PL176653B1 - Wektor ekspresyjny i sposób otrzymywania polipeptydów heterologicznych w komórkach Halobacteria - Google Patents

Abstract

1. Wektor ekspresyjny stosowany do wytwarzania polipeptydów heterologicznych w gospodarzu ha lobakteryjnym, znamienny tym, ze zawiera regulatory transkrypcji i translacji DNA dla indukowanych ekspresji DNA w pozycji 3' tych regulatorów; DNA kodujace polipeptydy heterologiczne w pozycji 3' od opisanych regionów regulatorowych DNA; DNA kodujace sygnaly stop dla transkrypcji i translacji w pozy- cji 3' od opisanego heterologicznego DNA. ( 1 2 ) OPIS PATENTOWY ( 1 9 ) PL (21) Numer zgloszenia: 310557 (2 2) Data zgloszenia: 28.02.1994 (86) Data i numer zgloszenia miedzynarodowego: 28.02.1994, PCT/US94/02388 (87) Data i numer publikacji zgloszenia miedzynarodowego: 29.09.1994, W094/21789, PCT Gazette nr 22/94 PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiot wynalazku dotyczy opracowania i stosowania systemu ekspresji genów w halobakteriach, umożliwiającego wytwarzanie rozpuszczalnych i śródbłonowych polipeptydów heterologicznych, które u halobakterii nie występują endogennie.

Halobakterie w naturalnym środowisku występują w parujących słonych jeziorach, w warunkach silnego naświetlenia i niskiego wysycenia tlenem. Zawierają one wyraźne, jaskrawe barwniki (pigmenty), tj. barwnik pomarańczowo-czerwony, bakterioruberinę lub fragmenty tzw. błony purpurowej. Halobakterie należą do filogenetycznie oddzielnej grupy organizmów prokariotycznych - Archaebacteria (Archaea), które są równie słabo spokrewnione z eubakteriami jak te ostatnie z organizmami eukariontycznymi.

Archebakterie wykazują niektóre własności wspólne z eukariontami i eubakteriami, jak również niektóre cechy, które są specyficzne wyłącznie dla nich. Na przykład archebakterie posiadają podobny do eukariontycznego aparat transkrypcyjny z 7-12 jednostkami polimerazy RNA, które są immunologicznie spokrewnione z polimerazami eukariotycznymi RNA (1), a struktury promotora zbliżone są do struktur RNA Pol II (2). Z drugiej strony archebakterie wykazują prokariontyczną morfologię komórkową i mają23S, 16S i 5S rRNA z genami kodującymi rRNA rozmieszczonymi w sposób podobny do operonu eubakterii. Warto zauważyć, że archebakterie mają unikalną kompozycję błon.

Bakteriorodopsyna (BR) występuje jako pojedyncza proteina w wyspecjalizowanych krystalicznych fragmentach błony purpurowej u halobakterii. Synteza BR jest indukowana dużą intensywnością światła i niskim ciśnieniem tlenu, a fragmenty purpurowej błony mogą stanowić do 50% powierzchni komórki archebakterii Halobacterioum halobium.

BR składa się z kompleksu jednej proteiny (bacterio-opsyna) i chromoforu retynalowego, w stosunku stechiometiycznym 1:1. Kompleks ten jest osadzony w matrix lipidowej jako

176 653 siedem śródbłonowych hydrofobowych α-helis w konfiguracji trimerycznej (5). Retynal jest kowalencyjnie związany z lizyną w pozycji 216. Lizyna ta występuje w jednej trzeciej regionu śródbłonowego jednej z α-helis (6). Kompleks bakterio-opsyny z retynalem nazywa się bakteriorodopsyną (BR). Bakteriorodopsyna jest pompą proteinową, indukowaną światłem, a w Halobacterioum halobium koduje ją gen bop.

Znane są wyniki badań dotycące ekspresji endogennych polipeptydów w halobakteriach (7, 8, 9).

Wynalazek dotyczy opracowania i warunków stosowania systemu ekspresji, w celu wytwarzania heterologicznych polipeptydów w halobakteriach.

System taki musi zawierać regiony związane z regulacją transkrypcji i translacji DNA, DNA kodujące polipeptyd heterologiczny, który nie jest endogenny u halobakterii oraz DNA kodujące sygnały stop dla transkrypcji i translacji.

Korzystne jest, gdy systemy te zawierają. DNA kodujące pre-sekwencje bakteriorodopsyny takie, że produkowany polipeptyd jest przyłączony do pre-sekwencji, co pozwala na umieszczenie polipeptydu heterologicznego w błonie lub wydzielenie go na zewnątrz błony.

W najkorzystniejszym systemie powyższego wynalazku stosuje się sekwencje regulatorowe translacji i transkrypcji oraz sekwencje stop translacji i transkrypcji pochodzące z genu bakteriorodopsyny, zarówno w obecności pre-sekwencji bakteriorodopsyny jak też przy ich braku. Zastosowanie sekwencji regulatorowych i sekwencji stop pochodzących z genu bakteriorodopsyny umożliwia wysoką ekspresję sekwencji kodujących polipeptydy heterologiczne.

Drugi aspekt wynalazku dotyczy wykorzystania C-końcowych domen polipeptydu bakteriorodopsyny w celu ułatwienia _ izolowania z błon halobakterii dojrzałego polipeptydu heterologicznego. Korzystne jest, gdy DNA kodujące specyficzne miejsce cięcia dla proteazy jest wprowadzone pomiędzy wspomnianą C-końcową sekwencję a DNA kodujące polipeptyd heterologiczny.

Wysoki poziom ekspresji polipeptydów heterologicznych przyłączonych do C-końcowego regionu bakteriorodopsyny uzyskuje się przez zastosowanie DNA kodującego sekwencje regulatorowe transkrypcji i translacji oraz sekwencje stop transkrypcji i translacji pochodzące z genu bakteriorodopsyny.

Kolejną korzyścią wynalazku jest zastosowanie pre-sekwencji genu bakteriorodopsyny do wzmocnienia ekspresji polipeptydów heterologicznych przyłączonych do regionu C-końcowego bakteriorodopsyny.

Wynalazek dotyczy systemów oraz ich odpowiedników, obejmując wektory ekspresyjne, transformowanie halobakterii za pomocą tych wektorów oraz metody produkcji, izolacji i ewentualnie dalszego oczyszczenia heterologicznych polipeptydów przy użyciu wektorów ekspresyjnych.

Wynalazek został opisany przez załączenie najkorzystniejszych zastosowań i najkorzystniejszego sposobu wykonania. Naturalnie, mając szczegółowy opis metody użytej przez wynalazców do produkcji polipeptydów heterologicznych, można dokonywać zmian, prowadzących do stworzenia systemu ekspresji, różnego w mniejszym lub większym stopniu od oryginalnego opisu.

Opis rysunków.

Rysunek 1. Mapa restrykcyjna plazmidu Pstl/BamHI zawierającego gen bakteriorodopsyny i około 400 par zasad sekwencji będących upstream do tego genu u Halobacterioum halobium, szczep Rl.

Rysunek 2. Sekwencja kwasów nukleinowych (SEQ ID NO:1) fragmentu Pstl/BamHI skonstruowanego jak na rys. 1, zawierającego gen bakteriorodopsyny i około 400 par zasad sekwencji będącej upstream od tego genu u Halobacterioum halobium, szczep Rl. Przedstawiono także sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO:2), produkt translacji proteiny BR.

Rysunek 3. Mapa restrykcyjna pUBP2.

Rysunek 4. Mapa drugorzędowej struktury dojrzałej proteiny BR (SEQ ID NO:3).

Rysunek 5. Mapa restrykcyjna fragmentu Pstl/BamHI zawierająca sekwencje regulatorowe BR i genu ludzkiego receptora acetylocholinowego muskarynowego (Typ HM1) w pENDS-OMl.

176 653

Rysunek 6. Sekwencja kwasów nukleinowych (SEQ ID NO:6) fragmentu Pstl/BamHI skonstruowanego jak na rys. 5, zawierającego gen ludzkiego muskarynowego receptora acetylocholinowego (Typ HM1) wpENDS-OMl. Przedstawiona jest również sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO:7) w HM1.

Rysunek 7. Mapa restrykcyjna fragmentu Pstl/BamHI zawierającego sekwencje regulatorowe BR i gen ludzkiego muskarynowego receptora acetylocholinowego (Typ HM1) w pENDS-OM2.

Rysunek 8. Sekwencja kwasów nukleinowych (SEQ ID NO:8) fragmentu Pstl/BamHI skonstruowanego jak na rys. 7, zawierającego gen ludzkiego muskarynowego receptora cholinowego (Typ HM1), charakteryzujący się brakiem domeny 13. Sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO:9) zawierająca usuniętą domenę 13.

Rysunek 9. Mapa restrykcyjna fragmentu Pstl/BamHI zawierającego sekwencje regulatorowe BR i szczurzy gen receptora serotoniny (typ IC).

Rysunek 10. Sekwencja kwasów nukleinowych (SEQ ID N0:10) we fragmencie Pstl/BamHI pokazanym na rys. 9 zawierającym szczurzy gen receptora serotoniny i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 11) szczurzego receptora serotoniny.

Rysunek 11. Southern biot DNA wyizolowanego ze szczepu H. halobium L33 zawierającego zmutowany gen Bop, transformowanego pUBP2 zawierającym szczurzy gen receptora serotoniny (typ IC). Linie 1-10, 12-19, 21-24 i 27 opisują DNA ze szczepu L33 ztransformowanego pUBP2 zawierającym fragment Pstl/BamHI przedstawiony na rys. 9 i 10 (SEQ ID NO: 10). Linie 11 i 25 są kontrolą pozytywną, która zawiera oczyszczony plazmid DNA (tj. pUBP2 zawierający gen receptora serotoniny). Linia 29 przedstawia DNA ze szczepu L33. Strzałka wskazuje położenie fragmentu Pstl/BamHI odpowiadającego DNA receptora 'serotoniny.

Rysunek 12. Northern blot całkowitego RNA wyizolowanego z H. halobium L33 zawierającego zmutowany gen Bop, transformowanego pUBP2 zawierającym gen receptora serotoniny. Linie 2 i 5 zawierają RNA ze szczepu dzikiego L33 transformowanego fragmentem 1.2 kb Pstl/BamHI zawierającym gen bop jako kontrolę. Linie 1, 3 i 4 zawierają DNA zL33 transformowanego szczurzym genem receptora serotoniny. Fragment 1.85 kb Pstl/BamHI przedstawiony na rys. 9 i 10 był używany jako sonda. Strzałki pokazują lokalizację RNA receptora serotoninowego.

Rysunek 13. Mapa restrykcyjna fragmentu Pstl/BamHI zawierającego sekwencję regulatorową BR oraz ludzki gen receptora trombiny.

Rysunek 14. Sekwencja kwasów nukleinowych (SEQ ID NO: 12) fragmentu Pstl/BamHI przedstawionego na rys. 13 zawierającego ludzki gen receptora trombiny i sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 13) ludzkiego receptora trombiny.

Rysunek 15. Mapa restrykcyjna ppgbop, pEK17, pBATC, pl.2KbBop, pBRAT.

Rysunek 16. Mapa restrykcyjna fragmentu Pstl/BamHI zawierającego sekwencję regulacyjną BR, gen bakterio-opsyny i gen kodujący katalityczną podjednostkę transkarbamylazy u Escherichia coli.

Rysunek 17. Sekwencja kwasów nukleinowych (SEQ ID NO:14) fragmentu przedstawionego na rys. 16, zawierającego geny bakterio-opsyny oraz transkarbamylazy E. coli i aminokwasową sekwencję (SEQ Id NO: 15) złożonego białka transkarbamylazy BR/ E. coli.

Rysunek 18. Western biot H. halobium transformowanego przez pBRAT. Jako sondę wykorzystano przeciwciała skierowane przeciw katalitycznej podjednostce transkarbamylazy asparaginianowej. Linia 2 zawiera transkarbamylazę E. coli. Linie 6-9 i 11 zawierają białko z H. halobium transformowane z pBRAT. Strzałka w linii 8 wskazuje pozycję złożonego białka bakteriorodopsyny/transkarbamylazy (BR/ATCaza).

Rysunek 19. Umiejscowienie białka złożonego: bakteriorodopsyny/transkarbamylazy w purpurowej błonie komórkowej halobakterii po ekspresji. Wyizolowane całe błony komórkowe H. halobium rozdzielono w gradiencie sacharozy (A), poddano elektroforezie na żelu SDS-poliakryloamidowym i barwiono Coomassie blue (B). Linie na rys. 19B zawierają następujące markery białek: molekularne markery wagowe (linia 1); nierozdzielone całe błony z H. halobium szczep L33 transformowany pBRAT (linia 2); błony purpurowe z H. halobium

176 653 szczep L33 transformowany fragmentem 1,2 Kb Pstl/BamHI zawierającym gen Bop (linia 4); całe błony z H. halobium szczep L33 (linia 5); błony purpurowe H. halobium szczep dziki R1 (linia 6); błona purpurowa H. halobium szczep L33 transformowany pBRAT (linia 7-9).

Termin wektor ekspresyjny jest definiowany funkcjonalnie i oznacza wektory zdolne do ekspresji sekwencji DNA w nich zawartych, gdy takie sekwencje są operacyjnie połączone z innymi sekwencjami mogącymi wpływać na ich ekspresję. W obecnym opisie terminy wektor i plazmid używane są zamiennie, jako że plazmid jest najczęściej używaną formą wektora. Jednakowoż wynalazek zawiera także inne formy wektorów ekspresyjnych o równoważnych funkcjach, które są lub staną się znane.

Przez termin operacyjny oraz jego gramatyczne odpowiedniki rozumieć należy, że odpowiednie sekwencje DNA są zdolne do działania w wyznaczonych im celach.

Termin polipeptyd heterologiczny oznacza znane lub nieznane polipeptydy nie będące endogennymi polipeptydami komórek, w których są syntetyzowane lub, jeśli są endogenne, to są uzyskiwane w ilościach niemożliwych do otrzymania w stanie naturalnym. Definicja obejmuje także nieretynalowe związki białek u halobakterii. Przykłady polipeptydów heterologicznych to polipeptydy z eukariontów, eubakterii, archebakterii, polipeptydy syntetyczne i polipeptydy zawierające analogi aminokwasów równoważne biologicznie. Ponadto dotyczy ona także innych pochodnych rodziny białek śródbłonowych zawierających 7 a-helis, takie jak acetylocholinowy receptor muskarynowy, receptor seretoninowy, receptor trombinowy, receptor adrenergiczny i podobne. Termin polipeptydy heterologiczne odnosi się również do białek błonowych np. mukowiscydozowy regulator przewodnictwa śródbłonowego i proteiny rozpuszczalne, takie jak różne enzymy (np. proteazy i transkarbamylaza asparaginowa). Każdy enzym jest stosowany zgodnie ze znaną, lub ustaloną funkcją biologiczną i jest zastosowany zgodnie z procedurą ogólnie znaną w tej dziedzinie.

Termin DNA kodujący polipeptydy heterologiczne oznacza sekwencje DNA kodujące polipeptyd, który nie jest endogenny dla gospodarza. Z powodu wysokiej zawartości par GC (tj. około 58-68%) w genomie halobakterii, korzystne jest, gdy sekwencja DNA kodująca polipeptyd heterologiczny ma podobną wartość, chociaż mogą być stosowane sekwencje z wyższą lub niższą zawartością GC niż zwykle u halobakterii. Na przykład, udało się nam uzyskać ekspresję genu transkarbamylazy asparaginianowej E. coli zawierającego tylko 50% par GC.

Termin określający region regulujący transkrypcję i translację oznacza sekwencję DNA odpowiedzialną zarówno za transkrypcję i translację elementów ekspresji. Korzystne jest, gdy regulatorowe DNA występuje w genie bakteriorodopsynowym (od -364 do +41 w stosunku do miejsca startu RNA, fig. (SEQ ED NO:1).

W innym wypadku sekwencji regulatorowe DNA zawierają około 4000 par zasad (od około -4000 do +41) będących upstream do genu bop i obejmuje trzy inne geny bop klasteru (zbioru genów), który zawiera brp (13) bat (14) i blp (Gropp & Betlach, opis otrzymywania). Kilka lub wszystkie z tych genów mogą występować jako geny regulatorowe.

Termin sekwencje stop transkrypcji i translacji oraz równoważniki w szerokim zakresie oznaczają DNA, którego funkcją jest odpowiednio kończenie transkrypcji i translacji. Korzystne jest, gdy sekwencje stop transkrypcji i translacji pochodzą z genu bakteriorodopsynowego.

Termin pre-sekwencje genu bakteriorodopsyny oznacza sekwencje około 13 aminokwasów niezbędne do wprowadzenia bakteriorodopsyny do błony. Pre-sekwencja złożona z 13 aminokwasów kodowana jest przez nukleotydy od +3 do +41 odnoszące się do miejsca startu RNA przedstawionym na rys. 2 (SEQ ID NO:l).

Termin gospodarz halobakteryjny oznacza szczep należący do Halobacterium sp. obejmujący gatunki skrajnych i umiarkowanych halofili o dzikim genotypie. Przykładami skrajnych halofili o dzikim genotypie są: Halobacterium saccharovorium (ATCC 29252), Halobacterium califoimia (ATCC 38799), Halobacterium halobium (CCM 2090), Halobacterium valismortis (ATCC 29-715). Umiarkowane halofile z typu dzikiego są reprezentowane przez gatunek Halobacterium mediterannei (ATCC 33500). Korzystniej jest, gdy gatunki halobakterii, w których następuje ekspresja, nie syntetyzują bakteriorodopsyn. Gatunki wykazujące brak bakteriorodopsyn są zarówno typu dzikiego np. H. volcanii lub mutantami, np.

176 653

L33 (15), S9Flx3 (16), IV-8 (17) i IV-14 (17). W zależności od potrzeb stosuje się szczepy zmutantowane, charakteryzujące się brakiem syntezy bakteriorodopsyn pochodzące ze szczepu syntetyzującego purpurową błonę konstytutywnie, np. L33 lub po zaindukowaniu. Możliwość regulowania ekspresji zależy od struktury regionów regulatora będących upstream w konstrukcji wektora ekspresyjnego i jest możliwa tylko w szczepach indukowalnych.

Termin miejsce restrykcyjne oznacza sekwencje DNA rozpoznawalne przez endonukleazę jako miejsce cięcia DNA.

Termin sekwencja C-końcowa, obszar C-końcowy oraz równoważniki oznacza sekwencje polipeptydowe w rejonie C-końcowym bakteriorodopsyny, patrz rys. 4.

Termin miejsce cięcia proteazy oznacza sekwencję aminokwasową rozpoznawalną przez proteazę jako miejsce cięcia polipeptydu, które jest przygotowane i wolne od produktu heterologicznej ekspresji polipeptydów. Korzystnie stosuje się miejsca cięcia proteazy (IleGlu-Gly-Arg) (SEQ ID NO:4) faktora Xa, z powodu rzadkości powyższej sekwencji.

Przykłady.

Klonowanie sekwencji DNA, kodującej polipeptyd heterologiczny, do wektora ekspresyjnego halobakterii.

Konstrukcje ekspresji białek błonowych.

Wszystkie konstrukcje są tworzone z użyciem standardowych technik molekularnych (12) włączając PCR. Wektor ekspresyjny może być otrzymywany w różny, konwencjonalny sposób. Jakkolwiek inne wektory mogą być stosowane, najlepszym wektorem klonowania u halobakterii dostosowanym do wektora ekspresyjnego jest plazmid pUBP2 (fig. 3), opisany przez Blaseio i innych (7). Plazmid izoluje się stosując konwencjonalne techniki. Na przykład, plazmid może być oczyszczany w gradiencie gęstości chloroetydium cezu i bromku, elektroforezy na żelu agarozowym, przepuszczając przez błonę dializacyjną, a także oczyszczony stosując dostępne w sprzedaży kolumny chromatograficzne, tak jak w metodzie oczyszczania DNA zwanej magie minipres (Promega Corp., Madison, WI), itp.

Zastosowane wektory ekspresyjne zawierają zazwyczaj marker, który umożliwia selekcję komórek, w których nastąpiło wbudowanie DNA, na tle komórek, w których DNA nie zostało wbudowane. Przykładem powszechnie stosowanej selekcji są markery odporności na antybiotyki. Dwa markery umożliwiają selekcję halobakteri, zawierające nowobiocynę (8) i mewinolinę (7). Korzystne jest gdy stosowanym markerem jest marker odporności mevinolinowej. Jest to inhibitor reduktazy HMG CoA (7). Marker ten występuje w sklonowanym plazmidzie pUBP2 (fig. 3). Dla wygody insercji sekwencji DNA, plazmidy zawierają sekwencje polilinkera o różnych miejscach restrykcyjnych. Szereg polilinkerów jest znanych i dostępnych (12). Typowym polilinkerem jest polilmker 1 (12.3) (fig. 3), który zawiera miejsca restrykcyjne dla Hindll, Sohl, XhoI, Pstl, Sali, BamHI, HiND HI, Xbal i KpnI. Innym typowym polilinkerem jest polilinker 2 (3.70) (fig. 3) z miejscami restrykcyjnymi dla SphI, EcoR5, Sstl, Smal i EcoRI.

Sekwencję DNA kodującą heterologiczne polipeptydy wprowadza się w kierunku downstream od regionu regulatora transkrypcji i translacji zawierającego promotor i miejsce wiązania rybosomu z zastosowaniem technik standardowych. Korzystne jest stosowanie promotora indukowalnego, umożliwiającego kontrolowanie ekspresji heterologicznych polipeptydów. Najlepiej jest stosować regulatorowe sekwencje transkrypcji i translacji pochodzące z genu bakteriorodopsyny. Gen bakteriorodopsyny może być izolowany z genomu halobakterii przez zastosowanie odpowiednich enzymów restrykcyjnych. Sekwencje regulatorowe transkrypcji i translacji w genach bakteriorodopsynowych są położone w obszarze -365 do +41 od miejsca startu RNA dla sekwencji bakteriorodopsyny, pokazanym na fig. 2 (SEQ ID NO:1).

Aby nastąpiło właściwe zakończenie syntezy heterologicznych polipeptydów umieszcza się sygnały stop transkrypcji i translacji w kierunku downstream, od sklonowanej sekwencji DNA kodującej heterologiczny peptyd, z wykorzystaniem dobrze znanych technik (12). Korzystnie, gdy jako sygnały stop występują sekwencje w kierunku downstream genu bakteriorodopsynowego (fig. 2) (SEQ ID NO:1), który zawiera translacyjny kodon stop (TGA), po którym następuje 80 par zasad zawierających sygnał zakończenia transkrypcji.

176 653

Tam, gdzie jest korzystne otrzymywanie heterologicznego polipeptydu śródbłonowego, który jest włączany do błon halobakterii, DNA kodujące polipeptyd heterologiczny jest wklonowane będących upstream do DNA kodującego pre-sekwencję BR.

Interesujący nas gen heterologiczny może być klonowany na plazmidzie pUC19 E. coli (20) jednocześnie z sekwencjami regulatora BR tak, że wszystkie klonowane sekwencje umieszczone są na fragmencie DNA zawierającym dwa specyficzne miejsca restrykcyjne (wybrane z Pstl, BamHI, Smal). Bardziej dokładnie, heterologiczny gen jest związany tak, że wbudowuje się w presekwencję BR, w kierunku downstream od sekwencji regulatorowej bakteriorodopsyny/promotora i będących upstream od sekwencji zakończenia transkrypcji i translacji bakteriorodopsyny. Specyficzne miejsce cięcia proteazy może być wbudowane w różnych konstruktach pomiędzy pre-sekwencję BR i gen heterologiczny.

Fragment 1,2 kilo par zasad, zawierający gen bop i około 370 par zasad będących upstream izolowano z H. halobium szczepu R1 DNA z zastosowaniem techniki PCR i klonowano do PstlBamHI w miejscach pUC19 (opisany jako pl.2Kbbop) (fig. 15B). Z klonowanego fragmentu usunięto dwa endogenne miejsca AlwNI. i) pierwsze miejsce zlokalizowane 165 par zasad będących upstream od kodonu startu genu bop (SEQ ID NO:1) usunięto przez stworzenie mutacji punktowej G-T według metody Kunkel'a (29). ii) drugie miejsce AlwNI jest zlokalizowane 7 par zasad, będących upstream od kodonu stop genu bop usunięto używając zestaw Transformer Site-Directed Mutagenesis (Clontech Laboratories, Inc., Pało Alto, CA). Następnie ze zmutowanego fragmentu 1,2 kilo par zasad wyizolowano techniką. PCR, fragment około 400 par zasad Pstl/AlwNI (opisany jako fragment bop 5’), zawierający sekwencję bop będących upstream, DNA kodujące pre-sekwencję BR i pierwsze cztery (niehelikalne) części BR. Równolegle otrzymano z fragmentu genu bop 1,2 kilo par zasad, fragment około 100 par zasad Notl/BamHI (opisany jako fragment bop 3’), zawierający DNA kodujące 6 części BR, kodon stop BR i transkrypcyjne sekwencje końcowe BR (aż do 44 par zasad w kierunku downstream od kodonu stop). Zastosowano trawienie i oczyszczanie wg Prep-A-Gene, BioRad, Richmond, CA. Dodatkowo usunięto przy użyciu, zestawu Clontech Transformer endogenne miejsce AlwNI zlokalizowane w pUC19 (pozycja 1217) oraz zmutowany pUC19 trawiono Pstl/BamHI i oczyszczono (opisany jako fragment wektora). Trzy fragmenty (tj. fragment bop 5’, fragment bop 3’, fragment wektora) zostały związane z fragmentami DNA zawierającymi różne heterologiczne geny, mające złączyć się z presekweneją. BR i niehelikalnymi częściami i zawierać pojedyncze miejsca cięcia AlwNI przy końcu 5’ i pojedyncze miejsce Notl przy 3’ końcu fragmentu, tak jak opisano poniżej. We wszystkich genach heterologicznych, endogenne miejsca cięcia: AlwNI, Notl, BamHI oraz Pstl zostały uprzednio usunięte (jeśli było to niezbędne) aby ułatwić konstrukcję. Po sklonowaniu heterologicznego genu, wraz z sekwencjami regulatorowymi BR 5’ i 3’ do pUC19, ten pośredni konstrukt (opisany jako pENDs) był trawiony Pstl/BamHI.

Następnie, fragment restrykcyjny zawierający heterologiczny gen z sekwencjami regulatorowymi BR, został wyizolowany z sekwencji pUC19 przez elektroforezę na żelu agarozowym, oczyszczony używając Prep-A-Gene (BioRad, Richmond, CA, USA) i sklonowany do wektora przenoszącego (shuttle vector), pUBP2 (7). pUBP2 jest nośnikiem replikonu pBR322 i markera odporności na ampicylinę, halobakteryjnego plazmidu pHHl oryginału replikacji i markera odporności na mewiolinę. Odporność na mewiolinę jest kodowana przez mutację up-promotora genu reduktazy HMG-CoA.

Konstrukcę sprawdzono przez mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie nukleotydowe pomiędzy połączeniami 3’ i 5’ sekwencji regulatorowych BR i genu heterologicznego.

a. Ludzki receptor acetocholino-muskarynowy (typ HM1).

Dwa różne konstrukty zostały stworzone dla tego genu. Pierwszy (opisany jako pENDsOM1) zawiera cały gen, natomiast drugi (opisany jako pENDsOM2) został pozbawiony dużej, wewnętrznej cytoplazmatycznej pętli (tj. 13), która prawdopodobnie ma znaczenie w przekazywaniu sygnałów. Zanim przystąpiono do konstrukcji układów opisanych poniżej usunięto dwa, endogeniczne miejsca cięcia AlwNI i jedno endogenne miejsce cięcia Pstl, z ludzkiego receptora muskarynowo-acetylocholinowego (opisanego jako HM1), sklonowa176 653 nego w pGEM3 (Promega Corp., Madison, WI, USA) przy użyciu zestawu Clontech Transformer lub metody Kunkel'a (29). Pozycje usuniętych miejsc cięcia przedstawiono na rys. 6 (SEQ ID NO:6).

pENDsOMl został stworzony następująco. Wyizolowano z GEM3/HM1, przy użyciu techniki PCR, gen HM1 tak, aby zawierał miejsce AlwNI na końcu 5’ i miejsce cięcia Notl na końcu 3’ fragmentu PCR. Fragment ten został przyłączony do fragmentu bop 5’, fragmentu bop 3’, fragmentu wektora, opisanych powyżej i przeniesiony do E. coli. Otrzymany plazmid nazwano pENDsOMl. pENDsOMl zawiera kodon sart metioniny HMl umiejscowiony 4 kodony w kierunku dwonstream od sekwencji BR 5’ oraz. Dziewięć dodatkowych par zasad stworzono przez wprowadzenie miejsca AlwNI kodującego 3 dodatkowe części (tj. gin, ala, Ieu) zlokalizowane pomiędzy sekwencją BR 5’ i kodonem start genu HMl. Na końcu 3’ genu, kodon stop HMl poprzedza kodon stop BR 48 parami zasad. Regulatorowe sekwencje BR, wraz z genem HMl zostały przeniesione z pENDsOMl na pUBP2 za pomocą fragmentu Pstl/BamHI (rys. 5 i 6, (SEQ ID NO:6) jak opisano powyżej.

pENDsOM2 został stworzony na podobnej zasadzie, jako siostrzana konstrukcja. Jednakże delecja l3 domen została przeprowadzona po trawieniu genu HMl w specyficznym miejscu restrykcyjnym Stul (pozycja 7l2, w odniesieniu do kodonu startu genu HMl, SEq ID NO:6), po której następowało trawienie eksonukleazą Bal-3l dla różnych czasów, w temperaturze 4°C. Tępo zakończony produkt związał się sam ze sobą dając mutanty o de¹ecjach różnych rozmiarów, w obszarze l3 domen. Do dalszych badań wybrano mutanta, wykazującego brak aminokwasów 23l do 357 HMl (SEQ ID NO:7). DNA tego mutanta zostało użyte do stworzenia fragmentu PCR, zawierającego gen HMl (bez l3-tej pętli) z miejscami cięcia AlwNI’ i Notl 3’. Fragment ten był identyczny z fragmentem opisanym powyżej, z wyjątkiem braku l3-tej pętli i został użyty do stworzenia pENDsOM2 w podobny sposób jak pENDsOMl. Sekwencja fragmentu Pstl/BamHI zawierającego sekwencje regulatorowe BR i gen HMl (bez l3-tej pętli) przedstawiono na rys. 8 (SEQ ID NO:8).

b. Receptor serotoniny szczura (typ IC).

Gen receptora serotoniny szczura (opisany jako Ser) sklonowany jako fragment cDNA 3Kb EcoRI na plazmidzie pSRc (27) użyto jako podstawę niniejszej konstrukcji. Gen Ser nie zawiera endogennych miejsc AlwNI, Notl, BamHI i Pstl i został przygotowany następująco. Wprowadzono miejsca klonowania AlwNI i Notl, odpowiednio, z kodującymi 5’ oraz niekodującymi 3’ regionami genu Ser. Dodatkowo DNA kodujące białko, kwas poliasparaginowy umieszczono w ramce będących upstream od genu Ser i downstream miejsca AlwNI. Przez translację tej sekwencji otrzymujemy peptyd, użyteczny dla dalszej detekcji białka ekspresyjnego (3l). Fragment ten został wyizolowany i związany z fragmentem bop 5’, fragmentem bop 3’, fragmentem wektora, opisanymi powyżej i przeniesiony do E. coli. Otrzymany plazmid nazwano pENDs-Ser. Zawierał on 36-ty kodon genu receptora serotoniny szczura poprzedzany przez DNA kodujące białko i sekwencję BR 5’. Otrzymano dziewięć dodatkowych par zasad kodujących 3 dodatkowe części (tj. gin, ala, leu) zlokalizowane w ramce pomiędzy sekwencją BR 5’ i sekwencją. epitopu. Na końcu 3’ genu, kodon stop Ser poprzedza stop kodon BR l8 zasadami. Dalsza konstrukcja z pENDs-Ser polegała na przeniesieniu regulatorowej sekwencji BR z genem Ser do pUBP2 na fragmencie Pstl/BamHI (rys. 9 i l0, SEQ ID NO: l0).

c. Ludzki receptor trombinowy.

Podstawą niniejszej konstrukcji był klon genu ludzkiego receptora trombinowego (opisany jako Thromb) (33). Cztery endogenne miejsca restrykcyjne: trzy AlwNI (29l, 945 i l038) i jeden Pstl (537), zostały usunięte z genu metodą Kunkel'a (29). Pozycje podano w odniesieniu do pierwszej zasady kodona start genu. pENDs-Thromb stworzono insercji następująco. Fragment AlwNI/Notl zawierający gen stworzono używając mutagenezy oligonukleotydowo-kierunkowanej oraz PCR. Włączone do tego fragmentu zostały dodatkowe sekwencje nukleotydowe kodujące krótkie białka wykorzystywane w oznaczaniu i oczyszczaniu białka ekspresyjnego. Fragment AlwNI/Notl zawierający gen wraz z epitopem związano z fragmentem bop 5’, fragmentem bop 3’, fragmentem wektora, opisanymi powyżej i przeniesiony do E. coli. Otrzymany plazmid nazwano pENDs-Thromb. Otrzymano 33 do10

176 653 datkowe pary zasad, kodujące jedenaście dodatkowych aminokwasów, zlokalizowanych w ramce pomiędzy sekwencją BR 5’ i sekwencją trombiny. Dwadzieścia siedem dodatkowych części koduje sekwencję peptydu, przez której translacje otrzymujemy epitop, wykorzystywany do wykrywania białka ekspresyjnego (31). Na końcu genu 3’, sześć kodonów wstawiono upstream do kodonu stop trombiny. Te kodony histydynowe są pomocne do oczyszczania otrzymanego białka przez analizę powinowactwa (26). Na 3’ końcu genu kodon stop trombiny poprzedza kodon stop BR 18 parami zasad.

Regulatorowe sekwencje BR wraz z genem ludzkiego receptora trombiny mogą być przeniesione do pUBP2 na fragmencie Pstl/BamHI (rys. 13 i 14, SEQ ID NO:12), jak opisano powyżej.

ii) Konstrukcja ekspresji białek rozpuszczalnych.

Tam, gdzie jest wymagane, aby po ekspresji, rozpuszczalne białka heterologiczne były uwalniane na zewnątrz komórki, do środowiska hodowli, sekwencje DNA kodujące polipeptydy heterologiczne mogą zostać związane z DNA kodującym pre-sekwencje bakteriorodopsyn (rys. 2, SEQ ID NO:1), od +3 do +41 w odniesieniu do miejsca startu RNA). Zastosowano tu standardowe techniki biologii molekularnej (12).

Tam, gdzie korzystniej jest, aby po ekspresji, rozpuszczalne białka heterologiczne były umieszczane w błonie halobakterii, DNA kodujące polipeptydy heterologiczne jest wiązane w kierunku downstream do DNA kodującego region C-końcowy (rys. 2 i 4, SEQ ID NO 1 i 3) bakteriorodopsyny lub do jego fragmentów.

W celu ułatwienia oczyszczenia produktu (heterologicznego polipeptydu), sekwencję DNA, kodującą specyficzne miejsce cięcia proteazy wstawiono pomiędzy DNA kodujące region C-końcowy bakteriorodopsyny a DNA kodujące polipeptyd heterologiczny. Sekwencje kodujące specyficzne miejsca cięcia są znane i obejmują np. subtilisinę, trombinę, enterokinazę, czynnik X_a. Korzystnie stosuje się sekwencję DNA kodującą sekwencję aminokwasów (Ile-Glu-Gly-Arg) (SEQ ID NO:4) do kodowania specyficznego miejsca cięcia proteazy, które jest rozpoznawane przez faktor X_a.

Projekt wektora ekspresyjnego rozpuszczalnego białka i metody są podobne do opisanych powyżej dla białek błonowych. Jednakże ekspresja rozpuszczalnych białek zachodzi jako związanie w ramce (in-frame) z regionem C-końcowym BR, a więc te białka złożone będą posiadały domeny błonowe (tj. BR lub jej części) i domeny rozpuszczalne (tj. polipeptyd heterologiczny). Gen heterologiczny jest klonowany na C-końcowym BR, pomiędzy genem bakteriorodopsyny i końcową sekwencją transkrypcyjno/translacyjną BR, w kierunku downstream. Dodatkowo, specyficzne miejsca cięcia znajduje się pomiędzy BR a genem heterologicznym, w celu ułatwienia następującego oczyszczenia białka. Następnie końcowy fragment jest klonowany do E. coli/H. halobium wektora przenoszącego, pUBP2 (7).

ii) Transkarbamylaza asparaginowa (podjednostka katalityczna) u E. coli.

Podjednostka katalityczna transkarbamylazy asparaginowej (oznaczona jako ATCaza), białka rozpuszczalne, dołączono do C-końcowego BR następująco. Gen bop zawierający plazmid ppgbop (32), trawiono w specyficznym miejscu cięcia Notl zlokalizowanym niedaleko 3’ końca genu bop (patrz rys. 15A). Następnie to miejsce Notl zostało wypełnione, aby utworzyć tępy koniec (12). Otrzymane DNA trawiono SphI w celu otrzymania dwóch fragmentów, duży fragment (oznaczony jako fragment 1), zawierający wektor wraz z N-końcem genu bop oraz mały fragment zawierający wewnętrzną sekwencję genu bop. Fragment 1 wyizolowano i oczyszczono. Drugą część p(3gbop trawiono SphI/Haell i fragment 217 par zasad (oznaczony jako fragment 2) zawierający wewnętrzną część genu bop wyizolowano i oczyszczono (rys. 15A).

Gen strukturalny podjednostki katalitycznej transkarbamylazy asparaginowej wyizolowano z pEK17 (rys. 15A) (30). Wyizolowano i oczyszczono fragment 845 par zasad Msel//Nrul (określony jako fragment 3), zawierający wszystkie oprócz 18 par zasad genu kodującego ATCazę.

Syntetyczny fragment DNA (oznaczony jako fragment 4) skonstruowano przez annealing dwóch dwóch komplementarnych oligonukleotydów i zastosowano połączenia genów bop i ATCazy. Syntetyczny fragment stworzono tak, aby zawierał miejsce cięcia Haell przy

176 653

5’ końcu i Msel przy 3’ końcu oraz wewnątrz Nrul. Zawierał on także nukleotydy kodujące i) specyficzne miejsce cięcia proteazy (faktor Xa krzepliwości krwi) oraz ii) aminokwasy 6

7 ATCazy (w odniesieniu do kodona startu ATCazy), rys. 17, SEQ ID NO: 14.

Wszystkie 4 fragmenty DNA związano i użyto do transformacji E. coli szczepu D1210 (28) z selekcją odporności na ampicylinę. Pozytywne szczepy zidentyfikowano przez hybrydyzację filtrową dla koloni, używając jako próby znakowanego radioaktywnie P32 fragmentu Msel/Nrul. Pozytywne klony zweryfikowano jako mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie nukleotydów. Wybrano jeden klon odpowiadający pozytywnie i oznaczono pBATC (rys. 15A).

Następnie, złożony konstrukt bop-ATCaza został przystosowany do ekspresji w H. halobium jak opisano poniżej. Fragment spinający sekwencje i zawierający wewnętrzne miejsce spięcia SphI genu bop na końcu 5’ i translacyjny kodon stop ATCazy przy końcu 3’ wyizolowano z pBATC przy zastosowaniu techniki PCR (patrz rys. 15B). Dodatkowo, oligonukleotyd używany do konstrukcji końca 3’ tego fragmentu PCR, zaprojektowano tak, aby był komplementarny do sekwencji bop w kierunku downstream końcowej sekwencji transkrypcji i zawierał specyficzny BamHI dla ułatwienia dalszego klonowania. Otrzymany fragment PCR trawiono SphI/BamHI, oczyszczono i stosowano w poniższej konstrukcji.

Plazmid pl.2Kbbop, zawierający gen bop i sekwencje sklonowane będące upstream wpUCló (opisane powyżej) trawiono SphI/BamHI w celu otrzymania dwóch fragmentów, dużego, zawierającego wektor oraz główną część genu bop i fragment 358 par zasad zawierających połowę C-końcową genu bop (rys. 15B). Większy fragment wyizolowano, oczyszczono i związano z fragmentem PCR, SphI/BamHI bop-ACTazy. Pozytywny klon izolowano i potwierdzono przez mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie nukleotydowe. Klon ten trawiono Pstl/BamHI i fragment zawierający DNA kodujące połączenie BR/ACTazy wraz z regulatorowymi sekwencjami bop będących upstream (rys. 16) sklonowano do wektora nośnikowego pUBP2 E. coli/H. halobium. Otrzymaną konstrukcję nazwano pBRAT (rys. 15B). Sekwencję nukleotydową (SEQ ID NO:14) oraz sekwencję aminokwasową po translacji (SEQ ED NO: 15) fragmentu Pstl/BamHI przedstawiono na rys. 17.

2. Transformacja Halobacterium halobium.

Wyizolowano i oczyszczono fragmenty Pstl/BamHI konstruktów pENDs-Ser (rys. 9 i 10, SEQ ID NO: 10) i pBRAT (rys. 15B, 16 i 17, SEQ ID NO: 14), zawierające geny heterologiczne oraz regulatorowe sekwencje BR. Następnie fragmenty te sklonowano w wektorze nośnikowym E. coli/H halobium wektor wahadłowy pUB2 (7), a następnie wektorem tym ztransformowano defektywny pod względem Bop szczep H. halobium L33, jak opisano (24).

Dogodniejsze jest wprowadzanie plazmidów do halobakterii metodą z zastosowaniem glikolu polietylenowego (PEG) (10, 11). Następnie transformowane komórki halobakterii hoduje się w pożywkach, o odpowiednio dobranych składnikach odżywczych, wystarczających do wzrostu komórek halobakterii (7, 8).

H. halobium wykazuje skłonności do lizy komórek podczas prowadzenia procedur trasformacji (7). Ponieważ wiadomo, iż środki powierzchniowo czynne wzmacniają lizę halobakterii, wszystkie bufory oraz szkło zostało oczyszczone z mydeł. 'Transformację prowadzono z zastosowaniem metody Blaseio (7) i Cline (11) z modyfikacjami. Wstępnie komórki były pasażowane kilka razy w medium złożonym (YET) (przy braku mydeł). Następnie hodowano do osiągnięcia wartości OD600 około 0,01 i rosły w temperaturze 40°C do osiągnięcia etapu średnio-logarytmicznego wzrostu (ODfi00 od 0,4 do 0,6). Wszystkie następujące czynności były prowadzone w temperaturze pokojowej. Kulturę wyjęto z wytrząsarki w łaźni wodnej i inkubowano przez 4 godziny (lub przez noc) bez wytrząsania, następnie ml hodowli zwirowano przy 1000 x g przez 15 minut. Supematant ostrożnie usunięto pipetą, a wnętrze probówki do wirowania osuszono papierem chłonnym. Osad komórkowy zawieszono w 1/10 objętości roztworu sferoplastów (11), następnie dodano 1/100 objętości 0,5 mM EDTA w roztworze sferoplastów (11) i inkubowano przez 2 min. 1gg DNA i 10 μl roztworu sferoplastów dodano następnie do komórek sferoplasyzowanych wraz z równą objętością 60% PEG 600 (nie rekrystalizowanego) w roztworze sferoplastów. Połączone roztwory łagodnie, lecz dokładnie rozmieszano i inkubowano przez 20 min. Następnie do12

176 653 dano 10 ml 15% sacharozy w medium złożonym (YET) i inkubowano przez noc w spoczynku, w temperaturze 42°C. Następnego dnia komórki żwirowano przy 3000 x g przez 15 min. i zawieszono w 300 μΐ ml 15% sacharozy w medium złożonym (YET). Roztwór powyższy wysiano na podłoże stałe (YET) selekcyjnie.

3. Analiza transformantów, ekspresja polipeptydu heterologicznego i sposób przeprowadzenia ekspresji.

Aby ustalić, czy komórki halobakteryjne zostały ztransformowane efektywnie, można zastosować różne techniki. Tam, gdzie wektory ekspresyjne użyte do transformacji halobakterii zawierają dominujący marker selekcyjny, komórki ztransformowane izolowano przez hodowlę na odpowiednim medium selekcyjnym tak, że wzrost komórek halobakteryjnych, które nie zawierają tego plazmidu, jest zahamowany. Na przykład tam, gdzie wykorzystano marker odporności na mewinolinę, komórki halobakteryjne, zawierające ten plazmid mogą być izolowane przez hodowlę na podłożu stałym, zawierającym mewinolinę o stężeniu 5-25 μΜ. Następnie plazmid może być wyizolowany przy użyciu technik standardowych (12), pocięty i wykorzystany. Można przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazy, elektroforezę w żelu, analizę restrykcyjną, Southern, Northern, Western biot, czy sekwencjonowanie itp.

Opierając się na tym szczególnym konstrukcie i podstawowym szczepie halobakterii, które zostały wykorzystane dla ekspresji polipeptydów heterologicznych można uzyskać konstruktywną i indukowalną ekspresję polipeptydów heterologicznych. W przypadku ekspresji konstruktywnej produkt będzie produkowany konstytutywnie przez cały okres wzrostu komórki. Z kolei przy zastosowaniu ekspresji indukowalnej można zaindukować ekspresję w momencie, kiedy komórki w hodowli osiągają wcześniej założoną gęstość.

W przypadku, kiedy promotory indukowalne zostały wprowadzone do wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencje DNA, kodującą polipeptyd heterologiczny, transkrypcja może być indukowana, przy wykorzystaniu odpowiednich związków indukujących, które można zastosować w takim stężeniu i przez taki okres, aby końcowym efektem jego działania była indukcja transkrypcja. Na przykład, jeżeli zastosujemy sekwencje regulatorowe pochodzące z genu bakteriorodopsyny, transkrypcja może być indukowana poprzez niskie stężenie tlenu i wysoką intensywność naświetlania (18, 19), które są znanymi induktorami zwiększającymi poziom ekspresji BR. Niskie stężenie tlenu jest osiągane na różne sposoby, np. poprzez przepłukiwanie naczyń hodowlanych zawierających kultury bakteryjne azotem, nie zawierającym tlenu, a następnie ich szczelne zamykanie; lub też poprzez prowadzenie hodowli do momentu kiedy osiąga on fazę stacjonarną, w której to fazie zmniejszony dostęp tlenu występuje naturalnie (18). Wysokie natężenie światła przewyższające wartość 100 mW/cm może być osiągnięte przy wykorzystaniu źródeł światła (18,19). H. halobium transformowane pUBP2, zawierającym fragment pBRAT Pstl/BamHI oraz pUBP2 zawierające fragment pENDs-Ser Pstl/BamHI były hodowane na podłożu stałym (YET), zawierającym 25 μΜ mewinolinę. Szalki były inkubowane przez 1-2 tygodnie w temperaturze 42°C, co pozwalało na wzrost transformantów. Plazmidowe DNA było izolowane z poszczególnych transformantów przy wykorzystaniu systemu oczyszczania DNA Magie Minipreps DNA Purification System (Promego Corp., Madison, WI, USA). Analiza Southern biot przy wykorzystaniu fragmentu AlwNI/Notl zawierającego gen receptora seroninowego jako sondy wykazała obecność sekwencji genu receptora seroninowego we wszystkich przebadanych transformantach (rys. 11). Totalne RNA zostało wyizolowane z poszczególnych transformantów przy wykorzystaniu procedury RNAzol (Cinna Biotech) i poddane analizie metodą Northern. Analizy Northern blot wykazały, że zachodzi transkrypcja genu Ser (rys. 12). Analizy Western przy wykorzystaniu przeciwciał przeciw BR i ATCazy wykazały, że konstrukt BR/ATCaza ulegał ekspresji i był zlokalizowany w błonie halobakterii (rys. 18). Błony komórkowe halobakterii frakcjonowano na gradiencie sacharozy (rys. 19A), a próby pochodzące z uzyskanych frakcji zostały poddane elektroforezie na żelu SDS PAGE (rys. 19B). Zaobserwowano, że prążek o masie cząsteczkowej odpowiadającej przewidywanej masie cząsteczkowej białka złożonego (tj. -60 kDa, rys. 19B) pochodzi z frakcji purpurowej.

176 653

Te dane potwierdzają ekspresję całego konstruktu i wskazują, że fragment BR białka złożonego jest prawidłowo umiejscowiony w błonie halsbaktornjnej. Obecność chromafara BR (współczynnik ekstynkcji 63 000; 31) pozwala na stwierntenie, że w wyniku ekspresji utnskujeme około 5 mg/l białka złożonego.

Transformanię wyizolowane drogą selekcji 2azntnwnej na drodze analizy Southern i są następnie poddawane analizie Western, jeżeli dostępne są przeciwciała skierowane specyficznie przeciw białku heteralogicznomu. Jeżeli przeciwciała takie są niedostępne, DNA, o którym wiemy, że koduje 02ita2, warunkujący antygonawość cząsteczki białka, jest umieszczany na wektorze ekspresyjnym w celu ułatwienia wykrywania ekspresji. Przykładem takiego opitopu jest sekwencja kodująca Glu-Glu-Glu-Glu-Ter-Met-ProMet-Glu (SEQ ID No: 5) (22). Innym sposobem sprawdzania ekspresji białek hetoralagicznych jest analiza funkcjonalna; np. w wypadku receptorów badanie wiązania z ligandem, czy też jak w wypadku białek rozpuszczalnych badanie ich aktywności enzymatycznej po podaniu substratu.

4. Oczyszczanie białek heterologicznych.

Produkcja białek heterolagicznych może być zahamowana na różne sposoby. Jeżeli poli2eptyd heterologiczny jest uwalniany do środowiska, może on być izolowany w formie rozpuszczonej łub niorazpuszczonej przy wykorzystaniu metod fizycznych np. mechanicznych, termicznych czy chemicznych. Zastosowane metody mogą obejmować zamrazanie (□0°C), ogrzewanie, ścinanie hynrodynamictno, wysuszanie, filtrację selektywną lub procypitację po dodaniu kwasu, zasady, soli, czy rozpuszczalnika organicznego.

Jeżeli ulegający ekspresji kalipeptyn hetoralogiczny znajduje się w błonie lub cytaplazmie, pierwszym etapem oczyszczania jest oddzielenie komórek bakteryjnych od pożywki hodowlanej. Przy izolacji komórek bakteryjnych mogą być wykorzystane różne techniki, najczęściej wykorzystaną pozostaje wirowanie. Supernat-ant jest wyrzucany, a osad zawierający interesujące nas komórki przemywany odpowiednio ^utorowanym roztworem, ma to na celu usunięcie ewentualnych pozostałości pożywki hodowlanej. Standardowo, stosuje się zbuforowann roztwór o temperaturze 1 do 10°C, najczęściej ma on temperaturę 4°C.

Komórki sądzowane przy wykorzystaniu jednej z następujących metod: zamrażanie, liza mechaniczna, zawieszenie w roztworze hi2otamcznem (23), itp. Otrzymana zawiesina zEzowanych komórek jest następnie poddawana szeregowi czynności prowadzących do oddzielenia błon komórkowych od białek rozpuszczalnych i innych zanieczyszczeń. Przy izolacji błon komórkowych można wykorzystać szereg technik, np. wirowanie różnicujące, wirowanie w gradiencie stężeń itp. Izolacja błon komórkowych prowadzi do oddzielenia interesujących nas białek złożonych od wszelkich pozostałych białek rozpuszczalnych.

Polipoptydy hoterolagiczno są następnie oczyszczane, przy czym metoda stosowana do ich oczyszczania zależy od ich indywidualnych właściwości, jak i od właściwości BR. Jeżeli ulegający ekspresji rozpuszczalny 2ali202ten heterotogiczny jest przyłączony do C-końcowego regionu BR, można wykorzystać fakt, że domena BR będzie zakotwiczała całą cząsteczkę białka w błonie.

Jeżeli powstający polipekten hotorologictne jest wynikiem ekspresji konstruktu, w którym białko złożone jest połączone z C-końcowym regionem (lub fragmentem tego regionu) genu baktertorodopsyny, tak, że pomiędzy białkiem złożonym a C-końcowym regionem występuje unikalne miejsce cięcia dla krotoazy. W tym przypadku kolikektyn heterologiczny może być wyizolowany poprzez inkubację błon halobaktoryjnych z odpowiednią 2rateazą na skutek czego 2rateaza dokonuje cięcia w unikalnym dla siebie miejscu. Np. jeżeli palipeptyd hoteralogiczny jest połączony z C-końcowym regionem bakteriorodo2syny poprzez sekwencję aminokwasową Ile-Glu-Gly-Arg (SEQ ID NO: 4), błony komórkowe są inkubowane z czynnikiem Xa, w warunkach zalecanych przez producenta (czynnika Xa). Czynnik Xa jest rozpuszczany w rodestytowanej wodzto tak, aby osiągnąć końcowe stężenie białka 1mg/ml. Białko złożone, które ma być poddane cięciu jest rozpuszczane w 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCh, pH 8,0. Aby zwiększyć rozpuszczalność substratu, można dodać mocznik lub acetonitryl do osiągnięcia stężenia końcowego onkawiennio 1 M i 10% (v/v), dodanie tych substancji nie ma znacznego hamującego wpływu na aktywność

176 653 enzymu. Zalecane stężenie enzymu wynosi wagowo: 1/200 do 1/10 substratu. Inkubacja powinna być przeprowadzana w temperaturze 4 do 25°C przez 1-18 godzin. Optymalne warunki cięcia muszą być określane oddzielnie dla każdego białka złożonego. Odcięcie pożądanego polipeptydu od białka złożonego zależy od sekwencji aminokwasów znajdujących się w pobliżu miejsca cięcia proteazy, rozmiarów dwóch połączonych składników polipeptydowych i dostępności miejsca cięcia. Po zastosowaniu proteazy następuje standardowa procedura oczyszczania, mająca na celu usunięcie nawet śladowych ilości proteazy.

Jeśli niezbędne jest dalsze oczyszczanie polipeptydów heterologicznych, można zastosować następujące metody: chromatografię powinowactwa, elektroforezę, wirowanie strefowe, czy specyficzne przeciwciała skierowane przeciw określonemu polipeptydowi heterologicznemu, itp. Następnie produkt może być suszony w każdy dogodny sposób, tj. zamrażanie (suszące), rozpylanie itp. lub też zawieszony w odpowiednio zbuforowanym roztworze wodnym. Polipeptyd heterologiczny jest gotowy do użytku.

5. Bioassays - test na alkyywiość pollpeptydu.

Jakość otrzymanego polipeptydu heterologicznego może być sprawdzona poprzez wykonanie prób mających na celu określenie jego aktywności; rodzaj przeprowadzonej próby zależy od indywidualnych właściwości otrzymanego białka. Na przykład, receptory są sprawdzane poprzez badanie ich zdolności do wiązania ligandu. W przypadku białek rozpuszczalnych, które wykazują aktywność enzymatyczną, stosuje się próbę na sprawdzenie jej aktywności, przy wykorzystaniu odpowiedniego dla danego białka substratu.

Literatura.

Dla wygody, poszczególne dokumenty, na które powoływano się powyżej są zebrane w niniejszej literaturze według numerów odpowiadających numerom w nawiasach w tekście. Każdy z dokumentów jest opisany poprzez odnośnik.

1. Gropp Syst. AppL MicrobioL 7, 95 (1986).

2. Zillig Eur. J. Biochenu 173, 473 (1986).

3. Dennis J. Bacteriol. 168, 471 (1986).

4. Oesterhelt Proc. Nat. Acad. ScL USA 70, 2853 (1971).

5. Hendeeronzlti/ziu Rev. Biophys. Bioenerg. 6, 87 (1977).

6. Katre Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, 4068 (1981).

7. Blasieo Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87, 6772 (1990).

8. Holmes J. Bacteriol. 172, 756 (1990).

9. Ni Gene 90, 169(1990).

10. Charlebois Proc. Nat Acad. Sci. USA 84, 8530 (1987).

11. Cline-J. Bacteriol. 169, 1341 (1987).

12. Maniatis Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, N.Y. (1989).

13. Betlach Nucl. Acids Res. 12, 7949 (1984).

14. Leong J. Bacteriol. 170, 4903 (1988).

15. Wagner FEBS Letters 131, 341 (1983).

16. Spudich Proc. Nat Acad. Sci. USA 79, 4398 (1982).

17. Pfeifer J. Bacteriol. 145, 375 (1981).

18. Shand J. Bacteriol. 173, 4692 (1991).

19. Betlach, In: Protocols for Archael Research. Robb & Das Sarma (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, Gold Spring Harbor, N.Y., in press (1993).

20. Yam^-PenOn Gene 33, 103 (1985).

21. Kamekura Appl. Environmental MicrobioL 54, 990 (1988).

22. Grussenmeyer Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 7952 (1985).

176 653

23. Turner Biochemistry 32, 1332 (1993).

24. Cline Can. J. Microbiol 35, 148 (1989).

25. Feinberg Analytical Biochemistry 132, 6 (1983).

26. Hoffmann Nucleic Acids Research 19, 6337 (1991).

27. Julius Science 241, 588 (1988).

28. Kuhn Gene 44, 253 (1986).

29. Kunkel Methods EnzymoL 154, 367 (1987).

30. Nowlan J. Biol. Chem. 260, 14712 (1985).

31. Power Gene 113, 95 (1992).

32. Shand Biochemistry 30, 3082 (1991).

33. Vu Cell 64, 1057(1991).

Uwagi końcowe.

Powyższy opis przedstawia szczegółowe metody, które mogą być zastosowane do wykonania wynalazku. Znajomość szczegółowych metod używanych przez nas do konstruowania i wykorzystania wektorów oraz do ekspresji, izolacji, znakowania i dalszego oczyszczania poiipeptydów heterologicznych w halobakteriach, umożliwia innym osobom zajmującym się podobnymi badaniami odkrywanie alternatywnych metod osiągania tych samych lub równoważnych systemów jak przedstawione w niniejszej pracy. Powyższe przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając zakresu ochrony, określonego przez zastrzeżenia patentowe.

Wykorzystane przez nas szczepy Halobacterium zostały zdeponowane w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776. Daty depozytów ATCC 29252 - February 3, 1976; ATCC 38799 - September 13, 1979; ATCC 29715

Claims (18)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wektor ekspresyjny stosowany do wytwarzania polipeptydów heterologicznych w gospodarzu halobakteryjnym, znamienny tym, że zawiera regulatory transkrypcji i translacji DNA dla indukowanych ekspresji DNA w pozycji 3' tych regulatorów; DNA kodujące polipeptydy heterologiczne w pozycji 3' od opisanych regionów regulatorowych DNA; DNA kodujące sygnały stop dla transkrypcji i translacji w pozycji 3' od opisanego heterologicznego DNA.
2. 2. Wektor według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera regiony DNA umożliwiające replikację i selekcję w gospodarzu halobakteryjnym.
3. 3. Wektor według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera dodatkowy region DNA, znajdujący się pomiędzy DNA regulatorowym, w punkcie 1 i DNA kodującym polipeptydy hetesologiczne, w punkcie 1, kodujący pre-sekwencję genu bakteriorodopsynowego, wykorzystywany do ekspresji białka złożonego, składającego się z pre-sekwencji i polipeptydu heterologicznego.
4. 4. Wektor według zastrz. 1 lub 3, znamienny tym, że zawiera DNA kodujące C-końcowe sekwencje genu bakteriorodopsynowego i DNA kodujące unikalne miejsce cięcia dla proteazy i mieisce gestrykcyjne, w określowej kolejności, imędzy sekwencjtą C-końcową i DNA kadyjąc^km ko^jipoktyn hetejolegiczny, przy czym dodatkowe DNA zaczyna s^kę w pozy cp 3' od DNA kodującego polipeptyd hototologiczny.
5. 5. Wektor według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencje regulatorowe dla transkrypcji i translacji oraz sekwencje stoj? transkrypcji i ϊκ^οοϊϊ pochodzą z genu ba^ejeriorodopryn^k.
6. 6. Wektor wedłeg zasts^. 4, znamienny tym, że sekwoncSe regulatorów franskrypcji i translacji oraz e stop transrnypcri i translacji pochowką z g enu bakterierodopsyyy.
7. 7. Wektor· według zastrz. 1 albo 2, zn amienny tym, żs kalipepjyd hotorologiczny jest ludzkim receptorem aco^tylochalinawym muskaaynawym, ayk HM1.
8. 8. Wektor według zasta. 4, znamrenny tym, że 2olipoptyn heterologiczny jest 2odjod nostką katalrtyozną transkarbamylazy ae2araginiakowej z Eschefichia coli.
9. 9. Wektor według zaetrz. 5, znamienny tym, że 2ali2eptyd hetorologiczny jest 2adjonnostkąkaa^otyar:nątranskarbaIkelaze asparaginowej z Escherichia coli.

   1(0. Gospodarz he⁽abak^Ie^yjłnⁿ, znamienny tym, że transformowany jest wektorem akroślanem w zamrz. 1.
10. 11. Gospodarz halobakterejnn, znamienny tym, że transformowany jest wektorem określonym w zastrz. 4.
11. 12. Gospodarz halabakteryjne, znamienny tym, że transformowany jest wektorem akreśla2em w zastrz. 5.
12. 13. Sposób wytwarzania 2alipeptydów hoterologicznech w komórkach Halobact_eri_a, znamienny tym, że otrzymuje się olomonrn konieczne do ekspresii zawierające regiony DNA regulujące transkrepsję i t-ranslację DNA niezbędne do ekspresji DNA w pozncji 3' od tych rogiauówi DNA kodujące polipeptyn hoioralogiczny, w pozycji 3' od tych regionów regul_at_orogiyc^ó DNA; oraz DNA kanu2ące sygnały stop transkrypcji i translaj znajdujące tię w pocycji 3' od opisanego DNA hetorolog^jcznega, przy czym elemency te zestawie sⁱę w frnkjjanalną catość, następnie trantfoπkaje się ^aospodarza halobaktornjnoga elementami złożonym! powoduje się ekspresję opisakega DNA kodułącogo 2olipekted hetejolkgicznn, izoluje się 2olipop^jtjn heterologiczny; oraz ewentualnie oczyszcza się polikekted hotoroⁱogiczny.

    176 653
13. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że elementy zawierają dodatkowe DNA kodujące sekwencję C-końcową genu bakteriorodopsynowego i DNA kodujące unikalne miejsce cięcia dla proteazy oraz miejsce cięcia enzymem restrykcyjnym, w określonej kolejności, między sekwencją C-końcową i dNa kodującym polipeptyd heterologiczny, przy czym dodatkowe DNA zaczyna się w pozycji 3' od DNA kodującego polipeptyd heterologiczny.
14. 15. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że sekwencje regulatorów transkrypcji, translacji i sygnały stop transkrypcji i translacji pochodzą z genu bakteriorodopsyny.
15. 16. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że polipeptyd heterologiczny jest katalityczną podjednostkątranskarbamylazy asparaginianowej z Escherichia coli.
16. 17. Sposób wytwarzania polipeptydów het urologicznych w gospodarzu halobakteryjnym, znamienny tym, że indukuje się ekspresję DNA kodującego polipeptyd heterologiczny, przy czym DNA znajduje się na wektorze ekspresyjnym, którym transformuje się halobakterium; izoluje się polipeptyd heterologiczny; oraz ewentualnie polipeptyd heterologiczny poddaje się oczyszczaniu.
17. 18. Sposób wytwarzania polipeptydów heterologicznych w gospodarzu halobakteryjnym, znamienny tym, że indukuje się ekspresję DNA kodującego polipeptyd heterologiczny i C-końcowa sekwencję genu bakteriorodopsyny z operacyjnego wektora ekspresyjnego, którym transformuje się opisane halobakterium, a sekwencja C-końcowa zaczyna się w pozycji 3' od DNA kodującego polipeptyd heterologiczny; po ekspresji DNA kodującego polipeptyd heterologiczny i region C-końcowy bakteriorodopsyny izoluje się błony halobakterium; izoluje się polipeptyd heterologiczny; oraz ewentualnie oczyszcza się polipeptyd heterologiczny.
18. 19. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że opisane dNa zawiera dodatkowe DNA kodujące unikalne miejsce cięcia dla proteazy, znajdujące się pomiędzy DNA kodującym polipeptyd heterologiczny a DNa kodującym C-końcową sekwencję bakteriorodopsyny, przy czym dodatkowe DNA zaczyna się w pozycji 3' od opisanego DNA kodującego polipeptyd heterologiczny.