SK282332B6

SK282332B6 - Kvapalné imunoglobulínové prípravky a spôsob stabilizácie týchto prípravkov

Info

Publication number: SK282332B6
Application number: SK300-97A
Authority: SK
Inventors: Ren� Br�Gger; Katharina Gennari; Gerhard Hodler; Bernard W�St
Original assignee: Zlb Bioplasma Ag
Priority date: 1994-09-08
Filing date: 1995-09-07
Publication date: 2002-01-07
Also published as: CZ285967B6; CN1157572A; CA2197432C; PT779818E; FI970603A; AU700788B2; SK30097A3; ATE246005T1; EP0779818B1; DK0779818T3; HU223668B1; IL115226A; KR100370631B1; US5871736A; DE69531400T2; RO118568B1; FI970603A0; CZ68497A3; PL318265A1; EP0779818A1

Abstract

Imunoglobulínové prípravky, hlavne kvapalné prípravky imunoglobulínu G na intravenóznu infúziu, sa stabilizujú proti tvorbe diméru prídavkom jedného alebo viacerých amfifilných stabilizátorov. Výhodné amfifilné stabilizátory sú deriváty kyseliny nikotínovej, hlavne nikotínamid a prírodne sa vyskytujúce alfa-aminokyseliny obsahujúce vedľajší lipofilný reťazec, napríklad fenylalanín, prolín, leucín a izoleucín.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka stabilných imunoglobulínových prípravkov.

Doterajší stav techniky

Je známe množstvo spôsobov výroby imunoglobulínových prípravkov, hlavne intravenózne podávaných foriem IgG (iv-IgG) z frakcií ľudskej krvnej plazmy. Aby produkt mohol byť podávaný intravenózne, je potrebné odstrániť agregáty alebo zabrániť tvorbe agregátov, ktoré majú antikomplementámu účinnosť a ktoré, pokiaľ by boli intravenózne podané, mohli by spôsobiť vznik závažných vedľajších reakcií vrátane anaíýlaktického šoku. Väčšina iv-IgG prípravkov dostupných na klinické použitie sa lyofilizuje (vysuší zmrazením) na zlepšenie stability pri skladovaní, ale tieto prípravky sa musia pred použitím rekonštituovať riedidlom, napríklad sterilnou vodou alebo fyziologickým roztokom. Táto rekonštitučná operácia je nevýhodná a časovo náročná a dáva možnosť kontaminácie produktu. Je preto žiaduce vyrábať farmaceutické prostriedky z iv-IgG, určené na skladovanie a použitie v kvapalnej forme (vo vodnom roztoku), s potrebným stupňom stability na toto skladovanie. Tieto prostriedky sú ďalej označované ako kvapalné prípravky iv-IgG. Niektoré z týchto prípravkov sú už obchodne dostupné.

Aj keď IgG produkty na intravenózne injekcie obsahujú len veľmi malé množstvá agregátov (triméry alebo vyššie polyméry IgG molekúl), môžu obsahovať pomerne veľké množstvá dimérov IgG, čo je možné zistiť napríklad vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou. Tieto diméry nespôsobujú anafylaktický šok a zvyčajne neboli pokladané za problém. V mnohých špecifikáciách produktov sú monoméry a diméry uvádzané spoločne ako „funkčné IgG“.

Tankersley a spol. (Molecular Immunology 25, 41-48, 1988) zistili, že obsah diméru v IgG prípravkoch je o to vyšší, čim viac darcov prispieva do plazmovej banky, z ktorej bol IgG získaný. Dimér teda nemôže byť zistený v IgG získanom od jediného človeka a jeho obsah je pomerne nízky pri hyperimúnnom IgG získanom od niekoľko sto až niekoľko tisíc darcov, ktorí boli imunizovaní proti antigénu určitej choroby, zatiaľ čo dosahuje vysoké hladiny v IgG pripravenom z darcovských bánk s 10 000 alebo viac darcami. Autori prichádzajú k záveru, že diméry IgG sú diméry idiotyp-anti-idiotyp, ktoré sa vytvoria, keď protilátka od jedného darcu pozná oblasť viažucu antigén protilátky od iného darcu a viaže ju. Diméry a monoméry sú prítomné v rovnováhe a obsah diméru rastie s celkovou koncentráciou imunoglobulínu.

Rovnakí autori zistili, že tvorba diméru rastie s časom skladovania. Obsah diméru typického prípravku sa môže zdvojnásobiť počas prvého týždňa skladovania a potom pokračovať v pomalom raste. Ak je IgG prípravok lyofllizovaný krátko po príprave, zabráni sa tomu, aby došlo k tomuto zvýšeniu tvorby diméru. Ak má byť však prípravok skladovaný a použitý v kvapalnej forme, zvýši sa pri skladovaní koncentrácia diméru.

K rovnakému typu tvorby diméru môže prísť pri iných imunoglobulínoch ako IgG, napríklad IgA, IgD a IgE. Ďalej sa tiež pozoruje tvorba diméru pri prípravkoch monoklonálnych protilátok, aj keď sa mechanizmus tvorby diméru pri monoklonálnych látkach môže líšiť od toho, ktorý navrhli Tankersley a spol.

Podstata vynálezu

Teraz autori vynálezu zistili, že i keď IgG dimér na rozdiel od vyšších polymérov nespôsobuje anafylaktický šok, sú predsa len prípravky IgG s vysokým obsahom diméru po intravenóznej injekcii menej dobre znášané a môžu spôsobiť vznik nežiaducich vedľajších účinkov vrátane horúčky, nauzey a niekedy zníženie krvného tlaku. Hypotézne vedľajšie účinky pozorovali na modeli krysy Bleeker a spol. (Vox Sanguinis 52,281-290,1987), a to tiež ukazuje na zrejmú súvislosť s obsahom diméru. Je preto žiaduce stabilizovať prípravky imunoglobulínov, hlavne kvapalné prípravky iv-IgG, proti tvorbe diméru.

Použilo sa množstvo prísad na stabilizáciu iv-IgG a na zlepšenie znášanlivosti proti nemu po iv-injekcii. Patria k nim glycín, disacharidy, napríklad maltóza a sacharóza, alkoholy cukrov, napríklad sorbitol, polyetylénglykol, alebo malé množstvá povrchovo aktívnych činidiel, ako je PEG-20-sorbitan-monooleát alebo PEG-10-nonyloxyfenol. Ako sa však zistilo, žiadny z týchto zvyčajných stabilizátorov nie je schopný účinne zabrániť inhibícii tvorby diméru v kvapalných prípravkoch iv-IgG.

Pretože obsah diméru je funkciou koncentrácie IgG, samozrejme sa môže znížiť obsah diméru zriedením kvapalných IgG prípravkov. Tento postup však nie je praktický, pretože by vyžadoval neprijateľne veľké objemy kvapaliny na infúziu pre pacientov.

Podľa vynálezu sa tento problém vyriešil pridaním účinného množstva amfifilného stabilizátora do imunoglobulínového prostriedku.

Amfifilné stabilizátory použité podľa vynálezu sú látky, ktoré obsahujú v molekule silne alebo stredne hydrofilnú oblasť, ako aj silne alebo stredne lipofilnú oblasť, ktoré však nie sú tenzidy, to znamená netvoria micely vo vodnom roztoku v koncentráciách, pri ktorých sa používajú, ale zostávajú v monomémej forme. Amíifilné stabilizátory podľa vynálezu obsahujú v molekule jednu alebo viac skupín zvolených z karboxylovej kyseliny, sulfónovej kyseliny, kyseliny fosforečnej (všetky vo forme voľnej kyseliny alebo vo forme farmakologicky prijateľnej soli), ketoskupiny, aldehydy, hydroxylové skupiny, aminoskupiny alebo amidové skupiny, ako aj jedna alebo viac lipofilných skupín obsahujúcich 3 až 12 atómov uhlíka, výhodne 4 až 10 atómov uhlíka, a prípadne jeden atóm dusíka alebo síry. Tieto skupiny sú výhodne zvolené z alkylových skupín s priamym alebo rozvetveným reťazcom, alkenylových skupín s priamym alebo rozvetveným reťazcom a aromatických, heteroaromatických, alifatických alebo heteroalifatických kruhov.

Ak je v lipofilnej skupine prítomný atóm dusíka, je výhodne v terciámej forme, napríklad v pyridinovom kruhu. Výhodne necyklické lipofilné skupiny sú rozvetvené alkylové skupiny obsahujúce 4 až 10, výhodne 4 až 6 atómov uhlíka.

Samozrejme ktorákoľvek zlúčenina použitá ako stabilizátor musí byť sama osebe farmaceutický prijateľná na intravenózne injekcie v použitých koncentráciách. Je tiež výhodné, aby nemenila chemicky molekulu IgG a aby nemenila výrazne pH pri hodnotách pH medzi 4 a 8.

Výhodnými stabilizátormi sú nikotínová kyselina a jej deriváty, napríklad nikotínamid, nikotínamid-N-oxid a N'-metyl-nikotínamid, z ktorých je hlavne výhodný nikotínamid.

Ďalšou výhodnou skupinou amfifilných stabilizátorov je skupina prírodné sa vyskytujúcich α-aminokyselín, v ktorých je skupina karboxylovej kyseliny nahradená skupinou vzorca -CONHR₂, -CONHR, -CH₂OH alebo -COOR,

SK 282332 Β6 kde R znamená alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až 4 atómy uhlíka. Takéto aminokyseliny sú fenylalanín, metionín, leucín, izoleucin, prolin a valín, z ktorých sú výhodné fenylalanín, prolín, leucín a izoleucin, ale hlavne prolin, leucín a izoleucin a najvýhodnejší je prolin.

Japonská patentová publikácia č. 61-194 035 opisuje kvapalné γ-globulínové prípravky, ktoré sú podrobené tepelnému spracovaniu za prítomnosti stabilizátora, ktorým je monosacharid, disacharid alebo alkohol cukrov v množstve 10 až 100 g/100 ml, a pomocného stabilizátora, ktorým môže byť neutrálna aminokyselina, napríklad valín, leucín alebo izoleucin, alebo soľ karboxylovej kyseliny.

Predmetom vynálezu je kvapalný imunoglobulínový prípravok, hlavne kvapalný prípravok imunoglobulínu G na intravenózne injekcie, obsahujúci jeden alebo viac definovaných amftfilných stabilizátorov v celkovom množstve najmenej 0,2 mmol/g imunoglobulínu a v celkovej koncentrácii najmenej 20 mmol/1, za predpokladu, že keď prípravok obsahuje 100 g/1 alebo viac monosacharidu, disacharidu alebo alkoholu cukru, potom je najmenej jeden amfifilný stabilizátor iný ako neutrálna aminokyselina alebo soľ karboxylovej kyseliny a je výhodne zvolený z nikotínovej kyseliny a jej derivátov.

Výhodnými stabilizátormi sú prostriedky obsahujúce nikotínamid spoločne s jednou alebo viacerými uvedenými amfiftlnými aminokyselinami alebo ich derivátmi. Výhodnejšie stabilizátory obsahujú nikotínamid a prolin, prípadne spoločne s jednou alebo viacerými ďalšími amfifilnými aminokyselinami. Hlavne výhodné prostriedky sú zmesi a) nikotínamidu a prolínu, b) nikotinamidu, prolínu a izoleucínu a c) nikotínamidu, prolínu, izoleucínu a leucínu. V týchto prostriedkoch je molámy pomer nikotinamidu k celkovým amfifilným aminokyselinám výhodne medzi 1 : 1 a 1 : 4. Najvýhodnejší prostriedok je zmes nikotinamidu, prolínu a izoleucínu, výhodne v molámom pomere 1: (0,8-2,0): (0,8-2,0).

Imunoglobulín stabilizovaný podľa vynálezu môže byť ľubovoľný prípravok IgA, IgD, IgE alebo IgG, ako polyklonálny alebo monoklonálny a ako izolovaný z ľudskej alebo zvieracej krvnej plazmy, taktiež vyrobený inými spôsobmi, napríklad hybridómom alebo technológiou rekombinantnej DNA. Výhodne je to prípravok IgG z ľudskej krvnej plazmy, ktorý bol spracovaný tak, aby sa mohol aplikovať injekčné, a ktotý je určený na to, aby bol skladovaný a použitý v kvapalnej forme. Výhodnejšie to je polyvalentný, intaktný imunoglobulín, ktorý nebol rozštiepený (napríklad vysokými koncentrácia pepsínu) a ktorý si zachováva štrukturálnu a funkčnú integritu 7S-IgG protilátok vrátane intaktnej oblasti Fc. Výhodne sa získava z frakcie krvného séra modifikovanou alkoholickou kryoprecipitáciou vrátane spracovania nízkymi koncentráciami pepsínu pri pH 4.

Obsah IgG v kvapalnom prípravku je výhodne medzi 3 % a 16 %, výhodnejšie medzi 6 % a 12 %. Hodnota pH roztoku je výhodne od 5 do 8, výhodnejšie od 5 do 6, hlavne od 5,2 do 5,4. Pri týchto pomerne kyslých hodnotách pH je dôležité, aby roztok mal nízku kapacitu pufra, aby sa zabránilo akémukoľvek podstatnému zníženiu pH krvi príjemcu po itravenóznej injekcii. Tonicita roztoku sa môže upraviť na fyziologické hodnoty prídavkom jednej alebo viacerých nepufrovaných látok, napríklad chloridu sodného, glycínu, sacharózy, maltózy a sorbitolu. Takéto kvapalné prípravky sa môžu aplikovať intravenóznou infúziou napríklad v dávkach 0,2 až 1,0 g IgG na kg telesnej hmotnosti za deň.

Množstvo amfifilného stabilizátora prítomného v prostriedku podľa vynálezu je výhodne 0,2 až 6 mmol/g IgG, výhodnejšie l až 3 mmol/g IgG. Imunoglobulínové prí pravky môžu obsahovať tiež iné proteíny, napríklad albumín.

Kvapalný iv-IgG prípravok podľa vynálezu obsahujúci amfifilný stabilizátor sa môže skladovať až 2 roky pri teplote medzi 2 °C a 25 °C, bez zvýšenia obsahu diméru na neprijateľnú hladinu. Takéto prípravky sú dobre znášané po intravenóznej injekcii.

Roztoky iv-IgG, ktoré sú určené na to, aby boli lyofilizované a predávané v pevnej lyofilizovanej forme, sa môžu tiež stabilizovať prídavkom amfifilných stabilizátorov podľa vynálezu tak, aby sa obmedzila tvorba diméru v období medzi prípravou a lyoftlizáciou.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález ilustrujú nasledujúce príklady.

A. Preparativny postup na prípravu kvapalného prípravku iv-IgG

Surová pasta IgG, získaná alkoholickou frakcionáciou ľudskej krvnej plazmy, odobranej od väčšieho počtu darcov, sa rozpustí pri 4 °C v sterilnej vode a prefiltruje sa. Roztok sa okyslí na pH 4 a inkubuje sa s malým množstvom pepsínu pri pH 4 a 37 °C, a potom sa zneutralizuje. Produlď sa diafiltruje na odstránenie eventuálne zostávajúceho alkoholu, potom sa pH upraví na hodnotu 5,3 a roztok sa skoncentruje ultrafiltráciou, čím sa získa konečná koncentrácia proteínu 6 % až 15 % hmotn./obj.

Produkt sa môže tiež pripraviť, ako je opísané v švajčiarskom patente č. 684 164.

B. Meranie obsahu diméru

Produkt sa analyzuje pomocou vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie na Hewlett Packard HP 1090, použitím kolóny TS G3000SW-XL s rozmermi 7,8 x 300 mm s mobilnou fázou 0,04 M fosfátového pufra a 0,2 M chloridu sodného pri pH 7,0. Prietoková rýchlosť je 0,7 ml/minúta. Použije sa vzorka 1,3 μΐ zo 150 mg/ml roztoku a proteín sa zisťuje ultafialovou absorpciou pri 280 nm. Oblasti píkov zodpovedajúceho agregátu (typický retenčný čas 8 až 9 minút) diméru (9 až 10,5 minút) a monoméru (10,5 až 13,5 minút) sa zmeria automaticky a obsah diméru je daný rovnicou

AD

D% =---—---x 100

AA+AD+AM kde AA, AD a AM sú oblasti píkov agregátov, diméru a monoméru.

C. Testy stability

Kvapalné prípravky iv-IgG sa skladujú pri teplote miestnosti (20 až 25 °C) v zatavených obaloch počas 80 až 90 dni a na konci tohto obdobia sa zmeria obsah diméru.

Príklad 1

Do litra štandardného kvapalného prípravku, pripraveného ako v A hore a obsahujúceho 15 % proteínu, a ktorý má hodnotu pH 5,3, sa pridá 24,75 g fenylalanínu (150 mmol/1, mmol/g proteínu).

Údaje o stabilite pre príklad 1 a pre dodatočné príklady až 16 podľa vynálezu, spoločne s porovnávacími príkladmi A až G neobsahujúcimi žiadne prísady alebo obsahujúcimi len glycín, sú uvedené v ďalej uvedených tabuľkách 1 a 2. Tabuľka 3 obsahuje výsledky testovania štyroch kvapalných prípravkov, z ktorých každý obsahuje 12 % proteínu, na modely hypotenzívnej krysy, opísanom Blee kerom a spol. (Vox sanguinis 52, 281-290, 1987), po skladovaní pri teplote miestnosti. Prípravky podľa vynálezu (príklady 17 až 19) spôsobili len 5 až 18 % pokles krvného tlaku, zatiaľ čo nestabilizovaný prípravok spôsobil pokles takmer 50 %.

Tabuľka 1

Obsah diméru po 80 dňoch skladovania

Pr.	Prísady	Koncentrácia prísady (mmol/1)	Koncentrácia proteínu hmotn./obj	Obsah diméru
A	žiadna	-	15	20,2 %
1	fenylalanín	150	15	14,7 %
2	fenyialanínamid	150	15	12,5 %
3	fenylalaninol (2-amino-3-fenyl-l-propanol)	150	15	13,1 %
4	2-fenyletylamín	150	15	11,7%
B	žiadna	-	12	17,7 %
5	nikotínamid	120	12	12,5 %
6	kys. nikotínová	120	12	13,3 %
7	nikotínamid + + fenylalanín	120 120	12	10,3 %

Tabuľka 2

Obsah diméru po 90 dňoch skladovania

Pr.	Prísady	Koncentrácia prísady (mmol/1)	Koncentrácia proteínu hmotn./obi.	Obsah diméru
C	žiadna	-	15	18,0%
D	glycín	300	15	17,4%
8	glycín fenylalanín	200 140	15	12,6%
9	glycín nikotínamid	200 150	15	10,7%
E	žiadna	-	6	11,4%
F	glycín	300	6	11,2%
10	glycín fenylalanín	300 60	6	9,3 %
11	glycín nikotínamid	300 60	6	8,7 %
12	metionín leucín	60 60	6	9,8 %
G	žiadna	-	12	17,5%
13	prolín nikotínamid	200 100	12	10,6 %
14	prolín leucín izoleucín nikotínamid	100 60 60 100	12	10,0 %
15	prolín leucín izoleucín nikotínamid	120 80 80 80	12	10,1 %
16	prolín izoleucín nikotínamid glycín	100 120 100 40	12	(len 70 dní) 9,4 %

Tabuľka 3

Obsah diméru a pokles tlaku na modeli krysy

Pr.	Prísady	Koncentr. (mmol/1)	Protein kone. (% hmotn. /obj.)	Obsah diméru (%)	Pokles krvného tlaku (%)
G	žiadna	-	12	16,0	49
17	glycín fenylalanín nikotínamid	100 120 120	12	7,8	5
18	prolín nikotínamid	200 100	12	8,4	18
19	prolín leucín izoleucín nikotínamid	100 60 60 100	12	7,9	6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kvapalný imunoglobulínový prípravok obsahujúci jeden alebo viac netenzidných amfifilných stabilizátorov, vyznačujúci sa tým, že tieto stabilizátory obsahujú v molekule jednu alebo viac skupín zvolených z kyseliny karboxylovej, kyseliny sulfónovej, ketoskupiny, aldehydu, hydroxylovej skupiny, aminoskupiny alebo amidovej skupiny, ako aj jednu alebo viac lipofilných skupín obsahujúcich 3 až 12 atómov uhlíka a prípadne jeden atóm dusíka alebo síry v celkovom množstve najmenej 0,2 mmol/g imunoglobulínu a v celkovej koncentrácii najmenej 20 mmol/1, pričom najmenej jeden amfifilný stabilizátor je kyselina nikotínová alebo derivát kyseliny nikotínovej.
2. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že je to kvapalný prípravok imunoglobulínu G na intravenózne injekcie.
3. Prípravok podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že derivátom kyseliny nikotínovej je nikotínamid.
4. Prípravok podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že najmenej jeden z amfifilných stabilizátorov je zvolený z fenylalanínu, metionínu, leucínu, izoleucínu, prolínu, valínu alebo derivátu ktoréhokoľvek z nich, v ktorom je skupina karboxylovej kyseliny nahradená skupinou -CONH₂, -CONHR, -CH₂OH alebo -COOR, kde R je alkylová skupina obsahujúca 1 až 4 atómy uhlíka.
5. Prípravok podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že najmenej jeden amfifilný stabilizátor je zvolený z prolínu, leucínu a izoleucínu.
6. Prípravok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že obsahuje prolín a nikotínamid.
7. Prípravok podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že molámy pomer nikotínamidu ku všetkým amfifilným aminokyselinám je medzi 1:1 a 1 :4.
8. Prípravok podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nikotínamid, prolín a izoleucín ako jediné amfifilné stabilizátory.
9. Prípravok podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že uvedené stabilizátory sú prítomné v molámom pomere 1 : (0,8-2,0): (0,8-2,0).
10. Kvapalný prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2až 9, vyznačujúci sa tým, že má pH medzi 5 a 6.
11. Spôsob stabilizácie kvapalných prípravkov iv-IgG proti tvorbe diméru pri skladovaní pri teplote medzi 2 °C a

SK 282332 Β6

25 °C, pri ktorom sa k prípravku pridá najmenej 20 mmol/1 jedného alebo viacerých netenzidných amflfilných stabilizátorov, vyznačujúci sa tým, že tieto stabilizátory obsahujú v molekule jednu alebo viac skupín zvolených z kyseliny karboxylovej, kyseliny sulfónovej, ketoskupiny, aldehydu, hydroxylovej skupiny, aminoskupiny alebo amidovej skupiny, ako aj jednu alebo viac lipofilných skupín obsahujúcich 3 až 12 atómov uhlíka a prípadne jeden atóm dusíka alebo síry, v celkovom množstve najmenej 0,2 mmol/g imunoglobulínu, pričom najmenej jeden amfifilný stabilizátor je nikotínová kyselina alebo derivát kyseliny nikotínovej.
12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že prípravok sa podrobí tepelnému spracovaniu pri teplotách do 50 °C.
13. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že stabilizovaný kvapalný prípravok sa ďalej podrobí lyofilizácii.