Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych kompleksów inkluzyjnych cyklodekstry¬ ny i indometacyny.Wiadomo, ze cyklodekstryny tworza kompleksy inkluzyjne z innymi czasteczkami o odpowiednich wymiarach i polarnosci [J.Pharm.Sci.64, 1583(1975)].Cyklodekstryny lub dekstryny Schardingera sa cykloamylozami lub cykloglukanami, czyli pier¬ scieniowymi oligosacharydami, których najwazniej¬ szymi przedstawicielami sa a-cykliodeksttryna skla¬ dajaca sie z 6 jednostek anhydroglukopiranozo- wych i /?-cyklodekstryna skladajaca sie 7 jed¬ nostek anhydaroglukopiranozowych.IndometacynaR, czyli kwas li- -5-metoksy-2-metyloindolo-3-octowy, jest znanym lekiem przeciwzapalnym obarczonym jednak ta wada, ze powoduje owrzodzenia, opis patentowy W. Brytanii nr 997 638. Zwiazek ten wykazuje ponadto dzialanie ochronne podczas ciazy.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze kompleks inklu- zyjny cyklodekstryn z indometacyna w stosunku molowym okolo 2 : 1 nie ma ubocznego dzialania wrzodotwórczego a równoczesnie wykazuje calko¬ wicie taka sama aktywnosc przeciwzapalna i och¬ ronna podczas ciazy jak indometacyna.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych kompleksowi inkluzyjnych cyklodekstry¬ ny z indometacyna w stosunku molowym okolo 2 : 1 polegajacy na poddaniu reakcji okolo 2 moli a-lub /^-cyklodekstryny z 1 molem indometacyny 10 ii 20 25 podczas ogrzewania, w obecnosci rozpuszczalnika organicznego rozpuszczajacego indometacyne, a nie tworzacego z cyklodekstryna trwalego kompleksu i oddzieleniu powstalego kompleksu.Wzajemne oddzialywanie cyklodekstryn i indo¬ metacyny badali Hamada, Nambu i Nagai [Chem.Pharm.Bull. 23. 1205(1975)] i zaobserwowali, ze wzrost stezenia cyklodekstryny w roztworze wod¬ nym powoduje, ze rozpuszczalnosc indometacyny równiez wzrasta. Ta droga pierwotna rozpuszczal¬ nosc w temperaturze 35°C moze byc zwiekszona z 3,5 • 10-4 molaAitr do 9y8 • 10—4 mola/litr, czyli 2,8-krotnie.Stwierdzono, ze indometacyna w roztworze wod¬ nym hydrolizuje gwaltownie w obecnosci glukozy, wolno w obecnosci a ^cykiodekstryny, a ^-cyklo¬ dekstryna hamuje hydrolize indometacyny.Kurozumi, Nambu i Nagai [Chem^Pharm.Bull., 23, 3062 (1975)] próbowali otrzymac kompleks cyklo¬ dekstryny z indometacyna. Wedlug jednej z prób 100 ml 10—3 molarnego roztworu cyklodekstryny wytrzasano w temperaturze pokojowej z 20 ml 3 • 10—3 molarnego eterowego roztworu indometa¬ cyny w ciagu 24 godzin i produkt krystalizowano po ochlodzeniu roztworu do temperatury 2°C.Jednak wytracana substancja nie zawierala indo¬ metacyny a stanowila czysta /?-cyfclodekstryne.Wynik próby interpretowano we wspomnianym artykule tym, ze pusta srednica jff-cykiodekstryny wynosi tylko 0,7—0,8 mm, podczas gdy srednica 117 208117 208 czastki indometacyny jest równa 0,85 mm, czyli jest zbyt duza na to, aby mogla zostac wbudo¬ wana we wglebienie ^-cyklodekstryny.Czyniono równiez wysilki zmierzajace do otrzy¬ mania kompleksu na drodze liofilizacji. Iridometacy- ne przeksztalcono dzialaniem 2&'D/o /wodnego roztwo¬ ru wodorotlenku amonu w sól amonowa, która roz¬ puszczono w wodzie. Do roztworu dodawano równomolowa ilosc /7-cyklodekstryny w postaci roztworu wodnego i mieszanine zamrazano a nas¬ tepnie Liofilizowano. Otrzymany produkt zawieral oba zwiazki wyjsciowe indometacyne i cyklodek- stryne w' postaci mieszaniny, czyli w stosunku molowym 1:1 {wedlug cytowanego artykulu sto¬ sunek indometacyny do cyklodekstryny wynosil 0,92 : 1).W celu udowodnienia, ze mieszanina do stosun¬ ku molowym 1': 1 jest w istocie kompleksem, auto¬ rzy omówili wykresy dyfrakcji promieni rentge¬ nowskich przez proszek, ale wykresy te nie zosta¬ ly opublikowane. Diagram proszkowy dyfrakcji promieni rentgenowskich otrzymane z ibufenac, czy¬ li kwasu (p-izobutylofenylo) octowego, przez kry¬ stalizacje i liofilizacje, zostaly podane w omawia¬ nym artykule, przy czym mozna zauwazyc, ze . wykresy proszkowe liofilizowanej /j-cyklodekstry- ny i liofilizowanego kompleksu ibufenac-^-cyklo- 'dekstryna sa praktycznie takie same i odpowia¬ daja stanowi bezpostaciowemu.Wiadomo ogólnie, ze przez liofilizacje otrzymuje sie bezpostaciowe proszki, które nie wykazuja istotnych cech charakterystycznych przy zastoso¬ waniu technik ekspozycji proszku na promienio¬ wanie rentgenowskie w celu otrzymania obrazu dyfrakcyjnego.Takeo i Kuge [Agriic.Biol.Ohem. 34, 17&7 (1970)] podali, ze kompleksy inkluzyjne ^-cyklodekstryny w stanie bezwodnym daja identyczne wykresy dyfrakcji promieni rentgenowskich przez proszek, niezaleznie od rodzaju czasteczek stanowiacy gos¬ podarza kompleksu.W przypadku materialów liofilizowanych fakt tworzenia sie kompleksu nie moze byc okreslony na podstawie danych o dyfrakcji promieni ren¬ tgenowskich. W zwiazku z tym, to co opisano w omawianym artykule, nie moze byc traktowane jako wytwarzanie kompleksu indometacyna — cyk¬ lodekstryna, ale jako wytwarzanie fizycznej mie¬ szaniny soli amonowej indometacyny i cyklodek¬ stryny, która otrzymano jako produkt.Wedlug poczynionych obecnie obserwacji sole indometacyny nie moga byc zamkniete w kompleks inkluzyjny z cyklodekstryna, poniewaz sole te sa zbyt jonowe, czyli hydrofilne.Wymienieni autorzy japonscy postawili . sobie za cel otrzymanie kompleksu o stosunku molowym 1 :1 i nie odniesli sukcesu.Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania kom¬ pleksu okolo 2 czasteczek cyklodekstryny i 1 cza¬ steczki indometacyny.Indometacyna moze byc rozpatrywana jako zwia¬ zek dwufunkcyjny z punktu widzenia tworzenia kompleksu inkluzyjnego z cyklodekstryna, jako ze czesc czasteczki, grupa p-chlorofenylowa, moze byc wbudowana sama do wglebienia cyklodekstryny, a druga czesc czasteczki, czyli czesc zawierajaca grupe karboksylowa jest wbudowana w inna cza¬ steczke cyklodekstryny. Zgadnie z tym budowa kompleksu przedstawiona jest schematycznie na 5 fig. 1 na rysunku, przy czym puste krazki przed¬ stawiaja cyiklodekstryne widoczna ponizej.Stosunek molowy cyklodekstryny i indometacy¬ ny w kompleksie wynosi 2:1, ale kompleksy o sto¬ sunku molowym 1 : 1 moga byc wytwarzane rów- w niei, przy czym kompleks o stosunku molowym 1:1 nie tyko nie zmniejsza, ale nawet nasila szkodliwe dzialanie indometacyny, podczas gdy kompleks o stosunku molowym 2 :1 znacznie obni¬ za, dzialanie uboczne. Dane fizyko-chemiczne pot- 13 wierdzaja róznice miedzy tymi dwoma komplek¬ sami. Na przyklad, — wartosc stalej dysocjacji kwasu pKa znacznie wzrasta wskutek wlaczenia dwóch pierscieni cyklodekstryny. s Sposób wytwarzania kompleksu inkluzyjnego 20 wedlug wyinaiLazkiu polega na potdldainiiu wodnego irioHtiwoiru cyModetotiryiny xeakajii z .mzflwocrem iinido. (metaicymy w obojetnym rozpu&ziozaiMikiu. Jafao óbo- jeitny nozpujsizazaikiik orgainiiozny stosuje s&k taki roizpuisiziozakiiik, który rozpuszciza injoVxmejtaicy!ne 25 i nie tworzy trwalego kompleksu z cykJliojdelklsitryina.,'Koir-zystinyimi inoizpuisizazallnikarni sa alkafruole o 1—3 atomach wegla, takie jak metanol lub etanol, ketony, takie jak aceton lub etery,"takie jak czterowodorofuran lub eter etylowy. Reakcje 30 prowadzi sie korzystnie w temperaturze 50—100°C. zwlaszcza w temperaturze 60—80°C. Reakcje moz¬ na przeprowadzic wylacznie podczas ogrzewania, poniewaz w wewnetrznym wglebieniu cyklodek¬ stryny znajduja sie czasteczki wody utrzymywane 35 wiazaniami wodorowymi, które moga byc rozerwa¬ ne jedynie na skutek wzrostu temperatury. Reak¬ cja po kilku godzinach jest zakonczona. Kompleks wyodrebnia sie korzystnie przez ochlodzenie i od saczenie lub odwirowanie mieszaniny reakcyjnej. 40 Cyklodekstryne stosowana w reakcji mozna otrzy¬ mac ze skrobi hydrolizowanej wstepnie w miesza¬ ninie reakcyjnej przez dzialanie enzymem skro¬ biowym cyklodekistryny trains^gilukoKylazy. Wedlug iteij metody realizacji procesu zawieailne skriobii ze- 45 luje sie w podwyzsizoinej temperatiurze (100—20{y°C) i czesciowo hydrolizuje sie wstepnie alfa amyla- za. Hydrolizat wyjalawia sie i dodaje sie enzym cyklodekstrynaze, na przyklad enzym skrobiowy cyklodekstryno-trains-glikolaze. Konwersje prowa- 50 dzi sie 2—7 dni w temperaturze 40—50°. Otrzyma¬ na w ten sposób mieszanine zawierajaca cyklo¬ dekstryne ogrzewa sie ewentualnie po rozciencze¬ niu woda w celu zdezaktywowania enzymu i pod¬ czas ogrzewania dodaje sie alkohol. Otrzymana 55 zawiesine chlodzi sie, saczy i po przesaczeniu do¬ daje sie roztwór indometacyny w rozpuszczalniku organicznym. Reakcje tworzenia kompleksu inklu¬ zyjnego i wyodrebnianie produktu prowadzi sia w wyzej opisany sposób. Stosunek molowy okolo 60 2:1 moze wahac sie nie wiecej niz w zakresie ±10*/t, czyli w zakresie stosunków molowych 2 : 0,9 —1,1.Otrzymany nowy kompleks inkluzyjny .cyklo¬ dekstryny i indometacyna moze byc preparowany w znany sposób w celu otrzymania dopuszczalnych 63 do stosowania srodków farmaceutycznych, prze*117 208 6 dodanie obojetnych nosników stalych lub ciek¬ lych i ewentualnie rozczynników farmaceutycznych.Preparaty farmaceutyczne moga byc korzystnie przygotowywane w postaci odpowiedniej do poda¬ wania doustnie, na przyklad w postaci tabletek lub kapsulek. Podczas zestawiania preparatu na¬ lezy uwzglednic, ze zawartosc indornetacyny w kompleksie inkhizyjnym wynosi okolo 15—20%.Jeden ze skladników kompleksu inkluzyjnego, cyklodekstryna, jest korzystnym nosnikiem. Zgod¬ nie z tym masa do tabletkowania moze byc uzu¬ pelniona dalsza iloscia cyklodekstryny i dzieki temu równowaga kompleksu w srodowisku bio¬ logicznym, na przyklad w zoladku, jest nawet bardziej przesunieta w pozadanym kierunku i dlatego mozliwosc powodowania owrzodzen przez preparat jest dodatkowo ograniczana.Tabletki i kapsulki wykonuje sie znana metoda granulowania na sucho.Jezeli kompleks podaje sie doustnie, to dawka dzienna wynosi 25—200 mg/kg wagi ciala w prze¬ liczeniu na zawartosc indornetacyny w komplek¬ sie inkluzyjnym i moze byc podawana jednora¬ zowo lub w kilku porcjach w ciagu dnia.Nowy kompleks wykazuje szereg istotnych zalet fizyko-chemicznych i farmaceutycznych. Jak wspo¬ mniano, kompleks posiada przeciwzapalne dziala¬ nie indornetacyny, a przy tym znacznie mniejsze uboczne dzialanie wrzodotwórcze Dzieki temu mozna stosowac kompleks korzystnie jako sro¬ dek przeciwzapalny, posiadajacy dzialanie chro¬ niace ciaze, o znacznie zmniejszonym, szkodli¬ wym dzialaniu ubocznym. Komjpjleks jest duzo le¬ piej rozpuszczalny od indornetacyny.Badania absorpcji wykazuja, ze indometacyna podawana doustnie w postaci kompleksu daje wyz¬ szy poziom zawartosci we krwi niz wolna indo¬ metacyna, poniewaz absorpcja indornetacyny z kompleksem jest bardziej efektywna niz indorne¬ tacyny w postaci wolnej.Aktywnosc kompleksu cyklodekstryny z indo¬ metacyna w stosunku molowym 2 : 1 i brak hamo¬ wania dzialania wrzodotwórczego kompleksu o sto¬ sunku molowym 1 : 1 udowodniono w nastepuja¬ cych badaniach biologicznych.Kompleks o stosunku molowym 1 : 1 przygoto¬ wano w sposób opisany w przykladzie I, przy czym 1 mol cyklodekstryny poddano w reakcji z 1 molem indornetacyny. Podostra toksycznosc otrzymanego produktu badano tak samo jak tok¬ sycznosc kompleksu o stosunku molowym 2:1.Wyniki badan.Badanie resorpcji. 72 glodzone szczury podzie¬ lono na 3 grupy. Pierwszej grupie podano 5 mg indornetacyny doustnie, drugiej grupie podano kompleks cyklodekstryny zawierajacy 5 mg indo¬ rnetacyny, a trzeciej grupie traktowanej jako kon¬ trolna podano tylko wode. Po pewnym czasie 3—3 zwierzetom odcieto glowy i wykrwawiono.Z krwi wyodrebniono surowice i oznaczono zawar¬ tosc indornetacyny metoda chromatografii gazowej opisanej w artykulach W.G.Perry: J.Chromatogr. 89, 110 (1974) i Hellaberg EJ£foromatogr., 117, 167 (1970). 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 85 Wyniki przedstawione sa na fig. 2 na rysunku, gdzie poziom we krwi szczurów wywolany poda¬ niem inidometacyny lufb kompleksu cyklodekstry¬ ny z indometacyna o stosunku molowym 2 :1,, przy czym w obu przypadkach ilosc indornetacyny wy¬ nosi 5 mg, wykreslono w zaleznosci od czasu, który uplynal od chwili podania leku. Jak widac z wykresu na fig. 2 indometacyna podana w pos¬ taci kompleksu zapewnia wyzszy poziom zawar¬ tosci leku we krwi w calym okresie badania niz wolna indometacyna. CD+IND — kompleks otrzy¬ many wedlug przykladu I IND — indometacyna. Badanie aktywnosci ochro¬ ny ciazy indometacyna i kompleksem ^-cyklo¬ dekstryny z indometacyna u szczurów z wycie¬ tymi jajnikami.Badany zwiazek: Kompleks ^-cyklodekstryny z indometacyna w stosunku molowym 2:1.Substancja odniesienia: indometacyna.'Badane zwierzeta: samice szczura o sredniej wa¬ dze 3(08 g, pochodzace ze szczepu l€OFY.Leczenie: w 17-tym diniiu ciazy usunieto zwierze¬ tom jajniki i umieszczono je pojedynczo w klat¬ kach. W 18-tyim dniu ciazy 6 zwierzetom podano doustnie 1„25 mgykg wagi ciala zawiesiny indorne¬ tacyny w wodzie, a 6 zwierzetom podano doustnie kompleks zawierajacy te sama ilosc irudometacyny, równiez w postaci zawiesiny wodnej. 6 zwierzat traktowano jako grupe kontrolna. W 19-tyim i 20-tym dniu ciazy rano leczenie powtórzono/ czyli, zwierzeta otrzymaly lacznie 6,25 mgyikig wagi ciala indornetacyny i kompleksu zawierajacego od¬ powiednia ilosc iindometaieyny.Wyniki: rano w Zl-«izyim diniu ciazy dokonywano sekcji zwierzat i liczbe . poronien oznaczano na podstawie liczby implantacji w macicy i liczby plodów pozostalych w macicy. U zwierzat kon¬ trolnych srednio 16,1% calej liczby plodów pozo¬ stalo przy zyciu. Dwa sposród 6 zwierzat mialy 100% poronienie. U zwierzat leczonych indometa¬ cyna 58,8% wszystkich plodów pozostalo przy zy¬ ciu, a u zwierzat leczonych kompleksem 66,7% wszystkich plodów pozostalo przy zyciu. Porówna¬ nie obu grup leczonych iindometacyina i jej komp¬ leksem z grupa kontrolna wykazuje . znaczny pro¬ centowy wizrost Utrzymania plodu, inatoimiaist porównanie dzialania indometacyiny i jej komp¬ leksu nie wykazuje duzych róznic aktywnosci.Badania farmakologiczne. Badanie farmakolo¬ giczne aktywnosci przeciwzapaiLnej.Badany zwiazek: kompleks pncyklodekstryny z indometaicyna w stosunku molowym 2:1.Zwiazek odniesienia: indometacyna. iZwierzeta uzyte do badan: aktywnosc przeciw¬ zapalna badano na samicach szczura pochodzacych ze szczepu CFY; 10—10 zwierzat stosowano do zbadania kazdej substancji we wszystkich daw¬ kach. Zwierzeta w wieku 4—5 tygodni o sredniej wadze 90—110 g uzyto na poczatku serii badan, przy czym dla kazdej serii brano grupe kontrolna liczaca 10 zwierzat.Leczenie: aktywnosc przeciwzapalna badano w tescie ostrym. Zwierzetom podawano badany zwia¬ zek i indornetacyne jako zwiazek odniesienia dou¬ stnie, w postaci zawiesiny w 1% metylocelulozie,117 208 pirizez sonde przelykowa. Zwierzetom leczonym i nielaczonyim podano podpodeszwowo 0,1 ml/zwie¬ rze 0,5% roztworu wywolujacego zapalenie kanra- geneim.Dawki: kompleks p-cyklodekstryna-iindomeitaicyna podawano w dawkach: 8,06—iiajlla—B4yl»—32,24 i 40,3 mg/kg, a indomeitacyne w daiwkach 1—2—3—4 i 5 mg/kg. Kompleks p-eyklodeksitryna-indometa- cyna zawieral 12,4°/o leku, czyli 1 nug indometa¬ cyny byl równowazny 8,06 mg kompleksu, i w celu lepszego porównania stosowano podane wyzej daw¬ ki. Grupa kontrolna otrzymala doustnie l°/o me- tyioceluloze.Badamie: aktywnosc parzeciiwzapalna badano na szczurach glodzonych 16 godzin.Leczenie: substancje przeciwzapalne podawano badanym zwierzetom doustnie, przy czym karra- genen wywolujacy zapalenie podawano podpo¬ deszwowo, a 1 ml letniej wody z kranu podano kazdemu zwierzeciu doustnie. W 3 godziny po podaniu leku zwierzeta likwidowano i oznaczano ciezar oddzielonych lap zwierzat traktowanych i nietraktowanych karragenem. Lapy oddzielano ponad sródreczem.Ocena: róznica ciezaru lap traktowanych i nie¬ traktowanych u tego samego zwierzecia zostala oznaczona po oddzieleniu ich od korpusu, przy czym za 100% uznano przyrost ciezaru u grupy kontrolnej, a wyniki uzyskane dla grupy leczo¬ nej porównywano z wynikami grupy kontrolnej.Aktywnosc przeciwzapalna w przypadku zwie¬ rzat leczonych róznymi dawkami kompleksu /?-cy- klodekstrynaindometacyna i indometacyny prze¬ liczono na wartosci procentowe. Otrzymane wy¬ niki przedstawia fig. 3 na rysunku.Z otrzymanych danych wynika, ze aktywnosci przeciwzapalne kompleksu ^-cyklodekstryna-indo- metacyna i indometacyny porównywane w sta¬ nie ostrego zapalenia nie wykazuja istotnych róznic. Aktywnosc przeciwzapalna wzrasta pro¬ porcjonalnie do stopnia przyrostu dawki, przy czym aktywnosc jest przesunieta w kierunku kompleksu. Wynika z tego, ze indometacyna jest lepiej absorbowana z kompleksu niz gdy jest po¬ dana w stanie wolnym.Badanie szybkosci z jaka zwiazek przestaje dzialac i czasu trwania jego aktywnosci. Badany zwiazek, substancja odniesienia, zwierzeta, lecze¬ nie, dawki i badania byly takie same jak opisa¬ ne powyzej. Róznice w postepowaniu beda wi¬ doczne z ponizszego opisu. W tej serii testów przeprowadzono nastepujace badania: 1. Jednoczesnie podawanie srodka przeciwzapal¬ nego z karragenem i ocena wyników w róznym czasie po podaniu leku, czyli po 3, 6, 24 i 28 godzinach. 2. Karragenen podawano 1, 2 lub 3 godziny po podaniu srodka przeciwzapalnego, a wyniki oce¬ niano po uplywie 3 godzin. Zwierzeta likwido¬ wano eterem i okreslano ciezar oddzielonych lap traktowanych i nietraktowanych karragenenem, przy czym lapy oddzielano ponad sródreczem.Ocena: wyliczono róznice ciezaru lap traktowa¬ nych i nietraktowanych u tego samego zwierze¬ cia, przy czym przyrost ciezaru grupy kontro!- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 nej uznawano za 100°/o zapalenia i wyniki uzys¬ kane dla grupy zwierzat leczonych porównywano z grupa kontrolna. Aktywnosc przeciwzapalna wyrazano w procentach, a otrzymane wyniki na¬ niesiono na wykresy fig. 4 i fig. 5. 1. Jezeli srodek przeciwzapalny badany jest razem z karragenenem to z uzyskanych danych wynika, ze aktywnosc przeciwzapalna utrzymuje sie po 3 i 6 godzinach od podania karragenenu, natomiast po uplywie 24 i 48 godzin aktywnosc karragenenu sipada -tak dalece, ze uzyskane wyni¬ ki nie odpowiadaja juz rzeczywistosci. Zgodnie z uzyskanymi wynikami kompleks /?-cyklodekstry- na-indometacyna przeciwdziala stanowi zapalne¬ mu bardziej skutecznie niz indometacyna i jego aktywnosc prawie nie zmniejsza sie w ciagu 6 godzin po podaniu, natomiast w przypadku indo¬ metacyny zapalenie rozwija sie po uplywie 6 go¬ dzin zamiast zmniejszac sie (fig. 5). 2. Po uplywie 1, 2 i 3 godzin po podaniu srodka przeciwzapalnego zastosowano karrage¬ nen, a w 3 godziny pózniej dokonano oceny, któ¬ ra wykazala, ze aktywnosc przeciwzaipaiLna kom¬ pleksu ^-cyklodekstryna-indometacyna jest wyz¬ sza od aktywnosci indometacyny. Nachylenie linii (fig. 4) wskazuje, ze indometacyna wlaczona w kompleks dziala znacznie szybciej jako srodek przeciwzapalny niz indometacyna.Podsumowujac mozna stwierdzic, ze kompleks /?-cyklodekstryna-indometacyna dziala znacznie szybciej i przez dluzszy czas niz indometacyna.Badanie podostrej toksycznosci kompleksu (3-cyklodekstryna-indometacyna (test wrzodowy) na szczurach. Badanym zwiazkiem jest kompleks /7-eyklodekstryna-indoTnetacyna otrzymany we¬ dlug pnzyklaidiu I i .indomeitacyina jako substancja odniesienia.Zwierzeta: badanie podostrej toksycznosci pro¬ wadzono na zwierzetach plci zenskiej i meskiej pochodzacych ze szczepu CFY; 10—10 zwierzat traktowano kaizda substancja podajac ja zarówno osobnikom meskim jak i zenskim. Na poczatku badania zwierzeta mialy po 7 tygodni i wazyly 150—170 g. Zwierzeta trzymano w stalej tempe¬ raturze 22—24°C i przy stalej wilgotnosci wzgled¬ nej 45—50°/o. Podczas podawania badanej sub¬ stancji zwierzeta byly na standardowej diecie i pily wode zgodnie z potrzebami.Traktowanie: podostra toksycznosc badano w ciagu 4 godzin. Zwierzeta traktowano badanym zwiazkiem rano, przy czym badany zwiazek i substancje odniesienia podawano w postaci za^ wiesiny przygotowanej z Wo metyloceluloza przez sonde przelykowa. Zwierzeta kontrolne otrzymy¬ waly doustnie l°/o metyloceluloza. Przyrost wagi zwierzat i ich stan kliniczny rejestrowano w kaz¬ dym tygodniu badania.Dawki: i 1, Kontrolna: 1% zawiesina metylocelulozy w ilosci 0,2 ml/100 g, doustnie, 2. Zawiesina 40,3 mg/kg kompleksu /?-cyklo- dekstryna-indometacyna, doustnie. 3. Zawiesina 5,0 mg/kg indometacyny, doustnie.Obserwacje: zwierzeta traktowano przez 28 dni,117208 M 1. U 10% zwierzat plci meskiej z grupy trakto* wanej 1% metyloceluloza stwierdzono nadzerki. 2. 30% zwierzat pici meskiej z grupy trakto¬ wanej 40,3 mg/kg kompleksu padlo do 7 dmda a 30% zwierzat pici zenskiej padlo do 25 dnia. 3. 80% zwierzat plci meskiej z grupy trakto¬ wanej 5 mg/kg inctameitacyny padlo dio 14 cinia ai 60% zwiieirzait plci zenskiej padlo 2)1 cln-ia.Liczbe znalezionych owrzodzen i nadzerek u traktowanych zwierzat w poszczególnych gru¬ pach podano w tablicy I.Tablica I Grupa zwierzat kontrolna 40,3 mg/kg kompleksu cyklodekstryny z indometacyna 5,0 mg/kg indometacyny Wrzód osobnik me¬ ski 0/10 2/10 7/10 zen¬ ski 0/10 1/10 6/10 Nadzerka osobnik me¬ ski 1/10 4/10 9/10 zen¬ ski 0/10 4/10 7/10 Przyrost ciezaru ciala. W tablicy II zestawiono oznaczone co tydzien ciezary ciala. Z danych wy¬ nika, ze przyrost ciezaru ciala zwierzat plci zen¬ skiej i meskiej, które traktowano badanym zwiazkiem i zwiazkiem odniesienia nie rózni sie w istotnym stopniu od przyrostów ciezaru ciala zwierzat z grupy kontrolnych. Wartosci ciezaru ciala zwierzat plci zenskiej i meskiej traktowa¬ nych dawka 5 mg/kg indornetacyiny. daje praw¬ dziwy obraz tylko w ciagu trzech tygodni trakto¬ wania, poniewaz w czwartym tygodniu duzy pro¬ cent zwierzat padlo.Talblica II 'Sredni.'przyiroist oi-ej^airu ciala dg) Osobnik Meski kanitroila 40„,3 mg/kg kompleksu 5,0 mg/kg 'iodojme- itacyny Zenski kontrola 40J3 mg/kg komplelkisfu fyfi tog/kg iindome- taicymy Tydlzien 0 1152,5 161,0 164,5 154,5 164,5 161,3 1 1,96,5 206,2 210,7 183,0 190,5 182,0 2 3 | 240,5 253,8 212,5 209,0 212,0 177,5 276,5 303,6 287,5 222,0 212,0 206,5 4 300,5 339;,3 320,0 2141,0 _2t2fc,5 221,2 10 15 20 25 35 40 43 50 S5 60 63 Nastepujace badaniie wykazuje, ze. wytwarzanie koimplieitósu o stosunku moloiwyim ii al nie zmniej¬ sza sizkodtLiwych dlziialan- -utoocanyiGh iindomeitacy- _ny. 1(6 mg kompleksu ,o jsitolsuinku mollowym 1:1 oitrzymiSiiiiegioi w opLjaainy poprzednio sposób je,st identyczne iz 5 mg1 liinidomeitiaicyny, - Jako zwiazek odbuiespenia stosuje sie czysta imdometacyne. iZwiLeirzeta: badanie ptotdioisitanej ttioksyczuiosca pro¬ wadzono na: zwierzetach plci zenskiej i, meskiej pochodzacych, ze isizcizepu I^nig-Ewainis,, 10—10 zwierzat traktowano kazdym bladanym zwiazkiieim, ptrizy czym 'byly to izwienzejtlai plci zenskiej i me¬ skiej. Przeid iroizpoczejcieim badania zwierzeta mia¬ ly ipo 7 tygodni i. imiially Isreidmi ciieziar 140—jl|60 g.Zwierzeta trzymano w stalej 'fteirniperaltiuirze 22— 24°C i przy stalej wilgotnosci wizgledlnej 45^50% Podcizals badania zwierizeta byly ma standardowej diecie i pily wode w- miiaire poitrzelby.TiraktctWiainiie: badainie toksycznosci podostrej oibteijimiuje okres 4 tyigoldnii. iZwieirzetom podawano biadamy ziwiazek lo Itej samej porze dnia, ramo.Kompleks o stosunku molowym 1:: 1 i substancje odnie-s/iienia ipodiawano dousltniie w posltaci ziawie- siny w 1% nueltylocieilulozie przez siojnde [przely¬ kowa. Ziwierzeta z ©rupy kontrolnej otrzymywa- ly .1% oneityiocoludoze doustnie. Przyrost ciezaru i stan kliniczny zwierzat rejesforoiwainioi co tydzien podiczas badania.; iDiawki: li. Koinitroina: 1% metyloceluloza w dOlosci 0^2 ml/ /lOOjgi^doustnie 2. iZiajwiefcima kcmpleklsu: Lii w ilasci 16 mg/kg, diouisitmie ,3. Zawiesina iaidomieltacyny (w liloisdi 5 mg/kg, doiuisitimie. - 1 mg lindomeitacyny byl równowazny 3,2 mg kompleksu 1:1.Badanie: zwierzeta traktowano w opisany spo¬ sób 2)8. dni. W 20 dniu zwierzeta pozostale przy zyciu 'likwidowano eterem i wypreparowywano zo- lajdek i dwfuniajsitniiice. /ZtoiajdikL ii diwuinaisltnice zwie¬ rzat padlych pcldicizas traktowlaoiia preparowano równiez.W kazdym pirzypadJku blone sluzowa zoladka, woreczka zóilciowego i jielit biaidaino makroskopo¬ wo i okiresliamoi liczibe eiwelntluiakiych wirzodów i nadzerek.Wyniki badania: w tablicy liii podaino liczbe zwierzat padlych w grupach zwierzat traktowa¬ nych baidanym zwiazkiem w tablicy IV d. liczbe wirzodów znalezionych w kazdiej (grupie w odmie- sietntiu do Mcizby zwieirzat traktywarnych w grupie, (Przyrost ciezaru ciala oaniaczano w kazdym ty¬ godniu,. ale ze wzgledu ma wysoka smieirtelnosc zwierzat plci 'zenskiej ii meskiej którym jpoda- waino I16 mg/kg' kompleksu 1:1 i S mg/kg imdo- metacyny (uzyiskane wyniki miie odpowiadaja rze¬ czywistosci!.Objawy kliniczne: iriocizawiszy od .tnzectiieigo dnia traktowania u zwierzat, którym podawano 5 mg/kg inidlometacyiny i 16 nig/kig koimpleksu 1:1 wystapifly loibjiaiwy Eiwoioiieffiia; dddechu i depresji.Objawy te wystepowaly 'do cziaisu smiieircii zwie¬ rzat, czyli Odpowiednio dio 28 dnia opodaiwania bajdianych zwierzat.117 208 11 12 Talblica1 ani Simiecrtielnolsc Grupa kontrola 116 irug/kg kompleksu IM 5 mg/kg indometacyny Dzien 7 osobnik •meski 0/10 5/10 4/10 zenski III 14 olsdbniik meski 0/10 7i/10 i4/10 zenski 0/10 ,2/10 2/1,0 i21 osobnik meski o o o 1 zenski iii Q3 osobnik meski lii zenski iii iT-aibldwca XV (Wrzody i iniadlzerki Grupa.Kontrolna) 16 img/kig kom¬ pleksu 1:1 5 im@/kg indometacyny wiTiZody osobnik me¬ ski 0/10 9/10 8/10 zen¬ ski 0/10 9/10 7/10 nadzerki osobnik me¬ ski 3/10 ia/io 10/10 zen¬ ski •2/10 10/10 uaao Podsumowanie: 'u 9i0!°/o zwierzat iptoL zenskiej i meskie}} traktowanych 116 intg/kg kompleksu ^-cykl^delksltryne-dinidioimeitiaicyniai 1^1 znaleziono wrzód. U 80°/o zwierzat iplcd mejslkiiej traktowanych 5 rng/lkg1 dndiornetaicyny i. u 7i0% (zwietrzajt plci zenskiej otrzymujacych te sama dawke indome- tacyny znalleziono wrzód.Jak wyindika z przeiprowadzonych badan sizko- diiwe idziiailainiie uboczne inloimeitacyny wzrasta w przypadku uzycia jej w postaci kompleksu 1:1. Korzystne* dzialanie^ hamowania tworzenia sie owrzodzen wykazuje jedynie- koaniplekis. 2:1.Nastepujace przyklady ilustruja dokladniej sfeEEisgolowie cechy wyniadaizfcu.IPrzykliad I. W lilO |ml wody rozpuszcza sie 11,35 g {0,0)1 mola) i/^cylklodeklsltryny ii do tego nasyconego iroatworiu woidneigo (dodaje isie roztwór 1,718 g indoimetacyiny w 120 ml acettomiu, co w.prze¬ liczeniu odpowiada 8 molomi ^-cyfclodekstryny na 1 miOil itndometacyniy, Imiieszajac icailGisc w ^tem¬ peraturze 70°C. Miefslzamiine reakeyljna chlodzi sie 6 gicdiaim, a nastepnie 1(2 godzim przechowuje sie w 'lodówce. Pio ochlodlzemiiiu {wydzijela tsiie bialy, krystafczny Osad, który odisacizia sie, ptnzerciywa zimnym acetonem lub eterem i suszy pieciotlen¬ kiem folstforu. Zawartosc indioimieltacyny w kom¬ pleksie ozmacizia sii*e przez rozfpusJzczenie krysta¬ licznego produktu w wodzie iprzy lagodnym ogrze¬ waniu i rozliozeniiie koimjplelksiu lallkoholem. .Sub* stanieje te poddaje sie fojtomietriili przy 320 mm.Zawartosc liniotamieltacyny w kompfljeksiije wynosi 14% a stoisituusk molowy ,/z^cyklodekstryina: dndo- metacyna — il^4t6. iWlMma w uUtrlafiiiolecie tiado- metacyny uwolnionej z kompleksu i oryginalnej indiometacyiny sa iMienityicizne, 25 Przyklad II. iPo zzelowaniu w temperaturze 120°C zawielsiine 30% slkroibi chlodzi sie_ do tern- peratury 80°C, dlodaije sie 0,2% wagowych alfa- -aniylazy d mieszanine ozesciilow© hydrolizuje sie wstepnie w ciagu 2l0 imiinut. Hydrolizat wyjalawia sie i: ipo ochlodzeniu do temperatury 50°C dodaje siiie 5 jieidinoisftek/g enzymu skrobiowego cyklo- dekstryny-trans-tglukozylazy, a po upilywie 4 godzin 5°/o objetosciowych Itodiueniij Konwersija trwa 2;—7 dni i otrzymuje sile optymalna wydajnosc cyklodekstryny. Ptoldukt konwersji irozciencza sie woida do dwukrotnej objejtoscii, zagioltowiuje sie w celu zdezaktywowania enzymu i w temperatu¬ rze 70°C dodajje sie 5G0/o objetosciowych 9i0% eta¬ nolu. Otrzymana zawiesine, chlodzi isie do Ibejmpe- 30 ratury 40°C i saicizy. ,Do przeisaczlu dodaje sie acetonowy roztwór indoimeitacyny uwzgledniajac, ze okolo 700/o suoheij siuibstainciji sklada islie z /?- -cyklodeksltryny. Kompleks ,/?-cyklodekstryny z indomeltaicyna krystalizuje podczas mdeiszania i poiwolnegb chlodzenia w ciagiu 6 godzin d po przechowywaniu w ciagu 24 godzin w itempera- tuirze 0°C iKoImpileks jest w zasadzie identyczny z koimiplekseim otrzymianym w przykladzie I.Róznica poilegia na 'tym, ze zawiera en 5—i10°/q substancji! róznych od ^-cyklojdeksltryny, w odnie- sienilu do siuichej masy, takich jak czesciowo a-idekstiryinia^ a cizesciiowo liniowe dieksitryny. iSklad- niki ite nie zaklócaja jednak uzyitecznosci, otrzy- maniego iiroduktu, a zaltem dalsze oczyszczania nie jelsit Ikoiniecjzne. Tylko indoimetacyinie, która nie zostala wlaczona w kompleks nalezy usunac przez plankanie iroz;puszczalniik:ieni organicznym w sposób opisany w przykladzie I. iProdnkit zar wiera równiez w tym przypadku 14i°/o indometa- 50 cyny.Fakt tworzenia sie kompleksu lUidowodniono dokonjujac nastepujacych ojbse.rwacji.Badania rozpuszczalnosci. Zairówno indometacy- na jak i jej komiplekis z cyklodekstryna o sto¬ sunku molowym 12al sa ipraktyczinie nie rozpusz¬ czalne w oroztworach o wartosci pH — 2. \Przy wartosci pH — 4 roz^puiszczalinoisc kompleksu p-rze- wyzsjzja o 33'%, ,przy [pH —/i6 iprzewy^siza o lil'2%, przy pH — 7 przelwyizsiza o 2l2l3|0/o ia pnzy ipH — 8 przewyasiza o przeszlo il0!G0l0/o roizjpuszczalnosc indomeitacyny.Metoda chromatografii cienkowarstwowej udo¬ wodniono, ze w takich okolicznosciach indometa- cyna nie ulega rozkladowi. Istotna róznica poja- 33 40 45 55 65117 208 13 14 wia sie w widmie w podczerwieni indometacyny, P-cyklodekstryny i kompleksu inkluzyjnego indo¬ metacyny z cyklodekstryna w stosunku molowym J2;l, gdyz pasano 16)118 nar-1 c.hair.ak|teirysityiczine dila gruipy p-chloroarylowej znika w kompleksie. * Wykres rentgenograficzny dyfrakcji promieni rentgenowskich przez proszek wykazuje, ze cha¬ rakterystyczny dla cyklodekstryny intensywny pik pojawiajacy sie zwykle przy 2oo=10,0° jest dla kompleksu przesuniety do 2i °o = 109'5o. Wedlug io artykulu w Chem. Phartm. Buli., 23, 3062 (1975) wykres dyfrakcji promieni rentgenowskich miesza¬ niny cyModekstryny z indometacyna otrzymanej przez liofilizacje nie wykazuje zadnych istotnych cech charakterystycznych. 1S Badania dyfuzji. Komore dyfuzyjna podzielono na dwie czesci membrana pólprzepiuszczalna. Jedna polowe komory napelniono indometacyna w roz¬ tworze buforowym o wartosci pH — 7, a druga czystym buforem. Po 4 godzinach w temperaturze *° pokojowej indometacyna ulegla podzialowi pomie¬ dzy obie czesci komory dyfuzyjnej w stosunku 50°/oi: 50°/o, czyli zrównanie stezen bylo zakonczone.Gdy jedna polowe komory napelniono buforowym roztworem indometacyny a druga roztworem P-cy- » klodekstryny w takim samym buforze, to po 4 go¬ dzinach bylo wiecej indometacyny po stronie roz¬ tworu P-cyklodekstryny niz po stronie roztworu kidomeitacyiny, ozyili cykUodefesitirymy „pompowala" czesc indometacyny na skutek tworzenia komp- 30 leksu. Gdy na poczatku doswiadczenia po jednej stronie membrany umieszczono roztwór kompleksu |3-cyklodekstryny: indometacyny = 2:1 a po dru¬ giej czysty roztwór buforowy, to po uplywie 4 go¬ dzin ponad 70% indometacyny znalazlo sie tam 35 gdzie bylo umieszczona na poczatku doswiadczenia, a równowaga zostala osiagnieta tylko w przybli¬ zeniu, w czasie dluzszym niz 10 godzin.Badania skrecalnosci optycznej dyspersji. Cyklo¬ dekstryna nie wykazuje absorpcji promieni ultra- 40 fioletowych, natomiast wykazuje skrecalnosc op¬ tyczna a indometacyna absorbuje ultrafiolet a nie wykazuje skrecalnosci optycznej, poniewaz nie za¬ wiera zadnego asymetrycznego atomu wegla. Kom¬ pleks o stosunku molowym 2: li wykazuje skrecal- n nosc optyczna i absorpcje ultrafioletu i dlatego pojawiaja sie efekty Cottona w strefie oryginal¬ nych pasm absorpcji.Dichroizm kolowy widma dowodzi, ze nawet w roztworze 10-4 molarnym 10—20|°/o skladników so¬ wystepuje w stanie zwiazanym, czyli ze kompleks jest raczej trwaly.Badanie metoda chromatografii cienkowarstwowej.Chromatografie wykonuje sie na warstwie silika- gel G, stosujac jako uklad rozwijajacy mieszanine 55 chloroformu, etanolu i acetonu w stosunku 98 :1,5 : 0,5. Rozwiniety chroimatogram spryskuje sie 1 g p-dwumetyloaminobenzaldehydu + 50 ml 3©% kwasu solnego + 50 ml etanolu i po ogrza¬ niu do temperatury 50°C uzyskuje sie wartosc Rf indometacyny 0,92 a wartosc Rf kompleksu indo- metacyna-eyklodekisitryna w stosunku molowym 2 : 1 tylko 0,10.Okreslenie wartosci pKa. W mieszaninie wody i etanolu w stosunku 1 : 1 rozpuszcza sie w tempe¬ raturze 25°C 0,1 mola/litr chlorku potasu i 10~* mola/litr indometacyny i kompleks cyklodekstryny z indometacyna w stosunku molowym 1 :1 komp¬ leks cyklodekstryny z indometacyna w stosunku molowym 2:1. Roztwory miareczkuje sie wodoro¬ tlenkiem sodu stosujac elektrode szklana i oznacza sie wartosci pK. pK indometacyny = 5^30, dK kom¬ pleksu w stosunku molowym 1:1 = 5,43, czyli praktycznie tyle samo co pK indometacyny, nato¬ miast pK kompleksu; w stosunku molowym 2': 1 = = 5,54.Wynik ten dowodzi bezposrednio, ze w komplek¬ sie o stosunku molowym 1 :1 pierscien cyklodek¬ stryny znajduje sie wzglednie dalej od grupy kar¬ boksylowej, czyli przy grupie p-chlorofenylowej, natomiast w kompleksie o stosunku molowym 2:1 obie czesci czasteczki indometacyny wlaczone sa do kompleksu i dlatego wartosc pKa wzrasta, czyli maleje charakter kwasowy.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych kompleksów in- kluzyjnych cyklodekstryny i indometacyny, w sto¬ sunku molowym okolo 2:1, znamienny tym, ze okolo 2 mole a-albo 0-cyklodekstryny poddaje sie reakcji z okolo 1 molem indometacyny podczas ogrzewania, w obecnosci rozpuszczalnika organicz¬ nego rozpuszczajacego indometacyne a nie tworza¬ cego z cyklodekstryna trwalego kompleksu, i od¬ dziela sie powstaly kompleks. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze reakcje prowadzi sie w temperaturze 50—100°C, korzysitinie w tempeirartminze 60^h80°C 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze jako obojetny rozpuszczalnik organiczny stosuje sie alkanol o 1—3 atomach wegla, keton lub eter. 4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze jako obojetny rozpuszczalnik organiczny stosuje sie metanol, etanol, aceton, eter etylowy lub czte- rowodorofuran. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze wodny roztwór cyklodekstryny poddaje sie reak¬ cji z roztworem indometacyny w rozpuszczalniku organicznym. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze powstaly kompleks cyklodekstryny — indometacy¬ na w stosunku molowym 2:1 wydziela sie przez ochlodzenie mieszaniny reakcyjnej.117 208 ^ J* AKTYWNOSC so go¬ le-J POZIOM WE KRWI iND[yug/tol]J 30- 80- 10 J 0 J •i 0 l°\ r\ -*- V —P- © -IL- 8 ©***¦ —t- © • -*- —*- • —CD-INO • -4-INO —* ^ e » a 6 « WCZAS CZYNNIK PRZECIWZAPALNY 40. 30' £&¦ 10' CD-IND S W CZAS FigA AKTYWNOSC I %- 40- SO- 10- U" I •^..^^ 5 ^^-CD-!KD \« [h) CZAS roi.s 5 (mg/l* ] DAWKA 'UZGraf. Z-d Nr f2 — 959/8(3 90 egz, A-4 Cena ICO zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL