Wuest
Original assignee: Red Cross Found Cent Lab Blood
Priority date: 1994-09-08
Filing date: 1995-09-07
Publication date: 2002-02-28
Also published as: IL115226A0; DE69531400T2; EP0779818B1; MX9701510A; NO971016L; ATE246005T1; CA2197432A1; WO1996007429A1; NO971016D0; CA2197432C; RO118568B1; PT779818E; DK0779818T3; GB9418092D0; FI970603A0; IL115226A; CN1157572A; US5871736A; TW407056B; HU223668B1

Abstract

1. Ciekly preparat immunoglobuliny, zawierajacy co najmniej jeden nieczynny powierzchniowo amfi- filowy stabilizator, znamienny tym, ze stabilizator zawiera w czasteczce co najmniej jedna grupe wybrana sposród grupy karboksylowej, sulfonowej, ketonowej, aldehydowej, hydroksylowej, aminowej, amidowej oraz estrowej, a takze co najmniej jedna grupe lipofilowa, zawierajaca od 3 do 12 atomów wegla i ewentual- nie jeden atom azotu lub siarki, przy czym co najmniej jeden amfifilowy stabilizator jest zwiazkiem o wzorze 1, w którym przerywana linia pomiedzy N a Y wskazuje, ze ewentualnie z atomem N, majacym ladunek dodatni, jest zwiazany Y, który oznacza -CH3-O-, lub -(CH2)n -SO3 -, gdzie n oznacza 1 lub 2, R 1 oznacza H, -OH, lub metyl, X 1 , X2 oraz X3 niezaleznie oznaczaja H, -COZ, -SO3 H lub -CH2 Z1 , pod warunkiem, ze co najmniej je- den z X 1 , X2 oraz X3, lecz nie wiecej niz dwa sposród X 1 , X2 oraz X3 , oznaczaja atom wodoru, Z oznacza -OR lub -N(R)2, gdzie kazdy R niezaleznie oznacza H lub alkil C 1 -3 , Z1 oznacza reszte naturalnego a-aminokwasu, lub jego amidu lub estru, zwiazana poprzez atom wegla a albo co najmniej jeden amfifilowy stabilizator jest zwiazkiem o wzorze 2, w którym R3 oznacza -COZ, -SO3 H, -CH2 -CO-COOH, -CH(COOH)2, grupe -Q-Z 1 , lub -Q-Z2 , w których Q oznacza -CH2- lub -CO-, Z oraz Z 1 maja wyzej podane znaczenie, zas Z2 oznacza reszte naturalnego a-aminokwasu, lub jego amidu lub estru, zwiazana poprzez atom azotu grupy a-aminowej, albo co najmniej jeden amfifilowy stabilizator jest zwiazkiem o wzorze 3, w którym Z ma wyzej podane znaczenie, przy czym calkowita zawartosc stabilizatora wynosi co najmniej 0,2 mmol na gram immunoglobuliny, zas stezenie preparatu wynosi co najmniej 20 mmol/dm3. PL PL PL

Description

1. Ciekły preparat immunoglobuliny, zawierający co najmniej jeden nieczynny powierzchniowo amfifilowy stabilizator, znamienny tym, że stabilizator zawiera w cząsteczce co najmniej jedną grupę wybraną spośród grupy karboksylowej, sulfonowej, ketonowej, aldehydowej, hydroksylowej, aminowej, amidowej oraz estrowej, a także co najmniej jedną grupę lipoftlową, zawierającą od 3 do 12 atomów węgla i ewentualnie jeden atom azotu lub siarki, przy czym co najmniej jeden amfifilowy stabilizator jest związkiem o wzorze 1, w którym przerywana linia pomiędzy N a Y wskazuje, że ewentualnie z atomem N, mającym ładunek dodatni, jest związany Y, który oznacza -CH3-O-, lub -(CH₂)_n-SO₃-, gdzie n oznacza 1 lub 2,

Ri oznacza H, -OH, lub mety],

X_h X₂ oraz X₃ niezależnie oznaczają H, -COZ, -SO₃H lub -CH₂Z_b pod warunkiem, że co najmniej jeden z X), X₂ oraz X₃, lecz nie więcej niż dwa spośród X_b X₂ oraz X₃, oznaczają atom wodoru,

Z oznacza -OR lub -N(R)₂, gdzie każdy R niezależnie oznacza H lub alkil C_b3,

Z] oznacza resztę naturalnego α-aminokwasu, lub jego amidu lub estru, związaną poprzez atom węgla a albo co najmniej jeden amfifilowy stabilizator jest związkiem o wzorze 2, w którym

R₃ oznacza -COZ, -SO₃H, -CH₂-CO-COOH, -CH(COOH)₂, grupę -Q-Z] lub -Q-Z₂, w których Q oznacza -CH₂- lub -CO-,

Z oraz Z| mają wyżej podane znaczenie, zaś

Z₂ oznacza resztę naturalnego α-aminokwasu, lub jego amidu lub estru, związaną poprzez atom azotu grupy α-aminowej, albo co najmniej jeden amfifilowy stabilizator jest związkiem o wzorze 3, w którym Z ma wyżej podane znaczenie, przy czym całkowita zawartość stabilizatora wynosi co najmniej 0,2 mmol na gram immunoglobuliny, zaś stężenie preparatu wynosi co najmniej 20 mmol/din³.

Ciekły preparat immunoglobuliny

Claims

1. Ciekły preparat immunoglobuliny, zawierający co najmniej jeden nieczynny powierzchniowo amfifilowy stabilizator, znamienny tym, że stabilizator zawiera w cząsteczce co najmniej jedną grupę wybraną spośród grupy karboksylowej, sulfonowej, ketonowej, aldehydowej, hydroksylowej, aminowej, amidowej oraz estrowej, a także co najmniej jedną grupę lipofilową, zawierającą od 3 do 12 atomów węgla i ewentualnie jeden atom azotu lub siarki, przy czym co najmniej jeden amfifilowy stabilizator jest związkiem o wzorze 1, w którym przerywana linia pomiędzy N a Y wskazuje, że ewentualnie z atomem N, mającym ładunek dodatni, jest związany Y, który oznacza -CH3-O-, lub -(CH₂)_n-SO3-, gdzie n oznacza 1 lub 2,

Ri oznacza H, -OH, lub metyl,

X_b Χ2 oraz Χ3 niezależnie oznaczają H, -COZ, -SO3H lub -CH2Z], pod warunkiem, że co najmniej jeden z Χι, Χ2 oraz Χ3, lecz nie więcej niż dwa spośród Χι, Χ2 oraz Χ3, oznaczają atom wodoru,

Z oznacza -OR lub -N(R)2, gdzie każdy R niezależnie oznacza H lub alkil C1-3,

Zi oznacza resztę naturalnego α-aminokwasu, lub jego amidu lub estru, związaną poprzez atom węgla a albo co najmniej jeden amfifilowy stabilizator jest związkiem o wzorze 2, w którym

R₃ oznacza -COZ, -SO₃H, -CH₂-CO-COOH, -CH(COOH)₂, grupę -Q-Zj lub -Q-Z₂, w których Q oznacza -CH2- lub -CO-,

Z oraz Zi mająwyżej podane znaczenie, zaś

Z2 oznacza resztę naturalnego α-aminokwasu, lub jego amidu lub estru, związaną poprzez atom azotu grupy α-aminowej, albo co najmniej jeden amfifilowy stabilizator jest związkiem o wzorze 3, w którym Z ma wyżej podane znaczenie, przy czym całkowita zawartość stabilizatora wynosi co najmniej 0,2 mmol na gram immunoglobuliny, zaś stężenie preparatu wynosi co najmniej 20 mmol/dm³.

2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako immunoglobulinę zawiera immunoglobulinę G oraz ma postać do dożylnego wstrzykiwania.

3. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera związek o wzorze 1, w którym dwa podstawniki spośród X_b Χ2 oraz Χ3 są wodorami, zaś trzeci z nich oznacza -COZ.

4. Preparat według zastrz. 3, znamienny tym, że związkiem o wzorze 1 jest kwas nikotynowy lub pochodna kwasu nikotynowego, w której Xi oznacza -COZ, zaś X] oraz Χ3 są wodorami.

5. Preparat według zastrz. 4, znamienny tym, że pochodną kwasu nikotynowego jest nikotynamid.

6. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera związek o wzorze 2, w którym R3 jest wybrany spośród grup -COZ, -CH2-CO-COOH, -CH(COOH)2, lub -Q-Z2.

7. Preparat według zastrz. 6, znamienny tym, że związkiem o wzorze 2 jest benzamid.

8. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera, poza związkiem o wzorze 1, 2 lub 3, dodatkowy amfifilowy stabilizator, którym jest aminokwas wybrany spośród fenyloalaniny, metioniny, leucyny, izoleucyny, proliny, waliny, lub pochodnej dowolnego z tych aminokwasów, w którym grupa karboksylowa jest zastąpiona grupą o wzorze -CONH2, -CONHR, -CH2OH lub -COOR, gdzie R oznacza alkil Cm.

9. Preparat według zastrz. 8, znamienny tym, że co najmniej jeden amfifilowy stabilizator jest wybrany spośród proliny, leucyny i izoleucyny.

10. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera prolinę i nikotynamid.

11. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek molowy nikotynamidu do sumarycznej zawartości sumy amfifilowych aminokwasów wynosi od 1:1 do 1:4.

182 738

12. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że jako jedyne amfifilowe stabilizatory zawierają nikotynamid, prolinę i izoleucynę.

13. Preparat według zastrz. 12, znamienny tym, że zawiera nikotynamid, prolinę i izoleucynę w stosunkach molowych 1 : (0,8-2,0): (0,8-2,0).

14. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że wykazuje pH między pH 5 i pH 6.

15. Sposób stabilizacji ciekłych preparatów iv-IgG, przeciw powstawaniu dimeru podczas przechowywania w temperaturach 2°C do 25°C, polegający na dodawaniu do tych preparatów co najmniej 20 mmol/dm³ przynajmniej jednego nieczynnego powierzchniowo amfifilowego stabilizatora, znamienny tym, że dodaje się stabilizator, który zawiera w cząsteczce co najmniej jedną grupę wybraną spośród grupy karboksylowej, sulfonowej, ketonowej, aldehydowej, hydroksylowej, aminowej, amidowej oraz estrowej, a także co najmniej jedną grupę lipofilową zawierającą od 3 do 12 atomów węgla i ewentualnie jeden atom azotu lub siarki, przy czym co najmniej jeden amfifilowy stabilizator jest związkiem o wzorze 1, w którym przerywana linia pomiędzy N a Y wskazuje, że ewentualnie z atomem N, mającym ładunek dodatni, jest związany Y, który oznacza -CH3-O-, lub -(CH2)_n-SO3-, gdzie n oznacza 1 lub 2,

Ri oznacza H, -OH, lub metyl,

X], Χ2 oraz Χ3 niezależnie oznaczają H, -COZ, -SO3H lub -CH2Z1, pod warunkiem, że co najmniej jeden z Χι, Χ2 oraz Χ3, lecz nie więcej niż dwa spośród Χι, Χ2 oraz Χ3, oznaczają atom wodoru,

Z oznacza -OR lub -N(R)2, gdzie każdy R niezależnie oznacza H lub alkil C1.3,

R₃ oznacza -COZ, -SO₃H, -CH₂-CO-COOH, -CH(COOH)₂, lub grupę -Q-Zj lub -Q-Z₂, w których Q oznacza -CH2- lub -CO-,

Z oraz Zi mają wyżej podane znaczenie, zaś

Z2 oznacza resztę naturalnego α-aminokwasu, lub jego amidu lub estru, związaną poprzez atom azotu grupy α-aminowej, albo co najmniej jeden amfifilowy stabilizator jest związkiem o wzorze 3, w którym Z ma wyżej podane znaczenie, w całkowitej ilości wynoszącej co najmniej 0,2 mmol stabilizatora na gram immunoglobuliny.

♦ ♦ *

Niniejszy wynalazek dotyczy trwałych preparatów immunoglobulin.

Znane są liczne sposoby wytwarzania preparatów immunoglobulinowych, zwłaszcza nadających się do dożylnego wstrzykiwania postaci IgG (iv-IgG) z frakcji osocza krwi ludzkiej. W celu otrzymania produktu nadającego się do dożylnego wstrzykiwania konieczne jest usunięcie lub uniknięcie powstawania agregatów, które wykazują działanie przeciwdopełniające, i które podczas dożylnego wstrzykiwania mogą powodować silne reakcje uboczne ze wstrząsem anafilaktycznym włącznie. Większość preparatów iv-IgG dostępnych do użytku klinicznego liofilizuje się (suszy w zamrożeniu) w celu powiększenia trwałości przy przechowywaniu, ale takie preparaty muszą być przed zastosowaniem przywrócone do pierwotnej postaci z użyciem rozpuszczalnika, np. sterylnej wody lub roztworu soli. Ten etap przywracania do pierwotnej postaci jest niewygodny i czasochłonny oraz stwarza możliwość zanieczyszczenia produktu. Pożądane jest przeto wytwarzanie farmaceutycznych kompozycji iv-IgG, które byłyby przeznaczone do przechowywania i stosowania w ciekłej postaci (wodnego roztworu) i które wykazywałyby niezbędny stopień trwałości przy takim przechowywaniu. Takie kompozycje określa się tu dalej jako ciekłe preparaty iv-IgG. Niektóre takie preparaty sąjuż dostępne w handlu.

182 738

Chociaż produkty IgG do wstrzykiwania dożylnego zawierają jedynie bardzo małe ilości agregatów (trimerów lub wyższych polimerów cząsteczek IgG), to mogą one zawierać dość duże ilości dimerów IgG, które można oznaczyć np. metodą ciśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC). Te dimery nie powodują wstrząsu anafilaktycznego i zwykle uważa się, że nie stanowią one problemu. Istotnie w wielu specyfikacjach produktów monomery i dimery zalicza się razem do grupy „czynnościowych IgG”.

Tankersley i in. (Molecular Immunology 25, 41-48, 1988) odkryli, że zawartość dimeru w prepratach IgG jest tym większa, im więcej dawców ma udział w zbiorczym osoczu, z którego otrzymuje się IgG. Nie można więc wykryć dimeru w IgG uzyskanej od pojedynczej osoby i jest go stosunkowo mało w nadimmunizowanej IgG, otrzymanej od dawców w liczbie od kilkuset do kilku tysięcy, którzy byli uodpornieni przeciw określonym antygenom chorobowym, podczas gdy osiąga on wysoki poziom w IgG wytworzonej ze zbiorczego osocza, pochodzącego od 10000 i więcej dawców. Autorzy wnioskują, że dimery IgG są dimerami idiotypowo-antyidiotopowymi, które powstają, gdy przeciwciało od jednego dawcy rozpoznaj e okolicę wiązania antygenu przeciwciała od innego dawcy i łączy się z nim. Dimery oraz monomery znajdują się w równowadze i zawartość dimeru wzrasta z ogólnym stężeniem immunoglobuliny.

Ci sami autorzy stwierdzili, że tworzenie się dimeru wzrasta w czasie przechowywania; zawartość dimeru w typowym preparacie może podwoić się w czasie pierwszego tygodnia przechowywania, a potem nadal powoli wzrasta. Gdy preparaty IgG liofilizuje się wkrótce po ich wypordukowaniu, to zapobiega się występowaniu tego wzrostu tworzenia się dimeru. Jeśli jednak ma się zamiar przechowywać i stosować taki preparat w ciekłej postaci, to stężenie dimeru będzie wzrastało podczas przechowywania.

Ten sam rodzaj powstawania dimeru może występować w przypadku innych immunoglobin niż IgG, np. IgA, IgD i IgE. Ponadto tworzenie się dimeru obserwuje się również w preparatach przeciwciał monoklonalnych, chociaż mechanizm powstawania dimeru w przeciwciałach monoklonalnych może różnić się od mechanizmu proponowanego przez Trankersleya i in.

Obecnie autorzy niniejszego wynalazku odkryli, że aczkolwiek dimer IgG w odróżnieniu od wyższych polimerów nie powoduje wstrząsu anafilaktycznego, to jednak preparaty IgG o wysokiej zawartości dimeru są gorzej tolerowane przy dożylnym wstrzykiwaniu i mogą powodować niepożądane skutki uboczne, a w tym gorączkę, mdłości, a niekiedy obniżenie ciśnienia krwi. Podciśnieniowe skutki uboczne na szczurzym modelu wykryli Bleeker i in. (Vox Sanguinis 52, 281-290, 1987) i to również wykazuje widoczną współzależność z zawartością dimeru. Jest więc pożądane stabilizowanie preparatów immunoglobulin, zwłaszcza ciekłych preparatów iv-IgG, przeciw tworzeniu się dimeru.

W celu stabilizacji iv-IgG i polepszenia tolerancji na jej wstrzykiwanie dożylne stosuje się liczne dodatki. Należą do nich: glikol, dwusacharydy, np. maltoza i sacharoza; alkohole cukrowe, np. sorbit; poliglikol etylenowy; albo małe ilości środków powierzchniowo czynnych, takich jak jednooleinian sorbitanu z poliglikolem etylenowym 20 lub nonyloksyfenol z poliglikolem etylenowym 10. Stwierdzono jednak, że żaden z tych konwencjonalnych stabilizatorów nie powstrzymuje skutecznie powstawania dimeru w ciekłych preparatach iv-IgG.

Zawartość dimeru jest funkcją stężenia Ig, toteż oczywiście można zmniejszyć zawartość dimeru przez rozcieńczenie preparatów IgG. Takie podejście jest jednak niepraktyczne, gdyż wymagałoby wlewania chorym niedopuszczalnie dużych objętości cieczy.

Według niniejszego wynalazku problem ten rozwiązuje się przez dodanie do kompozycji immunoglobulinowej skutecznie działającej ilości stabilizatora amfifilowego.

Stabilizatory amfifilowe, stosowane według niniejszego wynalazku, są substancjami, które zawierają w cząsteczce obszar silnie lub umiarkowanie hydrofilowy oraz obszar silnie lub umiarkowanie lipofilny, ale które nie są substancjami powierzchniowo czynnymi, tj. nie tworzą micel w wodnym roztworze w stężeniach, w których są stosowane, natomiast pozostają w postaci monomerycznej. Stabilizatory amfifilowe według niniejszego wynalazku zawierają w cząsteczce jedną lub więcej grup wybranych spośród kwasów karboksylowych, kwasów sulfonowych, kwasów fosforowych (wszystkie w postaci albo wolnego kwasu, albo

182 738 farmakologicznie tolerowanej soli), grup ketonowych, aldehydowych, hydroksylowych, aminowych lub amidowych; a także jedną lub więcej grup lipofilnych, zawierających od 3 do 12 atomów węgla, korzystnie od 4 do 10 atomów węgla, i ewentualnie jeden atom azotu lub siarki. Grupy te korzystnie wybiera się spośród prostołańcuchowych lub rozgałęzionych grup alkilowych, prostołańcuchowych lub rozgałęzionych grup alkenylowych oraz pierścieni aromatycznych, heteroaromatycznych grup alkenylowych oraz pierścieni aromatycznych, heteroaromatycznych, alifatycznych lub heteroalifatycznych.

Jeśli w grupie lipofilnej znajduje się atom azotu, to korzystnie występuje on w postaci trzeciorzędowej, np. w pierścieniu pirydynowym. Korzystnymi niecyklicznymi grupami lipofilnymi są grupy alkilowe o rozgałęzionych łańcuchach, zawierające od 4 do 10, korzystnie od 4 do 6 atomów węgla.

Oczywiście każdy związek stosowany jako stabilizator dla iv-IgG sam musi być farmaceutycznie tolerowany przy dożylnym wstrzykiwaniu w używanych stężeniach. Korzystne jest również, aby nie zmieniał on chemicznie cząsteczki IgG i nie wykazywał znacznej pojemności buforowej przy wartościach pH między 4 i pH 8.

Korzystnymi stabilizatorami amfifilowymi są kwas nikotynowy i jego pochodne, np. nikotynamid, N-tlenek nikotynamidu i N'-metylonikotynamid, a wśród nich szczególnie korzystny jest nokotynamid.

Dalszą korzystną grupą stabilizatorów amfifilowych jest grupa naturalnie występujących α-aminokwasów zawierających nienaładowane lipofilne boczne łańcuchy oraz pochodnych takich aminokwasów, w których grupę kwasu karboksylowego zastępuje grupa o wzorze -CONH2, -CONHR, -CO2OH lub -COOR, gdzie R oznacza alkil Cm. Takimi aminokwasami są: fenyloalanina, metionina, leucyna, izoleucyna, prolina i walina, wśród których korzystne są: fenyloalanina, prolina, leucyna i izoleucyna, zwłaszcza prolina, leucyna i izoleucyna, a najbardziej prolina.

Japońska publikacja patentowa nr 61-194035 ujawnia ciekłe preparaty gammaglobuliny, które poddaje się obróbce cieplnej w obecności stabilizatora, którym jest jednosacharyd, dwusacharyd lub alkohol cukrowy w ilości od 10 do 100 g na 100 cm³ oraz pomocnicznego stabilizatora, którym może być obojętny aminokwas, jak np. walina, leucyna lub izoleucyna, albo sól kwasu karboksylowego.

Niniejszy wynalazek ustanawia ciekłe preparaty immunoglobulin, zwłaszcza ciekłe preparaty immunoglobuliny G do wstrzykiwania dożylnego, zawierające jeden lub więcej stabilizatorów amfifilowych tutaj określonych, w całkowitej ilości wynoszącej przynajmniej 0,2 mmol na gram immunoglobuliny i w ogólnym stężeniu wynoszącym przynajmniej 20 mmol/dm³, pod warunkiem, że jeżeli preparat zawiera 100 g/dm³ lub więcej jednosacharydu lub alkoholu cukrowego, to przynajmniej jeden stabilizator amfifilowy jest różny od obojętnego aminokwasu lub soli kwasu karboksylowego i korzystnie wybiera się go spośród kwasu nikotynowego i jego pochodnych.

Korzystnymi stabilizatorami są kompozycje zawierające nikotynamid wraz z jednym lub większą liczbą wyżej wymienionych amfifilowych aminokwasów lub ich pochodnych. Bardziej korzystne kompozycje stabilizatorów zawierają nikotynamid i prolinę, ewentualnie wraz z jednym lub większą liczbą dodatkowych aminokwasów amfiflowych. Szczególnie korzystnymi kompozycjami są mieszaniny (a) nikotynamidu i proliny; (b) nikotynamidu, proliny i izoleucyny; oraz (c) nikotynamidu, proliny, izoleucyny i leucyny. W takich kompozycjach stosunek molowy noktynamidu do sumy amfifilowych aminokwasów korzystnie wynosi od 1:1 do 1:4. Najkorzystniejszą kompozycją jest mieszanina niktynamidu, proliny i izoproliny, korzystnie w następujących stosunkach molowych 1 : (0,8-2,0): (0,8-2,0).

Immunoglobulina stabilizowana według niniejszego wynalazku może oznaczać dowolny preparat IgA, IgD, IgE lu IgG, zarówno monoklonalny, jak i poliklonalny, oraz zarówno wydzielony z ludzkiego lub zwierzęcego osocza krwi, jak i otrzymany w inny sposób, np. technologią hybrydomy lub rekombinantów DNA. Korzystnie oznacza ona preparaty IgG z ludzkiego osocza krwi, które przerabia się tak, aby nadawały się do wstrzykiwania dożylnego i które mają być przechowywane i stosowane w ciekłej postaci. Bardziej korzystnie oznacza ona wielowartościową, nie uszkodzoną immunoglobulinę, która nie była rozszczepiana

182 738 (np. pepsyną o wysokich stężeniach) i która zachowuje strukturalną i czynnościową integralność przeciwciał 7S-IgG, z nieuszkodzonym obszarem Fc włącznie. Korzystnie oznacza ona frakcje, otrzymane z osocza krwi na drodze zmodyfikowanej krioprecypitacji alkoholowej z obróbką przy użyciu pepsyny o niskich stężeniach w warunkach pH 4.

Zawartość IgG w ciekłych kompozycjach wynosi od 3% do 16%, a bardziej korzystnie od 6% do 12%. Wartość pH roztworu korzystnie wynosi od pH 4 do pH 8, bardziej korzystnie od pH 5 do pH 6, a zwłaszcza od pH 5,2 do pH 5,4. Przy takich stosunkowo kwaśnych wartościach pH jest istotne, aby roztwór wykazywał małą pojemność buforową, aby zapobiec jakiemukolwiek znaczniejszemu obniżeniu pH we krwi biorców podczas dożylnego wstrzykiwania. Ciśnienie osmotyczne roztworu można doprowadzać do wartości fizjologicznych przez dodanie jednej lub więcej niż jednej substancji nie buforującej, np. chlorku sodowego, glikolu, sacharozy, maltozy i sorbitu. Takie ciekłe kompozycje można podawać przez dożylne wlewanie np. w dawkach od 0,2 do 1,0 g IgG na kg wagi ciała na dzień.

Ilość amfifilowego stabilizatora, występującego w kompozycjach według niniejszego wynalazku, korzystnie wynosi od 0,2 do 6 mmol na gram IgG, a bardziej korzystnie od 1 do 3 mmol/g IgG. Preparaty immunoglobulinowe mogą także zawierać inne białka, np. albuminę.

Ciekłe preparaty iv-IgG według niniejszego wynalazku, zawierającego amfifilowy stabilizator, można przechowywać do 2 lat w temperaturze od 2°C do 25°Ć bez wzrostu zawartości dimeru do niedopuszczalnego poziomu. Takie kompozycje są dobrze tolerowane przy dożylnym wstrzykiwaniu.

Roztwory iv-IgG, które mają być liofilizowane i sprzedawane w liofilizowanej stałej postaci, można również stabilizować przez dodawanie amfifilowych stabilizatorów według niniejszego wynalazku w celu zmniejszenia powstawania dimeru w okresie czasu między ich wytwarzaniem i liofilizacją.

Następujące przykłady ilustrują niniejszy wynalazek:

A. Sposób postępowania przy wytwarzaniu ciekłych preparatów iv-IgG.

Surową pastę IgG, otrzymaną przez alkoholowe frakcjonowanie zbiorczego ludzkiego osocza krwi, rozpuszcza się w sterylnej wodzie w 4°C i przesącza. Roztwór ten zakwasza się do pH 4 i inkubuje z małą ilością pepsyny w warunkach pH 4 i 37°C, a następnie zobojętnia. Następnie produkt ten diafiltruje się w celu usunięcia pozostałego alkoholu, a potem doprowadza się pH do pH 5,3 i zatęża ten roztwór przez ultrafiltrację w celu uzyskania końcowego stężenia białka w granicach od 6% do 15% wagowo-objętościowych (w/o).

Produkt ten można również wytwarzać tak, jak to opisuje szwajcarski patent nr 684 164.

B. Pomiary zawartości dimeru

Produkt analizuje się metodą HPLC w urządzeniu Helwett Packard HP 1090, stosując kolumnę TSK G3000SW-XL o wymiarach 7,8 x 300 mm z ruchomą fazą, stanowiącą 0,04 m buforowy roztwór fosforanowy i 0,2 m roztwór chlorku sodowego o pH 7,0. Prędkość przepływu wynosi 0,7 cm³/min. Stosuje się próbki o objętości 0,0013 cm³ roztworu i stężeniu 150 mg/cm³ i wykrywa białko przez absorpcję w nadfiolecie przy 280 nm. Powierzchnie pod maksimami, odpowiadającymi agregatowi (typowy czas zatrzymania 8-9 min), dimerowi (9-10,5 mm) i monomerowi (10,5-13,5 min), mierzy się automatycznie, a zawartość dimeru D% określa wzór

D% = [AD : (AA + AD + AM)] · 100, w którym AA, AD i AM oznaczają odpowiednio powierzchnie maksimów dla agregatu, dimeru i monomeru.

C. Próby trwałości

Ciekłe preparaty iv-IgG przechowuje się w temperaturze otoczenia (20-25°C) w zamkniętych zbiornikach przez okres 80-90 dni i pod koniec tego okresu mierzy się zawartość dimeru.

Przykład I

Do 1 dm³ wzorcowego ciekłego preparatu, wytworzonego jak w powyższym przykładzie A i zawierającego 15% białka przy pH 5,3, dodaje się 24,75 g fenyloalaniny (150 mmol/dm³, 1 mmol/g białka).

182 738

Niżej tabele 1 i 2 przedstawiają dane trwałości dla przykładu I oraz dla dodatkowych przykładów II-XVI według niniejszego wynalazku wraz z danymi dla porównawczych przykładów A-G, nie zawierających dodatków lub zawierających tylko glikokol. Tabela 3 przedstawia niżej wyniki testowania czterech ciekłych preparatów, z których każdy zawierał 12% białka, na szczurzym modelu podciśnieniowym, według przepisu Bleckera i in. (Vox Sanguinis 52, 281-290, 1987), po ich przechowywaniu w pokojowej temperaturze. Preparaty według niniejszego wynalazku (przykłady XVII-XIX) powodują jedynie 5%-18% spadku ciśnienia krwi, podczas gdy nie stabilizowane preparaty powodująjego spadek bliski 50%.