CZ285967B6

CZ285967B6 - Kapalné imunoglobulinové přípravky

Info

Publication number: CZ285967B6
Application number: CZ97684A
Authority: CZ
Inventors: René Brügger; Katharina Gennari; Gerhard Hodler; Bernard Wüst
Original assignee: Red Cross Foundation Central Laboratory Blood Transfusion Service Src
Priority date: 1994-09-08
Filing date: 1995-09-07
Publication date: 1999-12-15
Also published as: ATE246005T1; PT779818E; KR100370631B1; DE69531400T2; DK0779818T3; PL182738B1; NO971016L; FI970603A; ZA957583B; DE69531400D1; MX9701510A; JP3004729B2; PL318265A1; FI970603A0; CA2197432A1; NZ292919A; RU2158605C2; CN1157572A; HU223668B1; HUT77122A

Abstract

Imunoglobulinové přípravky, zejména kapalné přípravky imunoglobulinu G pro intravenozní infuzi, se stabilizují proti tvorbě dimeru přídavkem jednoho nebo více amfifilních stabilizátorů. Výhodné amfifilní stabilizátory jsou deriváty nikotinové kyseliny, zejména nikotinamid a přírodně se vyskytující alfa-aminokyseliny obsahující postranní lipofilní řetězec, například fenylalanin, prolin, leucin a isoleucin.ŕ

Description

Stabilizovaný kapalný imunoglobulinový přípravek

Oblast techniky

Vynález popisuje stabilní imunoglobulinové přípravky.

Dosavadní stav techniky

Je známa řada způsobů výroby imunoglobulinových přípravků, zejména interavenózně podávaných forem IgG (iv-IgG) z frakcí lidské krevní plazmy. Aby produkt mohl být podáván intravenózně, je třeba odstranit agregáty nebo zabránit tvorbě agregátů, které mají antikomplementámí účinnost a které kdyby byly intravenózně podány, mohly by dát vznik závažným vedlejším reakcím včetně anafylaktického šoku. Většina iv-IgG přípravků dostupných pro klinické použití je lyofilizována (vysušena zmrazením) pro zlepšení stability při skladování, ale tyto přípravky musí být před použitím rekonstituovány ředidlem, např. sterilní vodou nebo fyziologickým roztokem. Tato rekonstituční operace je nevýhodná a časově náročná a otevírá možnost kontaminace produktu. Je proto žádoucí vyrábět farmaceutické prostředky z iv-IgG, určené ke skladování a použití v kapalné formě (ve vodném roztoku), s potřebným stupněm stability pro toto skladování. Tyto prostředky jsou nadále označovány jako kapalné přípravky ivIgG. Některé z těchto přípravků jsou již obchodně dostupné.

I když IgG produkty pro intravenózní injekce obsahují jen velmi malá množství agregátů (trimery nebo vyšší polymery IgG molekul), mohou obsahovat poměrně velká množství dimerů IgG, což je možno zjistit například vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Tyto dimery nezpůsobují anafylaktický šok a obvykle nebyly pokládány za problém. V mnoha specifikacích produktů jsou monomery a dimery uváděny společně jako „funkční IgG“.

Tankersley a spol. (Molecular Immunology 25, 41^18,1988) zjistili, že obsah dimeru v IgG přípravcích je o to vyšší, čím více dárců přispívá do plazmové banky, ze které byl IgG získán. Dimer tedy nemůže být zjištěn v IgG získaném od jediného člověka a jeho obsah je poměrně nízký u hyperimunního IgG získaného od několika set až několika tisíc dárců, kteří byli imunizováni proti antigenu určité nemoci, zatímco dosahuje vysokých hladin v IgG připraveném z dárcovských bank o 10 000 nebo více dárcích. Autoři docházejí k závěru, že dimery IgG jsou dimery idiotyp-anti-idiotyp, které se vytvoří, když protilátka od jednoho dárce pozná oblast vázající antigen protilátky od jiného dárce a váže ji. Dimery a monomery jsou přítomné v rovnováze a obsah dimeru roste s celkovou koncentrací imunoglobulinu.

Stejní autoři zjistili, že tvorba dimeru roste s dobou skladování. Obsah dimeru typického přípravku se může zdvojnásobit během prvého týdne skladování a potom pokračovat v pomalém růstu. Je-li IgG přípravek lyofilizován krátce po přípravě, zabrání se tomu, aby došlo k tomuto zvýšení tvorby dimeru. Má-li však přípravek být skladován a použit v kapalné formě, zvýší se při skladování koncentrace dimeru.

Ke stejnému typu tvorby dimeru může dojít u jiných imunoglobulinů než IgG, například u IgA, IgD a IgE. Dále je také pozorována tvorba dimeru u přípravků monoklonálních protilátek, i když se mechanismus tvorby dimeru u monoklonálních protilátek může lišit od toho, který navrhli Tankersley a spol.

-1 CZ 285967 B6

Podstata vynálezu

Nyní bylo vynálezci zjištěno, že i když IgG dimer na rozdíl od vyšších polymerů nezpůsobuje anafylaktický šok, jsou nicméně přípravky IgG s vysokým obsahem dimeru po intravenózní injekci méně dobře tolerovány a mohou dát vznik nežádoucím vedlejším účinkům včetně horečky, nausey a někdy sníženého krevního tlaku. Hypotenzivní vedlejší účinky pozorovali na modelu krysy Bleeker a spol. (Vox Sanguinis 52, 281-290, 1987), a to také ukazuje na zřejmou souvislost s obsahem dimeru. Je proto žádoucí stabilizovat přípravky imunoglobulinů, zejména kapalné přípravky iv-IgG, proti tvorbě dimeru.

Byla použita řada přísad ke stabilizaci iv-IgG a ke zlepšení tolerance proti němu po iv-injekci. Patří k nim glycin, disacharidy, například maltóza a sacharóza, alkoholy cukrů, například sorbitol, polyethylenglykol, nebo malá množství povrchově aktivních činidel, jako je PEG-20sorbitanmonooleát nebo PEG-10-nonyloxyfenol. Jak však bylo zjištěno, žádný z těchto obvyklých stabilizátorů není schopen účinně zabránit inhibici tvorby dimeru v kapalných přípravcích iv-IgG.

Protože obsah dimeru je funkcí koncentrace IgG, je samozřejmě možné snížit obsah dimeru zředěním kapalných IgG přípravků. Tento přístup však není praktický, protože by vyžadoval infuzi nepřijatelně velkých objemů kapaliny pacientům.

Podle vynálezu je tento problém vyřešen přidáním účinného množství amfífilního stabilizátoru do imunoglobulinového prostředku.

Amfifilní stabilizátory použité podle vynálezu jsou látky, které obsahují v molekule silně nebo středně hydrofilní oblast jakož i silně nebo středně lipofilní oblast, které však nejsou tenzidy, to znamená netvoří micely ve vodném roztoku v koncentracích, při kterých se používají, ale zůstávají v monomemí formě. Amfifilní stabilizátory podle vynálezu obsahují v molekule jednu nebo více skupin zvolených z karboxylové skupiny, sulfoskupiny (vždy ve formě volné kyseliny nebo ve formě farmakologicky přijatelné soli), ketoskupiny, aldehydové skupiny, hydroxylové skupiny, aminoskupiny nebo amidové skupiny, jakož i jednu nebo více lipofilních skupin obsahujících 3 až 12 atomů uhlíku, s výhodou 4 až 10 atomů uhlíku, a popřípadě jeden atom dusíku nebo síry. Tyto skupiny jsou s výhodou zvoleny z alkylových skupin s přímým nebo rozvětveným řetězcem a aromatických, heteroaromatických, alifatických nebo heteroalifatických kruhů.

Je-li v lipofilní skupině přítomen atom dusíku, je s výhodou v terciární formě, například v pyridinovém kruhu. Výhodné necyklické lipofilní skupiny jsou rozvětvené alkylové skupiny obsahující 4 až 10, s výhodou 4 až 6 atomů uhlíku.

Samozřejmě kterákoliv sloučenina použitá jako stabilizátor musí být sama o sobě farmaceuticky přijatelná pro intravenózní injekce v použitých koncentracích. Je také výhodné, aby neměnila chemicky molekulu IgG a aby neměnila výrazně pH při hodnotách pH mezi 4 a 8.

Výhodnými stabilizátory jsou nikotinová kyselina a její deriváty, například nikotinamid, nikotinamid-N-oxid a N-methylnikotinamid, z nichž je zejména výhodný nikotinamid.

Další výhodnou skupinou amfifilních stabilizátorů je skupina přírodně se vyskytujících alfaaminokyselin, ve kterých je skupina karboxylové kyseliny nahrazena skupinou vzorce -CONH₂, -CONHR, -CH₂OH nebo -COOR, kde R znamená alkylovou skupinu obsahují 1 až 4 atomy uhlíku. Takové aminokyseliny jsou fenylalanin, methionin, leucin, isoleucin, prolin a valin, z nichž jsou výhodné fenylalanin, prolin, leucin a isoleucin, zejména pak prolin, leucin a isoleucin, a nejvýhodnější je prolin.

-2CZ 285967 B6

Japonská patentová publikace č. 61-194035 popisuje kapalné gama-globulinové přípravky, které jsou podrobeny tepelnému zpracování za přítomnosti stabilizátoru, kterým je monosacharid, disacharid nebo alkohol cukrů v množství 10 až 100 g/100 ml, a pomocného stabilizátoru, kterým může být neutrální aminokyselina, například valin, leucin nebo isoleucin nebo sůl karboxylové kyseliny.

Předmětem vynálezu je kapalný imunoglobulinový přípravek, zejména kapalný přípravek imunoglobulinu G pro intravenózní injekce, obsahující jeden nebo více shora definovaných amfífilních stabilizátorů v celkovém množství nejméně 0,2 mmol na gram imunoglobulinu a v celkové koncentraci nejméně 20 mmol/litr, přičemž nejméně jeden amfifílní stabilizátor je nikotinová kyselina nebo derivát nikotinové kyseliny.

Kapalné přípravky iv-IgG stabilizované proti tvorbě dimerů pomocí výše definovaných amfifilních stabilizátorů se výhodně nepodrobují tepelnému zpracování nad 50 °C a lze je výhodně lyofílizovat.

Výhodnými stabilizátory jsou prostředky obsahující nikotinamid společně s jednou nebo více shora uvedenými amfífilními aminokyselinami nebo jejich deriváty. Výhodnější stabilizátory obsahují nikotinamid a prolin, popřípadě společně s jednou nebo více dalšími amfífilními aminokyselinami. Zejména výhodné prostředky jsou směsi (a) nikotinamidu a prolinu, (b) nikotinamidu, prolinu a isoleucinu a (c) nikotinamidu, prolinu, isoleucinu a leucinu. V těchto prostředcích je molámí poměr nikotinamidu k celkovým amfifilním aminokyselinám s výhodou mezi 1 : 1 a 1:4. Nejvýhodnější prostředek je směs nikotinamidu, prolinu a isoleucinu, s výhodou v molámím poměru 1 : (0,8 - 2,0) : (0,8 - 2,0).

Imunoglobulin stabilizovaný podle vynálezu může být libovolný přípravek IgA, IgD, IgE nebo IgG, jak polyklonální, tak monoklonální a jak izolovaný z lidské nebo zvířecí krevní plazmy, tak také vyrobený jinými způsoby, například hybridomem nebo technologií rekombinantní DNA.

výhodou je to přípravek IgG z lidské krevní plazmy, který byl zpracován tak, aby mohl být aplikován injekčně, a který je určen ktomu, aby byl skladován a použit v kapalné formě. Výhodněji to je polyvalentní, intaktní imunoglobulin, který nebyl rozštěpen (například vysokými koncentracemi pepsinu) a který si zachovává strukturální a funkční integritu 7S-IgG protilátek, včetně intaktní oblasti Fc. Výhodně se získává z frakcí krevního séra modifikovanou alkoholickou kryoprecipitací včetně zpracování nízkými koncentracemi pepsinu při pH 4.

Obsah imunoglobulinu, s výhodou IgG, v kapalném přípravku je mezi 3% a 16% hmotn., výhodně mezi 6 % a 12 %. pH roztoku má s výhodou hodnotu od 5 do 8, výhodněji od 5 do 6, zejména od 5,2 do 5,4. Při těchto poměrně kyselých hodnotách pH je důležité, aby roztok měl nízkou kapacitu pufru, aby se zamezilo jakémukoliv podstatnému snížení pH krve příjemce po intravenózní injekci. Tonicita roztoku může být upravena na fyziologické hodnoty přídavkem jedné nebo více nepufrovacích látek, například chloridu sodného, glycinu, sacharózy, maltózy a sorbitolu. Takové kapalné přípravky se mohou aplikovat intravenózní infuzí například v dávkách 0,2 až 1,0 g IgG na kg tělesné hmotnosti za den.

Množství amfífilního stabilizátoru přítomného v prostředku podle vynález činí s výhodou 0,2 až mmol na gram IgG, výhodněji 1 až 3 mmol/g IgG. Imunoglobulinové přípravky mohou obsahovat také jiné proteiny, například albumin.

Kapalný iv-IgG přípravek podle vynálezu obsahující amfifílní stabilizátor může být skladován až 2 roky při teplotách mezi 2 °C a 25 °C, aniž by obsah dimeru stoupl na nepřijatelné hladiny. Takovéto přípravky jsou dobře tolerovány po intravenózní injekci.

-3 CZ 285967 B6

Roztoky iv-IgG, které jsou určeny k tomu, aby byly lyofilizovány a prodávány v pevné lyofilizované formě, mohou být též stabilizovány, přídavkem amfífilních stabilizátorů podle vynálezu tak, aby se omezila tvorba dimeru v době mezi přípravou a lyofilizací.

Příklady provedení vynálezu

Vynález ilustrují následující příklady.

A. Preparativní postup pro přípravu kapalného přípravku iv-IgG

Surová pasta IgG, získaná alkoholickou frakcionací lidské krevní plazmy, odebrané od většího počtu dárců, se rozpustí při 4 °C ve sterilní vodě a zfiltruje se. Roztok se okyselí na pH 4 a inkubuje se s malým množstvím pepsinu při pH 4 a 37 °C a pak se zneutralizuje. Produkt se diafiltruje k odstranění eventuálně zbývajícího alkoholu, pak se pH upraví na hodnotu 5,3 a roztok se zkoncentruje ultrafiltrací, čímž se získá konečná koncentrace proteinu 6 % až 15 % hmotnost/objem.

Produkt může být také připraven, jak popsáno ve švýcarském patentu č. 684 164.

B. Měření obsahu dimeru

Produkt se analyzuje pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie na Hewlett Packardu HP 1090, použitím kolony TS G3000SW-XL o rozměrech 7,8x300 mm s mobilní fází 0,04 M fosfátového pufru a 0,2 M chloridu sodného při pH 7,0. Průtoková rychlost činí 0,7 ml/minuta. Použije se vzorek 1,3 μΐ ze 150mg/ml roztoku a protein se zjišťuje ultrafialovou absorpcí při 280 nm. Oblasti píků odpovídající agregátu (typický retenční čas 8 až 9 minut), dimeru (9 až 10,5 minut) a monomeru (10,5 až 13,5 minut) se zředí automaticky a obsah dimeru je dán rovnicí

AD

D % =-------------x 100

AA + AD + AM kde AA, AD a AM jsou oblasti píků agregátu, dimeru a monomeru.

C. Testy stability

Kapalné přípravky iv-IgG se skladují při teplotě místnosti (20 až 25 °C) v zatavených obalech po dobu 80 až 90 dní a na konci této doby se změří obsah dimeru.

Příklad 1

K 1 litru standardního kapalného přípravku, připraveného jako v A shora a obsahujícího 15 % proteinu a který má hodnotu pH 5,3, se připraví 24,75 g fenylalaninu (150mmol/l, 1 mmol/g proteinu).

Údaje o stabilitě pro příklad 1 a pro dodatečné příklady 2 až 16 podle vynálezu, společně se srovnávacími příklady A až G neobsahujícími žádné přísady nebo obsahujícími pouze glycin, jsou uvedeny v níže uvedených tabulkách 1 a 2. Tabulka 3 obsahuje výsledky testování čtyř kapalných přípravků, z nichž každý obsahuje 12% proteinu, na modelu hypotenzivní krysy, popsaného Bleekerem a spol. (Vox sanguinis 52, 281 až 290, 1987), po skladování při teplotě

-4CL 285967 B6 místnosti. Přípravky podle vynálezu (příklady 17 až 19) způsobily jen 5% a 18% pokles krevního tlaku, zatímco nestabilizovaný přípravek způsobil pokles téměř 50%.

Tabulka 1

Obsah dimeru po 80 dnech skladování

Příklad Přísady	Koncentrace přísady (mmol/1)	Koncentrace proteinu (% hmot./obj.)	Obsah dimeru
A	žádná	-	15	20,2 %
1	fenylalanin	150	15	14,7 %
2	fenylalaninamid	150	15	12,5 %
3	fenylalaninol (2-amino-3-fenyl1-propanol)	150	15	13,1 %
4	2-fenylethylamin	150	15	11,7%
B	žádná	-	12	17,7%
5	nikotinamid	120	12	12,5%
6	kys. nikotinová	120	12	13,3 %
7	nikotinamid +	120	12	10,3 %
	fenylalanin	120

Tabulka 2

Obsah dimeru po 90 dnech skladování

Příklad Přísady	Koncentrace přísady (mmol/1)	Koncentrace proteinu (% hmot./obj.)	Obsah dimeru
C	žádná	—	15	18,0%
D	glycin	300	15	17,4%
8	glycin	200	15	12,6 %
	fenylalanin	140
9	glycin	200	15	10,7 %
	nikotinamid	150
E	žádná	-	6	11,4%
F	glycin	300	6	11,2%
10	glycin	300	6	9,3 %
	fenylalanin	60
11	glycin	300	6	8,7 %
	nikotinamid	60
12	methionin	60	6	9,8 %
	leucin	60
G	žádná	—	12	17,5%
13	prolin	200	12	10,6 %
	nikotinamid	100
14	prolin	100	12	10,0%
	leucin	60
	isoleucin	60
	nikotinamid	100

-5CZ 285967 B6

Tabulka 2 - pokračování

Příklad Přísady	Koncentrace přísady (mmol/1)	Koncentrace proteinu (% hmot./obj.)	Obsah dimeru
15 prolin	120	12	10,1 %
leucin	80
isoleucin	80
nikotinamid	80
16 prolin	100	12	(pouze 70 dní)
isoleucin	120		94%
nikotinamid	100
glycin	40

Tabulka 3

Claims

Obsah dimeru a pokles tlaku na modelu krysy

Příklad Přísady Koncentrace (mmol/1) Protein konc. (% hmotnost/objem) Obsah dimeru (%) Pokles krevního tlaku (%) G žádná — 12 16,0 49 17 glycin 100 12 7,8 5 fenylalanin 120 nikotinamid 120 18 prolin 200 12 8,4 18 nikotinamid 100 19 prolin 100 12 7,9 6 leucin 60 isoleucin 60 nikotinamid 100

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Stabilizovaný kapalný imunoglobulinový přípravek obsahující jeden nebo více netenzidních amfífílních stabilizátorů, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden stabilizátor obsahující v molekule jednu nebo více skupin zvolených z karboxylové skupiny, sulfoskupiny, ketoskupiny, aldehydové skupiny, hydroxylové skupiny, aminoskupiny nebo amidové skupiny, jakož i jednu nebo více lipofilních skupin obsahujících 3 až 12 atomů uhlíku a popřípadě jeden atom dusíku nebo síiy, v celkovém množství nejméně 0,2 mmol na gram imunoglobulinu a v celkové koncentraci nejméně 20 mmol/litr, přičemž nejméně jeden amfifilní stabilizátor je nikotinová kyselina nebo derivát nikotinové kyseliny, a 3 až 16% hmotn. imunoglobulinu, vztaženo na celkovou hmotnost přípravku.

2. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jím je kapalný přípravek imunoglobulinu G pro intravenózní injekce.
3. Přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že derivátem nikotinové kyseliny je nikotinamid.

-6CZ 285967 B6
4. Přípravek podle libovolného z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň dva netenzidní amfifilní stabilizátory, přičemž nejméně jeden z amfifilních stabilizátorů je zvolen z fenylalaninu, methioninu, leucinu, isoleucinu, prolinu, valinu nebo derivátu kteréhokoliv z nich, ve kterém je karboxylová skupina nahrazena skupinou vzorce -CONH₂, -CONHR, -CH₂OH nebo -COOR, kde R je alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku.
5. Přípravek podle nároku 4, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň dva netenzidní amfifilní stabilizátory, přičemž nejméně jeden amfifilní stabilizátor je zvolen z prolinu, leucinu a isoleucinu.
6. Přípravek podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje prolin a případně další amfifilní aminokyseliny, a nikotinamid.
7. Přípravek podle nároku 6, vyznačující se tím, ke všem amfifilním aminokyselinám je mezi 1 : 1 a 1 : 4.
8. Přípravek podle nároku 7, vyznačující se tím, a isoleucin jako jediné amfifilní stabilizátory.

že molámí poměr nikotinamidu že obsahuje nikotinamid, prolin
9. Přípravek podle nároku 8, vyznačující se tím, že nikotinamid, prolin a isoleucin jsou přítomné v molámím poměru 1 : (0,8 až 2,0) : (0,8 až 2,0).
10. Kapalný přípravek podle kteréhokoliv z nároků 2 až 9, vyznačující se tím, že má hodnotu pH mezi 5 a 6.