NO341226B1

NO341226B1 - Alginoligosakkarider og derivater derav samt fremstilling og anvendelse av det samme

Info

Publication number: NO341226B1
Application number: NO20064825A
Authority: NO
Inventors: Meiyu Geng; Xianliang Xin; Guangqiang Sun; Huashi Guan; Zhao Yang
Original assignee: Ocean Univ China
Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2006-10-24
Publication date: 2017-09-18
Also published as: NO20064825L; BRPI0509217B1; JP2007530718A; US20070254848A1; BRPI0509217A8; PL1736160T3; EA011417B1; DK1736160T3; WO2005089776A1; AU2005223923A1; JP4709203B2; KR20070007397A; ES2552218T3; US20150105344A1; ZA200608813B; CA2561873A1; US20170112870A1; HUE028071T2; US9493496B2; EP1736160A1

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse vedrører alginat-oligosakkaridderivater som angitt i krav 1, fremstillingen derav som angitt i krav 4, og anvendelsene av det samme i behandlingen av Alzheimers sykdom (AD) og diabetes som angitt i krav 10.

Bakgrunnskunnskap

AD og diabetes er for tiden vanlige og hyppig forekommende sykdommer som se-riøst truer menneskers helse. Spesielt er deres forekomst økende med veksten av den eldre befolkningen. Derfor blir profylaksen og behandlingen av disse sykdommer mer og mer kritisk.

Det er lite sannsynlig at nåværende forebyggende og helbredende legemidler for AD vil revolusjonere behandlingen av AD på grunn av deres begrensning til kun den symptomatiske lindring eller alvorlige ugunstige effekter. Legemidlene som vanligvis brukes for diabetes er hovedsaklig insulin og andre orale hypoglykemiske legemidler, hvorav de fleste er ufordelaktige når det gjelder anvendelighet ved bruk og toksisitet. Spesielt er det faktisk ingen effektive legemidler for type 2 diabetes. Det har blitt funnet at forekomsten av AD og type 2 diabetes er forbundet med avset-ningen av amyloid-beta (AP) og amylin (IAAP), den påfølgende fibrillogenese og økte frie oksidative radikaler, som gir opphav til det faktum at hemming av fibrilldannelsen av amyloid-beta og amylin blir perspektivet for profylaksen og behandlingen av disse sykdommene.

Alginater er hovedkomponentene i celleveggen hos brunalge, hvilke er lineære anion-polysakkarider sammensatt av p-D-mannuronsyre (ManA) og a-L-guluronsyre (GulA), bundet med 1-4-glukosidiske bindinger. Alginater tilhører høy-polymerer med en molekylvekt på flere 10<4>til IO<6>med tallrike kilder. Alginater har blitt mye brukt i matproduksjon, kjemisk teknologi og medisin, osv. Nylige studier har vist at alginat har mange forskjellige bioaktiviteter. Imidlertid er dets anvendelse som et legemiddel begrenset i en viss utstrekning av dets høye molekylvekt. Derfor er oligosakkaridene degradert fra alginater ved forskjellige metoder, svært verdifulle for glykokjemi, glykobiologi, glykoteknologi og studier av sakka rid baserte legemidler, osv. Metodene for degradering av alginat inkluderer enzymatisk, fysisk og kjemisk degradering, allikevel har behovet for spesifikke enzymer begrenset anvendelsen av enzymatisk degradering. Fysisk degradering som vanligvis brukes i kombinasjon med andre metoder, kan ikke enkelt frembringe oligosakkarider på grunn av produktenes fundamentale molekylvekt på omtrent 50.000 Da. Kjemisk degradering brukt for polysakkarider inkluderer sur hydrolyse og oksidativ degradering. Sur hydrolyse begrenses ved dens kapasitet til å få oligosakkarider med en molekylvekt på 4000 eller mindre når utført ved en normal temperatur og under et normalt trykk.

Forskjellige typer alginater er kjent fra CN 1341665 A, CN 1408360 A, CN 1454992 A, JP H06172375 A og EP 1153933 Al.

Redegjørelse for oppfinnelsen

For å løse de over beskrevne problemer og gjennom dyptgående studier utført av oppfinnerne, har det blitt funnet at et alginat-oligosakkarid med en molekylvekt på 4.000 eller mindre kan oppnås ved syrehydrolyse ved en høy temperatur og under et høyt trykk, og dets derivater, hvis reduserte terminal i stilling 1 er et karboksylradikal, kan fremstilles i nærvær av oksidanter. Oppfinnelsen er gjennomført på grunnlag av det ovenstående.

Foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer et alginat-oligosakkarid og dets derivativer med en lav molekylvekt, eller farmasøytisk akseptable salter derav, og tilveiebringer en fremgangsmåte for å fremstille det samme. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et medikament for profylaksen og behandlingen av AD og diabetes omfattende det ovennevnte lavmolekylære alginat-oligosakkarid eller dets derivater eller farmasøytisk akseptable salter derav.

Foreliggende oppfinnelse vedrører et alginat-oligosakkarid representert ved formel (I) og dets derivater eller farmasøytisk akseptable salter derav. Nevnte oligosakkarid er sammensatt av p-D-mannuronsyrer bundet med a-1,4 glykosidiske bindinger,

hvor n representerer 0 eller et heltall fra 1 til 19.

I foreliggende oppfinnelsen er et eksempel på nevnte alginat-oligosakkaridderivater en forbindelse representert av formel (II), hvor den reduserte terminal i stilling 1 er karboksylradikal,

hvor n representerer 0 eller et heltall fra 1 til 19.

I formlene (I) og (II) er n fortrinnsvis 2 til 10, og mer foretrukket 4 til 8. Årsaken til at biologiske effekter av tetrasakkarider til dodekasakkarider (fortrinnsvis heksa-sakkarider til dekasakkarider) er bedre, forblir uklar, hvilket kan være forårsaket av disse oligosakkariders tilbøyelighet til å bli gjenkjent og akseptert av celler.

Alginat-oligosakkaridderivatene inkluderer ytterligere f.eks. derivatene hvorav en del av hydroksylgruppene i mannuronsyre er sulfaterte.

De farmasøytisk akseptable salter av nevnte alginat-oligosakkarid og dets derivater kan f.eks. være salter av natrium, kalium, kalsium, magnesium og lignende. Natri-umsaltene er foretrukket. De farmasøytisk akseptable salter kan fremstilles ved konvensjonelle metoder.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av alginat-oligosakkaridet og dets derivater, hvori en alginatløsning reageres i omtrent 2 til 6 timer i en autoklav ved pH 2-6 og en temperatur på omtrent 100-120 °C; og dens pH deretter justeres til 7. Det oksidative degraderingsprodukt oppnås ved tilsetningen av en oksidant til alginat- oligosakkaridløsningen.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen varmes 0,5~5 % vandig natriumal-ginatløsning i 4 timer i en autoklav ved pH 4 og en temperatur på 110 °C. Etter at reaksjonen er fullført, suges reaktanten ut og avkjøles, og deretter justeres pH til 7 ved å tilsette NaOH-løsning. Under omrøring helles filtratet sakte i teknisk sprit som er 4 ganger volumet av filtratet, og står natten over for å tillate presipitasjon. Presipitatet filtreres fra med sug til tørrhet, og dehydratiseres ved vasking med absolutt etanol. En hvit filterkake oppnås og tørkes i en ovn ved 60 °C for å gi et ubearbeidet alginat-oligosakkarid. Det ubearbeidede alginat-oligosakkarid formuleres til en 10 % løsning og presipiteres med 95 % etanolløsning. Presipitatet vaskes med absolutt etanol, tørkes og formuleres til en 5 % løsning. Løsningen filtreres gjennom en 3 um film for å fjerne urenheter, avsaltes deretter på en Bio-Gel-P6-kolonne (1,6x180 cm) med 0,2 mol/l NH4HC03som mobilfasen og produktet samles ved multiple trinn. Eluatet måles ved sulfat-karbazolmetoden. Fraksjonene in neholdende sakkarider samles, konsentreres under et redusert trykk og avsaltes, og lyofiliseres for å gi alginat-oligosakkarider.

Fremstillingen av derivatene representert ved formel (II) er som følger: en oksidant tilsettes og reagerer i 15 min til 2 timer ved en temperatur på 100~120 °C deretter reageres alginatløsningen i omtrent 2 til 6 timer i en autoklav ved pH 2~6 og en temperatur på omtrent 100~120 °C. I en utførelsesform av oppfinnelsen tilsettes 25 ml 5 % koppersulfatløsning til 50 ml 10 % NaOH (aq), blandes umiddelbart, og tilsettes umiddelbart 40 ml 5 % alginat-oligosakkaridløsning. Den resulterende blandingen varmes i et kokende vannbad inntil ikke mer mursteinsrødt presipitat dannes. Blandingen sentrifugeres for å fjerne presipitatene. Noe supernatant tas ut og settes til 10 % NaOH (aq) og 5 % koppersulfatløsning i henhold til forholdet over for å sjekke enhver dannelse av mursteinsrøde presipitater. Dersom resultatet er negativt, settes supernatanten til teknisk sprit som er 4 ganger volumet av supernatanten, og står natten over for å tillate presipitasjon. Presipitatet filtreres fra med sug til tørrhet, dehydratiseres gjentatte ganger med absolutt etanol og tørkes i en ovn ved 60 °C. Separasjonen utføres på samme måte som for alginat-oligosakkaridet med formel (I).

Oppfinnelsen tilveiebringer også en farmasøytisk sammensetning som inneholder en effektiv mengde av nevnte alginat-oligosakkarid eller dets derivater, eller farma-søytisk akseptable salter derav og farmasøytisk akseptable bærere.

Den farmasøytiske sammensetning kan anvendes som et medikament for profylaksen og behandlingen av Alzheimers sykdom.

Videre kan den farmasøytiske sammensetning anvendes som en inhibitor for fibrill-dannende amyloid-p protein og fibrilloppløsende aktivator.

Den farmasøytiske sammensetning kan også anvendes som et medikament for profylaksen og behandlingen av diabetes.

Videre kan den farmasøytiske sammensetning anvendes som inhibitor for fibrill-dannende amyloid protein fra pankreatisk øy og inhibitor for amyloid polypeptid fra pankreatisk øy. Med tanke på den nåværende vanskelighet med mangel på effektive medisiner for profylaksen og behandlingen av AD og diabetes, er det spesielt viktig at alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes i fremstillingen av et medikament for profylaksen og behandlingen av AD og diabetes.

Beskrivelse av tegninger

Figur 1 er elueringskurven til alginat-oligosakkaridet ifølge den foreliggende oppfinnelse separert av en Bio-Gel-P6-kolonne etter syrehydrolyse. Figur 2 er MALDI-TOF-spekteret av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse. Figur 3 er elueringskurven til det oksidative degraderingsprodukt av alginat-oligosakkaridet separert av en Bio-Gel-P6-kolonne. Figur 4 er MALDI-TOF-spekteret av det oksidative degraderingsprodukt av alginat-oligosakkaridet (Positiv modus). Figur 5 viser effekten av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse på latensen til AD-mus indusert av APi-40. Figur 6 viser effekten av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse på feiltallene til AD-mus indusert av Ap^o. Figur 7 viser de beskyttende effekter av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse på SH-SY5Y-celler svekket av AP25-35. Figur 8 viser de beskyttende effekter av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse på SH-SY5Y-celler svekket av Ap^o. Figur 9 viser de hemmende effekter av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse på den normale og heparininduserte fibrilldannelse av APi-40. Figur 10 viser ustabiliteten av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse på fibrill APi_40. Figur 11 viser effektene av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse på konformasjonen av oppløst 250^g/ml Ap^o. Figur 12 viser de beskyttende effekter av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse på NIT-celler svekket av IAAP. Figur 13 viser effekten av blandingen med oksidativt degraderingsprodukt av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse på latensen til AD-mus indusert med APi_40testet med Morris vannlabyrint. Figur 14 viser effekten av blandingen med oksidativt degraderingsproduktet av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse på svømmelengden til AD-mus indusert med APi.40testet med Morris vannlabyrint. Figur 15 viser effekten av blandingen med oksidativt degraderingsprodukt av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse på første tid for ankomst på originalplaten av AD-mus indusert med APi_40testet med Morris vannlabyrint. Figur 16 viser effekten av blandingen med oksidativt degraderingsprodukt av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse på antall kryssinger av originalplaten av AD-mus indusert med APi_40testet med Morris vannlabyrint. Figur 17 viser de beskyttende effekter av blandingen med oksidativt degraderings-

produkt av alginat-oligosakkaridet ifølge foreliggende oppfinnelse på NIT-celler svekket av IAAP.

Utførelsesformer

1 Fremstilling av alginat-oligosakkaridet

1 g natriumpolymannanuronat (vektgjennomsnittlig molekylvekt på 8.235 Da, levert av Lantai Pharm. LTD., Ocean University of China) settes til destillert vann for å oppnå en 1 % løsning, pH justeres til 4 med HCI, plasseres i en autoklav og varmes ved 110 °C i 4 timer. Etter avkjøling justeres løsningens pH til 7 med NaOH (aq.). Med omrøring helles filtratet sakte i teknisk sprit, som er 4 ganger volumet av filtratet, og står natten over for å presipitere. Alkoholpresipitatet filtreres fra med sug til tørrhet, og dehydratiseres ved vasking med absolutt etanol. En hvit filterkake oppnås og tørkes i en ovn ved 60 °C for å gi et ubearbeidet alginat-oligosakkarid.

Det ubearbeidede alginat-oligosakkarid formuleres til en 10 % løsning og presipiteres med 95 % etanolløsning. Presipitatet vaskes med absolutt etanol og formuleres til en 5 % løsning etter tørking. Løsningen filtreres gjennom en 3 pm film for å fjerne urenheter og avsaltes så på en Bio-Gel-P6-kolonne (1,6x180 cm) med 0,2 mol/l NH4HCO3som mobilfasen og samles over flere trinn. Eluatet måles ved sulfat-karbazolmetoden, og komponentene som inkluderer sukkere samles, konsentreres under et redusert trykk og avsaltes på en G-10-kolonne. Den ytre volumkomponent separeres ytterligere med en Bio-Gel-P10-kolonne (1,6x180 cm) og lyofiliseres for å gi en rekke alginat-oligosakkarider (fig. 1). 2 Fremstilling av det oksidative degraderingsproduktet av alginat-oligosakkaridet 5 g av det over fremstilte alginat-oligosakkarid formuleres til en 5 % løsning. 25 ml 5 % koppersulfatløsning settes til 50 ml 10 % NaOH (aq) og blandes umiddelbart, og tilsettes umiddelbart 40 ml 5 % alginat-oligosakkaridløsning. Den resulterende blandingen varmes i et kokende vannbad inntil ikke mer mursteinsrødt presipitat dannes. Blandingen sentrifugeres for å fjerne presipitatene. Noe supernatant tas ut og settes til 10 % NaOH (aq) og 5 % koppersulfatløsning i henhold til forholdet over for å sjekke for mursteinsrødt presipitat. Er dette negativt, settes supernatanten til teknisk sprit, som er 4 ganger volumet av supernatanten, og står natten over for å tillate presipitasjon. Presipitatet filtreres fra med sug til tørrhet, dehydratiseres gjentatte ganger med absolutt etanol og tørkes i en ovn ved 60 °C. Således oppnås et ubearbeidet oksidativt produkt av alginat-oligosakkarid.

Det ubearbeidede oksidative degraderingsprodukt av alginat-oligosakkarid formuleres til en 10 % løsning, og presipiteres med 95 % etanolløsning. Presipitatet vaskes med absolutt etanol og formuleres til en 5 % løsning etter tørking. Løsningen filtres gjennom en 3 pm film for å fjerne urenheter og avsaltes deretter på en Bio-Gel-P6-kolonne (1,6x180 cm) med 0,2 mol/l NH4HC03som mobilfasen og samles over flere trinn. Eluatet måles ved sulfat-karbazolmetoden, og komponentene som inkluderer sukker samles, konsentreres under et redusert trykk og avsaltes på en G-10-kol-onne. Den ytre volumkomponenten separeres videre med en Bio-Gel-P10-kolonne (1,6x180 cm) og lyofiliseres for å gi en rekke oksidative degraderingsprodukter (fig. 2).

3 Strukturidentifisering av alginat-oligosakkaridene

Strukturene til oligosakkarider inneholdt i fraksjonen oppnådd fra fremstillingen av alginat- oligosakkaridene identifiseres. Det bekreftes at oligosakkaridene er alginat-oligosakkarider sammensatt av p-D-mannuronsyre bundet med 1,4-glykosidiske bindinger. Strukturformelen er:

hvor n representerer 0 eller et heltall fra 1 til 19.

Heretter tas fraksjonen ved omtrent 292 ml av eluatet (fraksjonen merket som "6" i fig. 1, heretter henvist til som Komponent 6), som et eksempel for å illustrere strukturanalysen av oligosakkaridene over.

3.1 Ultrafiolettabsorpsjonsspektrogram

Oligosakkaridfraksjonen ved omtrent 292 ml av eluatet fortynnes til en passende konsentrasjon og skannes ved 190-400 nm med UV-2102 UV-VIS-spektrofotometer. Det finnes at ingen spesifikke absorpsjon stop per fremkommer i det ultrafiolette område, som indikerer at strukturen er fri for konjugerte dobbeltbindinger. Imidlertid fremkommer ikke-spesifikke absorpsjon stop per ved 190~200 nm. Således kan det under avsalting av oligosakkaridet detekteres online i det ultrafiolette område over.

3.2 Analyse av infrarødt spekter

0,5 mg av oligosakkaridfraksjonen over veies. Infrarødt spekter bestemmes med NEXUS-470 intelligent infrared-spektrometer med KBr-pelleter. Toppene ved 3420,79 cm"<1>, 3214,64 cm 1 og 2924,61 cm<1>skyldes symmetriske strekkvibrasjoner av hydroksylgruppen; toppen ved 1600,25 cm<1>skyldes symmetriske strekkvibrasjoner av karbonylgruppen i karboksylatet; toppen ved 1406,54 cm<1>skyldes forskyvningsvibrasjoner av hydroksylgruppen; toppen ved 1146,42 cm"<1>skyldes symmetriske strekkvibrasjoner av C-O-binding i karboksylgruppen; toppen ved 1045,77 cm"<1>skyldes antisymmetriske strekkvibrasjoner av anhydroeter; og toppen ved 804,02 cm"<1>skyldes antisymmetriske strekkvibrasjoner av mannuronsyres cykliske skjelett. Det indikeres at en slik forbindelse har karboksylgruppe, hydroksyl-gruppe og mannuronsyres cykliske skjelett.

3.3 MS-analyse

MS-analyse utføres med BIFLEX II type MALDI-TOF-massespektrometer (Bruker Daltonics Co.). Som sett fra spekteret (fig. 2, tabell 1), er toppen på m/z 1073,9 molekyliontoppen [M-H]"<1>; toppen på m/z 1096,6 er [M+Na-21-l]"<1>; toppen på m/z

1028,0 er [M-HzO-CO-H]"<1>; toppen på m/z 821,2 er [M-ManA-CH20-2H20-H]"<1>; m/z 704,3 er [M-2ManA-H20-H]"<1>; m/z 634,4 er [M^ManA^CHzCO-CO-H]"1; toppen på m/z 536,5 er [M-2H]<2>"; og toppen på m/z 357,4 er [M-3H]<3>". I ESI-MS-spekteret av oligosakkaridfraksjonen over er molekyliontoppen m/z 1073,9 som indikerer at

dens molekylvekt er 1074.

3.4 Kjernemagnetisk resonansspektroskopi av alginat-oligosakkaridet<1>H NMR og<13>C NMR av alginat-oligosakkaridet representert med formel (I) (n=4) oppnås med JNM-ECP600 NMR-spektrometer. Resultatene er vist i tabell 2 og 3.

I følge analyseresultatene over bekreftes det at alginat-oligosakkaridet i fraksjonen over er mannuron-heksasakkarid med den følgende struktur (Ia):

3.5 Bestemmelse av innholdet av mannuronsyre i alginat-oligosakkaridet (<1>H-NMR-spektroskopi)

Sammensetningen av alginat-oligosakkaridet bestemmes ved høyoppløsnings<1>H-NMR for å kvantifisere forholdet mellom mannuronsyre og guluronsyre (M/G) i alginat-oligosakkaridet i henhold til protonsignalintensiteten av anomert karbon. 3 til 5 mg tørket prøve veies, løses i D20 ved nøytral pD og tilsettes 0,3 mg EDTA. Prøven bestemmes med et Bruker DPX-300 NMR-spektrometer. Spekteret rapporteres ved

70 °C, slik at D20-toppen er langt unna den anomere protonresonansområde. Den relative signalintensiteten utrykkes ved integralet av topparealet. Resultatene indikerer at H-l-signaler av M-radikal kommer til syne ved 4,64 ppm og 4,66 ppm (dvs. H-l-signaler av M-radikal i henholdsvis MM- og MG-sekvenser); alle H-l-signaler av G-radikal kommer til syne ved 5,05 ppm (dobbeltopp). Det relative innhold av M og G i prøven kan utrykkes ved deres H-l-toppintensitet, som den følgende ligning:

hvor I representerer toppintensiteten, uttrykt ved integralet av topparealet.

Det relative innhold av D-mannuronsyre i prøven er 98,07 % ved metoden over, hvilket indikerer at alginat-oligosakkaridet hovedsakelig er sammensatt av mannuronsyre. 4 Strukturidentifisering av det oksidative degraderingsprodukt av alginat-oligosakkaridet

Strukturen til det oligosakkarid oksidative degraderingsprodukt i fraksjonen oppnådd fra fremstillingen av det oksidative degraderingsprodukt av alginat-oligosakkaridet identifiseres. Det bekreftes at det oksidative degraderingsprodukt er et derivat av alginat-oligosakkaridet sammensatt av p-D-mannuronsyre bundet med 1,4-glykosidiske bindinger, hvor den reduserte terminal i stilling 1 er et karboksylradikal. Strukturformelen er:

hvor n representerer 0 eller et heltall fra 1 til 19.

Komponent 6 tas som et eksempel for å illustrere strukturanalysen av det oligosakkarid oksidative degraderingsprodukt over.

4.1 Ultrafiolett absorpsjonsspektrogram

En passende mengde oksidativt degraderingsprodukt fortynnes til en viss konsentrasjon med destillert vann og skannes med Shimdzu UV-260 UV-spektrofotometer

(190 nm~700 nm) ved full bølgelengde. Det finnes at ingen spesifikk absorpsjons-topp fremkommer i de ultrafiolette og synlige lysområdene.

4.2 Analyse av Infrarødt spekter

Infrarødt spekter av det oksidative degraderingsprodukt av alginat-oligosakkaridet bestemmes med NICOLE NEXUS-470 intelligent infrared-spektrometer. Resultatene er vist i tabell 4.

4.3 'H-NMR-analyse

<1>H-NMR- og<13>C-NMR-spekterene av det oksidative degraderingsprodukt oppnås med et Bruker Auance DPX-300 NMR-spektrometer. Som sett fra ^-NMR-spekteret, er det hovedsaklig sammensatt av signalene fra seks hydrogenatomer i p-D-mannuronsyre. Etter at koblingsmønsteret til hvert signal er tilordnet finnes det at det oksidative degraderingsprodukt av alginat-oligosakkaridet hovedsaklig er sammensatt av mannuronsyre. Hvis den reduserte terminal i stilling 1 er aldehydgruppen, bør kjemisk skifte av H-l a og H-l p være henholdsvis 5,11 ppm og 4,81 ppm. Siden den reduserte terminal i stilling 1 i alginat-oligosakkaridet er oksidert til karboksylgruppen fra aldehydgruppen, forsvinner H-l og således forsvinner signaler ved 5,11 ppm og 4,81 ppm. Som sett fra<13>C-NMR-spekteret, er den hovedsakelig sammensatt av signalene fra seks karbonatomer i p-D-mannuronsyre. Etter at kob-

lingsmønster til hvert signal er tilordnet, finnes det at intermediatmolekylet hovedsakelig er sammensatt av mannuronsyre. Sammenlignet med spekteret av inter-mediatet forsvinner signalet av den reduserte terminal C-l i mannuronsyre (94 ppm). Signalet av den reduserte terminal C-l (175,81 ppm) forskyves mot lavt felt. Grunnen er at den reduserte terminal i stilling 1 i alginat-oligosakkaridet er oksidert til karboksylgruppen fra aldehydgruppen og det kjemiske skift til C-l forandres fra omtrent 94 ppm for aldehydgruppen til 175,81 ppm for karboksylgruppen.

4.4 MS-analyse

MS-analyse utføres med BIFLEX III type MALDI-TOF-massespektrometer (Bruker Daltonisks Co.). Resultatene er vist i fig. 4. Som sett fra fig. 4, er toppen på m/z 1113,7 [M+Na]<+1>; toppen på m/z 1113,7 er [M-0+Na]<+1>; toppen på m/z 1083,7 er [M-CH20+Na]<+1>; toppen på m/z 1067,6 er [M -CH20-0 +Na]<+1>; toppen på m/z 1053,6 er [M-2(CH20)+Na]<+1>; toppen på m/z 979,6 er [M-3(CH20)-C02+Na]<+1>; og toppen på m/z 921,6 er [M-4(CH20)-C02-CO+Na]<+1>. MS-analyse av det oksidative degraderingsprodukt av alginat-oligosakkaridet er vist i tabell 5.

I MALDI-TOF-spekteret av det oksidative degraderingsprodukt av alginat-oligosakkaridet, er toppen på m/z 1113,7 [M+Na]<+1>, som indikerer at molekylvekt til det oksidative degraderingsprodukt av alginat-oligosakkaridet er 1090,7. Mole-kylvekten økte seksten sammenlignet med den til syrehydrolysert alginat-oligosakkarid (M = 1075), det vil si et oksygenatom er lagt til i molekylet, som kan anses som at alginat-oligosakkaridet er oksidert under fremstillingen.

I henhold til analyseresultatene over er strukturen til det oksidative degraderingsprodukt av alginat-oligosakkaridet formelen (Ila):

5 Evaluering av alginat-oligosakkaridet på Alzheimers sykdom (AD)

En 6-mer separert med Bio-Gel-P6-kolonne brukes som et eksempel for å vise dens aktivitet. Så alginat-oligosakkaridet refereres til som "6-mer" i følgende eksperi-menter.

5.1 Effekter av 6-mer på AD-mus indusert med APi.40

Hann Balb/c-mus (18-22 g, kjøpt fra Laboratory Centre of Shandong University) veies og tildeles tilfeldig til seks grupper som følger: en kontrollgruppe, en modell-gruppe, en lavkonsentrasjons (15 mg/kg) 6-mer-behandlet gruppe, en middelskon-sentrasjons (30 mg/kg) 6-mer-behandlet gruppe, en høykonsentrasjon (60 mg/kg) 6-mer-behandlet gruppe og en Huperzin A-behandlet (HBY, med en konsentrasjon på 0,2 mg/kg) gruppe. Musene ble administrert oralt med korresponderende legemidler på dag 3 etter gruppering. Legemidlene ble administrert én gang daglig fort-løpende med en dosering på 0,5 ml/20 g inntil eksperimentet var ferdig. Musene fra kontroll- og modellgruppene ble administrert samtidig med en ekvivalent mengde normal saline.

På den 8. dagen etter legemiddeladministrasjon injiseres mus med eldet Ap^o unntatt vehikkelgruppen, som referansemetoden (Jhoo JH et al. p-amyloid (1-42)-induced learning and memory deficits in mice: involvement of oxidative burdens in the hippocampus and cerebral cortex. Behavioural Brain Research (2004) 155: 185-196) for å indusere AD-modellen. Eldet Ap^o-løsning injiseres i den høyre cerebral ventrikkelen. Resultatene av tilegnelsesforsøk testet med Morris vannlabyrint viser at Ap-behandlede mus viser en lengre rømningslatens (P<0,05, P<0,01) sammenlignet med kontroll- og modellgruppene, hvilket indikerer at AD-modellmusene er etablert (fig. 6). På den første testdagen forkortes imidlertid den-ne økte rømningslatens i alle legemiddelbehandlede grupper unntatt gruppen behandlet med 15 mg/kg 6-mer. Og rømningslatensen for den 60 mg/kg 6-mer-behandlede gruppe har statistisk signifikans sammenlignet med den til modellgrup pen (P<0,05). Pa den andre og tredje testdag forkortes rømmingslatensen for av alle legemiddelbehandlede grupper, hvori den til den 60 mg/kg 6-mer-behandlede gruppe og HBY-behandlede gruppe har statistisk signifikans sammenlignet med den til modellgruppen (P<0,05).

På den fjerde dag i Morris vannlabyrinttest fjernes originalplaten og prosenten av tiden med mus som sår ved fasen til originalplaten innen 60 s registreres. Resultatene viser at mus i modellgruppen foreviser mye lavere latensnivå enn kontrollgruppen (P<0,05), og latensnivået er signifikant hevet etter administrasjonen av 6-mer sammenlignet med den til modellgruppen (P<0,05) (tabell 7).

På den 25. dagen etter Ap-injeksjon trenes musene videre for å gå gjennom oppgaven med passiv unngåelse. I oppgaven plasseres hver mus i den opplyste del av apparatet, snudd vekk fra det mørke del, og døren åpnes hvilket gir adgang til den mørke del. Så snart musen kommer inn i den mørke del mottar den et uunngåelig elektrisk sjokk i føttene (36 V) gjennom det rustfrie stålgittergulv. Testen utføres på lignende måte etter 24 timer. Inngangstiden til hver mus inn i det mørke kammer (latens til å gå igjennom, maks testing begrenset til 3 min) og antallet inntredener inni den mørke del (antall feil) registreres.

Resultatene av oppgaven med gå gjennom passiv unngåelse er vist i figur 5 og 6. Hver gruppe har 8 dyr. Dataen presenteres som gjennomsnitt ± SE. Symbolet # betyr signifikant forskjell sammenlignet med kontrollgruppen (P<0,05).<*>betyr signifikant forskjell sammenlignet med modellgruppen (P<0,05). Gå gjennom-latensen til den Ap^o-behandlede gruppe forkortes (P<0,01) og antallet feil økes (P<0,05) sammenlignet med den til kontrollgruppen, som indikerer den vellykkede etableringen av AD-mus. Imidlertid er gå gjennom-latensen signifikant forlenget i 30 og 60 mg/kg 6-mer-behandlede grupper og HBY-behandlede grupper, som indikerer at antall feil er signifikant redusert i 6-mer- og HBY-behandlede grupper, som indikerer at 6-mer har virkningen å signifikant forbedre lære- og hukommelsesakti-vitet i APi-4o-induserte modeller.

Effekter av 6-mer på de hjernebiokjemiske indikatorer i Ap-induserte AD-mus

Etter atferdstesten avlives rottene. Cerebral cortex og hippocampus dissekeres umiddelbart på is og lagres ved -80 °C etter hurtig frysning i flytende nitrogen i 1 time. MDA-, SOD-, GSH-PX-, Na<+->, K<+->ATPase-, AchE- og CHAT-aktiviteter i hjerne-områdene bestemmes ved bruk av de respektive kit. Homogenatene av cerebral cortex og hippocampus prepareres med saline med en sluttkonsentrasjon på 10 % og 5 %. Supernatanten ble oppnådd etter sentrifugering ved 3600 rpm for å teste MDA-, CuZn-SOD-, GSH-PX-, Na<+>K<+->ATPase-, AchE- og ChAT-aktiviteter. ChAT-aktiviteten bestemmes ved en isotopmerket metode. De andre indeksene og meng-den totale proteiner testes med de respektive kit levert av Nanjing Jiancheng Bio-engineering Institute.

(1) Effekter av 6-mer på ChAT-akti vi teten i AD-mus ChAT-aktiviteten i den cerebrale cortex er merkbart redusert etter behandling med

Ap sammenlignet med kontrollgruppen (p<0,05). Imidlertid er dens aktivitet høynet etter behandlingen med 6-mer og HBY, hvor de helbredende effekter av 30 mg/kg og 60 mg/kg med 6-mer og HBY har en statistisk signifikans (tabell 8).

(2) Effekter av 6-mer på SOD-aktiviteten i AD-mus

SOD-aktiviteten i hjernen er redusert etter behandling med Ap, men har ingen statistisk signifikans sammenlignet med kontrollgruppen. Dens aktivitet er signifikant høynet i både cerebral cortex og hippocampus etter behandlingen med 6-mer ved en dose på 60 mg/kg, som indikerer at virkningsmekanismen av 6-mer på AD er knyttet til forbedringen av antioksidantaktiviteten (tabell 9).

(3) Effekter av 6-mer på MDA-innholdet i AD-mus

MDA-innholdet i cerebral cortex og hippocampus har ingen signifikant forskjell sammenlignet med kontrollgruppen. Dets innhold er redusert i hjernen etter behandlingen med HBY og 6-mer ved en dose på 30 mg/kg og 60 mg/kg, som indikerer at begge har evnen til å forbedre responsen på oksidasjon og skade av frie radikaler i hjernen og beskytter hjernen mot oksidativ skade (tabell 10).

(4) Effekter av 6-mer på GSH-PX-aktiviteten i AD-mus

GSH-PX-aktiviteten i cerebral cortex og hippocampus reduseres etter bruk av Ap med signifikant forskjell sammenlignet med kontrollgruppen i hippocampus (p < 0,05). Dens aktivitet høynes i cerebral cortex etter behandlingen med 6-mer, hvor aktiviteten er signifikant forskjellig etter behandlingen med alginat-oligosakkaridet ved en dose på 60 mg/kg og HBY (p < 0,05). Resultatene er vist i tabell 11.

(5) Effekter av 6-mer på Na+-, K+-ATPase-aktiviteten i AD-mus

Na+-, K+-ATPase-aktiviteten i cerebral cortex og hippocampus reduseres signifikant etter behandling med Ap sammenlignet med kontrollgruppen, som indikerer at Ap påvirket energimetabolismen i nevroner i hjernen signifikant. Imidlertid er dens aktivitet markert høynet etter behandlingen med alginat-oligosakkaridet ved tre forskjellige doseringer, hvori aktiviteten er signifikant høynet etter 60 mg/kg-behandlingen i hippocampus sammenlignet med HBY, som indikerer at forbedring av energimetabolismenivået i hjernen kan være én av mekanismene til alginat-oligosakkaridet for å beskytte hjernefunksjoner og anti-AD. Resultatene er vist i tabell 12.

5.2 Beskyttende effekter av 6-mer på nevroner svekket av Ap in vitro

De primære cerebral cortex nevronene fra rotte dyrkes som referansemetoden (Banker GA, et al. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res, 1977, 126:397-425). Cellene dyrket i 1 uke brukes i dette eksperiment. Dette vil si at på den åttende dagen forbehandles cellene med en rekke konsentrasjoner av 6-mer (sluttkonsentrasjon på 0, 10, 50, 100 ug/ml) i 24 timer, etterfulgt av tilsetningen av eldet Ap25-35(først løst i destillert vann ved en konsentrasjon på 1 mg/ml, så stått ved 37 °C i 7 dager for å få eldet AP25.35og lagret ved -20 °C for bruk) med en sluttkonsentrasjon på 30 uM. Etter 24 timer ved 37 °C tilsettes 10 pl MTT med en konsentrasjon på 5 mg/ml. Etter 4 timer ved 37 °C fjernes supernatanten og 150 pl DMSO tilsettes. Så registreres absorbansen ved 570 nm (630 nm som refe-ranse) med en ELISA-avleser (Rainbow, TECAN, Østerrike).

Det finnes at etter at primærnevronene er innkubert med 30 pM eldet AP25-35har reduksjonen av MTT sunket merkbart og cellenes overlevelsesrate er signifikant redusert til 54,5 + 8,9 % (P<0,001) etter behandlingen med eldet AP25-35. 6-mer ved dosering på 10, 50, 100 \ ig/ m\ kunne signifikant øke de overlevende cellene svekket av AP25-35på en doseavhengig måte (overlevelsesraten er henholdsvis 72,0 +11,2 %, 77,1 + 8,1 % og 82,3 + 11,6 %).

6-mer har liknende beskyttende effekter på nevroncellelinje SH-SY5Y som primærnevronene. SH-SY5Y svekket med 30 pM eldet Ap25-35(fig- 7) og 2 pM Ap^o (fig. 8)

i 48 timer kunne indusere en rekke forandringer, f.eks. skader på cellene, redusert antall celler, forekomst av noen runde celler og suspensjonsceller. Videre er overlevelsesraten til cellene redusert til henholdsvis 73,3+9,4 % og 64,1+2,5 %. Imidlertid kunne alginat-oligosakkaridet ved en dosering på 50 og 100 \ ig/ m\ signifikant hemme nevrotoksisiteten av Ap, f.eks. reduseres forekomsten av suspensjonsceller og overlevelsesraten er økt.

Eksperimentene over viste at 6-mer kunne forkorte rømningslatensen og øke antall ganger originalplaten krysses og forkorte tiden for å ankomme på originalplaten for AD-mus indusert med APi-40, hvilket impliserer dens atferdsmessige forbedring av aktivitet i Ap-behandlede mus. Dette in vivo-resultatet samt de in vitro-beskyttende effekter og nevroncellelinjer antyder at 6-mer har anti-AD-aktivitet.

6 Virkningsmekanismestudier av 6-mer på AD

6.1 Effekter av 6-mer på apoptosen i cellelinje SH-SY5Y indusert av Ap25.

35

SH-SY5Y-celler inkuberes i 6-brønns plater ved en tetthet på 2xl0<5>celler per brønn. Dagen etter plettering forbehandles celler med varierende konsentrasjoner (0, 50, 100^g/ml) av 6-mer i 24 timer, etterfulgt av tilsetning av 30 eldet Ap25_35(Kjøpt fra Sigma. Co.). Etter 48 timer ved 37 °C fordøyes cellene, samles, vaskes, sentrifugeres ved 1200 rpm og inkuberes med 200 ml av en blanding av 5 mg/ml pro-pidiumjodid (Hyclone Co.) og 100 U/ml RNase(Hyclone Co.). Deretter måles cellene med flow-cytometri (BD Co., US) med 8000 celler per prøve.

Det finnes at SH-SY5Y-celler stimulert med 30 eldet Ap25_35i 48 timer viser 24,8±1,9 % hypodiploide celler. Imidlertid undertrykker forbehandling med 50 og 100^g/ml 6-mer i 24 timer signifikant apoptose indusert av eldet Ap25.35, og de observerte prosentandeler av hypodiploide celler er henholdsvis 10,2 ± 1,3 % og 5.1 ± 0,7 %.

Videre finnes det at 6-mer også signifikant stanser apoptotisk kaskade ved å reversere overbelastning av intracellulært kalsiumion og ROS-opphopning, og ved å opp-regulere ekspresjonen av Bcl-2 og nedregulere ekspresjonen av P53 og kaspase-3 indusert av Ap. Alle disse faktorene bidrar til det terapeutiske potensial av 6-mer i behandlingen av AD.

6.2 6-mers molekylærmekanisme på antinevrontoksisitet av Ap (1) Effekter av 6-mer på fibrilldannelsen av APi.40

Fersk Ap^o inkuberes alene eller med 6-mer (sluttkonsentrasjon på henholdsvis 10, 50 og 100 ug/ml) ved 37 °C i 24 timer. Etter inkubasjon tilsettes Th-T og fluo-rescensintensitet undersøkes ved Em=450nm og Ex=480nm.

Resultatene viser at 6-mer (ved en dose på 10, 50, 100^g/ml) kan hemme opphopning av APi.40, hvori den hemmende effekt av 100 \ ig/ m\ 6-mer er mest åpenbar. Fluorescensintensiteten er henholdsvis 10,46±0,94, 9,18±1,32 og 7,81±1,38 (henholdsvis p<0,05, 0,05 og 0,001). De samme effektene av 6-mer på fibrilldannelsen av APi-40er studert med TEM (Fig. 9), som indikerer at 6-mer signifikant kan hem me fibrilldannelse av APi-40. Videre finnes det at 6-mer viser signifikant hemmende effekt på fibrilldannelsen av APi_40fremmet av heparin ved bruk av TEM. I fig. 9 viser A resultatet av inkubasjon med APi_40alene i 24 timer; B viser resultatet av inkubasjon med en blanding av Ap^o og heparin 24 timer; C viser resultatet av inkubasjon med en blanding av APi_40og 6-mer i 24 timer; D viser resultatet av inkubasjon med en blanding av APi_40, heparin og 6-mer i 24 timer; E viser resultatet av inkubasjon med APi_40alene i 48 timer; F viser resultatet av inkubasjon med en blanding av APi.40og heparin i 48 timer; G viser resultatet av inkubasjon med en blanding av APi.40og 6-mer i 48 timer; og H viser resultatet av inkubasjon med en blanding av APi_40, heparin og 6-mer i 48 timer.

(2) Effekter av 6-mer på ustabiliteten av Api.40-fibrill

1 mg/ml destillert vannoppløst APi.40eldes ved 37 °C i 7 dager, hvoretter det eks-poneres for 6-mer i 3 dager. Prøven farges med uranacetat og TEM (JEM 1200EX) viser at APi_40alene fører til dannelsen av lange, vridde fibere etter aldring i 7 dager (Fig. 10A). I nærvær av heparin i ytterligere 24 timer blir de lange, vridde fibrene mye tettere og lengre sammenlignet med de dannet i fravær av heparin (Fig. 10B). I nærvær av 6-mer i ytterligere 3 dager, forandres de lange og aggregerte Ap-fibrene merkbart til små irregulære korte fibere (Fig. 10C). Disse funnene antyder at 6-mer er i stand til å reversere tidligere dannet Ap-fibrill, som understreker den destabiliserende virkning av 6-mer på tidligere dannet Ap-fibrill og dermed potensiell terapeutisk intervensjon.

(3) Effekter av 6-mer på konformasjonen av APi.40

CD-spekter (J-500A, JASCO, Japan) av monomerisk Ap^o (250^ig/ml i TBS (100 mM Tris, 50 mM NaCI, pH 7,4)) inkubert ved 37 °C i 12 timer er hovedsakligkarakterisert vedp-ark sekundær struktur (Fig. 11A). Den samtidige eksponering av monomerisk APi.40for 6-mer (100 \ ig/ m\) i 12 timer forhindrer p-arkdannelse (Fig. 11C). Imidlertid akselererer heparin signifikant den konformasjonelle overgang til p-arkstruktur (Fig. 11B).

(4) Interaksjon mellom 6-mer og Ap

SPR-teknikk (BIAcore X, Uppsala, Sverige) brukes for å karakterisere interaksjonen mellom 6-mer og Ap. Forskjellig grad av eldet APi_40(eldet i 0, 0,5, 1, 2, 4, 6 dager ved 37 °C) i HBS EP-bufferløsning (0,01 M HEPES, 150 mmol/l NaCI, 3,4 mmol/l EDTA-Na2, 0,005 vol% Tween-20, pH 7,4) med 5 konsentrasjoner strømmes gjennom den 6-mer-immobiliserte sensorbrikken. Strømningshastighet er 5^l/min og injeksjonsvolumet er 10 n.1. Bindingssensorgrammet registreres og sensorbrikken regenereres med 2 M NaCI.

Det finnes at forskjellige grader av eldet APi_40alle kan binde til 6-mer. Bindingsaffiniteten er svakest for fersk APi_40og 6-mer med en KD-verdi på 6,85E-07 M. Bindingsaffiniteten øker med grad av alder (KD-verdier er henholdsvis l,07E-07, 9,06E-08, 5,43E-08, 2,15E-08, l,45E-08 M) og blir i all vesentlighet stabil etter 2 dagers aldring.

Videre studier viser at 6-mer binder til full-lengdet Ap gjennom Hisl3~Lysl6 og binder til AP25-35gjennom Ser26~Lys28. Bindingen av 6-mer med fersk Ap kan bidra til dens hemming av fibrillogenese av Ap. Bindingen av 6-mer med eldet Ap kan bidra til ustabiliteten av Ap-fibrill.

Studiene over viser at molekylærmekanismene tilskrives det faktum at 6-mer både hinder den total fibrillogenetiske prosess og spesielt tar fra hverandre den tidligere dannede Ap-fibrill. Disse resultatene indikerer at 6-mer, som virker som en full Ap-kaskadeantagonist, er en potensiell forebyggende og terapeutisk kandidat for AD, som sørger for beviset for prinsippet om en ny strategi for behandlingen av AD.

7 Studie av 6-mer på diabetesmodeller

7.1 Beskyttende effekter av 6-mer på pankreatiske beta-celler svekket av amylin in vitro

Den humane pankreatiske beta-cellelinje NIT dyrkes med DMEM-medium inneholdende 10 % FBS. Cellene inkuberes inn i 96-brønns plater med en tetthet på lxlO<4>celler/brønn. Dagen etter plettering forbehandles de med varierende konsentrasjoner av 6-mer (sluttkonsentrasjon på 0, 10, 50, 100^g/ml) i 24 timer, etterfulgt av tilsetningen av eldet amylin med en sluttkonsentrasjon på 30^M. Etter 48 timer ved 37 °C måles cellenes overlevelse ved MTT-metoden.

Resultatene viser at 6-mer kunne øke de overlevende cellene svekket av amylin på en doseavhengig måte (fig. 12). Hver gruppe har 6 dyr. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SE. ## betyr statistisk forskjell sammenlignet med kontrollgruppen (p<0,01).<*>og<**>betyr statistisk forskjell sammenlignet med den IAPP-behandlede gruppe (p<0,05 og p<0,01). Dataene antyder at 6-mer har beskyttende effekter på pankreatiske beta-celler svekket av amylin.

7.2 Effekter av 6-mer på diabetiske mus indusert med streptozotocin (STZ) in vivo

Seksti hann NIH-mus (vekt 18-22 g) deles på måfå i kontroll, modell, 50, 150, 450 mg/kg 6-mer-behandlede og 5 mg/kg dimetyldiguanid-behandlede grupper. Musene injiseres intraperitonealt med 150 mg/kg STZ unntatt kontrollgruppen på den første dagen. Musene gis deretter legemidler følgelig fortløpende i 10 dager og øye-eplene plukkes ut for å trekke ut blod på den ellevte dagen. Blodet tas for å måle glukosekonsentrasjonen. Konsentrasjonen i hver 6-merbehandlede gruppe er signifikant lavere enn den i modellgruppen, som indikerer at 6-mer har terapeutiske effekter på STZ-induserte diabetiske mus (tabell 13).

De samme eksperimentene utføres med 2-mer til 22-mer alene eller deres blan-dinger eller de oksidative degraderingsprodukter derav. Resultatene lignende de med 6-mer for å indikere deres potensielle aktivitet på AD og diabetes. Figur 13 til 16 viser atferdsresultatene til blandingen av oksidative degraderingsprodukter av alginat-oligosakkaridene på AD-mus indusert med Ap^o injisert i hjernen. Hver gruppe har 8 dyr. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SE. Symbolet # og ## står for statistisk forskjell sammenlignet med kontrollgruppen (p<0,05, p<0,01), og<*>og<**>står for statistisk forskjell sammenlignet med modellgruppen (p<0,05, p<0,01). Dataene viser at blandingen av de oksidative degraderingspro- duktene av oligosakkaridene signifikant kan forbedre lærings- og hukommelsesev-nen hos AD-mus. Figur 17 viste det beskyttende resultatet av blandingen med oksidative degraderingsprodukter av alginat-oligosakkaridene på pankreatisk beta-cellelinje NIT svekket av IAAp(amylin). Hver gruppe har 6 dyr. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. Symbolet ## står for statistisk forskjell sammenlignet med kontrollgruppen (p<0,01), og<*>og<**>står for statistisk forskjell sammenlignet med modellgruppen (p<0,05, p<0,01). Dataene viser at blandingen av de oksidative degraderingsprodukter av alginat-oligosakkaridene har en signifikant forebyggende og helbredende effekt på diabetes.

8 Statistisk analyse

Dataene analyseres statistisk ved bruk av programvaren Statview uttrykt som gjennomsnitt ± SE og sammenlignes ved variansanalyse (ANOVA).

Basert på ovenstående resultater kan den farmasøytiske sammensetning inneholdende en effektiv mengde av alginat-oligosakkaridene og farmasøytisk akseptable bærere fremstilles. Den farmasøytiske sammensetning inkluderer en inhibitor for fibrilldannende amyloid p protein og en inhibitor for fibrilldannende amyloid protein fra pankreatisk øy. Alginat-oligosakkaridet ifølge den foreliggende oppfinnelsen har viktige verdier i fremstilling av legemidler for profylakse og behandling av AD og diabetes.

Claims

1. Alginat-oligosakaridderivater som vist i den følgende formel II eller farma-søytisk akseptable salter derav, hvor alginat-oligosakaridet er satt sammen av p-D-mannuronsyre bundet sammen av a-1,4 glykosid-bindinger:

hvor n representerer 0 eller et heltall fra 1 til 19.

2. Alginat-oligosakaridderivater eller farmasøytisk akseptable salter av disse i henhold til krav 1, karakterisert vedat ner 2 til 12.

3. Alginat-oligosakaridderivater eller farmasøytisk akseptable salter av disse i henhold til krav 1, karakterisert vedat ner 4 til 8.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av alginat-oligosakaridderivater eller farma-søytisk akseptable salter av disse i henhold til krav 1, hvor fremgangsmåten omfat-ter de følgende trinn: en vandig alginatoppløsning omsettes i omkring 2 til 6 timer i en autoklav ved pH 2-6 og en temperatur på omkring 100-120 °C; pH justeres til 7 etter at reaksjonen er stoppet; og et oksydasjonsmiddel tilsettes og omsettes i 15 minutter til 2 timer ved en temperatur på 100-120 °C.

5. Fremgangsmåte i henhold til krav 4, karakterisert vedat nevnte alginat er natriumalginat og blir omsatt i 4 timer under betingelsene med pH 4 og 110 °C.

6. Fremgangsmåte i henhold til krav 4, karakterisert vedat etter å ha justert pH til 7, tilsettes alkohol for å gi et presipitat; presipitatet filtreres fra med sug, tørkes og avsaltes.

7. Fremgangsmåte i henhold til krav 4, karakterisert vedat nevnte oksydasjonsmiddel er kopperhydroksid og omsettes i 30 min ved en temperatur på 100 °C.

8. Farmasøytisk sammensetning inneholdende en effektiv mengde av alginat-oligosakaridderivatene eller de farmasøytisk akseptable salter derav i henhold til hvert av kravene 1 til 3, og farmasøytisk-akseptable bærere.

9. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 8, karakterisert vedat sammensetningen er enhver av gruppen beståen-de av et medikament for profylakse og behandling av Alzheimers sykdom, en amyloid-p protein-fibril-dannende inhibitor, et medikament for profylakse og behandling av diabetes, et øy-amyloid protein-fibril-dannende inhibitor og en fibril-disaggregerende promoter.

10. Alginat-oligosakkarid av formel I eller farmasøytisk akseptable salter derav, hvor alginat-oligosakkaridet består av p-D-mannuronsyre bundet med a-1,4 glyko-sidbindinger:

hvor n representerer 0 eller et heltall på 1 til 19, for anvendelse ved profylakse og behandling av Alzheimers sykdom, som en inhibitor for fibrilldannende amyloid-p protein, samt for anvendelse ved profylakse og behandling av diabetes, som en inhibitor for fibrill-dannende amyloid protein fra pankreatisk øy og som en fibrill-oppløsende aktivator.