JPH0634724B2 - プラスミド - Google Patents
プラスミドInfo
- Publication number
- JPH0634724B2 JPH0634724B2 JP57147035A JP14703582A JPH0634724B2 JP H0634724 B2 JPH0634724 B2 JP H0634724B2 JP 57147035 A JP57147035 A JP 57147035A JP 14703582 A JP14703582 A JP 14703582A JP H0634724 B2 JPH0634724 B2 JP H0634724B2
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- JP
- Japan
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- fragments
- plasmid
- molecular weight
- added
- solution
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- Expired - Lifetime
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
Description
【発明の詳細な説明】 本発明はプラスミドに関する。詳しくは高度好塩菌ハロ
バクテリウムハロビウムから得られる新規なプラスミド
に関する。
バクテリウムハロビウムから得られる新規なプラスミド
に関する。
染色体外遺伝子であるプラスミドは、インビトロ(in vi
tro)遺伝子組換えにおけるベクター(vector)として、遺
伝子工学において広く用いられており、インビトロ遺伝
子組換え技術は、有用な微生物の育種をはじめとして用
途が広い。
tro)遺伝子組換えにおけるベクター(vector)として、遺
伝子工学において広く用いられており、インビトロ遺伝
子組換え技術は、有用な微生物の育種をはじめとして用
途が広い。
本発明者等は、高い塩濃度がデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）の高次構造に及ぼす影響を検討するため、高度好塩
菌プラスミドを検索中のところ、ハロバクテリウムハロ
ビウムから新しいプラスミドを分離することに成功し、
本発明を達成した。すなわち、本発明の要旨は、高度好
塩菌ハロバクテリウムハロビウムＲ１は株（微工研菌寄
6677号）から得られ、制限酵素に対し下記の分解特性を
有する分子量２７メガダルトン塩基組成ＧＣ（％）＝6
1、融解温度(Tm)92.5℃の環状プラスミド BamHＩで６個の断片に、Hind IIIで２個の断片に、Bal
Ｉで６個の断片に、Pvu IIで７個の断片に、KpnＩで４
個の断片に、HpaＩで２個の断片にPstＩで８個の断片に
それぞれ分解される。
Ａ）の高次構造に及ぼす影響を検討するため、高度好塩
菌プラスミドを検索中のところ、ハロバクテリウムハロ
ビウムから新しいプラスミドを分離することに成功し、
本発明を達成した。すなわち、本発明の要旨は、高度好
塩菌ハロバクテリウムハロビウムＲ１は株（微工研菌寄
6677号）から得られ、制限酵素に対し下記の分解特性を
有する分子量２７メガダルトン塩基組成ＧＣ（％）＝6
1、融解温度(Tm)92.5℃の環状プラスミド BamHＩで６個の断片に、Hind IIIで２個の断片に、Bal
Ｉで６個の断片に、Pvu IIで７個の断片に、KpnＩで４
個の断片に、HpaＩで２個の断片にPstＩで８個の断片に
それぞれ分解される。
に存する。
本発明を詳細に説明するに、本発明における供試菌は、
高度好塩菌ハロバクテリウムハロビウム(Halobacterium
halobium)R1由来の変異株である。ハロバクテリウムハ
ロビウムR1は株（微工研菌寄第6677号）である。
高度好塩菌ハロバクテリウムハロビウム(Halobacterium
halobium)R1由来の変異株である。ハロバクテリウムハ
ロビウムR1は株（微工研菌寄第6677号）である。
この菌は所謂古細菌（アルケバクテリア）に属し、唯一
のプラスミドを有し、通常約２５％濃度の食塩の存在下
においてのみ、生育し、かつ細胞内は低濃度であるため
細胞膜を挾んでNa+イオンを積極的に排除する機構をも
つている。視紅素（ロドプシン）と類似するバクテリオ
ロドプシンを有し、光の刺激に対して電子を動かす仕組
みをもつている。さらにアルギニンを唯一のエネルギー
源として嫌気的にＡＴＰを生産することができ、またそ
の構成成分としてイソプレノイドの誘導体、カロチノイ
ドの誘導体などの有用成分が見出されている。
のプラスミドを有し、通常約２５％濃度の食塩の存在下
においてのみ、生育し、かつ細胞内は低濃度であるため
細胞膜を挾んでNa+イオンを積極的に排除する機構をも
つている。視紅素（ロドプシン）と類似するバクテリオ
ロドプシンを有し、光の刺激に対して電子を動かす仕組
みをもつている。さらにアルギニンを唯一のエネルギー
源として嫌気的にＡＴＰを生産することができ、またそ
の構成成分としてイソプレノイドの誘導体、カロチノイ
ドの誘導体などの有用成分が見出されている。
本発明のプラスミドは、上述のハロバクテリウムハロビ
ウムR1は株の菌体を、後記実施例に具体的に記述する方
法に従つて、低張液で溶菌し、アルカリ処理して得られ
るプラスミド分画をフエノールで除蛋白し、精製するこ
とによつて分離することができる。
ウムR1は株の菌体を、後記実施例に具体的に記述する方
法に従つて、低張液で溶菌し、アルカリ処理して得られ
るプラスミド分画をフエノールで除蛋白し、精製するこ
とによつて分離することができる。
本発明のプラスミドの分子量は、アガロースゲル電気泳
動および透過型電子顕微鏡写真による測定の結果から、
２７メガダルトン(38.5キロベース）である。また塩基
組成はGC(%)＝６１であり、融解温度(Tm)は92.5℃であ
る。
動および透過型電子顕微鏡写真による測定の結果から、
２７メガダルトン(38.5キロベース）である。また塩基
組成はGC(%)＝６１であり、融解温度(Tm)は92.5℃であ
る。
さらに、本発明のプラスミドの制限酵素による分解断片
の分子量はつぎの通りである。
の分子量はつぎの通りである。
分子量（単位はメガダルトン） BamHＩ：7.3,5.9,5.3,2.95,2.9,2.7 Hind III：22.4,4.6 BalＩ：8.8(２本),3.1,2.7,2.4,1.3 Pvu II：11.2,3.9,3.0,2.7,2.4,2.2,1.4 KpnＩ：11.6,10.6,3.6,1.2 HpaＩ：13.9,13.0 PstＩ：9.8,6.2,2.8,2.5,1.7,1.5,1.3,0.8 以上に述べたように、本発明のプラスミドは、各種の制
限酵素による適当な切断部位を備え、またその分子量も
既知のものよりも遥かに小さい。さらに、前記の好塩菌
ハロバクテリウムハロビウムR1株の諸性状に徴し、本発
明のプラスミドは、例えば、イソプレノイド誘導体、カ
ロチノイド誘導体などの有用成分の産生用ベクターとし
ての用途が期待される。
限酵素による適当な切断部位を備え、またその分子量も
既知のものよりも遥かに小さい。さらに、前記の好塩菌
ハロバクテリウムハロビウムR1株の諸性状に徴し、本発
明のプラスミドは、例えば、イソプレノイド誘導体、カ
ロチノイド誘導体などの有用成分の産生用ベクターとし
ての用途が期待される。
以下本発明を実施例について説明する。
実施例 (1)菌の培養 ハロバクテリウムハロビウムR1は（株）を下記組成の寒
天培地上に接種し、３７℃で約４日間静置培養する。
天培地上に接種し、３７℃で約４日間静置培養する。
寒天培地１の組成(pH6.5) イーストエキス ５ｇ バクトトリプトン ５ｇ NaCl ２５０ｇ MgSO4・7H2O ５ｇ CaCl2 0.2ｇ 寒 天 １５ｇ 得られたコロニーを下記組成の液体培地（本培養の1/10
倍量）中に植菌し、３７℃で約３日間振とう培養し、前
培養を行う。
倍量）中に植菌し、３７℃で約３日間振とう培養し、前
培養を行う。
これを、本培養の液体培地に植え継ぎ、３７℃で約１日
間振とう培養を行う。
間振とう培養を行う。
液体培地１の組成(pH6.5) カザミノ酸 7.5ｇ イーストエキス １０ｇ NaCl ２５０ｇ MgSO4・7H2O ２０ｇ クエン酸ナトリウム ３ｇ KCl ２ｇ １mlの4.98%FeSO4・7H2O(W/V) (2)プラスミドの調製 (1)で得られた培養液から遠心で菌体を集める。これ
を、下記組成の洗菌用緩衝液にサスペンドし、7,000rp
m、１０分間遠心して、上清をすてる。
を、下記組成の洗菌用緩衝液にサスペンドし、7,000rp
m、１０分間遠心して、上清をすてる。
洗菌用緩衝液100mlの組成(pH6.5) NaCl ２５ｇ MgSO4・7H2O ２ｇ クエン酸ナトリウム 0.3ｇ KCl 0.2ｇ このようにして得られた菌体を溶液Ｉ〔５０mM グルコ
ース、１０mM CyDTA（シクロヘキサンジアミン四酢
酸）、２５mM トリス塩酸pH8.0〕１mlにサスペンド
し、さらに同溶液９mlを加え均一にとかす。次に、溶液
II〔0.2M MaOH、1%(W/V)ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）〕２０mlを加え、０℃で１０分間静かに攪拌する。
さらに溶液III〔3M CH3COOK、2M CH2COOH〕１５mlを加
え、０℃で２０分間放置し、変性タンパク、ＳＤＳ変性
ＤＮＡ等を沈殿させる。これを12000rpmで１５分間遠心
し、上清をとり、0.6倍量のイソプロパノールを加え
て、攪拌してのち、−２０℃で一晩放置する。
ース、１０mM CyDTA（シクロヘキサンジアミン四酢
酸）、２５mM トリス塩酸pH8.0〕１mlにサスペンド
し、さらに同溶液９mlを加え均一にとかす。次に、溶液
II〔0.2M MaOH、1%(W/V)ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）〕２０mlを加え、０℃で１０分間静かに攪拌する。
さらに溶液III〔3M CH3COOK、2M CH2COOH〕１５mlを加
え、０℃で２０分間放置し、変性タンパク、ＳＤＳ変性
ＤＮＡ等を沈殿させる。これを12000rpmで１５分間遠心
し、上清をとり、0.6倍量のイソプロパノールを加え
て、攪拌してのち、−２０℃で一晩放置する。
次いで、5000rpm、１０分間遠心し、上清を捨て沈殿物
を５０mM トリス塩酸(pH8.0)−0.1M CH3COONa緩衝液に
とかし、等量の水飽和フエノールを加え、手で振とうし
て遠心により、水層を集める。
を５０mM トリス塩酸(pH8.0)−0.1M CH3COONa緩衝液に
とかし、等量の水飽和フエノールを加え、手で振とうし
て遠心により、水層を集める。
さらに、クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：
１v/v)を等量加え、振とうし、これを遠心して水層を集
め、再度クロロホルム−イソアミルアルコールを加えて
除蛋白を行う。
１v/v)を等量加え、振とうし、これを遠心して水層を集
め、再度クロロホルム−イソアミルアルコールを加えて
除蛋白を行う。
このようにして得られた水層に、２倍量のエタノールを
加えて攪拌して−２０℃で２〜３時間放置する。次い
で、5000rpm１０分間の遠心でＤＮＡを沈殿させ、５０m
M トリス塩酸−２５mM Na3EDTA緩衝液(pH8.0)に溶解し
て、再び２倍量のエタノールで沈殿させてCH3COONaを除
去し、アルコールをできるだけ除いてから、１０mlの５
０mMトリス塩酸−２５mM Na3EDTA緩衝液に溶解し、さら
に同緩衝液で、溶液１２ｇに調整する。次に、13.2ｇの
セシウムクロライドを加え、５mg/ml H2Oエチジウムブ
ロマイド2.4mlを加えて静かに混合する。これを、ポリ
アロマーチユーブにいれ、アルミキヤツプをつけた後、
上部の穴から、流動パラフインを重層し、35,000rpmで
４０〜４８時間、１５℃で遠心を行う。
加えて攪拌して−２０℃で２〜３時間放置する。次い
で、5000rpm１０分間の遠心でＤＮＡを沈殿させ、５０m
M トリス塩酸−２５mM Na3EDTA緩衝液(pH8.0)に溶解し
て、再び２倍量のエタノールで沈殿させてCH3COONaを除
去し、アルコールをできるだけ除いてから、１０mlの５
０mMトリス塩酸−２５mM Na3EDTA緩衝液に溶解し、さら
に同緩衝液で、溶液１２ｇに調整する。次に、13.2ｇの
セシウムクロライドを加え、５mg/ml H2Oエチジウムブ
ロマイド2.4mlを加えて静かに混合する。これを、ポリ
アロマーチユーブにいれ、アルミキヤツプをつけた後、
上部の穴から、流動パラフインを重層し、35,000rpmで
４０〜４８時間、１５℃で遠心を行う。
U.Vランプをあてると、２本のシヤープなバンドが見え
るので下の方のバンドを集め、セシウムクロライド−エ
チジウムブロマイドの溶液〔５０mM トリス塩酸(pH8.
0)−２５mM Na3EDTA 8.0ｇ、セシウムクロライド8.8
ｇ、1.25mg/ml H2Oエチジウムブロマイド1.6ml〕を加え
て、再度35,000rpm４０〜４８時間、１５℃で遠心す
る。ＵＶランプをあてると、バンドが１本観察されるの
で、これを取り出し、ｎ−ブタノールで４〜５回抽出し
てエチジウムブロマイドを除き、透析チユーブにいれて
１０mM トリス塩酸(pH8.0)−１mM Na3EDTA緩衝液に対
し、数時間以上４℃で透析する。得られたプラスミド
は、４℃で保存する。
るので下の方のバンドを集め、セシウムクロライド−エ
チジウムブロマイドの溶液〔５０mM トリス塩酸(pH8.
0)−２５mM Na3EDTA 8.0ｇ、セシウムクロライド8.8
ｇ、1.25mg/ml H2Oエチジウムブロマイド1.6ml〕を加え
て、再度35,000rpm４０〜４８時間、１５℃で遠心す
る。ＵＶランプをあてると、バンドが１本観察されるの
で、これを取り出し、ｎ−ブタノールで４〜５回抽出し
てエチジウムブロマイドを除き、透析チユーブにいれて
１０mM トリス塩酸(pH8.0)−１mM Na3EDTA緩衝液に対
し、数時間以上４℃で透析する。得られたプラスミド
は、４℃で保存する。
(3)分子量の測定 (2)で得られたプラスミドをアガロースゲル電気泳動及
び電子顕微鏡写真により、分子量を測定した結果、分子
量は、２７メガダルトンであることが判明した。使用し
たアガロースゲル電気泳動及びＤＮＡの検出条件は、下
記の通りである。
び電子顕微鏡写真により、分子量を測定した結果、分子
量は、２７メガダルトンであることが判明した。使用し
たアガロースゲル電気泳動及びＤＮＡの検出条件は、下
記の通りである。
電気泳動装置：サブマリン型電気泳動装置（１７×１３
cm）を使用した。
cm）を使用した。
電気泳動：0.09Mトリス、0.09Mホウ酸、2.5mM Na2EDTA
を含む緩衝液に１％(w/v)のアガロースを溶解させて、
その上にＤＮＡサンプルを置いて、１００Ｖ、３〜４時
間泳動を行う。
を含む緩衝液に１％(w/v)のアガロースを溶解させて、
その上にＤＮＡサンプルを置いて、１００Ｖ、３〜４時
間泳動を行う。
泳動後、ゲルを0.2μｇ／mlのエチジウムブロマイド溶
液にひたして染色し、ＵＶ２５４nm照射下で、ポラロイ
ドフイルムで撮影する。
液にひたして染色し、ＵＶ２５４nm照射下で、ポラロイ
ドフイルムで撮影する。
(4)制限酵素による分解 (2)で得られたプラスミドを表１の各種制限酵素と共に
表１の緩衝液中で３７℃、１時間反応させる。反応溶液
に５０mM Na2EDTA、５％ＳＤＳ、２５％グリセリン、0.
05%(w/v)ブロムフエノールブルーの混合溶液を1/5倍量
加え反応を停止させ、アガロースゲル電気泳動法によ
り、ＤＮＡ断片の分子量を測定した。インターナルマー
カーとしては、λＤＮＡをHind IIIおよびBamHＩで分解
したＤＮＡ断片を、またColE１／（プラスミド）をHae
IIで分解したものを使用した。
表１の緩衝液中で３７℃、１時間反応させる。反応溶液
に５０mM Na2EDTA、５％ＳＤＳ、２５％グリセリン、0.
05%(w/v)ブロムフエノールブルーの混合溶液を1/5倍量
加え反応を停止させ、アガロースゲル電気泳動法によ
り、ＤＮＡ断片の分子量を測定した。インターナルマー
カーとしては、λＤＮＡをHind IIIおよびBamHＩで分解
したＤＮＡ断片を、またColE１／（プラスミド）をHae
IIで分解したものを使用した。
各種制限酵素で分解して得られた断片の分子量を表２に
示す。
示す。
Claims (1)
- 【請求項１】高度好塩菌ハロバクテリウムハロビウムＲ
１は株（微工研菌寄6677号）から得られ、制限酵素に対
し下記の分解特性を有する、分子量27メガダルトン、塩
基組成ＧＣ（％）＝61、融解温度(Tm)92.5℃の環状プラ
スミド。 ＢａｍＨ Ｉで６個の断片に、ＨｉｎｄIIIで２個の断
片に、Ｂａｌ Ｉで６個の断片に、ＰｖｕIIで７個の断
片に、Ｋｐｎ Ｉで４個の断片に、Ｈｐａ Ｉで２個の
断片にＰｓｔ Ｉで８個の断片にそれぞれ分解される。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57147035A JPH0634724B2 (ja) | 1982-08-25 | 1982-08-25 | プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57147035A JPH0634724B2 (ja) | 1982-08-25 | 1982-08-25 | プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5936700A JPS5936700A (ja) | 1984-02-28 |
| JPH0634724B2 true JPH0634724B2 (ja) | 1994-05-11 |
Family
ID=15421048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57147035A Expired - Lifetime JPH0634724B2 (ja) | 1982-08-25 | 1982-08-25 | プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0634724B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0690913A1 (en) * | 1993-03-25 | 1996-01-10 | The Regents Of The University Of California | Expression of heterologous polypeptides in halobacteria |
-
1982
- 1982-08-25 JP JP57147035A patent/JPH0634724B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃｈｅｓｋａｙａＫｈｉｍｉｙａ８（２）（１９８２）Ｐ．２６６−２６８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5936700A (ja) | 1984-02-28 |
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