Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych pochodnych aminowych glicerolu lub propanodioli, majacych wlasciwosci antywirusowe.Zakazenia wirusowe u ssaków, w tym równiez u ludzi sa schorzeniami zakaznymi sprawiajacymi wiele cierpien i strat ekonomicznych. Niestety, od¬ krywanie zwiazków antywirusowych jest znacznie bardziej skomplikowane i trudniejsze niz odkrywa¬ nie srodków bakteriobójczych i grzybobójczych.Powodem tego jest czesciowo fakt, ze istnieje sci¬ sle podobienstwo strukturalne wirusów i pewnych zasadniczych skladników komórki, takich jak kwa¬ sy rybonukleinowe i dezoksyrybonukleinowe.Niemniej jednak w literaturze opisano liczne nie- wirusowe „srodki antywirusowe", to jest substancje „które moga wywierac dzialanie zabezpieczajace lub lecznicze z wyrazna korzyscia dla osobnika zakazo¬ nego, albo tez zwiekszajace wytwarzanie przeciw¬ ciala, poprawiajace jego aktywnosc, polepszajace niespecyficzna odpornosc, przyspieszajace powrót do zdrowia iub tlumiace objawy" (Herrman i wspól¬ pracownicy, Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 103, 625 (1960).Znane sa np. takie srodki antywirusowe jak inter¬ feron oraz produkty syntetyczne, takie jak chloro¬ wodorek amantydyny, pirymidyny, dwuguanidy. guanidyna, pterydyny i metisazon.Znane srodki antywirusowe maja dosc waski za¬ kres dzialania w przypadku zakazen wirusowych, 10 15 20 25 30 przeto pozadane sa nowe srodki, które moglyby skutecznie pomagac w lecznictwie.W przypadku zakazenia wirusem komórki ssaków wytwarzaja substancje, która umozliwia komórkom opieranie sie rozmnazaniu róznych, wirusów. Sub¬ stancje opierajace sie wirusom i zaklócajace ich dzialanie znane sa pod nazwa „interferonów". Inter¬ ferony sa glikoproteinami, które moga róznic sie wlasciwosciami fizykochemicznymi, ale wszystkie maja jednakowe wlasciwosci biologiczne, a miano¬ wicie dzialaja hamujaco na liczne nie spokrewnione wirusy, nie sa toksyczne dla komórek ani nie wy¬ wieraja na nie innego szkodliwego wplywu i sa ga¬ tunkowo specyficzne (Lockart, Frontiers of Biology, tom 2, „Interferons", wyd. Finter, W. B. Saunders Co., Philadelphia, 1966, str. 19—20).Dotychczas nie opracowano zadnej ekonomicznej metody wytwarzania poza organizmami interfero¬ nu nadajacego sie do klinicznego stosowania prze¬ ciwko zakazeniom wirusowym. Stosowano przeto metode posrednia, a mianowicie polegajaca na poda¬ waniu zwierzeciu, które ma byc chronione przed zakazeniem lub juz zakazonemu wirusom, niewiru- sowej substancji, która pobudza lub nasila wytwa¬ rzanie interferonu w komórkach. Wytworzony w ten sposób interferon okresla sie jako „endoge- niczny".Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki nr 2*738351 znane sa zwiazki o ogólnym wzo¬ rze 6, w którym RA i R^ oznaczaja rodniki alkilowe. 1157773 115777 4 aralkilowe, arylowe, cykloalkilowe lub rodniki ary- lowe podstawione grupa nitrowa, alkilowa lub alko- ksylowa albo atomami chlorowca, X, Y i Z oznacza- ^ ja atomy tlenu lub siarki albo grupy sulfonylowe, ALK oznacza prosty lub rozgaleziony rodnik alki¬ lenowy o 1—6 atomach wegla i B oznacza nizsza grupe dwualkiloaminowa, grupe piperydynowa, morfolinowa, pirolidynowa, nizsza grupe alkilopiro- lidynowa, grupe N'-alkilopiperazynowa albo pipeko- linowa, majace wlasciwosci miejscowo znieczula¬ jace.W omówieniu ewentualnych dróg syntezy (patrz kol. 1, 11, 57—70 powolanego opisu patentowego) ujawniono produkty posrednie o wyzej podanym wzorze, w którym B oznacza grupe aminowa albo nizsza grupe alkiloaminowa. Jednakze zaden ze zwiazków wymienionych szczególowo w tym opisie nie zawiera rodników alkilowych Rj albo R2 wyz¬ szych niz rodnik n-pentylowy. Poza tym, w zadnym z tych zwiazków oba podstawniki Rt i B^ nie ozna¬ czaja rodników alkilowych, gdy oba symbole Xi Y oznaczaja atomy tlenu.Znane sa ponadto owadobójcze i roztoczobójcze zwiazki o wzorze 7, w którym Rt i Rg oznaczaja miedzy innymi nizsze grupy alkilotio, q oznacza liczbe 0—5 i A oznacza miedzy innymi grupe 1-pi¬ perydynowa albo nizsza grupe dwualkiloaminowa.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze pewne nowe po¬ chodne aminowe dwu-0-/n-alkilo- i n-alkenylo-/ /-glicerolu lub propanodioli, w których rodniki al¬ kilowe i alkenylowe sa wyzszymi rodnikami, maja zdolnosc zwalczania wirusowych zakazen u ssaków.Te nowe zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku maja ogólny wzór 1", w którym jeden z podstawników Qx i Q2 oznacza grupe o wzorze -O-Y-NHRa, a drugi grupe o wzorze ORl5 B^ i R* oznaczaja rodniki n-alkilowe o 12—20 atomach we¬ gla lub rodniki n-alkenylowe nie majace podwój¬ nego wiazania w pozycji 1 i zawierajace 12—20 ato¬ mów wegla, Y oznacza rodnik alkilenowy o 2—4 atomach wegla, majacy obie wolne wartosciowosci przy róznych atomach wegla, albo Y oznacza grupe o-, m- lub p-fenylenodwumetylenowa, lub grupe o wzorze 2, w którym q oznacza liczbe calkowita 1—3 i wolna wartosciowosc po lewej stronie wzoru jest zwiazana z atomem tlenu, a Jl9 oznacza atom wodoru.Sposób wedlug wynalazku wytwarzania zwiaz¬ ków, o wzorze 1, polega na tym, ze redukuje sie zwiazek o wzorze 3, w którym jeden z podstawni¬ ków Qs i Q4 oznacza grupe o wzorze -ORl5'a dru¬ gi — grupe o wzorze -0-Y'-CN, RA i R2 maja wyzej podane znaczenie, a Y' oznacza rodnik alkilenowy o 1—3 atomach wegla lub grupe o wzorze 4, zwia- ' zana z lewej strony z atomem tlenu, albo tez Y' oznacza grupe o wzorze 5, w którym q ma wyzej podane znaczenie, a grupa ta jest z lewej strony zwiazana z atomem tlenu.Sposób wedlug wynalazku obejmuje równiez wy- ¦ twarzanie farmakologicznie dopuszczalnych soli ad¬ dycyjnych zwiazków o wzorze 1 z kwasami.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku stanowia czynne substancje w preparatach leczni¬ czych, zawierajacych równiez-farmakologicznie do¬ puszczalny nosnik. Preparaty te podawane ssakom dzialaja profilaktycznie antywirusowo i wywoluja wytwarzanie interferonu w organizmie ssaka.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku przejawiaja dzialanie antywirusowe w stosunku do 5 bardzo licznych wirusów in vivo u ssaków i in vitro w kulturach tkanek ssaków. Co najmniej czesciowo aktywnosc ta jest wynikiem wytwarzania interfe¬ ronu w komórkach, powodowanego przez te zwiazki, a wiec interferonu endogenicznego. 10 Jako farmakologicznie dopuszczalne sole addycyj¬ ne z kwasami stosuje sie sole nietoksyczne w poda¬ wanych dawkach. Moga to byc sole rozpuszczalne lub nierozpuszczalne w wodzie, np. sole kwasów takich, jak kwas solny, bromowodory, fosforowy, 15 azotowy, siarkowy, octowy, szesciofluorofosforowy, cytrynowy, glikonowy, benzoesowy, propionowy, maslowy, sulfosalicylowy, maleinowy, laurynowy, maleinowy, fumarowy, bursztynowy, szczawiowy, winowy, amsonowy, to jest 4,4'-dwuaminostylbeno- 20 -2,2'-dwusulfonowy, pamoesowy, to jest l,l'-metyle- no-dwu-2-hydroksy-3-naftoesowy, stearynowy, 3- -hydroksy-2-naftoesowy, p-toluenosulfonowy, meta- nosulfonowy, mlekowy i suraminowy.Korzystne wlasciwosci maja addycyjne sole zwiaz¬ ków o wzorze 1 z kwasem solnym. Grupe zwiazków o. korzystnych wlasciwosciach stanowia te, w któ¬ rych Rj i Rj oznaczaja rodniki n-alkilowe o 14—18 atomach wegla, zwlaszcza gdy rodniki te sa jedna¬ kowe. Korzystne wlasciwosci maja zwlaszcza zwiaz¬ ki o wzorze 1, w którym oba podstawniki RA i R^ oznaczaja rodniki n-heksadecylowe. Dobre wlasci¬ wosci maja zwiazki o wzorze 1, w którym R3 ozna¬ cza atom wodoru, a Y oznacza prosty rodnik alkile¬ nowy o 2—4 atomach wegla albo rodnik o-, m- lub p-fenylenodwumetylenowy.Szczególnie cenne wlasciwosci maja nastepujace zwiazki i ich farmakologicznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami: 40 l,3-dwu-0-/n-heksadecylo-/-2-0-/3-aminopropylo/ /-glicerol, l,2-dwu-0-/n-heksadecylo/-3-0-/3-aminopropylo/ /-glicerol, l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0-/m-aminometylo- 45 benzylo/-glicerol, l,2-dwu-0-/n-heksadecylo/-3-0-/m-aminometylo- benzylo/-glicerol, l,2-dwu-0-/n-tetradecylo/-3-0-/m-aminometylo- benzylo/-glicerol, 50 l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0-/m-aminpmetylo- fenylo/-glicerol, l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0-/p-aminometylo- fenylo/-glicerol, l,2-dwu-0-/n-heksadecylo/-3-0-/p-aminometylo- 55 fenyloZ-glicerol.Zwiazki o wzorze 1 wytwarza sie z odpowiednich l,2-dwu-0-/n-alkilo- albo n-alkenylo/-gliceroli albo l,3-dwu-0-/n-alki- albo n-alkenylo/-gliceroli, w któ- ' rych rodniki alkilowe albo alkenylowe sa rodnikami 60 wyzszymi. Stosuje sie w tym celu metody analogicz¬ ne do znanych, jak podano nizej. a) Zwiazki o wzorze 1, w którym Rs oznacza atom wodoru, a Y oznacza rodnik 3-propylenowy wytwarza sie kondensujac produkt wyjsciowy 65 z akrylonitrylem w wodnym roztworze i w silnie115777 zasadowym srodowisku, po czym otrzymana pochod¬ na 2-cyjanoetylowa uwodornia sie. b) Zwiazki o wzorze 1, w którym Rs oznacza atom wodoru i Y oznacza rodnik 4-butylenowy, wy¬ twarza sie wprowadzajac do produktu wyjsciowego 5 rodnik alkilowy droga reakcji z halogenkiem allilu w silnie zasadowym srodowiska, po czym otrzyma¬ na pochodna allilowa poddaje sie reakcji z wodor¬ kiem boru, utlenia otrzymany produkt posredni nadtlenkiem wodoru w zasadowym srodowisku wod- 10 nym i otrzymana pochodna 3-hydroksypropylowa poddaje sie reakcji z chlorkiem sulfonylu RS02C1, np. z chlorkiem p-toluenosulfonylu, w srodowisku zasadowym^ wytwarzajac odpowiednio ester sulfo- nianowy, np. tosylan i nastepnie dzialajac cyjan- 15 kiem sodu wymienia sie grupe RSOs— na grupe cyjanowa, po czym redukuje sie otrzymana pochod¬ na 3-cyjanopropylowa. c) Zwiazki o Wzorze 1, w którym R* oznacza atom wodoru i Y oznacza rodnik 2-propylenowy, 20 wytwarza sie stosujac reakcje podane wyzej w uste¬ pie (b) az do reakcji utleniania nadtlenkiem wodoru wlacznie, po czym wyosobniony uboczny produkt utleniania, bedacy pochodna 2-hydroksypropylowa, poddaje sie dalszym reakcjom podanym w ustepie 25 _(b), ale zamiast cyjanku sodowego, stosuje sie azy¬ dek sodowy. d) Zwiazki o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru i Y oznacza rodnik fenylenodwumetyleno- wy, wytwarza sie przez reakcje produktu wyjscio- 30 wego z halogenkiem cyjanobenzylu w silnie zasado¬ wym srodowisku i nastepnie redukcje otrzymanej pochodnej cyjanobenzylowej wodorkiem, np. wodor¬ kiem litowoglinowym. e) Zwiazki o wzorze 1, w którym R, oznacza atom 35 wodoru i Y oznacza grupe o wzorze 2, w którym q oznacza liczbe calkowita 1—3, wytwarza sie przez reakcje produktu wyjsciowego z Ghlorkiem sulfony- lu RSOjCl, np. z chlorkiem p-toluenosulfonylu, w srodowisku zasadowym, po czym w otrzymanym 40 estrze sulfonianowym (np. tosylanowym) dwu-O-/ /n-alkilo- lub n-alkenylo/-glicerolu, majacym wyz¬ szy rodnik alkilowy lub alkenylowy), grupe RSOa wymienia sie na grupe co-cyjanoalkilofenoksylowa, dzialajac np. cyjanofenolem sodowym, po czym 45 otrzymana pochodna cyjanofenylowa lub cyjano- alkilofenylowa wyjsciowej pochodnej glicerolu uwo¬ dornia sie.Sole addycyjne zasad o wzorze 1 z kwasami wy¬ twarza sie zwyklymi sposobami; np. mieszajac 50 zwiazek aminowy albo amidynowy w odpowiednim rozpuszczalniku z wlasciwym kwasem, po czym sól wyosobnia sie przez odparowanie lub wytrace¬ nie za pomoca fozpuszczalnika, w którym sól ta nie rozpuszcza sie. Sole w postaci chlorowodorków 55 mozna latwo wytwarzac przepuszczajac chlorowodór przez roztwór zwiazku aminowego w organicznym rozpuszczalniku.Jak podano w przykladach, liczne chlorowodorki i dwuchlorowodorki zwiazków o wzorze 1 zawieraja 60 duze ilosci wody, przy czym nie stwierdzono, czy woda ta jest tylko przypadkowo wchlonieta podczas krystalizacji, czy tez stanowi wlasciwa wode krysta- lizacyjna w wódzianach, czy tez jest wynikiem innego zjawiska. Niemniej jednak ta woda nie 65 przeszkadza przy wytwarzaniu preparatów z oma¬ wianych zwiazków i nie trzeba jej usuwac.Pochodne l,2-dwu-0-/n-alkilo/-glicerolu z wyz¬ szym rodnikiem alkilowym stosowane jako produk¬ ty wyjsciowe mozna wytwarzac metoda M. Kates i-wspólpracowników, Biochemistry, 2, 394 (1963).Pochodne l,3-dwu-0-/n-alkilo/-glicerolu z wyz¬ szym rodnikiem alkilowym, wytwarza sie metoda R. Domenico i wspólpracowników, J. Lipid Res., 8, 63 (1967). Produkty wyjsciowe w postaci wyzszych pochodnych l,2-dwu-0-/n-alkenylo/-glicerolu mozna wytwarzac metoda W. J. Bauman i H. K. Mangold, J. Org. Chem. 31, 498 (1966).Antywirusowe dzialanie zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku oznacza sie dwiema odrebnymi metodami. W pierwszej z nich badany zwiazek podaje sie dootrzewnowo myszy, na 24 go¬ dziny przed podaniem jej smiertelnej* dawki wirusa EMC powodujacego zapalenie mózgu *i miesnia ser¬ cowego. Po uplywie 10 dni liczbe zwierzat, które przezyly porównuje sie z odpowiednia liczba my¬ szy tak samo zakazonych, ^de którym nie podano. badanego zwiazku. Badany zwiazek podaje sie my¬ szy na 18—24 godzin^rzed zakazeniem jej wirusem i w sposób inny niz wstrzykiwanie wirusa, w celu unikniecia miejscowego dzialania tego zwiazku na wirusa i w celu ustalenia, które z badanych zwiaz¬ ków wywoluja reakcje antywirusowa organizmu.Wedlug drugiej metody jednowarstwowe komórki' ludzkiego polipa nosowego wyhodowane na mikro- plytkach do miareczkowania traktuje sie badanym zwiazkiem na okolo 18 godzin przed potraktowa¬ niem smiertelna dawka wirusa pecherzykowego za¬ palenia jamy ustnej VSV. Badany zwiazek zmywa sie z warstwy przed potraktowaniem wirusem.Ciecz hodowlana ekstrahuje sie z plytek po uplywie okresu hodowlanego i miareczkuje ilosc zarazliwego wirusa L-929 fibroblastów u myszy obecnego w plyt¬ kach. Wyniki te porównuje sie z odpowiednimi da* nymi uzyskanymi w próbie prowadzonej z komór- kami polipa nie poddanymi dzialaniu badanego zwiazku.Poza tym, wiele zwiazków wytworzonych sposo¬ bem wedlug wynalazku badano ustalajac ich zdol¬ nosc wzmagania znanej dzialalnosci antywirusowej kwasu poliinozynowego i policytydylowego. Niektó¬ re wreszcie zwiazki badano w celu oznaczenia ich zdolnosci do wywolywania obiegu interferonu u my¬ szy. W tym celu podawano badane zwiazki myszom pozajelitowo i stosowano metode W. W. Hoffmana i wspólpracowników, Anitimicrobiol Agents and Chemotherapy, 3, str. 498—301 (1973). x Stwierdzono, ze pozajelitowe, miejscowe i sródno- sowe podawanie ssakom zwiazków wytwarzanych sposobem wedlugs wynalazku przed narazeniem,tych zwierzat na zakazenie wirusem powoduje szybkie uodpornienie ich na wirusy. Korzystnie jest poda¬ wac te zwiazki na okolo 2—1 dni przed narazeniem na zaatakowanie przez wirusa, chociaz okres ten jest rózny dla róznych gatunków zwierzat i rodza¬ jów wirusa.Przeprowadzono nastepujace badania.W celu oznaczenia aktywnosci chlorowodorku 1,3- -dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0-/3-aminopropylo/-gli- cerolu in vivo przeciwko wirusowi EMC sporzadzo-115777 no preparat w postaci emulsji stapiajac i mieszajac rózne Clesci wagowe podanego wyzej zwiazku, poli- sorbinianu 80 i gliceryny i nastepnie dyspergujac mieszanine w goracej wodzie przy silnym miesza¬ niu. Stezenie substancji czynnej w preparacie do¬ prowadzono nastepnie do wartosci koncowych doda¬ jac 0,14 m roztwór chlorku sodowego i 0,01 m roz¬ twór fosforanu sodowego o wartosci pH 7. Dalsze rozcienczenie prowadzono przez dodawanie takich samych roztworów.Trzem grupom po 10 samic myszy bielaka o wa¬ dze ciala 20—25 g podawano przez wtryskiwanie sródotrzewnowe dawki zwiazku podanego w tytule w ilosci 1;5, 5 i 15 mg na 1 kg masy ciala. Czwartej grupie 10 myszy substancji tej nie podawano. Na¬ stepnie, po uplywie 18—24 godzin wszystkim my¬ szom z 4 grup wstrzyknieto podskórnie po 0,2 ml preparatu wirusa EMC, to jest wirusa powodujace¬ go zapalenie lnózgu i miesnia sercowego. Dawki te odpowiadaly 20 dawkom LD50, to jest takim, które u nie chronionych myszy powoduja smiertelnosc 50% w ciagu 10 dni. W ciagu nastepnych 10 dni po zabiegu liczono myszy zywe i ustalano srednia wartosc (Sr), to jest srednia liczbe myszy z 7 prób pozostalych przy zyciu. Wyniki prób podano w ta¬ beli I.Tabela I Tabela II..cd.Dawka badanego zwiazku mg/kg 15 5 1,5 Sr (srednia z 7 prób) liczba myszy pozostalych przy zyciu 61 45 24 J Aktywnosc antywirusowa wyrazona jako stosu¬ nek liczby myszy, które przezyly w trzech grupach poddawanych dzialaniu badanego zwiazku do odpo¬ wiedniej liczby w próbie kontrolnej w 10 dniu pró¬ by, to jest wartosc Sr, obliczono z wzoru 8 podane¬ go na rysunku. We wzorze tym Sr oznacza wzgledna liczbe myszy przy zyciu, Sx oznacza procent myszy z 3 grup, które zyly po 10 dniach, xA oznacza liczbe myszy zywych w dniu „i" w 3 grupach, przy czym i oznacza liczbe 1—10, zas ei oznacz^ liczbe myszy zywych w dniu „i" w grupie kontrolnej.W sposób analogiczny do opisanego powyzej ba¬ dano in vivo aktywnosc szeregu zwiazków opisa¬ nych w przykladach przeciwko wirusowi EMC.Zwiazki badane i wyniki podano w tabeli II.Tabela II Numer przykladu, w którym opisano badany zwiazek XI [ XII Sr przy dawce mg/kg wynoszacej 15 71 62 5 1,5 49 20 47 1 18 0,5 | 6 10 25 30 35 40 45 50 55 Numer przykladu, w którym opisano badany zwiazek XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX XXI XXII XXIII XXIV xxv XXVI XXVII XXVIII Sr przy dawce mg/kg wynoszacej 15 80 74 57 64 74 46 45 70 37 44 68 66 68 60 53 56 1,5 0,5 72 46 -42 58 44 7 5 36 31 30 43 45 28 63 34 35 20 4 3 15 34 6 4 3 12 8 2 17 33 16 16 20 65 W celu okreslenia zmniejszania wydajnosci wiru¬ sa na komórkach ludzkiego polipa in vitro pod wplywem chlorowodorku l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/ /-2-0-/3-aminopropylo/-glicerolu, przygotowano po¬ zywke uzupelniajac 100 ml minimalnej pozywki za¬ sadniczej Eagle'a przez dodanie 2 m strokrotnie ste¬ zonego roztworu antybiotycznego- przeciwgrzybi- czego, 1 ml roztworu glutaminy o stezeniu 0,2 m, 1 ml stokrotnie stezonego roztworu niepodstawo- wych aminokwasów, 1 ml roztworu pirogronianu so¬ dowego o stezeniu 0,1 m i 10% dezaktywowanej przez ogrzewanie plodowej surowicy cielecej.W kazdym gniazdku plytek do mikromiareczko- wania o 96 gniazdkach umieszczono po okolo 50 000 komórek ludzkiego polipa nosowego w postaci za¬ wiesiny w 0,2 ml pozywki. Plytki nastepnie utrzy¬ mywano w ciagu 8—10 dni w temperaturze 37°C w atmosferze zawierajacej 5% C02, w celu wyhodo¬ wania pojedynczych komórek. Po uplywie 8—10 dni zlewajace sie pojedyncze warstwy na plytkach splu¬ kano czterokrotnie solanka z dodatkiem fosforano- . wej substancji buforowej i niezwlocznie po tym do kazdego gniazdka dodawTano 0,2 ml pozywki z za¬ wartoscia odpowiednio 10, 5,0, 1,0, 0,5, 0,1 i 0 mikro- gramów zwiazku podanego wyzej-w tytule na; 1 ml pozywki hodowanej. Pozywka ta byla identyczna z podana wyzej pozywka wzrostowa, ale zawierala nie 10%, lecz 2% plodowej surowicy cielecej.Plytki poddawano hodowli w ciagu dalszych 18 godzin w temperaturze 37°C, po czym pojedyncze warstwy plukano czterokrotnie solanka buforowa¬ na fosforanem, w celu usuniecia badanego zwiazku i nastepnie traktowano preparatem wirusa peche- rzykowatego zapalenia jamy ustnej (VSV) w daw¬ kach wiekszych 1000 razy od dawki TCID50, to jest . dawki, która w niechronionych kulturach powoduje 50% wzrost predkosci rozszerzania sie zakazenia. Po zakazeniu plytki utrzymywano w ciagu 2 godzin115777 9 10 w temperaturze 37°C, po czym splukano czterokrot¬ nie solanka buforowana fosforanem, w celu usunie¬ cia czastek wirusa nie zaadsorbowanego, a nastepnie dostarczono ponownie do kazdego gniazdka 0,2 ml pozywki hodowlanej o wyzej podanym skladzie.Plytki poddawano nastepnie hodowli w ciagu 7 godzin w temperaturze 37°C i zbierano ciecz ho¬ dowlana z 5—8 powtarzajacych sie komórek z kaz¬ dej plytki, przechowywano zamrozona w probów¬ kach i nastepnie miareczkowano, w celu okreslenia ilosci zakaznego wirusa L-929 fibroblastów u myszy w plytkach do mikromiareczkowania. Kultury L-929 myszy notowano pod mikroskopem i analizo¬ wano po uplywie okolo 3—4 dni, otrzymujac naste¬ pujace wyniki: Procentowe zmniejszenie wydajnosci wirusa przy stezeniu badanego zwiazku w [Ag/ml 10 5,0 1,0 0,5 0,1 94% 90% 84% 75% < 68% W sposób opisany powyzej badano zmniejszenie wydajnosci wirusa na komórkach ludzkiego polipa Numer przy¬ kladu w którym opisano badany zwiazek VI VIII X XI XV XVI XVII XIX XX xxv XXVII XXVIII XXIX xxx Tab<-la III Procentowe zmniejszenie wydajnosci wirusa przy stezeniu badanego zwiazku jig/ml wynoszacym 10 | 5,0 + ND + + + + + + + + + + + ND + H- + + — + ± + ± + + + + + 1,0 — — — — — — — — — — — — — 0,5 .— — ND — ND — — — — — ND ND — ND 0,1 ND ND ND — ND — — — — — ND ND ND ND | 10 15 20 25 30 35 — — — 40 In vitro pod wplywem zwiazków podanych w tabe¬ li III. W tabeli tej znak + oznacza zmniejszenie wieksze niz 68%, znak ± oznacza zmniejszenie okolo 68%, znak — oznacza zmniejszenie mniejsze niz 68%, a ND oznacza, ze zadnej próby nie wykonano.Zdolnosc chlorowodorku l,3-dwu-0-(n-heksadecy- lo)-2-0-(3-aminopropylo)-glicerolu do pobudzania wytwarzania krazeniowego interferonu badano na¬ stepujaco: Mieszanine jednakowycji wagowo ilosci podane¬ go wyzej zwiazku, polisorbinianu 80 i gliceryny 45 50 stopniowo zmieszano homogenicznie w goracym roz¬ tworze wodnym chlorku sodowego o stezeniu 0,14m, zawierajacym roztwór wodny fosforanu sodowego (PBS) o stezeniu 0,01 m i wartosci pH 7. Otrzyma¬ na emulsje typu olej w wodzie mozna bylo latwo rozcienczyc PBS przed podawaniem.. Po 0,5 ml tej emulsji wstrzykiwano sródotrzewno- wo samicom myszy szwajcarskiej o wadze ciala 20— —25 g, stosujac emulsje tak rozcienczona, aby po¬ dana dawka zawierala ilosc badanego zwiazku od¬ powiadajaca 25 mg na 1 kg masy ciala. Po uply¬ wie 8, 12, 16 i 20 godzin od wstrzykniecia pobiera¬ no próbki plazmy 4 myszy i po szeregowym roz¬ cienczeniu pozywka L-15 Leibovitza, zawierajaca 5% cielecej surowicy plodowej poddawano hodowli w plytkach do mikromiareczkowania w temperatu¬ rze 37°C na rozplywajacych sie pojedynczych war¬ stwach fibroblastów myszy L-.929. Warstwy te splukiwano nastepnie pozywka nie* zawierajaca protein i zarazano wirusem pecherzykowatego za¬ palenia jamy ustnej VSV w dawce 10 razy wiekszej od dawki TCID50, to jest od tej, która w niechronio- nych kulturach powoduje 50% zakazenia. Po zaka¬ zeniu plytki utrzymywano w temperaturze 37°C w ciagu 1 godziny, po czym plukano, ponownie trak¬ towano wyzej wymieniona pozywke L-15 i hodowa¬ no w temepraturze 37°C w ciagu 48 godzin.Kultury L-929 badano nastepnie pod mikrosko¬ pem w celu stwierdzenia wirusowej cytopatologii i analizowano oznaczajac zawartosc interferonu w plazmie, bedaca odwrotnoscia rozcienczenia plaz¬ my, przy którym uzyskuje sie 50% ochrony warstw L-929.Drugi szereg prób wykonano stosujac wyzej po¬ dana metode, ale myszom wstrzykiwano po 10 mg podanego wyzej zwiazku na 1 kg masy ciala i prób¬ ki otrzewnowych popluczyn pobierano z 4 myszy po uplywie 6, 9, 12, 15 i 18 godzin od wstrzykniecia.Próbki te pobierano w ten sposób, ze do jamy otrze¬ wnowej po obnazeniu przepony wstrzykiwano 1 ml zrównowazonego roztworu soli Hank'a, zawieraja¬ cego 100 jednostek penicyliny na 1 ml i 100 mikro- gramów streptomycyny na 1 ml, po czym krótko masowano brzuch, a nastepnie zasysano ciecz otrzewnowa.W obu wyzej opisanych próbach otrzymano na¬ stepujace wyniki.W sposób analogiczny do opisanego powyzej ba- ddno zdolnosc innych zwiazków wytworzonych spo¬ sobem wedlug wynalazku do pobudzania wytwa¬ rzania krazeniowego interferonu. Zwiazki badane oraz wyniki prób podano w tabeli V.Wplyw chlorowodorku l,3-dwu-0-(n-heksadecy- lo)-2-0-(3-aminopropylo)-glicerolu na powodowane przez polimer kwasu inozynowego i cytydylowego Tabela IV Zródlo interferonu Plaz-ma Ciecz otrzewnowa Zawartosc interferonu jednostek/ml po uplywie -czasu(godziny) od wstrzykniecia 6 16 8 34 9 768 12 67 320 15 448 16 52 — 18 448 20 | 40 ,115777 11 12 Tabela V Numer przykladu w którym opisano badany zwiazek XI XII XIII XIV 1 \ Zawartosc interferonu w plazmie w jednostkach na 1 ml po uplywie czasu (godziny) od dokonania zastrzyku 8 <20 20 < 18 <20 12 23 71 138 28 16 75 54 217 60 20 90 68 163 70 Zawartosc interferonu w cieczy otrzewno¬ wej w jednostkach na 1 ml po uplywie czasu (godziny) od dokonania zastrzyku 6 <13 <18 <13 <13 9 <13 <18 <13 <13 12 39 43 43 91 15 35 59 92 109 18 72 32 57 50 zwiekszenie jodpornosci komórkowej na zakazenie wirusowe badano nastepujaco.Pozywke wzrostowa przygotowano uzupelniajac 100 ml minimalnej pozywki zasadniczej Eagle'a przez dodanie 2 m stokrotnie stezonego roztworu antybiotycznego-przeciwgrzybicznego, 1 ml roztworu glutaminy o stezeniu 0,2 m i 5% dezaktywowanej przez ogrzewanie plodowej surowicy cielecej.W pozywce tej wytworzono zawiesine fibroblastów mysich L-929 i do kazdego gnizdka plytek do mi- kromiareczkowania o 96 gniazdkach wprowadzono po 0,2 ml tej zawiesiny, co odpowiada zawartosci 20000—30000 komórek.Plytki poddawano hodowli w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierajacej 5% C02, w ciagu 2—4 dni, w celu wytworzenia pojedynczych warstw ko¬ mórek, po czym tuz przed dalszym badaniem splu¬ kano plytki czterokrotnie solanka buforowana fos¬ foranem.Przygotowano roztwory polimeru kwasu inozyno- wego i cytydylowego w podanej wyzej pozywce, ale nie zawierajacej surowicy plodowej. Roztwory te mialy stezenia 5,0, 1,0, 0,2 i 0,04 mikrograma/ml. Po 0,1 ml kazdego z tych roztworów polaczono stosujac uklad szachownicy na warstwach komórek L-929 z 0,1 ml roztworów' badanego zwiazku, zawierajace- cych w 1 ml takiej samej pozywki bez surowicy plodowej po 20,0, 4,0, 0,8, 0,16 i 0,032 mikrograma tego zwiazku.W próbach kontrolnych stosowano albo dodatek wymienionych polikwasów, albo samego badanego zwiazku. Plytki poddano hodowli w temperaturze 37°C w atmosferze zawierajacej 5% C02 w ciagu 6 godzin, po czym splukano czterokrotnie solanka buforowa fosforanem i ponownie do kazdego gniazdka dodano 0,1 ml pozywki wzrostowej, za¬ wierajacej 2% plodowej surowicy cielecej. Po uply¬ wie dalszych 18 godzin hodowli badano toksycznosc plytek, a nastepnie zakazono je, wprowadzajac do kazdego gniazdka 0,1 ml zawiesiny wirusa peche- rzykowatego zapalenia jamy ustnej VSV o stezeniu 10—30 razy wiekszym od TCID50.Plytki badano pod mikroskopem w celu ustalenia efektu cytopatogemicznego i stwierdzono, ze komór¬ ki chronione badanym zwiazkiem efektu tego nie wykazywaly. Okreslono najnizsza dawke ochronna (MPD) polikwasów (I :C) i wielkosc wzrostu anty¬ wirusowej aktywnosci powodowanej przez kombina¬ cje tych polikwasów z badanym zwiazkiem uzytym w róznych stezeniach. Wyniki prób podano ponizej.Zwiekszenie odpornosci komórkowej na zakazenie wirusowe powodowanej przez polikwasy pod wply¬ wem badanego zwiazku uzytego w stezeniu poda¬ nym nizej w mikrogramach na 1 ml 10 15 20 25 20,0 125 razy • 4,0 125 razy 0,8 125 razy 0,16 5 razy 0,032 5 razy W sposób analogiczny do opisanego powyzej ba¬ dano wplyw innych zwiazków wytwarzanych spo¬ sobem wedlug wynalazku na powodowana przez polikwasy odpornosc komórek na zakazenie wiru¬ sowe. Badane zwiazki i uzyskane wyniki podano w tabeli VI. W tabeli tej znak + oznacza wzrost odpornosci wiekszy od pieciokrotnego, znak + oz¬ nacza pieciokrotny wzrost, znak — oznacza wzrost mniejszy od pieciokrotnego, a ND oznacza, ze da¬ nej próby nie wykorzystano.Wytwarzane sposobem wedlug wynalazku zwiaz¬ ki podaje sie pozajelitowo, miejscowo lub donoso- wo przed narazeniem ssaka na dzialanie wirusa.Zwiazki najdogodniej podaje sie w postaci zdysper- gowanej w dopuszczalnym, zazwyczaj stosowanym nosniku. Okreslenie „zdyspergowane" oznacza stan, w którym czastki sa zmieszane dokladnie ze stalym nosnikiem, tworzac mieszanine w postaci proszku lub pylu. Moga one tez stanowic mieszaniny nada¬ jace sie do rozpylania, a wiec roztwory, zawiesiny czy emulsje.Przy podawaniu pozajelitowym (podskórnie, do¬ miesniowo, dootrzewnowo) zwiazki wytwarzane spo¬ sobem wedlug wynalazku stosuje sie w ilosci od okolo 1 mg do okolo 250 mg, korzystnie od okolo 5 mg do okolo 100 mg, a zwlaszcza od okolo 5 do okolo 50 mg na 1 kg masy ciala. Preparaty do poda¬ wania donosowego zwykle zawieraja 1,0—100 mg substancji czynnej na 1 ml nosnika, a preparaty o stezeniu 30—50 mg/ml umozliwiaja podawanie od¬ powiedniej objetosci srodka.Przy podawaniu miejscowym substancje antywi-\ rusowe korzystnie stosuje sie w nosniku ulatwiaja¬ cym dawkowanie i dobra absorpcje. Zwykle odpo¬ wiednie sa preparaty o stezeniu czynnej substancji od okolo 1,0 do okolo 250 mg na 1 ml.Ogólnie biorac, w obu wyzej omówionych sposo¬ bach podawania stcsuje sie czynne substancje w* ilosci od okolo 1,0 mg do okolo 250 mg, a ko¬ rzystnie cd okolo 5,0 do okclo 50 mg na 1 kg masy ciala,13 115777 14 Tabela VI Numer przykladu w którym opisano badany zwiazek VI VII XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX XXI XXII XXIII XXIV xxv XXVI XXVII XXVIII XXIX xx?f Wzrost odpornosci przy stezeniu badanego zwiazku w mikrogra- mach/ml 20 + + ' + + + + + + + + • — + + + u— + + + + + + + + 4,0 + + + + + + + + + + — + + + — + + ' + + + + + 0,8 — ± ± ± ± ± ± ± — — ± \ ± — — — — — ~i~ — + Przyklad I. Chlorowodorek l,3-dwu-0-/n- -heksadecylo-/-2-0-/3-aminopropylo/-glicerólu.A. l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0-/2-cyjanoetylo/- -gliceroL Mieszanine 80 g (148 milimoli) l,3-dwu-0-/n-he- ksadecyloz-glicerolu, 1,49 g (28,1 milimola) akrylo¬ nitrylu i 1,2 litra 2n wodnego roztworu wodorotlen¬ ku sodowego ogrzewa sie do temperatury 50°C i powoli dodaje 19,2 g 40% roztworu wodnego (29,15 milimola) wodorotlenku czterobutyloamoniowego, przy czym na skutek egzotermicznej reakcji tempe¬ ratura mieszaniny wzrasta do okolo 80—90°C.Mieszanine miesza sie nastepnie w ciagu 20 minut bez zewnetrznego ogrzewania, po czym chlodzi do temperatury 20°C, dodaje 1,0 litr wody, odsacza staly nie przereagowany produkt wyjsciowy i cyja- noetylowana pochodna l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/- -glicerolu i ponownie traktuje ten osad swieza por¬ cja 1,49 g (28,1 milimola) akrylonitrylu, 1,2 litra 2n wodnego roztworu wodorotlenku sodowego i 19,2 g 40% roztworu wodnego wodorotlenku czterobutylo¬ amoniowego (29,15 milimola) i miesza w ciagu 20: minut w temperaturze 50°C, po czym chlodzi i dolewa 1,0 litr wody.Otrzymany "staly l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0- -/2-cyjanoetylo/-glicerol odsacza sie, przemywa ko¬ lejno woda, metanolem i acetonitrylem i suszy, otrzymujac 82 g (93% wydajnosci teoretycznej) produktu o temperaturze topnienia 45—46°C, IR (CHC13) 2250 cm-1, NMR (CDC13) q 3,92 (t, 2, NCCH2CH20-), 3,33—3,67 (m, 9 -OOH(CH2OCH2Cl5 65 HS1)2) 2,62 (t, 2, NCCH2CH20-) i 0,75—1,58 (m, 62, ali¬ fatyczne protony).B. Zwiazek podany w tytule przykladu.Mieszanine 20,5 g (34,5 milimola) l,3-dwu-0-/n-he- 5 ksadecylo/-2-0-/2-cyjanoetylo/-glicerolu, 200 ml czte¬ rowodorofuranu i 10 ml etanolu oraz 3 g. katali¬ zatora w postaci niklu Raneya nasyca sie gazowym amoniakiem w temperaturze 0°—5°C i uwodornia w aparacie Paara pod cisnieniem 3,43 • 105 Pa w tem- 10 peraturze pokojowej w ciagu .3 godzin, po czym od¬ sacza sie katalizator, przemywa go 50 ml czterowo- dorofuranu i przesacz odparowuje pod zmniejszo¬ nym cisnieniem.Oleista pozostalosc rozpuszcza sie w 500 mFeteru, 15 przemywa roztwór 500 ml 2% wodnego roztworu wodorotlenku amonowego, suszy nad MgS04, prze¬ sacza i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem.Stala pozostalosc rozpuszcza sie w 300 ml metanolu, roztwór nasyca gazowym chlorowodorem i odparo- 20 wuje pod zmniejszonym cisnieniem. Stala pozosta¬ losc przekrystalizowuje sie z octanu.etylu, otrzymu¬ jac 63 g (72% wydajnosci teoretycznej) nieznacznie zanieczyszczonego chlorowodorku l,3-dwu-0-/n-he- ksadecylo/-2-0-/3-aminopeopylo/-glicerolu o tempe- 25 raturze topnienia^ 69—70°C.Po dwukrotnym przekrystalizowaniu z 800 ml mieszaniny izopropanolu z acetonitrylem (1:1) otrzymuje sie 47,5 g (54% wydajnosci teoretycznej) produktu o temperaturze topnienia 58—59°C, NMR 30 (CDC1,)6 3,84 (t, 2, H,NCH2CH,CHtO-), 3,55 (m, 9, -OCHCCI^OCHAbH,^) 3,24 (t, 2 HjNCH^HfcCHjp 2,04 (m, 2, H^NCHjCHjCHp-) i 0,90—1,32 (m, 62, alifatyczne protony). 35 Analiza elementarna: %C %H %N obliczono 72,04 12,73 2,21 znaleziono 71,80 12,41 2,30 Przyklady II—VII.Postepujac w sposób analogiczny do opisanego 40 w przykladzie I i stosujac odpowiednie produkty wyjsciowe, otrzymuje sie zwiazki o wzorze 1, w którym Y oznacza rodnik -CH2CH2CH2- i R3 oznacza atom wodoru, a Rj i Rj maja znaczenie po¬ dane w tabeli VII i dla przykladów II—IV znajduja 45 sie w polozeniu 1,3-, a dla przykladów V—VII w polozeniu 1,2- glicerolu.Przyklad VIII. Chlorowodorek l,a-dwu-0-/n- -heksadecylo/-2-On/3-etyloaminopropylo/-glicerolu.A. l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0-/3-acetamido- 50 propylo/-glicerol.Do mieszaniny 830 g (6,0 milimoli) weglanu pota¬ sowego i 75 ml benzenu dodaje sie 1,0 g (1,6 milimo¬ la) chlorowodorku l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0- -/3-aminopropylo/-glicerolu, a nastepnie dodaje sie 55 150 mg (1,9 milimola) chlorku acetylu i miesza w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 1 godziny, po czym dodaje sie znów 150 mg (1,9 mili¬ mola) chlorku acetylu,i dalej miesza w stanie wrze¬ nia w ciagu 1 godziny. 60 Analiza metoda chromatografii cienkowarstwowej wykazuje, ze reakcja zaszla zasadniczo calkowicie.Wówczas chlodzi sie mieszanine, dodaje 75 ml wody i ekstrahuje 3 porcjami eteru po 100 ml. Polaczone wyciagi suszy sie (MgS04), przesacza i odparowuje 65 pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 800 mg 30 35 40 45 50 5515 115777 Tabela VII 16 Numer przy¬ kladu II III IV V VI VII Ri n-dodecyl n-tetra- decyl n-okta- decyl n-tetra- decyl n-heksa- decyl n-okta- decyl - R2 n-dodecyl n-tetra- decyl n-okta- decyl n-tetra- decyl n-heksa- decyl n-okta- decyl Wzór sumaryczny C3oH6303N • HCl - • 3/2H20 C34H7103N • HCl • H20 C42H8703N • HCl C34H7103N - HCl C38H7903N-HC1- • 3/4H20 C42H8703N • HCl • H20 Tempe¬ ratura topnie- • nia °C 76—77 57—58 64—65 90—91 76—78 67—69 Analiza elementarna Obliczono C 65,60 68,47 73,04 70,60 7Q,54 71,19 H 12,29 12,50 12,84 12,55 12,77 12,80 % N 2,54 2,35 2,03 2,42 2,16 1,98 Znaleziono % C 65,45 68,51 72,96 70,74 70,42 70,95 H 11,91 11,24 12,56 12,85 12,17 12,19 N 2,61 2,29 1,99 2,68 2,07 1,91 (97% wydajnosci teoretycznej) wyzej podanej po¬ chodnej glicerolu o temperaturze topnienia 53— 54°C, IR (CHCy 3400 i 1670 cm-i, N.M.R. (CDCl^g 1,97 (s, 3. NHCOCH3).B. Zwiazek podany w.tytule przykladu. 700 mg (1,1 milimola) 1.3-dwu-0-/n-heksadecylo/- -2-0-/3-acetamidopropylo/-glicerolu rozpuszcza sie w 100 ml eteru i traktuje 500 mg (13 milimoli) wo¬ dorku glinowolitowego, po czym dodaje sie 100 ml wody i mieszanine ekstrahuje 2 porcjami eteru po 100 ml. Polaczone wyciagi suszy sie (MgS04), prze¬ sacza, przesacz nasyca gazowym chlorowodorem* i 'odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Stala pozostalosc przekrystalizowuje sie z goracego octa¬ nu etylu, otrzymujac 470 mg (66% wydajnosci teore¬ tycznej) chlorowodorku l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/- -2-0-/3-etyloaminopropylo/-glicerolu o temperaturze topnienia 61—62°C, NMR (CDCl3)g 1,47 (t, 3, -NHCH2CH8). 25 Analiza elementarna: obliczono znaleziono %C 72,51 72,47 %H 12,78 12,56 % N 2,11 2,03 Przyklad IX. Chlorowodorek 1,3-dwu-O-n-he- ksadecylo/-2-0-/3-izopropyloaminopropylo/-glice- rolu. 700 mg (1,1 milimola) chlorowodorku 1,3-dwu-O- -/n-heksadecylo/-2-0-/3-aminopropylo/-glicerolu rozpuszcza sie w roztworze 1,05 ml kVasu octowego, 350 mg (4,3 milimola) octanu sodowego i 1,3 ml ace¬ tonu,-po czym dodaje sie malymi porcjami 1,25 g (33 milimoli) wodorku borosodowego az do chwili, gdy analiza metoda chromatografii cienkowarstwo¬ wej wykaze, ze zwiazek 3-aminopropylowy zostal calkowicie zuzyty. Wówczas dodaje sie do mieszani¬ ny 20 ml wodorotlenku sodowego i 20 ml wody i ekstrahuje 3 porcjami eteru po 40 ml.Polaczone wyciagi suszy sie (MgS04), przesacza i traktuje gazowym chlorowodorem, a nastepnie od¬ parowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Stala po¬ zostalosc przekrystalizowuje sie z goracego octanu etylu, otrzymujac 210 mg (20% wydajnosci teore- 50 65 tycznej) zadanego chlorowodorku, który na 1 mol zawiera okolo 0,5 mola wody, topnieje w temperatu¬ rze 72—73°C, NMR (CDC13)6 1,42 (d, 6-NHCH(CH3)2).Analiza elementarna: %C %H %N obliczono 71,82 12,79 2,04 znaleziono 71,92 12,46 1,94 Przyklad X. Chlorowodorek l,3-dwu-0-/n-he- ksadecylo/-2-0-/4-aminobutylo/-glicerolu^ A. l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0-/3-hydroksy- propylo/-glicerol. 6,5 ml (68,5 milimola) kompleksu boranu z siarcz¬ kiem metylu (BMS) dodaje sie w temperaturze 0°—5°C do roztworu 10,82 g (18,6 milimola) wytwo¬ rzonego w sposób opisany w przykladzie IX 1,3- -dwu-0-/n-heksydecylo/-2-0-alliloglicerolu w 190 ml heksanu i miesza w temperaturze pokojowej w cia¬ gu 3 godzin, po czym otrzymany roztwór chlodzi sie ponownie do temperatury 0°—5°C wkrapla 17,3 ml etanolu, w celu rozlozenia pozostalego kom¬ pleksu BMS.Nastepnie do roztworu dodaje sie 13 ml 3n wodne¬ go roztworu wodorotlenku sodowego i 11 ml 30% wodnego roztworu nadtlenku wodoru i mieszajac utrzymuje w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 16 godzin, po czym chlodzi i wlewa do wo¬ dy z lodem zawierajacej wodorosiarczyn sodowy Roztwór miesza sie az do zaniku nadtlenków (pró¬ ba jodoskrobiowa) i ekstrahuje 3 porcjami po 200 ml eteru.Polaczone wyciagi plucze sie 200 ml wody i 200 ml nasyconego roztworu wodnego chlorku sodowego, suszy (MgS04), przesacza i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem. Produkt oczyszcza sie chromato¬ graficznie na zelu krzemionkowym, eluujac benze¬ nem z etanolem. Otrzymuje sie 5 g (45% wydajnosci teoretycznej) produktu o temperaturze topnienia 29°C, N.M.R. (CDC13)6 3,80 (t, J = 5 Hz, 2, -OCH2CH2CH2OH) i 3,75 (t, J = 5 Hz, 2 -OCH2CH2CH2OH).B. l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0-/3-/p-tosyloksy/- -propylo/-glicerol. 8,0 g (13,4 milimola) l,3-dwu-0-/n-heksadecylo-2-17 -0-/3-hydroksypropylo/-glicerolu dodaje sie w tem¬ peraturze 10°C do roztworu 5,25 g (27,5 milimola) chlorku p-toluenosulfonylu i 10 ml pirydyny w 200 ml chlorku metylenu i miesza sie w ciagu 60 godzin w temperaturze pokojowej, po czym dodaje 200 ml wody, rozdziela fazy i faze wodna ekstrahuje 2 por¬ cjami po 150 ml chlorku metylenu. Wszystkie 3 roz¬ twory w chlorku metylenu laczy sie, plucze 2 por¬ cjami wody po 150 ml, suszy (MgS04), przesacza i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem.Otrzymany tosylan oczyszcza sie chromatograficz¬ nie na zelu krzemionkowym, eluujac benzenem.Otrzymuje sie 3,0 g (30% wydajnosci teoretycznej) oleistego produktu, IR (CHCla) 1130 i 1350 cm-1, N.M.R. (CDClj) 8 7,53 (q, 4, protony na pierscieniu fenylowym), 4,15 (t, 2, -SOsCH2CH2CH20-), 3,63 (t, 2 -S08CH2CH2CH20-), 3,42 (m, 9, -OCH(CH2OCH2C15 HS1)2), 2,45 (m, 3, Ar-CH3), 1,90 (m, 2, -S08CH2CH2 CH20-) i 0,90—1,50 (m, 62, alifatyczne protony).C. l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2-0-/3-cyjanopro- pylo/-glicerol. 3,0 g (4,0 milimola) l,3-dwu-0-/n-heksadecylo/-2- -0-/3-/p-tosyloksy/-propylo/-glicerolu rozpuszcza sie w roztworze 0,§ g (10 milimoli) cyjanku sodowego w 50 ml N,N-dwumetyloformamidu i miesza w tem¬ peraturze 80°C w ciagu 16 godzin, po czym chlodzi, rozciencza 100 ml wody i ekstrahuje 3 porcjami ete¬ ru po 100 ml. Polaczone wyciagi plucze sie kolejno 3 porcjami In kwasu solnego po 75 ml, 3 porcjami po 75 ml nasyconego roztworu wodnego wodoro¬ weglanu sodowego, 75 ml wody i 75 ml nasyconego roztworu wodnego chlorku sodowego, suszy (MgS04), przesacza i odparowuje pod zmniejszonym cisnie¬ niem, otrzymujac 2,0 g (83% wydajnosci teoretycz¬ nej) produktu o konsystencji wosku, IR (CHC1) 2250 cm-1.D. Zwiazek podany w tytule przykladu. 800 mg (21 milimoli) wodorku glinowolitowego dodaje sie do roztworu 2,0 g (3,3 milimoli) 1,3-dwu- -0-/n-heksadecylo/-2-0-/3-cyjanopropylo/-glicerolu w 100 ml eteru i miesza w pokojowej temperatu¬ rze w ciagu 60 godzin, po czym dodaje ostroznie nieco wody zeby zwilzyc mieszanine, a nastepnie jeszcze 100 ml, miesza w ciagu 1 godziny w tempe¬ raturze pokojowej i ekstrahuje 3 porcjami eteru po 100 ml.Polaczone wyciagi plucze sie 3 porcjami po 75 ml nasyconego roztworu wodnego chlorku sodowego, suszy (MgS04), przesacza i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem. Oleisty produkt oczyszcza sie chromatograficznie na zelu krzemionkowym, eluujac benzenem z etanolem i nastepnie rozpuszcza w eta¬ nolu i traktuje gazowym chlorowodorem, po czym odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem.Stala pozostalosc przekrystalizowuje sie z octanu etylu, otrzymujac 444 mg (21% wydajnosci teore¬ tycznej) produktu o temperaturze topnienia 61,5— 63,5°C, N.M.R. (CDC1,)6 3,67 (t, 2, -OCH2CH2CH2CH2 NH2), 3,55 (m, 9, OCH(CH2OCH2016H81)2) 3,10 (t, 2 -OCH2CH2CH2CH2NH2), 1,50—2,00 (m, 4, -OCH2CH2 CH2CH2NH2) i 0,80—1,50 (m, 62, alifatyczne protony).Analiza elementarna: %C %H %N obliczono 72,23 12,74 2,16 znaleziono 72,53 12,42 2,10 18 Przyklad XI. Chlorowodorek 1,2-dwu-O-Zn- -heksadecylo/-3-0-/3-aminometylobenzylo/-glicero- lu.A. l,2-dwu-0-/n-heksadecylo/-3-0-/3-cyjanoben- 5 zylo/-glicerol. 1,056 g 50% dyspersji wodorku sodowego (22 mili¬ moli) w oleju mineralnym dodajecie do roztworu 9,73 g (18 milimoli) l,2-dwu-0-/n-heksadecylo/-gli- cerolu w 150 ml czterowodorofuranu i miesza roz- 10 twór w ciagu 20 minut w pokojowej temperaturze i w atmosferze azotu, po czym dodaje sie 4,0 g (20 milimoli) bromku m-cyjanobenzylu i miesza w pokojowej temperaturze i w atmosferze azotu w ciagu nocy. 15 Nastepnie dodaje sie ostroznie 200 ml wody i eks¬ trahuje mieszanine 3 porcjami octanu etylu po 150 ml. Polaczone wyciagi suszy sie (MgS04), prze¬ sacza i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 12 g oleistego produktu, który oczysz- 20 cza sie chromatograficznie na zelu krzemionkowym, eluujac benzenem z heksanem. Otrzymuje sie 8,0 g (68% wydajnosci teoretycznej) oleistego produktu, IR (CHCla) 2230 cm-1.B. Zwiazek podany w tytule przykladu. 25 Roztwór 1,0 g (1,5 milimola) 1,2-dwu-O-Zn-heksa- decylo/-3-0-/3-cyjanobenzylo/-glicerolu w 10 ml ete¬ ru dodaje sie powoli i w atmosferze azotu do zawie¬ siny 0,057 g (1,5 milimola) wodorku glinowolitowego w 40 ml eteru i miesza w ciagu 1 godziny utrzymu- 30 jac w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna i w at¬ mosferze azotu.Nastepnie dodaje sie ostroznie 50 ml wody i eks¬ trahuje 3 porcjami eteru po 50 ml. Polaczone wy¬ ciagi suszy sie (MgS04), przesacza i odparowuje pod 35 zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac oleisty pro¬ dukt, który oczyszcza sie chromatograficznie na ze¬ lu krzemionkowym* eluujac benzenem z etanolem.Oczyszczony produkt rozpuszcza sie w octanie etylu i roztwór traktuje gazowym chlorowodorem, po 40 czym odparowuje do sucha pod zmniejszonym cis¬ nieniem i stala pozostalosc przekrystalizowuje z oc¬ tanem etylu. Otrzymuje sie 220 mg (21% wydajnosci teoretycznej) zadanego chlorowodorku o tempera¬ turze topnienia 88—90°C. 45 Analiza elementarna: %C %H %N obliczono 74,14 11,87 2,01 znaleziono 74,35 11,54 2,15 Przyklady XII—XXIII. W sposób analogicz- 50 ny do opisanego w przykladzie XI, stosujac odpo¬ wiednie produkty wyjsciowe i bromek cyjanoben- zylu otrzymuje sie zwiazki o wzorze 1, w którym R9 oznacza atom wodoru, Y oznacza grupe o wzorze 4, a Rj i R2 maja znaczenie podane w tabeli VIII 55 i dla przykladów,XII—XIV znajduja sie w poloze¬ niu 1,3-, a dla przykladów XV—XXIII w polozeniu 1,2 — glicerolu.Przyklad XXIV. Chlorowodorek 1,2-dwu-O-/ (n-heksadecylo)-3-0-(4-aminometylofenylo)-glicero- 60 lu.A. l,2-dwu-0-(n-heksadecylo)-3-0-(p-tosylo)-gli- cerol.Zwiazek ten otrzymuje sie w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie XI B, przez reakcje 1,2- 65 -dwu-0-(n-heksadecylo)-glicerolu z chlorkiem p-19 115777 Tabela VIII 20 Numer przykladu XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX XXI XXII XXIII Rl n-heksadecyl n-heksadecyl n-heksadecyl n-tetradecyl n-heksadecyl n-tetradecyl n-oktadecyl n-oktadec-9-enyl n-tetradecyl n-heksadecyl n-oktadecyl n-oktadec-9-enyl • 1*2 n-heksadecyl n-heksadecyl n-heksadecyl n-tetradecyl n-heksadecyl n-tetradecyl n-oktadecyl n-oktadec-9-enyl n-tetradecyl n-heksadecyl n-oktadecyl n-oktadec-9-enyl Pozycja pod- stawnika w pierscieniu fenylowym orto meta para orto orto meta meta meta para para para para Wzór sumaryczny zwiazku C43H81O3N • HC1 C48H81OaN-HCl C4sH8iOsN • HC1 • H20 C89H7508N-HC1-1/ /4H20 C43H8108N-HC1 , C89H7808N • HC1 C47HMOsN • HC1 C47H95OsN-HCl-l/ ' /2HaO Ca^HTaO^N-HCl C«H81OsN-HCl C47He90,N • HC1 C^H^OaN • HC1 • 3/ /4H20 Temperatura topnienia produktu °C 71—73 77—79 77—78 . 71—72 79—80 87—88 73—75 olej 132—135 117—119 67—69 olej Tabela VIIa W tabeli VJIa podano wyniki analizy elementarnej produktów wytworzonych w przykladach XII—XXIII Numer przykladu XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XX XXI XXII \ XXIII c 74,14 73,20 72,28 72,63 74,14 73,14 74,99 74,50 73,14 74,14 74,99 74,06 Obliczono (%) H 11,87 11,85 11,83 11,48 11,87 11,65 12,06 11,57 11,65 11,87 12,06 11,54 Analiza e 1 N 2,01 1,98 1,96 2,17 2,01 2,19 1,86 1,85 2,19 2,01 1,86 1,83 ementarna C 73,89 73,17 72,52 72,62 73,94 72,86 74,97 74,40 72,84 74,33 74,50 74,00 Znaleziono (%) H 11,43 11,53 11,46 11,81 . 11,25 11,44 11,73 11,08 11,30 11,55 11,30 10,99 N 1,99 2,28 1,90 ' 2,43 2,02 2,11 1,83 2,08 2,26 2,15 1,91 1,93 1 -toluenosulfonylu. Po przekrystalizowaniu z octa¬ nu etylu produkt topnieje w temperaturze 53— —55°C, JR(CHC18) 1360 i 1180 cm-1.B. l,2-dwu-0-(n-heksadecylo)-3-0-(4-cyjanofeny- lo)-glicerol.Mieszanine 1,4 g (2,0 milimola) l,2-dwu-0-(n-heksa- decylo)-3-0-(p-tosylo)-glicerolu i 0,5 g (3,5 milimo¬ la) 4-cyjanofenolanu sodowego -w 100 ml ksylenu miesza'sie utrzymujac w stanie wrzenia pod chlod¬ nica zwrotna w ciagu 16 godzin, a poniewaz reak¬ cja nie dobiega jeszcze konca, przeto nastepnie od- destylowuje sie ksylen i zastepuje go 100 ml N,N- -dwumetyloformamidu i dalej miesza w ciagu 16 godzin w temperaturze 150°C. Nastepnie roztwói chlodzi sie, rozciencza 100 ml. wody i ekstrahuje 2 porcjami eteru po 100 ml.Polaczone wyciagi plucze sie kolejno 100 ml 3n 50 60 65 kwasu solnego, 100 ml 10% wodnego roztworu wo¬ doroweglanu sodowego i 100 ml wody, suszy (Mg S04), przesacza i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Oleista pozostalosc oczyszcza sie chro¬ matograficznie na zelu krzemionkowym, /eluujac benzenem. Otrzymuje sie 0,65 g (50% wydajnosci te¬ oretycznej) procluktu o temperaturze topnienia 53— —55°C, JR(CHC13) 2210 cm-1.C. Zwiazek podany w tytule przykladu. 0,60 g (0,93 milimola) l,2-dwu-0-(n-heksadecylo)- -3-0-(4-cyjanofenylo)-glicerolu dodaje sie do za¬ wiesiny 0,3 g (7,9 milimola) wodoroku glinowo- litowego w 25 ml eteru i miesza w pokojowej tem¬ peraturze w ciagu 30 minut, po czym dodaje sie ostroznie 25 ml wody, rozdziela warstwy i warstwe wodna -ekstrahuje 3 porcjami po 25 ml eteru i 25 ml octanu etylu. Pierwotna warstwe organicz-115777 21 22 na laczy sie z 4 wyciagami, suszy (Mg S04), prze¬ sacza i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem.Oleista pozostalosc rozpuszcza sie w eterze i wpro¬ wadza do roztworu chlorowodór, wytracajac osad.Otrzymuje sie 0,41 g (64% wydajnosci teoretycznej) produktu o temperaturze topnienia 110—112°C, N.M.R. (CDCI,) 6 4,02 (s. 2, -CH^NH^.Analiza elementarna: % C % H % N obliczono 73,91 11,81 2,05 znaleziono 73,62 Il7?l 2,14 Przyklady XXV—XXVII. W sposób* analo¬ giczny do opisanego w przykladzie XXIV B—C, stosujac odpowiednie produkty wyjsciowe, wytwo¬ rzone z odpowiednich tosylanów sposobem podanym w przykladzie XXIV A i poddajac je reakcji z cy- janofenolanem sodowym, otrzymuje sie zwiazki o wzorze, 1, w którym RL i R^ oznaczaja rodniki n-heksadecylowe i dla przykladów XXV i XXVI znajduja sie w polozeniu 1,3-, a dla przykladu XXVII w polozeniu 1,2-glicerolu, R, oznacza atom wodoru i Y oznacza grupe o wzorze 2, w którym q oznacza liczbe 1. Dane dotyczace otrzymanych zwiazków zamieszczono w tabeli IX.P r z y k fa d XXVIII. Chlorowodorek 1,2-dwu-O- -(n-heksadecylo)-3-0-(4-)3-aminopropylo(-fenylo)-gli cerolu.Zwiazek ten wytwarza sie w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie XXIV, stosujac zamiast 4-cyjanofenolanu sodowego 4-(2-cyjanoetylo)-feno- lan sodowy. Produkt topnieje w temperaturze 153— —155°C.Analiza elementarna: % C % H % N obliczono 74,37 11,91 1,97 znaleziono 74,13 11,44 2,08 Przyklad XXIV. Chlorowodorek 1,2-dwu-O- 10 15 20 25 30 35 B. l,2-dwu-0-(n-heksadecylo)-3-0-(2-azydopropy- lo)-glicerol. 3,0 g (4,0 milimole) mieszaniny tosylanów (ustep A) rozpuszcza sie w* 50 ml N,N-dwumetyloacetami- du, dodaje roztwór 0,326 g 5,0 milimoli) azydku so¬ dowego w 5 ml wody i utrzymuje w temperaturze 90°C w ciagu 16 godzin, po czym .mieszanine chlo¬ dzi sie, rozciencza 200 ml wody i ekstrahuje 2 por¬ cjami po 150 ml eteru.Polaczone wyciagi plucze sie woda, suszy (Mg, S04), przesacza i odparowuje pod zmniejszonym cis¬ nieniem, otrzymujac 2g (81% wydajnosci teoretycz¬ nej) oleistego produktu, JR (CHCla) 2100 cm-1, be¬ dacego mieszanina zwiazków 2-azydopropylowego i 3-azydopropylowego. Mieszanine te stosuje sie do reakcji podanej w ustepie C.C. Zwiazek podany w tytule przykladu. 2 g (3,2 milimola) mieszaniny azydków rozpuszcza sie w 100 ml eteru, dodaje 0,4 g (10,5 milimola) "wo¬ dorku glinowolitowego i miesza w ciagu 2 go¬ dzin w temperaturze pokojowej, po czym nadmiar wodorku rozklada sie dodajac ostroznie 10 ml eta¬ nolu i 150 ml wody i mieszanine ekstrahuje sie 2 porcjami po 100 ml eteru.. Polaczone wyciagi eterowe suszy sie (Mg S04), przesacza i odparowuje pod zmniejszonym cisnie¬ niem, otrzymujac 1,8 g oleistego produktu. Produkt ten oczyszcza sie chromatograficznie na zelu krze¬ mionkowym, eluujac benzenem z etanolem, po czym dzialajac gazowym chlorowodorem na roztwór pro¬ duktu wytwarza sie chlorowodorek. Sól te przekry- stalizowuje sie z octanem etylu, otrzymujac 0,21 g (10% wydajnosci teoretycznej) zadanego produktu, który na" 1 mol zawiera okolo 0,5 mola H^O i top¬ nieje w temperaturze 56—58°C.Tabela IX Numer przy¬ kladu XXV XXVI XXVII 1 ii 1 Pozycja podstaw- nika w pierscieniu fenolo¬ wym meta para meta Wzór suma¬ ryczny zwiazku C42H790aN • •HC1 C^H^OsN • • HC1 C48H7901N • •HC1 Tempera¬ tura topnienia produktu 79—80 120—122 84—86 Analiza elementarna produktu Obliczono (%) C 73,91 73,91 73,91 H 11,81 11,81 11,81 N 2,05 2,05 2,05 Znaleziono (%) C 74,11 73,94 74,00 H 1 N -| 11,64 11,37 11,34 2,44 2,04 2,04 -(n-heksadecylo)-3-0-(2-aminopropylo)-glicerolu. 55 A. l,2-dwu-0-(n-heksadecylo)-3-0-(2-)p-tosylok- sy)-propylo)-glicerol.W sposób analogiczny do opisanego w przykla¬ dzie X A,.B l,2-dwu-0-(n-heksadecylo)-3-0-allilo- glicerol poddaje sie reakcji z kompleksem boranu 60 z siarczkiem metylu (BMS) i otrzymane zwiazki 2-hydroksypropylowy i 3-hydroksypropylowy prze¬ prowadza sie w odpowiadajace im tosylany. Mie¬ szaniny nie rozdziela sie, lecz bezposrednio poddaje dalszejreakcji. 65 Analiza elementarna: % C % H % N obliczono 71,03 12,70 2,18 znaleziono . 71,11 12,91 2,16 Przyklad XXX. Chlorowodorek 1,2-dwu-O- -n-oktadecylo)-3-0-(2-aminopropylo)-glicerolu.W sposób analogiczny do opisanego w przykla¬ dzie XXIX A z l,2-dwu-0-(n-oktadecylo)-3-0-allilo- glicerolu wytwarza sie l,2-dwu-0-(n-oktadecylo)- -3-0-(2-hydroksypropylo)glicerol, z którego sposo¬ bem podanym do opisanego w przykladzie XXIX B.C wytwarza sie zwiazek podany w tytule.23 115777 24 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych ami¬ nowych glicerolu lub propano"dioli o ogólnym wzo¬ rze 1, w którym jeden z podstawników QL i Q2 oz¬ nacza grupe o wzorze -0-Y-NHR3, a drugi grupe o wzorze OR1? Rx i R2 oznaczaja rodniki n-alkilowe o 12—20 atomach wegla albo rodniki n-alkenylowe o 12—20 atomach wegla, nie majace podwójnego wia¬ zania w pozycji 1, Y oznacza rodnik alkilenowy o 2—4 atomach wegla, majacy obie wolne wartoscio¬ wosci przy róznych atomach wegla, albo grupe o-, m- lub p-fenylenodwumetylenowa, albo grupe o wzorze 2, w której q oznacza liczbe calkowita 1—3 i wolna wartosciowosc po lewej stronie tego wzoru jest zwiazana z atomem tlenu, a R3 oznacza atom wodoru, jak równiez farmakologicznie dopu¬ szczalnych soli addycyjnych tych zwiazków z kwa¬ sami, znamienny tym, ze redukuje sie zwiazek o wzorze 3, w którym jeden z podstawników Q3 i Q4 oznacza grupe o wzorze — ORj, a drugi grupe o wzorze -0-Y'-CN, R± i R2 maja wyzej podane znaczenia, a Y' oznacza rodnik alkilenowy o 1—3 atomach wegla lub grupe o wzorze 4, zwiazana z lewej strony z atomem tlenu, albo tez Y' oznacza grupe o wzorze 5, w którym q ma wyzej podane znaczenie, a grupa ta jest z lewej strony zwiazana z atomem tlenu, po czym otrzymany zwiazek ewen¬ tualnie przeprowadza sie w farmakologicznie do¬ puszczalna sól z kwasem. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zwiazek o wzorze 3, w którym Rt i R2 oznaczaja rodniki n-heksadecylowe, a pozostale podstawniki maja znaczenia, podane w zastrz. 1. 10115777 Cl-U — Q1 1 2 ch —er i CH2 — 0R2 WZ0R 1 WZtfR 4 %, (CN2)q- WZCJR 2 CH?-Q3 I CH2- 0R2 WZ0R 3 CHoln.i — "•2^-1 WZ0R 5 ^1 —X-CM? CH-Z-ALK-B R2"-y-CH2 WZ0R 6 Rt — ch2 CH-(CH2)q —A CM9 WZÓR 7 i = 1 do 10 i = 1 do 10 100 + 1 00 ~Y_ x100 i = 1 do 10 WZÓR 8 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL